[go: up one dir, main page]

KR102603729B1 - Jak 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Jak 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102603729B1
KR102603729B1 KR1020217008505A KR20217008505A KR102603729B1 KR 102603729 B1 KR102603729 B1 KR 102603729B1 KR 1020217008505 A KR1020217008505 A KR 1020217008505A KR 20217008505 A KR20217008505 A KR 20217008505A KR 102603729 B1 KR102603729 B1 KR 102603729B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
pharmaceutically acceptable
formula
group
compounds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020217008505A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210049858A (ko
Inventor
웨이웨이 마오
웨뉴안 찌안
주에지안 젱
구오핑 후
창칭 웨이
지안 리
슈휘 첸
Original Assignee
주하이 유나이티드 라보라토리즈 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주하이 유나이티드 라보라토리즈 컴퍼니 리미티드 filed Critical 주하이 유나이티드 라보라토리즈 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20210049858A publication Critical patent/KR20210049858A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102603729B1 publication Critical patent/KR102603729B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

JAK 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물 및 JAK1 또는/및 TYK2 관련된 질병을 치료하기 위한 약물 제조에 이의 응용이 개시된다. 구체적으로, 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물, 또는 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

Description

JAK 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-A]피리딘 화합물 및 이의 용도
본 출원은 JAK 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물, 뿐만 아니라 JAK1 또는/및 TYK2와 관련된 질병을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 화학식 (I)의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원서는 2018 년 8월 23일에 제출된 중국 출원 일련 번호 CN201810968207.6의 우선 혜택을 주장한다.
야누스 키나아제(Janus kinase, JAK)는 염증, 자가 면역 질환, 증식성 질환, 이식 거부, 연골 회전 장애와 관련된 질환, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과분비와 관련된 질환과 관련된 티로신 키나제(tyrosine kinase) 계열에 속한다. 본 출원은 상기 화합물, 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물의 제조 방법, 본 출원에 따른 화합물을 투여함으로써 염증, 자가 면역 질환, 증식성 질환, 이식 거부, 연골 회전 장애와 관련된 질환, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6 과분비와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 더 제공한다.
야누스 키나아제 (JAK)는 막 수용체에서 STAT 전사 인자로 사이토 카인 신호를 매개하는 세포질 티로신 키나아제다. JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 네 가지 유형의 JAK 키나제가 기존 기술에 설명되어 있다. 사이토 카인이 수용체와 결합되면, JAK 키나제 패밀리의 구성원은 서로 자가인산화 및/또는 트랜스인산화되고, 그런 다음 STAT가 인산화되고, 다음 핵으로 이동하여 전사를 조절한다. JAK STAT 세포내 신호 전달은 인터페론, 대부분의 인터루킨 및 EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM CSF 및 PRL과 같은 다양한 사이토 카인 및 내분비 인자에 적용할 수 있다(Vainchenker W.et al. (2008)).
유전학 모델과 저분자 JAK 억제제의 조합에 대한 연구는 JAK의 몇 가지 치료 효능을 보여준다. JAK3는 마우스와 인간 유전학에 의해 면역 억제 표적으로 확인되었다(O'Shea J. et al. (2004)). JAK3 억제제는 임상 개발에 성공적으로 사용되어 처음에는 이식 거부에 사용되었으며 나중에 류마티스 관절염(RA), 건선 및 크론 병(http://clinicaltrials.gov/)과 같은 다른 면역 염증 질환에 사용된다. 마우스에 대한 유전학 및 유전자 녹아웃 연구(Levy D. and Loomis C. (2007))에 의해 TYK2가 면역 염증의 잠재적 표적이라는 것이 입증되었다. JAK1은 면역 염증 질환 분야의 새로운 표적이다. JAK1은 형질 도입 세포질 신호에 의해 유도되는 전 염증 신호로 형질 도입하기 위해 다른 JAK와 이종이합체화 된다.
US2009220688은 갈라파고스에서 개발한 류마티스 관절염 치료에 사용되는 임상 3상 약물인, 필고티닙(Filgotinib)을 공개했다.
*본 출원은 화학식 (I)의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
여기서,
E1 및 E2는 단일 결합, -CH2- 또는 -(CH2)2-에서 독립적으로 선택되고;
L1은 단일 결합, -(CH2)g-, -C(=O)- 또는 -C(=O)-(CH2)h-에서 선택되고;
m은 1 또는 2이고;
n은 1 또는 2이고;
g는 1, 2 또는 3이고;
h는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, CN, C1-6 알킬기 또는 3~6-원 사이클로알킬기에서 선택되며, 여기서 상기 C1-6 알킬기 및 3~6-원 사이클로알킬기는 1, 2 또는 3 Ra로 선택적으로 치환되고;
R2는 H, F, Cl, Br, I 또는 C1-3 알킬기에서 선택되며, 여기서 상기 C1-3 알킬기는 1, 2 또는 3 Rb로 선택적으로 치환되고;
R3, R4 및 R5는 H, F, Cl, Br, I 또는 C1-3 알킬기에서 독립적으로 선택되며, 상기 C1-3 알킬 그룹은 1, 2 또는 3 Rc로 선택적으로 치환되고;
R6, R7 및 R8은 H, F, Cl, Br, I 또는 C1-3 알킬기에서 독립적으로 선택되며, 상기 C1-3 알킬 그룹은 1, 2 또는 3 Rd로 선택적으로 치환되고;
각각의 Ra는 H, F, Cl, Br, I, CN 또는 C1-3 알킬기에서 독립적으로 선택되며, 상기 C1-3 알킬기는 1, 2 또는 3 R로 선택적으로 치환되고;
각각의 Rb는 F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Rc는 F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Rd는 F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고;
각 R은 F, Cl, Br 또는 I에서 독립적으로 선택된다.
본 출원의 일부 실시예에서, 각각의 상기 Ra는 H, F, Cl, Br, I 또는 CN으로부터 독립적으로 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 R1은 H, CN, C1-3 알킬기 또는 3~5-원 사이클로알킬기로부터 선택되고, 여기서 C1-3 및 3~5-원 사이클로알킬기는 1, 2 또는 3 개의 Ra로 선택적으로 치환되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 R1은 H, CN, CH3, , 또는 로부터 선택되며, 여기서 CH3, , 및 는 1, 2 또는 3개의 Ra로 선택적으로 치환되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 R1은 H, CN, CF3, CHF2, , , , 또는 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 R2는 H, F, Cl, Br 또는 I로부터 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 R3, R4 및 R5는 H, F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 R6, R7 및 R8 는 H, F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 L1은 단일 결합, -CH2-, -(CH2)2-, -C(=O)- 또는 -C(=O)-(CH2)- 로부터 독립적으로 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 구조 단위는 , , , 또는 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 구조 단위는 , , , , , , , , , 또는 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 단위는, , , , , , , , 또는 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 구조 단위는 , , , , , , , , , , , , , , , , 또는 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 출원에서 정의된 바와 같다.
상기 변수 중 어느 것으로부터 결합된 일부 실시예가있다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 화학식 (I)의 화합물, 그의 이성질체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은,
로부터 선택되고,
여기서,
L1, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 화학식 (I)의 화합물, 그의 이성질체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은,
여기서,
L1, Ra, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 본 출원에서 정의된 바와 같다.
본 출원은 하기 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 더 제공한다:
.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 화학식 (I)의 화합물, 그의 이성질체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은,
로부터 선택된다.
본 출원은 치료학적 유효량의 상기 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 약학적으로 허용되는 이의 담체를 활성 성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 더 제공한다.
본 출원은 또한 JAK1 및/또는 TYK2와 관련된 질병을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 약제학적 조성물의 용도를 더 제공한다.
본 출원의 일부 실시예에서, 상기 용도는 상기 약물이 류마티스 관절염 치료용 약물인 것을 특징으로 한다.
본 출원의 다양한 화합물은 4 개의 JAK 키나아제 아형 (JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2)의 시험관 내 테스트에서 JAK1 및/또는 TYK2에 대한 우수한 선택적 억제 효과를 나타냈고, 이들 화합물은 약동학 실험에서 높은 노출 및 우수한 경구 생체이용도을 나타내며, 이는 우수한 생체 내(in vivo) 효능을 생성하는 데 유리하다.
도 1. 관절염이 있는 마우스(mouse)의 평균 임상 점수.
도 2. 투여 기간에 곡선 아래 면적(AUC)으로 계산된 마우스(mouse)의 관절염 억제율(inhibition rate).
도 3. 투여 기간에 마우스(mouse)의 관절염 발병률(incidence rate).
도 4. 관절염이 있는 마우스(mouse)의 체중 변화.
도 5. 관절염에 대한 임상 점수 비율.
도 6. 관절염에 대한 발 부피 변화 곡선 비율.
도 7. 관절염에 대한 체중 변화 곡선 비율.
달리 명시되지 않는 한, 문맥상의 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 나타낸다. 특별한 정의가없는 특정 용어나 문구는 불확실하거나 불명확한 것으로 간주되어서는 안되며, 일반적인 의미로 간주되어야 한다. 문맥에서 상호가 언급될 때 그것은 그 제품 또는 활성 성분을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 신뢰할 수 있는 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 의미한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 출원에서 발견된 특정 치환기 및 비교적 무독성인 산 또는 염기로부터의 화합물에 의해 제조된, 본 출원에서 화합물의 염을 의미한다. 본 출원의 화합물에 비교적 산성 작용기가 있는 경우, 알칼리 부가 염은 그러한 화합물의 중성 형태를 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 알칼리와 접촉시켜 제조할 수 있다. 약학적으로 허용되는 알칼리 부가 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민 또는 마그네슘 염 등을 포함한다. 본 출원의 화합물이 비교적 알칼리성 작용기를 함유하는 경우, 이러한 화합물의 중성 형태를 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 산과 접촉시켜 산 부가 염을 제조 할 수있다. 약학적으로 허용되는 산 부가 염의 예로는 염산, 브롬화 수소산, 질산, 탄산, 중탄산, 인산, 일수소 인산염, 이수소 인산염, 황산, 수소 황산염, 요오드화 수소산, 아인산, 등을 포함하는 무기산으로부터 유도된 염; 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 옥탄디오익산, 푸마르산, 젖산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, 파라-톨루엔설폰산, 구연산, 타르타르산, 메탄설폰산 등을 포함하는 유기산으로부터 유도된 염; 및 아미노산 (예를 들어, 아르기닌)으로부터 유도된 염, 및 글루쿠론산 등과 같은 유기산으로부터의 염을 포함한다. 본 출원에서 일부 특정 화합물은 알칼리성 및 산성 작용기를 포함하므로 임의의 알칼리 또는 산 부가 염으로 번역될 수 있다.
본 출원에서 제약 상 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 산 라디칼 또는 염기성 그룹을 갖는 모 화합물로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염을 제조하는 방법은 유리 산 또는 염기 형태의 이들 화합물을 물 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물에서 적절한 화학 양론적 염기 또는 산과 반응시켜 이들을 제조하는 것을 포함한다.
본 출원에서 화합물은 특정 기하 이성질체 또는 입체 이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 본 출원에서 구상되는 화합물은 시스-및 트랜스-이성질체, (-)-및 (+)-거울상 이성질체, (R)-및 (S)-거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 뿐만 아니라 이들의 라세미 혼합물 및 거울상 이성질체 및 부분 입체 이성질체의 혼합물과 같은 기타 혼합물은 모두 본 출원의 범위에 포함된다. 다른 비대칭 탄소 원자는 알킬기와 같은 치환기에 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 출원의 범위에 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "거울상 이성질체" 또는 "광학 이성질체"는 서로 거울상인 입체 이성질체이다.
달리 언급되지 않는 한, "시스-트랜스-이성질체" 또는 "기하학적 이성질체"라는 용어는 고리 형성 탄소 원자의 이중 결합 또는 단일 결합이 자유롭게 회전할 수 없기 때문에 형성된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "부분 입체 이성질체"는 둘 이상의 키랄 중심을 갖고 분자 사이에 거울상 관계가없는 입체 이성질체인 분자를 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "(D)"또는 "(+)"는 오른손 회전을, "(L)"또는 "(-)"는 왼손 회전을, "(DL)"또는 "(±) ”는 라세믹을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 쐐기 형 풀 라인 본드 () 및 쐐기 형 점선 본드 ()는 입체 중심의 절대 구성을 나타내고, 직선 실선 본드 () 및 직선 점선 ()은 입체 중심의 상대적 구성을 나타내고, 물결 선 ()은 쐐기 형 실선 본드 () 또는 쐐기 형 점선 본드 ()를 나타내거나, 또는 물결 선 ()은 직선 실선 본드 ()와 직선 점선 ()을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 화합물에 C=C 이중 결합, C=N 이중 결합 및 N=N 이중 결합과 같은 이중 결합이 있고, 이중 결합의 원자가 두 개의 다른 치환기(질소 원자를 포함하는 이중 결합에서 질소 원자에 있는 한 쌍의 단일 전자는 연결된 치환기로 간주된다)에 연결되어 있을 때, 화합물의 이중 결합에 있는 원자가 물결 선 ()으로 치환기에 연결되어 있으면, (Z) 이성질체, (E) 이성질체 또는 두 화합물의 혼합물로 간주된다. 예를 들어,하기 화학식 (A)는 화합물이 화학식 (A-1) 또는 화학식 (A-2)의 단일 이성질체, 또는 화학식 (A-1) 및 화학식 (A-2)의 두 이성질체의 혼합물로 존재함을 나타낸다. 하기 화학식 (B)는 화합물이 화학식 (B-1) 또는 화학식 (B-2)의 단일 이성질체, 또는 화학식 (B-1) 및 화학식 (B-2)의 두 이성질체의 혼합물 형태로 존재함을 나타낸다. 하기 화학식 (C)는 화합물이 화학식 (C-1) 또는 화학식 (C-2)의 단일 이성질체, 또는 화학식 (C-1) 및 화학식 (C-2)의 두 이성질체의 혼합물 형태로 존재함을 나타낸다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "호변 이성질체(tautomer)"또는 "호변 이성질체 형태(tautomer form)"는 상이한 작용기 이성질체가 동적 평형을 유지할 수 있고, 실온에서 상호 전환될 수 있음을 의미한다. 호변 이성질체를 사용할 수 있는 경우(예를 들어, 용액에서), 호변 이성질체의 화학적 평형이 있을 수 있다. 예를 들어, 양성자 호변 이성질체(친양성자성 호변 이성질체라고도 함)에는 케토(keto)-에놀(enol) 호변 이성질체 및 이민(imein)-에나민(enamine) 호변 이성질체와 같은, 양성자 이전반응에 의한 상호 전환이 포함된다. 원자가(Valence) 호변 이성질체는 결합 전자의 일부 재결합에 의한 상호 변환을 포함한다. 특히, 구체적인 예는 펜탄(pentane)-2,4-디온(dione) 및 4-히드록시아밀(hydroxyamyl)-3-엔(en)-2-온(on) 호변 이성질체의 상호 전환이다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "이성질체가 풍부하다", "이성질체의 풍부함", "거울상 이성질체가 풍부하다", "거울상 이성질체의 풍부함"은 이러한 이성질체 또는 거울상 이성질체 중 하나의 함량이 100 % 미만임을 의미하고, 이러한 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량은 60 % 보다 더 또는 그와 같거나, 70 % 보다 더 또는 그와 같거나, 80 % 보다 더 또는 그와 같거나, 또는 90 % 보다 더 또는 그와 같거나, 95 % 보다 더 또는 그와 같거나, 96 % 보다 더 또는 그와 같거나, 97 % 보다 더 또는 그와 같거나, 98 % 보다 더 또는 그와 같거나, 99 % 보다 더 또는 그와 같거나, 99.5 % 보다 더 또는 그와 같거나, 99.6 % 보다 더 또는 그와 같거나, 99.7 % 보다 더 또는 그와 같거나, 99.8 % 보다 더 또는 그와 같거나, 99.9 % 보다 더 또는 그와 같다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "과잉 이성질체"또는 "과잉 거울상 이성질체"는 2 개의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 상대적 백분율 차이를 지칭한다. 예를 들어, 하나의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량은 90 %이고, 다른 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량은 10 % 인 경우, 과잉 이성질체 또는 거울상 이성질체의 값(ee 값)은 80 %이다.
광학 활성 (R)- 및 (S)-이성질체 및 D 및 L 이성질체는 키랄 합성 또는 키랄 시약 또는 기타 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 출원의 화합물의 거울상 이성질체가 필요한 경우, 키랄 프로모터를 사용한 비대칭 합성 또는 유도체화에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 생성된 부분 입체 이성질체 혼합물이 분리되고 보조기가 분할되어 원하는 순수한 거울상 이성질체를 제공한다.
대안적으로, 분자가 알칼리성 작용기(예를 들어, 아미노기) 또는 산성 작용기(예를 들어, 카르복실기)를 포함하는 경우, 부분 입체 이성질체의 염은 적절한 광학 활성 산 또는 염기 및 부분 입체 이성질체로 형성된다. 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 분리한 후 순수한 거울상 이성질체를 회수한다. 또한 거울상 이성질체와 부분 입체 이성질체의 분리는 키랄 고정상을 사용하고 화학적 유도체화 (예를 들어, 아민에서 카바메이트(carbamates)로)와 선택적으로 결합되는 크로마토그래피(chromatography)를 사용하여 보통 수행된다. 본 출원의 화합물은 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자상에 비자연적인 비율의 원자 동위 원소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 삼중수소(3H), 요오드-125 (125I) 또는 C-14 (14C)와 같은 방사성 동위 원소로 표지할 수 있다. 예를 들어, 중수소는 중수소화 약물을 형성하기 위해 수소를 대체하는 데 사용될 수 있다. 중수소와 탄소에 의해 형성된 결합은 일반 수소와 탄소에 의해 형성된 결합보다 강하다. 중수소화되지 않은 약물과 비교하여 중수소화 약물은 부작용 감소, 약물 안정성 증가, 치료 효과 향상 및 약물의 생물학적 반감기를 연장하는 장점이 있다. 방사성 여부에 관계없이 본 출원의 화합물의 모든 동위 원소 조성의 변형은 본 출원의 범위에 포함된다. "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 설명될 수 있지만 반드시 그런 것은 아닌, 이벤트 또는 조건을 의미하며, 이러한 설명에는 이벤트 또는 조건이 발생하는 상황과 이벤트 또는 조건이 발생하지 않는 상황이 포함된다.
용어 "치환된"은 특정 원자상의 임의의 하나 이상의 수소 원자가 치환기에 의해 치환되는 것을 의미하고, 특정 원자의 원자가 상태가 정상이고 치환된 화합물이 안정하다면 중수소 및 수소 변이체를 포함할 수 있다. 치환기가 산소 (예를 들어, =O)인 경우, 두 개의 수소 원자가 치환되었음을 의미한다. 방향족 그룹에서는 산소 치환이 발생하지 않는다. 용어 "선택적으로 치환된"은 그것이 치환되거나 치환되지 않을 수 있음을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 치환기의 유형과 수는 화학적 실행 가능성에 따라 선택 사항일 수 있다.
어떤 변수(예를 들어, R)가 화합물의 구성이나 구조에 한 번 보다 더 존재하는 경우, 그 정의는 각 경우에 독립적이다. 따라서, 예를 들어, 그룹이 0-2개의 R로 치환된 경우, 그룹은 최대 2개의 R로 선택적으로 치환될 수 있고, 각각의 경우 R은 독립적인 옵션을 갖는다. 또한, 치환기 및/또는 이들의 변이체의 조합은 이러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다.
-(CRR)0-과 같이, 연결 그룹의 수가 0 인 경우, 연결 그룹은 단일 결합이다.
변이체 중 하나가 단일 결합에서 선택되면, 두 연결 그룹이 직접 연결되어 있음을 의미한다. 예를 들어, L이 단일 결합을 나타낼 때, A-L-Z의 구조는 실제로 A-Z이다.
치환기가 비어 있으면, 치환기가 존재하지 않음을 의미한다. 예를 들어 A-X의 X가 비어 있으면, 구조가 실제로 A임을 의미한다. 나열된 치환기가 치환기에 연결된 원자를 나타내지 않는 경우, 치환기는 치환기의 임의의 원자에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 치환기로서 피리디닐(pyridinyl) 그룹은 피리딘 고리상의 임의의 탄소 원자에 의해 치환된 그룹에 연결될 수 있다.
나열된 연결 그룹이 연결 방향을 나타내지 않는 경우, 연결 방향은 선택 사항이다. 예를 들어 의 연결 그룹 L이 -M-W-인 경우, -M-W-는 를 형성하기 위해 왼쪽에서 오른쪽으로 읽는 것과 같은 방향으로 링 A와 B를 연결하거나, 또는 를 형성하기 위해 왼쪽에서 오른쪽으로 읽는 것과 반대 방향으로 링 A와 B를 연결할 수 있다. 연결기, 치환기 및/또는 이의 변이체의 조합은 이러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다.
달리 명시되지 않는 한, 고리상 원자의 수는 고리의 구성원 수로 식별된다. 예를 들어, "5-7-원 고리"는 5 내지 7개의 원자가 주위에 배열된 고리를 의미한다.
달리 구체화되지 않는 한, "5-6-원 고리"는 5 내지 6 개의 고리 원자로 구성된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로알케닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴을 의미한다. 고리에는 단일 고리, 및 나선형 고리, 결합 고리 및 브리지 고리와 같은 이중 고리 시스템을 포함한다. 달리 구체화되지 않는 한, 고리는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 선택적으로 포함한다. 5-6-원 고리는 5-요소 고리, 6-요소 고리 등을 포함한다. "5-6-원 고리"는, 예를 들어, 페닐, 피리딜, 피페리디닐 등을 포함하고; 반면, 용어 "5-6 원 헤테로사이클릭 알킬"은 피페리디닐 등을 포함하지만, 페닐은 포함하지 않는다. 용어 "고리"는 또한 각각 독립적으로 상기 정의에 따르는, 적어도 하나의 고리를 포함하는 고리의 시스템을 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "C1-6 알킬기"는 1 내지 6 개의 탄소 원자로 구성된 비분지형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 지칭한다. C1-6 알킬기는 C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-4, C6 및 C5 알킬기 등을 포함하고, 1가(예: 메틸), 2가(예: 메틸렌) 또는 다가(예: 메틴) 일 수 있다. C1-6 알킬기의 예로는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(n-프로필 및 이소프로필 포함), 부틸(n-부틸, 이소 부틸, s-부틸 및 t-부틸 포함), 펜틸(n-펜틸, 이소펜틸 및 네오펜틸 포함), 헥실 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "C1-3 알킬기"는 1 내지 3 개의 탄소 원자로 구성된 비분지형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 지칭한다. 기술된 C1-3 알킬기는 1가(예: 메틸), 2가(예: 메틸렌) 또는 다가(예: 메틴)일 수 있는 C1-2 및 C2-3알킬기 등을 포함한다. C1-3알킬기의 예는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(n-프로필 및 이소프로필 포함) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
달리 언급되지 않는 한, "C3-6사이클로알킬 그룹"은 모노사이클릭 및 바이사이클릭 시스템을 포함하는, 포화 사이클릭 탄화수소 그룹을 의미한다. C3-6시클로알킬기는 1가, 2가 또는 다가 일 수 있는 C3-5, C4-5 및 C5-6시클로알킬기 등을 포함한다. C3-6시클로 알킬기의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
달리 명시되지 않는 한, Cn-n+m 또는 Cn-Cn+m에는 n 내지 n+m 탄소가있는 특정 상황이 포함된다. 예를 들어, C1-12는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 및 C12를 포함하고, n 내지 n+m의 임의의 범위를 추가로 포함하고, 예를 들어, C1-12는 C1-3, C1-6, C1-9, C3-6, C3-9, C3-12, C6-9, C6-12 및 C9-12등을 포함한다. 마찬가지로, n-원에서 n+m-원은 고리의 원자 수가 n내지 n + m임을 의미한다. 예를 들어, 3-12-원 고리는 3-원 고리, 4-원 고리, 5-원 고리, 6-원 고리, 7-원 고리, 8-원 고리, 9-원 고리, 10-원 고리, 11-원 고리, 및 12-원 고리를 포함하고, n 내지 n+m의 임의의 범위를 추가로 포함하고, 예를 들어, 3-12-원 고리는 3-6-원 고리, 3-9-원 고리, 5-6-원 고리, 5-7-원 고리, 6-7-원 고리, 6-8-원 고리, 및 6-10-원 고리 등을 포함한다.
본 출원의 화합물은 아래 나열된 특정 실시예, 화합물과 다른 화학적 합성 방법의 조합에 의해 형성된 실시예, 및 당업자에게 잘 알려진 동등한 치환 방법을 포함하는, 당업자에게 잘 알려진 다양한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 실시예는 본 출원의 실시예를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용되는 용매는 시판 중이다. 본 출원은 다음과 같은 약어를 채택한다. 물에 대한 aq;O- (7- 아자 벤조 트리아 졸 -1- 일) -N, N, N ', N'- 테트라 메틸 우레아 헥사 플루오로 포스페이트에 대한 HATU;N- (3- 디메틸 아미노 프로필) -N'- 에틸 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드에 대한 EDC;3- 클로 로퍼 옥시 벤조산에 대한 m-CPBA;동등하거나 동등한 양에 대한 EQ;카르 보닐 디 이미 다졸에 대한 CDI;디클로로 메탄에 대한 DCM;석유 에테르 용 PE;디 이소 프로필 아조 디카 르 복실 레이트에 대한 DIAD;N, N- 디메틸 포름 아미드의 경우 DMF;디메틸 설폭 사이드에 대한 DMSO;에틸 아세테이트를위한 EtOAc;에탄올의 경우 EtOH;메탄올의 경우 MeOH;아민 보호기 인 벤질 옥시 카르 보닐에 대한 CBz;아민 보호기 인 tert 부 톡시 카르 보닐에 대한 BOC;아세트산에 대한 HOAc;에피시 아노 베르 보 하이드 라이드에 대한 NaCNBH3;R.T. 실온의 경우;하룻밤 동안 O / N;테트라 히드로 푸란에 대한 THF;디 -tert- 부틸 디 카보네이트에 대한 Boc2O;트리 플루오로 아세트산에 대한 TFA;디 이소 프로필 에틸 아민에 대한 DIPEA;설폭 사이드 클로라이드의 경우 SOCl2;이황화 탄소에 대한 CS2;p- 톨루엔 설 폰산에 대한 TsOH;N- 플루오로 -N- (페닐 설 포닐) 벤젠 설폰 아미드에 대한 NFSI;1- 클로로 피 롤리 딘 -2, 5- 디온에 대한 NCS;테트라 부틸 암모늄 플루오 라이드에 대한 n-Bu4NF;2- 프로판올에 대한 iPrOH;융점에 대한 mp;디 이소 프로필 아미노 리튬에 대한 LDA;[1,1'- 비스 (디 페닐 포스 피노) 페로센] 팔라듐 디 클로라이드의 디클로로 메탄 착물에 대한 Pd (dppf) Cl2.CH2Cl2;N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민에 대한 DIEA; 이소프로판올에 대한 IPA;1- 히드 록시 벤조 트리아 졸에 대한 HOBt;헥사 메틸 디 실리 실 아미노 리튬에 대한 LiHMDS;트리 에틸 아민에 대한 TEA;4- 하이드 록시 에틸 피페 라진 에탄 설 폰산에 대한 HEPES;헥사 메틸 디 실리 실 아미노 리튬에 대한 LiHMDS;카르 보디이 미드에 대한 EDCI;팔라듐 탄소의 경우 Pd / C;메탄올의 경우 METHANOL;칼륨 아세테이트에 대한 KOAc;탄산 칼륨에 대한 K2CO3.
화합물은 수동으로 이름이 지정되거나 ChemDraw Software에 의해 지정되며,시판되는 화합물은 공급 업체 카탈로그 이름으로 지정된다.
본 출원은 아래의 실시 예에 의해 상세하게 설명 될 것이나, 이는 본 출원에 불리한 제한을 부과하려는 의도는 아니다. 본 출원은 여기에서 상세히 설명되고, 특정 실시예도 개시된다. 본 출원의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 출원의 특정 실시 예에 대해 다양한 변경 및 개선을 행하는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
단계 1 : LiHMDS (1M, 51.2mL)를 -78℃에서 화합물 1-1(10.2g, 42.6mmol)을 함유하는 THF(150mL) 용액에 적하했다. -78℃에서 1 시간 동안 반응 용액을 교반 한 후, 1,1,1-트리플루오로-N-페닐-N-(트리플루오로메탄설포닐) 메탄설폰아미드(16.7g, 46.9mmol)를 함유하는 THF(150mL) 용액이 반응 용액에 첨가되었고, 그러고나서 15℃에서 12시간 동안 교반한다. TLC(PE:EA=10:1)는 원자재가 완전히 소모된 것으로 나타났으,며 새로운 포인트가 생성되었다. 용액을 포화 염화암모늄 250mL를 사용하여 급냉시키고, 물 200mL로 희석한 다음 EtOAc(200mL * 3)로 추출하였다. 유기상을 조합하고, 포화 식염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축하여 화합물 1-2를 제공하였다. 코스(Coarse) 생성물을 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 5.63 (br s, 1H), 3.50-3.65 (m, 4H), 2.34 (br s, 4H), 1.88 (br t, J=5.90 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H).
단계 2 : 아세트산 칼륨(12.7g, 129.3mmol) 및 Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(3.5g, 4.3mmol)를 화합물 1-2(16g, 43.1mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(bis(pinacolato)diboron)(12.0g, 47.4mmol)를 함유하는 DMF(100mL) 용액에 첨가했고, 그런 다음 질소로 3 회 교체하고, 70 ℃에서 3 시간 동안 질소 조건에서 교반하였다. TLC는 원자재가 완전히 소비되고 새로운 포인트가 생성되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물 300mL 및 EtOAc 400mL의 혼합물에 분산시켰다. 유기상을 분리하고, 포화 식염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축하여 코스(Coarse) 생성물을 제공하였다. 코스(Coarse) 생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 화합물 1-3을 제공하였다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ6.46 (br s, 1H), 3.71-3.53 (m, 4H), 2.31 (br d, J=3.0Hz, 2H), 2.24-2.16 (m, 2H), 1.74 (t, J=6.3Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.26 (s, 12H).
단계 3 : 질소 분위기에서 탄산 칼륨(3.8g, 27.3mmol) 및 Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(744mg, 911.0μmol)를 화합물 1-3(3.5g, 10.0mmol) 및 N-(5-브로모-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-2-일) 사이클로프로판 포름아미드(N-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridine-2-yl) cyclopropane formamide)(2.6g, 9.1mmol) 함유하는 디옥산(60mL)과 물(15mL)의 용액에 첨가했다. 이 반응 용액을 90℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모된 것으로 나타났으며, 표적 분자 이온 피크가 감지되었다. 반응 용액을 농축하여 코스(Coarse) 생성물을 얻었고, 이것을 정제하고 크로마토그래피로 분리하여 화합물 1-4를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 424.3[M + H]+.
단계 4 : 화합물 1-4(3.5g, 8.2mmol)를 함유하는 디클로로메탄(10mL) 용액에 염산/EtOAc(4M, 30mL)를 첨가하고, 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모된 것으로 나타났다. 표적 분자 이온 피크가 검출되었다. 고체를 침전시키고, 여과하고 건조시켜 화합물 1-5(3.3g 염산염, 코스(Coarse) 생성물)를 제공하고, 이후 정제없이 다음 반응에 직접 사용된다. LCMS (ESI) m/z: 324.1.
단계 5 : 질소 분위기에서 Pd/C(1g, 10%)를 화합물 1-5(3.0g, 8.34mmol, 염산염)를 포함하는 메탄올(100mL) 용액에 첨가했다. 현탁액을 수소로 3회 교체 한 다음 30℃의 수소(30psi) 분위기에서 12시간 동안 교반했다. LCMS는 원료가 완전히 소모된 것으로 나타났으며 표적 분자 이온 피크가 검출되었다. 반응 용액을 여과 한 다음, 농축하여 화합물 1-6을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 326.2 [M + H]+.
단계 6 ： 화합물 1-6(0.87g, 2.40mmol, 염산염)을 N,N-디메틸 포름아미드(N,N-dimethyl formamide)(10mL)에 용해시키고, HOBt(487mg, 3.6mmol) 및 EDCI(691mg, 3.6mmol)를 첨가하고, 그런 다음 (1S)-2,2-디플루오로시클로프로판카르복실산((1S)-2,2-difluoro cyclopropanecarboxylic acid)(323mg, 2.6mmol) 및 에틸디이소프로필아민(ethyldiisopropylamine)(621mg, 4.8mmol)을 첨가하고, 15℃에서 12시간 동안 반응시켰다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 감압하에 농축하고, 잔류물을 분취용 HPLC(중성 시스템)로 처리하여 화합물 1-13을 제공했다. 1H NMR(400MHz, METHANOL-d4) δ7.32-7.73 (m, 2H), 6.95 (br s, 1H), 3.62-4.22 (m, 4H), 3.45 (br s, 1H), 3.18-3.37 (m , 1H), 2.61 (brs, 1H), 1.45-2.27 (m, 10H), 0.78-1.17 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 430.0 [M + H]+.
화합물 1-13에 사용된 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 1-6으로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물을 얻었다(즉, 화합물 1-13 합성을 위한 카르복실 산은 산 아미드 축합 반응에서 다음 표적 분자에 해당하는 카르복실 산으로 대체되었다):
화합물 1-7： 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ11.08 (br s, 1H), 7.48 - 7.78 (m, 2H), 7.03 (d, J=7.0 Hz, 1H), 3.86 - 4.25 (m, 2H), 3.61 - 3.80 (m, 2H), 3.29 - 3.38 (m, 1H), 2.69 - 2.88 (m, 1H), 1.85 - 2.19 (m, 7H), 1.51 - 1.79 (m, 4H), 0.83 - 0.96 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 430.0[M + H]+.
화합물 1-8： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.14 (br s, 1H), 7.52-7.66 (m, 2H), 7.00 (d, J=7.03 Hz, 1H), 3.54-3.83 (m, 6H), 3.29 (br t, J=11.54 Hz, 1H), 1.94-2.09 (m, 5H), 1.41-1.70 (m, 4H), 0.77-0.90 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 393.1[M + H]+.
화합물 1-9： 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.99 (br s, 1H), 7.49-7.65 (m, 2H), 6.99 (br d, J=7.03 Hz, 1H), 4.02-4.20 (m, 2H), 3.61-3.78 (m, 2H), 1.94-2.13 (m, 5H), 1.48-1.72 (m, 4H), 1.14-1.32 (m, 4H), 0.77-0.87 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 412.1[M + H]+.
화합물 1-10： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.77-7.87 (m, 1H), 7.62 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.20 (dd, J=7.28, 11.80 Hz, 1H), 4.08 (s, 1H), 3.96 (s, 1H), 3.83 (s, 1H), 3.72 (s, 1H), 3.43-3.56 (m, 1H), 3.22 (dq, J=6.90, 10.75 Hz, 2H), 2.06-2.23 (m, 4H), 1.94 (br s, 1H), 1.56-1.84 (m, 3H), 1.56-2.00 (m, 1H), 0.94-1.14 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 436.1[M + H]+.
화합물 1-11： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.56-7.67 (m, 1H), 7.50 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.00 (t, J=7.15 Hz, 1H), 4.26-4.48 (m, 2H), 3.70-3.90 (m, 2H), 3.42-3.59 (m, 1H), 2.08-2.24 (m, 4H), 1.48-1.99 (m, 9H), 0.87-1.10 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 419.1[M + H]+.
화합물 1-12： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.56-7.64 (m, 1H), 7.48 (d, J=9.03 Hz, 1H), 6.97 (d, J=7.28 Hz, 1H), 3.91-4.17 (m, 2H), 3.78-3.86 (m, 1H), 3.67-3.75 (m, 1H), 3.40-3.54 (m, 1H), 2.53-2.69 (m, 1H), 1.92-2.21 (m, 6H), 1.72-1.85 (m, 3H), 1.50-1.69 (m, 2H), 0.86-1.08 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 430.1[M + H]+.
화합물 1-14： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.57-7.66 (m, 1H), 7.50 (d, J=8.78 Hz, 1H), 6.95-7.03 (m, 1H), 6.01-6.38 (m, 1H), 4.62 (s, 1H), 3.65-4.10 (m, 4H), 3.43-3.58 (m, 1H), 2.76-2.93 (m, 2H), 2.04-2.21 (m, 4H), 1.51-1.87 (m, 4H), 1.01-1.07 (m, 2H), 0.93 (qd, J=3.74, 7.34 Hz, 2H). LCMS (ESI) m/z: 418.1[M + H]+.
화합물 1-15： 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 11.01 (br s, 1H), 7.48-7.66 (m, 2H), 7.00 (dd, J=7.53, 9.79 Hz, 1H), 4.11-4.33 (m, 2H), 3.60-3.81 (m, 2H), 3.25-3.32 (m, 1H), 2.03 (br t, J=9.03 Hz, 5H), 1.53-1.73 (m, 4H), 1.49 (d, J=4.77 Hz, 6H), 0.76-0.88 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 421.1[M + H]+.
화합물 1-16의 합성: 화합물 1-6(100 mg, 227.6μmol, TFA)을 N,N-디메틸 포름아미드(5 mL)에 용해시키고, 탄산 칼륨(94mg, 682.7μmol) 및 2-브로모아세토니트릴(2-bromoacetonitrile)(30mg, 250.3μmol)를 첨가하고, 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(5 mL)로 희석하고, 디클로로메탄/메탄올(dichloromethane/methanol)(10/1, 10 mL)로 추출하고, 포화 식염수 (10 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압 하에서 농축했다. 잔류물을 분취용 HPLC(중성 시스템)에 의해 처리하여 화합물 1-16을 제공하였다. 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.83 (t, J=8.03Hz, 1H), 7.64 (br d, J=8.78Hz, 1H), 7.21 (d, J=7.53Hz, 1H), 4.51 (s, 2H), 4.23 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 3.49 (br t, J=11.92Hz, 1H), 2.14-2.30 (m, 4H), 1.79-1.97 (m, 3H), 1.59-1.74 (m, 2H), 0.95-1.12 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 365.0[M + H]+.
화합물 1-16에 사용 된 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 1-6으로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물을 얻었다(브로모아세토니트릴은 이에 상응하여 표적 분자에서 브로모프로피오니트릴(bromopropionitrile)로 대체 되었다):
화합물 1-17： 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ11.00 (br s, 1H), 7.50-7.63 (m, 2H), 6.96 (d, J=6.27 Hz, 1H), 3.33-3.34 (m, 2H), 3.23-3.30 (m, 1H), 2.95 (s, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.58-2.69 (m, 2H), 1.99 (br d, J=10.29 Hz, 5H), 1.40-1.65 (m, 4H), 0.74-0.88 (m, 4H).LCMS (ESI) m/z: 379.0[M + H]+.
실시예 2
단계 1: -78℃의 질소 분위기에서, tert-부틸 9-산소-3-아자스피로[5.5]헨 데칸-3-카복실산(tert-butyl 9-oxygen-3-azaspiro[5.5]hendecane-3-carboxylic acid)(3-1)(5g, 18.7mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란(anhydrous tetrahydrofuran)(150 mL), 비스(트리메틸실릴)아민 리튬(bis(trimethylsilyl)amine lithium)(1 M, 22.4 mL)을 천천히 적하하고, -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 용액에 1,1,1-트리플루오로-N-[(트리플루오로메틸)설포닐]-메탄 설폰아미드(1,1,1-trifluoro-N-[(trifluoromethyl)sulfonyl]- methane sulfonamide)(7.35g, 20.6mmol)를 함유하는 무수 테트라하이드로퓨란(50mL) 용액을 첨가하고 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 포화 염화암모늄(50 mL)으로 급냉시키고, EtOAc(200mL * 2)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 식염수(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압에서 농축하여 화합물 3-2를 제공하였으며, 이는 정제되지 않고 다음 반응에 직접 사용되었다.
단계 2： 화합물 3-2(8g, 20.0mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(5.59g, 22.0mmol)을 N,N-디메틸 포름아미드(100mL)에 용해시키고, 아세트산 칼륨(5.90g, 60.1mmol)을 첨가하고, 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센-팔라듐(II)디클로라이드디클로로메탄(1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocene-palladium(II)dichloride dichloromethane)(1.64g, 2.0mmol)을 넣고 70℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(300 mL)로 희석하고 EtOAc(200 mL * 2)로 추출하였다. 결합된 유기상을 포화 식염수 (150 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압에서 농축 하였다. 잔류물을 신속한 실리콘 겔 컬럼(0~10% EtOAc/PE)으로 분리하여 화합물 3-3을 제공하였다. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ6.41 (br s, 1H), 6.34-6.47 (m, 1H), 3.32-3.44 (m, 2H), 3.14-3.29 (m, 2H), 2.00-2.10 (m, 2H), 1.90 (br d, J=3.01 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.28 (br t, J=5.52 Hz, 4H), 1.19 (s, 12H).
단계 3: 질소 분위기에서, N-(5-브로모-[1,2,4]트리아졸[1,5-a]피리딘-2-일)시클로프로필 포름아미드(N-(5-bromo-[1,2,4]triazole[1,5-a] pyridine-2-yl) cyclopropyl formamide)(2g, 7.1mmol), 화합물 3-3(3.49g, 9.3mmol), 탄산 칼륨(2.95g, 21.3mmol), 및 [1,1-비스(디페닐포스핀)페로센] 팔라듐 디클로라이드 디클로로메탄([1,1-Bis (diphenylphosphine) ferrocene] palladium dichloride dichloromethane)(581mg, 711.5μmol)을 함유하는 혼합된 디옥산(40ml)과 물(10ml) 용액을 질소로 3회 교체하고, 반응 용액을 3시간 동안 90℃로 가열 하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 액을 감압 농축하고 잔류물을 빠른 실리카겔 컬럼(0~4% 메탄올/디클로로메탄)으로 분리하여 화합물 3-4를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 452.4[M + H]+.
단계 4: 화합물 3-4(3.5g, 7.8mmol)를 디클로로메탄(15mL)에 용해시키고, 염산/EtOAc(4M, 30mL)를 첨가하고, 20℃에서 30분 동안 반응시켰다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 고체를 침전시키고, 여과하고 건조시켜 화합물 3-5를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 352.2[M + H]+.
단계 5: 질소(N2) 분위기에서, 화합물 3-5(2.9g, 7.4mmol, 염산염)를 메탄올(100mL)에 용해시키고, 촉매 건조 팔라듐/탄소(1g, 10 %)를 첨가하고 수소로 3회 교체했다. 반응 용액을 수소 압력(30 Psi) 및 반응 온도 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 고체를 규조토로 여과하여 여액을 제공하고, 이를 농축하여 화합물 3-6(2.6g 염산염)을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 354.7[M + H]+.
단계 6: 화합물 3-6(1g, 2.6mmol, 염산염)을 N,N-디메틸포름아미드(20mL)에 용해시키고, HOBt(573mg, 4.2mmol) 및 EDCI(813mg, 4.2mmol)를 첨가한 다음 (1S)-2,2-디플루오로시클로프로필카르복실산((1S)-2,2-difluorocyclopropyl carboxylic acid)(380mg, 3.1mmol) 및 DIEA(731mg, 5.7mmol)를 15℃에서 12시간 동안 반응시켰다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(100 mL)로 희석하고 디클로로메탄/메탄올(10/1, 150 mL * 2)로 추출하였다. 결합된 유기상을 포화 식염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압에서 농축시켰다. 잔류물을 분취용 HPLC(중성 시스템)로 처리하여 화합물 3-7을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.57-7.64 (m, 1H), 7.48 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.02 (d, J=7.28 Hz, 1H), 3.63-3.77 (m, 3H), 3.41-3.61 (m, 2H), 2.93 (dt, J=8.28, 11.80 Hz, 1H), 1.36-2.06 (m, 15H), 1.04 (quin, J=3.76 Hz, 2H), 0.93 (qd, J=3.66, 7.34 Hz, 2H). LCMS (ESI) m/z: 458.1[M + H]+.
화합물 3-7에 사용된 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 3-6으로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물을 얻었다(화합물 3-7의 카르복실산은 산 아미드 축합 반응에서 다음 표적 분자에서 카르복실산으로 대체되었다):
화합물 3-8： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ7.57-7.67 (m, 1H), 7.49 (d, J=8.53 Hz, 1H), 7.03 (dd, J=3.76, 6.78 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.83-3.91 (m, 1H), 3.62 (td, J=3.76, 7.53 Hz, 2H), 3.42-3.54 (m, 3H), 1.68-2.08 (m, 9H), 1.40-1.56 (m, 4H), 1.05 (quin, J=3.76 Hz, 2H), 0.88-0.97 (m, 2H).LCMS (ESI) m/z: 421.1[M + H]+.
화합물 3-9： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.61 (dd, J=7.28, 8.78 Hz, 1H), 7.49 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.02 (dd, J=4.52, 6.78 Hz, 1H), 3.63 (td, J=3.83, 7.40 Hz, 2H), 3.43-3.58 (m, 5H), 1.67-2.07 (m, 9H), 1.39-1.54 (m, 4H), 1.01-1.08 (m, 2H), 0.93 (qd, J=3.68, 7.28 Hz, 2H).LCMS (ESI) m/z: 464.1[M + H]+.
실시예 3
단계 1： 0℃에서, 5-브로모-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딜-2-아민(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridyl-2-amine)(4-1)(5g, 23.5mmol)을 아세토니트릴(50 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민(11.87g, 117.4mmol) 및 시클클프로판카르보닐 클로라이드(cyclopropanecarbonyl chloride)(6.13g, 58.7mmol)를 첨가하고, 25℃에서 12시간 동안 반응시켰다. TLC는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매 아세토니트릴을 감압 농축하여 제거하고, 잔류물을 급속 컬럼(0~5% 메탄올/디클로로메탄)으로 분리하여 화합물 4-2를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 350.8[M + H]+.
단계 2： 질소(N2) 분위기에서, 화합물 4-2(1.99g, 5.7mmol)와 화합물 1-1(1.5g, 6.3mmol)을 무수 테트라히드로푸란(30mL)에 용해시키고, -70℃에서 n-부틸리튬(2.5M, 5.7 mL) 용액을 첨가하고, 10℃에서 30분 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 0℃에서 포화 염화암모늄(50 mL)으로 급냉시키고 EtOAc(150 mL * 2)로 추출하였다. 결합된 유기상을 포화 식염수(10 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 신속한 실리콘 겔 컬럼(0~3% 메탄올/디클로로메탄)으로 분리하여 화합물 4-3을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 442.3[M + H]+.
단계 3： 0℃에서, 화합물 4-3(0.8g, 1.81mmol)을 무수 디클로로메탄(10mL)에 용해시키고, 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드(diethylaminosulphur trifluoride)(DAST)(351mg, 2.17mmol)를 첨가하고, 0℃에서 15분간 반응시키고, 그런 다음 25℃로 가열한 후 1시간 동안 반응하도록 두었다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 0℃에서 포화 중탄산 나트륨 수용액(5 mL)으로 급냉시키고, 물(10 mL)로 희석하고, 디클로로메탄(50mL * 3)으로 추출하였다. 결합한 유기상을 포화 식염수(20 mL)로하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축 하였다. 잔류물을 신속한 실리콘 겔 컬럼(0~100% EtOAc/PE)으로 분리하여 화합물 4-4를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 444.3[M + H]+.
단계 4： 화합물 4-4(410mg, 924.4μmol)를 디클로로메탄(5mL)에 용해시키고, 염산/EtOAc(4M, 10mL)를 첨가하고, 20℃에서 30분간 반응시켰다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 고체를 침전시키고, 여과하고 건조시켜 화합물 4-5(390 mg 염산염)를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 344.2[M + H]+.
단계 5： 화합물 4-5(130mg, 342.2μmol, 염산염)를 N,N-디메틸포름아미드(10mL)에 용해시키고, HOBt(77mg, 567.9μmol) 및 EDCI(109mg, 567.9μmol)를 첨가하고, 그런 다음 2-시아노아세트산(35mg, 416.4μmol) 및 디이소프로필에틸아민(98mg, 757.1μmol)을 첨가하고, 15℃에서 12시간 동안 반응하도록 두었다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 감압하에 농축하고 잔류물을 분취용 HPLC(중성 시스템)로 처리하여 화합물 4-6을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4 ) δ 7.66-7.72 (m, 1H), 7.56-7.62 (m, 1H), 7.25 (t, J=7.28 Hz, 1H), 4.29 (s, 1H), 4.03 (s, 1H), 3.97 (s, 1H), 3.76 (s, 1H), 3.26-3.30 (m, 2H), 2.97-3.28 (m, 2H), 1.74-2.08 (m, 7H), 0.89-1.13 (m, 4H).LCMS (ESI) m/z: 411.1[M + H]+.
화합물 4-6에서 사용한 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 4-5로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물 4-7 및 4-8을 얻었다(화합물 4-6과 다른 치환기를 갖는 카르복실산 화합물이 추가되었다):
화합물 4-7： 1H NR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ = 7.65-7.73 (m, 1H), 7.59 (dt, J=1.13, 9.72 Hz, 1H), 7.20-7.29 (m, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.01 (d, J=11.29 Hz, 2H), 3.76 (s, 1H), 2.99-3.30 (m, 4H), 1.74-2.10 (m, 7H), 0.88-1.12 (m, 4H).LCMS (ESI) m/z: 454.1[M + H]+.
화합물 4-8： 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4 ) δ = 7.64-7.73 (m, 1H), 7.59 (dt, J=1.25, 9.16 Hz, 1H), 7.20-7.28 (m, 1H), 6.01-6.44 (m, 1H), 4.30 (s, 1H), 3.99 (d, J=11.80 Hz, 2H), 3.73 (s, 1H), 2.99-3.27 (m, 2H), 2.76-2.99 (m, 2H), 1.75-2.10 (m, 7H), 0.89-1.10 (m, 4H).LCMS (ESI) m/z: 436.1[M + H]+.
실시예 4
단계 1： -78℃에서, LiHMDS(1M, 770μL)를 화합물 5-1(0.15g, 592.1μmol)을 포함하는 THF(8mL)에 적하했다. 혼합물을 -78℃에서 1 시간 동안 교반하였다. -78℃에서, 1,1,1-트리플루오로-N-페닐-N-(트리플루오로메틸 설포닐) 메탄설폰아미드(1,1,1-trifluoro-N-phenyl-N-(trifluoromethyl sulfonyl) methanesulfonamide)(233mg, 651μmol)가 포함된 테트라하이드로퓨란(4mL) 용액을 반응 용액에 적하 하였고, 그런 다음 15℃에서 12시간 교반하였다. TLC(PE:EA=5:1)는 반응이 완료되었음을 보여주었고, 새로운 포인트가 생성되었다. 반응 용액을 10mL 포화 염화 암모늄 용액으로 급냉시키고, 그런 다음 물 20mL를 첨가하고, EtOAc(30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 화합물 5-2를 제공하였고, 이는 정제없이 다음 반응에 직접 사용되었다.
단계 2： KOAc(191mg, 2.0mmol) 및 Pd(dppf)Cl2(48mg, 64.9μmol)를 화합물 5-2(0.25g, 648.7μmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(165mg, 648.7μmol)를 함유하는 DMF(10mL) 용액에 첨가했다. 반응 용액을 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC(PE:EA=5:1)는 반응이 완료되었음을 보여주었고, 새로운 포인트 생성이 감지되었다. 반응 용액에 물 20 mL를 첨가하고, EtOAc(30 mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 코스(coarse) 생성물을 제공하고, 이를 크로마토그래피(SiO2, PE:EA =50:0 ~ 20:1)로 분리 및 정제하여 무색의 유성 화합물 5-3을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d4) δ6.50 (br s, 1 H), 3.35 - 3.49 (m, 2 H), 3.07 - 3.15 (m, 2 H), 2.02 - 2.22 (m, 4 H), 1.54 - 1.81 (m, 4 H), 1.47 (s, 9 H), 1.27 (s, 12 H).
단계 3： 화합물 5-3(0.13g, 357.8μmol), N-(5-브로모-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-2-일) 시클로프로판 포름아미드(N-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridine-2-yl)cyclopropane formamide)(101 mg, 357.8μmol), K2CO3(149mg, 1.1mmol), 및 Pd(dppf)Cl2(26mg, 35.8μmol)을 함유하는 디옥산(4mL)과 물(1mL)의 용액이 질소 가스에 의해 교체되었다. 혼합물을 질소 분위기에서 90℃로 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었다. 반응 용액을 농축하여 용매를 제거하고, 그런 다음 10 mL 물에 분산시키고, DCM/MeOH(10:1, 30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 그런 다음 여과하여 여액을 제공하고, 이를 감압 하에 증류하여 코스(coarse) 생성물을 제공하였다. 코스(coarse) 생성물을 크로마토그래피 컬럼 방법(SiO2, DCM:MeOH =1:0 to 20:1)으로 정제하여 화합물 5-4를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 438.3[M + H]+.
단계 4： 아르곤 분위기에서, Pd/C(10%, 50mg)를 화합물 5-4(0.2g, 457.1μmol)를 포함하는 메탄올(10mL)에 첨가했다. 혼합물이 수소로 3회 교체되었고, 그런 다음 25℃에서 2시간 동안 수소 분위기(15psi)에서 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었다. 반응 용액을 여과 및 농축하여 화합물 5-5를 제공하였고, 이를 정제없이 다음 반응에 직접 사용 하였다. LCMS (ESI) m/z: 440.4[M + H]+.
단계 5： 화합물 5-5(150mg, 341.3μmol) 및 TFA(4mL)를 함유하는 디클로로메탄(10mL)이 질소로 3회 교체되었고, 반응 용액을 25℃에서 30분간 교반했다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었다. 반응 용액을 농축하고 용매를 제거하여 화합물 5-6(0.15g, TFA 염)을 제공하였고, 이를 정제없이 다음 반응에 직접 사용하였다. LCMS (ESI) m/z: 340.2[M + H]+.
단계 6: EDCI(104mg, 541.1μmol), HOBt(73mg, 541.1μmol) 및 DIEA(140mg, 1.1mmol, 189μL)를 (1S)-2,2-디플루오로시클로프로필 포름산((1S)-2, 2-difluorocyclopropyl formic acid)(44mg, 360.7μmol)을 함유하는 DMF(4mL)에 첨가했고, 25℃에서 5분 동안 반응하도록 교반하고, 그런 다음 화합물 5-6(122 mg, 270μmol, TFA 염)을 첨가하고, 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 목표 분자 이온 피크가 검출되었다. 코스(coarse) 생성물이 분리되었고(중성 분리 조건, 크로마토그래피 컬럼: Waters Xbridge 150mm*25mm 5μm; 이동상: [H2O(10mM NH4HCO3)-ACN]; B(CH3CN)%: 25%-55%, 7 분), 및 SFC 키랄(chiral) 분리(크로마토그래피 컬럼: DAICEL CHIRALCEL OD-H(250mm*30mm, 5μm); 이동상: [0.1%NH3H2O EtOH]; B(CO2)%: 40%)로 화합물 5-7를 제공하였고, SFC 머무름 시간: 3.685분이다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4) δ 7.48 - 7.55 (m, 1 H), 7.39 (d, J=8.78 Hz, 1 H), 6.92 (dd, J=6.90, 3.39 Hz, 1 H), 3.35 - 3.76 (m, 5 H), 2.66 - 2.94 (m, 1 H), 1.51 - 2.10 (m, 13 H), 0.94 (br s, 2 H), 0.78 - 0.88 (m, 2 H). LCMS (ESI) m/z: 444.1[M + H]+. 화합물 5-8, SFC 머무름 시간: 4.283분. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4) δ 7.48 - 7.59 (m, 1 H), 7.40 (br d, J=8.53 Hz, 1 H) , 6.94 (br d, J=6.78 Hz, 1 H), 3.23 - 3.78 (m, 5 H) , 2.65 - 2.81 (m, 1 H), 1.54 - 2.06 (m, 13 H), 0.95 (br s, 2 H) , 0.77 - 0.87 (m, 2 H). LCMS (ESI) m/z: 444.2[M + H]+.
화합물 5-7에 사용된 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 5-6으로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물을 얻었다(화합물 5-7과 다른 치환기를 가진 카르복실산 화합물이 추가되었다):
화합물 5-9: 분리에 HPLC(중성 분리 조건, 크로마토그래피 컬럼: Waters Xbridge 150mm*25mm 5μm; 이동상: [H2O(10mM NH4HCO3)-ACN]; B(CH3CN)%: 18%-32%, 9분)를 사용하고, 머무름 시간은 2.117분이다. 1H NMR(400MHz, METHANOL-d 4) δ 7.60 - 7.68 (m, 1H), 7.52 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.05 (dd, J=3.4, 6.8 Hz, 1H), 3.44 - 3.73 (m, 4H), 3.31 (br s, 2H), 2.11 (td, J=7.6, 14.9 Hz, 3H), 2.01 (br t, J=7.3 Hz, 1H), 1.96 (br s, 1H), 1.66 - 1.88 (m, 6H), 1.31 (br s, 1H), 1.02 - 1.10 (m, 2H), 0.91 - 0.99 (m, 2H).LCMS (ESI) m/z: 407.2[M + H]+.
화합물 5-10：SFC 키랄 분해 조건, 크로마토그래피 컬럼: DAICEL CHIRALCEL OD-H(250mm*30mm, 5μm); 이동상: [0.1%NH3H2O EtOH]; B(CO2)%: 40%-40%, 머무름 시간 4.114분. 1H NMR(400MHz, METHANOL-d4) δ = 7.52 (br d, J=8.0 Hz, 1H), 7.40 (br d, J=8.8 Hz, 1H), 6.89 - 6.98 (m, 1H), 3.57 (t, J=7.0 Hz, 1H), 3.25 - 3.51 (m, 6H), 1.78 - 2.09 (m, 5H), 1.51 - 1.76 (m, 6H), 0.94 (br d, J=3.8 Hz, 2H), 0.79 - 0.88 (m, 2H). LCMS (ESI) m/z: 450.2[M + H]+.
실시예 5
단계 1: -78℃에서, LiHMDS(1M, 1.3mL)를 화합물 6-1(250mg, 986.8μmol)을 함유하는 THF(8mL)에 적하했다. 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. -78℃에서, 1,1,1-트리플루오로-N-페닐-N-(트리플루오로메틸 설포닐) 메탄 설폰아미드(1,1,1-trifluoro-N-phenyl-N-(trifluoromethyl sulfonyl) methane sulfonamide)(388mg, 1.1mmol)를 함유하는 테트라하이드로푸란(4mL)을 반응 용액에 적하 하였고, 그런 다음 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC(PE:EA=5:1)는 원료가 완전히 반응하였고, 새로운 포인트가 생성되었음을 보여주었다. 반응 용액을 10 mL 포화 염화 암모늄 용액을 사용하여 급냉시켰고, 그런 다음 20 mL 물을 첨가하고, EtOAc(30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 코스 생성물을 제공하였고, 그런 다음 크로마토그래피 컬럼(SiO2, PE:EA =20:1 ~ 10:1)으로 분리 및 정제하여 화합물 6-2를 제공하였다.
단계 2： KOAc(295mg, 3.0mmol) 및 Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(82mg, 100μmol)를 화합물 6-2(386mg, 1.0mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(254 mg, 1.0mmol)을 함유하는 DMF(5mL) 용액에 첨가했다. 반응 용액을 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC (PE:EA=5:1)는 원료가 완전히 소모되었고, 새로운 포인트 생성이 감지되었음을 보여주었다. 반응 용액에 물 20 mL를 첨가하고, EtOAc(30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 식염수(40 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 코스 생성물을 제공하였고, 이를 크로마토그래피 컬럼(SiO2, PE:EA =50:0 ~ 20:1)으로 분리 및 정제하여 화합물 6-3을 제공하였다.
단계 3: 화합물 6-3(186mg, 512μmol), N-(5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일)사이클로프로판 포름아미드(144mg, 512μmol), K2CO3(212mg, 1.5mmol), 및 Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(42mg, 51.2μmol)를 함유하는 다이옥산(4mL) 및 물(1mL) 용액이 질소로 3 회 교체되었다. 질소 조건에서, 혼합물을 90℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 용액을 용매를 제거하고, 10 ,mL 물에 분산시키고, DCM:MeOH(10:1, 30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 그런 다음 감압 증류하여 코스 생성물을 제공하였다. 코스 생성물을 크로마토그래피 컬럼 방법(SiO2,　DCM:MeOH =1:0 ~ 20:1)으로 정제하여 화합물 6-4를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 438.7[M + H]+.
단계 4： 아르곤 분위기에서, Pd/C(10%, 50mg)를 화합물 6-4(196mg, 448μmol)를 함유하는 메탄올 용액(10mL)에 첨가하였다. 혼합물을 수소로 3회 교체하였고, 그런 다음 25℃의 수소 분위기(15psi)에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과한 다음 농축하여 화합물 6-5를 제공하고, 정제없이 다음 반응에 직접 사용되었다. LCMS (ESI) m/z: 440.3[M + H]+.
단계 5： 화합물 6-5(130mg, 296μmol) 및 TFA(4mL)를 함유하는 디클로로메탄(10mL) 용액을 질소로 3회 교체하였고, 그런 다음 25에서 30분 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 용액을 농축하여 용매를 제거하고, 화합물 6-6(134mg, TFA 염)을 제공하였고, 이를 정제없이 다음 반응에 직접 사용하였다.
단계 6: EDCI(85mg, 443.3μmol), HOBt(60mg, 443.3μmol) 및 DIEA(115mg, 886.5μmol, 154.4μL)를 (1S)-2,2-비플루오로시클로프로판카르복실산(36mg, 295.5μmol) 함유하는 DMF(4mL)에 첨가하였고, 25℃에서 5분 동안 교반하여 반응시켰고, 그런 다음 화합물 6-6(134mg, 295.5μmol, TFA 염)을 첨가하였고, 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 코스 생성물 분리(중성 조건, 크로마토그래피 컬럼: Waters Xbridge 150*25 5μm; 이동상: [물 (10mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 30%-50%, 7분) 및 SFC 키랄 분리(크로마토그래피 컬럼: YMC CHIRAL Amylose-C(250mm*30mm,10 μm; 이동상: [0.1%NH3H2O EtOH];B%: 50%). 2.339분의 SFC 머무름 시간으로 화합물 6-7을 얻었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.01 (br s, 1 H), 7.51 - 7.63 (m, 2 H), 7.08 (br d, J=6.78 Hz, 1 H), 3.83 (br s, 1 H), 3.41 - 3.66 (m, 4 H), 3.15 (br d, J=5.02 Hz, 1 H), 2.14 - 2.35 (m, 2 H), 2.06 (br s, 1 H), 1.75 - 1.95 (m, 4 H), 1.40 - 1.73 (m, 6 H) , 0.84 (br s, 4 H). LCMS (ESI) m/z: 444.1[M + H]+. 화합물 6-8: SFC 머무름 시간은 4.142분이다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.01 (br s, 1 H), 7.54 - 7.65 (m, 2 H), 7.08 (br s, 1 H), 3.80 - 3.90 (m, 1 H), 3.45 - 3.66 (m, 4 H), 3.09 - 3.22 (m, 1 H), 2.18 - 2.36 (m, 2 H), 2.06 (br s, 1 H), 1.75 - 1.95 (m, 4 H) , 1.68 (br d, J=7.28 Hz, 3 H) , 1.50 (br d, J=4.77 Hz, 3 H), 0.77 - 0.88 (m, 4 H). LCMS (ESI) m/z: 444.1[M + H]+.
실시예 6
단계 1: -78℃에서, LiHMDS(1M, 1.7mL)를 화합물 7-1(0.3g, 1.33mmol)을 포함하는 THF(8mL) 용액에 첨가하였다. -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 혼합물을 1,1,1-트리플루오로-N-페닐-N-(트리플루오로메틸설포닐) 메탄 설폰아미드(1,1,1-trifluoro-N-phenyl-N-(trifluoromethylsulfonyl) methane sulfonamide)(523mg, 1.46mmol)를 함유하는 테트라하이드로푸란(4mL) 용액에 적하하였고, 그런 다음 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC(PE:EA=5:1)는 원료가 완전히 반응하였고, 새로운 포인트가 생성되었음을 보여주었다. 반응 용액을 포화 염화 암모늄으로 급냉시켰고, 그런 다음 물 20mL를 첨가하고, EtOAc(30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 코스 생성물을 제공하였고, 이를 크로마토그래피 컬럼 방법(SiO2, PE:EA =20:1~ 10:1)으로 분리 및 정제하여 화합물 7-2를 제공하였다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 5.72 (s, 1 H), 3.86 - 3.92 (m, 2 H), 3.76 - 3.82 (m, 2 H), 2.53 - 2.61 (m, 2 H), 2.18 - 2.25 (m, 2 H), 1.37 (s, 9 H).
단계 2： KOAc(379mg, 3.9mmol) 및 Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(105mg, 128.7μmol)를 화합물 7-2(0.46g, 1.3mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(327mg, 1.3mmol)을 함유하는 DMF(5mL) 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC(PE:EA=5:1)는 원료가 완전히 반응하였고, 새로운 포인트 생성이 감지되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물 20mL를 첨가하여 급냉시키고, EtOAc(30mL * 3)로 추출 하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하여 코스 생성물을 제공하였고, 이를 크로마토그래피 방법(SiO2, PE:EA =50:0 ~ 20:1)으로 정제하여 화합물 7-3을 제공하였다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 6.45 (t, J=1.88 Hz, 1 H), 3.83 - 3.88 (m, 2 H), 3.73 - 3.78 (m, 2 H), 2.36 - 2.42 (m, 2 H), 2.04 (t, J=7.03 Hz, 2 H), 1.37 (s, 9 H), 1.21 (s, 12H).
단계 3： 화합물 7-3(0.15g, 447.43μmol), N-(5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일)사이클로프로판 포름아미드(126mg, 447.43μmol), K2CO3(186mg, 1.34mmol) 및 Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(37mg, 44.7μmol)를 함유하는 다이옥산(4mL) 및 물(1mL) 용액을 질소로 3회 교체되었다. 혼합물을 질소 분위기에서 12시간 동안 90℃로 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 목표 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 용액을 농축하여 용매를 제거하였고, 그런 다음 10mL 물에 분산시키고, DCM:MeOH(10:1, 30mL * 3)로 추출하였다. 유기상이 결합되었고, 포화 식염수(40mL)로 세척하고, 함수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증류하여 코스 생성물을 제공하였다. 크로마토그래피 컬럼 방법(SiO2,　DCM:MeOH =1:0 ~ 20:1)으로 정제하여 화합물 7-4를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 410.2[M + H]+.
단계 4: 아르곤 분위기에서, 화합물 7-4(0.15g, 366.3μmol)를 함유하는 메탄올(10mL) 용액에 Pd/C(10%, 0.05g)를 첨가하였다. 혼합물을 수소로 3 회 교체하였고, 그런 다음 25℃의 수소 분위기(15psi)에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모 되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과하고, 농축하여 화합물 7-5를 제공하였고, 이를 정제없이 다음 반응에 직접 사용하였다. LCMS (ESI) m/z: 412.2[M + H]+.
단계 5： 화합물 7-5(0.13g, 315.9μmol) 및 TFA(4mL)를 함유하는 디클로로메탄 용액(10mL)을 질소로 3회 교체하였고, 그런 다음 25℃에서 30분 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 용액을 용매를 제거하여 화합물 7-6(130mg, TFA 염)을 제공하였고, 이를 정제없이 다음 반응에 직접 사용하였다. LCMS (ESI) m/z: 312.1[M + H]+.
단계 6: EDCI(88mg, 458.4μmol), HOBt(62mg, 458.4μmol) 및 DIEA(119mg, 916.8μmol, 160μL)를 (1S)-2,2-비플루오로시클로프로필 포름산(37mg, 305.6μmol)을 함유하는 DMF(4mL) 용액에 첨가하였고, 그런 다음 25℃에서 5분 동안 반응하도록 교반하였고, 그런 다음 화합물 7-6(0.13g, 305.6μmol, TFA 염)을 첨가하였고, 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었음을 보여주었다. 코스 생성물을 분리(크로마토그래피 컬럼: Waters Xbridge 150*25, 5μm; 이동상: [H2O(10 mM NH4HCO3)-ACN]; B(CH3CN)%: 20%-50%, 7 분) 및 키랄 분리(크로마토그래피 컬럼: DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*30mm, 10μm); 이동상, A%: (0.1%NH3H2O EtOH); B(CO2)%: (40%-40%))로 화합물 7-7을 제공하였고, SFC 머무름 시간: 3.714분이다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ =9.59 (br d, J=12.05 Hz, 1 H), 7.34 - 7.57 (m, 2 H) , 6.70 - 6.84 (m, 1 H), 4.06 - 4.21 (m, 2 H), 3.92 - 3.99 (m, 1 H), 3.74 - 3.92 (m, 2 H), 1.81 - 2.38 (m, 8 H), 1.59 (dtd, J=11.36, 7.62, 7.62, 3.76 Hz, 1 H) , 1.08 - 1.24 (m, 2 H), 0.79 - 0.96 (m, 2 H) . LCMS (ESI) m/z: 416.0[M + H]+. 분리를 수행하여 화합물 7-8을 제공하였고, SFC 머무름 시간: 4.468분이다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ = 9.48 (br s, 1 H), 7.34 - 7.54 (m, 2 H), 6.76 (br d, J=7.03 Hz, 1 H), 4.03 - 4.25 (m, 2 H), 3.73 - 3.99 (m, 3 H), 2.50 (ddd, J=16.81, 13.18, 8.16 Hz, 1 H), 1.80 - 2.40 (m, 8 H), 1.53 - 1.66 (m, 1 H), 1.05 - 1.23 (m, 2 H), 0.80 - 0.95 (m, 2 H). LCMS (ESI) m/z: 416.0[M + H]+.
실시예 7
단계 1: 질소 분위기에서, 화합물 8-1(1.11g, 5.21mmol), 화합물 1-3, 탄산 칼륨(2.16g, 15.6mmol), 및 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센-팔라듐(II)디클로라이드 디클로로메탄(425mg, 520.6μmol)을 함유하는 혼합된 디옥산(40mL)과 물(10mL) 용액을 질소로 3회 교체되었고, 그런 다음 90℃로 가열하여 3시간 동안 반응하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하여 잔류물을 제공하였고, 급속 컬럼(0~4% 메탄올/디클로로메탄)으로 분리하여 화합물 8-2를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 356.3[M + H]+.
단계 2： 질소(N2) 분위기의 보호하에, 화합물 8-2(2g, 5.6mmol)를 메탄올(100mL) 용액에 용해시키고, 촉매, 즉 건식 팔라듐/탄소(0.5g, 10 %)를 첨가하고, 수소로 3회 교체하였다. 반응 용액을 수소 압력(30Psi) 및 반응 온도 30℃의 조건에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 원료의 50%가 남아 있음을 보여주었다. 촉매를 여과로 제거하고, 새로운 촉매, 즉 건조 팔라듐/탄소(1g)를 첨가하고, 3시간 동안 반응을 계속하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 고체를 규조토로 여과하여 여액을 제공하였고, 이를 감압하에 농축하여 화합물 8-3을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 358.2[M + H]+.
단계3 : (1R)-2,2-디플루오로시클로프로필 카르복실산((1R)-2,2-difluorocyclopropyl carboxylic acid)(282mg, 2.3mmol)을 피리딘(10mL)에 용해시키고, EDCI(4.0g, 21.0mmol) 및 화합물 8-3(0.75g, 2.1mmol)을 첨가하고, 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(30mL)로 희석하고, 디클로로메탄/메탄올(10/1, 50mL * 3)로 추출하였다. 결합된 유기상을 포화 식염수(30mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물은 급속 실리콘 겔 컬럼(0~3% 메탄올/디클로로메탄)으로 분리되었고, 그런 다음 EtOAc로 박동-정제하여 화합물 8-4를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 462.3[M + H]+.
단계 4： 화합물 8-4(300mg, 650.1μmol)를 디클로로메탄(5mL)에 용해시키고, 염산/EtOAc(4M, 10mL)을 첨가하였고, 15℃에서 30분 동안 반응하도록 두었다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 농축하여 화합물 8-5(염산염)을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 362.2[M + H]+.
단계 5： 화합물 8-5(100mg, 251.4μmol, HCl)를 N,N-디메틸포름아미드(5mL)에 용해시키고, HOBt(51mg, 377.0μmol) 및 EDCI(72.28mg, 377.0μmol)를 첨가하였고, 그런 다음 (1S)-2,2-디플루오로시클로프로필 카르복실산(34mg, 276.5μmol) 및 디이소프로필에틸아민(65mg, 502.7μmol)을 첨가하였고, 15℃에서 12시간 동안 반응하도록 두었다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 감압하에 농축하였고, 잔류물을 분취용 PLC(중성 시스템)로 처리하여 화합물 8-6을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4) δ7.59-7.67 (m, 1H), 7.51 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.01 (br d, J=7.53 Hz, 1H), 3.92-4.20 (m, 2H), 3.79-3.88 (m, 1H), 3.67-3.77 (m, 1H), 3.43-3.57 (m, 1H), 2.81 (br s, 1H), 2.62 (dq, J=7.78, 11.96 Hz, 1H), 2.07-2.24 (m, 5H), 1.52-2.05 (m, 7H). LCMS (ESI) m/z: 466.2[M + H]+.
화합물 8-6에 사용된 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 8-5로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물 8-7 및 8-8을 얻었다(화합물 8-6과 다른 치환기를 가진 카르복실산 화합물이 추가되었다):
화합물 8-7, 코스 생성물은 정제를 위해 분취용 HPLC(중성 시스템)에 의해 처리되었다. 1 H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ 7.59-7.66 (m, 1H), 7.51 (d, J=8.78 Hz, 1H), 6.97-7.04 (m, 1H), 4.30 (d, J=4.27 Hz, 1H), 4.18 (d, J=4.27 Hz, 1H), 3.87 (s, 1H), 3.76 (s, 1H), 3.49 (br t, J=11.80 Hz, 1H), 2.81 (br s, 1H), 2.05-2.28 (m, 5H), 1.74-1.96 (m, 3H), 1.53-1.70 (m, 2H), 1.23-1.33 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 448.2[M + H]+.
화합물 8-8, 코스 생성물은 정제를 위해 분취용 HPLC(중성 시스템)에 의해 처리되었다. 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ7.59-7.67 (m, 1H), 7.51 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.00 (t, J=7.40 Hz, 1H), 4.61 (s, 2H), 3.69-4.11 (m, 4H), 3.41-3.54 (m, 1H), 2.82 (br s, 1H), 2.04-2.26 (m, 5H), 1.72-1.93 (m, 3H), 1.61 (q, J=11.80 Hz, 2H). LCMS (ESI) m/z: 429.0[M + H]+.
화합물 8-9의 합성: 중간체 8-5(100mg, 227.6μmol, TFA)를 N,N-디메틸포름아미드(5mL)에 용해시키고, 탄산 칼륨(94mg, 682.7μmol) 및 2-브로모아세토니트릴(30mg, 250.3μmol)을 첨가하였고, 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(5 mL)로 희석하고, 디클로로메탄/메탄올(10/1, 10mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수(10mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 그런 다음 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 정제를 위해 분취용 HPLC(중성 시스템)로 처리하여 화합물 8-9를 제공하였다. 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ 7.59-7.66 (m, 1H), 7.50 (d, J=8.78 Hz, 1H), 6.99 (d, J=7.53 Hz, 1H), 3.62 (s, 2H), 3.46 (br t, J=12.05 Hz, 1H), 3.33 (s, 2H), 3.21 (s, 2H), 2.80 (br s, 1H), 2.14 (br d, J=9.79 Hz, 5H), 1.82-1.95 (m, 1H), 1.52-1.77 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 401.0[M + H]+.
실시예 8
단계 1: (S)-2,2-디플루오로시클로프로필 카르복실산((S)-2,2-difluorocyclopropyl carboxylic acid)(1.13g, 9.2mmol)을 피리딘(150mL)에 용해시키고, EDCI(16.1g, 84mmol) 및 화합물 8-3(3g, 8.4mmol)을 첨가하고, 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 aq(100 mL)로 희석하고, 그런 다음 디클로로메탄/메탄올(10/1, 100mL * 3)로 추출하였다. 결합된 유기상을 포화 식염수(30mL)로 세척하고, 그런 다음 무수 황산나트륨으로 건조하였고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물은 급속 컬럼(0~3% 메탄올/디클로로메탄)으로 분리되었으며, 이후 EtOAc를 사용하여 박동-정제하여 화합물 9-1을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 462.3[M + H]+.
단계 2: 화합물 9-1(2.3g, 4.9mmol)을 디클로로메탄(5mL)에 용해시키고, 염산/EtOAc(4M, 20mL)를 첨가하였고, 15℃에서 30분 동안 반응하도록 두었다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었고, 표적 분자 이온 피크가 감지되었다. 석출된 고체를 여과하고, 건조하여 화합물 9-2(염산염)을 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 362.2[M + H]+.
단계 3： 화합물 9-2(1.23g, 3.1mmol, HCl)를 N,N-디메틸포름아미드(20mL)에 용해시키고, HOBt(626mg, 4.6mmol) 및 EDCI(889mg, 4.6mmol)를 첨가하고, 그런 다음 (1S)-2,2-디플루오로시클로프로필 카르복실산(414.92mg, 3.40mmol) 및 디이소프로필에틸아민(798.70mg, 6.18mmol)을 첨가하였고, 15℃에서 12시간 동안 반응하도록 두었다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(10mL)로 희석하고, 디클로로메탄/메탄올(10/1, 50mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수(10mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 분취용 HPLC(중성 시스템)에 의해 처리하여 화합물 9-3을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4) δ 7.63 (dd, J=7.53, 8.78 Hz, 1H), 7.51 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.01 (br d, J=7.28 Hz, 1H), 3.92-4.19 (m, 2H), 3.79-3.87 (m, 1H), 3.67-3.76 (m, 1H), 3.44-3.55 (m, 1H), 2.52-2.92 (m, 2H), 1.53-2.25 (m, 12H). LCMS (ESI) m/z: 466.1[M + H]+.
화합물 9-3에서 사용한 것과 동일한 합성 및 분리 방법을 사용하여 공통 중간체인 화합물 9-2로부터 다음과 같은 특성 데이터를 갖는 다음 화합물 9-4, 9-5를 얻었다(화합물 9-3과 다른 치환기를 갖는 카르복실산 화합물이 추가되었다):
*화합물 9-4: 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ 7.58-7.68 (m, 1H), 7.51 (d, J=8.78 Hz, 1H), 6.97-7.05 (m, 1H), 4.30 (d, J=4.02 Hz, 1H), 4.18 (d, J=4.27 Hz, 1H), 3.87 (s, 1H), 3.76 (s, 1H), 3.49 (br t, J=11.80 Hz, 1H), 2.82 (br s, 1H), 2.07-2.25 (m, 5H), 1.73-1.95 (m, 3H), 1.51-1.70 (m, 2H), 1.24-1.35 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 448.2[M + H]+.
화합물 9-5: 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ 7.58-7.68 (m, 1H), 7.51 (d, J=9.03 Hz, 1H), 7.00 (t, J=7.53 Hz, 1H), 4.61 (s, 2H), 3.69-4.10 (m, 4H), 3.43-3.55 (m, 1H), 2.82 (br s, 1H), 2.05-2.25 (m, 5H), 1.72-1.97 (m, 3H), 1.51-1.69 (m, 2H). LCMS (ESI) m/z: 429.0[M + H]+.
화합물 9-6의 합성: 중간체 화합물 9-2(190mg, 525.8μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(5mL)에 용해시키고, 탄산 칼륨(218mg, 1.6mmol) 및 2-브로모아세토니트릴(70mg, 578.3μmol)을 첨가하였고, 반응 용액을 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 용액을 물(5 mL)로 희석하고, 디클로로메탄/메탄올(10/1, 10mL)로 추출하였고, 유기상을 포화 식염수(10mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 정제를 위해 분취용 HPLC(중성 시스템)로 처리하여 화합물 9-6을 제공하였다. 1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ7.58-7.66 (m, 1H), 7.50 (d, J=8.53 Hz, 1H), 6.99 (d, J=7.28 Hz, 1H), 3.62 (s, 2H), 3.46 (br t, J=11.42 Hz, 1H), 3.33 (s, 2H), 3.21 (s, 2H), 2.81 (br s, 1H), 2.14 (br d, J=10.29 Hz, 5H), 1.81-1.95 (m, 1H), 1.51-1.78 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 401.2[M + H]+.
*실시예 9
단계 1: 화합물 10-1(100mg, 334.3μmol), 화합물 3-3(126mg, 334.3μmol), Pd(dppf)Cl2(25mg, 33.4μmol) 및 탄산 칼륨(139mg, 1.00mmol) 함유하는 혼합 디옥산(12mL) 및 H2O(3mL)를 질소로 3회 교체되었고, 90℃에서 2시간 동안 질소 분위기에서 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 주요 피크는 표적 분자 이온 피크로 검출되었다. 반응 용액을 여과 및 농축하여 용매를 제거하고, 조제 판을 이용하여 분리 및 정제하여 화합물 10-2를 제공하였다. LCMS (ESI) m/z: 470.4[M + H]+.
단계 2: 화합물 10-2(130mg, 276.9μmol) 및 HCl/EtOAc(4M, 2mL)를 함유하는 디클로로메탄(1mL) 용액을 25℃에서 5분 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 주요 피크는 표적 분자 이온 피크로 검출되었다. 반응 용액을 감압 농축하여 황색 고체 화합물 10-3(120mg, 염산염)을 제공하고, 이를 정제하지 않고 다음 반응에 직접 사용하였다. LCMS (ESI) m/z：370.6[M + H]+.
단계 3: 질소 분위기에서, Pd/C(20mg, 10%)를 화합물 10-3(120mg, 295.6μmol, 염산염)을 함유하는 MeOH(25mL) 용액에 첨가하였다. 현탁액을 수소로 3회 교체하고, 그런 다음 25℃의 질소 분위기(15Psi)에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 주요 피크는 표적 분자 이온 피크로 검출되었다. 반응 용액을 여과하고, 감압 농축하여 용매를 제거하였고, 화합물 10-4(130mg, 염산염)를 제공하였고, 이를 정제없이 다음 반응에 직접 사용하였다. LCMS (ESI) m/z: 372.3[M + H]+.
단계 4: 화합물 10-4(130mg, 318.7μmol, 염산염), 2-시아노아세트산(33mg, 382.4μmol), EDCI(92mg, 478μmol), HOBt(65mg, 478μmol) 및 DIEA(206mg, 1.6mmol, 277.6μL)를 함유하는 DMF(5mL) 용액을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLCMS는 원료가 완전히 소모되었음을 보여주었고, 표적 분자 이온 피크가 검출되었다. 반응 용액을 감압 농축하여 용매를 제거하였고, 그런 다음 분리하여 화합물 10-5(중성 계)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d 4) δ =7.57-7.65 (m, 1H), 7.49-7.55 (m, 1H), 3.59-3.81 (m, 3H), 3.44-3.54 (m, 2H), 3.34-3.38 (m, 2H), 2.48 (br s, 2H), 1.81-2.04 (m, 5H), 1.64-1.77 (m, 2H), 1.36-1.58 (m, 4H), 0.86-1.12 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 439.1[M + H]+.
생물학적 활성 테스트
실험예 1： Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2 키나제(kinases) 활성 in vitro 시험
재료
재조합 인간 JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2 프로테아제, 대부분의 장치 및 시약은 Eurofins(영국)에서 공급받았다.
방법
JAK2, JAK3 및 TYK2의 희석: 20mM 3-(N-모르폴린)프로판설폰산(3-(N-morpholine)propanesulfonic acid, MOPS), 1mM EDTA, 0.01% Brij-35.5% 글리세롤, 0.1% β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1mg/mL BSA; JAK1의 희석: 20mM TRIS, 0.2mM EDTA, 0.1% β-메르캅토에탄올, 0.01% Brij-35.5% 글리세롤. 모든 화합물은 100% DMSO 용액으로 준비되었으며 농도는 최종 측정 농도인 50 배에 도달했다. 시험 화합물은 3배 농도 구배로 희석되었고, 최종 농도는 10μM에서 0.001μM까지 9가지 농도였다. 검출 반응에서 DMSO의 함량은 2%였다. 이 화합물의 저장 용액을 첫 번째 성분으로 웰에 첨가하고, 그런 다음 다른 구성 요소는 다음 세부 프로세스로 추가되었다.
JAK1(h)의 효소 반응
JAK1(h)는 20mM Tris/HCl pH7.5, 0.2mM EDTA, 500μM MGEEPLYWSFPAKKK, 10mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 맞춤화 됨)와 함께 배양되었다. Mg/ATP의 혼합물을 첨가하여 반응을 시작하고, 이는 실온에서 40분 배양한 후 0.5% 인산을 첨가하여 중단시켰다. 그런 다음 10μL의 반응물을 P30 필터 패드에 분산시키고, 4분 이내에 0.425% 인산으로 3회 및 메탄올로 1회 세척하고, 건조하고, 섬광물을 세었다.
JAK2(h)의 효소 반응
JAK2(h)는 8mM MOPS pH7.0, 0.2mM EDTA, 100μM KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC, 10mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 맞춤화 됨)와 함께 배양되었다. Mg/ATP의 혼합물을 첨가하여 반응을 시작하고, 이는 40분 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 중단시켰다. 그런 다음 10μL의 반응 용액을 P30 필터 패드에 분산시키고, 4분 이내에 0.425% 인산으로 3회 및 메탄올로 1회 세척하고, 건조하고, 섬광물을 세었다.
JAK3(h)의 효소 반응
JAK3(h)는 8mM MOPS pH7.0, 0.2mM EDTA, 500μM GGEEEEYFELVKKKK, 10mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 맞춤화 됨)와 함께 배양되었다. Mg/ATP의 혼합물을 첨가하여 반응을 시작하고, 이는 40분 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 중단시켰다. 그런 다음 10μL의 반응 용액을 P30 필터 패드에 분산시키고, 4분 이내에 0.425% 인산으로 3회 및 메탄올로 1회 세척하고, 건조하고, 섬광물을 세었다.
TYK2(h)의 효소 반응
TYK2(h)는 8mM MOPS pH7.0, 0.2mM EDTA, 250μM GGMEDIYFEFMGGKKK, 10mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도 맞춤화 됨)와 함께 배양되었다. Mg/ATP의 혼합물을 첨가하여 반응을 시작하고, 이는 40분 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 중단시켰다. 그런 다음 10μL의 반응 용액을 P30 필터 패드에 분산시키고, 4분 이내에 0.425 % 인산으로 3회 및 메탄올로 1회 세척하고, 건조하고, 섬광물을 세었다.
데이터 분석
IC50의 결과는 IDBS의 XLFIT5(205 공식) 분석에 의해 제공되었고, 자세한 내용은 표 1에 나와 있다.
생체 내(in vitro) 화합물 스크리닝 시험 결과
Compounds TYK2
(IC50, nM)		 JAK1
(IC50, nM)		 JAK2
(IC50, nM)		 JAK3
(IC50, nM)
1-7 38 6 60 3834
1-8 27 14 78 2939
1-9 366 34 315 >10000
1-10 311 32 426 >10000
1-11 18 15 198 >10000
1-12 360 45 527 >10000
1-13 36 3 37 1517
1-14 134 12 144 5035
1-15 106 20 208 9669
1-16 581 114 1020 >10000
1-17 371 65 791 >10000
3-7 26 3 40 1002
3-8 26 20 80 2323
3-9 155 54 294 >10000
4-6 307 170 2008 8448
4-7 194 436 7685 >10000
4-8 >10000 244 3711 364
5-7 67 31 324 5759
5-8 692 75 789 7349
5-9 278 68 520 >10000
5-10 1526 131 2730 >10000
6-7 829 63 998 9391
6-8 570 381 1924 >10000
7-7 830 63 1632 >10000
7-8 404 176 2313 >10000
8-6 127 14 110 7637
8-7 1032 63 5463 >10000
8-8 109 60 1376 >10000
8-9 1329 52 3672 >10000
9-3 105 7 292 >10000
9-4 1186 253 982 >10000
9-5 175 224 624 >10000
9-6 1388 432 1174 >10000
10-5 430 336 812 5410
결론: 본 출원의 화합물은 키나제 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2 키나제의 4 가지 아형의 활성에 대한 in vitro 시험에서 JAK1 및/또는 TYK2에 대한 우수한 선택 억제를 나타냈다.
실험예 2: 약동학(PK) 테스트
시험 화합물을 용해하여 얻은 투명한 용액을 꼬리 정맥에 주입하고 수컷 마우스(C57BL/6) 또는 래트(rat)(SD)(하룻밤 금식, 7-8주령)에게 위내 투여하였다. 시험 화합물 투여 후, 정맥 투여군(2mg/kg)은 0.117, 0.333, 1, 2, 4, 7, 24시간 및 정맥 투여군(15mg/kg)은 0.25, 0.5, 1, 2 , 4, 8, 24시간 후, 하악 정맥에서 혈액을 채취하고 원심 분리하여 혈장을 얻었다. LC-MS/MS 방법을 사용하여 혈장 농도를 결정하였고, WinNonlin™ 버전 6.3 약동학 소프트웨어는 비-구획 모델 선형 로그 래더 방법 매개 변수에 의해 관련 약동학을 계산하는 데 사용되었다. 테스트 결과는 다음과 같다:
마우스에서 화합물 1-11의 PK 시험 결과
PK 매개 변수 결과
T1/2 (hr) 2.99
Cmax (nM) 5745
AUC0-inf (nM.hr) 9918
생체 이용률 (%)a 42.1%
마우스에서 화합물 1-13의 PK 시험 결과
PK 매개 변수 결과
T1/2 (hr) 1.61
Cmax (nM) 5105
AUC0-inf (nM.hr) 9917
생체 이용률 (%)a 38.1%
마우스에서 화합물 3-7의 PK 시험 결과
PK 매개 변수 결과
T1/2 (h) 4.74
Cmax (nM) 7380
AUC0-inf (nM.h) 17969
생체 이용률 (%)a 50.1%
참고: T1/2 : 반감기; Cmax: 피크 농도; AUC0-inf： 시간 0에서 무한대까지의 혈장 농도-시간의 AUC;결론: 본 출원의 화합물은 생체 이용률이 좋고, 노출이 높으며, 생체 내 효능이 우수하다.
실험예 3： 마우스의 콜라겐-유도성 관절염(CIA)의 생체 내( in vivo ) 효능 연구
실험 목적:
류마티스 관절염(RA)은 전 세계 발병률이 약 1%인 여러 자가 면역 질환의 한 유형이고, 이는 관절염의 염증, 손상 및 기형을 초래하고, 심각한 상황에서는 전신 염증 반응을 초래한다. RA 치료제에 대한 연구는 류마티스 관절염의 증상을 완화하는 데 도움이 될 수 있으며, 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다. 콜라겐-유도성 마우스 관절염 모델은 RA 치료에서 약물의 효능을 평가하는 데 자주 사용되는 동물 모델이다. 그것의 병인과 증상은 RA 질환과 상당히 관련이 있다. B 세포와 T 세포의 뼈 콜라겐에 대한 반응성은 모델에 II 형 콜라겐을 주입하여 활성화되고, 활성화된 B 세포와 T 세포가 관절 부위로 들어가 관절 손상을 일으키며, 이는 인간 류마티스 관절염과 유사한 일련의 증상을 유발한다. 관절염 후보 화합물의 임상 전에 류마티스에 대한 약물 치료 평가, 마우스의 콜라겐-유도성 관절염은 종종 그 효과를 평가하는 데 사용된다.
실험의 목적은 마우스의 콜라겐-유도성 관절염에서 화합물 1-13, 화합물 3-7 및 참조 화합물 필고티닙(Filgotinib)의 치료 효과를 연구하여, 후속 임상 연구를위한 전임상 약력학적 정보를 제공하는 것이다.
실험 방법:
1. 유형 II 콜라겐/완전 프로인트 보조제 면역
아세트산의 제조: 2N 아세트산을 100mM로 희석하고, 0.22micron 필터 막으로 여과하고, 4℃에서 보관했다.
소 타입 2 콜라겐(CII)을 100mM 아세트산 용액에 용해시키고, 그런 다음 4℃에서 밤새 보관했다. 콜라겐의 최종 농도는 8mg/ml이다.
에멀젼의 준비: 밤새 저장된 CII 용액을 동일한 부피의 완전 프로인트 보조제와 혼합하고, 용액이 안정된 에멀젼을 형성할 때까지 약 60분 동안 분당 30,000 회전으로 고속 균질화 기에서 얼음 위에서 균질화했다.
2. 관절염 도입:
마우스는 무작위로 다른 처리 그룹으로 나뉘었다. 첫 번째 예방 접종 날짜는 0일로 기록되고, 다음 날짜는 순서대로 표시된다.
DBA/1 마우스를 이소플루란으로 마취하고 준비된 콜라겐 에멀젼(200mg CII 함유) 50ml를 피하(꼬리 뿌리로부터 2~3cm)로 주사했다. 21 일째에, 꼬리에 같은 양의 콜라겐 에멀젼을 같은 방식으로 주입했다. 정상 그룹의 마우스는 면역되지 않았다.
3. 투여 및 투여량 설계
평균 임상 점수가 약 1인, 28일에, 중등도 발병률을 가진 50마리의 마우스(mouse)를 체중과 점수를 기준으로 5개의 처리 그룹으로 무작위로 나누었으며, 각 그룹에는 8 마리의 마우스가 있다.
덱사메타손(Dexamethasone, Dex.)은 0.3mg/kg(CIA 모델에서 일반적으로 사용되는 투여량)의 투여량으로 모델이 성공적으로 확립되었는지 여부를 측정하기 위한 참조 약물로 사용되었다. 또한, 예비 실험 결과에 따라, 시험 화합물 1-13, 화합물 3-7 및 기준 화합물 필고티닙의 투여량을 결정하고 표 5에 나타내었다: 첫 번째 그룹은 치료를 받지 않은 정상 마우스다. 두 번째 그룹은 용매만 제공된 블랭크 그룹이다. 세 번째 그룹은 0.3mg/kg 투여량의 덱사메타손을 투여받았다. 여섯 번째 그룹, 일곱 번째 그룹 및 여덟 번째 그룹에는 15mg/kg의 투여량을 투여받았다. 총 14일 동안 하루에 두 번 투여되었다.
복투여량 및 그룹화 설계
그룹 시험 약물 이름 마리 수 투여 경로 농도
(mg/mL)		 투여량
(mg/kg)		 투여 빈도
G1 정상 5 N/A N/A N/A N/A
G2 블랭크(용매 대조군) 8 p.o. N/A N/A bid, 14days
G3 덱사메타손 (Dex.) 8 p.o. 0.03 0.3 qd, 14days
G6 화합물 1-13 8 p.o. 1.5 15 bid, 14days
G7 화합물 3-7 8 p.o. 1.5 15 bid, 14days
G8 필고티닙 8 p.o. 1.5 15 bid, 14days
참고: p.o.: 구두; bid: 하루에 두 번; qd: 하루에 한 번.
4. 관절염 발병률 측정
임상 관찰: 면역 7일 전부터 면역 후 21 일까지, DBA/1 마우스의 기본 건강 상태와 체중 변화를 매일 관찰했다(주 1회 기록). 22일 이후에는, 실험이 끝날 때까지 매일 생쥐의 건강 상태, 발생 상황 및 체중 변화를 관찰했다(적어도 주 3회 기록).
임상 점수: 마우스의 발병률은 면역 기능을 강화한 후 매일 관찰되었다. 마우스가 공격을 받은 후(관절염의 임상적 증상을 보임), 발병률은 질병의 다른 수준(발적, 관절 변형)에 따른 점수 기준으로 0-4점으로 평가되었다. 각 사지의 최고 점수는 4점이며, 각 동물의 최고 점수는 16점이다. 채점 기준은 표 6에 나와 있다. 평가는 일주일에 세 번 수행되었다.
관절염의 임상 점수 기준
점수 임상 증상
0 홍반 및 부기 없음
1 발목 뼈, 발목 또는 중족골 근처의 홍반 또는 약간의 부종, 한쪽 발가락의 부종
2 발목과 중족골의 경미한 홍반 및 부기 또는 두 개 이상의 발가락에 부종
3 발목 및 손목 관절과 중족골의 중등도 홍반 및 부기
4 모든 발목 및 손목 관절, 중족골 및 발가락에 심한 부종
5. 통계 처리
실험 데이터는 평균 ± 표준 오차(평균 ± SEM)로 표현되고, 곡선 아래 면적(AUC)은 일원 분산 분석으로 분석된다. P<0.05는 중요한 것으로 간주된다.
실험 결과:
1. 임상 점수 및 발병률:
첫 번째 면역 후 28일(두 번째 면역 후 7일)에, 마우스는 관절염의 임상 증상을 보이기 시작했다. 투여는 28일에 시작되었다. 자세한 실험 결과는 표 5 및 도 1에 나와 있다. 용매 대조군의 평균 임상 점수는 점차 증가하여, 41일에 5.8에 도달하였고, 콜라겐-유도 관절염 모델이 성공적으로 확립되었음을 나타낸다. 15mg/kg의 동일한 투여량의 화합물 1-13, 3-7 및 필고티닙은 실험의 종점(41일)에서 관절염 마우스의 임상 점수를 상당히 감소시킬 수 있다. 동일한 투여량에서 화합물 1-13, 3-7 및 필고티닙의 평균 점수가 1.5, 3.0 및 5.6 점으로 떨어졌고(표 5의 값 참조), 15mg/kg의 화합물 1-13, 3-7이 콜라겐-유도성 관절염을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 덱사메타손 0.3mg/kg (G3 그룹) 치료는 콜라겐-유도성 관절염의 임상 점수를 유의하게 억제할 수 있으며, 27일부터, 임상 점수는 약 0.3으로 유지되고 31일(임상 점수가 0으로 떨어짐, 표 7의 값 참조) 곡선과 정상 그룹 곡선 (G1 그룹)은 실험이 끝날 때까지 일치한다(도 1 참조).
본 출원의 평균 임상 점수 *
날짜(Date) G1 정상(Normal) G2 블랭크 군(Blank) G3 Dex G6 화합물 1-13 G7 화합물 3-7 G8 필고티닙(Filgotinib)
21 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
24 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
27 0.00±0.00 0.38±0.18 0.25±0.16 0.50±0.19 0.50±0.19 0.25±0.16
28 0.00±0.00 0.50±0.19 0.50±0.27 0.63±0.26 0.63±0.26 0.63±0.26
29 0.00±0.00 1.38±0.38 0.25±0.16 1.00±0.38 0.75±0.25 0.88±0.40
31 0.00±0.00 2.50±0.73 0.00±0.00 1.38±0.53 1.00±0.33 1.88±0.81
34 0.00±0.00 4.25±0.73 0.00±0.00 1.50±0.63 1.63±0.38 2.63±0.82
36 0.00±0.00 4.75±1.08 0.00±0.00 1.75±0.67 2.50±0.46 3.88±1.27
38 0.00±0.00 5.38±1.00 0.00±0.00 1.88±0.77 3.13±0.58 4.88±1.39
41 0.00±0.00 5.75±0.96 0.00±0.00 1.50±0.71 3.00±0.60 5.63±1.45
* 참고: 평균 임상 점수 ± 표준 오류
각 그룹에서 각 동물의 임상 점수 곡선을 분석하여, 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하고, 용매 대조군에 대한 각 투여군의 억제율(inhibition rate)은 그룹 간 AUC 평균으로 계산되었다. 자세한 결과는 표 8 및 도 2에 나와 있다. 화합물 1-13, 3-7 및 필고티닙은 15mg/kg의 동일한 투여량으로 관절염 동물의 임상 점수 AUC를 감소시킬 수 있고, 억제율은 각각 59.9%, 48.6% 및 18.7%이다. 덱사메타손은 또한 97.3%의 억제율로 관절염 동물의 임상 점수를 상당히 감소시킬 수 있다.
발병률 AUC *
G2 블랭크 군(Blank) G3 Dex G6 화합물 1-13 G7 화합물 3-7 G8 필고티닙(Filgotinib)
AUC±SEM 51.75±10.97 1.38±0.81 20.75±8.05 26.63±4.57 42.06±12.50
Inhibition rate N/A 97.3% 59.9% 48.6% 18.7%
* 참고: 곡선 아래 영역의 값은 동물의 임상 소프트웨어 Graphpad Prism ® 에 따라 적합하고, 그들은 투여 기간 동안 각 그룹에서 각 마우스의 발병률 곡선 아래 면적이다. 억제율(inhibition rate) = (블랭크 그룹의 평균 곡선 아래 면적 값-투여 그룹의 곡선 아래 면적의 평균) / 블랭크 그룹의 곡선 아래 면적의 평균
다양한 치료 인자가 콜라겐-유도성 관절염의 발병률에도 영향을 미칠 수 있다. 실험의 자세한 결과는 표 7 및 도 3에 나와 있다. 시험 화합물 1-13의 발병률은 29일에 63%에 이르렀고 실험이 끝날 때까지 유지되었다(표 9의 특정 값 참조). 화합물 3-7의 발병률은 34일에 88%에 도달했으며, 끝까지 100%를 유지했다. 필고티닙그룹의 발병률은 초기 투여 후 감소하고, 그런 다음 마지막 투여 후 100%까지 점진적으로 증가했다. 용매 대조군의 관절염 발생률은 면역 후 34일에 100%에 도달하였고, 유지되었다; 양성 대조군인 덱사메타손 0.3mg/kg 그룹의 발병률은 투여 후 감소하기 시작하여 31일에 0%로 감소하였다.
본 출원의 발병률*
날짜(Date) G1 정상(Normal) G2 블랭크 군(Blank) G3 Dex G6 화합물 1-13 G7 화합물 3-7 G8 필고티닙(Filgotinib)
21 0% 0% 0% 0% 0% 0%
24 0% 0% 0% 0% 0% 0%
27 0% 38% 25% 50% 50% 25%
28 0% 50% 38% 50% 50% 50%
29 0% 75% 25% 63% 63% 50%
31 0% 75% 0% 63% 75% 75%
34 0% 100% 0% 63% 88% 88%
36 0% 100% 0% 63% 100% 88%
38 0% 100% 0% 63% 100% 88%
41 0% 100% 0% 63% 100% 100%
* 참고: 발병률 = 각 그룹에서 병원성 동물의 수 / 각 그룹에서 동물의 총 수 * 100%
2. 체중
실험의 자세한 결과는 표 8 및 도 4에 나와 있다. 정상군에 비해, 면역 및 모델링 후 마우스의 체중이 면역 후 감소하였고, 각 투여 그룹의 체중은 28일에서 34일까지 감소하였고(도 4 참조), 그런 다음 천천히 회복하기 시작했다. 덱사메타손 그룹이 가장 큰 체중 감소를 보였지만, 다른 그룹과 비교했을 때 유의한 차이는 없었다. 화합물 1-13, 3-7 및 필고티닙 그룹 간에 유의한 차이가 없었고, 그 체중은 기본적으로 동일한 방식으로 변화되어(표 10의 특정 값 참조), 이 화합물은 쥐의 체중에 많은 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
본 출원에서 평균 체중*
날짜(Date) G1 정상(Normal) G2 블랭크 군(Blank) G3 Dex G6 화합물 1-13 G7 화합물 3-7 G8 필고티닙(Filgotinib)
21 22.30±1.10 22.38±0.23 22.41±0.26 22.38±0.30 22.59±0.27 22.63±0.27
24 23.00±1.07 21.89±0.67 22.36±0.20 22.33±0.37 22.66±0.28 22.50±0.33
27 23.22±1.11 21.96±0.63 22.35±0.25 21.99±0.44 22.10±0.33 22.25±0.32
28 23.12±1.12 22.14±0.56 22.43±0.26 22.08±0.51 22.36±0.30 22.30±0.35
29 23.30±1.15 21.89±0.47 21.51±0.23 21.59±0.41 22.26±0.38 21.95±0.40
31 23.78±1.17 21.64±0.48 21.24±0.23 21.80±0.58 22.40±0.42 21.61±0.49
34 23.70±1.24 22.21±0.54 20.71±0.26 22.18±0.53 22.25±0.49 21.46±0.57
36 24.26±1.36 22.40±0.52 21.28±0.20 22.53±0.47 22.46±0.42 21.84±0.61
38 23.56±1.32 21.79±0.44 19.91±0.20 22.09±0.40 21.88±0.49 20.88±0.54
41 24.24±1.42 23.06±0.49 20.84±0.30 22.99±0.34 22.59±0.43 22.30±0.52
* 참고: 평균 체중 ± 표준 오차
결론: 콜라겐-유도성 마우스 관절염(CIA) 모델에서, 본 출원에 따른 화합물은 마우스의 체중에 큰 영향을 미치지 않고, 질병에 대해 좋은 치료 효과를 보였으며, 동일한 투여량에서 필고티닙 보다 생체 내(in vivo) 효능이 더 좋다.
실험예 4： 보조제 유도성 관절염(AIA)의 생체 내( in vivo ) 효능 연구
실험 목적 :
보조제 유도성 관절염(AIA) 래트(rat) 모델은 류마티스 관절염 질환 연구 및 신약 개발에서 일반적으로 사용되는 동물 모델 중 하나다. 그 병인 및 임상 증상은 인간 류마티스 관절염과 유사하다. 이 모델은 결핵균(mycobacterium tuberculosis)을 발바닥에 주입하여 뼈 및 관절 손상 기능을 가진 면역 세포와 항체를 유도하여, 관절 부종, 골 용해, 활액 손상 및 인간 류마티스 관절염과 유사한 기타 증상으로 나타나는 전신 반응을 유발한다. 이 실험의 목적은 덱사메타손과 필고티닙을 기준 화합물로 사용하여 보조제-유도성 관절염 래트 모델에 대한 화합물 1-13의 치료 효과를 평가하는 것이다. 이 실험에는 정상 그룹(정상 그룹), 용매 대조군(운반체 그룹), 화합물 1-13 1 mg/kg BID, 3mg/kg BID, 10mg/kg BID 및 30mg/kg BID 투여량 그룹, 양성 약물 덱사메타손 0.3 mg/kg QD 그룹 및 참조 화합물 필고티닙 30mg/kg BID 그룹의 8개 그룹이 있다. 정상군을 제외하고, 모든 래트는 0일째에 왼발에 프로인트 완전 보고제를 피하 주사하여 관절염을 유도하였다. 실험 프로토콜에 따라서, 체중과 점수에 따라 그룹을 나누고, 투여는 13번째 날에 시작하여, 14일 동안 계속되었다. 실험 동안, 래트의 체중, 발 부피(13번째 날 이후 일주일에 3회 측정) 및 임상 점수를 모니터링했다. 실험이 끝날때, 병리학적 점수 분석을 위해 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, HE) 염색을 위해 래트의 오른쪽 뒷발을 수집했다.
실험 방법:
1. 관절염 모델
보조제 준비: 100mg의 결핵균 H37Ra를 칭량하고, 약 5분 동안 분쇄하고, 3mL의 파라핀 오일을 첨가하여 분말을 용해시키고, 갈색 디스펜스 병에 옮겼다. 모르타르(mortar)를 3 mL 및 4 mL의 파라핀 오일로 두 번 세척하고, 모든 오일을 갈색 디스펜스 병에 옮겼고, 이의 최종 농도는 10mg/mL였다. 용액을 얼음-물 혼합물에서 초음파로 약 30분 동안 깨뜨렸다.
2. 관절염 유도
제조된 보조제를 흔들어 균질화하였고, 1mL 유리 주사기(20G 바늘)를 드로잉하여 기포를 제거하였고, 그런 다음 25G 바늘로 하였다. 래트를 이소플루란으로 마취시켰다. 예방 접종 전에, 주사기를 뒤집어서, 결핵균이 완전히 혼합되도록 하였다. 마취 후, 0.1mL의 보조제를 래트의 왼발 발바닥에 피하 주사하였다. 정상군 래트의 발바닥에 파라핀 오일 0.1 mL를 피하 주사 한 날은 0번째 날이었다.
3. 투여
13번째 날에는, 모든 동물이 홍반이나 발의 부기 등 관절염 증상을 보였고, 점수, 발 크기 및 체중에 따라 계층화되고 무작위로 그룹화 되었다. 그룹화는 표 9에 나와 있다. 70마리의 래트를 7개 그룹, 각 그룹에 10마리, 정상 그룹에 5마리로 나누었다. 표 11에 따르면, 각 군의 투여량은 다음과 같다. 위내 투여 부피는 5 mL/kg이었다. 화합물은 총 14일 동안 하루에 두 번 투여되었다.
그룹화 및 투여량 설계
그룹 시험 약물 마리 수 투여 농도
(mg/mL)		 투여량
(mg/kg)		 투여 빈도
G1 정상(Normal) 5 N/A N/A N/A N/A
G2 운반체(Vihecle) 10 p.o. N/A N/A bid, 14days
G3 덱사메타손 (Dex.) 10 p.o. 0.06 0.3 qd, 14days
G4 필고티닙(Filgotinib) 10 p.o. 6 30 bid, 14days
G5 화합물 1-13 10 p.o. 0.2 1 bid, 14days
G6 화합물 1-13 10 p.o. 0.6 3 bid, 14days
G7 화합물 1-13 10 p.o. 2 10 bid, 14days
G8 화합물 1-13 10 p.o. 6 30 bid, 14days
4. 관절염 발병률 결정
체중: 래트의 체중을 13일부터 27일까지 일주일에 3회 측정했다.
발 부피: 예방 접종 전 1회, 13일부터 27일까지 일주일에 3회 측정하였다.
평가: 평가는 13일부터 27일까지 주 3회 진행되었다. 병변의 정도(발적, 관절 변형)와 0~4점의 기준에 따라, 각 사지의 최고 점수는 4점이고, 각 동물의 최고 점수는 12점이다(주사 측의 왼쪽 뒷다리 제외). 평가 기준은 표 12에 나와 있다.
관절염의 임상 평가 기준
Scores 임상 증상
0 홍반 및 부기 없음
1 근처의 족골 뼈 또는 발목 또는 중족골 뼈의 홍반 또는 약간의 부종 또는 한쪽 발가락의 홍반 및 부기
2 발목 및 중족골의 경미한 홍반 및 부기, 두 개 이상의 발가락의 홍반 및 부기
3 발목, 손목 관절 및 중족골의 중등도 홍반 및 부기
4 모든 발목, 손목 관절, 중족골 및 발가락에 심한 부종
5. 병리학적 분석
27일째에, 래트를 안락사시켰다. 채혈 후, 래트의 오른쪽 뒷다리를 채취하여, 10% 포르말린 용액에 담그고, 포름산 용액으로 석회를 제거하고, 파라핀에 묻고, 절편하고, HE 염색하고, 현미경으로 관찰했다. 관절 손상 정도는 4가지 측면에서 평가되었다: 염증 세포 침윤, 판누스(pannus) 형성, 연골 손상 및 골 재흡수, 그리고 0-4점 기준에 따라 점수를 매겼다. 평가 기준은 다음과 같다(표 13).
관절염의 병리학 점수 기준
병변 병변 특성 점수
염증 세포 침윤 염증 세포는 관찰되지 않았다; 0
활막하 세포는 최소한의 세포 침윤으로 섬유화되었다； 1
소수의 단핵 세포가 침윤하면서 활액 세포가 증식했다; 2
활액 세포 증식, 많은 수의 단핵구, 형질 세포, 침윤된 림프구; 3
관절 주위에 침투한 많은 수의 염증 세포, 조직 섬유증, 활액 비후; 4
판누스(Pannus) 형성 판누스 형성은 관찰되지 않았다; 0
연골 가장자리에는 판누스 형성이 거의 없었다; 1
관절 가장자리에 소량의 판 누스 형성과 함께 연골 간 섬유 조직이 증식했다; 2
판누스 형성은 관절 연골의 50%에 존재했다; 3
판누스 형성은 관절 연골 전체에서 관찰되었다; 4
연골 손상 연골 손상은 관찰되지 않았다; 0
관절 연골 세포가 증식했다; 1
연골 세포 기질이 손실되고 적은 수의 연골 세포가 파괴되었다; 2
관절 주위에 섬유 조직이 증식하고 많은 수의 연골 세포가 파괴되었다; 3
관절 연골, 연골 침식 사이에 많은 섬유 조직 증식이 있었다; 4
골 흡수 골 흡수는 관찰되지 않았다; 0
활액 가장자리에서 최소한의 골 흡수가 관찰되었다; 1
적은 수의 파골 세포가 골 조직의 작은 영역에 형성될 수 있다; 2
골 흡수가있는 국소 관절 하 연골 뼈 조직; 3
연골 침식과 함께 골 조직의 넓은 영역에서 골 흡수; 4
6. 통계 처리
실험 데이터는 평균 ± 표준 오차 (Mean ± SEM)로 표현되며, 체중, 임상 점수 및 병리 점수는 일원 분산 분석으로 표현되며, p <0.5는 유의한 것으로 간주된다.
실험 결과:
1. 임상 점수
이 실험은 덱사메타손과 필고티닙을 참조로 사용하여 래트 관절염(AIA) 모델에서 임상 점수에 대한 화합물 1-13의 개선 효과를 평가했다. 래트는 보조제 예방 접종 후 6일째에 관절염 증상이 나타나기 시작했다. 투여는 13일째에 시작되었고, 용매 대조군의 평균 임상 점수는 점차 증가했다. 실험 결과는 용매 대조군의 평균 임상 점수가 24일째에 최고점에 도달하고 약 8점에서 안정화되었음을 보여주었고, 이는 AIA 모델의 성공적인 확립을 나타낸다(도 5, 표 14).
실험이 끝날때(27일), 1, 3, 10 및 30 mg/kg의 4회 투여량에서 화합물 1-13은 관절염 래트의 임상 점수를 유의하게 억제하였고(용매 대조군과 비교했을 때, p 값은 모두 <0.0001 임), 관절염 래트의 임상 점수는, 투여량-의존적으로, 각각 5.4, 3.9, 3.2 및 2.7로 감소했다(고-투여량 군과 저-투여량 군과 비교하여, p <0.0001). 그들 중, 화합물 1-13의 30mg/kg에서의 효과가 가장 분명하다(17일부터 시작하여, 용매 대조군과 비교하여 매우 유의한 차이가 있음, p <0.0001). 이 그룹의 평균 관절염 임상 점수는 13일에 최고점에서 6.0점이며, 실험 종료점인 27일에 2.7점으로 떨어졌다(도 5, 표 12). 기준 화합물 필고티닙 30mg/kg BID의 점수는 실험 종료점인 27일에 5.1로 떨어졌고, 이는 용매 대조군보다 유의하게 낮았지만(p <0.001) 화합물 1-13 30mg/kg BID보다 유의하게 높았다(p <0.001). 관절염의 임상 점수에 대한 화합물 1-13의 개선 효과는 동일한 투여량에서 필고티닙의 효과보다 현저하게 우수했다.
양성 대조군인 덱사메타손 처리군의 평균 임상 점수는 13일 후 6.0으로 가장 높았다. 투여 후, 임상 점수는 계속 하락하여 27일 실험 종료 시점에서 2.7로 떨어졌다. 대조군과 비교할 때, 매우 큰 차이가 있다(그림 5, 표 14).
임상 점수
일(Days) 정상군(Normal) 용매 대조군(Solvent control) 덱사메타손 아세테이트 군(Dex.)
(0.3mg/kg)		 필고티닙(Filgotinib)
(30mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(1mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(3mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(10mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(30mg/kg)
13 0.0±0.0 6.1±0.5 6.0±0.5 6.0±0.6 6.0±0.5 6.0±0.6 6.1±0.5 6.0±0.5
15 0.0±0.0 7.3±0.4 5.3±0.5* 6.6±0.5 6.9±0.5 5.8±0.5 5.5±0.4* 4.5±0.4***
17 0.0±0.0 7.6±0.4 4.1±0.5**** 6.3±0.6 6.7±0.4 5.4±0.5** 4.4±0.4**** 3.1±0.2****
20 0.0±0.0 7.8±0.4 3.4±0.5**** 5.8±0.6** 6.0±0.4 4.1±0.4**** 3.8±0.2**** 3.0±0.2****
22 0.0±0.0 8.0±0.4 3.1±0.5**** 5.5±0.6*** 5.8±0.4** 4.0±0.4**** 3.7±0.3**** 2.8±0.2****
24 0.0±0.0 8.1±0.3 3.1±0.5**** 5.4±0.5**** 5.6±0.4*** 4.0±0.4**** 3.4±0.2**** 2.7±0.2****
27 0.0±0.0 8.1±0.3 2.9±0.5**** 5.1±0.5**** 5.4±0.3**** 3.9±0.4**** 3.2±0.1**** 2.7±0.2****
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 vs. 용매 대조군, 일원 분산 분석
2. 발 부피
이 실험은 덱사메타손 및 필고티닙을 참조로 사용하여, 래트 관절염 (AIA) 모델에서 발 부피에 대한 화합물 1-13의 효과를 평가했다. 용매 대조군에서 동물의 평균 발 부피는 13일에 1.9mL에서 27일에 실험이 끝날 때 2.9mL로 꾸준히 증가하여, AIA 모델의 성공적인 확립을 표시했다(도 6, 표 15). 실험 종료시, 1, 3, 10 및 30mg/kg의 투여량에서 화합물 1-13은 관절염 래트의 발 부피 증가를 현저하게 억제할 수 있다(용매 대조군과 비교하여, 모든 p 값은 < 0.0001). 염증 래트의 평균 발 부피는, 투여량-의존적 방식으로, 각각 1.59mL, 1.26mL 및 1.21mL로 감소했다(고-투여량 군과 저-투여량 군의 비교, p <0.0001). 기준 화합물 필고티닙 30mg/kg BID 실험 종료 시인 27일에, 발 부피가 1.91 포인트로 감소했으며, 이는 용매 대조군(p <0.0001)보다 유의하게 낮았지만 래트에서 화합물 1-13 30mg/kg BID(p <0.0001)보다 유의하게 높았다. 발 부피를 개선하는 효과는 동일한 투여량에서 필고티닙의 효과보다 훨씬 낫다. 양성 대조군인 덱사메타손 치료군은 또한 평균 발 부피의 증가를 매우 잘 억제했다. 투여 후, 실험이 끝날 때까지 발의 부피는 꾸준히 감소하였고, 이는 17일에 안정화되었으며, 용매 대조군(p <0.0001) 과 크게 달랐다(도 6, 표 15).
발 부피
일(Days) 정상군(Normal) 용매 대조군(Solvent control) 덱사메타손 아세테이트 군(Dex.)
(0.3mg/kg)		 필고티닙(Filgotinib)
(30mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(1mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(3mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(10mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(30mg/kg)
13 1.1±0.0 1.9±0.1 1.9±0.1 1.9±0.1 1.9±0.1 1.9±0.1 1.9±0.1 1.9±0.1
15 1.1±0.0 2.3±0.1 1.7±0.1**** 2.2±0.1 2.0±0.1 2.0±0.1* 1.8±0.1**** 1.6±0.1****
17 1.1±0.0 2.4±0.1 1.4±0.1**** 2.0±0.1** 2.0±0.1** 1.9±0.1**** 1.6±0.1**** 1.4±0.1****
20 1.0±0.0 2.5±0.1 1.3±0.1**** 1.9±0.1**** 1.9±0.1**** 1.8±0.1**** 1.5±0.1**** 1.3±0.1****
22 1.1±0.0 2.6±0.1 1.3±0.1**** 2.0±0.1**** 1.9±0.1**** 1.7±0.1**** 1.4±0.1**** 1.2±0.0****
24 1.1±0.0 2.8±0.1 1.2±0.1**** 2.0±0.1**** 1.9±0.1**** 1.6±0.1**** 1.3±0.1**** 1.2±0.0****
27 1.1±0.0 2.9±0.1 1.2±0.1**** 1.9±0.1**** 1.9±0.1**** 1.6±0.1**** 1.3±0.0**** 1.2±0.0****
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 vs. 용매 대조군, 일원 분산 분석
3. 무게
정상군에 비해, 면역화 및 모델링 후 래트의 체중이 감소했다. 13일째에 투여 시작 후, 각 투여군의 체중은 용매 대조군에 비해 서서히 그리고 지속적으로 증가하였으며, 반면 양성 대조군인 덱사메타손 그룹의 체중은 더 천천히 회복되었고, 이는 래트가 필고티닙 및 화합물 1-13을 잘 견딘다는 것을 의미힌다. 화합물 1-13 30mg/kg 그룹의 체중이 가장 빠르게 증가했으며, 4회 투여량의 체중은 투여량-의존적으로 증가했다(도 7 및 표 16).
체중
일(Days) 정상군(Normal) 용매 대조군(Solvent control) 덱사메타손 아세테이트 군(Dex.)
(0.3mg/kg)		 필고티닙(Filgotinib)
(30mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(1mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(3mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(10mg/kg)		 화합물(compound) 1-13
(30mg/kg)
0 177.6±2.0 182.0±2.3 182.2±2.7 182.7±2.9 182.0±1.6 187.0±2.2 181.6±2.2 181.2±2.3
13 210.2±3.4 168.1±3.3 169.1±0.1 168.0±3.0 168.0±1.3 169.6±1.4 168.5±2.5 169.3±2.2
15 209.8±3.1 167.7±3.1 162.4±0.1 167.5±2.9 170.1±2.0 172.3±1.5 171.1±2.7 174.8±2.2
17 212.5±2.7 168.0±3.0 160.5±0.1 168.3±3.0 168.9±1.5 170.9±1.7 175.2±2.7 180.6±2.4**
20 216.9±3.7 166.9±3.0 161.6±0.1 169.7±2.8 168.1±1.5 172.8±1.5 179.9±3.3** 188.9±2.5****
22 218.8±3.1 168.9±3.0 163.5±0.1 171.2±2.6 169.6±1.4 177.0±1.3 186.3±3.5**** 196.0±2.2****
24 218.7±3.5 171.7±2.7 163.7±0.1 174.3±3.7 173.6±1.8 179.8±1.8 190.1±2.5**** 198.8±2.2****
27 220.1±3.7 177.2±2.8 163.4±0.1** 181.7±3.5 180.9±1.8 188.6*±1.7 198.2±2.9**** 206.3±2.7****
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 vs. 용매 대조군, 일원 분산 분석
4. 조직 병리 검사 결과
용매 대조군의 관절염 쥐는 총 병리학적 점수가 16±0.00이었고, 화합물 1-13을 1mg/kg의 투여량으로 투여한 경우, 점수는 13.3±0.44(용매 대조군과 비교했을 때, P=0.09, 통계적 차이 없음)로 감소했으며, 억제율은 16.9%였고; 반면 3mg/kg, 10mg/kg 및 30mg/kg 투여량은 관절염 래트의 병리학적 점수를 각각 11.3±1.64, 4.4±1.16 및 1.6±0.47로 현저하게 감소시킬 수 있으며, p 값은 0.014, <0.0001 및 <0.0001, 및 억제율은 29.4%, 72.5% 및 90%이다. 참조 화합물 필고티닙 30mg/kg은 총 병리학적 점수가 15.2±0.49이고, 억제율은 5%였다. 용매군에 비해 유의한 차이는 없었다. 동일한 투여량(30mg/kg)의 화합물 1-13은 필고티닙보다 유의하게 낮은 총 병리학적 점수(p <0.0001)를 나타냈다. 0.3mg/kg 투여량의 대조군 화합물인 덱사메타손은 관절염 래트의 병리학적 점수를 4.40.8로 극도로 상당히 감소시켰으며, p 값은 <0.0001, 억제율은 72.5%였다(표 17).
병리학적 점수
그룹 병리학적 점수 (평균 값±표준 오차)
염증 세포 침윤 판누스(Pannus) 형성 연골 손상 골 흡수 총 점수
정상군(Normal) 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
용매 대조군(Solvent control) 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0 16.0±0.0
덱사메타손 아세테이트 군(Dex.)(0.3mg/kg) 1.8±0.2 1.4±0.3 0.6±0.2 0.6±0.2 4.4±0.8****
필고티닙(Filgotinib)(30mg/kg) 4.0±0.0 3.9±0.1 3.7±0.2 3.6±0.2 15.2±0.5
화합물(compound) 1-13(1mg/kg) 3.6±0.3 3.5±0.3 3.3±0.4 2.9±0.5 13.3±1.4
화합물(compound) 1-13(3mg/kg) 3.3±0.3 3.2±0.3 2.5±0.5 2.3±0.5 11.3±1.6*
화합물(compound) 1-13(10mg/kg) 1.7±0.3 1.4±0.4 0.8±0.3 0.5±0.3 4.4±0.2****
화합물(compound) 1-13(30mg/kg) 0.6±0.2 0.5±0.2 0.3±0.1 0.2±0.1 1.6±0.5****
*p<0.05, ****p<0.001 vs. 용매 대조군, 일원 분산 분석
결론: 용매 대조군의 쥐는 관절염의 임상 증상을 보였고 계속 악화되었다. 용매 대조군과 비교하여, 화합물 1-13(1, 3, 10, 30mg/kg), 필고티닙(Filgotinib)(30mg/kg) 및 덱사메타손(dexamethasone)(0.3mg/kg)은 보조제-유발 관절염에 대해 유의한 억제 효과를 보였고, 이는 지연된 발병 시간으로 나타나고, 임상 증상과 병리학적 변화를 현저히 감소시켰고, 화합물 1-13은 보조제-유발 관절염 모델에 대한 투여량-의존적 치료 효과를 갖는다. 상기 실험 결과는 화합물 1-13이 쥐에서 보조제-유발 관절염에 대해 유의한 치료 효과가 있고, 그 효과가 필고티닙보다 우수하다는 것을 보여준다.

Claims (19)

  1. 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염,
    ,
    여기서,
    E1 및 E2는 단일 결합, -CH2- 또는-(CH2)2-에서 독립적으로 선택되고;
    L1은 단일 결합, -(CH2)g-, -C(=O)-또는 -C(=O)-(CH2)h-에서 선택되고;
    m은 1 또는 2이고;
    n은 1 또는 2이고;
    g는 1, 2 또는 3이고;
    h는 1, 2 또는 3이고;
    R1은 H, CN, C1-6 알킬기 또는 3~6-원 사이클로알킬기에서 선택되며, 여기서 상기 C1-6 알킬기 및 3~6-원 사이클로알킬기는 1, 2 또는 3 Ra로 비치환 또는 치환되고;
    R2는 H, F, Cl, Br, I 또는 C1-3 알킬기에서 선택되며, 여기서 상기 C1-3 알킬기는 1, 2 또는 3 Rb로 비치환 또는 치환되고;
    R3, R4 및 R5는 H, F, Cl, Br, I 또는 C1-3 알킬기에서 독립적으로 선택되며, 상기 C1-3 알킬 그룹은 1, 2 또는 3 Rc로 비치환 또는 치환되고;
    R6, R7 및 R8은 H, F, Cl, Br, I 또는 C1-3 알킬기에서 독립적으로 선택되며, 상기 C1-3 알킬 그룹은 1, 2 또는 3 Rd로 비치환 또는 치환되고;
    각각의 Ra는 H, F, Cl, Br, I, CN 또는 C1-3 알킬기에서 독립적으로 선택되며, 상기 C1-3 알킬기는 1, 2 또는 3 R로 비치환 또는 치환되고;
    각각의 Rb는 F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고;
    각각의 Rc는 F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고;
    각각의 Rd는 F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되고;
    각 R은 F, Cl, Br 또는 I에서 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    각각의 Ra가 H, F, Cl, Br, I 또는 CN으로부터 독립적으로 선택되는 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 H, CN, C1-3 알킬기 또는 3~5-원 사이클로알킬기로부터 선택되고, 여기서 C1-3 알킬기 및 3~5-원 사이클로알킬기는 1, 2 또는 3개의 Ra로 비치환 또는 치환된, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  4. 제3항에 있어서,
    R1은 H, CN, CH3, , 또는 로부터 선택되고, 여기서 CH3, , 및 는 1, 2 또는 3개의 Ra로 비치환 또는 치환된, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  5. 제4항에 있어서,
    R1은 H, CN, CF3, CHF2, , , , 또는 로부터 선택되는, 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  6. 제1항에 있어서,
    R2는 H, F, Cl, Br 또는 I로부터 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  7. 제1항에 있어서,
    R3, R4 및 R5는 H, F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  8. 제1항에 있어서,
    R6, R7 및 R8은 H, F, Cl, Br 또는 I로부터 독립적으로 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  9. 제1항에 있어서,
    L1은 단일 결합, -CH2-, -(CH2)2-, -C(=O)- 또는 -C(=O)-(CH2)-로부터 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  10. 제1항에 있어서,
    구조 단위는 , , , 또는 로부터 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  11. 제1항에 있어서,
    구조 단위는 , , , , , , , , , 또는 로부터 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  12. 제1항에 있어서,
    구조 단위는 , , , , , , , , ,
    Figure 112023057558076-pct00193
    , , , , , , , 또는 로부터 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure 112023057558076-pct00203


    화합물은 상기 화학식 중 하나로 선택되는, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염,
    여기서,
    L1은 청구항 제1항 또는 제9항에서와 같이 정의되고;
    R1은 청구항 제1항 내지 제5항에서와 같이 정의되고;
    R2는 청구항 제1항 또는 제6항에서와 같이 정의되고;
    R3, R4 및 R5는 청구항 제1항 또는 제7항에서와 같이 정의되고;
    R6, R7 및 R8은 청구항 제1항 또는 제8항에서와 같이 정의된다.
  14. 제13항에 있어서,

    화합물은 상기 화학식 (I-1A)인, 상기 화학식 (I)의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염,
    여기서,
    L1은 청구항 제1항 또는 제9항에서와 같이 정의되고;
    Ra은 청구항 제1항 내지 제2항에서와 같이 정의되고;
    R2는 청구항 제1항 또는 제6항에서와 같이 정의되고;
    R3, R4 및 R5는 청구항 제1항 또는 제7항에서와 같이 정의되고;
    R6, R7 및 R8은 청구항 제1항 또는 제8항에서와 같이 정의된다.
  15. 하기 화학식들로 구성되는 그룹으로부터 하나로 선택되는 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 및 이의 약학적으로 허용되는 염,

    및 .
  16. 제15항에 있어서,
    및
    상기 화합물들 중 하나로 선택되는 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 및 이의 약학적으로 허용되는 염.
  17. 자가면역질환, 이식 거부 반응, 선천성 연골 이형성증 또는 류마티스 관절염 중에서 선택된 질병을 치료하기 위한, 제1항의 화합물, 이의 기하이성질체, 입체이성질체, 호변이성질체(tautomer) 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 질병은 JAK1 또는 TYK2 관련된 질병인, 약제학적 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 질병은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
KR1020217008505A 2018-08-23 2019-08-23 Jak 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물 및 이의 용도 Active KR102603729B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810968207 2018-08-23
CN201810968207.6 2018-08-23
PCT/CN2019/102209 WO2020038457A1 (zh) 2018-08-23 2019-08-23 作为JAK抑制剂的[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶类化合物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210049858A KR20210049858A (ko) 2021-05-06
KR102603729B1 true KR102603729B1 (ko) 2023-11-17

Family

ID=69592871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217008505A Active KR102603729B1 (ko) 2018-08-23 2019-08-23 Jak 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물 및 이의 용도

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11919896B2 (ko)
EP (1) EP3842431B1 (ko)
JP (1) JP7140920B2 (ko)
KR (1) KR102603729B1 (ko)
CN (1) CN112739696B (ko)
AU (1) AU2019326647B2 (ko)
CA (1) CA3106490C (ko)
ES (1) ES2973331T3 (ko)
HR (1) HRP20240300T1 (ko)
HU (1) HUE065919T2 (ko)
PL (1) PL3842431T3 (ko)
RS (1) RS65243B1 (ko)
WO (1) WO2020038457A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220127900A (ko) * 2020-02-13 2022-09-20 주하이 유나이티드 라보라토리즈 컴퍼니 리미티드 Jak 키나아제 관련 질병의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 jak 억제제의 용도
EP4108664B1 (en) * 2020-02-21 2025-07-09 Zhuhai United Laboratories Co., Ltd. Crystalline form of jak inhibitor and application thereof
CA3210023A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Zhuhai United Laboratories Co., Ltd. Oral preparation containing jak inhibitors or salts or crystal forms thereof, and preparation method and application thereof
JP2024532843A (ja) * 2021-08-19 2024-09-10 チューハイ ユナイテッド ラボラトリーズ シーオー．，エルティーディー． Ｊａｋ阻害剤、その塩または結晶形を含有する局部用外用製剤、ならびにその製造方法および使用
WO2023076161A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Kymera Therapeutics, Inc. Tyk2 degraders and uses thereof
WO2024229406A1 (en) 2023-05-04 2024-11-07 Revolution Medicines, Inc. Combination therapy for a ras related disease or disorder
WO2025034702A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Revolution Medicines, Inc. Rmc-6291 for use in the treatment of ras protein-related disease or disorder
US20250154171A1 (en) 2023-10-12 2025-05-15 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010010187A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2011006074A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Array Biopharma Inc. SUBSTITUTED PYRAZOLO[1,5-a]PYRIMIDINE COMPOUNDS AS TRK KINASE INHIBITORS
CN102105471A (zh) 2008-07-25 2011-06-22 加拉帕戈斯股份有限公司 用于治疗变性和炎性疾病的新化合物
WO2018019223A1 (zh) 2016-07-26 2018-02-01 张文燕 作为选择性jak抑制剂化合物，该化合物的盐类及其治疗用途
WO2018032104A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Pharmascience Inc. Spirocyclic containing compounds and pharmaceutical uses thereof
CN108341814A (zh) 2017-01-23 2018-07-31 上海翔锦生物科技有限公司 Jak激酶抑制剂及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090220688A1 (en) 2005-07-27 2009-09-03 Buddy Tools, Llc Drywall tape and joint compound dispenser
CN111094581A (zh) * 2017-08-14 2020-05-01 4阵营疗法公司 治疗肝病的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010010187A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
CN102105471A (zh) 2008-07-25 2011-06-22 加拉帕戈斯股份有限公司 用于治疗变性和炎性疾病的新化合物
WO2011006074A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Array Biopharma Inc. SUBSTITUTED PYRAZOLO[1,5-a]PYRIMIDINE COMPOUNDS AS TRK KINASE INHIBITORS
WO2018019223A1 (zh) 2016-07-26 2018-02-01 张文燕 作为选择性jak抑制剂化合物，该化合物的盐类及其治疗用途
WO2018032104A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Pharmascience Inc. Spirocyclic containing compounds and pharmaceutical uses thereof
CN108341814A (zh) 2017-01-23 2018-07-31 上海翔锦生物科技有限公司 Jak激酶抑制剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019326647A1 (en) 2021-02-18
KR20210049858A (ko) 2021-05-06
HRP20240300T1 (hr) 2024-05-24
CA3106490A1 (en) 2020-02-27
EP3842431C0 (en) 2023-12-27
US11919896B2 (en) 2024-03-05
CN112739696A (zh) 2021-04-30
CN112739696B (zh) 2022-08-02
AU2019326647B2 (en) 2022-02-10
ES2973331T3 (es) 2024-06-19
JP2021534259A (ja) 2021-12-09
RS65243B1 (sr) 2024-03-29
HUE065919T2 (hu) 2024-07-28
JP7140920B2 (ja) 2022-09-21
EP3842431B1 (en) 2023-12-27
EP3842431A4 (en) 2022-06-01
WO2020038457A1 (zh) 2020-02-27
PL3842431T3 (pl) 2024-05-20
US20210155621A1 (en) 2021-05-27
EP3842431A1 (en) 2021-06-30
CA3106490C (en) 2023-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102603729B1 (ko) Jak 억제제로서의 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘 화합물 및 이의 용도
US12344595B2 (en) 2-amino-n-phenyl-nicotinamides as NAV1.8 inhibitors
EP4025568B1 (en) Rip1 inhibitory compounds and methods for making and using the same
JP6517928B2 (ja) キナーゼ阻害剤として有用なインドールカルボキシアミド
EP2590981B1 (en) Novel homopiperazine derivatives as protein tyrosine kinase inhibitors and pharmaceutical use thereof
US20240246932A1 (en) Aryl 3-oxopiperazine carboxamides and heteroaryl 3-oxopiperazine carboxamides as nav1.8 inhibitors
US20250092057A1 (en) Heterocyclic rip1 inhibitory compounds
CN106170290A (zh) 取代的二氨基嘧啶基化合物、其组合物及其治疗方法
CN119039290A (zh) P2x3调节剂
WO2020021015A1 (en) New imidazopyridine derivatives for treating pain and pain related conditions
CN113332292A (zh) 6,7-二氢-5H-吡唑并[5,1-b][1,3]噁嗪-2-甲酰胺化合物
WO2021159372A1 (zh) Jak抑制剂在制备治疗jak激酶相关疾病药物中的应用
CN115279757A (zh) 用于治疗和预防hiv感染的抗病毒药剂的嘧啶系双环化合物
CN114901640A (zh) 适用于治疗血脂异常的新型化合物
US11780843B2 (en) Compounds active towards nuclear receptors
CN118139865A (zh) 吡咯并吡唑螺环化合物
HK1262295A1 (en) 6,7-dihydro-5h-pyrazolo[5，1-b][1,3]oxazine-2-carboxamide compounds

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20210322

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210401

Comment text: Request for Examination of Application

PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20230328

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20230901

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20231114

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20231115

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration