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KR102619598B1 - 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 - Google Patents

신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 Download PDF

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KR102619598B1
KR102619598B1 KR1020210110890A KR20210110890A KR102619598B1 KR 102619598 B1 KR102619598 B1 KR 102619598B1 KR 1020210110890 A KR1020210110890 A KR 1020210110890A KR 20210110890 A KR20210110890 A KR 20210110890A KR 102619598 B1 KR102619598 B1 KR 102619598B1
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Abstract

본 출원은 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 L-발린 생산 방법{Novel acetohydroxy acid synthase small subunit variant and a method for producing L-valine acid using the same}
본 출원은 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 특히 분지쇄 아미노산(Brached Chain Amino Acids, BCAA)는 필수 아미노산인 L-발린, L-루이신, L-이소류신을 총칭하는 것으로, 상기 분지쇄 아미노산는 항산화 효과 및 근육세포의 단백질 합성작용을 직접적으로 촉진시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 미생물을 이용한 분지쇄 아미노산의 생산은, 주로 에스케리키아속 미생물 또는 코리네박테리움속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 케토이소카프로산 (2-ketoisocaproate)을 전구체로 생합성된다고 알려져 있다. [대한민국 특허 등록번호 제10-0220018호, 대한민국 특허 등록번호 제10-0438146호]. 그러나, 상기 미생물을 통한 L-분지쇄 아미노산의 생산은 공업적으로 대량 제조가 쉽지 않은 문제점이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 미생물을 이용한 L-발린의 생산능을 향상시키기 위한 목적으로 미생물의 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 ilvN(acetohydroxy acid synthase small subunit) 활성이 강화된 변이형을 도입하였을 시, L-발린의 생산능이 현저하게 증가함을 확인하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 44번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-발린 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 44번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "L-발린"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-류신, L-이소류신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 (CH3)2CHCH(NH2)COOH인 L-아미노산을 의미한다.
본 발명에서 용어, "아세토하이드록시산 신타아제"는 L-발린 생합성에서 첫 번째 효소로서, 아세토락테이트 산타아제로도 명명된다. 아세토하이드록시산 신타아제는 피루브산(pyruvate)의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린의 전구체인 아세토락테이트를 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토히드록시부티레이트를 생산할 수 있다.
아세토하이드록시산 신타아제는 ilvB 및 ilvN, 두 유전자에 의하여 코딩되며, ilvB 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체(large subunit)를, ilvN 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제 작은 소단위체(small subunit)를 각각 코딩한다. 이 중 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 작은 소단위체가 피드백 저해에 중요하게 관여한다고 여겨진다.
상기 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 아세토하이드록시산 신타아제는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 출원의 상기 변이체는 기존의 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 아미노산 서열에서, 특이적 위치의 아미노산이 치환되어 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 1 이상 또는 2 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 44번째 위치 및/또는 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 변이체는 상기 위치에서 어느 하나 이상 또는 두 위치 모두 또는 이들의 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "다른 아미노산"은 치환 전의 아미노산과 다른 것이면 제한되지 않는다. 예를 들어, "서열번호 1에서 44번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었다"고 기재하는 경우, 트레오닌 (threonine) 을 제외한 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글리신(glycine), 아르기닌 (arginine), 아스파테이트 (aspartate), 시스테인 (cysteine), 글루탐산 (glutamate), 아스파라긴 (asparagine), 글루타민 (glutamine), 히스티딘 (histidine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 타이로신 (tyrosine), 이소류신 (isoleucine), 라이신 (lysine), 트립토판 (tryptophan), 발린 (valine), 메티오닌 (methionine) 또는 루신(leucine)으로 치환되는 것을 의미하고, "서열번호 1에서 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었다"고 기재하는 경우, 알라닌(alanine)을 제외한 발린, 아스파라긴, 글리신, 아르기닌, 아스파테이트, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 프롤린, 세린, 타이로신, 이소류신, 류신, 라이신, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 또는 트레오닌으로 치환되는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 당업자라면 당업계에 알려진 서열 얼라인먼트를 통해 임의의 아미노산 서열에서 본 출원의 서열번호 1의 44번째, 42번째 위치에 상응하는 아미노산을 파악할 수 있으며, 본 출원에서 별도로 기재하지 않더라도 "특정 서열번호에서 특이적 위치의 아미노산"를 기재하는 경우, 임의의 아미노산 서열에서 그와 "상응하는 위치의 아미노산"까지 포함하는 의미임은 자명하다. 따라서 서열번호 1의 서열번호 1의 44번째, 42번째 위치에 상응하는 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 역시 본 출원의 범위에 포함된다.
일 예로, 서열번호 1의 44번째, 42번째 위치에 상응하는 아미노산 중 1 이상 또는 2이상 아미노산을 다른 아미노산으로 치환할 경우, 비치환된(비변형된) 아미노산 서열보다 더 높은 활성을 갖는 변이체를 제공할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1의 44번째 및/또는 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적인 예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 44번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 및/또는 42번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적인 예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 3 또는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 변이체로서, 서열번호 1의 N-말단으로부터 44번 아미노산 및/또는 42번 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파테이트를 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 또한, 아미노산은 전하를 띠는(electrically charged) 곁사슬을 갖는 아미노산과 전하를 띠지 않는(uncharged) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류할 수 있으며, 전하를 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아스르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산은 다시 비극성(nonpolar) 아미노산 또는 극성 아미노산(polar)으로 분류할 수 있으며, 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신. 메티오닌, 페닐알라닌. 트립토판, 프롤린, 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 1의 44번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환된, 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열; 또는 서열번호 1의 44번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고 42번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 L-발린을 생산하는 미생물의 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 상기 미생물의 돌연변이는 해당 분야에서 널리 알려진 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 혹은 화학적 돌연변이 발생 둘 중의 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 화학적 돌연변이 유발 요인으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG), 디에폭시부탄, 에틸메탄 설폰에이트, 머스타드 화합물, 히드라진 및 아질산을 포함하는데, 이러한 화합물들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 물리적 돌연변이 유발 요인은 자외선 및 감마 방사선을 포함할 수 있는데, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN)는 그 발현이 강화될 수 있으며, 상기 발현 강화로 인하여 L-발린의 생산능 증가를 가져올 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 44번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 알라닌을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 서열번호 5의 42번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 발린을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 미생물에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 미생물 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 미생물 혹은 미생물 내에 도입하여 미생물 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 미생물에 도입되어 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다. 본 출원에서 "미생물", "균주", "미생물"은 동일한 의미로서 제한 없이 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주(예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주(예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 균주는 L-발린을 생산하는 미생물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "L-발린을 생산하는 미생물"은 L-발린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 말한다. 본 발명의 목적상 상기 미생물은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 포함하여 L-발린을 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하며, 그 예로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰을 들 수 있다.
상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물은, 상기 아세토하이드록시산 신타아제를 암호화하는 염색체상의 유전자가 돌연변이되어 본 발명에 따른 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 서열을 포함하는 미생물 또는/및 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시켜 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 포함하는 미생물을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물은, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체의 활성이 모균주에 비해 강화된 것일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 L-발린을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 L-발린을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체가 발현되어, L-발린 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-발린 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 아세토하이드록시산 신타아제 비변형 미생물(즉, 야생형 아세토하이드록시산 신타아제(서열번호 1)를 발현하는 미생물 또는 변이형(서열번호 3 또는 서열번호 5) 단백질을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-발린 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-발린 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상 약 18.1% 이상, 약 18.2% 이상, 약 18.3% 이상, 약 18.4% 이상 또는 약 18.5% 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하 또는 약 15% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-발린 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 약 1.14배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상 또는 1.18배 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 미생물 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 미생물 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 미생물 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 미생물 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 미생물에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 CaCl2침전법, CaCl2방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 상기 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 전달된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 미생물에 도입될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 미생물에 도입되어, 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 미생물 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 미생물 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 L-발린 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-발린 생산방법을 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 L-발린 생산방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-발린은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-발린 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-발린 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 L-발린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-발린을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-발린을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-발린 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-발린 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 미생물 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-발린 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 L-발린 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체를 포함하는, 미생물을 배양하는 경우, 기존 비변형 폴리펩티드를 갖는 미생물에 비해 고수율의 L-발린 생산이 가능하다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 인공변이법을 통한 발린 생산능 증가 변이주 선별
실시예 1-1. UV조사를 통한 인공 돌연변이 유발
발린 생산능 증가된 변이주를 선별하기 위하여 발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)를 한천을 포함하는 영양배지에 도말하여 30oC에서 36시간 배양하였다. 이렇게 획득한 수백 개의 콜로니를 실온에서 UV를 조사하여 균주 내 게놈상에 무작위 돌연변이를 유발시켰다.
실시예 1-2. 돌연변이 유발 균주 발효역가 평가 및 균주 선별
모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 대비하여 L-발린의 생산능이 증가된 변이주를 선별하고자 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다. 각각의 콜로니는 영양배지에서 계대 배양된 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표1에 나타내었다.
[영양배지 (pH 7.2)]
포도당 10g, 육추출물 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모추출물 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
[생산배지 (pH 7.0)]
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
균주명 L-발린(g/L)
대조군 KCCM11201P 2.8
실험군 C1 3.1
C2 3.3
C3 2.5
C4 2.4
C5 2.3
C6 1.2
C7 2.9
C8 3.4
C9 3.2
C10 3.2
C11 1.9
C12 2.4
C13 3.8
C14 4.5
C15 1.8
C16 2.3
C17 2.7
C18 2.6
C19 2.6
C20 3.5
C21 2.5
표 1의 결과를 기반으로, 대조군인 KCCM11201P 균주에 비하여 발린 생산량이 가장 많이 증가한 C14 균주를 선별하였다.
실시예 2. 유전자 시퀀싱을 통한 변이 확인
상기 균주의 주요 유전자들을 시퀀싱하여 KCCM11201P 균주 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 야생형 균주와 비교하였다. 그 결과, KCCM11201P 균주 및 발린 생산능이 증가된 상기 C14 균주는 ilvN 유전자 ORF(open reading frame) 영역의 특정 위치에 염기서열 변이를 포함하고 있음을 확인하였다. 구체적으로, KCCM11201P 균주는 상기 ilvN 유전자의 개시코돈으로부터 125번째에 위치한 염기에 1개의 변이가 도입되어 기존 GCA 에서 GTA로 바뀐, 42번째 아미노산 알라닌이 발린으로 치환된 형태임을 확인하였다.
발린 생산량이 가장 많이 증가한 C14 균주는 모균주 KCCM11201P가 포함한 A42V 변이를 동일하게 포함하며, 이와 더불어 ilvN 유전자의 개시코돈으로부터 130번째에 위치한 염기에 1개의 변이가 도입되어 기존 ACC 에서 GCC로 바뀐, 44번째 아미노산 트레오닌이 알라닌으로 치환된 형태임을 확인하였다.
상기 변이 영역을 분석해 본 결과, 발린 생합성 효소의 Effector binding domain 에 영향을 주는 것으로 확인되어, 해당 단백질의 활성이 강화될 것으로 예상하였다. 이하 실시예 에서는 상기 ilvN 유전자 내 ORF 특정 위치에 삽입된 A42V, T44A 변이의 개별효과와 통합 적용 시 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산인 발린 생산능에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 또한 44번째 아미노산 트레오닌 위치 변이에 대해 알라닌 외의 다른 아미노산으로 치환될 경우 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산인 발린, 이소류신, 루이신의 생산능에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 3. ilvN 변이가 도입된 KCCM11201P 균주 제작 및 발린 생산능 확인
실시예 3-1. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주에서 ilvN 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
서열번호 6으로 표시되는 ilvN(A42V+T44A) 변이형을 글루타미쿰 KCCM11201P에 삽입하기 위하여 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 C14균주의 게노믹(genomic) DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하고, 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 150초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였으며, 서열번호 7과 서열번호 8을 이용하여 1010 bp의 PCR 결과물(이하, "변이 도입 단편 1"이라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 1을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리된 pDZ벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)와 Infusion Cloning Kit (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 상기 변이 도입 단편 1을 포함하는 벡터 pDZ-ilvN(A42V+T44A)를 제조하였다.
프라이머 염기 서열
서열번호 7 cggggatcctctaga AGGACGGTACTCAAATACTAAACTTC
서열번호 8 cggggatcctctaga GACAACTACATTATTATTATACCACA
상기 pDZ-ilvN(A42V+T44A)을 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(Kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 7과 서열번호 8을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ilvN 유전자의 ORF 내 서열번호 1의 아미노산 42번 위치에 알라닌이 발린으로, 아미노산 44번 위치에 트레오닌이 알라닌으로 각각 치환된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) 라 명명하였다.
발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P, KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A)의 발린 생산능을 비교하기 위하여 플라스크 평가를 수행하였다. 각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.
[영양배지 (pH 7.2)]
포도당 10g, 육추출물 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모추출물 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
[생산배지 (pH 7.0)]
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
KCCM11201P 및 KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) L-발린 생산능
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
KCCM11201P 2.7 2.7 2.8 2.7
KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) 3.3 3.2 3.1 3.2
그 결과, KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) 균주의 L-발린 생산능은 KCCM11201P대비 18.5% 증가함을 확인하였다.
실시예 3-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주에서 ilvN 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
서열번호 3으로 표시되는 ilvN(T44A) 변이형을 글루타미쿰 KCCM11201P에 삽입하기 위하여 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹(genomic) DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하고, 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 150초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였으며, 서열번호 9와 서열번호 10을 이용하여 515 bp의 PCR 결과물(이하, "변이 도입 단편 2"이라 명명함) 및 서열번호 11와 서열번호 12를 이용하여 518 bp의 PCR 결과물(이하, "변이 도입 단편 3"이라 명명함)을 각각 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 2, 3을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리된 pDZ벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)와 Infusion Cloning Kit (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 상기 변이 도입 단편 2,3을 포함하는 벡터 pDZ-ilvN(T44A)를 제조하였다.
프라이머 염기 서열
서열번호 9 cggggatcctctaga AGGACGGTACTCAAATACTAAACTTC
서열번호 10 GGCCTTTGCAGACACGAGGGACACGAGG
서열번호 11 TGTCCCTCGTGTCTGCAAAGGCCGAAACACTCGGC
서열번호 12 cggggatcctctaga GACAACTACATTATTATTATACCACA
상기 pDZ- ilvN(T44A)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상기 상동 재조합에 의해 A42V 변이가 원복되고, T44A 변이가 도입되었다. 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(Kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 9와 서열번호 12를 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ilvN 유전자의 ORF 내 서열번호 1의 아미노산 44번 위치에 트레오닌이 알라닌으로 치환된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P::ilvN(T44A)라 명명하였다.
제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 5에 나타내었다.
KCCM11201P, KCCM11201P::ilvN(T44A) 및 KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) L-발린 생산능
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
KCCM11201P 2.7 2.7 2.8 2.7
KCCM11201P::ilvN(T44A) 2.9 3.0 2.9 2.9
KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) 3.2 3.3 3.1 3.2
그 결과, KCCM11201P::ilvN(T44A) 및 KCCM11201P::ilvN(A42V+T44A) 균주의 L-발린 생산능은 KCCM11201P 대비 각각 7.4%, 18.5% 증가함을 확인하였다.
실시예3-3: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V 균주에서 ilvN 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 L-발린 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 서열번호 13와 서열번호 14의 프라이머 쌍 및 서열번호 15과 서열번호 16의 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 단편 A, B 각각 528 bp, 509bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 두 단편을 주형으로 서열번호 13과 서열번호 16을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하여 1010bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편 4"라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 4를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.
프라이머 염기 서열
서열번호 13 cggggatcctctagaAGGACGGTACTCAAATACTAAACTTC
서열번호 14 TGCCGAGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGACACG
서열번호 15 TGTCTGTAAAGACCGAAACACTCGGCATCAA
서열번호 16 cggggatcctctagaGACAACTACATTATTATTATACCACA
이후, 상기 pDZ-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 13와 서열번호 16을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 삽입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V라 명명하였다.
마지막으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 상기 실시예 3-1및 실시예 3-2와 같은 방법으로 각각의 벡터들을 형질전환시킨 균주를 제작하고 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V::ilvN(T44A), CJ7V:: ilvN (A42V+T44A)라 명명하였다. 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 7에 나타내었다.
CJ7V, CJ7V::ilvN(T44A) 및 CJ7V:: ilvN (A42V+T44A)의 L-발린 생산능
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
CJ7V 3.5 3.5 3.6 3.5
CJ7V::ilvN(T44A) 3.9 3.8 3.8 3.8
CJ7V::ilvN (A42V+T44A) 4.1 4.0 4.0 4.0
그 결과, CJ7V::ilvN(T44A) 및 CJ7V:: ilvN (A42V+T44A) 균주의 L-발린 생산능은 CJ7V 대비 각각 8.5%, 12.3% 증가함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel acetohydroxy acid synthase small subunit variant and a method for producing L-valine acid using the same <130> KPA211107-KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Acetohydroxy acid synthase small subunit <400> 1 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 2 <211> 519 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Acetohydroxy acid synthase small subunit <400> 2 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgcaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420 cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> acetohydroxy acid synthase small subunit variant (T44A) <400> 3 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Ala Glu Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 4 <211> 519 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> acetohydroxy acid synthase small subunit variant (T44A) <400> 4 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 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Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 44번째 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌으로 치환된 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN) 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 추가적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 것인, 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 44번째 위치에 상응하는 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로 치환된 것인, 변이체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 44번째 위치에 상응하는 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로, 42번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된 것인, 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는, 변이체.
  6. 제2항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는, 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물과 비교하여 L-발린 생산능이 증가된, 미생물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인, 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  13. 제9항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-발린 생산 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계;를 추가적으로 포함하는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100438146B1 (ko) 1996-11-28 2004-11-03 씨제이 주식회사 L-루이신생산미생물인코리네박테리움글루타미컴ch25
KR100220018B1 (ko) 1997-06-25 1999-10-01 손 경 식 L-루이신을 생산하는 신규한 미생물 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CH45
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
RU2355763C2 (ru) * 2006-09-13 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот
JP5756259B2 (ja) 2006-09-15 2015-07-29 シージェイ チェイルジェダン コーポレイション Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法
KR20080033001A (ko) 2006-10-12 2008-04-16 삼성전자주식회사 백라이트 유닛 및 이를 구비하는 액정 표시 장치
KR101251540B1 (ko) * 2010-10-08 2013-04-08 한국과학기술원 Ｌ-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 ｗ 균주 및 이를 이용한 ｌ-발린의 제조방법
DE102011118019A1 (de) * 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
PL2811028T3 (pl) * 2013-06-03 2017-07-31 Evonik Degussa Gmbh Sposób wytwarzania L-waliny z zastosowaniem zrekombinowanych bakterii maczugowatych zawierających operon ilvBN indukowany propionianem
KR101720836B1 (ko) * 2014-08-05 2017-04-03 씨제이제일제당 (주) 피드백 저항성 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린의 생산방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
CN110283823B (zh) 2016-08-31 2023-05-12 Cj第一制糖株式会社 新型启动子及其应用
KR101996129B1 (ko) * 2017-07-11 2019-07-04 씨제이제일제당 (주) 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법
KR101947945B1 (ko) * 2018-01-25 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
KR102063909B1 (ko) * 2019-03-29 2020-01-08 씨제이제일제당 주식회사 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법
KR102153534B1 (ko) * 2019-09-02 2020-09-09 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법
KR102207867B1 (ko) * 2020-01-21 2021-01-26 씨제이제일제당 주식회사 Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR102263091B1 (ko) * 2020-05-21 2021-06-09 씨제이제일제당 주식회사 L-분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 l-분지쇄 아미노산 생산방법

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