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KR102584661B1 - 염증 촉진 인자 발현 억제제, 그 유효 성분의 스크리닝 방법, 그 방법에 유용한 발현 카세트, 진단약 및 진단 방법 - Google Patents

염증 촉진 인자 발현 억제제, 그 유효 성분의 스크리닝 방법, 그 방법에 유용한 발현 카세트, 진단약 및 진단 방법 Download PDF

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KR102584661B1
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히로시 아사하라
도모키 지바
겐타로 아베
Original Assignee
고쿠리츠 다이가쿠호우징 도쿄이카시카다이가쿠
니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

염증 촉진 인자의 발현량에 영향을 미치는 신규 인자를 발견하고, 이것에 기초한 염증 촉진 인자 발현 억제제나 그 개발 툴을 제공하는 것, 그리고 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등의 진단약 및 진단 방법을 제공하는 것. RBMS2 발현 억제제 및 RBMS2 기능 억제제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는 염증 촉진 인자 발현 억제제, RBMS2 의 발현 또는 기능을 지표로 한 스크리닝 방법, 및 그 방법에 유용한 발현 카세트, 그리고 RBMS2 유전자 발현 산물 검출제를 함유하는 진단약, 및 RBMS2 유전자 발현량을 지표로 한 질환 검출 방법.

Description

염증 촉진 인자 발현 억제제, 그 유효 성분의 스크리닝 방법, 그 방법에 유용한 발현 카세트, 진단약 및 진단 방법
본 발명은 염증 촉진 인자 발현 억제제, 그 유효 성분의 스크리닝 방법, 및 그 방법에 유용한 발현 카세트, 그리고 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등의 진단약 및 진단 방법 등에 관한 것이다.
IL-6, COX-2 등의 염증 촉진 인자에 의해 그 증상이 발현 혹은 증악 (增惡) 되는 질환, 예를 들어 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등의 질환의 환자수는 매우 많다. 예를 들어, 대표적인 면역 질환인 관절 류머티즘이면, 일본 국내에서 약 70 만명, 전 세계에서는 약 7,000 만명의 환자가 있다고 일컬어지고 있다. 또, 염증성 질환의 하나인 관절증은, 일본에서만 약 1,560 만명의 환자가 있으며, 관절증의 대표라고도 할 수 있는 변형성 슬관절증은, 일본에서 약 1,000 만명의 환자가 있다고 추정되고 있다. 또한 동통성 질환의 대표인 요통증은, 일본 국내에서만 2,400 만명의 환자가 있다고 되어 있다. 그리고, 이들 질환의 환자수는, 고령화가 진행됨에 따라, 해마다 증가 경향이 있다. 이와 같은 현상은, 고령화율이 세계에서 제일 높은 일본뿐만 아니라, 향후 생활 환경이나 식생활·영양 상태의 개선, 의료 기술의 진보 등에 의해 고령화가 진행되는 모든 나라에 있어서 동일하게 발생하는 것으로 생각된다. 보다 조기에 이러한 질환을 발견함으로써, 적절한 치료를 개시하고, 질환의 중증화를 억제하며, 나아가서는 환자의 QOL 을 보다 높게 유지하는 것이 가능해진다. 이 때문에, 이들 질환의 치료약이나 그 개발 툴에 관한 연구, 나아가서는 이들 질환의 진단약이나 진단 방법을 개발하는 것은, 사회적으로 매우 중요한 요청이 되고 있다.
그러한 중, 최근, 염증 촉진 인자 mRNA 의 전사 후 조절과 상기 질환의 관련이 분명해지고 있다. 염증 촉진 인자 mRNA 의 분해 제어는 염증 응답의 지속 시간을 결정하는 요인이 되는 것이 시사되어 있고, 염증 촉진 인자의 mRNA 레벨에서의 분해나 안정화에 관련되는 인자는, 면역 질환이나 염증성 질환, 동통성 질환의 발증이나 만성화에 관여한다고 일컬어지고 있다. 예를 들어, 비특허문헌 1 에서는, Tristetraprolin (TTP) 이나 Regnase-1 이 IL-6 mRNA 의 분해에 기여하는 것이 기재되어 있다. 또, 비특허문헌 2 에서는, Arid5a 가 IL-6 mRNA 의 안정성을 제어하고 있는 것이 나타나 있다. 이들 인자의 이상은 염증의 촉진 등에 의해 상기 질환의 발증 또는 악화 메커니즘에 있어서 큰 역할을 담당하고 있는 것이 해명되고 있다. 그 때문에, 염증 촉진 인자의 발현량에 영향을 미치는 인자는 상기 질환 치료약의 표적이 되는 것이고, 그러한 인자의 새로운 발견이 요망되고 있다. 또, 환자의 세포나 혈액 등 중의, 염증 촉진 인자의 발현량에 영향을 미치는 물질의 양을 측정함으로써, 상기 질환의 유무나 진행도를 진단할 수 있는 진단약이나 진단 방법은 매우 유용하고, 그러한 인자의 새로운 발견이 요망되고 있다.
RNA-binding motif, single-stranded-interacting protein 2 (RBMS2) 는, N 말단측에 2 개의 RNA 결합 도메인을 갖는다고 일컬어지고 있는 단백질이지만, 실제로 그 기능을 해석했다고 하는 보고는 여전히 없고, 그 기능은 지금까지 분명해지지 않았었다.
Inflammation and Regeneration, Vol.33, No.1, January 2013, pp54-65. PNAS, June 4, 2013, vol.110, no.23, pp9409-9414
본 발명은, 염증 촉진 인자의 발현량에 영향을 미치는 신규 인자를 발견하는 것, 및 이것에 기초한 염증 촉진 인자 발현 억제제나 그 개발 툴을 제공하는 것, 그리고 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등의 진단약 및 진단 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자 등은 상기 과제를 감안하여 예의 연구를 한 결과, RBMS2 가 여러 가지 염증 촉진 인자 mRNA 의 전사 후 조절을 하고 있는 것을 알아내었다. 또한 염증 촉진 인자에 의해 그 증상이 발현 또는 증악되는 질환에 있어서는, RBMS2 의 발현과 염증 촉진 인자의 발현에 정 (正) 의 상관이 있는 것을 알아내었다. 이러한 지견에 기초하여, RBMS2 의 발현 또는 기능의 억제에 의해, 염증 촉진 인자를 억제할 수 있고, 나아가서는 상기 질환의 예방 또는 치료가 가능한 것, 그리고 RBMS2 의 발현량을 지표로 함으로써 이들 질환을 진단할 수 있는 것을 알아내었다. 이상에 기초하여 더욱 연구를 진행시킨 결과, 본 발명이 완성되었다. 즉, 본 발명은 하기의 양태를 포함한다 :
항 1. RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 유전자를 포함하는, 발현 카세트.
항 2. 상기 유전자가 리포터 유전자인, 항 1 에 기재된 발현 카세트.
항 3. 항 1 또는 2 에 기재된 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
항 4. 항 3 에 기재된 벡터를 포함하는, 세포.
항 5. RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 유전자를 포함하는 발현 카세트, 그 발현 카세트를 포함하는 벡터, 그리고 그 벡터를 포함하는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는, 염증 촉진 인자 발현 억제제의 유효 성분의 스크리닝용 시약.
항 6. 피검물질의 존재하에 있어서의 하기 (i) ∼ (iii) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 지표로 하는, RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질의 스크리닝 방법 :
(i) RBMS2 유전자 발현 제어 영역에 의해 발현 제어되는 유전자 발현량,
(ii) RBMS2 와 AU-리치 엘리먼트 (AU-rich element) 를 포함하는 RNA 의 결합량, 및
(iii) RBMS2 과잉 발현 세포에 있어서의 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량.
항 7. 피검물질 존재하에 있어서의 상기 지표의 값이, 피검물질 비존재하에 있어서의 상기 지표의 값보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질로서 선택하는 것을 포함하는, 항 6 에 기재된 스크리닝 방법.
항 8. 상기 AU-리치 엘리먼트가, IL-6 mRNA, COX-2 mRNA, IL-8 mRNA, IL-1βmRNA, TNF-α mRNA, MMP1 mRNA, IL-24 mRNA, 및 c-Myc mRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 mRNA 유래의 AU-리치 엘리먼트인, 항 6 또는 7 에 기재된 스크리닝 방법.
항 9. 상기 RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질을, 염증 촉진 인자 발현 억제제의 유효 성분 또는 그 후보 물질로서 선택하는, 항 6 ∼ 8 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.
항 10. 하기 공정 (a1) ∼ (c1) 을 포함하는, 항 6 ∼ 9 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법 :
(a1) RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 유전자를 포함하는 발현 카세트를 함유하는 발현계와, 피검물질을 접촉시키는 공정,
(b1) 피검물질을 접촉시킨 발현계에 있어서의 상기 유전자의 발현량을 피검발현량으로서 측정하고, 그 피검발현량과, 피검물질을 접촉시키지 않는 발현계에 있어서의 상기 유전자의 발현량을 대조 발현량으로서 비교하는 공정, 그리고
(c1) 피검발현량이 대조 발현량보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 RBMS2 의 발현을 억제하는 물질로서 선택하는 공정.
항 11. 상기 발현계가 세포인, 항 10 에 기재된 스크리닝 방법.
항 12. 상기 유전자가 리포터 유전자인, 항 10 또는 11 에 기재된 스크리닝 방법.
항 13. 하기 공정 (a2) ∼ (c2) 를 포함하는, 항 6 ∼ 9 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법 :
(a2) AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 와 RBMS2 를 피검물질의 존재하에서 접촉시키는 공정,
(b2) 피검물질의 존재하에서 접촉시켰을 경우의 상기 RNA 와 상기 RBMS2 의 결합량을 피검결합량으로서 측정하고, 그 피검결합량과, 피검물질의 비존재하에서 접촉시켰을 경우의 상기 RNA 와 상기 RBMS2 의 결합량을 대조 결합량으로서 비교하는 공정, 그리고
(c2) 피검결합량이 대조 결합량보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 RBMS2 의 기능을 억제하는 물질로서 선택하는 공정.
항 14. 상기 결합량의 측정 방법이 면역 침강법 또는 겔 시프트법인, 항 13 에 기재된 스크리닝 방법.
항 15. 하기 공정 (a3) ∼ (c3) 을 포함하는, 항 6 ∼ 9 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법 :
(a3) 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 를 함유하고, 또한 RBMS2 가 과잉 발현하고 있는 세포와, 피검물질을 접촉시키는 공정,
(b3) 피검물질과 접촉시킨 세포에 있어서의 상기 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 피검량으로서 측정하고, 피검물질과 접촉시키지 않는 세포에 있어서의 상기 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 대조량으로 하여, 그 피검량과 그 대조량을 비교하는 공정, 그리고
(c3) 피검량이 대조량보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 RBMS2 의 기능을 억제하는 물질로서 선택하는 공정.
항 16. 상기 mRNA 가 리포터 단백질의 ORF 를 포함하는, 항 15 에 기재된 스크리닝 방법.
항 17. RBMS2 발현 억제제 및 RBMS2 기능 억제제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는, 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 18. RBMS2 발현 억제제를 함유하는, 항 17 에 기재된 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 19. 상기 RBMS2 발현 억제제가, RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, RBMS2 특이적 안티센스 핵산, 및 이들의 발현 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 RBMS2 발현 억제를 함유하는, 항 18 에 기재된 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 20. 상기 RBMS2 발현 억제제가 IL-10 인, 청구항 18 에 기재된 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 21. 발현 억제 대상인 상기 염증 촉진 인자가, IL-6, COX-2, IL-8, IL-1β, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 항 17 ∼ 20 중 어느 하나에 기재된 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 22. 면역 질환, 염증성 질환 및 동통성 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 예방 또는 치료제로서 사용되는, 항 17 ∼ 21 중 어느 하나에 기재된 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 23. 자기 면역 질환, 류머티즘성 질환, 관절 류머티즘, 변성 관절 질환, 관절염, 패혈증, 림프 증식성 질환, 중추성 탈수 (脫髓) 질환, 척추 관절증, 염증성 동통, 수술후 동통, 및 알레르기성 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 예방 또는 치료제로서 사용되는, 항 17 ∼ 22 중 어느 하나에 기재된 염증 촉진 인자 발현 억제제.
항 24. RBMS2 유전자 발현 산물 검출제를 함유하는, 염증 촉진 인자에 의해 발증 또는 증악되는 질환의 진단약.
항 25. 상기 질환이 염증 촉진 인자에 의해 발증 또는 증악되는 것인 항 24 에 기재된 진단약.
항 26. 상기 질환이 면역 질환, 염증성 질환 및 동통성 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항 24 또는 25 에 기재된 진단약.
항 27. 염증 촉진 인자가 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항 25 또는 26 에 기재된 진단약.
항 28. 상기 RBMS2 유전자 발현 산물 검출제가, RBMS2 mRNA 혹은 그것에서 유래하는 핵산에 대한 프로브 혹은 프라이머, 또는 RBMS2 단백질을 인식하는 항체인, 항 24 ∼ 27 중 어느 하나에 기재된 진단약.
항 29. 진단 대상 질환인 상기 질환이, 자기 면역 질환, 류머티즘성 질환, 관절 류머티즘, 변성 관절 질환, 관절염, 패혈증, 림프 증식성 질환, 중추성 탈수 질환, 척추 관절증, 염증성 동통, 수술후 동통, 및 알레르기성 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 질환인, 항 24 ∼ 28 중 어느 하나에 기재된 진단약.
항 30. 진단 대상 질환인 상기 질환이 관절 류머티즘인, 항 29 에 기재된 진단약.
항 31. 진단 대상이 상기 질환의 유무인, 항 24 ∼ 30 중 어느 하나에 기재된 진단약.
항 32. 진단 대상이 상기 질환의 진행도인, 항 24 ∼ 30 중 어느 하나에 기재된 진단약.
항 33. (a1) 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량을 측정하는 공정, 및
(b1) 상기 공정 (a1) 에서 측정된 피검발현량을, 면역 질환, 염증성 질환 및 동통성 질환의 어느 것으로도 이환하고 있지 않은 대조 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 대조 발현량과 대비하는 공정
을 갖고,
(c1) 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을, 피검체가 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환이라는 판단 지표로 하는, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 검출 방법.
항 34. (a2) 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환으로 이환하고 있는 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량을 측정하는 공정, 및
(b2) 상기 공정 (a2) 에서 측정된 피검발현량을, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환으로 이환하고 있는 대조 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 대조 발현량과 대비하는 공정
을 갖고,
(c3) 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을, 피검체쪽이, 대조 피검체보다 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 진행도가 높다는 판단 지표로 하는, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 진행도의 판정 방법.
항 35. 상기 공정 (a1) 및 공정 (a2) 에 있어서의 상기 시료가 혈액 시료인, 항 33 또는 34 에 기재된 방법.
항 36. 상기 공정 (a1) 및 공정 (a2) 에 있어서의 상기 시료가 혈액 시료 중의 혈구 성분인, 항 33 ∼ 35 중 어느 하나에 기재된 방법.
항 37. 상기 면역 질환, 염증성 질환 및 동통성 질환이 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종에 의해 발증 또는 증악되는 것인, 항 33 ∼ 36 중 어느 하나에 기재된 방법.
항 38. RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량 및 대조 발현량이, RBMS2 mRNA 혹은 그것에서 유래하는 핵산에 대한 프로브 혹은 프라이머, 또는 RBMS2 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 측정되는 것인, 항 33 ∼ 37 중 어느 하나에 기재된 방법.
본 발명에 의하면, 염증 촉진 인자의 발현량에 영향을 미치는 신규 표적 인자를 이용한, 새로운 염증 촉진 인자 발현 억제제나, 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등의 새로운 예방 또는 치료제, 나아가서는 이들 개발 툴 (예를 들어 유효 성분의 스크리닝 방법, 그 방법에 유용한 발현 카세트 등) 을 제공할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 신규 메커니즘에 기초한 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등의 진단약 및 진단 방법을 제공할 수 있다.
도 1A 는, 실시예 1A 의 스크리닝의 개요를 나타낸다.
도 1B 는, 실시예 1B 의 결과를 나타낸다. 그래프 좌측에 있어서, 상방의 모식도는 사용한 컨트롤 리포터 벡터 (IL-6 의 3'UTR 없음) 의 부분 구조를 나타내고, 하방의 모식도는 사용한 리포터 벡터 (IL-6 의 3'UTR 있음) 의 부분 구조를 나타낸다. 백색 칼럼은, 빈 벡터 (pcDNA3.1) 를 도입했을 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 RBMS2 발현 벡터 (pcDNA3.1 FLAG-RBMS2) 를 도입했을 경우를 나타낸다. 가로축은 측정된 루시페라아제 활성의 상대값을 나타낸다.
도 1C 는, 실시예 1C 의 결과를 나타낸다. 좌측 도면의 세로축은 RBMS2 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타내고, 우측 도면의 세로축은 IL-6 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타낸다. 가로축 중, N. C. 는 컨트롤 siRNA 를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2-1 및 RBMS2-2 는, RBMS2 의 상이한 영역에 대한 siRNA 를 도입했을 경우를 나타낸다. 백색 칼럼은 IL-1β 를 첨가하고 있지 않은 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 IL-1β 를 첨가했을 경우를 나타낸다.
도 1D 는, 실시예 1D 의 결과를 나타낸다. 세로축은 상청 중의 IL-6 단백질 농도를 나타낸다. 가로축 중, N. C. 는 컨트롤 siRNA 를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2-1 및 RBMS2-2 는, RBMS2 의 상이한 영역에 대한 siRNA 를 도입했을 경우를 나타낸다. 백색 칼럼은 IL-1β 를 첨가하고 있지 않은 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 IL-1β 를 첨가했을 경우를 나타낸다.
도 1E 는, 실시예 1E 의 결과를 나타낸다. 좌측 도면의 세로축은 RBMS2 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타내고, 우측 도면의 세로축은 IL-6 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타낸다. 가로축 중, Empty 는 컨트롤 레트로바이러스를 감염시켰을 경우를 나타내고, RBMS2 는 RBMS2 를 발현하는 레트로바이러스를 감염시켰을 경우를 나타낸다. 백색 칼럼은 IL-1β 를 첨가하고 있지 않은 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 IL-1β 를 첨가했을 경우를 나타낸다.
도 1F 는, 실시예 1F 의 결과를 나타낸다. 세로축은 측정된 루시페라아제 활성의 상대값을 나타낸다. 가로축 중, Empty 는 빈 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2 는 RBMS2 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다.
도 2A 는, 실시예 2A 의 결과를 나타낸다. 세로축은, IL-6 mRNA 량의 액틴 β (Actb) mRNA 량에 대한 상대값을 나타낸다. 가로축 중, - 는 발현 벡터 도입으로부터 48 시간 후에 회수한 세포 샘플, LPS 는 LPS 첨가로부터 5 시간 후에 회수한 세포 샘플, ActD 는 악티노마이신 D 첨가로부터 3 시간 후에 회수한 세포 샘플을 나타낸다. 흑색 칼럼은 빈 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, ● 는 RBMS2 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다.
도 2B 는, 실시예 2B 의 결과를 나타낸다. 가로축 중, 0 은 벡터 도입으로부터 24 시간 후 (독시사이클린 미첨가시) 에 회수한 세포 샘플을 나타내고, 2 는 독시사이클린 첨가로부터 2 시간 후에 회수한 세포 샘플을 나타낸다. 세로축은, 루시페라아제 mRNA 량의 상대 비율 (0 인 경우가 100 ％) 을 나타낸다. 흑색 칼럼은 빈 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, ● 는 RBMS2 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다.
도 2C 는, 실시예 2C 의 결과를 나타낸다. 그래프 좌측에 있어서의 모식도는, 사용한 변이형 3'UTR 리포터 벡터의 부분 구조를 나타낸다. 가로축은, 루시페라아제 활성의 상대값을 나타낸다. 백색 칼럼은 빈 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 RBMS2 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다. * 는, t-test 의 결과, p 값이 0.05 이하인 것을 나타낸다.
도 3A 는, 실시예 3A 의 결과를 나타낸다. 세로축은, 면역 침강 전의 세포 용해액 중의 루시페라아제 mRNA 량을 100 ％ 로 했을 경우의, 면역 침강물 중의 루시페라아제 mRNA 량의 상대값을 나타낸다. 가로축 중, ARE WT 는, 루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR 이 연결된 리포터 벡터 (실시예 1A) 를 도입했을 경우를 나타내고, ARE Mut 는 변이형 3'UTR 리포터 벡터 (실시예 2C : ARE 뮤턴트) 를 도입했을 경우를 나타낸다. 흑색 칼럼은 항 FLAG 항체에 의해 면역 침강했을 경우를 나타내고, 백색 칼럼은 비특이적 IgG 에 의해 면역 침강했을 경우를 나타낸다.
도 3B 는, 실시예 3B 의 결과를 나타낸다. 세로축은, 면역 침강 전의 세포 용해액 중의 루시페라아제 mRNA 량을 100 ％ 로 했을 경우의 면역 침강물 중의 루시페라아제 mRNA 량의 상대값을 나타낸다. 가로축 중, RBMS2 WT 는, FLAG 표지된 야생형 RBMS2 의 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2 ΔRRM1 은, FLAG 표지된 RRM1 도메인 결손형 RBMS2 의 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다. 흑색 칼럼은 항 FLAG 항체에 의해 면역 침강했을 경우를 나타내고, 백색 칼럼은 비특이적 IgG 에 의해 면역 침강했을 경우를 나타낸다.
도 3C 는, 실시예 3C 의 결과를 나타낸다. 그래프 좌측에 있어서의 모식도는, 사용한 발현 벡터에 의해 발현하는 RBMS2 의 구조를 나타낸다. 가로축은, 루시페라아제 활성의 상대값을 나타낸다.
도 4A 는, 실시예 4A 의 결과를 나타낸다. 각 도면의 세로축은, 각 도면의 상부에 기재되는 유전자의 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타낸다. 가로축 중, N. C. 는 컨트롤 siRNA 를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2 는, RBMS2 에 대한 siRNA 를 도입했을 경우를 나타낸다. 백색 칼럼은 IL-1β 를 첨가하고 있지 않은 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 IL-1β 를 첨가했을 경우를 나타낸다.
도 4B 는, 실시예 4B 의 결과를 나타낸다. 상단은 LPS 를 사용한 경우를 나타내고, 중단은 Pam3CSK4 를 사용한 경우를 나타내고, 하단은 IL-1β 를 사용한 경우를 나타낸다. 각 도면의 세로축은, 각 도면의 상부에 기재되는 유전자의 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타낸다. 가로축 중, N. C. 는 컨트롤 siRNA 를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2 는, RBMS2 에 대한 siRNA 를 도입했을 경우를 나타낸다. 백색 칼럼은 LPS, Pam3CSK4 및 IL-1β 모두 첨가하고 있지 않은 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 LPS, Pam3CSK4 또는 IL-1β 를 첨가했을 경우를 나타낸다.
도 4C 는, 실시예 4C 의 결과를 나타낸다. 세로축은, 루시페라아제 ORF 의 하류에 각 도면의 상부에 기재되는 유전자의 야생형 3'UTR (또는 그 ARE 변이형 3'UTR) 이 배치된 리포터 벡터를 사용한 경우의 루시페라아제 활성의 상대값을 나타낸다. 가로축 중, WT 는 야생형 3'UTR 을 채용했을 경우, Mut 는 ARE 변이형 3'UTR 을 채용했을 경우를 나타낸다. 백색 칼럼은 빈 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 RBMS2 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다.
도 5A 는, 실시예 5A 에 있어서의 RBMS2 결손 마우스 제조 스킴을 나타낸다.
도 5B 는, 실시예 5B 의 결과를 나타낸다. 각 도면의 세로축은, 각 도면의 상부에 기재되는 인자를 배지에 첨가했을 경우의 IL-6 의 발현량 (GAPDH mRNA 량에 대한 상대값) 을 나타낸다. 가로축 중, 0 은 각 도면의 상부에 기재되는 인자의 첨가 전인 것을 나타내고, 1, 3, 5 및 9 는 각 도면의 상부에 기재되는 인자 첨가 후의 경과 시간을 나타낸다. 백색 칼럼은 야생형 마우스 유래의 세포를 사용한 경우를 나타내고, 그레이 칼럼은 RBMS2 헤테로 결손 마우스 유래의 세포를 사용한 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 RBMS2 호모 결손 마우스 유래의 세포를 사용한 경우를 나타낸다.
도 5C 는, 실시예 5C 의 결과를 나타낸다. 각 도면의 세로축은, 각 도면의 상부에 기재되는 유전자의 mRNA 발현량 (GAPDH mRNA 량에 대한 상대값) 을 나타낸다. 가로축 중, 0 은 Pam3CSK4 의 첨가 전인 것을 나타내고, 1, 3, 5 및 9 는 Pam3CSK4 첨가 후의 경과 시간을 나타낸다. 백색 칼럼은 야생형 마우스 유래의 세포를 사용한 경우를 나타내고, 그레이 칼럼은 RBMS2 헤테로 결손 마우스 유래의 세포를 사용한 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 RBMS2 호모 결손 마우스 유래의 세포를 사용한 경우를 나타낸다.
도 6A 는, 실시예 6 의 생존 시간의 계측 결과를 나타낸다. 세로축은 생존율을 나타내고, 가로축은 LPS 투여 후의 시간을 나타낸다. WT 는 야생형 마우스의 생존율을 나타내고, KO 는 RBMS2 호모 결손 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 6B 는, 실시예 6 의 IL-6 농도의 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 혈청 중의 IL-6 농도를 나타내고, 가로축 중, WT 는 야생형 마우스를 나타내고, KO 는 RBMS2 호모 결손 마우스를 나타낸다. 그래프 중, 각 플롯은, 각 개체의 혈청에 있어서의 IL-6 농도를 나타내고, 바는 평균값을 나타낸다.
도 7 은, 실시예 7 의 결과를 나타낸다. 세로축은 RBMS2 발현량의 상대값을 나타낸다. 가로축은 IL-6 발현량의 상대값을 나타낸다.
도 8 은, 실시예 8 의 결과를 나타낸다. 세로축은, HPRT mRNA 발현량에 대한 RBMS2 mRNA 발현량의 상대값을 나타낸다. 가로축은, IL-10 단백질 또는 TGFβ 단백질 첨가 후의 경과 시간을 나타낸다. 백색 칼럼은 IL-10 단백질을 첨가했을 경우를 나타내고, 흑색 칼럼은 TGFβ 단백질을 첨가했을 경우를 나타낸다.
도 9 는, 실시예 9 의 결과를 나타낸다. 좌측 도면의 세로축은, 루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 3'UTR 을 연결했을 경우의 루시페라아제 활성을 나타내고, 우측 도면의 세로축은, 루시페라아제 ORF 의 하류에 PTGS2(COX2)3'UTR 을 연결했을 경우의 루시페라아제 활성을 나타낸다. 가로축 중, Empty 는 빈 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, RBMS2 는 RBMS2 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, HuR 은 HuR 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다.
도 10A 는, 실시예 10A 의 결과를 나타낸다. 세로축은, 루시페라아제 활성의 상대값을 나타낸다. 가로축 중, Empty 는 빈 벡터, FL 은 야생형 RBMS2 발현 벡터, dR1 은 RRM1 도메인 결실체 발현 벡터, F101A F104A 는 F101A 및 F104A 의 더블 변이체의 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다. ** 는 p 값 < 0.01 인 것을 나타낸다.
도 10B 는, 실시예 10B 의 결과를 나타낸다. 좌측의 도면은 IL-6 mRNA 량의 측정 결과를 나타내고, 우측의 도면은 IL-8 mRNA 량의 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 IL-6 mRNA 량 또는 IL-8 mRNA 량의 GAPDH mRNA 량에 대한 상대값을 나타낸다. 가로축 중, empty 는 컨트롤 렌티바이러스를 감염시켰을 경우를 나타내고, FL 은 야생형 RBMS2 를 발현하는 렌티바이러스를 감염시켰을 경우를 나타내고, RRM1 은 RRM1 도메인 결실체를 발현하는 렌티바이러스를 감염시켰을 경우를 나타내고, FF 는 F101A 및 F104A 의 더블 변이체를 발현하는 렌티바이러스를 감염시켰을 경우를 나타낸다.
도 10C 는, 실시예 10C 의 결과를 나타낸다. 세로축은, 면역 침강 전의 세포 용해액 중의 루시페라아제 mRNA 량을 100 ％ 로 했을 경우의 면역 침강물 중의 루시페라아제 mRNA 량의 상대값을 나타낸다. 가로축 중, WT FL 은, FLAG 표지된 야생형 RBMS2 의 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, WT dR1 은, FLAG 표지된 RRM1 도메인 결손형 RBMS2 의 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타내고, WT F101/F104A 는 F101A 및 F104A 의 더블 변이체의 발현 벡터를 도입했을 경우를 나타낸다. 흑색 칼럼은 항 FLAG 항체에 의해 면역 침강했을 경우를 나타내고, 백색 칼럼은 비특이적 IgG 에 의해 면역 침강했을 경우를 나타낸다.
도 11 은, 실시예 11 의 결과를 나타낸다. 세로축은, 시험 후의 귓바퀴의 두께로부터 시험 전의 귓바퀴의 두께를 빼서 얻어진 값 (귓바퀴의 부기가 나타내는 지표) 을 나타낸다. 가로축 중, Het 는, RBMS2 유전자 헤테로 결손 마우스를 나타내고, KO 는 RBMS2 유전자 호모 결손 마우스를 나타낸다.
도 12 는, 실시예 12 의 결과를 나타낸다. 세로축은, RBMS2 에 대한 siRNA 를 트랜스펙션했을 경우의 mRNA 발현량을 나타내고, 가로축은, 비특이적 siRNA (네거티브 컨트롤) 를 트랜스펙션했을 경우의 mRNA 발현량을 나타낸다. 각 플롯은, RBMS2 녹다운에 의해 발현량이 2 배 이상으로 증가 또는 2 분의 1 이하로 저하된 유전자를 나타낸다.
1. 정의
본 명세서 중에 있어서, 「함유」 및 「포함하는」 이라는 표현에 대해서는, 「함유」, 「포함하는」, 「실질적으로 이루어지는」 및 「만으로 이루어지는」 이라고 하는 개념을 포함한다.
아미노산 서열의 「동일성」 이란, 2 이상의 대비 가능한 아미노산 서열의 서로에 대한 아미노산 서열의 일치의 정도를 말한다. 따라서, 어느 2 개의 아미노산 서열의 일치성이 높을수록, 그들 서열의 동일성 또는 유사성은 높다. 아미노산 서열의 동일성의 레벨은, 예를 들어, 서열 분석용 툴인 FASTA 를 사용하고, 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 혹은, Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST (KarlinS, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes" Proc Natl Acad Sci USA. 87:2264-2268 (1990), KarlinS, Altschul SF. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences." Proc Natl Acad Sci USA. 90:5873-7 (1993)) 를 사용하여 결정할 수 있다. 이와 같은 BLAST 의 알고리즘에 기초한 BLASTX 라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법은 공지된 바이고, National Center of Biotechnology Information (NCBI) 의 웹사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 참조하면 된다. 또, 염기 서열의 『동일성』 도 상기에 준하여 정의된다.
본 명세서 중에 있어서, 「보존적 치환」 이란, 아미노산 잔기가 유사한 측사슬을 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 리신, 알기닌, 히스티딘과 같은 염기성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기끼리에서 치환되는 것이, 보존적인 치환에 해당한다. 그 밖에, 아스파르트산, 글루탐산과 같은 산성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인과 같은 비대전성 극성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판과 같은 비극성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 트레오닌, 발린, 이소류신과 같은 β-분지 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘과 같은 방향족 측사슬을 갖는 아미노산 잔기끼리에서의 치환도 동일하게, 보존적인 치환에 해당한다.
본 명세서에 있어서, 간단히 「RBMS2」 라고 나타내는 경우에는, RBMS2 단백질을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「뉴클레오티드」, 「올리고뉴클레오티드」 및 「폴리뉴클레오티드」 는, 핵산과 동일한 의미로서, DNA 및 RNA 의 양방을 포함하는 것으로 한다. 또, 이들은 2 본쇄이어도 되고 1 본쇄이어도 되고, 어느 서열을 갖는 「뉴클레오티드」 (또는 「올리고뉴클레오티드」, 「폴리뉴클레오티드」) 와 같은 경우, 특별히 언급하지 않는 한, 이것에 상보적인 서열을 갖는 「뉴클레오티드」 (또는 「올리고뉴클레오티드」 및 「폴리뉴클레오티드」) 도 포괄적으로 의미하는 것으로 한다. 또한 「뉴클레오티드」 (또는 「올리고뉴클레오티드」 및 「폴리뉴클레오티드」) 가 RNA 인 경우, 서열표에 나타내는 염기 기호 「T」 는 「U」 로 바꾸어 읽을 수 있는 것으로 한다.
2. 발현 카세트
본 발명은, RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 유전자를 포함하는, 발현 카세트 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 발현 카세트」 라고 하는 경우가 있다) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.
본원에 있어서, 「발현 카세트」 란, 세포 (예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유 동물 세포) 내에서, 그 발현 카세트가 포함하는 유전자를 발현시키는 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 있어서 「RBMS2 유전자 발현 제어 영역」 이란, 세포 내에 있어서 내재성 RBMS2 유전자의 발현을 제어하고 있는 DNA 영역, 혹은 그것과 동등한 발현 제어능을 갖는 DNA 영역인 한 특별히 제한되지 않는다. 그 영역으로는, 예를 들어, RBMS2 유전자의 전사 개시점, 그 상류 (5' 측) 의 서열, 및 필요에 따라 그 하류 (3' 측) 의 서열을 포함하는 프로모터를 들 수 있다. 그 프로모터의 구체예로는, RBMS2 유전자의 전사 개시점의 염기를 +1, 그 하류 (3' 측) 이 정의 값, 그 상류가 0 또는 부 (負) 의 값으로 했을 경우, 예를 들어 -10000 ∼ +2000, 바람직하게는 -5000 ∼ +1000, 보다 바람직하게는 -2000 ∼ +500, 더욱 바람직하게는 -1000 ∼ +200, 보다 더 바람직하게는 -500 ∼ +100, 특히 바람직하게는 -200 ∼ +50 의 DNA 영역을 들 수 있다. 그 프로모터는, 세포 내에 있어서 내재성 RBMS2 유전자의 발현을 제어하고 있는 프로모터와 동등 정도의 발현 제어능을 갖는 한, 변이를 가지고 있어도 된다. 이 경우, 변이를 갖는 프로모터의 염기 서열은, 세포 내에 있어서 내재성 RBMS2 유전자의 발현을 제어하고 있는 프로모터의 염기 서열과, 예를 들어 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 97 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는다. 변이의 부위는, 예를 들어 공지된 발현 제어 엘리먼트 (예를 들어 기본 전사 인자 결합 영역, 각종 액티베이터 결합 영역 등) 이외의 부위인 것이 바람직하다. 또한, 발현 제어 엘리먼트의 콘센서스 서열은 이미 공지된 바이고, 각종 데이터베이스상에서 용이하게 탐색할 수 있다.
본원에 있어서 「RBMS2 유전자」 란, 특별히 제한되지 않고, 동물, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 말, 소, 양, 염소, 사슴 등의 여러 가지 포유류의 것을 들 수 있다.
여러 가지 동물 유래의 RBMS2 유전자는 공지된 바이다. 그 발현 산물인 RBMS2 mRNA 및 RBMS2 단백질은 다음과 같이 예시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 인간 RBMS2 mRNA 로는, 서열 번호 3 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA (NCBI Reference Sequence : NM_002898.3) 를 들 수 있고, 마우스 RBMS2 mRNA 로는, 서열 번호 4 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA (NCBI Reference Sequence : NM_019711.2) 를 들 수 있다. 인간 RBMS2 단백질로는, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 (NCBI Reference Sequence : NP_002889.1) 을 들 수 있고, 마우스 RBMS2 단백질로는, 서열 번호 5 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 (NCBI Reference Sequence : NP_062685.2) 을 들 수 있다. 또, RBMS2 단백질에는, N 말단이 결손된 타입의 것도 포함되고, 이와 같은 타입의 것으로는, 예를 들어 마우스의 경우이면, 서열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 (NCBI Reference Sequence : NP_001034169.1) (mRNA 는, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어진다 (NCBI Reference Sequence : NM_001039080.1)) 을 들 수 있다.
RBMS2 유전자의 발현 산물인 RBMS2 단백질은, 염증 촉진 인자 mRNA (예를 들어, IL-6 mRNA, COX-2 mRNA, IL-8 mRNA, IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, MMP1 mRNA, IL-24 mRNA, c-Myc mRNA 등) 유래의 3'UTR 을 갖는 mRNA 또는 그 mRNA 로부터 번역되는 단백질의 발현을 촉진할 수 있는 활성 (이하 「염증 촉진 인자 발현 촉진 활성」 이라고 한다) 을 갖는 한, 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 아미노산 변이를 가지고 있어도 된다. 변이로는, 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성이 보다 잘 저해되지 않는다는 관점에서, 바람직하게는 치환, 보다 바람직하게는 보존적 치환을 들 수 있다.
또, RBMS2 유전자의 발현 산물인 RBMS2 mRNA도, 그 mRNA 로부터 번역되는 단백질이 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 한, 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 염기 변이를 가지고 있어도 된다. 변이로는, 그 mRNA 로부터 번역되는 단백질에 있어서 아미노산 치환이 생기지 않는 변이나 아미노산의 보존적 치환이 생기는 변이가 바람직하다.
염증 촉진 인자 발현 촉진 활성의 유무는, 공지된 방법에 따라 또는 준하여 판정할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 따라 또는 준하여 판정할 수 있다. 구체예로는, 실시예 1B 에 있어서, 발현 벡터로서 피검 단백질의 발현 벡터를 사용한 경우에, 빈 벡터를 사용한 경우보다 루시페라아제 활성이 높으면, 그 피검 단백질은 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 것으로 판정할 수 있다.
RBMS2 유전자의 발현 산물인 RBMS2 단백질의 바람직한 구체예로는, 하기 (a) 에 기재하는 단백질 및 하기 (b) 에 기재하는 단백질 :
(a) 서열 번호 2, 5 또는 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 및
(b) 서열 번호 2, 5 또는 6 으로 나타내는 아미노산 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
상기 (b) 에 있어서, 동일성은, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 98 ％ 이상이다.
상기 (b) 에 기재하는 단백질의 일례로는, 예를 들어
(b') 서열 번호 2, 5 또는 6 으로 나타내는 아미노산 서열에 대해 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다.
상기 (b') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 30 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 개이고, 보다 더 바람직하게는 2 또는 3 개이다.
RBMS2 유전자의 발현 산물인 RBMS2 mRNA 의 바람직한 구체예로는, 하기 (c) 에 기재하는 mRNA 및 하기 (d) 에 기재하는 mRNA :
(c) 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA, 및
(d) 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 염기 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 mRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
상기 (d) 에 있어서, 동일성은, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 98 ％ 이상이다.
상기 (d) 에 기재하는 단백질의 일례로는, 예를 들어
(d') 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 염기 서열에 대해 1 혹은 복수개의 염기가 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 염기 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다.
상기 (d') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 500 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 100 개이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 50 개이고, 보다 더 바람직하게는 2 ∼ 10 개이다.
본원에 있어서, RBMS2 유전자 발현 제어 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 「유전자」 란, 그 발현 산물을 검출 가능한 유전자인 한 특별히 제한되지 않는다. 또한, 여기서 말하는 「유전자」 란, 그 유전자의 발현 산물인 단백질의 코드 서열을 포함하는 것이고, 그 유전자의 그 밖의 서열 (예를 들어 인트론 서열 등) 을 포함하고 있어도 되지만, 프로모터는 포함하지 않는 개념이다. 그 유전자로는, 예를 들어, 리포터 유전자, 약제 내성 유전자, 효소 유전자, 구조 유전자, 수송 유전자, 저장 유전자, 수축 유전자, 방어 유전자, 조절 유전자 등, 이들 유전자의 개변 유전자 등을 들 수 있다. 개변 유전자의 예로는, 그 발현 산물인 단백질의 일부에 있어서 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 아미노산 변이가 일어나도록 염기가 변이한 상기 유전자나, 상기 유전자의 발현 산물의 복수종이 융합한 단백질을 발현하는 유전자 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 바람직하게는 리포터 유전자, 약제 내성 유전자 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 리포터 유전자를 들 수 있다.
본원에 있어서 「리포터 유전자」 란, 예를 들어 특정한 기질과 반응하여 발광 (발색) 하는 발광 (발색) 단백질, 혹은 여기광에 의해 형광을 발하는 형광 단백질을 코드하는 유전자인 한 특별히 한정되지 않는다. 발광 (발색) 단백질로는, 예를 들어 루시페라아제, β 갈락토시다아제, 클로람페니콜아세틸트랜스페라아제, β 글루쿠로니다아제 등을 들 수 있고, 형광 단백질로는, 예를 들어 GFP, Azami-Green, ZsGreen, GFP2, HyPer, Sirius, BFP, CFP, Turquoise, Cyan, TFP1, YFP, Venus, ZsYellow, Banana, KusabiraOrange, RFP, DsRed, AsRed, Strawberry, Jred, KillerRed, Cherry, HcRed, mPlum 등을 들 수 있다.
본원에 있어서 「약제 내성 유전자」 란, 그것을 발현하는 세포에 항균약 등의 약제에 대한 내성을 부여할 수 있는 유전자인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들어, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 에리트로마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.
상기 「유전자」 에 대해 「발현이 제어되도록 배치」 란, 그 유전자에 코드되는 단백질이 발현하도록, 그 유전자가 배치되어 있는 것을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어, 5' 측으로부터, 그 유전자 발현 제어 영역, 그 유전자의 순서로 배치되어 있는 양태를 들 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는, 필요에 따라, 다른 엘리먼트 (예를 들어, 멀티클로닝 사이트 (MCS)) 를 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, 5' 측으로부터, RBMS2 유전자 발현 제어 영역, 상기 「유전자」 의 순서로 배치되어 있는 경우이면, RBMS2 유전자 발현 제어 영역의 5' 측에 (바람직하게는, 인접하여), RBMS2 유전자 발현 제어 영역과 상기 「유전자」 의 사이에 (바람직하게는 어느 일방 혹은 양방에 인접하여), 상기 「유전자」 의 3' 측에 (바람직하게는 인접하여), MCS 가 배치되어 있는 양태를 들 수 있다. MCS 는 복수 (예를 들어 2 ∼ 50, 바람직하게는 2 ∼ 20, 보다 바람직하게는 2 ∼ 10) 개의 제한 효소 사이트를 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 발현 카세트는, 이것만으로, 혹은 다른 서열과 함께 벡터를 구성하고 있어도 된다. 이와 같은 벡터 (이하 「본 발명의 벡터」 라고 한다) 도, 본 발명에 포함된다. 다른 서열로는, 특별히 제한되지 않고, 발현 벡터가 포함할 수 있는 공지된 서열을 각종 채용할 수 있다. 이와 같은 서열의 일례로는, 예를 들어 복제 기점, 약제 내성 유전자 등을 들 수 있다. 또, 약제 내성 유전자의 종류는 상기 서술한 것을 예시할 수 있다. 벡터의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 동물 세포 발현 플라스미드 등의 플라스미드 벡터 ; 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스, 헤르페스바이러스, 센다이바이러스 등의 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
본 발명의 벡터는 세포 내에 포함되어 있어도 된다. 이와 같은 세포 (이하 「본 발명의 세포」 라고 한다) 도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 세포에 있어서, 본 발명의 벡터는, 게놈 외에 존재하고 있어도 되고, 게놈 내에 삽입된 상태로 존재하고 있어도 된다. 세포의 유래 생물종으로는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 말, 소, 양, 염소, 사슴 등의 여러 가지 포유류를 들 수 있다. 또, 그 세포의 종류로서도, 특별히 제한되지 않고, 각종 조직 유래 또는 각종 성질의 세포, 예를 들어 혈액 세포, 조혈간세포·전구 세포, 배우자 (정자, 난자), 선유아 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포, 간세포, 케라틴 생성 세포, 근세포, 표피 세포, 내분비 세포, ES 세포, iPS 세포, 조직간세포, 암세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 벡터, 및 본 발명의 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종은, 후술하는 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 바람직하게 사용할 수 있다. 이 관점에서, 본 발명은, 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 벡터, 및 본 발명의 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는, RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질 (바람직하게는 염증 촉진 인자 발현 억제제의 유효 성분) 의 스크리닝용 시약 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 시약」 이라고 하는 경우가 있다) 에도 관한 것이다.
본 발명의 시약은, 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 벡터, 및 본 발명의 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 그 밖에, 예를 들어 본 발명의 발현 카세트로부터의 발현 산물의 검출에 필요한 것을 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 것의 구체예로는, 하이브리다이제이션용의 시약, 프로브의 표지, 라벨체의 검출제, 완충액, 기구 등을 들 수 있다. 본 발명의 시약은, 이들을 포함한 스크리닝용 키트의 형태이어도 된다.
3. 스크리닝 방법
본 발명은, 피검물질의 존재하에 있어서의 하기 (i) ∼ (iii) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 지표로 하는, RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질의 스크리닝 방법 :
(i) RBMS2 유전자 발현 제어 영역에 의해 발현 제어되는 유전자 발현량,
(ii) RBMS2 와 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 의 결합량, 및
(iii) RBMS2 과잉 발현 세포에 있어서의 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 스크리닝 방법」 이라고 하는 경우가 있다)
에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.
본원에 있어서의 「피검물질」 로는, 천연에 존재하는 화합물 또는 인공으로 만들어진 화합물을 상관없이 널리 사용할 수 있다. 또, 정제된 화합물에 한정되지 않고, 다종의 화합물을 혼합한 조성물이나, 동식물의 추출액도 사용할 수 있다. 화합물에는, 저분자 화합물에 한정되지 않고, 단백질, 핵산, 다당류 등의 고분자 화합물도 포함된다.
본 발명의 스크리닝 방법은, 보다 구체적으로는, 피검물질 존재하에 있어서의 상기 지표의 값이, 피검물질 비존재하에 있어서의 상기 지표의 값보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질로서 선택할 수 있다.
스크리닝된 「RBMS2 의 발현 또는 기능을 억제하는 물질」 은, 염증 촉진 인자 발현 억제제의 유효 성분 혹은 그 후보 물질로서 선택하는 것이 가능하다.
이하, 지표 (i) ∼ (iii) 의 각각을 이용하는 양태별로, 구체적인 스크리닝 방법에 대해 설명한다.
3-1. 지표 (i) 을 이용하는 스크리닝 방법
지표 (i) 을 이용하는 스크리닝 방법은, 하기 공정 (a1) ∼ (c1) 을 포함한다 :
(a1) RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 유전자를 포함하는 발현 카세트를 함유하는 발현계와, 피검물질을 접촉시키는 공정,
(b1) 피검물질을 접촉시킨 발현계에 있어서의 상기 유전자의 발현량을 피검발현량으로서 측정하고, 그 피검발현량과, 피검물질을 접촉시키지 않는 발현계에 있어서의 상기 유전자의 발현량을 대조 발현량으로서 비교하는 공정, 그리고
(c1) 피검발현량이 대조 발현량보다 낮은 경우에, 피검물질을 RBMS2 의 발현을 억제하는 물질로서 선택하는 공정.
공정 (a1) 에 있어서, 「RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 영역에 의해 발현이 제어되도록 배치된 유전자를 포함하는 발현 카세트」 에 대해서는, 상기 「2. 발현 카세트」 와 동일하다. 다만, 공정 (a1) 에 있어서의 그 발현 카세트는, 세포의 게놈 내의 내재성 RBMS2 유전자 발현 제어 영역 및 그 하류의 RBMS2 유전자를 포함하는 발현 카세트가 포함되는 점에서, 상기 「2. 발현 카세트」 에 있어서의 발현 카세트와는 상이하다.
공정 (a1) 에 있어서, 「발현계」 란, 상기 발현 카세트로부터 유전자가 발현하기 위해서 필요한 성분이 포함되어 있는 계인 한 특별히 제한되지 않는다. 그 발현계로는, 예를 들어 무세포 단백질 발현계, 세포를 들 수 있다. 무세포 단백질 발현계는, 통상, 전사 및 번역에 필요한 인자 (RNA 폴리메라아제, 리보솜, 각종 리보뉴클레오티드 등) 를 포함하는 용액 (세포 추출액 등) 으로 구성되어 있고, 각종 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 세포는, 상기 발현 카세트로부터 유전자 발현 가능한 세포인 한 특별히 제한되지 않고, 각종 조직 유래 또는 각종 성질의 세포, 예를 들어 혈액 세포, 조혈간세포·전구 세포, 배우자 (정자, 난자), 선유아 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포, 간세포, 케라틴 생성 세포, 근세포, 표피 세포, 내분비 세포, ES 세포, iPS 세포, 조직간세포, 암세포 등을 들 수 있다. 발현계는, 보다 간편하게 스크리닝을 실시할 수 있다는 관점에서, 세포가 바람직하다.
공정 (a1) 에 있어서, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현계는, 예를 들어 발현계가 무세포 단백질 발현계인 경우에는, 그 계의 용액 내에 상기 발현 카세트가 포함되어 있는 상태이면 된다. 또, 발현계가 세포인 경우에는, 상기 발현 카세트가, 세포의 게놈 내에 삽입된 양태, 게놈 외에 (예를 들어 플라스미드의 상태로) 존재하는 양태 등을 들 수 있다.
공정 (a1) 에 있어서, 피검물질을 접촉시키는 양태는, 특별히 한정되지 않는다. 발현계가 무세포 단백질 발현계인 경우에는, 예를 들어 그 계의 용액에 피검물질을 첨가하면 된다. 또, 발현계가 세포인 경우에는, 예를 들어 세포 배양 배지에 피검물질을 첨가하면 된다.
공정 (a1) 에 있어서, 피검물질의 접촉 시간은, 특별히 제한되지 않고, 피검물질의 종류, 발현계의 종류 등에 따라 적절히 설정된다. 그 시간은, 예를 들어 5 분간 ∼ 72 시간이다.
공정 (b1) 에 있어서, 피검발현량 및 대조 발현량의 측정은, 공지된 방법에 따라 또는 준하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서술한 본 발명의 진단약을 사용하여 실시할 수 있다. 측정 대상이 핵산 (RBMS2 mRNA 또는 그것에서 유래하는 핵산 (cDNA 등)) 인 경우이면, 예를 들어, 프로브나 프라이머로서 사용하여, 노던 블로트법, RT-PCR 법, DNA 칩 해석법, in situ 하이브리다이제이션 해석법 등에 의해 측정할 수 있다. 측정 대상이 단백질인 경우이면, 예를 들어, 특이적 항체를 사용하여, 웨스턴 블로트법, ELISA 법 등에 의해 측정할 수 있다. 측정 대상이 리포터 단백질인 경우에는, 그 리포터 시그널 (형광, 발색, 발광 등) 을 검출 가능한 방법 (형광 현미경 관찰, 루시페라아제 어세이 등) 에 의해 측정할 수 있다. 측정 대상이 약제 내성 단백질인 경우에는, 약제의 존재하에서 생존하고 있는 세포수를 측정함으로써, 간접적으로 측정할 수 있다.
노던 블로트법을 이용하는 경우에는, 구체적으로는, 프로브를 방사성 동위 원소 (32P, 33P 등 : RI) 나 형광 물질 등으로 표지하고, 그것을, 통상적인 방법에 따라 나일론 멤브레인 등에 트랜스퍼한 상기 발현계 유래의 mRNA 와 하이브리다이즈시킨 후, 형성된 진단약과 피검자의 시료 유래의 mRNA 의 이중 사슬을, 프로브의 표지물 (RI 혹은 형광 물질 등의 표지 물질) 에서 유래하는 시그널을 방사선 검출기 BAS-1800II (후지 필름사 제조) 또는 형광 검출기 등으로 검출, 측정하는 방법을 예시할 수 있다. 또, AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 을 사용하여, 그 프로토콜에 따라 프로브를 표지하고, 상기 발현계 유래의 mRNA 와 하이브리다이즈시킨 후, 프로브 표지물에서 유래하는 시그널을 멀티바이오이메이저 STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 으로 검출, 측정하는 방법을 사용할 수도 있다.
RT-PCR 법을 이용하는 경우에는, 구체적으로는, 상기 발현계 유래의 RNA 로부터 통상적인 방법에 따라 cDNA 를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 표적 영역이 증폭되도록, 1 쌍의 프라이머 (상기 cDNA (-사슬) 에 결합하는 정사슬, +사슬에 결합하는 역사슬) 를 이것과 하이브리다이즈시키고, 통상적인 방법에 따라 PCR 법을 실시하여, 얻어진 증폭 2 본쇄 DNA 를 검출하는 방법을 예시할 수 있다. 또한, 증폭된 2 본쇄 DNA 의 검출은, 상기 PCR 을 미리 RI 나 형광 물질로 표지해 둔 프라이머를 사용하여 실시함으로써 산생되는 표지 2 본쇄 DNA 를 검출하는 방법, 산생된 2 본쇄 DNA 를 통상적인 방법에 따라 나일론 멤브레인 등에 트랜스퍼시키고, 표지 프로브를 사용하여 이것과 하이브리다이즈시켜 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 생성된 표지 2 본쇄 DNA 산물은 애질런트 2100 바이오 애널라이저 (요코가와 애널리티컬 시스템즈사 제조) 등으로 측정할 수 있다. 또, SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 사 제조) 로 그 프로토콜에 따라 RT-PCR 반응액을 조제하고, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 사 제조) 으로 반응시켜, 그 반응물을 검출할 수도 있다.
DNA 칩 해석을 이용하는 경우에는, DNA 프로브 (1 본쇄 또는 2 본쇄) 를 첩부 (貼付) 한 DNA 칩을 준비하고, 이것에 상기 발현계 유래의 RNA 로부터 통상적인 방법에 의해 조제된 cRNA 와 하이브리다이즈시키고, 형성된 DNA 와 cRNA 의 2 본쇄를, 표지 프로브와 결합시켜 검출하는 방법을 들 수 있다.
웨스턴 블로트법은, 1 차 항체를 사용한 후, 2 차 항체로서 125I 등의 방사성 동위 원소, 형광 물질, 호스래디시퍼옥시다아제 (HRP) 등의 효소 등으로 표지한 표지 항체 (1 차 항체에 결합하는 항체) 를 사용하여, 얻어지는 표지 화합물의 방사성 동위 원소, 형광 물질 등의 표지 물질에서 유래하는 시그널을 방사선 측정기 BAS-1800II (후지 필름사 제조 등), 형광 검출기 등으로 검출하고, 측정하는 방법이 예시된다. 또, 1 차 항체를 사용한 후, ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 을 사용하여, 그 프로토콜에 따라 검출하고, 멀티바이오이메이저 STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 으로 측정할 수도 있다.
공정 (c1) 에 있어서, 예를 들어 피검발현량이 대조 발현량보다 낮은 경우, 예를 들어, 피검발현량이 대조 발현량의 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50 혹은 1/100 인 경우에, 피검물질을 RBMS2 의 발현을 억제하는 물질로서 선택할 수 있다.
3-2. 지표 (ii) 를 이용하는 스크리닝 방법
지표 (ii) 를 이용하는 스크리닝 방법은, 하기 공정 (a2) ∼ (c2) 를 포함한다 :
(a2) AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 와 RBMS2 를, 피검물질의 존재하에서 접촉시키는 공정,
(b2) 피검물질의 존재하에서 접촉시켰을 경우의 상기 RNA 와 상기 RBMS2 의 결합량을 피검결합량으로서 측정하고, 그 피검결합량과, 피검물질의 비존재하에서 접촉시켰을 경우의 상기 RNA 와 상기 RBMS2 의 결합량을 대조 결합량으로서 비교하는 공정, 그리고
(c2) 피검결합량이 대조 결합량보다 낮은 경우에, 피검물질을 RBMS2 의 기능을 억제하는 물질로서 선택하는 공정.
공정 (a2) 에 있어서, AU-리치 엘리먼트란, AUUUA 등으로 대표되는, 일반식 : (U)nW1(U)mW2(U)o [식 중 : U 는 우라실을 나타낸다. W1 및 W2 는 동일 또는 상이하고, 아데닌 또는 우라실을 나타낸다 (단, W1 및 W2 가 양방 모두 우라실인 경우를 제외한다). n 은 0 ∼ 3 의 정수 (整數) 를 나타낸다. o 는 0 ∼ 3 의 정수를 나타낸다. m 은 3 ∼ 5 의 정수 (바람직하게는 3) 를 나타낸다.] 로 나타내는 염기 서열을 콘센서스 서열로 하는 엘리먼트이다. 그 AU-리치 엘리먼트는, 바람직하게는 염증 촉진 인자의 mRNA (예를 들어, IL-6 mRNA, COX-2 mRNA, IL-8 mRNA, IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, MMP1 mRNA, IL-24 mRNA, 및 c-Myc mRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 mRNA) 유래의 AU-리치 엘리먼트이다. 여기서, 「∼ 유래의 AU-리치 엘리먼트 (AU-rich element)」 란, 바꾸어 말하면, 이들 mRNA 에 포함되는 AU-rich element 를 의미한다.
공정 (a2) 에 있어서, AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 는, 이 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 인 한 특별히 제한되지 않는다. 그 RNA 중의 AU-리치 엘리먼트의 수는, 예를 들어 1 ∼ 20 개, 바람직하게는 2 ∼ 15 개, 보다 바람직하게는 3 ∼ 12 개, 더욱 바람직하게는 4 ∼ 10 개, 보다 더 바람직하게는 6 ∼ 9 개이다. 그 RNA 중의 AU-리치 엘리먼트의 수가 복수인 경우, AU-리치 엘리먼트는 비교적 좁은 범위 내 (예를 들어, 20 ∼ 400 bp, 바람직하게는 40 ∼ 200 bp, 보다 바람직하게는 60 ∼ 150 bp, 더욱 바람직하게는 80 ∼ 120 bp) 에 존재하는 것이 바람직하다. 또, 이 범위는, U 리치인 것이 바람직하다. U 리치의 정도로는, 그 범위의 전체 염기수에 대한 U 의 수의 비율이, 예를 들어 20 ％ 이상, 바람직하게는 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 50 ％ 이상이다. 이 비율의 상한은 특별히 제한되지 않지만, 90 ％, 80 ％, 70 ％ 등을 예시할 수 있다.
공정 (a2) 에 있어서, RBMS2 에 대해서는, 상기 「2. 발현 카세트」 에 있어서의 RBMS2 단백질과 동일하다.
공정 (a2) 에 있어서, 피검물질을 접촉시키는 양태는, AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA, RBMS2, 및 피검물질의 3 성분이 접촉할 수 있는 양태인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 이들 3 성분을 적당한 용매 중에서 혼합하는 양태, 이들 3 성분을 세포 내에서 공존시키는 양태 등을 들 수 있다.
공정 (a2) 에 있어서, 피검물질의 접촉 시간은, 특별히 제한되지 않고, 피검물질의 종류, 접촉이 시험관 내에서 실시되고 있는지 혹은 세포 내에서 실시되고 있는지 등에 따라 적절히 설정된다. 그 시간은, 예를 들어 5 분간 ∼ 72 시간이다.
공정 (b2) 에 있어서, 피검결합량 및 대조 결합량의 측정은, 공지된 방법에 따라 또는 준하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 면역 침강법이나 겔 시프트법 등에 의해 측정할 수 있다.
면역 침강법은, 전형적으로는 다음과 같이 실시할 수 있다. AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 와 RBMS2 를 포함하는 (피검물질과 접촉한, 혹은 접촉하고 있지 않은) 세포의 세포 용해액을 조제하고, 그 용해액을 RBMS2 에 대한 항체 혹은 그 RBMS2 에 태그가 부가되어 있는 경우에는 그 태그에 대한 항체로 면역 침강하고, 침강물에 포함되는 「AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA」 의 양을 PCR 에 의해 측정한다. 그 측정량이 보다 많으면, 피검결합량 또는 대조 결합량이 보다 많은 것을 나타낸다.
겔 시프트법은, 전형적으로는 다음과 같이 실시할 수 있다. AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 와 RBMS2 를 포함하는 (추가로 피검물질을 포함하는, 혹은 포함하지 않는) 용액을, 적당한 겔 (아크릴아미드 겔 등) 등을 사용하여 전기 영동하고, AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 와 RBMS2 가 결합한 복합체를 나타내는 밴드의 시그널을 측정한다. 그 측정량이 보다 많으면, 피검결합량 또는 대조 결합량이 보다 많은 것을 나타낸다.
공정 (c2) 에 있어서, 예를 들어 피검결합량이 대조 결합량보다 낮은 경우, 예를 들어, 피검결합량이 대조 결합량의 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50 혹은 1/100 인 경우에, 피검물질을 RBMS2 의 발현을 억제하는 물질로서 선택할 수 있다.
3-3. 지표 (iii) 을 이용하는 스크리닝 방법
지표 (iii) 을 이용하는 스크리닝 방법은, 하기 공정 (a3) ∼ (c3) 을 포함한다 :
(a3) 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 를 함유하고, 또한 RBMS2 가 과잉 발현하고 있는 세포와, 피검물질을 접촉시키는 공정,
(b3) 피검물질과 접촉시킨 세포에 있어서의 상기 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 피검량으로서 측정하고, 피검물질과 접촉시키지 않는 세포에 있어서의 상기 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 대조량으로 하여, 그 피검량과 그 대조량을 비교하는 공정, 그리고
(c3) 피검량이 대조량보다 낮은 경우에, 피검물질을 RBMS2 의 기능을 억제하는 물질로서 선택하는 공정.
공정 (a3) 에 있어서, AU-리치 엘리먼트에 대해서는, 「3-2. 지표 (ii) 를 이용하는 스크리닝 방법」 에 있어서의 AU-리치 엘리먼트와 동일하다.
공정 (a3) 에 있어서, 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 는, 3'-UTR 에 있어서 이 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 인 한 특별히 제한되지 않는다. 그 mRNA 의 3'-UTR 에 있어서의 AU-리치 엘리먼트의 수는, 예를 들어 1 ∼ 20 개, 바람직하게는 2 ∼ 15, 보다 바람직하게는 3 ∼ 12, 더욱 바람직하게는 4 ∼ 10, 보다 더 바람직하게는 6 ∼ 9 이다. 그 mRNA 중의 AU-리치 엘리먼트의 수가 복수인 경우, AU-리치 엘리먼트는 비교적 좁은 범위 내 (예를 들어, 20 ∼ 400, 바람직하게는 40 ∼ 200, 보다 바람직하게는 60 ∼ 150, 더욱 바람직하게는 80 ∼ 120) 에 존재하는 것이 바람직하다.
공정 (a3) 에 있어서, 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 는, 바람직하게는, 염증 촉진 인자의 mRNA, 보다 바람직하게는 IL-6 mRNA, COX-2 mRNA, IL-8 mRNA, IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, MMP1 mRNA, IL-24 mRNA, c-Myc mRNA 등, 혹은 이들의 mRNA 의 변이형을 들 수 있다. 그 변이형으로는, 바람직하게는 AU-리치 엘리먼트 이외의 서열, 또는 일부의 AU-리치 엘리먼트에 있어서, 1 혹은 복수개 (예를 들어, 2 ∼ 50 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 20 개이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 10, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 더 바람직하게는 2 또는 3 개) 의 염기가 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 mRNA 를 들 수 있다.
공정 (a3) 에 있어서, RBMS2 에 대해서는, 상기 「2. 발현 카세트」 에 있어서의 RBMS2 단백질과 동일하다.
공정 (a3) 에 있어서, 세포에 대해서는, 상기 「3-1. 지표 (i) 을 이용하는 스크리닝 방법」 에 있어서의 세포와 동일하다.
공정 (a3) 에 있어서, 피검물질을 접촉시키는 양태는, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 세포 배양 배지에 피검물질을 첨가하는 양태를 들 수 있다.
공정 (a3) 에 있어서, 피검물질의 접촉 시간은, 특별히 제한되지 않고, 피검물질의 종류 등에 따라 적절히 설정된다. 그 시간은, 예를 들어 5 분간 ∼ 72 시간이다.
공정 (b3) 에 있어서, 피검량 및 대조량의 측정에 대해서는, 상기 「3-1. 지표 (i) 을 이용하는 스크리닝 방법」 에 있어서의 피검발현량 및 대조 발현량의 측정과 동일하다.
공정 (c3) 에 있어서, 예를 들어 피검량이 대조량보다 낮은 경우, 예를 들어, 피검량이 대조량의 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50 혹은 1/100 인 경우에, 피검물질을 RBMS2 의 발현을 억제하는 물질로서 선택할 수 있다.
4. 염증 촉진 인자 발현 억제제
본 발명은, RBMS2 발현 억제제 및 RBMS2 기능 억제제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는, 염증 촉진 인자 발현 억제제 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 제」 라고 하는 경우가 있다) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.
발현 억제 대상 및 기능 억제 대상인 RBMS2 에 대해서는, 상기 「2. 발현 카세트」 에 있어서의 RBMS2 단백질과 동일하다.
RBMS2 발현 억제제로는, RBMS2 단백질의 발현량을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 RBMS2 특이적 small interfering RNA (siRNA), RBMS2 특이적 microRNA (miRNA), RBMS2 특이적 안티센스 핵산, 이들의 발현 벡터 등을 들 수 있다. 또, 이들 외에도, IL-10 단백질이 RBMS2 발현 억제제로서 기능할 수 있는 것이 본 실시예에서 나타나 있다.
RBMS2 특이적 siRNA 는, RBMS2 를 코드하는 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 2 본쇄 RNA 분자인 한 특별히 제한되지 않는다. 일 실시형태에 있어서, siRNA 는, 예를 들어, 18 염기 이상, 19 염기 이상, 20 염기 이상, 또는 21 염기 이상의 길이인 것이 바람직하다. 또, siRNA 는, 예를 들어, 25 염기 이하, 24 염기 이하, 23 염기 이하, 또는 22 염기 이하의 길이인 것이 바람직하다. 여기에 기재하는 siRNA 의 길이의 상한값 및 하한값은 임의로 조합하는 것이 상정된다. 예를 들어, 하한이 18 염기이고, 상한이 25 염기, 24 염기, 23 염기, 또는 22 염기인 길이 ; 하한이 19 염기이고, 상한이 25 염기, 24 염기, 23 염기, 또는 22 염기인 길이 ; 하한이 20 염기이고, 상한이 25 염기, 24 염기, 23 염기, 또는 22 염기인 길이 ; 하한이 21 염기이고, 상한이 25 염기, 24 염기, 23 염기, 또는 22 염기인 길이의 조합이 상정된다.
siRNA 는, shRNA (small hairpin RNA) 이어도 된다. shRNA 는, 그 일부가 스템 루프 구조를 형성하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, shRNA 는, 어느 영역의 서열을 서열 a 로 하고, 서열 a 에 대한 상보 사슬을 서열 b 로 하면, 서열 a, 스페이서, 서열 b 의 순서가 되도록 이들 서열이 1 개의 RNA 사슬에 존재하도록 하고, 전체적으로 45 ∼ 60 염기의 길이가 되도록 설계할 수 있다. 서열 a 는, 표적이 되는 RBMS2 를 코드하는 염기 서열의 일부의 영역의 서열이고, 표적 영역은 특별히 한정되지 않고, 임의의 영역을 후보로 하는 것이 가능하다. 그리고 서열 a 의 길이는 19 ∼ 25 염기, 바람직하게는 19 ∼ 21 염기이다.
RBMS2 특이적 siRNA 는, 5' 또는 3' 말단에, 부가적인 염기를 가지고 있어도 된다. 그 부가적 염기의 길이는, 통상 2 ∼ 4 염기 정도이다. 그 부가적 염기는, DNA 이어도 되고 RNA 이어도 되지만, DNA 를 사용하면 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있는 경우가 있다. 이와 같은 부가적 염기의 서열로는, 예를 들어 ug-3', uu-3', tg-3', tt-3', ggg-3', guuu-3', gttt-3', ttttt-3', uuuuu-3' 등의 서열을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
siRNA 는, 3' 말단에 돌출부 서열 (오버행) 을 가지고 있어도 되고, 구체적으로는, dTdT (dT 는 데옥시티미딘을 나타낸다) 를 부가한 것을 들 수 있다. 또, 말단 부가가 없는 평활 말단 (블런트 엔드) 이어도 된다. siRNA 는, 센스 사슬과 안티센스 사슬이 상이한 염기수이어도 되고, 예를 들어, 안티센스 사슬이 3' 말단 및 5' 말단에 돌출부 서열 (오버행) 을 가지고 있는 「asymmetrical interfering RNA (aiRNA)」 를 들 수 있다. 전형적인 aiRNA 는, 안티센스 사슬이 21 염기로 이루어지고, 센스 사슬이 15 염기로 이루어지고, 안티센스 사슬의 양단에서 각각 3 염기의 오버행 구조를 취한다.
RBMS2 특이적 siRNA 의 표적 서열의 위치는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 일 실시형태에 있어서, 5'-UTR 및 개시 코돈으로부터 약 50 염기까지, 그리고 3'-UTR 이외의 영역으로부터 표적 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 선택된 표적 서열의 후보군에 대해, 표적 이외의 mRNA 에 있어서 16 - 17 염기가 연속된 서열에 상동성이 없는지의 여부를, BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 등의 호몰로지 검색 소프트를 사용하여 조사하고, 선택한 표적 서열의 특이성을 확인하는 것이 바람직하다. 특이성이 확인된 표적 서열에 대해, AA (혹은 NA) 이후의 19 - 21 염기에 TT 혹은 UU 의 3' 말단 오버행을 갖는 센스 사슬과, 그 19 - 21 염기에 상보적인 서열 및 TT 혹은 UU 의 3' 말단 오버행을 갖는 안티센스 사슬로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 siRNA 로서 설계해도 된다. 또, siRNA 의 전구체인 shRNA 는, 루프 구조를 형성할 수 있는 임의의 링커 서열 (예를 들어, 5 - 25 염기 정도) 을 적절히 선택하고, 상기 센스 사슬과 안티센스 사슬을 그 링커 서열을 통하여 연결함으로써 설계할 수 있다.
siRNA 및/또는 shRNA 의 서열은, 여러 가지 web 사이트상에 무료로 제공되는 검색 소프트를 사용하여 검색이 가능하다. 이와 같은 사이트로는, 예를 들어, 이하를 들 수 있다.
Ambion 이 제공하는 siRNA Target Finder (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) pSilencer (등록상표) Expression Vector 용 인서트 디자인 툴 (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html) RNAi Codex 가 제공하는 GeneSeer (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi).
siRNA 는, mRNA 상의 표적 서열의 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 DNA/RNA 자동 합성기로 각각 합성하고, 적당한 어닐링 완충액 중, 약 90 ∼ 약 95 ℃ 에서 약 1 분 정도 변성시킨 후, 약 30 ∼ 약 70 ℃ 에서 약 1 ∼ 약 8 시간 어닐링시킴으로써 조제할 수 있다. 또, siRNA 의 전구체가 되는 shRNA 를 합성하고, 이것을, RNA 절단 단백질 다이서 (dicer) 를 사용하여 절단함으로써 조제할 수도 있다.
RBMS2 특이적 miRNA 는, RBMS2 를 코드하는 유전자의 번역을 저해하는 한 임의이다. 예를 들어, miRNA 는, siRNA 와 같이 표적 mRNA 를 절단하는 것이 아니라, 표적의 3' 비번역 영역 (UTR) 에 대합 (對合) 하여 그 번역을 저해해도 된다. miRNA 는, pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA (precursor miRNA), 및 성숙 miRNA 중 어느 것이어도 된다. miRNA 의 길이는 특별히 제한되지 않고, pri-miRNA 의 길이는 통상 수백 ∼ 수천 염기이고, pre-miRNA 의 길이는 통상 50 ∼ 80 염기이고, 성숙 miRNA 의 길이는 통상 18 ∼ 30 염기이다. 일 실시형태에 있어서, RBMS2 특이적 miRNA 는, 바람직하게는 pre-miRNA 또는 성숙 miRNA 이고, 보다 바람직하게는 성숙 miRNA 이다. 이와 같은 RBMS2 특이적 miRNA 는, 공지된 수법으로 합성해도 되고, 합성 RNA 를 제공하는 회사로부터 구입해도 된다.
RBMS2 특이적 안티센스 핵산이란, RBMS2 를 코드하는 유전자의 mRNA 의 염기 서열과 상보적 혹은 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그 일부를 포함하는 핵산으로서, 그 mRNA 와 특이적 또한 안정적인 이중 사슬을 형성하여 결합함으로써, RBMS2 단백질 합성을 억제하는 기능을 갖는 핵산이다. 안티센스 핵산은 DNA, RNA, DNA/RNA 키메라 중 어느 것이어도 된다. 안티센스 핵산이 DNA 인 경우, 표적 RNA 와 안티센스 DNA 에 의해 형성되는 RNA : DNA 하이브리드는, 내재성 리보뉴클레아제 H (RNase H) 에 인식되어 표적 RNA 의 선택적인 분해를 일으킨다. 따라서, RNase H 에 의한 분해를 지향하는 안티센스 DNA 의 경우, 표적 서열은, mRNA 중의 서열뿐만 아니라, RBMS2 유전자의 초기 번역 산물에 있어서의 인트론 영역의 서열이어도 된다. 인트론 서열은, 게놈 서열과, RBMS2 유전자의 cDNA 염기 서열을 BLAST, FASTA 등의 호몰로지 검색 프로그램을 사용하여 비교함으로써, 결정할 수 있다.
RBMS2 특이적 안티센스 핵산의 표적 영역은, 그 안티센스 핵산이 하이브리다이즈함으로써, 결과적으로 RBMS2 단백질에 대한 번역이 저해되는 것이면 그 길이는 제한되지 않는다. RBMS2 특이적 안티센스 핵산은, RBMS2 를 코드하는 mRNA 의 전체 서열이어도 되고 부분 서열이어도 된다. 합성의 용이함이나 항원성, 세포내 이행성의 문제 등을 고려하면, 약 10 ∼ 약 40 염기, 특히 약 15 ∼ 약 30 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, RBMS2 유전자의 5' 단 (端) 헤어핀 루프, 5' 단 비번역 영역, 번역 개시 코돈, 단백질 코드 영역, ORF 번역 종지 코돈, 3' 단 비번역 영역, 3' 단 팔린드롬 영역 또는 3' 단 헤어핀 루프 등을 안티센스 핵산의 바람직한 표적 영역으로서 선택할 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
RBMS2 특이적 안티센스 핵산은, RBMS2 유전자의 mRNA 나 초기 전사 산물과 하이브리다이즈하여 단백질에 대한 번역을 저해할 뿐만 아니라, 2 본쇄 DNA 인 이들의 유전자와 결합하여 삼중 사슬 (트리플렉스) 을 형성하여, RNA 에 대한 전사를 저해할 수 있는 것 (안티젠 (antigene)) 이어도 된다.
상기한 RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, 및 RBMS2 특이적 안티센스 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 분자는, 안정성 (화학적 및/또는 대 (對) 효소) 이나 비활성 (RNA 와의 친화성) 을 향상시키기 위해, 여러 가지 화학 수식을 포함해도 된다. 예를 들어, 뉴클레아제 등의 가수분해 효소에 의한 분해를 방지하기 위해, 안티센스 핵산을 구성하는 각 뉴클레오티드의 인산 잔기 (포스페이트) 를, 예를 들어, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate ; PS), 메틸포스포네이트 (methylphosphonate), 포스포로디티오네이트 (phosphorodithioate) 등의 화학 수식 인산 잔기로 치환할 수 있다. 또, 각 뉴클레오티드의 당 (리보오스) 의 2' 위치의 수산기를, -OR(R=CH3(2'-O-Me), CH2CH2OCH3(2'-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, 또는 CH2CH2CN 등) 로 치환해도 된다. 또한 염기 부분 (피리미딘, 퓨린) 에 화학 수식을 실시해도 되고, 예를 들어, 피리미딘 염기의 5 위치에의 메틸기나 카티온성 관능기의 도입, 혹은 2 위치의 카르보닐기의 티오카르보닐에의 치환 등을 실시해도 된다. 또, siRNA 나 miRNA 를 구성하는 뉴클레오티드 분자의 일부는, 천연형의 DNA 로 치환되어 있어도 된다.
RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, 및 RBMS2 특이적 안티센스 핵산 등은, RBMS2 유전자의 cDNA 서열 혹은 게노믹 DNA 서열에 기초하여 mRNA 혹은 초기 전사 산물의 표적 서열을 결정하고, 시판되는 DNA/RNA 자동 합성기를 사용하여, 이것에 상보적인 서열을 합성함으로써 조제할 수 있다. 또, 상기한 각종 수식을 포함하는 안티센스 핵산도, 모두 공지된 수법에 의해, 화학적으로 합성할 수 있다.
RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, 또는 RBMS2 특이적 안티센스 핵산의 발현 벡터에 대해서는, RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, 또는 RBMS2 특이적 안티센스 핵산이 발현 가능한 상태로 삽입되어 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로는, 그 발현 벡터는, 프로모터 서열, 및 RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, 또는 RBMS2 특이적 안티센스 핵산의 코드 서열 (필요에 따라, 추가로 전사 종결 시그널 서열) 을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 필요에 따라 다른 서열을 포함한다. 프로모터는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 CMV 프로모터, EF1 프로모터, SV40 프로모터, MSCV 프로모터, hTERT 프로모터, β 액틴 프로모터, CAG 프로모터 등의 RNA polymerase II (polII) 계 프로모터 ; 마우스 및 인간의 U6-snRNA 프로모터, 인간 H1-RNase P RNA 프로모터, 인간 발린-tRNA 프로모터 등의 RNA polymerase III (polIII) 계 프로모터 등을 들 수 있고, 이들 중에서도, 짧은 RNA 의 전사를 정확하게 실시할 수 있다는 관점에서, polIII 계 프로모터가 바람직하다. 다른 서열로는, 특별히 제한되지 않고, 발현 벡터가 포함할 수 있는 공지된 서열을 각종 채용할 수 있다. 이와 같은 서열의 일례로는, 예를 들어 복제 기점, 약제 내성 유전자 등을 들 수 있다. 또, 약제 내성 유전자의 종류 및 벡터의 종류는 상기 서술한 것을 예시할 수 있다.
RBMS2 발현 억제제의 다른 예로는, RBMS2 특이적 리보자임 등을 들 수 있다. 「리보자임」 이란, 협의로는, 핵산을 절단하는 효소 활성을 갖는 RNA 를 의미하지만, 본원에서는 서열 특이적인 핵산 절단 활성을 갖는 한 DNA 도 포함한다. 리보자임 핵산으로서 가장 범용성이 높은 것은, 바이로이드나 바이루소이드 등의 감염성 RNA 로 보여지는 셀프스플라이싱 RNA 가 있고, 해머 헤드형이나 헤어핀형 등이 알려져 있다. 해머 헤드형은 약 40 염기 정도에서 효소 활성을 발휘하고, 해머 헤드 구조를 취하는 부분에 인접하는 양단의 수 염기씩 (합하여 약 10 염기 정도) 을 mRNA 의 원하는 절단 부위와 상보적인 서열로 함으로써, 표적 mRNA 만을 특이적으로 절단하는 것이 가능하다. 이 타입의 리보자임 핵산은, RNA 만을 기질로 하므로, 게놈 DNA 를 공격하는 일이 없다는 이점을 갖는다. RBMS2 유전자의 mRNA 가 자체에서 2 본쇄 구조를 취하는 경우에는, RNA 헬리카아제와 특이적으로 결합할 수 있는 바이러스 핵산 유래의 RNA 모티프를 연결한 하이브리드리보자임을 사용함에 따라, 표적 서열을 1 본쇄로 할 수 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10) : 5572-5577 (2001)]. 또한 리보자임을, 그것을 코드하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터의 형태로 사용하는 경우에는, 전사 산물의 세포질로의 이행을 촉진하기 위해, tRNA 를 개변한 서열을 추가로 연결한 하이브리드리보자임으로 할 수도 있다 [Nucleic Acids Res., 29(13) : 2780-2788 (2001)].
RBMS2 기능 억제제는, RBMS2 단백질의 기능을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 제한되지 않는다. 여기서, RBMS2 단백질의 기능을 억제란, 예를 들어 (x) RBMS2 와 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 의 결합량을 감소시키는 것, 및/또는 (y) RBMS2 과잉 발현 세포에 있어서의 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 감소시키는 것을 의미한다. RBMS2 단백질의 기능을 억제하는지의 여부는, 예를 들어, 상기 「3-2. 지표 (ii) 를 이용하는 스크리닝 방법」 이나 「3-3. 지표 (iii) 을 이용하는 스크리닝 방법」 에 기재된 방법에 의해 판정할 수 있다.
본 발명의 제의 발현 억제 대상인 염증 촉진 인자는, 생체 내에 있어서의 염증 반응의 야기 또는 그 증악에 기여하는 인자인 한 특별히 제한되지 않는다. 그 인자로는, 예를 들어 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, c-Myc 등을 들 수 있다.
본 발명의 제는, 염증 촉진 인자 (예를 들어 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, c-Myc 등) 에 의해 발증 또는 증악되는 질환의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다. 그 질환으로서 구체적으로는, 예를 들어 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등을 들 수 있다. 진단 대상 질환으로서 보다 구체적으로는, 예를 들어 자기 면역 질환, 류머티즘성 질환, 관절 류머티즘, 변성 관절 질환, 관절염, 패혈증, 림프 증식성 질환, 중추성 탈수 질환, 척추 관절증, 염증성 동통, 수술후 동통, 알레르기성 질환 등을 들 수 있고, 바람직하게는 자기 면역 질환, 관절 류머티즘, 림프 증식성 질환, 중추성 탈수 질환, 수술후 동통, 알레르기성 질환 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 관절 류머티즘을 들 수 있다.
본원에 있어서의 자기 면역 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 길랭·바레 증후군, 궤양성 대장염, 크론병, 바세도우병, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 다발성 근염, 강피증, 쇼그렌 증후군.
본원에 있어서의 류머티즘성 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 관절 류머티즘, 약년성 특발성 관절염, 전신성 에리테마토데스, 강피증, 다발성 근염, 혈관염 증후군, 베체트병, 쇼그렌 증후군, 관절증성 건선.
본원에 있어서의 변성 관절 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 변형성 슬관절증, 변형성 고관절증, 변형성 주관절증, 변형성 견관절증, 변형성 수관절증, 변형성 족관절증.
본원에 있어서의 림프 증식성 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 림프 부종, 림프절염, 악성 림프종, 캐슬만병.
본원에 있어서의 중추성 탈수 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 다발성 경화증, 급성 산재성 뇌척수염, 염증성 광범성 경화증.
본원에 있어서의 척추 관절증에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 강직성 척추염, 반응성 관절염, 건선성 관절염.
본원에 있어서의 염증성 동통에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 변형성 관절증, 요통증, 견관절 주위염, 경견완 증후군, 건·건초염, 치통.
본원에 있어서의 알레르기성 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 접촉성 피부염, 습진, 두드러기, 퀸케부종, 결절성 홍반, 아토피성 피부염 등의 알레르기성 피부 질환, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 약물 알레르기, 음식 알레르기.
본 발명의 제는, RBMS2 발현 억제제 및 RBMS2 기능 억제제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종 (본 명세서에 있어서, 간단히 「유효 성분」 이라고 하는 경우가 있다) 을 함유하는 한 특별히 제한되지 않고, 필요에 따라 추가로 다른 성분을 포함하고 있어도 된다. 다른 성분으로는, 약학적으로 허용되는 성분이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 기제, 담체, 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 증점제, 보습제, 착색료, 향료, 킬레이트제 등을 들 수 있다.
본 발명의 제의 사용 양태는, 특별히 제한되지 않고, 그 종류에 따라 적절한 사용 양태를 취할 수 있다. 본 발명의 제는, 예를 들어 in vitro 로 사용 (예를 들어, 배양 세포의 배지에 첨가한다) 할 수도 있고, in vivo 로 사용 (예를 들어, 동물에 투여한다) 할 수도 있다.
본 발명의 제의 적용 대상은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 말, 소, 양, 염소, 사슴 등의 여러 가지 포유류 동물 ; 동물 세포 등을 들 수 있다. 세포의 종류도 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 혈액 세포, 조혈간세포·전구 세포, 배우자 (정자, 난자), 선유아 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포, 간세포, 케라틴 생성 세포, 근세포, 표피 세포, 내분비 세포, ES 세포, iPS 세포, 조직간세포, 암세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 제의 제형은 특별히 제한되지 않고, 그 사용 양태에 따라 적절한 제형을 취할 수 있다. 예를 들어, 동물에 투여하는 경우이면, 예를 들어 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 세립제, 시럽제, 장용제, 서방성 캡슐제, 저작성, 드롭, 환제, 내용액제, 로젠지, 서방제, 서방성 과립제 등의 경구제 ; 점비제, 흡입제, 항문 좌제, 삽입제, 관장제, 젤리제 등의 외용제 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 제는, 고형제, 반고형제, 액제 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 제 중의 유효 성분의 함유량은, 사용 양태, 적용 대상, 적용 대상의 상태 등에 좌우되는 것이고, 한정되지는 않지만, 예를 들어 0.0001 ∼ 100 중량％, 바람직하게는 0.001 ∼ 50 중량％ 로 할 수 있다.
본 발명의 제를 동물에 투여하는 경우의 투여량은, 약효를 발현하는 유효량이면 특별히 한정되지 않고, 통상은, 유효 성분의 중량으로서, 일반적으로 경구 투여의 경우에는 1 일당 0.1 ∼ 1000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 일당 0.5 ∼ 500 ㎎/㎏ 체중이고, 비경구 투여의 경우에는 1 일당 0.01 ∼ 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.05 ∼ 50 ㎎/㎏ 체중이다. 상기 투여량은 1 일 1 회 또는 2 ∼ 3 회로 나누어 투여하는 것이 바람직하고, 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감시킬 수도 있다.
5. 진단약
본 발명은, RBMS2 유전자 발현 산물 검출제를 함유하는, 동물의 질환의 진단약 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 진단약」 이라고 나타내는 경우도 있다) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.
RBMS2 유전자 발현 산물 검출제의 검출 대상인 RBMS2 유전자 발현 산물은, 진단 대상의 생물의 생체 내에서 발현하고 있는 RBMS2 유전자 발현 산물이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 RBMS2 mRNA 또는 그것에서 유래하는 핵산 (cDNA 등), RBMS2 단백질 등을 들 수 있다.
진단 대상의 동물은, RBMS2 유전자를 생체 내에서 발현할 수 있는 동물이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼 등의 여러 가지 포유류를 들 수 있다.
여러 가지 동물 유래의 RBMS2 mRNA 및 RBMS2 단백질의 서열은 공지된 바이다. 구체적으로는, 예를 들어 인간 RBMS2 mRNA 로는, 서열 번호 3 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA (NCBI Reference Sequence : NM_002898.3) 를 들 수 있고, 마우스 RBMS2 mRNA 로는, 서열 번호 4 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA (NCBI Reference Sequence : NM_019711.2) 를 들 수 있다. 인간 RBMS2 단백질로는, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 (NCBI Reference Sequence : NP_002889.1) 을 들 수 있고, 마우스 RBMS2 단백질로는, 서열 번호 5 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 (NCBI Reference Sequence : NP_062685.2) 을 들 수 있다. 또, RBMS2 단백질에는, N 말단이 결손한 타입의 것도 포함되고, 이와 같은 타입의 것으로는, 예를 들어 마우스의 경우이면, 서열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 (NCBI Reference Sequence : NP_001034169.1) (mRNA 는, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA (NCBI Reference Sequence : NM_001039080.1)) 을 들 수 있다.
검출 대상인 RBMS2 단백질은, 염증 촉진 인자 mRNA (예를 들어, IL-6 mRNA, COX-2 mRNA, IL-8 mRNA, IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, MMP1 mRNA, IL-24 mRNA, c-Myc mRNA 등) 유래의 3'UTR 을 갖는 mRNA 또는 그 mRNA 에 의해 번역되는 단백질의 발현을 촉진할 수 있는 활성 (염증 촉진 인자 발현 촉진 활성) 을 갖는 한, 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 아미노산 변이를 가지고 있어도 된다. 변이로는, 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성이 보다 잘 저해되지 않는다는 관점에서, 바람직하게는 치환, 보다 바람직하게는 보존적 치환을 들 수 있다.
또, 검출 대상인 RBMS2 mRNA 도, 그 mRNA 로부터 번역되는 단백질이 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 한, 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 염기 변이를 가지고 있어도 된다. 변이로는, 그 mRNA 로부터 번역되는 단백질에 있어서 아미노산 치환이 생기지 않는 변이나 아미노산의 보존적 치환이 생기는 변이가 바람직하다.
염증 촉진 인자 발현 촉진 활성의 유무는, 공지된 방법에 따라 또는 준하여 판정할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 따라 또는 준하여 판정할 수 있다. 구체예로는, 실시예 1B 에 있어서, 발현 벡터로서 피검 단백질의 발현 벡터를 사용한 경우에, 빈 벡터를 사용한 경우보다 루시페라아제 활성이 높으면, 그 피검 단백질은 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 것으로 판정할 수 있다.
검출 대상인 RBMS2 단백질의 바람직한 구체예로는, 하기 (a) 에 기재하는 단백질 및 하기 (b) 에 기재하는 단백질 :
(a) 서열 번호 2, 5 또는 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 및
(b) 서열 번호 2, 5 또는 6 으로 나타내는 아미노산 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
상기 (b) 에 있어서, 동일성은, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상이다.
상기 (b) 에 기재하는 단백질의 일례로는, 예를 들어
(b') 서열 번호 2, 5 또는 6 으로 나타내는 아미노산 서열에 대해 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다.
상기 (b') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 30 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 개이고, 보다 더 바람직하게는 2 또는 3 개이다.
검출 대상인 RBMS2 mRNA 의 바람직한 구체예로는, 하기 (c) 에 기재하는 단백질 및 하기 (d) 에 기재하는 mRNA :
(c) 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 mRNA, 및
(d) 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 염기 서열과 85 ％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 mRNA
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
상기 (d) 에 있어서, 동일성은, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상이다.
상기 (d) 에 기재하는 단백질의 일례로는, 예를 들어
(d') 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 염기 서열에 대해 1 혹은 복수개의 염기가 치환, 결실, 부가, 또는 삽입된 염기 서열로 이루어지고, 또한 염증 촉진 인자 발현 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 mRNA 를 들 수 있다.
상기 (d') 에 있어서, 복수개란, 예를 들어 2 ∼ 500 개이고, 바람직하게는 2 ∼ 100 개이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 50 개이고, 보다 더 바람직하게는 2 ∼ 10 개이다.
RBMS2 유전자 발현 산물 검출제는, 상기한 RBMS2 유전자 발현 산물의 검출 및 정량이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않는다. RBMS2 유전자 발현 산물 검출제로는, RBMS2 유전자 발현 산물이 핵산 (예를 들어, RBMS2 mRNA, 그것에서 유래하는 핵산 (cDNA 등) 등) 인 경우에는, 예를 들어 프라이머, 프로브 등을 들 수 있고, RBMS2 유전자 발현 산물이 단백질인 경우에는, 예를 들어 항체 등을 들 수 있다.
프라이머나 프로브 등은, RBMS2 mRNA 나 그것에서 유래하는 핵산 등을 선택적으로 (특이적으로) 인식하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 여기서, 「선택적으로 (특이적으로) 인식한다」 란, 예를 들어 노던 블로트법에 있어서는, RBMS2 mRNA 가 특이적으로 검출할 수 있는 것, 또 RT-PCR 법에 있어서는 RBMS2 mRNA 혹은 그것에서 유래하는 핵산 (cDNA 등) 이 특이적으로 증폭되는 것을 의미하지만, 그것에 한정되지 않고, 당업자가 상기 검출물 또는 증폭물이 RBMS2 mRNA 에서 유래하는 것으로 판단할 수 있는 것이면 된다.
프라이머나 프로브의 구체예로는, 하기 (e) 에 기재하는 폴리뉴클레오티드 그리고 하기 (f) 에 기재하는 폴리뉴클레오티드 :
(e) RBMS2 mRNA 의 염기 서열에 있어서 연속되는 적어도 15 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 및/혹은 당해 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 그리고
(f) RBMS2 mRNA 의 염기 서열 혹은 그것에 상보적인 염기 서열에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는, 적어도 15 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 상보적인 염기 서열 (상보 사슬, 역사슬) 이란, RBMS2 mRNA 의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전체 길이 서열, 또는 그 염기 서열에 있어서 적어도 연속된 15 염기 길이의 염기 서열을 갖는 그 부분 서열 (여기서는 편의상, 이들을 「정사슬」 이라고도 한다) 에 대해, A : T 및 G : C 와 같은 염기 대 관계에 기초하여, 염기적으로 상보적인 관계에 있는 폴리뉴클레오티드 또는 염기 서열을 의미하는 것이다. 단, 이러한 상보 사슬은, 대상으로 하는 정사슬의 염기 서열과 완전히 상보 서열을 형성하는 경우에 한정되지 않고, 대상으로 하는 정사슬과 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈할 수 있을 정도의 상보 관계를 갖는 것이어도 된다. 또한, 여기서 스트린젠트한 조건은, Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA) 에 교시되는 바와 같이, 복합체 혹은 프로브를 결합하는 핵산의 융해 온도 (Tm) 에 기초하여 결정할 수 있다. 예를 들어 하이브리다이즈 후의 세정 조건으로서, 통상 「1 × SSC, 0.1 ％ SDS, 37 ℃」 정도의 조건을 들 수 있다. 상보 사슬은 이러한 조건으로 세정해도 대상으로 하는 정사슬과 하이브리다이즈 상태를 유지하는 것임이 바람직하다. 특별히 제한되지 않지만, 보다 엄격한 하이브리다이즈 조건으로서 「0.5 × SSC, 0.1 ％ SDS, 42 ℃」 정도, 더욱 엄격한 하이브리다이즈 조건으로서 「0.1 × SSC, 0.1 ％ SDS, 65 ℃」 정도의 세정 조건을 들 수 있다. 구체적으로는, 이와 같은 상보 사슬로서, 대상의 정사슬의 염기 서열과 완전히 상보적인 관계에 있는 염기 서열로 이루어지는 사슬, 그리고 그 사슬과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 98 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 사슬을 예시할 수 있다.
프라이머나 프로브 등은, 예를 들어 서열 번호 3, 4 또는 7 로 나타내는 RBMS2 mRNA 의 염기 서열을 기초로, 예를 들어 벡터 NTI (Infomax 사 제조) 를 이용하여 설계할 수 있다. 구체적으로는 상기 RBMS2 mRNA 의 염기 서열을 벡터 NTI 의 소프트웨어에 적용하여 얻어지는, 프라이머 또는 프로브의 후보 서열, 혹은 적어도 그 서열을 일부에 포함하는 서열을, 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있다.
프라이머나 프로브 등의 염기 길이는, 상기 서술한 바와 같이 연속하는 적어도 15 염기의 길이를 갖는 것이면 특별히 제한되지 않고, 용도에 따라 적절히 설정할 수 있다. 염기 길이로는, 예를 들어 프라이머로서 사용하는 경우이면, 예를 들어 15 염기 ∼ 100 염기, 바람직하게는 15 염기 ∼ 50 염기, 보다 바람직하게는 15 염기 ∼ 35 염기를 예시할 수 있고, 예를 들어 프로브로서 사용하는 경우이면, 예를 들어 15 염기 ∼ 전체 서열의 염기수, 바람직하게는 15 염기 ∼ 1000 염기, 보다 바람직하게는 100 염기 ∼ 1000 염기를 예시할 수 있다.
프라이머나 프로브 등은, 그 기능이 현저하게 저해되지 않는 한, 수식이 실시되어 있어도 된다. 수식으로는, 예를 들어, 표지물, 예를 들어 형광 색소, 효소, 단백질, 방사성 동위체, 화학 발광 물질, 비오틴 등의 부가를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 형광 색소로는, 일반적으로 뉴클레오티드를 표지하고, 핵산의 검출이나 정량으로 사용되는 것을 바람직하게 사용할 수 있고, 예를 들어, HEX (4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxylfluorescein, 녹색 형광 색소), 플루오레세인 (fluorescein), NED (상품명, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조, 황색 형광 색소), 혹은 6-FAM (상품명, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조, 황녹색 형광 색소), 로다민 (rhodamin) 또는 그 유도체 [예를 들어, 테트라메틸로다민 (TMR)] 을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 형광 색소로 뉴클레오티드를 표지하는 방법은, 공지된 표지법 중 적당한 것을 사용할 수 있다 [Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996) 참조]. 또, 시판되는 형광 표지 키트를 사용할 수도 있다 (예를 들어, 아머샴·파머시아사 제조, 올리고뉴클레오티드 ECL 3'-올리고라벨링 시스템 등).
프라이머는, 임의의 고상으로 고정화시켜 사용할 수도 있다. 이 때문에 본 발명의 진단약은, 프로브 (올리고 또는 폴리뉴클레오티드) 를 고정화 프로브 (예를 들어 프로브를 고정화시킨 DNA 칩, cDNA 마이크로 어레이, 올리고 DNA 어레이, 멤브레인 필터 등. 이하 「DNA 칩 등」 이라고 총칭한다.) 의 형태로서 제공할 수 있다.
고정화에 사용되는 고상은, 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 고정화시킬 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 유리판, 나일론 멤브레인, 마이크로 비드, 실리콘 칩, 캐필러리 또는 그 밖의 기판 등을 들 수 있다. 고상에의 올리고 또는 폴리뉴클레오티드의 고정은, 미리 합성한 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 고상 상에 올리는 방법이어도 되고, 또 목적으로 하는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 고상 상에서 합성하는 방법이어도 된다. 고정 방법은, 예를 들어 DNA 마이크로 어레이이면, 시판되는 스포터 (Amersham 사 제조 등) 를 이용하는 등, 고정화 프로브의 종류에 따라 당해 기술 분야에서 주지된 바이다 [예를 들어, photolithographic 기술 (Affymetrix 사), 잉크젯 기술 (Rosetta Inpharmatics 사) 에 의한 올리고뉴클레오티드의 in situ 합성 등].
항체 등은, RBMS2 단백질을 선택적으로 (특이적으로) 인식하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 여기서, 「선택적으로 (특이적으로) 인식한다」 란, 예를 들어 웨스턴 블로트법이나 ELISA 법에 있어서, RBMS2 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 것을 의미하지만, 그것에 한정되지 않고, 당업자가 상기 검출물이 RBMS2 단백질에서 유래하는 것으로 판단할 수 있는 것이면 된다.
항체에는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 1 본쇄 항체, 또는 Fab 프래그먼트나 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성되는 프래그먼트 등과 같이 항원 결합성을 갖는 상기 항체의 일부가 포함된다. RBMS2 단백질의 아미노산 서열 중 적어도 연속하는, 통상 8 아미노산, 바람직하게는 15 아미노산, 보다 바람직하게는 20 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드에 대해 항원 결합성을 갖는 항체도, 본 발명의 항체에 포함된다.
이들 항체의 제조 방법은, 이미 주지된 바이고, 본 발명의 항체도 이들의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology, Chapter 11.12 ∼ 11.13 (2000)). 구체적으로는, 본 발명의 항체가 폴리클로날 항체인 경우에는, 통상적인 방법에 따라 대장균 등으로 발현하여 정제한 RBMS2 단백질을 사용하여, 혹은 통상적인 방법에 따라 당해 RBMS2 단백질의 부분 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 합성하고, 집토끼 등의 비인간 동물에 면역하고, 그 면역 동물의 혈청으로부터 통상적인 방법에 따라 얻는 것이 가능하다. 한편, 모노클로날 항체의 경우에는, 통상적인 방법에 따라 대장균 등으로 발현하고 정제한 RBMS2 단백질, 혹은 RBMS2 단백질의 부분 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 마우스 등의 비인간 동물에 면역하고, 얻어진 비장 세포와 골수종 세포를 세포 융합시켜 조제한 하이브리도마 세포 중에서 얻을 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 ∼ 11.11).
항체의 제조에 면역 항원으로서 사용되는 RBMS2 단백질은, 공지된 유전자 서열 정보에 기초하여, DNA 클로닝, 각 플라스미드의 구축, 숙주에의 트랜스펙션, 형질 전환체의 배양 및 배양물로부터의 단백질의 회수의 조작에 의해 얻을 수 있다. 이들 조작은, 당업자에게 이미 알려진 방법, 혹은 문헌에 기재된 방법 (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) 등에 준하여 실시할 수 있다.
구체적으로는, RBMS2 를 코드하는 유전자가 원하는 숙주 세포 중에서 발현할 수 있는 재조합 DNA (발현 벡터) 를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터, 목적 단백질을 회수함으로써, 본 발명 항체의 제조를 위한 면역 항원으로서의 단백질을 얻을 수 있다. 또 RBMS2 단백질의 부분 펩티드는, 공지된 유전자 서열 정보에 따라, 일반적인 화학 합성법 (펩티드 합성) 에 의해 제조할 수도 있다.
또 본 발명의 항체는, RBMS2 단백질의 부분 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 사용하여 조제되는 것이어도 된다. 이러한 항체의 제조를 위해서 사용되는 올리고 (폴리)펩티드는, 기능적인 생물 활성을 갖는 것은 필요로 하지 않지만, RBMS2 단백질과 동일한 면역원 특성을 갖는 것임이 바람직하다. 바람직하게는 이 면역원 특성을 갖고, 또한 RBMS2 단백질의 아미노산 서열에 있어서 적어도 연속되는 8 아미노산, 바람직하게는 15 아미노산, 보다 바람직하게는 20 아미노산으로 이루어지는 올리고 (폴리)펩티드를 예시할 수 있다.
이러한 올리고 (폴리)펩티드에 대한 항체의 제조는, 숙주에 따라 여러 가지 아쥬반트를 사용하여 면역학적 반응을 높임으로써 실시할 수도 있다. 한정되지는 않지만, 그러한 아쥬반트에는, 프로인드 아쥬반트, 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 그리고 리조레시틴, 플루로닉폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 유유제 (油乳劑), 키홀 림펫 헤모사이아닌 및 디니트로페놀과 같은 표면 활성 물질, BCG (칼메트-게랑간균) 나 코리네박테리움-파붐 등의 인간 아쥬반트가 포함된다.
본 발명의 진단약은, 상기한 RBMS2 유전자 발현 산물 검출제를 함유하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 그 검출제만으로 이루어지는 것, 그 검출제 외에, 예를 들어 RBMS2 유전자 발현 산물의 검출에 필요한 것을 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 것의 구체예로는, 하이브리다이제이션용의 시약, 프로브의 표지, 라벨체의 검출제, 완충액, 기구 등을 들 수 있다. 본 발명의 진단약은, 이들을 포함한 진단약 키트의 형태이어도 된다.
본 발명의 진단약의 진단 대상 질환은, 염증 촉진 인자 (예를 들어 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, c-Myc 등) 에 의해 발증 또는 증악되는 질환인 한 특별히 제한되지 않는다. 진단 대상 질환으로서 구체적으로는, 예를 들어 면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등을 들 수 있다. 진단 대상 질환으로서 보다 구체적으로는, 예를 들어 자기 면역 질환, 류머티즘성 질환, 관절 류머티즘, 변성 관절 질환, 관절염, 패혈증, 림프 증식성 질환, 중추성 탈수 질환, 척추 관절증, 염증성 동통, 수술후 동통, 알레르기성 질환 등을 들 수 있고, 바람직하게는 자기 면역 질환, 관절 류머티즘, 림프 증식성 질환, 중추성 탈수 질환, 수술후 동통, 알레르기성 질환 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 관절 류머티즘을 들 수 있다.
본원에 있어서의 자기 면역 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 길랭·바레 증후군, 궤양성 대장염, 크론병, 바세도우병, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 다발성 근염, 강피증, 쇼그렌 증후군.
본원에 있어서의 류머티즘성 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 관절 류머티즘, 약년성 특발성 관절염, 전신성 에리테마토데스, 강피증, 다발성 근염, 혈관염 증후군, 베체트병, 쇼그렌 증후군, 관절증성 건선.
본원에 있어서의 변성 관절 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 변형성 슬관절증, 변형성 고관절증, 변형성 주관절증, 변형성 견관절증, 변형성 수관절증, 변형성 족관절증.
본원에 있어서의 림프 증식성 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 림프 부종, 림프절염, 악성 림프종, 캐슬만병.
본원에 있어서의 중추성 탈수 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 다발성 경화증, 급성 산재성 뇌척수염, 염증성 광범성 경화증.
본원에 있어서의 척추 관절증에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 강직성 척추염, 반응성 관절염, 건선성 관절염.
본원에 있어서의 염증성 동통에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 변형성 관절증, 요통증, 견관절 주위염, 경견완 증후군, 건·건초염, 치통.
본원에 있어서의 알레르기성 질환에는 다음의 것이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다 : 접촉성 피부염, 습진, 두드러기, 퀸케부종, 결절성 홍반, 아토피성 피부염 등의 알레르기성 피부 질환, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 약물 알레르기, 음식 알레르기.
본 발명의 진단약은, 후술하는 「2. 질환의 검출 방법」 및 「3. 질환의 진행도의 판정 방법」 에 기재된 바와 같이, 상기 진단 대상 질환의 유무 (즉, 피검체가 질환으로 이환하고 있는지의 여부) 의 진단, 및 상기 진단 대상 질환의 진행도의 진단에 사용하는 것이 가능하다.
2. 질환의 검출 방법
본 발명은, RBMS2 발현량을 지표로 한, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 검출 방법 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 질환 검출 방법」 이라고 나타내는 경우도 있다) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.
본 발명의 질환 검출 방법의 구체적 양태로는, 예를 들어 다음의 양태를 들 수 있다 :
(a1) 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량을 측정하는 공정, 및
(b1) 상기 공정 (a1) 에서 측정된 피검발현량을, 면역 질환, 염증성 질환 및 동통성 질환의 어느 것으로도 이환하고 있지 않은 대조 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 대조 발현량과 대비하는 공정
을 갖고,
(c1) 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을, 피검체가 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환이라는 판단 지표로 하는, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 검출 방법.
피검체는, 본 발명의 질환 검출 방법의 대상이고, 그 생물종은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼 등의 여러 가지 포유류를 들 수 있다.
시료는, RBMS2 유전자 발현 산물을 포함하는 시료이면 특별히 제한되지 않고, 검출 대상 질환의 종류 등에 따라 적절히 선택된다. 시료로는, 예를 들어 혈액 시료, 뇨 시료, 그 밖에 각종 조직편 등을 들 수 있다. 시료로는, 생체로부터 채취한 그대로의 것을 사용해도 되지만, 검출 대상의 RBMS2 유전자 발현 산물을 통상적인 방법에 따라 정제·농축한 것이 바람직하다. 또, 검출 대상의 RBMS2 유전자 발현 산물이 핵산인 경우에는, RBMS2 mRNA 로부터 그 mRNA 의 서열 정보를 반영하는 핵산 (예를 들어 cDNA 등) 을 조제하고, 이것을 시료로서 사용할 수도 있다.
RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량 및 대조 발현량의 측정은, 공지된 방법에 따라 또는 준하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서술한 본 발명의 진단약을 사용하여 실시할 수 있다. RBMS2 유전자 발현 산물이 핵산 (RBMS2 mRNA 또는 그것에서 유래하는 핵산 (cDNA 등)) 인 경우이면, 예를 들어, 본 발명의 진단약을 프로브나 프라이머로서 사용하여, 노던 블로트법, RT-PCR 법, DNA 칩 해석법, in situ 하이브리다이제이션 해석법 등에 의해 측정할 수 있다. RBMS2 유전자 발현 산물이 단백질인 경우이면, 예를 들어, 본 발명의 진단약을 항체로서 사용하여, 웨스턴 블로트법, ELISA 법 등에 의해 측정할 수 있다.
노던 블로트법을 이용하는 경우에는, 본 발명의 진단약을 프로브로서 사용함으로써, 시료 중의 RBMS2 mRNA 혹은 그것에서 유래하는 핵산의 유무나 그 양을 측정할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 진단약 (상보 사슬) 을 방사성 동위 원소 (32P, 33P 등 : RI) 나 형광 물질 등으로 표지하고, 그것을, 통상적인 방법에 따라 나일론 멤브레인 등에 트랜스퍼한 피검자의 시료 유래의 mRNA 와 하이브리다이즈시킨 후, 형성된 진단약과 피검자의 시료 유래의 mRNA 의 이중 사슬을, 진단약의 표지물 (RI 혹은 형광 물질 등의 표지 물질) 에서 유래하는 시그널을 방사선 검출기 BAS-1800II (후지 필름사 제조) 또는 형광 검출기 등으로 검출, 측정하는 방법을 예시할 수 있다. 또, AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 을 사용하여, 그 프로토콜에 따라 진단약을 표지하고, 피검자의 시료 유래의 mRNA 와 하이브리다이즈시킨 후, 진단약의 표지물에서 유래하는 시그널을 멀티바이오이메이저 STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 로 검출, 측정하는 방법을 사용할 수도 있다.
RT-PCR 법을 이용하는 경우에는, 본 발명의 진단약을 프라이머로서 사용함으로써, 시료 중의 RBMS2 mRNA 혹은 그것에서 유래하는 핵산의 유무나 그 양을 측정할 수 있다. 구체적으로는, 피검자의 생체 조직 유래의 RNA 로부터 통상적인 방법에 따라 cDNA 를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 표적 영역이 증폭되도록, 본 발명의 진단약으로부터 조제한 1 쌍의 프라이머 (상기 cDNA (-사슬) 에 결합하는 정사슬, +사슬에 결합하는 역사슬) 를 이것과 하이브리다이즈시키고, 통상적인 방법에 따라 PCR 법을 실시하여, 얻어진 증폭 2 본쇄 DNA 를 검출하는 방법을 예시할 수 있다. 또한, 증폭된 2 본쇄 DNA 의 검출은, 상기 PCR 을 미리 RI 나 형광 물질로 표지해 둔 프라이머를 사용하여 실시함으로써 산생되는 표지 2 본쇄 DNA 를 검출하는 방법, 산생된 2 본쇄 DNA 를 통상적인 방법에 따라 나일론 멤브레인 등에 트랜스퍼시키고, 표지한 진단약을 프로브로서 사용하여 이것과 하이브리다이즈시켜 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 생성된 표지 2 본쇄 DNA 산물은 애질런트 2100 바이오 애널라이저 (요코가와 애널리티컬 시스템즈사 제조) 등으로 측정할 수 있다. 또, SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 사 제조) 로 그 프로토콜에 따라 RT-PCR 반응액을 조제하고, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 사 제조) 으로 반응시켜, 그 반응물을 검출할 수도 있다.
DNA 칩 해석을 이용하는 경우에는, 본 발명의 진단약을 DNA 프로브 (1 본쇄 또는 2 본쇄) 로 하여 첩부한 DNA 칩을 준비하고, 이것에 피검자의 생체 조직 유래의 RNA 로부터 통상적인 방법에 의해 조제된 cRNA 와 하이브리다이즈시키고, 형성된 DNA 와 cRNA 의 2 본쇄를, 본 발명의 진단약으로부터 조제되는 표지 프로브와 결합시켜 검출하는 방법을 들 수 있다.
웨스턴 블로트법은, 본 발명의 진단약을 1 차 항체로서 사용한 후, 2 차 항체로서 125I 등의 방사성 동위 원소, 형광 물질, 호스래디시퍼옥시다아제 (HRP) 등의 효소 등으로 표지한 표지 항체 (1 차 항체에 결합하는 항체) 를 사용하고, 얻어지는 표지 화합물의 방사성 동위 원소, 형광 물질 등의 표지 물질에서 유래하는 시그널을 방사선 측정기 BAS-1800II (후지 필름사 제조 등), 형광 검출기 등으로 검출하여, 측정하는 방법이 예시된다. 또, 1 차 항체로서 본 발명의 진단약을 사용한 후, ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 을 사용하여, 그 프로토콜에 따라 검출하고, 멀티바이오이메이저 STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 으로 측정할 수도 있다.
피검발현량과의 대비 대상인 대조 발현량은, 피검체 1 개의 대조 발현량이어도 되지만, 복수의 피검체의 대조 발현량의 평균값이나 중앙값 등 쪽이 바람직하다.
피검체가 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환인지의 여부의 판단은, 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을 기준으로 하여 판단된다. 구체적으로는, 예를 들어 대조 발현량에 비해 피검발현량이 50 ％ 이상 상승, 바람직하게는 100 ％ 이상 상승, 보다 바람직하게는 200 ％ 이상 상승하고 있는 것을 지표로 하여 실시할 수 있다.
3. 질환의 진행도의 판정 방법
본 발명은, RBMS2 발현량을 지표로 한, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 진행도의 판정 방법 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 진행도 판정 방법」 이라고 나타내는 경우도 있다) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.
본 발명의 진행도 판정 방법의 구체적 양태로는, 예를 들어 다음의 양태를 들 수 있다 :
(a2) 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환으로 이환하고 있는 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량을 측정하는 공정, 및
(b2) 상기 공정 (a2) 에서 측정된 피검발현량을, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환으로 이환하고 있는 대조 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 대조 발현량과 대비하는 공정
을 갖고,
(c3) 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을, 피검체쪽이, 대조 피검체보다 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 진행도가 높다는 판단 지표로 하는, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 진행도의 판정 방법.
피검체, 시료, 피검발현량 및 대조 발현량의 측정, 피검발현량과의 대비 대상인 대조 발현량 등에 대해서는, 상기 「2. 질환의 검출 방법」 에 기재된 바와 같다.
질환의 진행도란, 예를 들어 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, c-Myc 등의 염증 촉진 인자의 발현과 관련하는 증상의 중독도 (重篤度) 로 정의할 수 있다.
피검체쪽이, 대조 피검체보다 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통성 질환의 진행도가 높은지 여부의 판단은, 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을 기준으로 하여 판단된다. 구체적으로는, 예를 들어 대조 발현량에 비해 피검발현량이 50 ％ 이상 상승, 바람직하게는 100 ％ 이상 상승, 보다 바람직하게는 200 ％ 이상 상승하고 있는 것을 지표로 하여 실시할 수 있다.
실시예
이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : IL-6 전사 후 조절 인자로서의 RBMS2 의 동정
실시예 1A
IL-6 전사 후 조절 인자를 알아내기 위하여, 스크리닝을 실시하였다. 개요를 도 1A 에 나타낸다. 구체적으로는, 다음과 같이 실시하였다. 먼저, SV40 프로모터의 하류에, 5' 측으로부터 루시페라아제의 ORF, IL-6 의 3'UTR (서열 번호 1) 이 배치되어 이루어지는 리포터 벡터를 제조하였다. 그 리포터 벡터, 및 여러 가지 유전자의 발현 벡터를, 384 웰 플레이트 상에서, 트랜스펙션 시약 (Fugene HD, 프로메가사 제조) 을 사용하여 HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 각 웰에 있어서의 루시페라아제 활성을 측정하였다. 얻어진 측정값을, 컨트롤 (발현 벡터로서 빈 벡터를 도입한 샘플) 의 측정값과 비교하고, 컨트롤에 대해 변화가 있던 발현 벡터를 스크리닝하였다 (1 차 스크리닝). 선택된 발현 벡터로부터, RNA 에 관련지어진 약 100 유전자의 발현 벡터를 추출하고, 상기와 동일하게 스크리닝을 실시하였다 (2 차 스크리닝).
2 차 스크리닝의 결과, IL-6 전사 후 조절 인자로서의 RBMS2 (NP_002889.1, 서열 번호 2) 가 동정되었다.
실시예 1B
실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터, 또는 그 리포터 벡터로부터 인간 IL-6 의 3'UTR 이 제거되어 이루어지는 컨트롤 리포터 벡터를, RBMS2 발현 벡터 또는 빈 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 1B 에 나타낸다.
도 1B 에 나타내는 바와 같이, RBMS2 는 IL-6 의 3'UTR 의존적으로 루시페라아제 활성을 상승시켰다.
실시예 1C
RBMS2 에 대한 siRNA (인간 RBMS2-1 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select, siRNA ID No. s11867, 서열 번호 8)), 혹은 인간 RBMS2-2 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select, siRNA ID No. s11868, 서열 번호 9), 또는 컨트롤 siRNA (네거티브 컨트롤 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select Negative Control No. 1 siRNA, 제품 번호 : 4390843)) 를, MDA-MB-231 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 IL-1β 를 배지에 첨가 (종농도 : 20 ng/㎖) 하고, 그 첨가로부터 3 시간 후에 세포를 회수하였다. 또한, MDA-MB-231 세포는 항상적으로 IL-6 을 산생하고, IL-1β 자극에 의해 더욱 많은 IL-6 을 발현한다. 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 정량 PCR 에 의해 RBMS2 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 12, 리버스 서열 번호 13) 및 IL-6 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 14, 리버스 서열 번호 15) 의 발현량을 측정하였다. 결과를 도 1C 에 나타낸다.
도 1C 에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-231 세포에 있어서, RBMS2 발현 억제에 의해 IL-6 mRNA 의 발현량이 현저하게 저하되었다.
실시예 1D
도입으로부터 36 시간 후에 IL-1β 를 첨가하고, 또한 그 첨가로부터 16 시간 후에 배양 상청을 회수하고 그 상청 중의 IL-6 단백질 발현량을 ELISA 에 의해 측정하는 것 이외에는, 실시예 1C 와 동일하게 실시하였다. 결과를 도 1D 에 나타낸다.
도 1D 에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-231 세포에 있어서, RBMS2 발현 억제에 의해 IL-6 단백질의 발현량이 현저하게 저하되었다.
실시예 1E
RBMS2 를 발현하는 레트로바이러스 또는 컨트롤 레트로바이러스를 MDA-MB-231 세포에 감염시킨 후, 퓨로마이신의 존재하에서 1 주간 배양하여, RBMS2 의 강제 발현 세포를 얻었다. 이 세포를 IL-1β 로 3 시간 자극한 후에 세포를 회수하고, 세포로부터 cDNA 를 조제하였다. 세포에 있어서의 IL-6 mRNA 의 발현량을 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 결과를 도 1E 에 나타낸다.
도 1E 에 나타내는 바와 같이, RBMS2 의 강제 발현에 의해 IL-6 mRNA 의 발현량이 상승하였다.
실시예 1F
IL-6 유전자의 프로모터 (서열 번호 36) 의 하류에, 루시페라아제 유전자의 ORF 가 배치되어 이루어지는 리포터 벡터를 제조하였다. 그 리포터 벡터를, RBMS2 발현 벡터 또는 빈 벡터와 함께, MDA-MB-231 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 1F 에 나타낸다.
도 1F 에 나타내는 바와 같이, RBMS2 의 발현은, IL-6 프로모터에 의해 유도되는 루시페라아제 활성에는 영향을 미치지 않았다.
실시예 1 의 결과
이상으로부터, RBMS2 는 IL-6 mRNA 의 전사 조절이 아니라 전사 후 조절을 통하여 IL-6 의 발현을 확실히 제어하는 것이 강하게 시사되었다.
실시예 2 : RBMS2 에 의한 ARE 를 통한 IL-6 mRNA 안정화
실시예 2A
RBMS2 발현 벡터 또는 빈 벡터를 THP-1 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 LPS 를 배지에 첨가 (종농도 : 1 ug/㎖) 함으로써 IL-6 mRNA 의 발현을 유도하고, 그 첨가로부터 5 시간 후에 악티노마이신 D 를 배지에 첨가 (종농도 : 5 ug/㎖) 함으로써 mRNA 합성을 정지시켰다. 발현 벡터 도입으로부터 48 시간 후, LPS 첨가로부터 5 시간 후, 및 악티노마이신 D 첨가로부터 3 시간 후에 세포를 회수하고, 정량 PCR 에 의해 IL-6 mRNA 량을 측정하였다. 결과를 도 2A 에 나타낸다.
도 2A 에 나타내는 바와 같이, 빈 벡터를 도입했을 경우, LPS 에 의해 IL-6 mRNA 의 발현이 유도되지만, 악티노마이신 D 처리에 의해 전사를 저해하면, IL-6 mRNA 는 급속히 분해되어, 그 양은 감소한다. 이에 대해, RBMS2 를 강제 발현시켰을 경우, 악티노마이신 D 처리 후에 보다 많은 IL-6 mRNA 의 잔존이 확인되었다. 이러한 점에서, RBMS2 에 의해 IL-6 mRNA 의 반감기가 연장된 것이 시사되었다.
실시예 2B
테트라사이클린 응답 인자 (TRE) 및 프로모터의 하류에, 5' 측으로부터 루시페라아제의 ORF, IL-6 의 3'UTR 이 배치되어 이루어지는 테트라사이클린 응답 발현 벡터를 제조하였다. 이 테트라사이클린 응답 발현 벡터를, RBMS2 발현 벡터 또는 빈 벡터와 함께, 미리 Tet-off 조절 플라스미드가 삽입된 HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 24 시간 후에 독시사이클린을 배지에 첨가 (종농도 : 10 ug/㎖) 하였다. 벡터 도입으로부터 24 시간 후, 및 독시사이클린 첨가로부터 2 시간 후에 세포를 회수하고, 정량 PCR 에 의해 루시페라아제 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 16, 리버스 서열 번호 17) 의 양을 측정하였다. 결과를 도 2B 에 나타낸다.
도 2B 에 나타내는 바와 같이, 빈 벡터를 도입했을 경우, 독시사이클린 첨가 (mRNA 합성 정지) 에 의해 IL-6 3'UTR 을 포함하는 루시페라아제 mRNA 량이 저하된다. 이에 대해, RBMS2 를 강제 발현시켰을 경우, 독시사이클린 첨가 후에 보다 많은 IL-6 3'UTR 을 포함하는 루시페라아제 mRNA 의 잔존이 확인되었다. 이러한 점에서, RBMS2 에 의해, IL-6 3'UTR 을 포함하는 루시페라아제 mRNA 의 반감기가 연장된 것이 시사되었다.
실시예 2C
프로모터의 하류에, 5' 측으로부터 루시페라아제의 ORF, IL-6 의 변이형 3'UTR (97-267 (염기 서열 : 서열 번호 37), 122-193 (염기 서열 : 서열 번호 38), ΔARE1 (염기 서열 : 서열 번호 39), ΔARE2 (염기 서열 : 서열 번호 40), 또는 ARE 뮤턴트 (염기 서열 : 서열 번호 41)) 가 배치되어 이루어지는 변이형 3'UTR 리포터 벡터를 제조하였다. 이 변이형 3'UTR 리포터 벡터를, RBMS2 발현 벡터 또는 빈 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 2C 에 나타낸다.
IL-6 mRNA 의 3'UTR 에는, mRNA 의 안정화에 관련되는 스템 루프 구조와, AU 가 풍부한 AU-리치 엘리먼트 (AU-rich element, ARE) 가 존재한다. 스템 루프 구조는 RNase 인 Regnase-1 (ZC3H12A) 에 의한 인식 및 그것에 계속되는 분해에 중요한 엘리먼트이다. 또, ARID5a 는 Regnase-1 의 기능과 길항함으로써 IL-6 mRNA 의 안정화에 기여하는 것이 보고되어 있다. 그러나, 도 2C 에 나타내는 바와 같이, RBMS2 는, 3'UTR 에 있어서 이 스템 루프 구조가 결손된 리포터 (97-267 및 122-193) 의 활성을 상승시켰다.
IL-6 mRNA 에는 2 개가 이웃한 ARE 가 2 지점 근접하여 존재한다. 이 영역을 통하여 TTP 등의 ARE 결합 단백질이 mRNA 의 분해에 관여하는 것이 알려져 있다. 도 2C 에 나타내는 바와 같이, 일방의 ARE 영역을 결손하면, RBMS2 에 의한 리포터 활성의 상승을 볼 수 없었다 (ΔARE1 및 ΔARE2). 또, ARE 의 서열을 변이 (U 를 G 로 치환) 시켜도, RBMS2 에 의한 리포터 활성의 상승을 볼 수 없었다 (ARE 뮤턴트). 이러한 점에서, RBMS2 는 ARE 영역을 통하여 mRNA 의 안정화에 관여하는 것이 시사되었다.
실시예 2 의 결과
이상으로부터, RBMS2 가, ARE 영역을 통한 mRNA 안정화 기구에 의해, IL-6 의 발현을 전사 후 레벨로 제어하는 것이 강하게 시사되었다.
실시예 3 : ARE 를 통한 RBMS2 와 IL-6 mRNA 의 결합
실시예 3A
실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터 (루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR), 또는 실시예 2C 에서 제조한 ARE 변이형 3'UTR 리포터 벡터 (ARE 뮤턴트) 를, FLAG 표지한 RBMS2 의 발현 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 세포를 회수하고, 세포 용해액을 조제하였다. 그 세포 용해액을 항 FLAG 항체 또는 비특이적 IgG 에 의해 면역 침강하고, 면역 침강물에 포함되는 루시페라아제 mRNA 량을 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 결과를 도 3A 에 나타낸다.
도 3A 에 나타내는 바와 같이, 항 FLAG 항체의 면역 침강에 의해, IL-6 의 야생형 3'UTR 을 포함하는 루시페라아제 mRNA 의 강한 농축이 관찰되었다. 이에 대해, ARE 변이형 3'UTR 을 포함하는 루시페라아제 mRNA 는 농축되지 않았다. 이상으로부터, RBMS2 가 ARE 를 통하여 결합하는 것이 시사되었다.
실시예 3B
실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터 (루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR) 를, FLAG 표지한 야생형 RBMS2 또는 RRM1 도메인 결손형 RBMS2 (아미노산 서열 : 서열 번호 46) 의 발현 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 세포를 회수하고, 세포 용해액을 조제하였다. 그 세포 용해액을 항 FLAG 항체 또는 비특이적 IgG 에 의해 면역 침강하고, 면역 침강물에 포함되는 루시페라아제 mRNA 량을 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 결과를 도 3B 에 나타낸다.
도 3B 에 나타내는 바와 같이, RBMS2 의 RRM1 도메인 결손 변이체를 과잉 발현시켜도, RNA 의 농축을 볼 수 없으므로, ARE 에의 결합에 RRM1 도메인이 중요하다는 것이 시사되었다.
실시예 3C
실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터 (루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR) 를, FLAG 표지한 야생형 RBMS2 또는 RRM 도메인 결손형 RBMS2 (RBMS2 ΔRRM1 (아미노산 서열 : 서열 번호 46), RBMS2 ΔRRM2 (아미노산 서열 : 서열 번호 47), 또는 RBMS2 ΔRRM1/2 (아미노산 서열 : 서열 번호 48)) 의 발현 벡터, 혹은 빈 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 3C 에 나타낸다
도 3C 에 나타내는 바와 같이, RRM1 도메인을 결손하는 RBMS2 변이체에서는, IL-6 3'UTR 의존적인 루시페라아제 활성의 상승을 볼 수 없었다.
실시예 3 의 결과
이상으로부터, RBMS2 는, IL-6 mRNA 의 3'UTR 에 존재하는 ARE 에, RRM1 도메인을 통하여 결합함으로써, IL-6 의 발현을 항진하는 것이 시사되었다.
실시예 4 : RBMS2 에 의한 ARE 를 포함하는 유전자의 발현 제어
실시예 4A
RBMS2 에 대한 siRNA (인간 RBMS2-1 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select, siRNA ID No. s11867, 서열 번호 8)), 혹은 인간 RBMS2-2 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select, siRNA ID No. s11868, 서열 번호 9), 또는 컨트롤 siRNA (네거티브 컨트롤 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select Negative Control No. 1 siRNA, 제품 번호 : 4390843)) 를, MDA-MB-231 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 IL-1β 를 배지에 첨가 (종농도 : 20 ng/㎖) 하고, 그 첨가로부터 3 시간 후에 세포를 회수하였다. 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 정량 PCR 에 의해 RBMS2 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 12, 리버스 서열 번호 13), IL-6 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 14, 리버스 서열 번호 15), PTGS2 (COX-2) mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 20, 리버스 서열 번호 21), IL-8 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 22, 리버스 서열 번호 23), IL-1β mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 18, 리버스 서열 번호 19), NFKBIA mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 24, 리버스 서열 번호 25), ZC3H12A mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 26, 리버스 서열 번호 27) 의 발현량을 측정하였다. 결과를 도 4A 에 나타낸다.
도 4A 에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-231 세포에 있어서, RBMS2 발현 억제에 의해, 3'UTR 에 ARE 영역을 갖는 IL-1β, IL-8, 및 COX-2 의 발현이 억제되었다. 한편, 3'UTR 에 ARE 영역을 갖지 않는 NFKBIA 나 ZC3H12A 의 발현에 차는 볼 수 없었다.
실시예 4B
RBMS2 에 대한 siRNA (마우스 RBMS2-1 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select, siRNA ID No. s80716, 서열 번호 10), 혹은 마우스 RBMS 2-2 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select, siRNA ID No. s80717, 서열 번호 11)), 또는 컨트롤 siRNA (네거티브 컨트롤 (Thermo Fisher Scientific (Ambion), Silencer Select Negative Control No. 1 siRNA, 제품 번호 : 4390843)) 를, MEF 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 LPS, Pam3CSK4 또는 IL-1β 를 배지에 첨가 (LPS 종농도 : 1 ug/㎖, Pam3CSK4 종농도 : 1 ug/㎖, 또는 IL-1β 종농도 : 20 ng/㎖) 하고, 그 첨가로부터 3 시간 후에 세포를 회수하였다. 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 정량 PCR 에 의해 RBMS2 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 28, 리버스 서열 번호 29), IL-6 mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 30, 리버스 서열 번호 31), IL-1β mRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 32, 리버스 서열 번호 33), TNF-αmRNA (PCR 프라이머 : 포워드 서열 번호 34, 리버스 서열 번호 35) 의 발현량을 측정하였다. 결과를 도 4B 에 나타낸다.
도 4B 에 나타내는 바와 같이, 마우스 태아성 선유아 세포 (MEF) 에 있어서, LPS, Pam3CSK4, 또는 IL-1β 의 자극에 의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 의 발현 상승이, RBMS2 발현 억제에 의해 억제되었다.
실시예 4C
프로모터의 하류에, 5' 측으로부터 루시페라아제의 ORF, 3'UTR (IL-8 의 야생형 3'UTR (염기 서열 : 서열 번호 42), IL-8 의 ARE 변이형 3'UTR (염기 서열 : 서열 번호 43), IL-1β 의 야생형 3'UTR (염기 서열 : 서열 번호 44), IL-1β 의 ARE 변이형 3'UTR (염기 서열 : 서열 번호 45)) 이 배치되어 이루어지는 리포터 벡터를 제조하였다. 제조한 리포터 벡터, 실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터 (루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR), 또는 실시예 2C 에서 제조한 IL-6 의 ARE 변이형 3'UTR 리포터 벡터 (ARE 뮤턴트) 를, RBMS2 발현 벡터 또는 빈 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 4C 에 나타낸다.
도 4C 에 나타내는 바와 같이, IL-6, IL-8, IL-1β 등의 3'UTR 에 포함되는 ARE 에 변이를 더하면, RBMS2 에 의한 루시페라아제 활성의 상승을 볼 수 없었다.
실시예 4 의 결과
이상으로부터, RBMS2 가, IL-6 mRNA 뿐만 아니라, ARE 를 갖는 mRNA 의 제어에 관련되는 것이 분명해졌다. 또, RBMS2 를 억제함으로써, IL-6 mRNA 등의 염증 촉진 인자의 발현량을 저하시킬 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 5 : RBMS2 결손 마우스에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현 저하
실시예 5A
TALEN 을 사용한 게놈 편집에 의해, RBMS2 결손 마우스를 제조하였다. 그 결과, 제 2 엑슨을 포함한 110 염기를 결손한 변이 마우스를 얻는 것에 성공하였다. 제조 스킴을 도 5A 에 나타낸다.
실시예 5B
RBMS2 호모 결손 마우스, RBMS2 헤테로 결손 마우스, 또는 야생형 마우스의 골수로부터 얻어진 세포를 M-CSF 존재하에서 7 일간 배양하고, 골수 유래 매크로파지 (BMDM) 를 얻었다. BMDM 의 배양 배지에, LPS (종농도 : 100 ng/㎖), Pam3CSK4 (종농도 : 300 ng/㎖), 또는 poly I : C (종농도 : 10 ug/㎖) 를 첨가하였다. 첨가 전, 혹은 첨가로부터 1시간, 3 시간, 5 시간, 또는 9 시간 경과 후에 세포를 회수하고, IL-6 의 발현량을 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 결과를 도 5B 에 나타낸다.
도 5B 에 나타내는 바와 같이, Pam3CSK4 자극으로 유도되는 IL-6 의 발현이, RBMS2 결손 마우스에 있어서 현저하게 감소하고 있었다.
실시예 5C
BMDM 배양 배지에 Pam3CSK4 를 첨가하고, 또한 IL-1β, COX-2 및 TNF-α 의 발현량을 측정하는 것 이외에는, 실시예 5B 와 동일하게 실시하였다.
도 5C 에 나타내는 바와 같이, IL-6 이외의 유전자에 대해서도, 실시예 5B 와 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 6 : RBMS2 결손 마우스의 패혈증 저항성
RBMS2 호모 결손 마우스 (n = 7) 또는 야생형 마우스 (n = 5) 의 복강 내에, LPS 를 투여 (15 ㎎/㎏) 하였다. 투여 후, 5 시간 후에 혈청을 채취하고, 추가로 각 마우스의 생존 시간을 계측하였다. 또, 혈청 중의 IL-6 농도를 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 생존 시간의 계측 결과를 도 6A 에 나타내고, IL-6 농도의 측정 결과를 도 6B 에 나타낸다.
도 6A 및 B 에 나타내는 바와 같이, 야생형 마우스는 LPS 의 복강내 투여에 의해 81 시간 이내에 60 ％ 마우스가 사망했지만, RBMS2 녹아웃 마우스는, 염증 촉진 인자인 IL-6 의 발현량이 억제되어 있고, 80 ％ 이상이 살아 남았다. 이상의 결과로부터, RBMS2 가 in vivo 에 있어서 염증 응답의 증악화에 관여하는 것이 분명해졌다.
실시예 7 : 관절 류머티즘 환자에 있어서의 RBMS2 발현량과 IL-6 발현량의 상관
관절 류머티즘 환자 (n = 12) 유래의 말초혈 단핵구부터 RNA 를 역전사한 후에, RBMS2 및 IL-6 의 발현량을 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다.
도 7 에 나타내는 바와 같이, 관절 류머티즘 환자 유래의 말초혈 단핵구에 있어서 RBMS2 의 발현과 IL-6 의 발현량은 정의 상관을 나타냈다.
비관절 류머티즘 환자의 경우의 IL-6 의 발현량은 관절 류머티즘 환자에 비해 낮은 점, 및 관절 류머티즘 환자에 있어서 IL-6 의 발현량은 질환의 진행도와 상관하는 점을 고려하면, 상기 결과로부터, RBMS2 의 발현량을 지표로 함으로써, 관절 류머티즘 (그 유무 및 진행도) 의 진단이 가능하다는 것이 시사되었다.
실시예 8 : RBMS2 의 발현을 제어하는 인자의 탐색
인간 T 세포주인 Jurkat 세포의 배양 배지에, IL-10 단백질 또는 TGFβ 단백질을 첨가하였다 (종농도 : IL-10 단백질 → 20 ng/㎖, TGFβ 단백질 → 10 ng/㎖). 첨가 전, 첨가로부터 8 시간 및 24 시간 경과 후의 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 정량 PCR 에 의해 RBMS2 mRNA 및 HPRT (컨트롤) mRNA 의 발현량을 측정하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다.
도 8 에 나타내는 바와 같이, IL-10 단백질의 첨가에 의해, RBMS2 mRNA 의 발현량이 저하되었다. 이러한 점에서, IL-10 단백질은 RBMS2 발현 억제 작용을 갖는 것을 알아내었다.
실시예 9 : ARE를 포함하는 유전자의 발현 제어 활성의 비교
실시예 4C 의 결과로부터, RBMS2 의 활성은 IL-6 3'UTR 에 존재하는 스템 루프 구조가 아니라 AU-리치 엘리먼트 (ARE) 에 의존하는 것이 분명해졌다. 한편, HuR 은, ARE 를 통한 염증성 사이토카인의 발현을 확실히 제어할 수 있는 것이 보고되어 있고, RBMS2 와 역할이 유사한 것으로 생각되었다. 그래서, RBMS2 와 HuR 의 활성을, 루시페라아제 어세이에 의해 비교하였다.
구체적으로는, 먼저, 프로모터의 하류에, 5' 측으로부터 루시페라아제의 ORF, IL-6 의 3'UTR 또는 PTGS2 (COX-2) 의 3'UTR 이 배치되어 이루어지는 리포터 벡터를 제조하였다. 그 리포터 벡터를, RBMS2 발현 벡터, HuR 발현 벡터, 또는 빈 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 9 에 나타낸다.
그 결과, IL-6 3'UTR 을 사용한 경우, RBMS2 에 의해 루시페라아제 활성이 항진하는 데에 대해, HuR 에서는 그러한 항진은 볼 수 없었다. 또, HuR 이 작용한다고 보고되어 있는 PTGS2 (COX-2) 의 3'UTR 을 사용한 경우, HuR 에 의해 루시페라아제 활성의 항진을 볼 수 있었지만, RBMS2 는 HuR 보다 더 강력하게 그 활성을 항진시키는 것이 분명해졌다. 이러한 점에서, RBMS2 는, HuR 과는 상이한 mRNA 를 표적으로 함과 함께, 공통의 표적 mRNA 에 대해서도 HuR 보다 강한 활성을 갖는 것이 강하게 시사되었다.
실시예 10 : RRM1 도메인을 통한 RBMS2 와 ARE의 결합
실시예 10A
지금까지 RRM 도메인 중의 β 시트가 RNA 결합 활성에 필수이고, 그리고 방향족 아미노산이 β 시트의 형성에 필요하다는 것이 보고되어 있다. 그래서, 단백질 2 차 구조의 예측 프로그램을 사용하여 RRM1 도메인 중의 β 시트를 추정하고, 그 β 시트 내의 아미노산의 변이체의 발현 벡터를 제조하였다. 이들 발현 벡터, 혹은 빈 벡터를, 실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터 (루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR) 와 함께, MDA-MB-231 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 경과 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과를 도 10A 에 나타낸다.
그 결과, RRM1 도메인 중의 2 개의 페닐알라닌 잔기 (F101 및 F104) 가, RBMS2 에 의한 리포터 활성 촉진에 필요하다는 것이 분명해졌다.
실시예 10B
F101/F104A 변이체를 발현하는 렌티바이러스를 MDA-MB-231 세포에 도입하고, 5 일간 후에 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 정량 PCR 에 의해 IL-6 mRNA 및 IL-8 mRNA 의 발현량을 측정하였다. 결과를 도 10B 에 나타낸다.
도 10B 에 나타내는 바와 같이, F101/F104A 변이체를 과잉 발현해도, 내재성 IL-6 및 IL-8 의 발현 레벨을 향상시킬 수 없었다.
실시예 10C
실시예 1A 에서 제조한 리포터 벡터 (루시페라아제 ORF 의 하류에 IL-6 의 야생형 3'UTR) 를, FLAG 표지한 F101/F104A 변이체의 발현 벡터와 함께, HEK293T 세포에 도입하였다. 도입으로부터 48 시간 후에 세포를 회수하고, 세포 용해액을 조제하였다. 그 세포 용해액을 항 FLAG 항체 또는 비특이적 IgG 에 의해 면역 침강하고, 면역 침강물에 포함되는 루시페라아제 mRNA 량을 정량 PCR 에 의해 측정하였다. 결과를 도 10C 에 나타낸다.
도 10C 에 나타내는 바와 같이, F101A 및 F104A 의 더블 변이에 의해, IL-6 의 3'UTR 과의 결합이 현저하게 감약되었다.
실시예 11
2,4-디니트로플루오로벤젠 용액 (용매는 아세톤과 올리브 오일의 혼합 용액 (아세톤 4 : 올리브 오일 1)) 을 RBMS2 호모 결손 마우스 (n = 15) 의 복부에 도포하였다. 1 주일 후, 2,4-디니트로플루오로벤젠 용액 (용매는 아세톤과 올리브 오일의 혼합 용액 (아세톤 4 : 올리브 오일 1)) 또는 그 혼합 용매만을, 마우스의 귀에 도포하였다. 6 시간 후에 귓바퀴의 두께를 측정하고, 얻어진 측정값으로부터, 시험 전의 귓바퀴의 두께의 값을 뺀 값을, 귓바퀴의 부기가 나타내는 지표로 하였다. 결과를 도 11 에 나타낸다.
도 11 에 나타내는 바와 같이, RBMS2 호모 결손쪽이 귓바퀴의 부기의 정도가 낮았다. 이러한 점에서, RBMS2 가 접촉성 피부염 등의 알레르기성 질환에 관여하고 있는 것이 시사되었다.
실시예 12
MDA-MB-231 세포에, 네거티브 컨트롤 또는 RBMS2 에 대한 siRNA 를 트랜스펙션하였다 (각각 n = 3). 48 시간 후에 RNA 를 조정하고, RNA 시퀀스용의 라이브러리를 프로토콜에 따라 (일루미나사) 조제하고, Next-seq 에 의해 RNA 시퀀스를 실시하였다. RBMS2 녹다운에 의해 발현량이 2 배 이상으로 증가 또는 2 분의 1 이하로 저하된 유전자를 도 12 에 나타낸다.
도 12 에 나타내는 바와 같이, IL-6, IL-8, MMP1, c-myc, IL-24 mRNA 등의, 3'UTR 에 ARE 를 갖는 mRNA 의 발현량이, RBMS2 의 녹다운에 의해 저하되는 것을 알 수 있었다.
또, 상기 실시예 1 ∼ 12 와 같이, RBMS2 가 IL-6 뿐만 아니라 다른 염증 촉진 인자 (IL-1β, IL-8, COX-2, TNF-α, MMP1, IL-24, c-Myc 등의 3'UTR 에 ARE 를 갖는 유전자) 의 발현도 제어하고 있으므로, 이들 염증 촉진 인자가 발증 및 진행에 관여하고 있는 질환 (면역 질환, 염증성 질환, 동통성 질환 등) 에 대해서도, RBMS2 의 발현량을 지표로 함으로써 질환의 유무 및 진행도의 진단이 가능하다는 것이 시사되었다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO MEDICAL AND DENTAL UNIVERSITY NIPPON ZOKI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Inhibitor of expression of inflammation promoting factor <130> P17-068WO <150> @JP 2016-094931 <151> @2016-05-10 <150> @JP 2016-162120 <151> @2016-08-22 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 446 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 catgggcacc tcagattgtt gttgttaatg ggcattcctt cttctggtca gaaacctgtc 60 cactgggcac agaacttatg ttgttctcta tggagaacta aaagtatgag cgttaggaca 120 ctattttaat tatttttaat ttattaatat ttaaatatgt gaagctgagt taatttatgt 180 aagtcatatt tatattttta agaagtacca cttgaaacat tttatgtatt agttttgaaa 240 taataatgga aagtggctat gcagtttgaa tatcctttgt ttcagagcca gatcatttct 300 tggaaagtgt aggcttacct caaataaatg gctaacttat acatattttt aaagaaatat 360 ttatattgta tttatataat gtataaatgg tttttatacc aataaatggc attttaaaaa 420 attcagcaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 446 <210> 2 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Pro Gly Ile 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aagagacatg gtggtcgcag cttctcatct atatgaaaaa gttttcgatg tattggaatt 1800 atttgggaat gcttttaaaa caatttgtaa ttatttcttt acaaaccaaa acagaacaga 1860 aaggtgtggt gctggaacat cgatgaagga gccctactta ctgagcttag ttatggactt 1920 ttttgatgca tgtgtgtatg tgttttaaaa agtatgcagg ctctaaaaat gttattttgt 1980 aaagctctca gctcatgcac cccatctcct cttcacccat attatgcctt ctttctcttg 2040 tccagattct tctttttctc ttttctaaac agctgagcct gcctactttg cccttttaca 2100 gcttttaatt ttatggattt ttaaaaatga aatttcatgt ggaatttggg gttggggggc 2160 aggctgggca aggaacaagg cagaacacta agtaggccat ggaagtggct gttctttccc 2220 ccaccctgcc acaccctggg agaaaaaact agactttggc ttcagaaagc acagatgtga 2280 cccaggctta ctaaagagac aactccacag ccctgggaac acacccttga gccaaacttg 2340 gttgaagact aggtcttccc tggcaagttc cggaagaatg gacttactga cttttatcaa 2400 ctcttctcac tgccaaggcc aacagcatct gaggtatagc tttttgggag tacctgcttt 2460 cttgcctcct ggaggatatt ttctgtcctg ggcttcatgg cccctctctt ccctgttaca 2520 cattgctgtg ctcagagcct ttgcagctgc gacctagttg aatccacata ggctccttcc 2580 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ctctttctcc ttataaaaca 900 ttgtgaattt cagttttctt tcccatcaag acatgctcaa gtgctgagtc acttttaaag 960 aaaaaaaaga agagtgctca tgcttcttag ggctagcctc aaggatgact taagcacact 1020 ttccccttcc tagttgtgat tctttcgatg ctaaacgacg tcacattgtg caatcttaat 1080 aaggtttcca atcagcccca cccactctgg ccccaccccc accctccaac aaagattttt 1140 atcaaatgtg ggattttccc atgagtctca aaattagaga gttgactcct aataaatatg 1200 agactgggga tgtctgtagc tcattctgct ctggagccca 1240 <210> 37 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 3'UTR 97-267 <400> 37 ctaaaagtat gagcgttagg acactatttt aattattttt aatttattaa tatttaaata 60 tgtgaagctg agttaattta tgtaagtcat atttatattt ttaagaagta ccacttgaaa 120 cattttatgt attagttttg aaataataat ggaaagtggc tatgcagttt g 171 <210> 38 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 3'UTR 122-193 <400> 38 tattttaatt atttttaatt tattaatatt taaatatgtg aagctgagtt aatttatgta 60 agtcatattt at 72 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 3'UTR delta ARE1 <400> 39 tattttaatt atttttaatt tattaatatt taaatatgt 39 <210> 40 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 3'UTR delta ARE2 <400> 40 agttaattta tgtaagtcat atttatattt ttaagaagta ccacttgaaa cattttatgt 60 attagttttg aaataataat ggaaagtggc tatgcagttt g 101 <210> 41 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 3'UTR ARE mutant <400> 41 tattttaatt atttttaagg gattaatagg gaaatatgtg aagctgagtt aagggatgta 60 agtcataggg a 71 <210> 42 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 3'UTR wild type <400> 42 ggatccacaa gtccttgttc cactgtgcct tggtttctcc tttatttcta agtggaaaaa 60 gtattagcca ccatcttacc tcacagtgat gttgtgagga catgtggaag cactttaagt 120 tttttcatca taacataaat tattttcaag tgtaacttat taacctattt attatttatg 180 tatttattta agcatcaaat atttgtgcaa gaatttggaa aaatagaaga tgaatcattg 240 attgaatagt tataaagatg ttatagtaaa tttattttat tttagatatt aaatgatgtt 300 ttattagata aatttcaatc agggttttta gattaaacaa acaaacaatt gggtacc 357 <210> 43 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 3'UTR mutant <400> 43 ggatccacaa gtccttgttc cactgtgcct tggtttctcc tttatttcta agtggaaaaa 60 gtattagcca ccatcttacc tcacagtgat gttgtgagga catgtggaag cactttaagt 120 tttttcatca taacataaat tattttcaag tgtaacttat taacctaggg attagggatg 180 tagggaggga agcatcaaat atttgtgcaa gaatttggaa aaatagaaga tgaatcattg 240 attgaatagt tataaagatg ttatagtaaa tttattttat tttagatatt aaatgatgtt 300 ttattagata aatttcaatc agggttttta gattaaacaa acaaacaatt gggtacc 357 <210> 44 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1B 3'UTR wild type <400> 44 agagagctgt acccagagag tcctgtgctg aatgtggact caatccctag ggctggcaga 60 aagggaacag aaaggttttt gagtacggct atagcctgga ctttcctgtt gtctacacca 120 atgcccaact gcctgcctta gggtagtgct aagaggatct cctgtccatc agccaggaca 180 gtcagctctc tcctttcagg gccaatcccc agcccttttg ttgagccagg cctctctcac 240 ctctcctact cacttaaagc ccgcctgaca gaaaccacgg ccacatttgg ttctaagaaa 300 ccctctgtca ttcgctccca cattctgatg agcaaccgct tccctattta tttatttatt 360 tgtttgtttg ttttattcat tggtctaatt tattcaaagg gggcaagaag tagcagtgtc 420 tgtaaaagag cctagttttt aatagctatg gaatcaattc aatttggact ggtgtgctct 480 ctttaaatca agtcctttaa ttaagactga aaatatataa gctcagatta tttaaatggg 540 aatatttata aatgagcaaa tatcatactg ttcaatggtt ctga 584 <210> 45 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1B 3'UTR mutant <400> 45 agagagctgt acccagagag tcctgtgctg aatgtggact caatccctag ggctggcaga 60 aagggaacag aaaggttttt gagtacggct atagcctgga ctttcctgtt gtctacacca 120 atgcccaact gcctgcctta gggtagtgct aagaggatct cctgtccatc agccaggaca 180 gtcagctctc tcctttcagg gccaatcccc agcccttttg ttgagccagg cctctctcac 240 ctctcctact cacttaaagc ccgcctgaca gaaaccacgg ccacatttgg ttctaagaaa 300 ccctctgtca ttcgctccca cattctgatg agcaaccgct tccctattta tttatttatt 360 tgtttgtttg ttttattcat tggtctaatt tattcaaagg gggcaagaag tagcagtgtc 420 tgtaaaagag cctagttttt aatagctatg gaatcaattc aatttggact ggtgtgctct 480 ctttaaatca agtcctttaa ttaagactga aaatatataa gctcagatta tttaaatggg 540 aatatttata 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Pro Val Ser Ser Tyr Gln Arg Val Thr Gln 180 185 190 Thr Ser Pro Leu Gln Val Pro Asn Pro Ser Trp Met His His His Ser 195 200 205 Tyr Leu Met Gln Pro Ser Gly Ser Val Leu Thr Pro Gly Met Asp His 210 215 220 Pro Ile Ser Leu Gln Pro Ala Ser Met Met Gly Pro Leu Thr Gln Gln 225 230 235 240 Leu Gly His Leu Ser Leu Ser Ser Thr Gly Thr Tyr Met Pro Thr Ala 245 250 255 Ala Ala Met Gln Gly Ala Tyr Ile Ser Gln Tyr Thr Pro Val Pro Ser 260 265 270 Ser Ser Val Ser Val Glu Glu Ser Ser Gly Gln Gln Asn Gln Val Ala 275 280 285 Val Asp Ala Pro Ser Glu His Gly Val Tyr Ser Phe Gln Phe Asn Lys 290 295 300 <210> 47 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3xFLAG- RBMS2 delta RRM2 domain <400> 47 Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys Leu Ala Pro Pro Ser Pro Ser Asn 20 25 30 Ser Thr Pro Asn Ser Ser Ser Gly Ser Asn Gly Asn Asp Gln Leu Ser 35 40 45 Lys Thr Asn Leu Tyr Ile Arg Gly Leu Gln Pro Gly Thr Thr Asp Gln 50 55 60 Asp Leu Val Lys Leu Cys Gln Pro Tyr Gly Lys Ile Val Ser Thr Lys 65 70 75 80 Ala Ile Leu Asp Lys Thr Thr Asn Lys Cys Lys Gly Tyr Gly Phe Val 85 90 95 Asp Phe Asp Ser Pro Ser Ala Ala Gln Lys Ala Val Thr Ala Leu Lys 100 105 110 Ala Ser Gly Val Gln Ala Gln Met Ala Lys Gln Gln Glu Gln Asp Pro 115 120 125 Cys Lys Phe Ala Asp Gly Gly Pro Lys Lys Arg Gln Asn Gln Gly Lys 130 135 140 Phe Val Gln Asn Gly Arg Ala Trp Pro Arg Asn Ala Asp Met Gly Val 145 150 155 160 Met Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Thr Thr Ala Leu Gln Asn Gly Phe Tyr 165 170 175 Pro Ala Pro Tyr Asn Ile Thr Pro Asn Arg Met Leu Ala Gln Ser Ala 180 185 190 Leu Ser Pro Tyr Leu Ser Ser Pro Val Ser Ser Tyr Gln Arg Val Thr 195 200 205 Gln Thr Ser Pro Leu Gln Val Pro Asn Pro Ser Trp Met His His His 210 215 220 Ser Tyr Leu Met Gln Pro Ser Gly Ser Val Leu Thr Pro Gly Met Asp 225 230 235 240 His Pro Ile Ser Leu Gln Pro Ala Ser Met Met Gly Pro Leu Thr Gln 245 250 255 Gln Leu Gly His Leu Ser Leu Ser Ser Thr Gly Thr Tyr Met Pro Thr 260 265 270 Ala Ala Ala Met Gln Gly Ala Tyr Ile Ser Gln Tyr Thr Pro Val Pro 275 280 285 Ser Ser Ser Val Ser Val Glu Glu Ser Ser Gly Gln Gln Asn Gln Val 290 295 300 Ala Val Asp Ala Pro Ser Glu His Gly Val Tyr Ser Phe Gln Phe Asn 305 310 315 320 Lys <210> 48 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3xFLAG- RBMS2 delta RRM1/2 domain <400> 48 Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys Leu Leu Glu Asp Gly Gly Pro Lys 20 25 30 Lys Arg Gln Asn Gln Gly Lys Phe Val Gln Asn Gly Arg Ala Trp Pro 35 40 45 Arg Asn Ala Asp Met Gly Val Met Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Thr Thr 50 55 60 Ala Leu Gln Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Tyr Asn Ile Thr Pro Asn 65 70 75 80 Arg Met Leu Ala Gln Ser Ala Leu Ser Pro Tyr Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Ser Ser Tyr Gln Arg Val Thr Gln Thr Ser Pro Leu Gln Val Pro Asn 100 105 110 Pro Ser Trp Met His His His Ser Tyr Leu Met Gln Pro Ser Gly Ser 115 120 125 Val Leu Thr Pro Gly Met Asp His Pro Ile Ser Leu Gln Pro Ala Ser 130 135 140 Met Met Gly Pro Leu Thr Gln Gln Leu Gly His Leu Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160 Thr Gly Thr Tyr Met Pro Thr Ala Ala Ala Met Gln Gly Ala Tyr Ile 165 170 175 Ser Gln Tyr Thr Pro Val Pro Ser Ser Ser Val Ser Val Glu Glu Ser 180 185 190 Ser Gly Gln Gln Asn Gln Val Ala Val Asp Ala Pro Ser Glu His Gly 195 200 205 Val Tyr Ser Phe Gln Phe Asn Lys 210 215

Claims (21)

  1. RBMS2 유전자 프로모터 및 그 프로모터에 의해 발현이 제어되도록 배치된 리포터 유전자를 포함하는 발현 카세트, 그 발현 카세트를 포함하는 벡터, 그리고 그 벡터를 포함하는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는, IL-6, COX-2, IL-8, IL-1β, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 염증 촉진 인자의 발현 억제제의 유효 성분의 스크리닝용 시약.
  2. 피검물질의 존재하에 있어서의 하기 (i) ∼ (iii) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 지표로 하는, IL-6, COX-2, IL-8, IL-1β, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 염증 촉진 인자의 발현 억제제의 유효 성분의 스크리닝 방법 :
    (i) RBMS2 유전자 프로모터에 의해 발현 제어되는 리포터 유전자 발현량,
    (ii) RBMS2 와 AU-리치 엘리먼트 (AU-rich element) 를 포함하는 RNA 의 결합량, 및
    (iii) RBMS2 과잉 발현 세포에 있어서의 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량.
  3. 제 2 항에 있어서,
    피검물질 존재하에 있어서의 상기 지표의 값이, 피검물질 비존재하에 있어서의 상기 지표의 값보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 염증 촉진 인자의 발현 억제제의 유효 성분으로서 선택하는 것을 포함하는, 스크리닝 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 AU-리치 엘리먼트가, IL-6 mRNA, COX-2 mRNA, IL-8 mRNA, IL-1β mRNA, TNF-α mRNA, MMP1 mRNA, IL-24 mRNA, 및 c-Myc mRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 mRNA 유래의 AU-리치 엘리먼트인, 스크리닝 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 공정 (a1) ∼ (c1) 을 포함하는, 스크리닝 방법 :
    (a1) RBMS2 유전자 프로모터 및 그 프로모터에 의해 발현이 제어되도록 배치된 리포터 유전자를 포함하는 발현 카세트를 함유하는 발현계와, 피검물질을 접촉시키는 공정,
    (b1) 피검물질을 접촉시킨 발현계에 있어서의 상기 리포터 유전자의 발현량을 피검발현량으로서 측정하고, 그 피검발현량과, 피검물질을 접촉시키지 않는 발현계에 있어서의 상기 리포터 유전자의 발현량을 대조 발현량으로서 비교하는 공정,
    그리고
    (c1) 피검발현량이 대조 발현량보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 상기 염증 촉진 인자의 발현 억제제의 유효 성분으로서 선택하는 공정.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 발현계가 세포인, 스크리닝 방법.
  7. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 공정 (a2) ∼ (c2) 를 포함하는, 스크리닝 방법 :
    (a2) AU-리치 엘리먼트를 포함하는 RNA 와 RBMS2 를, 피검물질의 존재하에서 접촉시키는 공정,
    (b2) 피검물질의 존재하에서 접촉시켰을 경우의 상기 RNA 와 상기 RBMS2 의 결합량을 피검결합량으로서 측정하고, 그 피검결합량과, 피검물질의 비존재하에서 접촉시켰을 경우의 상기 RNA 와 상기 RBMS2 의 결합량을 대조 결합량으로서 비교하는 공정, 그리고
    (c2) 피검결합량이 대조 결합량보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 상기 염증 촉진 인자의 발현 억제제의 유효 성분으로서 선택하는 공정.
  8. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 공정 (a3) ∼ (c3) 을 포함하는, 스크리닝 방법 :
    (a3) 3'-UTR 에 있어서 AU-리치 엘리먼트를 포함하는 mRNA 를 함유하고, 또한 RBMS2 가 과잉 발현하고 있는 세포와, 피검물질을 접촉시키는 공정,
    (b3) 피검물질과 접촉시킨 세포에 있어서의 상기 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 피검량으로서 측정하고, 피검물질과 접촉시키지 않는 세포에 있어서의 상기 mRNA 량 또는 상기 mRNA 유래의 단백질량을 대조량으로 하여, 그 피검량과 그 대조량을 비교하는 공정, 그리고
    (c3) 피검량이 대조량보다 낮은 경우에, 그 피검물질을 상기 염증 촉진 인자의 발현 억제제의 유효 성분으로서 선택하는 공정.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 mRNA 가 리포터 단백질의 ORF 를 포함하는, 스크리닝 방법.
  10. RBMS2 발현 억제제 및 RBMS2 기능 억제제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는, IL-6, COX-2, IL-8, IL-1β, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 염증 촉진 인자의 발현 억제제로서,
    상기 RBMS2 발현 억제제가, RBMS2 특이적 siRNA, RBMS2 특이적 miRNA, RBMS2 특이적 안티센스 핵산, 및 이들의 발현 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 RBMS2 발현 억제제를 함유하는, 염증 촉진 인자의 발현 억제제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    면역 질환, 염증성 질환 및 동통으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 예방 또는 치료제로서 사용되는, 염증 촉진 인자의 발현 억제제.
  12. RBMS2 유전자 발현 산물 검출제를 함유하는, 면역 질환, 염증성 질환 및 동통으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, IL-6, COX-2, IL-8, IL-1β, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 염증 촉진 인자에 의해 발증 또는 증악되는 질환의 진단약.
  13. (a1) 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량을 측정하는 공정, 및
    (b1) 상기 공정 (a1) 에서 측정된 피검발현량을, 면역 질환, 염증성 질환 및 동통 중 어느 것으로도 이환하고 있지 않은 대조 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 대조 발현량과 대비하는 공정
    을 갖고,
    (c1) 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을, 피검체가 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통이라는 판단 지표로 하는, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통의 검출 방법으로서,
    상기 면역 질환, 염증성 질환 및 동통이 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종에 의해 발증 또는 증악되는 것인, 방법.
  14. (a2) 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통으로 이환하고 있는 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 피검발현량을 측정하는 공정, 및
    (b2) 상기 공정 (a2) 에서 측정된 피검발현량을, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통으로 이환하고 있는 대조 피검체로부터 채취된 시료에 있어서의 RBMS2 유전자 발현 산물의 대조 발현량과 대비하는 공정
    을 갖고,
    (c3) 대조 발현량에 비해 피검발현량이 높은 것을, 피검체쪽이, 대조 피검체보다 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통의 진행도가 높다는 판단 지표로 하는, 면역 질환, 염증성 질환 또는 동통의 진행도의 판정 방법으로서,
    상기 면역 질환, 염증성 질환 및 동통이 IL-6, COX-2, IL-1β, IL-8, TNF-α, MMP1, IL-24, 및 c-Myc 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종에 의해 발증 또는 증악되는 것인, 방법.
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