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KR102609197B1 - 인터류킨 15 단백질 복합체 및 그의 용도 - Google Patents

인터류킨 15 단백질 복합체 및 그의 용도 Download PDF

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KR102609197B1
KR102609197B1 KR1020177018986A KR20177018986A KR102609197B1 KR 102609197 B1 KR102609197 B1 KR 102609197B1 KR 1020177018986 A KR1020177018986 A KR 1020177018986A KR 20177018986 A KR20177018986 A KR 20177018986A KR 102609197 B1 KR102609197 B1 KR 102609197B1
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씬 예
퀴예 후
동빙 쿠이
웨이캉 타오
리안샨 장
피아오양 썬
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지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 출원은 인터류킨 15(IL-15) 단백질 복합체를 제공한다. 상기 IL-15 단백질 복합체는 용해성 융합 단백질 I 및 II로 이루어지며, 여기에서 상기 융합 단백질 I은 IL-15 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이고, 상기 융합 단백질 II는 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이다. 상기 융합 단백질 I 또는 II상에 하나 이상의 아미노산 부위가 존재하며, 상기는 Cys로 돌연변이되었고, 상기 융합 단백질 II 또는 I상의 아미노산 부위로부터 돌연변이된 상응하는 Cys와 짝을 지어 디설파이드 결합을 형성하였다. 상기 IL-15 단백질 복합체를 종양 요법에 사용할 수 있다.

Description

인터류킨 15 단백질 복합체 및 그의 용도{INTERLEUKIN 15 PROTEIN COMPLEX AND USE THEREOF}
본 발명은 IL-15 단백질 복합체 및 그의 용도에 관한 것이며, 또한 용해성 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체, 및 치료제로서, 특히 암 및 자가면역 질병에 대한 치료제로서 그의 용도에 관한 것이다.
1994년 그라브스타인(Grabstein) 등에 의해 발견된 인터류킨 15(IL-15)는 약 12 내지 14 kD의 사이토킨으로, 유기체에서 정상적인 면역 응답에, 예를 들어 T 세포, B 세포 및 천연 살해(NK) 세포의 촉진에 한 역할을 한다.
IL-15는 사이토킨의 작은 4개의 α-나선 다발 계열의 일원이다. IL-15는 생물 활성을 발휘하기 위해서 그의 수용체와 결합할 필요가 있다. IL-15 수용체는 3개의 수용체 서브유닛: IL-15 수용체 α(IL-15Rα), IL-2 수용체 β(IL-2Rβ, 또한 IL-15Rβ 또는 CD122로서 공지됨) 및 γc(또한 CD132로서 공지됨)로 이루어진다. IL-15Rα는 스시(Sushi) 도메인을 함유하며, 상기 도메인은 IL-15와 결합할 수 있고 결합 후 IL-15의 생물학적 기능에 필수적이다.
최근에, IL-15 및 그의 수용체 IL-15Rα에 의해 형성된 복합체가 IL-15의 생물 활성을 현저하게 증대시킬 수 있음이 밝혀졌다. 연구는 상기 IL-15 및 용해성 IL-15Rα 수용체에 의해 형성된 복합체가 기억 CD8+ T 림프구 및 NT/NKT 세포의 증식을 자극하는데 있어서 IL-15 단독보다 현저하게 우수함을 지적하였다. 상기 IL-15/IL-15Rα는 CD122 고 세포(항원에 의해 자극된 기억 CD8+ T 림프구를 포함한다)를 현저하게 확장시켰고 그의 증식을 유도하였다. IL-15/IL-15Rα 복합체는 기억 CD8+ T 세포의 증식을 자극하고 그의 생존을 유지하는데 있어서 IL-15 단독보다 10배 더 강하며, 그 기전은 표시와 관련될 수 있다.
IL-15는 종양 면역요법 분야에서 가장 유망한 것이었기 때문에, NIH는 처음으로 종양 분야에서 IL-15 치료의 조사를 시작하였으며, 상기에 대해 I기 임상을 추구하고자 하였다. 그러나, IL-15는 작은 분자량, 짧은 생체내 반감기, 거의 조절되지 않는 반복 투여량의 단점을 가지며, 전신 면역 부작용을 일으키기 쉽다.
상기 생체내 반감기를 증가시킬 수 있고, 생체내에서 IL-15의 생물 활성을 촉진하거나 증대시킬 수 있는 접근법을 찾는 것이 시급히 필요하다. IL-15 면역요법과 관련된 연구, 예를 들어 항균성 감염 치료를 위한 IL-15-hIgG4Fc 동종이량체성 단백질에 관한 특허 CN100334112C(샹하이 하이신 바이오테크놀로지 캄파니 리미티드(Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.)에 종사하는 다수의 국내 및 외국 회사 또는 연구기관들이 존재하며; 본 발명의 IL-15 및 IL-15Rα 복합체 분자 사이에 디설파이드 결합을 도입시키는 것은 분자 안정성 및 생물활성을 증가시키는 동시에 제조 공정을 단순화할 수 있다.
본 발명은 유전 공학 방법을 통해 설계되고 제조된, 연장된 생체내 반감기, 증가된 시험관내 활성 및 현저한 항-종양 활성을 갖는 단백질 분자를 제공한다.
본 발명은 용해성 융합 단백질 I 및 용해성 융합 단백질 II를 포함하는 IL-15 단백질 복합체를 제공하며; 여기에서
상기 용해성 융합 단백질 I는 IL-15 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이고; 상기 용해성 융합 단백질 II는 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이며;
상기 용해성 융합 단백질 I 및/또는 상기 용해성 융합 단백질 II는 하나 이상의 아미노산 돌연변이로부터 생성된 Cys를 포함하고, 상기 용해성 융합 단백질 II 및 상기 용해성 융합 단백질 I 중에 존재하는 상응하는 Cys의 짝짓기에 의해 다이설파이드 결합이 형성된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 용해성 융합 단백질 I 및/또는 용해성 융합 단백질 II는 Fc 단편 또는 그의 돌연변이체에 공유 결합된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 용해성 융합 단백질 II는 Fc 단편 또는 그의 돌연변이체에 공유 결합된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 아미노산 Cys 돌연변이는 상기 IL-15 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편상에서 발생한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 아미노산 Cys 돌연변이 부위는 상기 IL-15 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편상의 L45, Q48, V49, L52, E53, C88 또는 E89, 바람직하게는 L52, E53 또는 E89, 보다 바람직하게는 L52에 존재한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 용해성 융합 단백질 I의 서열은 서열번호 2이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 아미노산 Cys 돌연변이 부위는 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편상에 존재한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 아미노산 Cys 돌연변이는 상기 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편의 K34, L42, A37, G38 또는 S40에서 발생하고, 바람직하게는 A37, G38 또는 S40, 보다 바람직하게는 S40에서 발생한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 용해성 융합 단백질 II는 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편 및 Fc 단편의 재조합에 의해 구성되고; 바람직하게는 상기 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편은 Fc 단편의 N-말단에 부착되며; 보다 바람직하게는 상기 Fc 단편을 서열번호 9에 나타낸다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체에서 상기 용해성 융합 단백질 II의 서열은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 바람직하게는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, IL-15 단백질 복합체는 하기 용해성 융합 단백질 I 및 용해성 융합 단백질 II의 조합 중에서 선택된다:
본 발명은 또한 상술한 바와 같은 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같은 핵산을 포함하는 DNA 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같은 DNA 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같은 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포를 상술한 바와 같은 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체의 발현에 충분한 조건하에서 배양하고; 상기 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체를 발현 및 정제함을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 IL-15/IL1-5Rα 단백질 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 IL-15/IL1-5Rα 단백질 복합체, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 면역 응답을 자극하거나 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IL-15-매개된 질병 또는 질환의 치료에 대한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 IL-15/IL1-5Rα 단백질 복합체 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도에 관한 것이며; 여기에서 상기 질병은 감염성 질병, 암, 혈액 질병 및 자가면역 질병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 암은 흑색종, 결장직장암, 피부암, 림프종, 신세포 암종, 고형 종양, 간암, 폐암, 위암, 및 유방암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 상기 감염성 질병은 두창 바이러스 감염, HIV 감염, 세균 감염, 진균 감염, 및 HBV 감염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 상기 혈액 질병은 빈혈, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 T-세포 대형 과립 림프구성 백혈병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 상기 자가면역 질병은 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염, 염증성 질병, 위염 및 점막 염증으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체 또는 상기 약학 조성물을 단독으로 또는 다른 약물과 함께 사용할 수 있다. 상기 다른 약물은 소분자 억제제 또는 항체 약물이며; 상기 소분자 억제제(들)는 바람직하게는 표적 화학요법 또는 방사선요법제, 보다 바람직하게는 알킬화제(들) 중에서 선택되고; 상기 항체 약물(들)은 바람직하게는 단클론성 항체(들), 보다 바람직하게는 항-CD20, 항-PD1, 항-PDL1, 항-Her2, 항-EGFR, 항-c-MET 항체(들) 중에서 선택된다.
본 발명은 또한 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 비제한적으로 화학요법, 방사선요법, 외과적 치료 등을 포함한다. 질병-관련된 항원은 상기 질병에서 발현된다. 상기 방법은 환자에게 상술한 바와 같은 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체 또는 상술한 바와 같은 약학 조성물을 투여하고; 면역 세포를 활성화하기에 충분히, 질병-관련 항원을 발현하는 세포와 IL-15Rα를 발현하는 상기 면역 세포간에 특이적인 결합 복합체를 형성시키고; 상기 면역 세포를 통해 질병-관련 항원을 발현하는 상기 세포를 살해함을 포함한다. 상기 질병-관련 항원을 발현하는 세포는 바람직하게는 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포이다. 상기 면역 세포는 바람직하게는 T-세포, LAK 세포 또는 NK 세포이다. 상기 질병은 감염성 질병, 암, 혈액 질병 및 자가면역 질병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 암은 흑색종, 결장직장암, 피부암, 림프종, 신세포 암종, 고형 종양, 간암, 폐암, 위암, 및 유방암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 감염성 질병은 두창 바이러스 감염, HIV 감염, 세균 감염, 진균 감염, 및 HBV 감염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 혈액 질병은 빈혈, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 T-세포 대형 과립 림프구성 백혈병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 자가면역 질병은 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염, 염증성 질병, 위염 및 점막 염증으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명은 또한 환자에게 상술한 바와 같은 IL-15/IL-15Rα 단백질 복합체 또는 상술한 바와 같은 약학 조성물을 다른 약물, 예를 들어 소분자 억제제 또는 항체 약물과 함께 투여함을 포함하는, 질병의 치료 또는 예방을 위한 복합 치료 방법에 관한 것이다. 상기 소분자 억제제(들)는 바람직하게는 표적 화학요법 또는 방사선요법제, 보다 바람직하게는 알킬화제(들) 중에서 선택되고; 상기 항체 약물(들)은 바람직하게는 단클론성 항체(들), 보다 바람직하게는 항-CD20, 항-PD1, 항-PDL1, 항-Her2, 항-EGFR 및 항-c-MET 항체(들) 중에서 선택된다.
본 명세의 보다 양호한 이해를 위해서, 몇몇 기술과학 용어들을 하기에 구체적으로 정의한다. 본 문서에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 다른 과학 기술 용어들은 본 명세가 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
용어
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 아미노산에 대한 1-문자 코드 및 3-문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, (1968)p3558]에 기재된 바와 같다.
본 발명에서, 본 발명의 "단백질 복합체" 또는 "복합체 단백질"은 2개의 상이한 단량체성 단백질의 결합에 의해 형성된 단백질을 지칭한다.
본 발명에서 상기 단백질 복합체를 구성하는 단량체성 단백질(즉 용해성 융합 단백질 I, 용해성 융합 단백질 II)은 융합 단백질 또는 비-융합 단백질일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 2개 이상의 유전자의 암호화 영역을 유전자 재조합 방법, 화학적 방법 또는 다른 적합한 방법을 사용함으로써 결합시키고; 상기 재조합 유전자를 동일한 조절 서열의 조절하에서 발현시킴으로써 수득된 단백질 생성물이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 용해성 융합 단백질 I은 Fc 단편과 같은 생물활성 폴리펩티드와 IL-15 또는 그의 변체의 융합 또는 비융합 발현에 의해 수득된 단량체성 단백질이고; 상기 용해성 융합 단백질 II는 Fc 단편과 같은 생물활성 폴리펩티드와 IL-15Rα 또는 그의 변체의 융합 또는 비융합 발현에 의해 수득된 단량체성 단백질이다. 본 발명의 융합 단백질에서, 상기 2개 이상 유전자의 암호화 영역들을 하나 또는 다수의 위치(들)에서 펩티드 링커(들)를 암호화하는 서열(들)에 의해 융합시킬 수 있다. 펩티드 링커를 또한 본 발명의 융합 단백질의 구성에 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "IL-15" 또는 "기능성 단편"은 임의의 IL-15(인터류킨-15) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 인간 또는 비-인간 포유동물 IL-15 또는 비-포유동물 IL-15일 수 있다. 예시적인 비-인간 포유동물은 예를 들어 돼지, 토끼, 원숭이, 침팬지, 마우스 등을 포함하고; 비-포유동물은 예를 들어 닭 등을 포함한다. 인간 IL-15 및 그의 기능성 단편이 바람직하다. 인간 인터류킨-15 성숙 분자(서열번호 1)는 데이터베이스 UniProtKB, 수납 번호 P40933, 49-162aa에서 발견된다. "IL-15 기능성 단편"이란 용어는 IL-15 생물학적 기능 또는 다른 성질에 대해 변경된 효과를 갖는, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 수득된 돌연변이체를 지칭한다. 상기와 같은 아미노산 변경은 IL-15와 그의 수용체 IL-15Rα 또는 IL-15Rβ간의 상호작용을 증가 또는 감소시킬 수 있거나; 또는 IL-15의 생물활성, 예를 들어 면역세포의 증식을 자극하는데 있어서 그의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있거나; 또는 상기와 같은 아미노산 돌연변이는 IL-15와 그의 수용체간에 공유 결합을 확립시키거나 또는 상기 공유 결합을 보다 안정하게 할 것이다. 예를 들어, IL-15(L52C), 즉 52번 위치에서 류신 L이 시스테인 C로 치환되고(서열번호 2), 상기 부위에 상응하는 IL-15Rα상의 몇몇 아미노산이 C에 대해 치환되어 상기와 디설파이드 결합을 형성하였다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "IL-15Rα" 또는 "기능성 단편"은 임의의 종으로부터의 임의의 IL-15Rα 또는 그의 기능성 단편, 예를 들어 인간 또는 비-인간 포유동물 IL-15Rα 또는 비-포유동물 IL-15Rα일 수 있다. 예시적인 비-인간 포유동물은 예를 들어 돼지, 토끼, 원숭이, 침팬지, 마우스 등을 포함하고; 비-포유동물은 예를 들어 닭 등을 포함한다. 인간 IL-15Rα가 바람직하고, IL-15Rα ECD(서열번호 3)라 지칭되는 인간 인터류킨-15 수용체 α의 세포외 도메인 부분이 보다 바람직하다, 데이터베이스 UniProtKB, 수납 번호 Q13261, 31-205aa를 참조하시오. "IL-15Rα 기능성 단편"이란 용어는 바람직하게는 IL-15Rα의 세포외 도메인 단편의 단축된 형태, 즉 인간 인터류킨 15 수용체 α 활성을 갖는, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 수득된 스시 도메인을 포함하는 분자, 예를 들어 IL-15Rα-스시 + (서열번호 4)이다.
"Fc 단편"이란 용어는 항원-결합 활성을 갖지 않는 인간 면역글로불린 쇄 불변 영역, 특히 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 C-말단 또는 그의 일부를 지칭하며, 항체 분자와 효과기 분자 또는 세포간의 상호작용을 위한 부위이다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역과 함께 중쇄 CH1, CH2, CH3 및 CH4 중 2개 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린을 상이한 범주, 주로 5개 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류할 수 있다. 이들 중 일부를 하위유형(아이소타입), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4; IgA-1, IgA-2 및 상이한 유전자형들로 추가로 분류할 수 있다.
"Fc 단편"은 바람직하게는 적어도 하나의 면역글로불린 힌지 영역, 및 IgG의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는 CH2 도메인, CH3 도메인 및 면역글로불린 힌지 영역을 포함하며, 힌지 영역의 초기 아미노산 위치는 변할 수 있다.
본 발명에서 "링커 펩티드(링커)"란 용어는 정확한 단백질 폴딩 및 안정성을 보장하기 위해서 IL-15 또는 IL-15Rα를 Fc 변체와 연결시키는데 사용되는 펩티드이다. 본 발명의 "링커 펩티드"는 바람직하게는 (GGGGS)n이고, 여기에서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상일 수 있으며, 바람직하게 n은 2 내지 4이다. 상기 링커 펩티드의 서열이 너무 짧으면 2개 단백질의 진행된 구조 폴딩에 영향을 미치고, 따라서 서로 방해될 수 있으며; 상기 링커 펩티드의 서열이 너무 길면 상기 링커 펩티드 서열 자체가 새로운 항원이기 때문에 면역원성의 문제가 우려된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단백질 복합체"는 바람직하게는 동시-발현된, 예를 들어 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이에서 동시-발현되거나; 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 293 및 CHO에서 동시-발현된 유전자의 생성물이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동시발현"은 다수의 유전자가 하나의 세포에서 함께 발현되어 그들의 생성물을 동시에 생성시킴을 지칭한다. 이들 유전자는 동시에 존재할 수 있으며 별도로 또는 공통으로 조절 및 발현될 수 있다. 본 발명에서, 2개의 유전자는 바람직하게는 진핵생물 세포에서 동시-발현된다. 유전자의 동시-발현에 의해 수득된 생성물은 복합체를 효율적이고 용이하게 형성시키는데 도움이 된다.
생물학적 물질, 예를 들어 동물, 인간, 피실험자, 세포, 조직, 기관 또는 생물유체에 적용되는 바와 같은 "투여" 또는 "치료"는 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물과 동물, 인간, 피실험자, 세포, 조직, 기관 또는 생물유체를 포함한 생물학적 물질과의 접촉을 지칭한다. "투여" 또는 "치료"는 예를 들어 치료학적, 약동학적, 진단학적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약을 상기 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라 시약을 유체(이때 상기 유체는 상기 세포와 접촉하고 있다)와 접촉시킴을 포함한다. "투여" 또는 "치료"는 또한 시약, 진단, 결합 화합물 또는 또 다른 세포에 의한, 예를 들어 하나의 세포의 시험관내 및 생체외 치료를 의미한다. "치료"는 인간, 동물 또는 피실험자에게 적용될 때, 연구 및 진단 용도를 위한 치료학적 치료, 예방학적 또는 방지 수단을 지칭한다. "치료"는 인간, 동물, 또는 피실험자, 또는 세포, 조직, 또는 기관에 적용될 때, IL15 작용물질 또는 IL15 길항물질을 인간 또는 동물, 피실험자, 세포, 조직, 생리학적 구획 또는 생리학적 유체와 접촉시킴을 포함한다. "세포의 치료"는 상기 IL15 작용물질 또는 IL15 길항물질을 IL15 수용체와, 예를 들어 유체상 또는 콜로이드상에서 접촉시키는 상황을 포함하며, 또한 상기 작용물질 또는 길항물질이 상기 세포 또는 상기 수용체와 접촉하지 않는 상황도 포함한다.
"치료하다"는 치료제, 예를 들어 본 발명의 IL-5 단백질 복합체 또는 이를 함유하는 조성물을 "면역" 또는 "암 중에서 선택된 하나 이상의 질병 또는 상태를 앓고 있는 환자에게 내부적으로 또는 외부적으로 투여함을 의미한다. 상기 치료제는 상기 질병 또는 상태에 대해 치료 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 치료제를 상기 질병 또는 상태의 역행을 유도하거나 상기와 같은 질병 또는 상태의 진행을 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 억제시킴으로써, 치료하고자 하는 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질병 또는 상태를 경감시키기에 유효한 양으로 투여한다. 임의의 특정한 질병 또는 상태를 경감시키기에 유효한 치료제의 양(또한 "치료 유효량"이라 지칭됨)은 다수의 인자들, 예를 들어 질병 상태, 환자의 연령 및 체중, 및 상기 환자에게 목적하는 응답을 이끌어내는 약물의 능력에 따라 변할 수 있다.
"면역 질병" 또는 "면역 질환"은 예를 들어 병적인 염증, 염증성 질환, 및 자가면역 질병 또는 질환을 포함한다. "면역 질병"은 또한 감염, 지속적인 감염, 및 증식성 질환, 예를 들어 암, 종양 및 혈관형성을 지칭한다. "암성 질병"은 예를 들어 암, 암세포, 종양, 혈관형성 및 전암성 병변, 예를 들어 이형성증을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리머라제 쇄 반응" 또는 "PCR"은 예를 들어 미국특허 제 4,683,195 호에 기재된 증폭 과정 또는 기법을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계할 수 있도록 관심 영역의 단부로부터의, 또는 상기 관심 영역을 넘어선 서열 정보를 입수할 필요가 있다. 상기 프라이머는 증폭시키려는 주형과 반대 가닥에 서열이 동일하거나 유사할 것이다.
"임의의" 또는 "임의로"는 이어지는 사건이나 상황이 일어날 수도 있지만 반드시 일어날 필요는 없음을 의미하며, 상기 기재는 상기 사건이나 상황이 일어나는 경우 또는 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 임의로 함유한다"는 상기 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만, 반드시 존재할 필요는 없음을 의미한다. 존재하는 경우, 1, 2 또는 3개가 있을 수 있다.
"약학 조성물"은 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물 또는 그의 생리학/약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물을 다른 화학 성분뿐만 아니라 추가적인 성분, 예를 들어 생리학적/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제와 함께 함유하는 혼합물을 지칭한다. 상기 약학 조성물은 유기체에의 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 촉진하며 이에 의해 생물학적 효과를 발휘하는 것을 목적으로 한다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환을 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 통상적인 기법에 의해 수행할 수 있다. 상기 수득된 형질전환체를 통상적인 방법을 사용하여 배양하여 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현시킨다. 배양 배지는 사용되는 숙주 세포를 기준으로 다양한 통상적인 배양 배지들 중에서 선택될 수 있다. 상기 숙주 세포는 적합한 조건하에서 증식한다.
도 1은 IL-15 및 수용체 α,β,γ의 결정 복합체 구조를 도시한다.
도 2는 IL-15 및 IL-15Rα(수용체 α)의 계면의 잔기들을 도시한다.
도 3은 IL-15 및 IL-15Rα상에 위치한 돌연변이 후보 잔기들의 상대적인 위치를 도시한다.
도 4는 IL-15상의 L52C와 IL-15Rα상의 S40C 사이에 형성된 디설파이드 결합의 모델 다이어그램이다.
도 5는 본 발명에서 동시-발현된 분자 생성물 1 내지 9상의 His 태그의 검출을 위한 웨스턴 분석을 가리킨다.
도 6은 본 발명에서 동시-발현된 분자 생성물 1 내지 18상의 Fc 부분의 검출을 위한 웨스턴 분석을 가리킨다.
도 7은 본 발명의 단백질 복합체 1, 2, 3, 4의 구조 다이어그램을 도시한다.
도 8은 마우스에서 폐 전이성 종양에 대한 본 발명의 단백질 복합체의 영향을 도시한다. 도면에서 "*"는 p<0.05, vs PBS를 나타낸다.
도 9는 마우스의 상대적인 폐 중량(폐 중량/체중)에 대한 단백질 복합체의 영향을 도시한다.
도 10은 마우스의 체중에 대한 단백질 복합체의 영향을 도시한다.
도 11은 래트에서 단백질 복합체 3의 반감기를 도시한다.
본 명세서에서 이후에, 본 발명을 실시예를 참조하여 추가로 기재하나; 본 발명의 범위가 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서, 구체적인 조건들이 기재되지 않는 경우, 실험을 통상적인 조건하에서 또는 물질 또는 제품 제조사에 의해 제안된 조건하에서 일반적으로 수행한다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY]을 참조하시오. 시약들의 공급원이 구체적으로 제공되지 않는 경우, 상기 시약들은 상업적으로 입수할 수 있는 통상적인 시약이다.
실시예 1. 돌연변이체의 선택 및 확인
IL-15는 암 및 바이러스성 질병의 치료에 유망한 사이토킨이다. 상기를 IL-15Rα(IL-15 수용체 α)에 의해 T 세포 및 NK 세포의 표면상에 위치한 IL-15 수용체 β/γ에 제공할 수 있으며, 이에 의해 상기 활성화된 T 세포의 증식을 자극할 수 있다. 따라서, IL-15 및 IL-15 수용체 α의 결합 능력 증가는 다양한 림프구의 기능을 현저하게 증대시킬 것이며, 이는 면역요법에 매우 중요하다.
3개의 수용체가, IL-15 및 수용체 α,β,γ(PDB ID: 4GS7)의 결정성 복합체 구조로부터 각각 3개의 상이한 배향으로 IL-15에 결합함을 알 수 있다(도 1). 따라서, IL-15와 수용체 α 사이의 계면상에 존재하는 잔기들을 변형시키는 경우, 수용체 β 및 γ에 대한 IL-15의 결합은 영향을 받지 않을 것이다.
본 발명자들은 초기 구조로서 IL-15 및 수용체 α의 공-결정 구조(PDB ID: 2Z3Q)를 선택하였다(상기 구조 중 수용체 α의 결정 구조는 4GS7에서의 구조보다 약간 더 길다). IL-15 및 수용체 α의 계면상에 위치한 잔기들을 상기 구조로부터 요약하였다(표 1). 컷-오프 값은 상대 분자로부터 6 Å으로 지정되었다(도 2).
IL-15 및 수용체 α 결정 복합체의 접촉 계면의 잔기들
분자 접촉 계면의 잔기들
IL-15 H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, C42, L45, E46, Q48, V49, L52, E53, S54, G55, E87, C88, E89, E90, E93, K94
수용체 α R24, R26, K34, R35, K36, A37, G38, T39, S40, S41, L42, E44, S60, I64, R65, D66, P67, A68, V70, H71, Q72
디설파이드 스캔을 시뮬레이션 소프트웨어 MOE에서 디설파이드 스캔을 사용함으로써 IL-15와 수용체 α 사이의 계면에서 수행하였다. 상기 스캐닝의 기본 원리는 상기 디설파이드 결합 길이 범위내에서 각각 IL-15 및 IL-15 수용체 α에 위치한 잔기들의 조합을 찾는 것이며, 이에 의해 하기의 잔기들의 조합(표 2) 및 후보 돌연변이 잔기들의 상대적인 위치(도 3)를 획득한다.
IL-15 및 IL-15 수용체 α에서 돌연변이 잔기들의 조합
IL-15 수용체 α D 안정성 (Kcal/mol)
L45C A37C -4.1933
L45C G38C -3.4475
Q48C G38C -5.7596
V49C S40C -3.6957
L52C S40C -4.0172
E53C L42C -3.3652
E87C P67C -2.8417
C88C A37C -4.0382
E89C K34C -7.3065
상기 돌연변이 조합에 대한 선택은 하기의 원칙에 따라 수행되었다. 1. 합치 오류를 피하고, 이어서 원래 분자내 디설파이드 결합의 잘못-짝짓기를 피하기 위해서, 상기 분자내 디설파이드 결합 부근의 잔기는 선택하지 않는다. 2. 돌연변이에 따른 단백질의 3-차원 구조에 영향을 미치지 않을 잔기를 선택하고자 한다. 3. 돌연변이에 따른 전체 구조에 대한 에너지의 영향을 최소화하는 잔기를 선택한다.
상기 요건 1을 충족시키기 위해서, 복합체의 결정 구조로부터, IL-15 구조상에서 분자내 디설파이드 결합이 각각 C35와 C85 사이, 및 C42와 C88 사이에 형성되었음을 알 수 있다. 따라서, 상기 IL-15상의 후보 잔기로서 각각 C88의 상류 및 하류 E87 및 E89의 가능성을 배제시키고, 후보 잔기로서 상응하는 수용체 α상의 P67 및 K34의 가능성을 배제시키는 것이 가능하다. 또한, IL-15의 C88 잔기와 수용체 α의 A37 잔기에 의해 형성된 디설파이드 결합의 가능성을 배제시킬 필요가 있다. 수용체 α의 구조상에서, C29 및 C63이 디설파이드 결합을 형성한다. 후보 잔기들이 상기 쌍 부근에서 발견되지 않았다.
상기 요건 2를 충족시키기 위해서, 결정화 복합체를 분석하였다. 먼저, L45, Q48, V49, L52 및 E53이 모두 IL-15 구조상의 알파 나선에 위치하였다. 또한, L45, Q48 및 V49가 모두 상기 알파 나선의 중앙에 위치하였다. 이들 잔기가 Cys로 돌연변이되는 경우, 상기 디설파이드 결합의 형성에 의해 야기된 측쇄의 비틀림은 상기 원래 알파-나선의 구조에 영향을 미칠 수 있으며, 이어서 전체 단백질 구조에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, IL-15상의 L52 및 E53 잔기가 바람직한 것으로 간주되었다. 둘 째로, IL-15 수용체 알파의 구조상에서, L42가 베타 폴드에 위치하였고, A37, G38 및 S40이 모두 고리에 위치하였다. 따라서, IL-15 수용체 알파상에 존재하는 A37, G38 및 S40이 바람직한 것으로 간주되었다. 상기 2개의 구조에 비추어, IL-15로부터의 L52 및 IL-15 수용체 알파로부터의 S40이 Cys에 대한 돌연변이에 바람직하고, 최종적으로 분자간 디설파이드 결합의 형성을 유도하는 것으로 간주되었다.
상기 요건 3을 총족시키기 위해서, 알라닌 스캔을 디스커버리 스튜디오 컴퓨테이셔널 소프트웨어(Discovery Studio Computational Software)를 사용하여 상기 잔기들 모두에 대해 수행하였다. 돌연변이들에서 계산된 에너지 변화의 결과(표 3)는 IL-15상에 존재하는 L52A가 구조 안정성에 최소로 영향을 미쳤고, IL-15 수용체 α상에 존재하는 S40A가 구조 안정성에 최소로 영항을 미쳤음을 나타낸다. 따라서, 상기 결과들로부터, IL-15로부터의 L52 및 IL-15 수용체 알파로부터의 S40이 Cys에 대한 돌연변이 및 최종적으로 분자간 디설파이드 결합의 형성에 바람직한 후보로서 간주될 수 있다(도 4).
알라닌 스캐닝 결과
분자 돌연변이체 돌연변이 에너지(Kcal/mol)
IL-15 LEU52>ALA 0.65
IL-15 GLU89>ALA 1.66
IL-15 GLN48>ALA 1.67
IL-15 LEU45>ALA 1.69
IL-15 GLU53>ALA 2.12
IL-15 VAL49>ALA 2.86
IL-15 수용체 α SER40>ALA -0.81
IL-15 수용체 α ALA37>ALA 0
IL-15 수용체 α GLY38>ALA 1.31
IL-15 수용체 α LEU42>ALA 2.65
IL-15 수용체 α LYS34>ALA 2.98
요약하면, 총 8개의 돌연변이 잔기들의 쌍이 설계되었다. 이들 중에서, IL-15로부터의 L52 및 IL-15 수용체 알파로부터의 S40이 Cys에 대한 돌연변이에 바람직하고, 최종적으로 분자간 디설파이드 결합의 형성에 바람직한 것으로 간주된다.
상기 돌연변이 잔기들의 8개 쌍을 기준으로, 분자들을 세포 발현 확인을 위해 설계하였다. 2개의 형태가 존재한다. 하나는 Cys 돌연변이를 갖는 IL-15Rα와 동시-발현된 Cys 돌연변이를 갖는 IL-15-Fc 융합 분자(조합 10-18)이고, 다른 하나는 Cys 돌연변이를 갖는 IL-15Rα-Fc 융합 분자와 동시-발현된 Cys 돌연변이를 갖는 IL-15-6his이다(조합 1-9). 상기 동시-발현으로부터 수득된 세포 상등액을 웨스턴 분석하였다. 상기 동시-발현 생성물 조합 1-9의 His 표지 부분은 항-마우스 His(1차 항체, 아브캠(abcam), ab14923) 및 염소 항-마우스 HRP(2차 항체, 잭슨(Jackson), 115-035-062)에 의해 검출될 수 있고; 동시-발현 생성물 조합 1-18의 Fc 부분은 염소 항-인간 Fc-HRP(잭슨, 109-035-098)에 의해 검출되었다. 구체적인 동시-발현 조합들을 표 4에 나타낸다.
상이한 돌연변이들의 동시-발현 조합
동시-발현 조합 번호 클론 동시-발현 조합 번호 클론
1 IL-15-his 10 IL-15-링커-Fc
IL-15Rα-링커-Fc IL-15Rα
2 IL-15(L45C)-his 11 IL-15(L45C)-링커-Fc
IL-15Rα(A37C)-링커-Fc IL-15Rα(A37C)
3 IL-15(L45C)-his 12 IL-15(L45C)-링커-Fc
IL-15Rα(G38C)-링커-Fc IL-15Rα(G38C)
4 IL-15(Q48C)-his 13 IL-15(Q48C)-링커-Fc
IL-15Rα(G38C)-링커-Fc IL-15Rα(G38C)
5 IL-15(V49C)-his 14 IL-15(V49C)-링커-Fc
IL-15Rα(S40C)-링커-Fc IL-15Rα(S40C)
6 IL-15(L52C)-his 15 IL-15(L52C)-링커-Fc
IL-15Rα(S40C)-링커-Fc IL-15Rα(S40C)
7 IL-15(E53C)-his 16 IL-15(E53C)-링커-Fc
IL-15Rα(L42C)-링커-Fc IL-15Rα(L42C)
8 IL-15(C88)-his 17 IL-15(C88)-링커-Fc
IL-15Rα(A37C)-링커-Fc IL-15Rα(A37C)
9 IL-15(E89C)-his 18 IL-15(E89C)-링커-Fc
IL-15Rα(K34C)-링커-Fc IL-15Rα(K34C)
웨스턴 분석은 Fc-융합된 IL-15 및 IL-15Rα의 짝짓기에 의한 동시-발현이 오합치를 생성시키고 정확하게 짝짓는 표적 생성물의 양을 감소시키기 쉬움을 입증하였다. 그러나, Fc와의 융합에 이어서, Fc-융합된 IL-15Rα 및 IL-15의 짝짓기는 정확하게 짝짓는 단일 분자를 생성시킬 수 있다. 이들 중에서, 동시-발현 조합 5, 6 및 7의 발현 수준이 더 높았으며, 상기 생성물은 매우 상동성이었고 밴드의 크기는 예상에 상응하였다(도 5-6). 상기 결과는 시뮬레이션으로부터의 예측과 잘 일치하였다. 컴퓨터 시뮬레이션으로부터의 결과 및 세포에 의해 발현된 생성물들의 성질을 고려하여, IL15상의 아미노산 Cys 돌연변이 부위는 L45, Q48, V49, L52, E53, C88 또는 E89, 바람직하게는 L52, E53 또는 E89, 보다 바람직하게는 L52로 선택되었다. IL-15Rα 상의 아미노산 Cys 돌연변이는 K34, L42, A37, G38 또는 S40, 바람직하게는 A37, G38 또는 S40, 보다 바람직하게는 S40으로 선택되었다. 가장 바람직한 것은 IL-15Rα상의 S40C와 짝짓는 IL-15상의 돌연변이 L52C이다. 더욱 또한, IL-15 단백질 복합체의 안정성은 IL-15와 IL-15Rα 사이의 디설파이드 결합의 2개 이상의 쌍을 선택하거나 상기 사이에 다른 비 시스테인 돌연변이를 도입시킴으로써 개선될 수 있다.
실시예 2. 관련된 벡터의 구성
물질:
진핵생물 발현 벡터 pcDNA3.1(+)(라이프 테크놀로지스, Cat.No. V790-20); IL-15(DNA 서열 1), IL-15Rα ECD, IL15Rα-스시+(73) 및 IgG1Fc DNA 단편을 유전자 합성 회사(제네위즈 인코포레이티드(GENENWIZ, Inc.), 중국 쑤저우 소재)에 의해 합성하였다;
프라이머를 유전자 합성 회사(제네위즈 인코포레이티드, 중국 쑤저우 소재)에 의해 합성하였다.
과정:
1 단편 결찰
IL-15Rα-ECD-Fc 단편: 오버랩 PCR을 사용하여 3개의 DNA 단편을, IL-15Rα-ECD, 링커 펩티드 및 Fc의 순서로 결합시킴으로써 IL-15Rα-ECD-Fc 단편(DNA 서열 2)을 형성시켰다.
Fc-IL-15Rα-ECD 단편: 오버랩 PCR을 사용하여 3개의 DNA 단편을, Fc, 링커 펩티드 및 IL-15Rα-ECD의 순서로 결합시킴으로써 Fc-IL-15RαECD 단편(DNA 서열 3)을 형성시켰다.
IL-15Rα-스시+-Fc 단편: 오버랩 PCR을 사용하여 3개의 DNA 단편을, IL-15Rα-스시+, 링커 펩티드 및 Fc의 순서로 결합시킴으로써 IL-15Rα-스시+-Fc 단편(DNA 서열 4)을 형성시켰다.
Fc-IL-15Rα-스시+단편: 오버랩 PCR을 사용하여 3개의 DNA 단편을, Fc, 링커 펩티드 및 IL-15Rα스시+의 순서로 결합시킴으로써 Fc-IL-15Rα-스시+ 단편(DNA 서열 5)을 형성시켰다.
Cys 돌연변이를 함유하는 유전자 단편들을 점 돌연변이에 의해 획득하였다, 예를 들어:
IL-15 (L52C): 52번 위치에서, L이 C로 돌연변이되었다 (DNA 서열 6)
IL15Rα-ECD (S40C)-Fc: 40번 위치에서, S가 C로 돌연변이되었다 (DNA 서열 7)
Fc-IL-15Rα ECD (S40C) 단편: (DNA 서열 8)
IL-15Rα-스시+ (S40C)-Fc 단편: (DNA 서열 9)
Fc-IL-15Rα-스시+ (S40C) 단편: (DNA 서열 10).
2. 제한 부위 및 신호 펩티드 서열 도입:
제한 엔도뉴클레아제 KpnI 부위, 코작 서열 및 신호 펩티드 서열을 PCR에 의해 상기 유전자 단편의 5'-말단에 도입시켰다. KpnI 부위와 상기 유전자 단편 사이의 서열을 하기에 나타낸다:
GGTACCTTGTGCCCGGGCGCCACCATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGC(밑줄 친 서열은 KpnI 제한 부위이고, 이탤릭체 서열은 신호 펩티드이다); 종결 코돈 TGA 및 NotI 제한 효소 부위를 각각 상기 3개 단편의 3'-말단에 도입시켰다.
3. 발현 벡터의 구성
상기 유전자 단편들을 KpnI 및 NotI 제한 효소 부위에 의해 벡터 pcDNA3.1(+)에 삽입하여 발현 벡터, 예를 들어 pcDNA3.1-IL-15, pcDNA3.1-IL-15Rα-ECD-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-EC, pcDNA3.1-IL-15Rα-스시+-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-스시+ 등을 구성하였다. 상응하는 발현 플라스미드가 획득되었다.
4. 유전자 중의 부위-지향 돌연변이
KOD 키트(토요보(TOYOBO) Cat.MOD-201)를, 2.5 ㎕ 10xKOD 완충제, 2.5 ㎕ 2 mM dNTP, 1 ㎕ 프라이머 1(10 μM), 1 ㎕ 프라이머 2(10 μM), 0.5 ㎕ KOD 플러스, 1 ㎕ 25 mM MgSO4 및 16 ㎕ ddH2O를 포함하는 25 ㎕ 시스템과 함께 부위-지향 돌연변이에 사용하였다. 합성 과정은 하기와 같다: 25 주기의 증폭 동안 94 ℃ 2분, 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 11분, PCR 증폭을 68 ℃에서 추가로 11분에 이어서 종결시켰다. PCT 산물을 1 ㎕의 DpnI(NEB Cat. R0176L)로 5시간 동안 절단시키고, 이어서 DH5a 수용 세포내로 형질전환시켰다. 그 후에, 클론을 서열분석을 위해 채집하여 목적하는 플라스미드 pcDNA3.1-IL-15(L52C), pcDNA3.1-IL-15Rα-ECD(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-ECD(S40C), pcDNA3.1-IL-15Rα-스시+(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-스시+(S40C) 및 다른 돌연변이 유전자들을 수득하였다. 본 발명의 실시예에 수반되는 단백질 복합체 1을, DNA 서열 6 및 7을 함유하는 발현 벡터를 발현시킴으로써 수득하였다. 본 발명의 실시예에 수반되는 단백질 복합체 3을, DNA 서열 6 및 9를 함유하는 발현 벡터를 발현시킴으로써 수득하였다. 본 발명의 실시예에 수반되는 단백질 복합체 4를, DNA 서열 6 및 10을 함유하는 발현 벡터를 발현시킴으로써 수득하였다. 본 발명의 실시예에 수반되는 단백질 복합체 2를, DNA 서열 6 및 8을 함유하는 발현 벡터를 발현시킴으로써 수득하였다.
발현 플라스미드의 뉴클레오티드 서열의 구성
하기의 서열들을 벡터 구성에 사용하였으며, 단일 수평선은 신호 펩티드 DNA 서열을 나타내고, 파선은 펩티드 링커 DNA 서열을 나타내고, 이중 수평선은 돌연변이된 DNA 서열을 나타낸다.
IL-15(DNA 서열 1, 서열번호 10):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGCGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCTTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA
IL-15Rα-ECD-Fc (DNA 서열 2, 서열번호 11):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA
Fc-IL-15Rα-ECD (DNA 서열 3, 서열번호 12):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA
IL-15Rα-스시+(73)-Fc (DNA 서열 4, 서열번호 13):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGAC
Fc-IL-15Rα-스시+(73) (DNA 서열 5, 서열번호 14):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA
IL-15(L52C) (DNA 서열 6, 서열번호 15):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCATGTGAGTCCGGCGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCTTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA
IL-15Rα-ECD(S40C)-Fc (DNA 서열 7, 서열번호 16):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA
Fc-IL-15Rα-ECD(S40C) (DNA 서열 8, 서열번호 17):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA
IL-15Rα-스시+(73)(S40C)-Fc (DNA 서열 9, 서열번호 18):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGAC
Fc-IL-15Rα-스시+(73)(S40C) (DNA 서열 10, 서열번호 19):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA
Fc 단편: IgG1-Fc DNA(DNA 서열 11, 서열번호 20):
GAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAG
실시예 3. IL-15 단백질 복합체의 특징
본 발명에 제공된 IL-15 단백질 복합체는 용해성 융합 단백질 I 및 용해성 융합 단백질 II로 이루어지며; 여기에서 상기 용해성 융합 단백질 I은 생물활성 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편에 공유 결합된 IL-15 폴리펩티드를 포함하고; 상기 용해성 융합 단백질 II는 생물활성 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편에 공유 결합된 IL-15R 알파 폴리펩티드를 포함하고; 상기 용해성 융합 단백질 I 또는 상기 용해성 융합 단백질 II는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 부위로부터 생성된 Cys를 가지며, 상기 용해성 융합 단백질 II 및 상기 용해성 융합 단백질 I 중에 존재하는 상응하는 Cys의 짝짓기에 의해 디설파이드 결합이 형성된다.
본 발명에서, 명백한 항-종양 활성 및 연장된 생체내 반감기를 갖는 안정한 단백질 복합체를 유전 공학 방법에 의해 구성하였으며, 상기 복합체 분자는 IL-15 또는 그의 유도체 및 IL-15Rα 또는 그의 유도체의 Fc 융합 단백질 분자를 포함한다.
상기 융합 단백질 분자는 하기의 특징들을 갖는다:
1) 상기 융합 단백질은 2개의 주요 분자 부분을 포함하며, 이중 하나는 IL-15 생물활성을 갖는 분자이고, 다른 하나는 IL-15Rα 또는 그의 기능성 단편을 갖는 Fc 융합 분자이다.
2) 상기 IL-15 생물활성을 갖는 분자 부분은 야생형 IL-15 또는 IL-15 기능성 돌연변이체를 토대로 하나 이상의 아미노산 부위에 시스테인 돌연변이를 가지며, 이들 시스테인 돌연변이 부위는 IL-15Rα 또는 그의 기능성 단편상의 상응하는 시스테인 돌연변이 부위와 짝을 지어 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
3) 상기 IL-15Rα 또는 기능성 단편을 갖는 Fc 융합 분자 부분은 스시 도메인의 단축된 형태를 함유하는 IL-15Rα 또는 IL-15Rα 기능성 단편의 전체 세포외 도메인 단편을 토대로 하나 이상의 아미노산 부위에 시스테인 돌연변이를 갖는다. 이들 시스테인은 IL-15 또는 그의 기능성 돌연변이체상의 상응하는 시스테인 돌연변이 부위와 짝을 지어 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
4) 상기 융합 단백질을, 2개의 플라스미드에 의해 단일 세포주를 동시-형질감염시키거나 구성함으로써 안정하게 발현시킬 수 있고, 통상적인 분리 방법에 의해 단일 분자를 수득할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 사용된 IL-15는 인간 인터류킨 15 성숙 분자(서열번호 1) 또는 그의 변체를 지칭한다. 본 발명의 실시예들에 사용된 IL-15Rα ECD는 인간 인터류킨 15 수용체 알파 세포외 도메인 단편(서열번호 3)을 지칭한다. 그의 변체는 바람직하게는 그의 단축된 버전, 예를 들어 IL-15Rα-스시+(서열번호 4)이다. 본 발명의 실시예들에 사용된 Fc 단편 부분은 인간 항체 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 단편 또는 그의 변체, 바람직하게는 인간 IgG1의 Fc 단편, 보다 바람직하게는 서열번호 9일 수 있다.
본 발명에서, IL-15Rα 또는 그의 유도체를 링커 펩티드를 통해 Fc 단편 또는 Fc 변체에 융합시켜 용해성 융합 단백질 II를 형성시키며, 여기에서 각 단백질 성분의 부착 순서는 제한되지 않는다. 상기 링커 펩티드는 당해 분야에 통상적으로 사용되는 소프트 링커일 수 있다. (GGGGS)n이 바람직하며, 여기에서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 및 가장 바람직하게는 2일 수 있다. IL-15의 IL-15R 알파에의 결합 외에, 상기 용해성 융합 단백질 II 및 용해성 융합 단백질 I을 또한 시스테인 돌연변이 부위 짝짓기를 통해 형성된 디설파이드 결합을 통해 결합시킬 수 있다. 상기 분자의 안정성을 상기 짝짓기에 의해 증가시킬 수 있다.
관련된 단백질 서열들은 하기와 같다:
IL-15(서열번호 1):(인간 인터류킨 15 아미노산 서열, 및 또한 참조 IL-15 서열)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-15(L52C)(서열번호 2):(52번 위치상에 돌연변이 L52C를 갖는 인간 인터류킨 15 아미노산 서열)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISCESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-15Rα-ECD(서열번호 3):(인간 인터류킨 15 수용체 알파의 세포외 도메인의 아미노산 서열)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
IL-15Rα-스시+(서열번호 4):(73개 아미노산을 함유하는, 인간 인터류킨 15 수용체 단편의 절두된 형태)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQR
IL-15Rα-ECD(S40C)-Fc(서열번호 5):(Fc에 융합된 IL-15Rα 세포외 도메인의 융합 폴리펩티드, S40C 돌연변이 부위를 함유한다)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc-IL-15RαECD(S40C)(서열번호 6):(IL-15Rα 세포외 영역에 융합된 Fc의 융합 폴리펩티드, S40C 돌연변이를 함유한다)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
IL-15Rα-스시+(S40C)-Fc(서열번호 7):(링커를 통해 Fc에 융합된 스시 도메인을 함유하는 인간 인터류킨 15 수용체 α의 절두된 형태, 여기에서 스시+는 S40C 돌연변이를 함유하고 스시+는 N-말단에 위치한다)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc-IL-15Rα-스시+(S40C)(서열번호 8):(링커를 통해 Fc에 융합된 스시 도메인을 함유하는 인간 인터류킨 15 수용체의 절두된 형태, 여기에서 스시+는 S40C 돌연변이를 함유하고 스시+는 N-말단에 위치한다)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQR
Fc 단편, IgG1-Fc(단백질)(서열번호 9)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
상기 실험에서, 시험하고자 하는 분자들을 하기와 같이 넘버링하였다: 단백질 복합체 1, 2, 3 및 4, 여기에서 단백질 복합체 1은 서열번호 2 및 서열번호 5의 동시-발현에 의해 수득되었다. 단백질 복합체 2는 서열번호 2 및 서열번호 6의 동시-발현에 의해 수득되었다. 단백질 복합체 3은 서열번호 2 및 서열번호 7의 동시-발현에 의해 수득되었다. 단백질 복합체 4는 서열번호 2 및 서열번호 8의 동시-발현에 의해 수득되었다. 도식적 다이어그램을 도 7에 나타내었다. 상기 복합체 분자의 안정성은 시스테인 돌연변이 부위들의 짝짓기에 의한 디설파이드 결합의 형성을 증가시킴으로써 증가되었다.
단백질 복합체의 목록은 하기와 같다:
실시예 4. IL-15 단백질 복합체의 수득
1. 단백질 발현
IL-15/IL-15Rα 단백질을 프리스타일(FreeStyle) 293 세포(깁코(GIBCO, Cat#R79007)를 사용함으로써 일시 형질감염시키고 발현시켰다. 프리스타일 293 세포를, 울트라 로우 IgG 소 태아 혈청(초저 면역글로불린 FBS, 깁코, Cat#16250078)이 1%의 최종 농도로 보충된 프리스타일 293 발현 배지(깁코, Cat#12338018)에서 현탁 배양하였다. IL-15/IL-15Rα 발현 플라스미드 및 형질감염 시약 PEI(폴리사이언시즈(Polysciences), Cat#239662)를 제조하고, IL-15 및 IL-15Rα의 2개의 플라스미드를 1:1 내지 9:1 범위의 비로 동시-형질감염시켰으며, 플라스미드의 총량은 100 ug/100 ㎖ 세포이고, 플라스미드 대 PEI의 비는 질량 기준으로 1:2였다. 형질감염일에 세포 밀도는 1x106/㎖이었다. 1L의 프리스타일 293 세포를 형질감염을 위해 제조하였다. 50 ㎖의 옵티(Opti)-MEM(깁코, Cat#11058021) 배지를 상기 플라스미드와 혼합하고, 5분간 유지시키고 여과하였다. 또 다른 50 ㎖의 옵티-MEM 배지를 PEI와 혼합하고, 5분간 유지시키고 여과하였다. 상기 플라스미드를 PEI와 혼합하고 15분간 유지시켰다. 상기 플라스미드 및 PEI의 혼합물을 상기 세포에 서서히 가하고 진탕 배양기에서 130 rpm에서 37 ℃, 8% CO2에서 배양하였다. 5일 후에, 상등액을 단백질 정제를 위해 원심분리에 의해 수집하였다.
2. 단백질 정제
IL-15 융합 단백질에 대한 친화성 크로마토그래피:
상등액을 고속 원심분리 후에 세포 배양물로부터 수집하고 GE로부터의 단백질 A 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피하였다. 크로마토그래피에 사용된 평형 완충제는 1xPBS(pH 7.4)였으며, 세포 상등액을 로딩하고 결합시킨 후에, UV가 기준선으로 회복될 때까지 PBS로 세척하고, 이어서 표적 단백질을 용출 완충제(산성, pH 2.5-5)로 용출시켰다. 상기 pH를 트리스로 중성으로 조절하고, 표적 단백질을 보관하였다.
IL-15 융합 단백질에 대한 이온 교환 크로마토그래피:
상기 친화성 크로마토그래피 중에 수득된 생성물의 pH를 pI보다 더 낮거나 더 높은 1 내지 2 pH 단위로 조절하였다. 이어서 상기 샘플을 상기 샘플의 전도도가 5 ms/cm 미만이도록 적합하게 희석하였다. 상응하는 pH 조건하에서 NaCl-구배 용출을 pH에 상응하는 적합한 완충제, 예를 들어 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 등을 사용함으로써, 당해 분야의 통상적인 이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법, 예를 들어 양이온 교환 또는 음이온 교환을 사용하여 수행하였다. 상이한 흡수 피크에 상응하는 표적 단백질들을 SDS-PAGE를 사용하여 수집하고 보관하였다.
IL-15 융합 단백질에 대한 크기 배제 크로마토그래피:
높은 순도를 갖는 목적하는 생성물을 수득하기 위해서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 중에 수득된 생성물을 한외여과에 의해 농축시키고 예를 들어 GE 슈퍼덱스(Superdex)200 젤을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 위해 로딩하여 가능한 중합체 및 다른 성분들을 제거하였다. 상기 수득된 단백질의 순도를 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의해 검출할 수 있다. 단백질 농도를 UV 분광광도측정에 의해 측정하였다.
시험 실시예
시험 실시예 1. 시험관내에서 PBMC 증식 분석
신선한 PBMC(인간 말초 혈액 단핵세포, 샹하이 혈액 센터)를, 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지(써모 피셔 케미칼 프로덕츠 캄파니 리미티드(Thermo Fisher Chemical Products Co., Ltd)(중국 베이징 소재), Cat No. SH30809.01B)에서 배양시키고, 원심분리하고 5x105 세포/㎖의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 90 ul을 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하였다. 샘플을 PBS에 의해 상이한 농도로 수회 희석하였다. 10 ul을 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하고 37 ℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양기에서 배양하였다. 그 후에, 50 ㎕를 셀티터 글로(CellTiter-Glo)(등록상표) 발광성 세포 생육성 분석 키트로 세포 증식의 검출을 위해 취하였다.
시험관내 PBMC 증식 분석에서 본 발명의 단백질 복합체 1 및 3의 활성의 검출 결과
샘플 EC50 (ng/ml) 세포의 상대적인 활성
IL-15 3.115 100
1 0.634 491
3 0.047 6627
표 5는 시험관내 PBMC 증식 분석에서 대조용 IL-15에 대한 본 발명의 단백질 복합체 1 및 3의 활성의 검출 결과를 나타내며, 이는 본 출원의 단백질 복합체 1 및 3이 대조용 IL-15에 비해 PBMC의 증식 활성을 현저하게 개선시켰음을 가리킨다. 상기 실험에서, 단백질 복합체 1에 의해 자극된 활성은 약 5배까지 증가된 반면, 단백질 복합체 3에 의해 자극된 활성은 약 66배 개선되었다.
시험 실시예 2. 시험관내에서 Mo7e 증식 분석
1. 주요 물질
Mo7e(인간 거핵세포 백혈병 세포주)를 북경협화의대로부터 구입하였다;
IL-15를 노보프로테인(Novoprotein)으로부터 구입하였고, Cat No. C016, IL-15 유사체를 사내 제조로부터 수득하였다;
세포 계수 키트-8(CCK-8)을 WST로부터 구입하였다, Cat No. EX660;
GM-CSF를 노보프로테인으로부터 구입하였다, Cat No. CC79.
2. 과정
1) Mo7e를 37 ℃(5% CO2)에서 배양기 중에서 변형된 RPMI-1640 배지(2.05 mM L-글루타민, 10% FBS 및 15 ng/㎖ GM-CSF 함유)에서 배양하였다;
2) 양호한 상태의 Mo7e 세포를 실온, 150xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 상등액은 버렸다;
3) 상기 세포 펠릿을 GM-CSF-부재 배지로 2회 세척하고 이어서 카운트하였다;
4) 세포 농도를 조절하고 2x104/웰의 세포수 및 90 ㎕(GM-CSF-부재)의 부피로 96-웰 플레이트에 도말하고, 배양을 위해 세포 배양기에서 유지시켰다;
5) IL-15 및 그의 유사체를 PBS로 4회 희석하고, 96-웰 플레이트에서 세포를 2시간 배양 후에 10 ㎕/웰을 상기 세포 배양 시스템에 가하였다. 각각의 농축을 3회 반복하고, 블랭크 웰(단지 PBS만 첨가됨)을 대조용으로서 사용하였다;
6) 세포 플레이트를 3일 동안 배양기에서 배양하였다;
7) 모든 시험 웰에 10 ul의 CCK-8을 가하고, 배양기에서 3시간 동안 배양하였다;
8) 450 ㎚에서 흡광도(OD450)를 검출하였다.
시험관내 Mo7e 세포 증식 분석에서 단백질 복합체 1-4의 결과
샘플 EC50(nM)-Mo7e 세포의 상대적인 활성
IL-15 15.5 100
1 0.42 3690
2 1.21 1281
3 0.07 22142
4 0.09 17222
표 6은 시험관내 Mo7e 세포 증식 분석에서 대조용 IL-15에 대한 단백질 복합체 1-4의 비교를 나타내며, 이는 단백질 복합체 1-4가 대조용 IL-15에 비해 증식 활성을 현저하게 개선시켰고, 복합체 3 및 4에 의해 자극된 증식 활성이 단백질 복합체 1 및 2에 의해 자극된 경우보다 현저하게 더 높았음을 가리킨다.
시험 실시예 3. 마우스 폐 전이 모델
1. 동물 시험 과정
32마리의 C57BL/6 마우스(SPF, 샹하이 슈퍼 B&K 레보라토리 애니멀 코포레이션 리미티드(Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp. Ltd.))를 각각 마우스 8마리씩 4개의 그룹으로 나누었다. 1.5x105의 B16F10 세포를 꼬리-정맥을 통해 마우스에게 정맥내 주사하였다(세포 자원 센터, 샹하이 생물과학 연구소, 중국 과학원, TCM36). PBS, 2 ㎍의 IL-15 및 5 ㎍ 또는 15 ㎍의 단백질 복합체 3을 1일째에 마우스에게 복강내 주사하였다. 2 내지 3일마다 1회 체중 측정하고, 각 그룹으로부터 마우스 한 마리를 14일째에 죽이고, 폐 전이를 관찰하였다. 모든 마우스를 16일째에 죽였다. 모든 마우스의 폐를 제거하여 칭량하고, 검은색 폐 덩어리를 관찰하고 사진촬영하였으며, 이어서 상기 폐를 포름알데하이드 중에 고정시키고 검은색 덩어리의 수를 카운트하였다.
2. 결과
PBS 그룹에서 마우스의 폐는 다수의 전이성 흑색종 성장(73±43)을 나타내었다. IL-15 그룹의 폐는 다수의 흑색종 덩어리를 나타내었으며(65±29), 이는 PBS 그룹에서의 경우의 약 90%이다. 단백질 복합체 3 내지 5 ㎍ 그룹의 폐는 흑색종 덩어리의 부분 전이를 나타내었으며(30±16), 이는 PBS 그룹에서의 경우의 약 41%이다. 단백질 복합체 3 내지 15 ㎍ 그룹의 폐는 흑색종 덩어리의 부분 전이를 나타내었으며(24±13), 이는 PBS 그룹에서의 경우의 약 33%이다.
B16F10 마우스 모델에서, 단백질 복합체 3의 효능은 도 8에 도시된 바와 같이, IL-15의 경우보다 현저하게 더 우수하였다.
PBS 그룹에서 상대적인 폐 중량은 도 9에 도시된 바와 같이, 단백질 복합체 3 그룹의 경우보다 현저하게 더 높았다.
상기 투여 동안 각 그룹에서 현저한 체중 감소는 관찰되지 않았으며, 이는 상기 투여 용량이 도 10에 도시된 바와 같이 현저한 독성을 갖지 않음을 암시한다.
또 다른 투여 그룹에 대한 또 다른 B16F10 마우스 모델 실험에서, 우리는 단백질 복합체 3의 용량을 0.5 ug/마우스로 감소시켰을 때 현저한 항-종양 활성을 관찰한 반면, 최대 허용 용량이 30 ug/마우스였을 때 명백한 비정상적인 증상은 관찰되지 않았다.
요약하면, 단백질 복합체 3은 마우스 폐에서 B16F10 세포의 전이를 억제하였으며, 용량-의존적인 효과를 갖고 양호한 안전성 창을 갖는다.
시험 실시예 4. 마우스 피하 종양 모델
1. 동물 시험 과정
1.1 마우스를 5일 동안 실험실 환경에 적응시켰다.
1.2 종양 세포 이식
C57BL/6 마우스(SPF, 샹하이 시 푸어 베이 카이(Shanghai Xi Puer Bei Kai) 실험 동물 캄파니 리미티드)를 B16F10 세포(5x106/마우스)로 우측 늑골에 피하 접종하였다. 종양이 7일 동안 성장하였다. 종양 부피가 160±40 ㎜3까지 성장했을 때, 동물을 각 그룹에 마우스 7마리씩 4개의 그룹으로 무작위로 나누었다(d0).
1.3 투여 용량 및 방법
각 그룹에 PBS, 또는 IL-15(2 ㎍), 또는 단백질 복합체 3(5 ㎍) 또는 단백질 복합체 3(15 ㎍)과 함께 시험 약물을 1일 및 5일째에 1회(총 2회) 복강내 주사하였다. 마우스를 2일마다 종양 부피 및 체중에 대해 측정하고 데이터를 기록하였다.
1.4 통계
엑셀 통계 소프트웨어: 평균값은 avg로서 계산되고; SD는 STDEV로서 계산되며; SEM은 STDEV/SQRT로서 계산되고; 상이한 그룹들간의 P값은 TTEST로서 계산된다.
종양 부피(V)는 V = 1/2xL길이xL짧은 2
상대 부피(RTV) = VT/V0
종양 억제율(%) = (CRTV-TRTV)/CRTV(%)로서 계산된다.
V0 및 VT는 각각 실험의 시작 및 실험의 끝에서 종양 부피를 나타낸다. CRTV 및 TRTV는 각각 실험의 끝에서 블랭크 대조용 그룹(PBS) 및 시험 그룹의 상대적인 종양 부피를 나타낸다.
2. 결과
상기 이식된 B16F10 세포 종양은 매우 빠르게 성장하였기 때문에, 상기 실험을 9일째에 중단하였다. B16F10 종양에 대한 IL-15 단백질의 성장 억제 효과를 표 1에 나타내었다. 각각 1일 및 5일째에 1회-용량 투여 후, IL-15는 9일째에 이식된 B16F10 세포 종양의 성장을 억제하지 못했다. 그러나, 상기 단백질 복합체 3 내지 5 ㎍ 그룹 및 3 내지 15 ㎍ 그룹에서 억제율은 각각 30% 및 73%였으며, 여기에서 상기 단백질 복합체 3 내지 15 ㎍은 상기 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있었다.
결론적으로, 상기 단백질 복합체 3은 본 연구에서 B16F10 이종이식편의 성장 억제에 대해 효과가 있으며, 명백히 용량-의존적인 효과를 갖는다(표 7을 참조하시오).
마우스에서 B16F10 이종이식편에 대한 투여된 단백질의 치료 효과
그룹 투여 경로 평균 종양 부피 (mm3) 평균 종양 부피 (mm3) 상대적인 종양 부피 D28 억제율% p
(vs 블랭크)
D1 SEM D9 SEM D28 SEM
PBS d1/5 i.p. 162.39 16.32 2703.46 393.15 16.32 2.18 　
IL-15-2㎍ d1/5 i.p. 161.74 16.64 3219.01 644.69 18.32 2.99 -12% 0.60
3-5㎍ d1/5 i.p. 168.26 19.22 1892.20 315.12 11.47 1.58 30%** 0.10
3-15㎍ d1/5 i.p. 168.30 19.17 824.38 170.63 4.48 0.61 73%** 0.00
**: p<0.01, vs PBS
시험 실시예 5. 단백질 복합체의 대사 반감기의 측정
1. 동물 시험 과정
상기 SD 래트(n = 2, 시푸어-비카이(Sipur-Bikai) 실험 동물 캄파니 리미티드에 의해 제공됨)에게 밤새 금식 후 188 ㎍/㎏의 용량 및 5 ㎖의 부피로 복강내 주사를 통해 투여하였다. 0.2 ㎖ 혈액 샘플을 투여 전후 및 0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 11h, 24h, 48h, 72h 및 96h에서 래트 안와 정맥총을 통해 채혈하였다. 상기 혈액 샘플을 튜브에 채집하고 4 ℃에서 30분 동안 튜브에서 유지시키고, 이어서 3500 rpm에서 10분 동안 원심분리시키고 혈청을 단리하였다. -80 ℃에서 보관하였다. 상기 래트에게 2시간 후에 먹이를 공급하였다.
2. 결과
래트 혈청 중 단백질 복합체 3을 항-IL-15 항체가 코팅된 ELISA 플레이트에 의해 포착하였다. 항-인간 IgG Fc 항체를 사용하여 농도 곡선을 검출하였으며, 래트에서 측정된 단백질 복합체3의 생체내 반감기는 약 13.7h였다(도 10). 상기 IL-15의 생체내 반감기는 1h 미만이며(J Immunol 2006; 177:6072-6080), 이는 상기 단백질 복합체3이 생체내에서 현저하게 연장된 반감기를 가짐을 가리킨다.
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO. LTD SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.LTD <120> INTERLEUKIN 15 PROTEIN COMPLEX AND USE THEREOF <130> 750038CTCP <150> CN 201410799889.4 <151> 2014-12-19 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15(L52C) <400> 2 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 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Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro 115 120 125 Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr 130 135 140 Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys 180 185 190 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 195 200 205 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 210 215 220 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 225 230 235 240 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 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Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile 245 250 255 Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn 260 265 270 Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val 275 280 285 Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys 290 295 300 Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser 305 310 315 320 Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro 325 330 335 Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala 340 345 350 Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys 355 360 365 Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His 370 375 380 Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser 385 390 395 400 Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr 405 410 415 Thr <210> 7 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15R alpha-(Sushi+,S40C)-Fc <400> 7 Ile Thr 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actggctcaa cgggaaggag tataagtgca aggtgtctaa caaggcactg 960 cccgcaccca tcgagaagac catttctaag gccaagggtc aaccacggga gccacaggtt 1020 tacacattgc ctcccagtcg ggaggagatg acaaagaatc aagtgtcact tacatgtctt 1080 gtgaagggct tctacccctc agacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg acaaccagaa 1140 aacaactaca agaccacacc tcctgtgctc gattcagatg gttccttttt cttgtacagc 1200 aaactcaccg ttgacaagag tcggtggcag caaggaaatg tgttcagctg ttctgtgatg 1260 cacgaggccc tgcacaacca ttatacccaa aaatctctca gcctttctcc cggcaagtga 1320 1320 <210> 12 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-IL-15R alpha-ECD vector sequence <400> 12 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120 ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180 agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240 aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300 gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360 ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420 aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480 agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540 ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600 acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660 aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720 aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780 ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840 atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900 tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct ccagcctgac cgagtgcgtg 960 ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020 cctgccctgg ttcaccaacg cccagcgcca ccatccacag taaccactgc aggcgtgacc 1080 ccacagccag agagcctctc cccttctggc aaagagccag cagcttcatc tccaagctca 1140 aacaacacag cggccacaac agcagctatt gtcccgggct cccagctgat gccttcaaaa 1200 tcaccttcca caggcaccac agagatcagc agtcatgagt cctcccacgg caccccatct 1260 cagacaacag ccaagaactg ggaactcaca gcatccgcct cccaccagcc gccaggtgtg 1320 tatccacagg gccacagcga caccacttga 1350 <210> 13 <211> 1015 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15R alpha-shushi+(73)-Fc vector sequence <400> 13 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120 tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180 acctccagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240 ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcggcgg aggaggctct 300 gggggcggag gaagcgaacc taagtcctct gataagaccc acacatgtcc cccctgccca 360 gctcctgagc tcttgggcgg accttccgtg tttctgttcc ccccaaagcc caaggatacc 420 cttatgatca gcagaacacc cgaagttact tgcgtggtcg tggacgtttc tcacgaagat 480 cctgaagtga aattcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc taagactaag 540 ccccgtgaag agcagtacaa ctctacctac cgggtcgttt cagtgctgac tgttctccat 600 caggactggc tcaacgggaa ggagtataag tgcaaggtgt ctaacaaggc actgcccgca 660 cccatcgaga agaccatttc taaggccaag ggtcaaccac gggagccaca ggtttacaca 720 ttgcctccca gtcgggagga gatgacaaag aatcaagtgt cacttacatg tcttgtgaag 780 ggcttctacc cctcagacat cgccgtggag tgggagagca acggacaacc agaaaacaac 840 tacaagacca cacctcctgt gctcgattca gatggttcct ttttcttgta cagcaaactc 900 accgttgaca agagtcggtg gcagcaagga aatgtgttca gctgttctgt gatgcacgag 960 gccctgcaca accattatac ccaaaaatct ctcagccttt ctcccggcaa gtgac 1015 <210> 14 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-IL-15R alpha-shushi+(73)vector sequence <400> 14 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120 ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180 agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240 aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300 gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360 ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420 aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480 agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540 ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600 acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660 aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720 aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780 ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840 atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900 tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct ccagcctgac cgagtgcgtg 960 ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020 cctgccctgg ttcaccaacg ctga 1044 <210> 15 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15(L52C)vector sequence <400> 15 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcaact gggtgaatgt aattagtgat ttgaaaaaaa ttgaagatct tattcaatct 120 atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc acccgagttg caaagtaaca 180 gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcat gtgagtccgg cgatgcaagt 240 attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ttagcaaaca acagtttgtc ttctaatggg 300 aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa 360 tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca acacttcttg a 411 <210> 16 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15R alpha-ECD(S40C)-Fc vector sequence <400> 16 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120 tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180 acctgcagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240 ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcccagc gccaccatcc 300 acagtaacca ctgcaggcgt gaccccacag ccagagagcc tctccccttc tggcaaagag 360 ccagcagctt catctccaag ctcaaacaac acagcggcca caacagcagc tattgtcccg 420 ggctcccagc tgatgccttc aaaatcacct tccacaggca ccacagagat cagcagtcat 480 gagtcctccc acggcacccc atctcagaca acagccaaga actgggaact cacagcatcc 540 gcctcccacc agccgccagg tgtgtatcca cagggccaca gcgacaccac tggcggagga 600 ggctctgggg gcggaggaag cgaacctaag tcctctgata agacccacac atgtcccccc 660 tgcccagctc ctgagctctt gggcggacct tccgtgtttc tgttcccccc aaagcccaag 720 gataccctta tgatcagcag aacacccgaa gttacttgcg tggtcgtgga cgtttctcac 780 gaagatcctg aagtgaaatt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca caatgctaag 840 actaagcccc gtgaagagca gtacaactct acctaccggg tcgtttcagt gctgactgtt 900 ctccatcagg actggctcaa cgggaaggag tataagtgca aggtgtctaa caaggcactg 960 cccgcaccca tcgagaagac catttctaag gccaagggtc aaccacggga gccacaggtt 1020 tacacattgc ctcccagtcg ggaggagatg acaaagaatc aagtgtcact tacatgtctt 1080 gtgaagggct tctacccctc agacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg acaaccagaa 1140 aacaactaca agaccacacc tcctgtgctc gattcagatg gttccttttt cttgtacagc 1200 aaactcaccg ttgacaagag tcggtggcag caaggaaatg tgttcagctg ttctgtgatg 1260 cacgaggccc tgcacaacca ttatacccaa aaatctctca gcctttctcc cggcaagtga 1320 1320 <210> 17 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-IL-15R alpha-ECD(S40C)vector sequence <400> 17 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120 ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180 agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240 aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300 gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360 ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420 aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480 agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540 ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600 acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660 aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720 aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780 ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840 atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900 tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct gcagcctgac cgagtgcgtg 960 ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020 cctgccctgg ttcaccaacg cccagcgcca ccatccacag taaccactgc aggcgtgacc 1080 ccacagccag agagcctctc cccttctggc aaagagccag cagcttcatc tccaagctca 1140 aacaacacag cggccacaac agcagctatt gtcccgggct cccagctgat gccttcaaaa 1200 tcaccttcca caggcaccac agagatcagc agtcatgagt cctcccacgg caccccatct 1260 cagacaacag ccaagaactg ggaactcaca gcatccgcct cccaccagcc gccaggtgtg 1320 tatccacagg gccacagcga caccacttga 1350 <210> 18 <211> 1015 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15R alpha-shushi+(73)(S40C)-Fc vector sequence <400> 18 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120 tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180 acctgcagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240 ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcggcgg aggaggctct 300 gggggcggag gaagcgaacc taagtcctct gataagaccc acacatgtcc cccctgccca 360 gctcctgagc tcttgggcgg accttccgtg tttctgttcc ccccaaagcc caaggatacc 420 cttatgatca gcagaacacc cgaagttact tgcgtggtcg tggacgtttc tcacgaagat 480 cctgaagtga aattcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc taagactaag 540 ccccgtgaag agcagtacaa ctctacctac cgggtcgttt cagtgctgac tgttctccat 600 caggactggc tcaacgggaa ggagtataag tgcaaggtgt ctaacaaggc actgcccgca 660 cccatcgaga agaccatttc taaggccaag ggtcaaccac gggagccaca ggtttacaca 720 ttgcctccca gtcgggagga gatgacaaag aatcaagtgt cacttacatg tcttgtgaag 780 ggcttctacc cctcagacat cgccgtggag tgggagagca acggacaacc agaaaacaac 840 tacaagacca cacctcctgt gctcgattca gatggttcct ttttcttgta cagcaaactc 900 accgttgaca agagtcggtg gcagcaagga aatgtgttca gctgttctgt gatgcacgag 960 gccctgcaca accattatac ccaaaaatct ctcagccttt ctcccggcaa gtgac 1015 <210> 19 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-IL-15R alpha -shushi+(73)(S40C)vector sequence <400> 19 atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60 cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120 ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180 agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240 aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300 gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360 ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420 aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480 agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540 ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600 acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660 aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720 aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780 ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840 atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900 tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct gcagcctgac cgagtgcgtg 960 ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020 cctgccctgg ttcaccaacg ctga 1044 <210> 20 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc fragment,IgG1-Fc <400> 20 gaacctaagt cctctgataa gacccacaca tgtcccccct gcccagctcc tgagctcttg 60 ggcggacctt ccgtgtttct gttcccccca aagcccaagg atacccttat gatcagcaga 120 acacccgaag ttacttgcgt ggtcgtggac gtttctcacg aagatcctga agtgaaattc 180 aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgctaaga ctaagccccg tgaagagcag 240 tacaactcta cctaccgggt cgtttcagtg ctgactgttc tccatcagga ctggctcaac 300 gggaaggagt ataagtgcaa ggtgtctaac aaggcactgc ccgcacccat cgagaagacc 360 atttctaagg ccaagggtca accacgggag ccacaggttt acacattgcc tcccagtcgg 420 gaggagatga caaagaatca agtgtcactt acatgtcttg tgaagggctt ctacccctca 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaacgga caaccagaaa acaactacaa gaccacacct 540 cctgtgctcg attcagatgg ttcctttttc ttgtacagca aactcaccgt tgacaagagt 600 cggtggcagc aaggaaatgt gttcagctgt tctgtgatgc acgaggccct gcacaaccat 660 tatacccaaa aatctctcag cctttctccc ggcaag 696

Claims (24)

  1. 용해성 융합 단백질 I 및 용해성 융합 단백질 II로 이루어지는 IL-15 단백질 복합체로;
    상기 용해성 융합 단백질 I이 IL-15 폴리펩티드이고; 상기 용해성 융합 단백질 II가 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이며, 상기 IL-15Rα 폴리펩티드의 기능성 단편은 인간 인터류킨 15 수용체 α 활성을 갖는 스시 도메인을 포함하는 IL-15Rα의 세포외 도메인 단편의 단축된 형태이고;
    상기 용해성 융합 단백질 I 또는 상기 용해성 융합 단백질 II가 하나의 아미노산 돌연변이로부터 생성된 시스테인를 포함하고, 상기 용해성 융합 단백질 II 및 상기 용해성 융합 단백질 I 중에 존재하는 상응하는 시스테인의 짝짓기에 의해 다이설파이드 결합이 형성되며,
    아미노산 시스테인 돌연변이가 IL-15 폴리펩티드의 L52에서 발생하고; 아미노산 시스테인 돌연변이가 IL-15Rα 폴리펩티드의 S40에서 발생하고,
    용해성 융합 단백질 I이 Fc 단편 또는 그의 돌연변이체에 공유 결합되고,
    용해성 융합 단백질 II가 Fc 단편 또는 그의 돌연변이체에 공유 결합되고,
    용해성 융합 단백질 II가 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편 및 Fc 단편의 재조합에 의해 구성되고,
    상기 IL-15Rα 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이 Fc 단편의 N-말단에 부착되고,
    상기 Fc 단편은 서열번호 9에 나타내고,
    상기 IL-15 단백질 복합체는 하기 용해성 융합 단백질 I 및 용해성 융합 단백질 II의 조합 중에서 선택되는 IL-15 단백질 복합체:
  2. 제 1 항에 따른 IL-15 단백질 복합체를 암호화하는 핵산.
  3. 제 2 항에 따른 핵산을 포함하는 DNA 벡터.
  4. 제 3 항에 따른 DNA 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 제 1 항에 따른 IL-15 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    제 4 항에 따른 숙주 세포를 제 1 항에 따른 IL-15 단백질 복합체의 발현에 충분한 조건하에서 배양하고;
    상기 IL-15 단백질 복합체를 발현 및 정제함
    을 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 따른 IL-15 단백질 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 IL-15-매개된 질병 또는 질환의 치료용 약학 조성물에 있어서,
    상기 질병 또는 질환이 감염성 질병, 암, 혈액 질병, 염증성 질병 및 자가면역 질병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 암이 흑색종, 결장직장암, 피부암, 림프종, 신세포 암종, 간암, 폐암, 위암 및 유방암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    상기 감염성 질병이 두창 바이러스 감염, HIV 감염, 세균 감염, 진균 감염 및 HBV 감염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    상기 혈액 질병이 빈혈, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 T-세포 대형 과립 림프구성 백혈병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    상기 자가면역 질병이 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염, 위염 및 점막염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는
    약학 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    약학 조성물이 소분자 억제제 또는 항체 약물과 함께 투여되는 약학 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 소분자 억제제가 표적 화학요법 또는 방사선요법제 중에서 선택되고; 상기 항체 약물이 항-CD20, 항-PD1, 항-PDL1, 항-Her2, 항-EGFR 및 항-c-MET 항체 중에서 선택되는 약학 조성물.
  10. 삭제
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