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KR102582916B1 - 2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR102582916B1
KR102582916B1 KR1020220054797A KR20220054797A KR102582916B1 KR 102582916 B1 KR102582916 B1 KR 102582916B1 KR 1020220054797 A KR1020220054797 A KR 1020220054797A KR 20220054797 A KR20220054797 A KR 20220054797A KR 102582916 B1 KR102582916 B1 KR 102582916B1
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cancer
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장봉근
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주식회사 제이비케이랩
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Abstract

본 발명은 2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 유방암세포주에서 유방종양괴 형성을 억제하고, 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종 등에서 널리 사용되는 국소이성질화효소 저해제인 sorafenib, etoposide 항암제와 비교하였을 때 동등 또는 그 이상의 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 1 화합물은 유방암세포주 및 간암세포주에서 방사선 또는 다른 항암제와 병용 투여시 항암효과가 더욱 증가(synergistic effect)하므로, 암 치료에 우수한 효과를 나타내는 항암제 또는 식품으로 개발이 가능하다.

Description

2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing, improving or treating cancer comprising 2,6-dichloro-4-(4-(4-hydroxycyclohexylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)phenol as an active ingredient}
본 발명은 2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
문명이 발달되어 갈수록 암의 발생률이 증가되고 있음에도 불구하고 암 환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 강한 세포독성을 나타내는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있다. 그러나, 이러한 치료법들은 대개 조기암 환자나 특정 암에만 처치가 국한되어 있을 뿐 아니라 다양한 부작용을 초래하므로 안전 프로파일을 가지면서 효과적이고 부작용이 적은 항암제 개발이 요구되고 있다.
이 중에서도, 유방암 시장은 높은 항암효과와 안정성이 결여된 미충족 의학적 수요를 가지고 있는 분야로 알려져 있다.
유방암 치료와 관련하여, 호르몬 요법, 화학 요법, 표적 치료 등 다양한 질환의 특성을 가진 환자를 대상으로 하는 다양한 기전의 치료제가 출시되고 있지만, 항암효과와 안전성 등이 우수한 치료제에 대한 임상적 수요가 꾸준히 요구되고 있다. 이 중에서도, 전체 유방암의 16%를 차지하는 삼중음성유방암(Triple-Negative Breast cancel; TNBC)은 치료 후 예후가 좋지 않아 치료에 어려움이 있고, 아직 TNBC를 대상으로 한 치료제가 충분치 않다(비특허문헌 1, Rev Peru Med Exp Salud Publica. Oct-Dec 2013;30(4):649-56).
현재 유방암 치료제는 종양의 성장에 관여하는 인간 상피세포성장인자 수용체 2(이하 'HER2' 라 함) 유전인자를 억제하는 치료제와 항호르몬제를 널리 사용하고 있으나, TNBC의 경우에는 HER2 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체가 모두 음성이기 때문에 기존 항암제에 반응하지 않으므로, 이에 안전하고 효율적으로 치료할 수 있는 새로운 타겟형 치료제가 시급하다.
이에 본 발명자들은 다양한 암세포주를 이용하여 연구한 결과 안전하고 효과적인 항암 약물로 이용할 수 있는 본 발명의 약학적 조성물을 완성하였다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료를 위한 방사선 및 항암제의 병용을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물 을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 약제학적 유효량의 항암제를 포함하는 제1성분; 및 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 제2성분;을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 암의 예방 또는 치료를 위한 방사선 및 항암제의 병용을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한, 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시예 1 화합물은 유방암세포주에서 유방종양괴 형성을 억제하고, 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종 등에서 널리 사용되는 국소이성질화효소 저해제인 sorafenib, etoposide 항암제와 비교하였을 때 동등 또는 그 이상의 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 1 화합물은 유방암세포주 및 간암세포주에서 방사선 또는 다른 항암제와 병용 투여시 항암효과가 더욱 증가(synergistic effect)하므로, 암 치료에 우수한 효과를 나타내는 항암제 또는 식품으로 개발이 가능함을 알 수 있다.
도 1은 주요 단백질 발현 저해능을 평가한 그림이다.
도 2는 인간 유래 유방암세포주인 BT20를 배양하여 실시예 1 화합물을 48시간 처리한 결과 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
도 3은 TNBC 세포주 MDA-MB-231를 배양하여 실시예 1 화합물을 48시간 처리한 결과 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
도 4는 MDA-MB-231, MDA-MB-453, BT-20 세포주에 대해 실시예 1 화합물을 24시간 처리한 결과 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 1 화합물을 처리한 경우 종양의 성장을 뚜렷하게 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있는 그래프이다.
도 6은 세포자멸과정을 겪어 apoptotic body 형태를 나타내는 그림이다.
도 7은 간암 세포주인 Hep3B 세포에서 실시예 1 화합물을 처리한 결과 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
도 8은 간암 세포주인 HepG2 세포에서 실시예 1 화합물을 처리한 결과 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
도 9는 간암 세포주인 Hep3B 세포에서 실시예 1 화합물을 처리한 결과를 나타내는 그림이다.
도 10은 간암 세포주인 HepG2 세포에서 실시예 1 화합물을 처리한 결과를 나타내는 그림이다.
도 11은 다양한 암세포주에 대한 본 발명 실시예 1 화합물의 암세포주에 대한 독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 치료방법에 따른 종양의 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 치료방법에 따른 폐 사진 및 종양 결절 수를 나타낸 그래프이다.
도 14는 종양세포에서 유세포분석을 통해 치료방법에 따른 면역세포의 변화를 관찰한 결과이다.
도 15는 도 14의 종양세포에서 유세포분석을 통해 치료방법에 따른 면역세포의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 종양세포에서 면역세포화학 분석을 통해 단백질 발현 및 면역세포 변화를 관찰한 결과이다.
도 17은 도 16의 종양세포에서 면역세포화학 분석을 통해 단백질 발현 및 면역세포 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 종양세포(SKOV-3 및 OVCAR-3)에서 실시예 1 화합물 및 시스플라틴(Cisplatin)의 단독 및 병용 투여시 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
도 19는 종양세포(SK Hep1 및 Huh-7)에서 실시예 1 화합물 및 소라페닙(Sorafenib)의 단독 및 병용 투여시 세포 생존능을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은,
하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
.
본 발명의 또 다른 일 측면에서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (trans)-2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서,
상기 약학적 조성물은 방사선 또는 항암제와 병용 치료에 사용될 수 있다.
상기 항암제는 시스플라틴, 소라페닙, OKN-007, 제피티닙, 독소루비신, 빈블라스틴, 탁솔, 에디포사이드, 5-FU 및 이포스파마이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서,
상기 약학적 조성물은 면역을 증진시킬 수 있다. 하기 실험예 9에서 종양미세환경내에서 의 면역세포 변화를 평가하였다. 그 결과, 실시예 1 화합물 단독 또는 방사선과의 병용 투여시 CD8 양성 T세포비율이 증가, M1 TAM 증가 및 M2 TAM 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 용어 『약제학적으로 허용가능한 염』이란, 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 칼슘, 포타슘, 소듐 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산, 과염소산 및 황산 등으로 제조된 무기산염; 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등으로 제조된 유기산염; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염; 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염; 및 트리메틸아민, 트라이에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염 등이 있으나, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 『이성질체』이란, 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조이성질체와, 입체이성질체(stereoisomer)가 있으며, 입체이성질체에는 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성질체(광학 이성질체, enantiomer), 기하이성질체(트랜스, 시스) 등이 모두 포함된다. 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 모든 입체이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어 『수화물』이란, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 물이 비공유적 분자간 힘으로 결합되어 있는 것으로 화학양론적 또는 비화학양론적의 양의 물을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 수화물은 활성성분 1 몰을 기준으로 물을 약 0.25몰 내지 약 10몰 비로 포함 할 수 있으며, 보다 구체적으로는 약 0.5몰, 약 1몰, 약 1.5몰, 약 2몰, 약 2.5몰, 약 3몰, 약 5몰 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 『용매화물』이란, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 물이 아닌 용매가 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 것으로, 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 것을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다. 구체적으로는, 상기 용매화물은 활성성분 1 몰을 기준으로 물을 약 0.25몰 내지 약 10몰 비로 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 약 0.5몰, 약 1목, 약 1.5몰, 약 2몰, 약 3몰, 약 5몰 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 『약』이란, 선행하는 값의 ±10%인 수치를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 용어 『유효성분으로 포함하는』이란, 암의 예방, 개선, 또는 치료의 효과를 가져오는 용량 범위로 함유하는 것을 의미하고, 중증도 및 제형에 따라 용량범위는 변할 수 있으며, 적용횟수도 적용 대상의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물 내에서 화학식 1로 표시되는 화합물은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물 내에 포함되는 화학식 1로 표시되는 화합물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효량의 화학식 1로 표시되는 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 물질을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구용 제제, 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화될 수 있다. 상기 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 및 동결건조제제로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 외용제는 크림, 젤, 연고, 유화액, 현탁액, 분무제 및 경피 전달성 패치제로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 『개선』이란, 본 발명의 약학적 조성물, 식품 조성물을 암 투병 개체에게 투여, 섭취 또는 적용하여 암의 증상의 경감, 예방 또는 치료를 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 용어 『예방』이란, 본 발명의 약학적 조성물, 식품 조성물을 암 투병중이지 않은 개체에게 투여, 섭취 또는 적용하여 암의 증세를 억제 또는 차단함으로써, 암의 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 『치료』란, 본 발명의 약학적 조성물을 암 투병중인 개체에게 투여한 결과로서 암의 증세의 완치는 물론 암의 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 『개체』란, 암이 이미 발병되었거나 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에 있어서, 용어 『약학적으로 유효한 양』이란, 의학적 치료 또는 개선에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 『투여』란, 임의의 적절한 방법으로 개체 또는 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 구체적으로, 본 발명에서, 용어 『비경구투여』란, 입으로 투여하는 것을 제외한 피하, 근육내, 정맥, 튜브를 이용한 복강내로 투여하는 방법을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 용어 『경구 투여』란, 병리학적 증상을 호전하기 위한 약제를 입으로 주입하는 방법을 의미한다.
비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액상제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 약제학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 암은 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종, 위암, 위장관암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 직장암, 결장암, 유방암, 자궁육종, 나팔관 암종, 내궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부감상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 다발성 골수종, 만성 또는 급성 백혈병 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 간암, 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종 및 유방암일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은,
하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 숙취해소제(음료, 저점도겔타입, 환, 정제, 캡슐 등), 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 상기 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품 또는 건강보조식품을 제공한다. 본 발명에 있어서, 용어 『건강기능식품 또는 건강보조식품』 이란, 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 용어 『기능성』 이라 함은, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미하며, 본 발명에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품 또는 건강보조식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품 또는 건강보조식품에 있어서의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품 또는 건강보조식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품 또는 건강보조식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 '식품 첨가물'로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 식품 조성물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
과립형태의 건강기능식품은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 μm), 14호 (1410 μm) 및 45호 (350 μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0%이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0%이하일 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 다른 일 측면은,
약제학적으로 치료가능한 양의 항암제를 포함하는 제1성분; 및
하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제2성분;을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
[화학식 1]
.
본 발명의 또 다른 일 측면에서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (trans)-2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서,
상기 암은 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종, 위암, 위장관암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 직장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 내궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 다발성 골수종, 만성 또는 급성 백혈병 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서,
상기 항암제는 시스플라틴, 소라페닙, OKN-007, 제피티닙, 독소루비신, 빈블라스틴, 탁솔, 에디포사이드, 5-FU 및 이포스파마이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나이상 일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은,
본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법(method)을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 방사선 또는 항암제를 필요한 대상에게 병용 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법(method)을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
암의 예방 또는 치료에 사용하기위한 약제(medicament)를 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도(use)를 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한 병용투여되는 것을 특징으로하는 본 명에서에 기재된 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 방사선 또는 항암제의 용도(use)를 제공한다.
상기 방법 또는 용도에 있어서, 전술한 약학적 조성물에 대한 상세한 설명이 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예, 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> (trans)-2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀의 제조
[반응식 1]
Figure 112022047436495-pat00004
단계 1
4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (2 g, 13.02 mmol)에 DMF (30 mL)를 넣고, 0℃에서 NBS (2.52 g, 14.24 mmol)를 넣었다. 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반 하였다. 반응이 완료된 후에, 용매를 고압 하에 제거해주고, 결과물을 물로 섞어 여과한 뒤, 헥산으로 씻어주고, 건조시켜 5-브로모-4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (2.66 g, 88%) 를 제조하였다.
1H NMR (DMSO, 300MHz): δ 7.81 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 5.02 (br s, 1H).
단계 2
DMF (10 mL) 에 녹여 있는 5-브로모-4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (1.2 g, 5.16 mmol) 에 NaH (0.41 g, 10.3 mmol)을 넣고, 0℃에서 30분 동안 교반 하였다. p-토실 클로라이드 (1.36 g, 7.16 mmol)를 넣어 준 후에, 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반 하였다. 반응이 완료된 후에, 물을 넣고, 10분 동안 교반한 뒤, 결과물을 여과하여 수집하고, 건조하여 5-브로모-4-클로로-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (1.79 g, 90%)을 제조하였다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 8.76 (s, 1H), 8.09 (d, 2H, J = 8.1Hz), 7.54 (s, 1H), 7.34(d, 2H, J = 8.1Hz), 2.41 (s, 3H).
단계 3
5-브로모-4-클로로-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (500 mg, 1.29 mmol)에 n-BuOH (10 mL)를 넣고, trans-4-아미노사이클로헥산-1-올 (223 mg, 1.94 mmol)을 넣고, DIPEA (2.58 mmol)을 넣었다. 혼합물을 110℃로 3시간 동안 가열하였다. 용매를 고압에서 제거하였고, 잔여물을 크로마토그래피를 통해 정제하여 (trans)-4-((5-브로모-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)사이클로헥산-1-올 (540 mg, 90 %)을 제조하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 8.37 (s, 1H), 8.06 (d, 2H, J = 8.3Hz), 7.45 (s, 1H), 7.31 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 5.87 (d, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.70 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.16 (m, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.54 (m, 2H), 1.31 (m, 2H).
단계 4
(trans)-4-((5-브로모-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)사이클로헥산-1-올 (200 mg, 0.43 mmol), 2,6-디클로로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로렌-2-일)페놀 (0.86 mmol), Na2CO3 (0.86 mmol)과 다이옥산 (4 mL), 물 (1mL)를 마이크로웨이브 바이얼에 넣는다. 용매를 15분 동안 탈기체화를 시키고 Pd(PPh3)2Cl2 (10 mol %)를 넣고 80℃에서 30분간 마이크로웨이브를 조사하였다. 용액을 셀라이트층으로 여과하였고 여과액을 브라인 (10 mL x 5)로 씻어주고 유기층을 농축하여 크로마토그래피(10% 메탄올:디클로로메탄)를 수행하여 (trans)-2,6-디클로로-4-(4-((-4-하이드록시사이클로헥실)아미노)-7-토실-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘-5-일)페놀 (40%)을 제조하였다.
1H NMR ( CDCl3, 300 MHz ): δ 8.46 (s, 1H), 8.11 (d, 2H, J = 8.36 Hz), 7.41 (s, 1H), 7.36 (s, 2H), 7.31 (d, 2H, J = 8.13 Hz), 6.03 (m, 1H), 4.71 (d, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.05 (m, 2H), 1.89 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 1.10 (m, 2H).
단계 5
상기의 중간체인 (trans)-2,6-디클로로-4-(4-((-4-하이드록시사이클로헥실)아미노)-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀에 1M TBAF (in THF)를 넣고 상온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응물을 감압하여 크로마토그래피(15% 메탄올:디클로로메탄 + 0.1% 암모니아수)를 수행하여 표제 화합물 (40%)을 제조하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 11.82 (br s, 1H), 10.16 (br s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.42 (s, 2H), 7.29 (s, 1H), 5.27 (d, 1H), 4.54 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.43 (m, 1H), 1.95 (m, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 1.20 (m, 4H).
<실험예 1> 주요 단백질 발현 저해 평가
Western blot을 통하여 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물의 암세포 성장에 주요한 단백질 발현 억제 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, TNBC 세포주인 MDA-MB-231 세포를 5% CO2와 37℃조건에서 배양하였으며 세포배양에 사용된 배지는 RPMI-1640이고 10% FBS를 첨가하여 사용하였다. MDA-MB-231 세포를 5x106/head/100㎕씩 BALB/c-nude 마우스를 각 대조군과 투여군으로 5마리씩 오른쪽 경배부에 피하주사하여 종양을 유도 시킨 뒤 종양의 크기가 200mm3가 되었을 때 실험을 진행하였다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물을 5, 10, 20 mg/kg(T4, T5, T6)농도별로 미정맥주사로 1회 투여한 뒤 CO2를 이용하여 안락사 시킨 뒤 대조군과 투여군에서의 발생된 종양조직을 취하여 Western blot을 진행하였다. 종양조직에서 단백질을 분리하여 각각 BRD4, c-myc, PD-L1, Actin 항체를 사용하여 Western blot결과를 확인하였다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물을 처리하지 않은 NC(Negative control)와 처리한 T4, 5, 6 그룹에서의 BRD4, c-myc, PD-L1의 발현을 비교했을 때, T4, 5, 6 그룹의 암 생성에 주요한 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 유방암 세포주 억제 평가
cell viability assay를 통하여 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물의 유방암세포주에서 성장억제 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, cell viability assay는 다음과 같이 진행하였다. 인간 유래 유방암세포주인 BT20과 TNBC 세포주 MDA-MB-231를 96well plate에 각각 5×103개씩 부유시켜준 뒤 24시간 배양하였다. 그 후에 I-bet 762과 실시예 1 화합물을 농도별로 처리해준 뒤 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 WST-8 용액을 100㎕씩 넣어 준 후에 살아있는 세포의 환원 요소에 의하여 생성된 formazan을 측정하기 위해 450nm의 광학필터를 이용하여 microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
도 2 내지 도 3을 참조하면, 인간 유래 유방암세포주인 BT20과 TNBC 세포주 MDA-MB-231를 배양해 유방종양괴의 형성을 분석한 결과, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물에 의해 일반 유방암 세포주뿐만 아니라, TNBC 세포주에서도 농도 의존적으로 세포생존율이 억제되는 것을 확인하였다.
도 4에는 MDA-MB-231, MDA-MB-453, BT-20 세포주에 대해 실시예 1 화합물을 24시간 처리한 결과 세포 생존능을 나타내며, 마찬가지로, 일반 유방암 세포주뿐만 아니라, TNBC 세포주에서도 농도 의존적으로 세포생존율이 억제되는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 유방암 성장 억제 평가
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물의 인간 유래 TNBC 세포주인 유방암 세포(MBA-MB-231)의 제노그래프트 종양 샘플에 대하여 종양 억제를 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물의 생체 외에서의 유방암 세포 생존 억제 효과를 확인하기 위하여 제노그래프트 Balb/c nude 마우스 종 5주령의 암컷 80마리를 이용하여 투여개시 시 약 8주령의 마우스를 이용하여 실험을 하였다.
실험용 제노그래프트 Balb/c nude 마우스로, 면역세포인 T세포가 결여되어 있어 인간 암 세포를 이식하기에 적당한 동물 모델을 선택하였고, 투여 시 전체 평균 체중의 ±20% 내외 동물을 선택하였으며, 일주일에 2회 종양발생이 표면적으로 보이는지 확인하여 버니아캘리퍼스로 종양의 크기를 3주간 측정하였다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물은 종양의 성장을 뚜렷하게 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
<실험예 4> Apoptotic body 빈도 비교
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물의 암세포주를 주입한 BALB/c-nude 마우스에서 종양의 세포사멸 수(apoptotic body)의 측정과 종양 조직의 H&E staining을 통해 종양 괴사 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실험예 1에서 진행한 T4, T5, T6 군의 종양조직에서 apoptotic body의 수를 측정하기 위해 종양조직이 자라고 있는 부위 5곳을 임의로 선정하여 x400배율에서 apoptotic body 수를 측정하였다. 측정한 그 합을 구하여 개체값으로 나타낸 후에 GraphPad Prism 5를 이용하여 통계학적 비교분석을 실시하였다.
Apoptotic body는 세포가 수축되어 작아져 있거나(shrinkage) 분열되어 있으며(blebs) 주변부에 빈공간(hollow)이 에워싸는 모양으로 관찰된다. 또한 세포질의 호산성이 증대되어 있고 핵은 작게 농축되거나 파편화되어 주변의 세포에 의해 탐식되어 관찰된다.
표 1의 측정한 Apoptotic body의 수를 볼 때, NC(Negative control)에 비해 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물을 처리했을 때인 T4, T5, T6에서 그 수가 실시예 1 화합물 농도 의존적으로 더 많은 것으로 보아 실시예 1 화합물이 암세포의 세포사멸을 증가시켜 종양억제 효과가 있는 것을 확인하였다.
도 6에서의 H&E staining은 종양부위의 중앙부위를 삭정하여 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 파라핀블럭을 제작하여 마이크로톰을 이용하여 3 μm 두께로 박절하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색을 실시하였고 세포괴사 부위를 관찰하였다.
염색한 조직의 NC군과 실시예 1 화합물을 처리한 T4, T5, T6를 비교했을 때 조직괴사가 일어나는 부위가 더 많은 것으로 보아 실시예 1 화합물이 종양조직의 괴사를 일으켜 종양 억제 효과가 있는 것을 확인하였다.
NC PC T4 T5 T6
number of examined 10 10 10 10 10
number of apoptotic body 7.2±3.8 12.1±5.4 9.6±4.7 9.2±4.6 13.6±7.4
<실험예 5> 간암 세포주 억제 평가
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 실시예 1 화합물이 TNBC 외의 암세포주에서도 성장 억제 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 도 7, 8에서의 Hepatocellular carcinoma의 세포주인 HepG2와 Hep3B의 세포 생존율 확인을 위한 WST-8 assay는 다음과 같이 진행하였다. HepG2와 Hep3B를 96well plate에 각각 5x103개씩 부유시켜준 뒤 24시간 배양하였다. 그 후에 Sorafenib과 OPT-0139를 2배씩 희석하여 농도별로 처리해준 뒤 24, 48, 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 WST-8 용액을 100㎕씩 넣어 준 후에 살아있는 세포의 환원 요소에 의하여 생성된 formazan을 측정하기 위해 450nm의 광학필터를 이용하여 microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
Sorafenib과 실시예 1 화합물을 처리하지 않은 세포에서는 진한 오렌지 색으로 나타나고 Sorafenib과 실시예 1 화합물을 처리한 세포에서는 세포주의 배양액인 연한 분홍색으로 결과가 나타나 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다.
도 9, 10에서의 Clonogenic assay는 다음과 같이 진행하였다. HepG2와 Hep3B를 12well plate에 각 3x103개씩 부유시켜준 뒤 24시간 배양하였다. 그 후에 Sorafenib과 실시예 1 화합물을 2.5, 5 μM씩 처리하여 10일동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 PBS로 세포를 씻어준 후 37% Formaldehyde로 세포를 고정시키고 0.01% crystal violet으로 염색시켜주었다. 염색이 끝난후 세포를 증류수로 씻어준 후 염색된 세포의 군집을 사진으로 촬영하였다.
염색된 세포의 군집을 보면 Sorafenib과 실시예 1 화합물를 처리하지 않은 곳과 처리한 곳의 군집 수가 확연하게 차이나 나는 것으로 세포 생존율을 알 수 있다.
요약하면 도 7 내지 10을 참조하면, 간암 세포주인 Hep3B와 HepG2 세포에서 WST-8을 이용한 세포 생존율 확인 결과, 실시예 1 화합물과 sorafenib 처리에 의해 농도 및 시간 의존적으로 세포 생존율이 감소하며, 기존 표적항암제인 sorafenib에 비해 현저한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
<실험예 6> 다양한 암세포주에 대한 세포독성 평가
전술한 간암 세포주 억제 평가와 유사한 과정을 통해, 실시예 1 화합물의 다양한 암세포주에 대한 세포독성을 평가하였다. 대조군으로는 항암제로 판매되고 있는 에토포시드(Etoposide)를 사용하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 다양한 암세포주에 대한 본 발명 실시예 1 화합물의 암세포주에 대한 독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11에 나타낸 바와 같이,
본 발명에 따른 실시예 1 화합물은 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, HCT15 암세포주에 대하여 농도 의존적으로 우수한 암세포주에 대한 독성을 나타내므로, 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 7> 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 치료방법에 따른 종양의 크기 변화 평가
6 주령의 immune-competent BALB/c 마우스의 뒷다리에 4T1 murine triple negative breast cancer cell (6x105 cell)를 주입하였다. 주입 7일 후, 종양이 일정하게 자란 것을 확인 후 각 군마다 10마리 마우스를 선별하여 이후 실험에 이용하였다.
대조군 (무치료군), 방사선치료군, 실시예 1 화합물 투여군, 실시예 1 화합물 투여 및 방사선치료의 병용치료군으로 구성되었다. 각 치료는 종양 이식 후 31일간 진행되었다.
방사선 치료는 전자선을 이용하였으며, 1주일간 2일에 한번 (Day 10, 12, 14)총 24Gy를 3번에 나누어 조사하였다(8Gy x 3). 실시예 1 화합물은 10 mg/kg의 용량으로 2일 또는 3일에 한번 (Day 10, 12, 14, 17, 19, 21) 2주에 걸쳐 총 6회 정맥 투여 되었다. 방사선 치료와 약물 투여가 겸치는 날에는 방사선 치료 후 4시간 이후에 생쥐가 마취상태에서 회복된 것을 확인 후 실시예 1 화합물을 투여하였다.
각 치료 수행일마다 종양의 크기를 버니어 캘리퍼스(Vernier Caliper)를 이용해 길이(length)와 너비(width)를 측정한 후 하기의 수학식 1의 방법으로 종양의 부피(volume, mm3 )을 계산하였다.
[수학식 1]
Volume(mm3) = length(mm) x {width(mm)}2 x 0.5
상기와 같은 방법으로 각 치료방법당 10마리의 마우스를 배정하여 종양을 주입한 후, 31일간 종양의 성장을 관찰한 결과를 도 12에 나타내었다. 그 결과, 실시예 1 화화물 단독 투여는 대조군과 비교하여 유의미하게 종양의 성장이 지연되는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 1 화합물 및 방사선을 병용 투여시 각각의 단독 투여와 비교하여 종양 성장 억제 효과가 뛰어남을 확인하였다.
<실험예 8> 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 치료방법에 따른 폐 전이 평가
상기 실험예 7과 같은 방법으로 마우스를 준비하였고, 종양을 주입한 후 31일째 되는 날에 마우스의 폐를 적출하여 폐 전이를 관찰한 결과를 도 13에 나타내었다. 그 결과, 실시예 1 화합물 단독 투여는 대조군과 비교하여 유의미하게 전이가 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 1 화합물 및 방사선을 병용 투여시 각각의 단독 투여와 비교하여 폐 전이가 유의미하게(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다.
<실험예 9> 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 치료방법에 따른 종양미세환경(tumor microenvironment)내에서의 면역세포 변화 평가
각 마우스로부터 종양 조직을 단일세포화 (single cell isolation)한 다음 유세포 분석법 (flow cytometric analysis, FACS)를 이용하여 면역 조절 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 7과 같은 방법으로 종양 세포 주입 후 31일째에 마우스의 비장과 종양을 각각 적출하였다. 종양 조직은 절제된 후 멸균된 면도날을 사용하여 잘게 자르는 (fine chopping) 기계적 가공을 하고 DNase 0.1mg/ml, 콜라게나아제 1mg/ml를 각각 처리하여 36℃, 30 분간 반응하여 단일세포 현탁액을 얻었다. 종양 조직으로부터 단일 세포 분리를 마친 후, 침윤 백혈구를 분석하기 위해, FACS 튜브당 1x10의 세포를 CD3 항체, CD8b 항체, CD4 항체, CD11b 항체, F4/80 항체, CD206 항체를 이용해 FITC, PE, PerCP/Cy5.5, APC 형광으로 염색을 수행하였다. 각 염색을 모두 마친 샘플에 대해, BD Bioscience FACSCalibur machines을 이용하여 CD8+세포독성 T 세포의 분획을 각각 계산하였으며 FACS 결과의 분석은 FlowJo software, version 10을 이용하였다.
상기와 같은 방법으로 치료방법에 따른 종양미세환경내에서의 관찰된 면역세포의 변화를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
CD 양성 T세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)로 종양 세포를 파괴할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기 실험 결과, 실시예 1 화합물 단독 투여로 CD8 양성 T세포비율이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 1 화합물 및 방사선을 병용 투여시 CD8 양성 T세포비율이 각각의 단독 투여와 비교하여 유의미하게 증가한 것을 확인하였다.
실시예 1 화합물 단독 투여시 항종양 효과 기능을 가지는 M1 TAM의 유의미한(P<0.01) 증가와 면역 억제 효과 기능을 가지는 M2 TAM의 유의미한(P<0.01) 감소를 확인하였다. 또한, 실시예 1 화합물 및 방사선을 병용 투여시에도 M1 TAM의 증가 및 M2 TAM 감소를 확인하였다.
<실험예 10> 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 치료방법에 따른 종양미세환경(tumor microenvironment)내에서의 단백질 발현 변화 평가
Bromodomain and extraterminal domain(BET) 패밀리 단백질은 최근 암치료에 있어 중요한 타겟이 되며 특히 BET 패밀리 중 하나인 BRD4는 혈액종양이나 고형종양에서 많이 발견된다. 따라서, BRD4 억제제는 종양 유전자의 하향조절 효과 외에도 직접 종양세포의 증식을 저해하여 종양의 성장을 억제한다. 또한 Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α) 단백질은 종양미세환경에서 종양세포 분열, 혈관신생, 침습과 전이를 조절하는 핵심인자이다.
상기 BRD4, HIF-1α과 같은 단백질 발현 변화를 평가하기 위하여, 상기 실험예 9에서 적출한 종양세포를 면역세포화학(immunocytochemistry method, IHC) 분석을 통해 치료방법에 따른 종양미세환경내에서의 단백질 발현 변화를 평가하여 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
구체적으로, 종양 조직을 추출하여 4% 파라포름알데히드에 넣어 고정(fixation)한 후 파라핀에 조직을 넣어 블록을 만든다. 조직이 들어간 파라핀 블럭을4 μm 두께로 횡축방향으로 얇게 잘라서 슬라이드에 붙인다. 슬라이드에 붙은 조직을 자일렌과에탄올을 이용하여 파라핀을 제거하고 메탄올에 3% H2O2를 넣은 용액에 10분간 상온에서 담궈서 조직내 과산화효소(endogenous peroxidase)를 제거한다. 그리고 antigen retrieval을 위해 0.01 M sodium citrate buffer (pH 6.0)에 넣고 끓인다. 그리고 non-specific binding을 없애기 위하여 5% normal goat serum으로 cell surface에 있는 FcR을 blocking 한다. 그런 다음에 primary antibodies (HIF-1α (SantaCruz, sc-13515), PD-L1 (Abcam, ab2025921), CD8 (Abcam, ab203035), and CD68 (CellSignaling, 97778)) 를 사용하여 4°C에서 overnight 동안 incubation 한다. ImmPRESSGoat Anti-Rat IgG (Mouse Adsorbed) Polymer kit (Vector Laboratories)와 Abcam (ab150165, ab150081), REAL EnVisiondetection system (Dako) 를 사용하여 secondary antibody를 붙이고 발색을 유도한다. 염색된 조직은 Axioskop40 광학현미경 (Carl Zeiss) 40× 배율로 관찰하고 AxioVision4.7 software로 이미지를 저장한다. Image J software (NIH, Bethesda)로 사진의 염색된 영역의 넓이를 통하여 발현량(expression level)을 측정한다. 샘플 당 최소 3개의 슬라이드에서 평균 density 값을 계산하였다.
그 결과, 종양조직내에서 실시예 1 화합물 투여에 의하여 Brd4 발현이 유의미하게(P<0.001) 감소하였고, Brd4와 관련되었다고 알려진 HIF-1α 발현도 유의미하게(P<0.05) 감소하였다. 또한, 실시예 1 화합물에 의하여 암세포가 면역 회피를 유도하기 위해 발현되는 PD-L1의 발현이 유의미하게(P<0.01) 감소하는 것을 확인하였다.
상기 실험예 9의 유세포분석 결과와 동일하게, 방사선 및 실시예 1 화합물 투여 각각에 의하여 CD8+ T cells 의 군집(population)이 증가함을 관찰하였다. 또한, 실시예 1 화합물 및 방사선을 병용 투여시 CD8+ T cells 의 군집이 더욱 증가함(synergistic effect)을 확인하였다. 게다가 실시예 1 화합물에 의하여 종양조직 내에 CD68+ macrophage의 군집(population)이 유의미하게(P<0.01) 감소하는 것을 확인하였다.
<실험예 11> 다른 항암제와의 병용효능평가
11-1. 시스플라틴과의 병용효능평가
인간 난소암 세포주(SKOV-3 및 OVCAR-3)에 대조군(무처리), 실시예 1 화합물 0.1μM 투여, 시스플라틴(Cisplatin) 1μM 투여, 실시예 1 화합물 0.1μM 및 시스플라틴(Cisplatin) 1μM 투여하여 SKOV-3 및 OVCAR-3의 세포 생존능을 확인하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
SKOV-3 및 OVCAR-3 세포주에 대해 실시예 1 화합물 0.1μM 또는 시스플라틴 1μM 투여시 세포생존율이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 1 화합물 0.1μM 및 시스플라틴을 1μM 병용 투여시 세포생존율이 더욱 억제(synergistic effect)되는 것을 확인하였다.
11-2. 소라페닙과의 병용효능평가
인간 간암 세포주(SK Hep1 및 Huh-7)에 대조군(무처리), 실시예 1 화합물 0.1μM 투여, 소라페닙(Sorafenib) 0.1μM 투여, 실시예 1 화합물 0.1μM 및 소라페닙(Sorafenib) 0.1μM 투여하여 SK Hep1 및 Huh-7의 세포 생존능을 확인하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
SK Hep1 및 Huh-7 세포주에 대해 실시예 1 화합물 0.1μM 또는 소라페닙 0.1μM 투여시 세포생존율이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 1 화합물 0.1μM 및 소라페닙을 0.1μM 병용 투여시 세포생존율이 더욱 억제(synergistic effect)되는 것을 확인하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 실시예 1 화합물은 유방암세포주 유방종양괴 형성을 억제하고, 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종 등에서 널리 사용되는 소이성질화효소 저해제인 sorafenib, etoposide 항암제와 비교하였을 때 동등 또는 그 이상의 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 1 화합물은 유방암세포주 및 간암세포주에서 방사선 또는 다른 항암제와 병용 투여시 항암효과가 더욱 증가(synergistic effect)하므로, 유방암 및 간암 치료에 우수한 효과를 나타내는 항암제 또는 식품으로 개발이 가능함을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (trans)-2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종, 위암, 위장관암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 직장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 내궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 다발성 골수종, 만성 또는 급성 백혈병 중 어느 하나인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 암은 유방암 또는 간암 중 어느 하나인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 시스플라틴 및 소라페닙으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 항암제와 병용 치료에 사용되는 것인 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 면역을 증진시키는 것인 약학적 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
    [화학식 1]
    .
  9. 약제학적 유효량의 항암제를 포함하는 제1성분으로서, 상기 항암제는 시스플라틴 및 소라페닙으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종인, 제1성분; 및
    하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 제2성분;을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트:
    [화학식 1]
    .
  10. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (trans)-2,6-디클로로-4-(4-(4-하이드록시사이클로헥실아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 난소암, 대장암, 흑색종, 위암, 위장관암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 직장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 내궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 다발성 골수종, 만성 또는 급성 백혈병 중 어느 하나인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  12. 삭제
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