KR102568885B1

KR102568885B1 - 항-tgf-베타 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102568885B1
Application number: KR1020197024043A
Authority: KR
Inventors: 게리 샤피로; 케빈 브라우어; 패드릭 핀; 리차드 씨. 그레고리; 라오 코두리; 펭 리우; 나탈리아 말코바; 파르민더 만쿠; 잭 알. 폴라드; 화웨이 추; 요아힘 테일하버; 크리스토퍼 윈터; 마르셀라 유
Original assignee: 사노피
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2023-08-21
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: KR102699080B1; AR110904A1; KR20240133763A; KR20230124768A; KR20190105077A

Abstract

본 발명은 자가면역 질병, 섬유성 질환, 및 암을 포함하는, TGF-β에 의해 매개되는 질환의 치료를 위한 개선된 범-TGF-β 항체를 제공한다. 또한 다른 면역조정제, 예컨대 항-PD-1 항체와 함께 사용하는 항체의 방법 및 용도가 제공된다.

Description

항-TGF-베타 항체 및 이의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 둘 다 2017년 1월 20일에 출원된 미국 가출원 62/448,800 및 유럽 출원 번호 17305061.8을 우선권으로 청구한다. 두 우선권 출원의 개시내용은 이의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 2018년 1월 11일에 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 022548_WO011_SL.txt이며, 크기가 30,458 바이트이다.

전환 성장 인자 베타(TGF-β)는 증식, 분화, 생존, 이동, 및 상피 중간엽 전이를 포함하는 여러 주요 세포 기능을 제어하는 사이토카인이다. 이는 다양한 생물학적 과정, 예컨대 세포외 기질 형성, 상처 치유, 배아 발생, 뼈 발생, 조혈, 면역 및 염증 반응, 및 악성 암화를 조절한다. TGF-β의 조절이상은 병리적 질환, 예컨대 성장 결함, 암, 만성 염증, 및 자가면역 및 섬유성 질병을 야기한다.

TGF-β는 알려진 3개 이소형 - TGF-β1, 2, 및 3을 갖는다. 모든 3개 이소형은 처음에 프로-펩타이드로 번역된다. 절단 후, 성숙 C-말단 끝은 N-말단(잠복 연관 펩타이드 또는 LAP로 언급됨)과 연관된 채 남아서, 세포로부터 분비되는 소형 잠복 복합체(SLC)를 형성한다. SLC가 TGF-β 수용체 II(TGFβRII)에 결합하지 못하는 무능은 수용체 관여를 예방한다. N- 및 C-말단의 해리에 의한 활성화는 단백분해 절단, 산성 pH, 또는 인테그린 구조 변경을 포함하는 몇몇 메커니즘 중 하나에 의해 일어난다(Connolly et al., Int J Biol Sci (2012) 8(7):964-78).

TGF-β1, 2, 및 3은 이의 기능이 다표현형 발현되며 세포 및 조직 유형에 걸쳐 상이한 패턴으로 발현된다. 이들은 시험관내 활성이 유사하지만, 특정 세포 유형에서의 개별 녹아웃은 동일한 수용체에 결합하는 이들의 공유된 능력에도 불구하고 생체내 동일하지 않은 역할을 제시한다(Akhurst et al., Nat Rev Drug Discov (2012) 11(10):790-811). TGFβRII에 대한 TGF-β 결합 시, 수용체의 구성적 키나제 활성은 TGFβRI를 인산화하고 활성화하며, 이는 SMAD2/3을 인산화하여, SMAD4에 대한 연합, 핵으로의 국소화, 및 TGF-β-반응성 유전자의 전사를 허용한다. Id. 상기 정규 신호전달 캐스케이드에 부가하여, 비-정규 경로가 p38 MAPK, PI3K, AKT, JUN, JNK, 및 NF-κB를 포함하는 다른 인자를 통해 신호를 전달한다. TGF-β 신호전달은 또한 WNT, Hedgehog, Notch, INF, TNF, 및 RAS를 포함하는 다른 경로에 의해 조정된다. 따라서 TGF-β 신호전달의 최종 결과는 세포의 상태 및 환경을 통합하는 이들 신호전달 경로 전체의 누화(crosstalk)이다. Id.

TGF-β의 다양한 기능으로 인해, 인간 환자에 대해 안전한 범-TGF-β-특이적 치료 항체에 대한 필요성이 존재한다(Bedinger et al., mAbs. (2016) 8(2):389-404). 그러나, TGF-β는 종들 간에 고도 보존된다. 그 결과, 동물, 예컨대 마우스에서 인간 TGF-β에 대한 항체의 생성은 어려운 과제이다.

또한 현재 효과적인 치료가 없는 환자에 대한 의학적 요구가 존재한다. 예를 들어, 항-PD1 항체 니볼루맵 단독치료법으로 치료받는 III상 Checkmate-067 연구에서 진행성 흑색종 환자의 50% 초과는 치료법에 대한 완전 또는 부분 반응을 갖지 않았다(Larkin et al., N Engl J Med (2015) 373:23-34; Redman et al., BMC Med (2016) 14:20-30).

발명의 개요

본 발명은 인간 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3에 특이적으로 결합하는(즉, 범-TGF-β-특이적인) 개선된 모노클로날 항체를 제공한다. 이들 항체는 제조 동안 절반 항체(즉, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 갖는 이량체성 복합체)를 형성하는 경향이 더 적다. 이들은 또한 더 우수한 약동학 프로필, 예컨대 증가된 반감기를 가지며 이에 따라 환자에게 개선된 임상적 이익을 부여할 수 있다. 본 발명자들은 또한, 예컨대 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편에 의해 시행되는 TGF-β 억제가 종양에서 면역억제성 미세환경을 경감시키고, 면역치료법, 예컨대 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1), PD-1 리간드 1(PD-L1) 및 2(PD-L2)를 표적화하는 치료법의 유효성을 강화함을 발견하였다.

하나의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 중쇄 상보성-결정 영역(CDR) 1~3 및 SEQ ID NO: 2의 경쇄 CDR1~3을 포함하는, 인간 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 항체는 위치 228(EU 넘버링)에 돌연변이를 갖는 인간 IgG₄ 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 세린에서-프롤린으로의 돌연변이(S228P)이다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1의 잔기 1~120에 해당하는 중쇄 가변 도메인(V_H) 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 2의 잔기 1~108에 해당하는 경쇄 가변 도메인(V_L) 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 항체의 F(ab')₂ 항원-결합 단편을 특징으로 한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 프레솔리무맵(fresolimumab)에 비해, 증가된 반감기, 증가된 노출, 또는 둘 다를 갖는다. 예를 들어, 증가는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상의 증가이다. 약물, 예컨대 본 발명의 항체 또는 단편의 노출은 시간에 관한 체내 약물 농도의 함수이다. 체내 약물의 농도는 종종 혈액, 혈장, 또는 혈청 중 약물 수준으로 나타낸다. 약물의 반감기 및 노출(생체-노출)은 아래에서 실시예 7에 예시된 바와 같이, 널리 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 조성물은 1% 미만의 절반 항체를 포함한다. 절반 항체 형성은, 예를 들어, 비-환원성 조건 하의 SDS-모세관 전기영동 또는 비-환원성 SDS-PAGE 분석에 이어, 밀도계측, 또는 RP-HPLC를 사용하여, 모노클로날 항체 조제물의 순도 분석을 통해 결정될 수 있다(Angal et al., Mol Immunol (1993) 30(1):105-8; Bloom et al., Protein Science (1997) 6:407-415; Schuurman et al., (2001) 38(1):1-8; 및 Solanos et al., Anal Chem (2006) 78:6583-94). 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 또한 포함하는 약학 조성물이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 TGF-β 신호 전달의 억제를 필요로 하는 환자(인간)에서 TGF-β 신호 전달을 억제하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 단편의 치료량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 환자는 면역-매개 질병(예컨대, 피부경화증), 섬유성 질환(예컨대, 신장 섬유성 질환, 예컨대 국소 분절 사구체경화증(FSGS), 또는 폐 섬유성 질환, 예컨대 특발성 폐 섬유증), 또는 출생 또는 뼈 결함(예컨대, 불완전 뼈형성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 방법에 사용되는 항체 또는 단편은 CD4⁺ T 세포의 유도성 조절 T 세포(iTreg)로의 분화를 억제한다. 항체 또는 단편은 면역억제성 종양 미세환경을 경감시킬 수 있다. 항체 또는 단편의 상기 작용은 면역계의 활성화를 돕고 면역치료법의 유효성을 강화한다. 본원에 기재된 치료 방법의 유효성은, 예를 들어, 환자에서(예컨대, 환자의 종양 조직에서) 하기 중 하나 이상에 의해 시사될 수 있다: (1) MIP2 및/또는 KC/GRO 수준의 증가, (2) CD8⁺ T 세포, 예컨대 INF-γ-양성 CD8⁺ T 세포의 종양 조직에 대한 활성화 또는 침윤, 및 (3) 자연 살해(NK) 세포의 클러스팅 증가.

본 발명은 (1) 본 발명의 항체 또는 단편의 치료 유효량, 및 (2) 면역 체크포인트 단백질의 억제제의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자(인간)에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 이들 두 제제는 동시에(예컨대, 단일 조성물로 또는 별도의 조성물로), 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다. 2개 제제는, 예를 들어, 동일한 날에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제 (1)은 치료제 (2) 전에(예컨대, 1일 이상 전에) 환자에게 투여된다.

일부 구현예에서, 면역 체크포인트 단백질은 PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2이다. 추가 구현예에서, 면역 체크포인트 단백질의 억제제는 항-PD-1 항체이다. 추가 구현예에서, 항-PD-1 항체는 (1) SEQ ID NO: 5의 중쇄 CDR1~3 및 SEQ ID NO: 6의 경쇄 CDR1~3, (2) SEQ ID NO: 5의 잔기 1~117에 해당하는 V_H 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 6의 잔기 1~107에 해당하는 V_L 아미노산 서열, 또는 (3) SEQ ID NO: 5에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 방법은 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TGF-β 항체, 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 항-PD-1 항체 단독치료법에 불응성이다. 환자는 진행성 또는 전이성 흑색종, 또는 피부 편평상피세포 암종을 가질 수 있다.

일부 요법에서, 항-TGF-β 항체 및 항-PD-1 항체는 환자에게 2주마다 또는 3주마다 투여된다. 일부 요법에서, 2개 제제는 0.01~40(예컨대, 0.02~20, 0.05~15, 또는 0.05~20) ㎎/체중 ㎏의 용량으로 각각 투여된다.

본 발명은 면역 반응의 증가를 필요로 하는 환자에서 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 면역 체크포인트 억제제 및 본 발명의 항체 또는 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 또한 제공한다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 예컨대 (1) SEQ ID NO: 5의 HCDR1~3 및 SEQ ID NO: 6의 LCDR1~3; (2) 각각 SEQ ID NO: 5의 잔기 1~117 및 SEQ ID NO: 6의 잔기 1~107에 해당하는 VH 및 VL; 또는 (3)

SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것이다.

본 발명의 방법은 비제한적으로 흑색종(예컨대, 전이성 또는 진행성), 폐암(예컨대, 비-소세포 폐암), 피부 편평상피세포 암종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 나팔관암, 자궁암, 두부경부암(예컨대, 두부경부 편평상피세포 암종), 간암(예컨대, 간세포암), 요로상피암, 및 신장암(예컨대, 신장 세포 암종)을 포함하는 다양한 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 중간엽 종양 또는 중간엽 서브타입의 고형 종양을 갖는다. 이러한 고형 종양의 예에는 결장(예컨대, 결장직장암), 난소, 두부경부(예컨대, 두부경부 편평상피세포 암종), 간(예컨대, 간세포 암종), 및 요로상피계에서의 종양이 포함된다.

일부 구현예에서, 중간엽 종양을 포함하는 암은 ACTA2(평활근 α2 액틴), VIM(비멘틴), MGP(매트릭스 Gla 단백질), ZWINT(ZW10 상호작용 동원체 단백질), 및 ZEB2(아연 핑거 E-박스-결합 호메오박스 2) 중 하나 이상의 과발현을 특징으로 할 수 있다. 이러한 바이오마커의 발현 수준은, 예를 들어, 환자로부터의 생물학적 샘플, 예컨대 종양 생검 또는 순환 종양 세포에서의 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 언급된 항체, 단편, 또는 조성물뿐만 아니라 본원에 기재된 질환의 치료용 약제의 제조에서 상기 언급된 항체, 단편, 또는 조성물의 용도를 제공한다.

또한 본 발명의 항체의, 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다를 인코딩하는 핵산 발현 벡터; 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열을 포함하는 숙주 세포; 및 적절한 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하여 항체 유전자의 발현을 허용하는 단계 및 이어서 항체를 수확하는 단계를 포함하는, 숙주 세포를 사용하여 항체를 제조하는 방법이 본 발명에 포함된다.

도 1a~e는 1 ng/㎖의 인간 TGF-β1(a), 인간 TGF-β2(b), 인간 TGF-β3(c), 쥐과 TGF-β1(d), 또는 쥐과 TGF-β2(e)로 처리된 밍크 폐(Mv 1 Lu) 세포의 증식에 대한 Ab1, 프레솔리무맵, 및 1D11의 효과를 나타내는 그래프이다. 항체 농도는 ㎍/㎖ 단위이다.
도 2는 인간 유도성 조절 T 세포(iTreg) 분화에 대한 50 ㎍/㎖ Ab1의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. T 세포로 제공되는 자극은 항-CD3 및 항-CD28 항체 + IL-2였다.
도 3은 2 ng/㎖ 인간 TGF-β1로 처리된 인간 CD4+ T 세포 배양에서 인간 유도성 조절 T 세포(iTreg) 분화에 대한 Ab1의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. T 세포로 제공되는 자극은 항-CD3 및 항-CD28 항체 + IL-2였다.
도 4는 T 세포 자극 및 항-PD-1 처리 후 Jurkat T 세포 상에서 NFATc-유도 루시퍼라제 발현에 대한 Ab1(30 ㎍/㎖) 및 인간 TGF-β1(18 ng/㎖)의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는 C57BL/6 MC38 결장 마우스 모델을 사용하여 나타낸 처리군에서 중앙값 절대 편차(MAD)를 갖는 중앙값 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 비히클: PBS. "항-PD-1": x-항-mPD-1 Mab(아래의 상세한 설명을 참고). "Ab1의 이소형 대조군": 항-HEL hIgG4.
도 6은 C57BL/6 MC38 결장 마우스 모델을 사용하여 나타낸 처리 27일차의 기준선으로부터의 종양 부피 변화를 나타내는 산란 점 그래프이다. 대조군: PBS. "항-PD-1 RPM114 mIgG1": x-항-mPD-1 Mab.
도 7A~F는 C57BL/6 MC38 결장 마우스 모델을 사용하는 각각의 나타낸 처리군에 대한 경시적인 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 그래프에서 각각의 선은 하나의 동물을 나타낸다. "mpk": ㎎/㎏. "Ab1 이소형 Ctrl": 항-HEL hIgG4. αPD1: x-항-mPD-1 Mab.
도 8은 LoVo 종양 용해액에서 활성 TGF-β1 농도에 대한 Ab1의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 5 ㎎/㎏으로 어느 한 항체의 단회 용량이 제공된 5개 래트 군에서의 경시적인 Ab1 및 프레솔리무맵의 혈청 농도를 나타내는 그래프이다. 군(Gr.) 1~3에 3개의 상이한 배치(B1, B2, 및 B3)의 프레솔리무맵이 제공되었다. 군 4 및 5에는 2개의 상이한 배치(B1 및 B2)의 Ab1이 제공되었다.
도 9b는 1 ㎎/㎏으로 어느 한 항체의 단회 용량이 제공된 원숭이에서의 경시적인 Ab1 및 프레솔리무맵의 혈청 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 나타낸 연구 기간 동안 용량당 1 ㎎/㎏으로 Ab1의 5주 1회 용량 또는 용량당 1 ㎎/㎏으로 프레솔리무맵의 2주 1회 용량이 제공된 원숭이에서의 경시적인 Ab1 및 프레솔리무맵의 혈청 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9d는 10 ㎎/㎏으로 어느 한 항체의 단회 용량이 제공된 원숭이에서의 경시적인 Ab1 및 프레솔리무맵의 혈청 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9e는 나타낸 연구 기간 동안 용량당 10 ㎎/㎏으로 Ab1의 5주 1회 용량 또는 용량당 10 ㎎/㎏으로 프레솔리무맵의 2주 1회 용량이 제공된 원숭이에서의 경시적인 Ab1 및 프레솔리무맵의 혈청 농도를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 Ab1(+/- 항-PD1)로의 처리 후 MC38 종양에서 TGF-β1 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 Ab1(+/- 항-PD1)로의 처리 후 MC38 종양에서 MIP-2 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10c는 Ab1(+/- 항-PD1)로의 처리 후 MC38 종양에서 KC/GRO 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 CD8^pos 세포의 CellTrace Violet 염색 및 IFN-γ 염색을 정량하는 그래프이다.
도 11b는 TGFβ-처리 CD8⁺ T 세포에서 Ab1이 증식 및 IFN-γ 생산 모두를 복원하였음을 나타내는 그래프이다.
도 12a는 결장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 유방암, 흑색종, 중피종 및 신장암에 대한 동계 마우스 종양 모델의 개략에 걸친 CD8⁺ T 세포의 상대 풍부도(log2-변환됨)를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 결장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 유방암, 흑색종, 중피종 및 신장암에 대한 동계 마우스 종양 모델의 개략에 걸친 TGFβ 경로 활성화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 또한 더 우수한 약동학 프로필, 예컨대 선행 기술에서 알려진 항체에 비해 체내에서의 더 높은 노출을 가지면서 절반 항체를 형성할 가능성이 더 낮은 개선된 범-TGF-β-특이적 모노클로날 항체를 특징으로 한다. 본 발명의 항체는 "Ab1 및 관련 항체"로 총칭되고 이들이 SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR(HCDR) 1~3 및 SEQ ID NO: 2의 경쇄 CDR(LCDR) 1~3을 가지며, 힌지 영역에서의 잔기 228(EU 넘버링)이 세린에서 프롤린으로 돌연변이된 인간 IgG₄ 불변 영역을 갖는다는 공통적인 구조적 특징을 공유한다. P228은 아래에 나타낸 SEQ ID NO: 1의 서열에서 박스에 진한 글씨체로 나타낸다.

항체 Ab1은 비-글리코실화되는 경우, 144 KD의 추정 분자량을 갖는다. 그 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1 및 2이다. 이들 두 서열을 아래에 나타낸다. 가변 도메인은 이탤릭체로 나타낸다. CDR은 박스에 나타낸다. 중쇄의 불변 도메인에서 글리코실화 부위는 진한 글씨체로 나타낸다(N297).

일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 예컨대 항-TGF-β 항체는 중쇄에 C-말단 라이신을 갖지 않는다. C-말단 라이신은 제조 동안 또는 재조합 기술에 의해 제거될 수 있다(즉, 중쇄의 코딩 서열에 C-말단의 말단 라이신에 대한 코돈이 포함되지 않음). 따라서 C-말단 라이신이 없는 SEQ ID NO: 1의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명 내에서 고려된다.

Ab1 및 관련 항체는 인간 TGF-β1, -β2, 및 -β3에 특이적으로 결합한다. "특이적으로"란, 결합이, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(예컨대, 아래의 실시예 1 참고), 또는 Bio-Layer 간섭계측에 의해 결정되는, 10^-7 M 미만, 예컨대 10^-8 M 미만(예컨대, 1~5 nM)의 K_D를 가짐을 의미한다. Ab1 및 관련 항체는 또한 밍크 폐 상피 세포 검정(예컨대, 아래의 실시예 2 참고)에서 검정되는 경우, 강한 TGF-β 중화 역가, 또는 A549 세포 IL-11 유도 검정(예컨대, 그 개시의 전문이 본원에서 참조로 포함되는 PCT 공개 WO 2006/086469의 실시예 6 참고)에서 결정되는 약 0.05 내지 1 ㎍/㎖의 EC50을 가질 수 있다.

Ab1 및 관련 항체의 이러한 항원-결합 및 중화 특성은 선행 기술의 항-TGF-β 항체 프레솔리무맵(WO 2006/086469에 기재된 생식계열화 IgG₄ PET1073G12 항체)과 필적한다. 리더 서열을 포함하는 프레솔리무맵의 중쇄 및 경쇄 서열을 각각 SEQ ID NO: 3 및 4에 나타낸다. SEQ ID NO: 3에 나타낸 바와 같이, 프레솔리무맵은 위치 228(EU 넘버링, SEQ ID NO: 3에서 실제 위치 247에 해당함)에 프롤린을 갖지 않는다. Ab1 및 관련 항체는 프레솔리무맵에 비해 몇몇 개선된 특징을 갖는다.

제조 동안, 프레솔리무맵은 비-환원성 변성 조건 하에 6~18%만큼의 절반 항체(즉, 2개의 경쇄와 복합체화된 2개의 중쇄를 갖는 사량체가 아닌 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 갖는 이량체)를 형성할 수 있다. 대조적으로, Ab1은 실질적으로 더 적은 절반 항체(<1%)를 생성한다. 따라서, Ab1 및 관련 항체는 제조 동안 더 순수한 완제 의약품을 제공한다.

또한, Ab1 및 관련 항체는 프레솔리무맵에 비해 개선된 약동학(PK) 프로필을 가질 수 있다. 이들은 프레솔리무맵보다 훨씬 더 긴 반감기 및 더 낮은 제거율을 갖는 선형 PK 거동을 가져서, 프레솔리무맵에 비해 약 1.7배 더 높은 생체내 노출을 야기할 수 있다. 예를 들어, 래트에서, Ab1은 프레솔리무맵의 4.3일에 비해 7.1일의 평균 반감기를, 그리고 프레솔리무맵의 0.51 ㎖/hr/㎏에 비해 0.30 ㎖/hr/㎏의 제거율(CL)을 갖는 것으로 나타났다(실시예 7, 아래). 게잡이 원숭이에서, Ab1은 프레솔리무맵의 4.5일에 비해 13일의 평균 반감기를, 그리고 프레솔리무맵의 0.66 ㎖/hr/㎏에 비해 0.40 ㎖/hr/㎏의 제거율(CL)을 갖는 것으로 나타났다. Id. 이러한 개선된 PK 특성은 Ab1 및 관련 항체가 더 적은 유해 부작용 및 더 적은 항-약물 항체 반응을 유도하면서 동일하거나 더 우수한 임상적 유효성을 달성하기 위해 프레솔리무맵보다 낮은 투여량 및/또는 적은 빈도로 환자에게 제공되어, 필요한 경우 더 긴 치료 기간을 허용할 수 있음을 제시한다.

또한, 비인간 영장류에서 프레솔리무맵의 독성학적 연구 동안, 약물 노출 및 유해 사례, 예컨대 빈혈 간 상관관계가 관찰되었다. 그러나, Ab1를 사용한 동등하거나 심지어 더 높은 노출에서의 유사한 연구에서는 이러한 사례가 관찰되지 않았다.

이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 Ab1 및 관련 항체의 중쇄에서의 잔기 228 돌연변이가 증가된 안정성뿐만 아니라 개선된 PK 및 독성학적 프로필을 야기하는 것으로 추정한다.

Ab1 및 관련 항체의 불변 도메인은 필요한 바에 따라, 예를 들어 분자의 임의의 바람직하지 못한 효과기 기능을 감소시키기 위해 Kabat 잔기 L248에서(예컨대, 돌연변이 L248E를 도입함으로써) 추가 개질될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "항체"(Ab) 또는 "면역글로불린"(Ig)은 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H)(약 50~70 kDa) 및 2개의 경쇄(L)(약 25 kDa)를 포함하는 사량체성 단백질을 나타낸다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 중쇄 불변 영역(C_H)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(V_L) 및 경쇄 불변 영역(C_L)으로 이루어진다. V_H 및 V_L 도메인은 "프레임워크 영역"(FR)으로 불리는, 보다 보존된 영역이 산재된, "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불리는, 초가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 V_H 또는 V_L은 다음 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열되는 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 각 영역으로의 아미노산의 할당은 IMGT® 정의[Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)]; 또는 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 또는 Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따를 수 있다.

용어 "인간 항체"는 가변 도메인 및 불변 영역 서열이 인간 서열로부터 유래되는 항체를 나타낸다. 이 용어는 인간 유전자로부터 유래되는 서열을 갖는 항체를 포괄하지만, 이들 서열은, 예컨대, 면역원성을 감소시키고, 친화도를 증가시키고, 안정성을 증가시키기 위해 개질되었다. 이 용어는 비인간 세포에서 재조합적으로 생성되는 항체를 포괄하며, 이는 인간 세포에 전형적이지 않은 글리코실화를 부여할 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 2개의 상이한 동물 종으로부터의 서열을 포함하는 항체를 나타낸다. 예를 들어, 키메라 항체는 또 다른 종(예컨대, 인간, 토끼, 또는 래트)으로부터 항체의 불변 영역에 연결된 쥐과 항체(즉, 쥐과 항체 유전자에 의해 인코딩되는 항체, 예컨대 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 마우스로부터 수득되는 항체)의 V_H 및 V_L을 함유할 수 있다.

항체의 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항원-결합 단편은 F(ab')₂ 단편이며, 이는 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이다(Fab는 V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 1가 항체 단편임). 일부 구현예에서, 본 발명의 항원-결합 단편은 또한 C_H2 또는 C_H3 도메인을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 단리될 수 있다. 용어 "단리된 단백질", "단리된 폴리펩타이드" 또는 "단리된 항체"는 그 기원 또는 유래 원천으로 인해, (1) 그 원상태에서 수반되는 천연 연관된 성분과 연관되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩타이드 또는 항체를 나타낸다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 천연 유래되는 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 폴리펩타이드는 그 천연 연관된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 단백질은 또한 당분야에 널리 알려진 단백질 정제 기법을 사용하여, 단리에 의해 천연 연관된 성분이 실질적으로 없도록 될 수 있다.

I. Ab1 및 관련 항체의 용도

TGF-β 수용체는 면역 세포에서 널리 발현되어, 선천성 및 적응 면역계 모두에서 TGF-β의 다양한 효과를 야기한다. TGF-β는 여러 이환 질환, 예를 들어, 출생 결함, 암, 만성 염증, 자가면역성, 및 섬유성 질병에 연관되었다. 치료량의 Ab1 또는 관련 항체가 이들 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. "치료 유효"량은 치료받는 질환의 하나 이상의 증상을 구제하는, 본원에서 언급되는 Ab1, 관련 항체, 또는 또 다른 치료제의 양을 나타낸다. 상기 양은 치료받는 질환 또는 환자에 따라 변할 수 있고, 널리 확립된 원칙을 사용하여 헬스케어 전문가에 의해 결정될 수 있다.

일부 구현예에서, Ab1 또는 관련 항체는 40, 20, 또는 15 ㎎/㎏ 이하(예컨대 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 ㎎/㎏)로 투여될 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 용량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 또는 0.5 ㎎/㎏일 수 있다. 투여 빈도는, 예를 들어, 1일 1회, 2일 1회, 3일 1회, 4일 1회, 또는 5일 1회, 1주 1회, 2주 1회, 또는 3주 1회, 1개월 1회, 또는 2개월 1회일 수 있다. 항체는 정맥내(예컨대, 0.5~8시간에 걸친 정맥내 주입), 피하, 국소, 또는 질환 및 약물 제형에 대해 적절한 임의의 다른 투여 경로로 투여될 수 있다.

Ab1 및 관련 항체는 인간 항체 유전자로부터 유도되며 이에 따라 인간에서 낮은 면역원성을 갖는다. Ab1의 독성학적 연구는 아래의 실시예 8에 상세히 기재된다. 소정 심장 및 폐 부작용이 래트에서 관찰되었다. 따라서, 환자를 Ab1 또는 관련 항체로 치료하는 경우, 환자는 유해 사례에 대해 모니터링될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 유효성은 환자에서(예컨대, 이환 조직, 예컨대 환자에서의 종양 조직에서) 하기 중 하나 이상에 의해 시사될 수 있다: (1) TGF-β의 수준 또는 활성의 감소, (2) MIP2 및/또는 KC/GRO 수준의 증가, (3) CD8⁺ T 세포, 예컨대 INF-γ-양성 CD8⁺ T 세포의 활성화 또는 종양 조직으로의 침윤, 및 (4) 자연 살해(NK) 세포의 클러스팅 증가.

A. 비-종양 이환 질환

Ab1 및 관련 항체에 의해 치료받을 수 있는 질환에는 비제한적으로 뼈 결함(예컨대, 불완전 뼈형성), 사구체신염, 신경 또는 피부 흉터형성, 폐 또는 폐의 섬유증(예컨대, 특발성 폐 섬유증), 방사선-유도 섬유증, 간 섬유증, 골수섬유증, 피부경화증, 면역-매개 질병(류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 버거병, 및 이식 거부 포함) 및 뒤퓌트랑 수축질환이 포함된다.

이들은 또한 비제한적으로 국소 분절 사구체경화증(FSGS), 당뇨성(I형 및 II형) 신장병증, 방사선 신장병증, 폐색성 신장병증, 광범위 전신 경화증, 유전성 신장 질병(예를 들어, 다낭성 신장 질병, 수질 해면 신장, 마제신), 사구체신염, 신장경화증, 신장석회증, 전신 또는 사구체 고혈압, 세뇨관간질성 신장병증, 신세뇨관 산증, 신장 결핵 및 신장 경색을 포함하는 신장 기능부전을 치료하고, 예방하고, 그 발생 위험을 감소시키는 데 유용할 수 있다. 특히, 이들은 비제한적으로 레닌 저해제, 안지오텐신-전환 효소(ACE) 저해제, Ang II 수용체 길항제("Ang II 수용체 차단제"로도 알려져 있음) 및 알도스테론 길항제를 포함하는 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템의 길항제와 조합되는 경우 유용하다. 예컨대, 그 개시의 전문이 본원에서 참조로 포함되는 WO 2004/098637을 참고한다.

Ab1 및 관련 항체는 ECM의 침적과 연관된 질병 및 질환, 예컨대 전신 경화증, 수술후 유착, 켈로이드 및 비후 흉터형성, 증식 유리체망막병증, 녹내장 배액 수술, 각막 손상, 백내장, 페로니병, 성인 호흡 곤란 증후군, 간 경화증, 심근 경색 후 흉터형성, 혈관성형술 후 재협착, 지주막하 출혈 후 흉터형성, 고리판절제술 후 섬유증, 힘줄 및 기타 회복 후의 섬유증, 담즙성 경화증(경화성 담관염 포함), 심장막염, 흉막염, 기관절개술, 침투성 CNS 손상, 호산구성 근육통 증후군, 혈관 재협착, 정맥폐쇄병, 췌장염 및 건선성 관절병증을 치료하는 데 유용하다.

Ab1 및 관련 항체는 재-상피화의 촉진이 유익한 질환에서 추가로 유용하다. 이러한 질환에는 비제한적으로 피부 질병, 예컨대, 정맥 궤양, 허혈성 궤양(욕창), 당뇨성 궤양, 이식 부위, 이식 공여자 부위, 찰과상 및 화상, 기관지 상피의 질병, 예컨대 천식, ARDS, 장 상피의 질병, 예컨대 세포독성 치료와 연관된 점막염, 식도 궤양(역류 질병), 위-식도 역류 질병, 위 궤양, 소장 및 대장 병변(염증성 대장 질병)이 포함된다.

Ab1 및 관련 항체의 추가 용도는 상피 세포 증식이 요망되는 질환에, 예를 들어 죽상경화판의 안정화, 혈관 문합의 치유 촉진에, 또는 평활근 세포 증식의 억제가 요망되는 질환에, 예컨대 동맥 질병, 재협착 및 천식에 있다.

Ab1 및 관련 항체는 또한 대식구-매개 감염, 예컨대 레이슈마니아(Leishmania) spp., 트립파노소르나 크루지(Trypanosorna cruzi), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae)뿐만 아니라 원생생물 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii), 진균 히스토플라즈마 캡술라텀(Histoplasma capsulatum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 및 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)에 의해 유도되는 것들에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 유용하다. 이들은 또한, 예를 들어, 종양, AIDS 또는 육아종 질병에 의해 유도되는 면역억제를 감소시키는 데 유용하다.

Ab1 및 관련 항체는 또한 안과 질환, 예컨대 녹내장 및 섬유주절제술 후 흉터형성의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

B. 종양 이환 질환

TGF-β는 세포 증식, 상피-중간엽 전이(EMT), 기질 리모델링, 혈관신생, 및 면역 기능을 포함하는 몇몇 생물학적 과정을 조절한다. 각각의 이들 과정은 종양 진행에 기여한다. 여러 적응증에 걸친 암 환자에서의 TGF-β의 널리 퍼진 유해한 역할은 종양 미세환경 내 뿐만 아니라 전신에서의 상승에 의해 또한 제시된다. 예컨대, 문헌[Kadam et al., Mol. Biomark. Diagn. (2013), 4(3)]을 참고한다. 연구는 악성 상태에서, TGF-β가 EMT를 유도할 수 있고 생성 중간엽 표현형이 증가된 세포 이동 및 침습을 야기함을 나타내었다.

Ab1 및 관련 항체는 과증식성 질병, 예컨대 피부암(예컨대, 절제 불가능한 또는 전이성 흑색종을 포함하는 흑색종, 피부 편평상피세포 암종, 및 각질가시세포종), 폐암(예컨대, 비-소세포 폐암), 식도암, 위암, 결장직장암, 췌장암, 간암(예컨대, 간세포 암종), 원발성 복강암, 방광암, 신장암 또는 신장 암(예컨대, 신장 세포 암종), 요로상피 암종, 유방암, 난소암, 나팔관암, 자궁경부암, 자궁암, 전립샘암, 정소암, 두부경부암(예컨대, 두부경부 편평상피세포 암종), 뇌암, 교모세포종, 교종, 중피종, 백혈병, 및 림프종을 포함하는 암의 치료에서 유용하다.

일부 구현예에서, Ab1 및 관련 항체는 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 치료제에 기반한 이전 치료법이 실패했거나 실패할 것으로 예상되는 환자, 즉 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 항-PD-L2 치료법에 대한 비-반응자이거나 비-반응자일 것으로 예상되는 환자에서 암을 치료하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, Ab1 및 관련 항체는 이전 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 항-PD-L2 치료법으로부터 재발한 환자에서 암의 치료에서 유용하다. 본원에 사용되는 용어 "예상되는"은 의학 분야의 당업자가 치료법의 투여 없이, 환자가 반응자일지 또는 비-반응자일지 그리고 치료법이 실패할지 또는 효과적이 아닐지를 본인의 일반 의학 지식 및 환자의 구체 질환에 기반하여 예상할 수 있음을 의미한다.

일부 구현예에서, 암은 비제한적으로 중간염 결장직장암, 중간엽 난소암, 중간엽 폐암, 중간엽 두부암 및 중간엽 경부암을 포함하는 중간엽 서브타입의 고형 종양이다. 상피 중간엽 전이(EMT)는 상피 세포 유전자의 하향조절 및 중간엽 유전자 발현의 증강에 의해 세포 이동 및 침습 특성을 촉진한다. EMT는 종양 진행 및 침습의 특징표시(hall mark)이다. 결장직장암 및 난소암의 최대 1/4은 중간엽이다. 따라서 TGF-β 및 EMT의 그 유도를 억제함으로써, Ab1 또는 관련 항체는 중간엽 고형 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 중간엽 서브타입의 고형 종양은 여러 유전 마커 및 병리적 평가에 의해 확인될 수 있다. 마커에는 ACTA2, VIM, MGP, ZEB2, 및 ZWINT가 포함되며, 이는 qRT-PCR 또는 면역조직화학에 의해 검출될 수 있다. 이러한 마커는 항-TGF-β 단독치료법 또는 본 발명의 조합 치료법을 위한 환자를 선택하기 위해 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, Ab1 및 관련 항체는 진행성 고형 종양을 갖는 환자를 치료하는 데 유용하다.

Ab1 및 관련 항체는 또한 조혈 장애 또는 종양, 예컨대 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군(MDS), 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 및 백혈병뿐만 아니라 다양한 육종, 예컨대 카포시 육종의 치료에 사용될 수 있다.

Ab1 및 관련 항체는 또한 사이클로스포린-매개 종양 또는 암 진행(예컨대, 전이)을 억제하는 데 유용할 수 있다.

당연히, 암 치료법의 맥락에서, "치료"에는 환자의 예상 수명을 연장시키기 위해 종양 성장의 저하, 종양 진행 또는 재발의 지연, 또는 종양 전이의 감소뿐만 아니라 암의 부분적인 관해를 일으키는 임의의 의학적 개입이 포함된다.

C. 종양학에서의 조합 치료법

암에서 세포독성 T 세포 침윤 수준이 바람직한 임상 결과와 관련됨이 관찰되었다(Fridman et al., Nat Rev Cancer (2012) 12(4):298-306; 및 Galon et al., Immunity (2013) 39(1):11-26). 또한, 세포독성 T 세포(CD4⁺ T_H1)를 보조하는 T 헬퍼 세포 및 이들이 생산하는 사이토카인(예컨대, IFN-γ)도 종종 긍정적인 환자 결과와 관련된다. 대조적으로, Treg 세포의 존재는 불량한 환자 예후와 관련되는 것으로 나타났다(Fridman, 상기 문헌).

TGF-β는 항-종양 면역 반응의 거의 모든 양태를 억제한다. 사이토카인은 iTreg 분화를 촉진하며 세포독성(CD8⁺) 세포 증식 및 침윤을 감소시킨다. Ab1 또는 관련 항체에 의한 TGF-β의 억제는 상술된 바와 같이 면역억제성 종양 미세환경을 경감시켜 암 환자에 대해 긍정적 결과를 가져올 것이다.

또한, 본 발명자들은 면역억제성 종양 미세환경을 경감시킴으로써, Ab1 및 관련 항체는 체크포인트 조정제, 예컨대 항-PD-1 항체가 면역 반응을 더 잘 유도할 수 있도록 함을 발견하였다. 결과적으로, 더 많은 환자가 면역치료법, 예컨대 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 항-PD-L2 치료로부터 이익을 얻을 수 있다.

면역 체크포인트 분자를 표적화하는 치료제를 포함하고 또는 포함하지 않고, Ab1 및 관련 항체는 또한 다른 암 치료법, 예컨대 화학치료법(예컨대, 백금- 또는 탁소이드-기반 치료법), 방사선 치료법, 및 암 항원 또는 종양형성 유도제를 표적화하는 치료법과 함께 사용될 수 있다.

Ab1 또는 관련 항체 및 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1 항체가 관여되는 조합에 의해 치료받을 수 있는 암에는 상기 하위섹션에 기재된 암이 포함된다.

일부 구현예에서, 암, 예컨대 진행성 또는 전이성 흑색종, 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종, 두부경부 편평상피세포 암종, 및 호지킨 림프종은 이전 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 항-PD-L2 치료법에 불응성이다. 불응성 환자는 그 질병 진행이, 예컨대 임의의 반응 증거 없이 치료 개시 12주 내에 방사선학적으로 확인되는, 환자이다.

일부 구현예에서, Ab1 또는 관련 항체는 중간엽 암, 예컨대 결장직장암, 비-소세포 폐암, 난소암, 방광암, 두부경부 편평상피세포 암종, 신장 세포 암종, 간세포 암종, 및 피부 편평상피세포 암종을 치료하기 위해 또 다른 암 치료법, 예컨대 항-PD-1 치료법과 함께 사용될 수 있다. 또한 상기 논의를 참고한다.

항-PD-1 항체의 예는 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 피딜리주맵, MEDI0608(예전 AMP-514; 예컨대, WO 2012/145493 및 U.S. 특허 9,205,148 참고), PDR001(예컨대, WO 2015/112900 참고), PF-06801591(예컨대, WO 2016/092419 참고) 및 BGB-A317(예컨대, WO 2015/035606 참고)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체에는 WO 2015/112800에 개시된 것들(예컨대 PCT 공보의 표 1에서 H1M7789N, H1M7799N, H1M7800N, H2M7780N, H2M7788N, H2M7790N, H2M7791N, H2M7794N, H2M7795N, H2M7796N, H2M7798N, H4H9019P, H4xH9034P2, H4xH9035P2, H4xH9037P2, H4xH9045P2, H4xH9048P2, H4H9057P2, H4H9068P2, H4xH9119P2, H4xH9120P2, H4xH9128P2, H4xH9135P2, H4xH9145P2, H4xH8992P, H4xH8999P 및 H4xH9008P로 언급되는 것들, 및 PCT 공보의 표 3에서 H4H7798N, H4H7795N2, H4H9008P 및 H4H9048P2로 언급되는 것들)이 포함된다. WO 2015/112800의 개시의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

예를 들어, WO 2015/112800에 개시된 항체 및 그 PCT 공보에 개시된 CDR, V_H 및 V_L 서열, 또는 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 및 항원-결합 단편을 포함하는 관련 항체뿐만 아니라 그 PCT 공보에 개시된 항체와 동일한 PD-1 에피토프에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편이 암을 치료하기 위해 본 발명의 Ab1 또는 관련 항체와 함께 사용될 수 있다. 관련 구현예에서, 유용한 항-PD-1 항체는 각각 SEQ ID NO: 5 및 6으로 아래에 나타낸 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; SEQ ID NO: 5 및 6의 V_H 및 V_L 서열(이탤릭체로 나타냄); 또는 SEQ ID NO: 5 및 6의 하나 이상의(예컨대, 6개 모두의) CDR(박스로 나타냄)을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 예컨대 항-PD-1 항체는 중쇄에 C-말단 라이신을 갖지 않는다. C-말단 라이신은 제조 동안 또는 재조합 기술에 의해 제거될 수 있다(즉, 중쇄의 코딩 서열에 C-말단의 말단 라이신에 대한 코돈이 포함되지 않음). 따라서 C-말단 라이신이 없는 SEQ ID NO: 5의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명 내에서 고려된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항-TGF-β 항체 또는 단편은 또한 면역조정 항원, 예컨대 PD-L1 및 CTLA-4에 대한 항체와 함께 사용될 수 있다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맵, 아벨루맵, 두르발루맵, LY3300054 및 BMS-936559이다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맵 또는 트레멜리무맵이다.

D. 치료 유효성의 바이오마커

Ab1 및 관련 항체의 유효성은 바이오마커 또는 표적 점유도에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 종양 조직에서, 표적 점유도는 메조 스케일 탐색(MSD) 검정을 사용하여 생검에서 활성 TGF-β 수준을 평가함으로써 검정될 수 있다. 혈액 중, 표적 관여는 말초 혈액 단핵구, 예컨대 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구 상에서 감소되는 순환 TGF-β의 효과를 평가함으로써 검정될 수 있다. 예를 들어, 순환 CD8⁺ T 세포의 증가된 증식은 유세포 측정에서 마커로서 CD45⁺RO⁺CCR7⁺CD28⁺ Ki67⁺을 사용하여 평가될 수 있다. 순환 NK 세포의 활성화는 유세포 측정에서 마커로서 CD3^-CD56^high/dim CD16⁺ 또는 CD137⁺을 사용하여 평가될 수 있다. 또한, Ki-67, PD-1, 및 ICOS는 T 세포 활성화와 연관된 PD 마커로서 사용될 수 있다.

Ab1 또는 관련 항체에 의한 처리 시의 면역 조정은, 예컨대 NeoGenomics 플랫폼을 사용하여 멀티플렉스 면역조직화학(IHC) 검정에 의해 침윤 면역 세포 및 면역 마커의 변화를 평가함으로써 검정될 수 있다. 구체적으로, NeoGenomic의 MultiOmyx TIL 패널은 면역 마커 패널을 염색하여, 다양한 면역 세포의 밀도 및 국소화의 정량적 결정을 허용한다. 면역 마커는 iTreg의 분화; CD8⁺ T 세포의 침윤 및 증식; 및 CD8⁺ T 세포에 의한 IFNγ의 생성을 시사할 수 있다. Ab1은 iTreg로의 CD4⁺ T 세포의 분화를 억제하고(예컨대, 아래의 실시예 3 참고), CD8⁺ T 세포 증식 및 이의 IFN γ 생성을 증가시키는 것으로 나타났다(혼합 림프구 반응 검정에 나타낸 바와 같음; 데이터는 나타내지 않음). 따라서, Ab1 또는 관련 항체에 의한 치료 유효성은 iTreg의 억제, CD8⁺ T 세포 증식 및 종양 또는 다른 이환 조직으로의 침윤 유도, 증가된 IFNγ 생산 및/또는 증가된 비의 CD8⁺ T 세포 대 Treg 세포에 의해 시사될 수 있다. Ab1 또는 관련 항체에 의한 치료 시의 면역 조정은 또한 CD8⁺ T 세포, Treg 세포, NK 세포, 및 다른 면역 세포의 메틸화-PCR 기반 정량적 면역 세포 계수에 의해 말초혈에서 검정될 수 있다. 치료 유효성은 질병 진행, 예컨대 종양 진행의 지연 또는 역전으로 임상적으로 발현될 수 있다.

II. 항체의 제조 방법

Ab1 및 관련 항체뿐만 아니라 다른 공동-표적, 예컨대 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2를 표적화하는 항체는 당분야에 널리 확립된 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열은 유전자가 필요한 발현 제어 서열, 예컨대 전사 및 번역 제어 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 발현 벡터에는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예컨대 컬리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAV, EBV 유래 에피좀 등이 포함된다. 항체 경쇄 코딩 서열 및 항체 중쇄 코딩 서열은 별도의 벡터 내로 삽입될 수 있고, 동일하거나 상이한 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터)로 작동 가능하게 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 두 코딩 서열이 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입되며 동일한 발현 제어 서열(예컨대, 공통 프로모터)에, 별도의 동일한 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터)에, 또는 상이한 발현 제어 서열(예컨대 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 항체 코딩 서열은 표준 방법(예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한효소 부위의 결찰, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는 경우 블런트(blunt) 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

항체 사슬 유전자에 부가하여, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 운반할 수 있다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열의 예에는 포유류 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래되는 프로모터 및/또는 인핸서(예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래되는 프로모터 및/또는 인핸서(예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스로부터 유래되는 프로모터 및/또는 인핸서(예컨대, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마 및 강력 포유류 프로모터, 예컨대 원상태 면역글로불린 및 액틴 프로모터가 포함된다.

항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 부가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대, 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 운반할 수 있다. 예를 들어, 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선별 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에 사용하기 위해), neo 유전자(G418 선별을 위해), 및 글루타메이트 합성효소 유전자가 포함될 수 있다.

본 발명의 항체를 인코딩하는 발현 벡터는 발현을 위한 숙주 세포로 도입된다. 숙주 세포는 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양되며, 이후 수확되고 단리된다. 숙주 세포에는 포유류, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포가 포함된다. 발현을 위한 숙주로 이용 가능한 포유류 세포주는 당분야에 널리 알려져 있고 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)로부터 이용 가능한 여러 불멸화된 세포주가 포함된다. 이들에는 특히, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 Freestyle 세포(Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예컨대, Hep G2), A549 세포, 및 여러 다른 세포주가 포함된다. 세포주는 이의 발현 수준에 기반하여 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포이다.

또한, 항체의 발현은 여러 알려진 기법을 사용하여 증강될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 소정 조건 하에 발현을 증강시키기 위한 일반적 접근이다.

숙주 세포를 위한 조직 배양 배지에는 동물-유래 성분(ADC), 예컨대 소 혈청 알부민이 포함되거나 이것이 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 안전성을 위해 ADC-비함유 배양 배지가 바람직하다. 조직 배양은 공급-배치 방법, 연속 관류 방법, 또는 숙주 세포 및 요망되는 수율을 위해 적절한 임의의 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

III. 약학 조성물

본 발명의 항체는 적합한 저장 안정성을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여 사용을 위해 동결건조되거나 보관되거나 재구성될 수 있다. 조합 치료법에 있어서, 2개 이상의 치료제, 예컨대 항체가 공동-제형화될 수 있으며, 예컨대 단일 조성물로 혼합되고 제공될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "부형제" 또는 "담체"는 본 발명의 화합물(들)이 아닌 임의의 성분을 설명한다. 부형제(들)의 선택은 요인들, 예컨대 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여량 형태의 성질에 상당 부분 의존할 것이다. "약학적으로 허용 가능한 부형제"에는 생리적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 일부 예는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이의 조합이다. 일부 경우에서, 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 포함될 것이다. 약학적으로 허용 가능한 성분의 추가 예는 수화제 또는 항체의 보관 기간 또는 효과를 증강시키는, 소량의 보조 성분, 예컨대 수화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액이다.

본 발명의 약학 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로, 또는 복수의 단일 단위 용량으로 제조되거나, 포장되거나, 판매될 수 있다. 본원에 사용되는 "단위 용량"은 사전 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 별개량이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에 투여될 활성 성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예컨대 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같다.

본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 비경구 투여에 적합하다. 본원에 사용되는 약학 조성물의 "비경구 투여"에는 대상체 조직의 물리적 누출을 특징으로 하는 임의의 투여 경로 및 조직 내 누출을 통한 약학 조성물의 투여가 포함되며, 이에 따라 일반적으로 혈류 내로, 근육 내로, 또는 내부 장기 내로 직접 투여를 일으킨다. 이에 따라 비경구 투여에는 비제한적으로 조성물의 주사에 의한, 수술적 절제를 통한 조성물의 적용에 의한, 조직-침투 비-수술 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학 조성물의 투여가 포함된다. 특히, 비제한적으로 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 경막내, 심실내, 자궁내, 두개내, 종양내, 및 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법을 포함하는 비경구 투여가 고려된다. 영역 관류도 고려된다. 바람직한 구현예에는 정맥내 및 피하 경로가 포함될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 제형물은 전형적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형물은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조되거나, 포장되거나, 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형물은 단위 투여량 형태, 예컨대 앰플 또는 보존제를 함유하는 다회 용량 용기로 제조되거나, 포장되거나, 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형물에는 비제한적으로 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀젼, 페이스트 등이 포함된다. 이러한 제형물은 비제한적으로 현탁화제, 안정화제, 또는 분산제를 포함하는, 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형물의 하나의 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대, 멸균 발열원-비함유수)로의 재구성을 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 비경구 제형물에는 또한 부형제, 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제를 함유할 수 있는(예컨대 3 내지 9의 pH를 갖는) 수용액이 포함되지만, 일부 적용을 위해, 이들은 보다 적합하게는 멸균 비수성 용액으로 또는 적합한 비히클, 예컨대 멸균, 발열원-비함유수와 함께 사용될 건조 형태로 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여형에는 멸균 수용액, 예를 들어, 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 중 용액 또는 현탁액이 포함된다. 이러한 투여량 형태는 요망되는 경우, 적합하게 완충될 수 있다. 유용한 다른 비경구-투여 가능한 제형물에는 미세결정성 형태로, 또는 리포좀 조제물로 활성 성분을 포함하는 것들이 포함된다. 비경구 투여용 제형물은 즉시 및/또는 개질 방출되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형물에는 지연-, 지속-, 펄스화-, 제어-, 표적화-, 및 프로그래밍된-방출이 포함된다.

IV. 예시적인 구현예

본 발명의 추가적인 특정 구현예가 하기와 같이 기재된다.

1. SEQ ID NO: 1의 중쇄 상보성-결정 영역(CDR) 1~3 및 SEQ ID NO: 2의 경쇄 CDR1~3을 포함하는, 인간 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체로서, 항체가 위치 228(EU 넘버링)에 프롤린을 갖는 인간 IgG₄ 불변 영역을 포함하는 항체.

2. 구현예 1에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 1의 잔기 1~120에 해당하는 중쇄 가변 도메인(V_H) 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 2의 잔기 1~108에 해당하는 경쇄 가변 도메인(V_L) 아미노산 서열을 포함하는 항체.

3. 구현예 2에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.

4. 구현예 3의 항체의 항원-결합 단편으로서, 단편이 F(ab')₂인 항원-결합 단편.

5. 구현예 1~4 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 프레솔리무맵에 비해 증가된 반감기 또는 증가된 노출을 갖는 항체 또는 단편.

6. 구현예 1~5 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 단편:

a) CD4⁺ T 세포의 유도성 조절 T 세포(iTreg)로의 분화를 억제함;

b) CD8⁺ T 세포 증식을 증가시킴;

c) 자연 살해(NK) 세포의 클러스터링을 증가시킴;

d) MIP-2의 수준을 증가시킴; 및

e) KC/GRO의 수준을 증가시킴.

7. 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 단편을 포함하는 조성물로서, 조성물이 1% 미만의 절반 항체를 포함하는 조성물.

8. 구현예 1~6 중 어느 하나에 있어서, 약제로서의 항체 또는 단편.

9. TGF-β 신호 전달의 억제를 필요로 하는 환자에서 TGF-β 신호 전달을 억제하는 방법으로서, 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 단편의 치료량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

10. 구현예 9에 있어서, 환자가 암을 갖는, 방법.

11. 구현예 10에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 피부 편평상피세포 암종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 두부경부암, 간세포 암종, 요로상피암, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.

12. 구현예 10 또는 11에 있어서, 암이 ACTA2, VIM, MGP, 및 ZWINT 중 하나 이상의 과발현을 특징으로 하는, 방법.

13. 구현예 10~12 중 어느 하나에 있어서, 암이 중간엽 종양인, 방법.

14. 구현예 10~13 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 면역억제성 종양 미세환경을 경감시키는, 방법.

15. 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 환자에게 (1) 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 단편, 및 (2) 면역 체크포인트 단백질의 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.

16. 구현예 15에 있어서, 면역 체크포인트 단백질이 PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2인, 방법.

17. 구현예 16에 있어서, 면역 체크포인트 단백질의 억제제가 항-PD-1 항체인, 방법.

18. 구현예 17에 있어서, 항-PD-1 항체가 SEQ ID NO: 5의 중쇄 CDR1~3 및 SEQ ID NO: 6의 경쇄 CDR1~3을 포함하는, 방법.

19. 구현예 17에 있어서, 항-PD-1 항체가 SEQ ID NO: 5의 잔기 1~117에 해당하는 V_H 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 6의 잔기 1~107에 해당하는 V_L 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

20. 구현예 17에 있어서, 항-PD-1 항체가 SEQ ID NO: 5에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

21. 구현예 15~20 중 어느 하나에 있어서, 항-TGF-β 항체가 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

22. 구현예 15~21 중 어느 하나에 있어서, 암이 항-PD-1 항체 치료에 불응성인, 방법.

23. 구현예 15~22 중 어느 하나에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종, 또는 피부 편평상피세포 암종인, 방법.

24. 구현예 15~23 중 어느 하나에 있어서, 암이 중간엽 서브타입의 고형 종양인, 방법.

25. 구현예 15~24 중 어느 하나에 있어서, 암이 ACTA2, VIM, MGP, 및 ZWINT 중 하나 이상의 과발현을 특징으로 하는, 방법.

26. 구현예 15~25 중 어느 하나에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 피부 편평상피세포 암종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 두부경부암, 간세포 암종, 요로상피암, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.

27. 구현예 15~26 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 면역억제성 종양 미세환경을 경감시키는, 방법.

28. 구현예 15~27 중 어느 하나에 있어서, 항-TGF-β 항체 및 항-PD-1 항체가 환자에게 같은 날 투여되는, 방법.

29. 구현예 15~28 중 어느 하나에 있어서, 항-TGF-β 항체 및 항-PD-1 항체가 환자에게 2주 1회 투여되는, 방법.

30. 구현예 15~29 중 어느 하나에 있어서, 항-TGF-β 항체 및 항-PD-1 항체가 0.05~20 ㎎/체중 ㎏의 용량으로 각각 투여되는, 방법.

31. 면역 반응의 증가를 필요로 하는 환자에서 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 면역 체크포인트 억제제 및 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

32. 구현예 31에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD-1 항체인, 방법.

33. 구현예 32에 있어서, 항-PD-1 항체가 다음을 포함하는, 방법:

a) SEQ ID NO: 5의 HCDR1~3 및 SEQ ID NO: 6의 LCDR1~3;

b) 각각 SEQ ID NO: 5의 잔기 1~117 및 SEQ ID NO: 6의 잔기 1~107에 해당하는 V_H 및 V_L; 또는

c) SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄.

34. 구현예 31~33 중 어느 하나에 있어서, 항-TGF-β 항체가 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열(C-말단 라이신을 포함하거나 포함하지 않음) 및 SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

35. 구현예 31~34에 있어서, 환자가 암을 갖는, 방법.

36. 구현예 35에 있어서, 환자가 면역 체크포인트 억제제로의 이전 치료에 불응성이고/이거나 중간엽 서브타입의 고형 종양을 갖는, 방법.

37. 구현예 35 또는 36에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 피부 편평상피세포 암종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 두부경부암, 간세포 암종, 요로상피암, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.

38. 구현예 35~37 중 어느 하나에 있어서, 암이 ACTA2, VIM, MGP, 및 ZWINT 중 하나 이상의 과발현을 특징으로 하는, 방법.

39. 구현예 35~38 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 면역억제성 종양 미세환경을 경감시키는, 방법.

40. 구현예 1~6 중 어느 하나에 있어서, 임의의 상기 방법에서 환자 치료에 사용하기 위한 항체 또는 단편.

41. 임의의 상기 방법에서 환자 치료용 약제의 제조를 위한, 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 단편의 용도.

42. 단리된 핵산 분자로서, 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 단편의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자.

43. 구현예 42의 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.

44. 구현예 43의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.

45. 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서,

항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 각각 인코딩하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계,

항체 또는 항원-결합 단편의 생산을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및

항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.

46. 약학 조성물을 제조하는 방법으로서,

구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하는 단계, 및

항체 또는 항원-결합 단편을 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 방법.

47. 구현예 1~6 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편 및 또 다른 치료제를 포함하는 제조 물품 또는 키트.

48. 구현예 47에 있어서, 다른 치료제가 본원에 기재된 면역 체크포인트 억제제인 제조 물품 또는 키트.

본 발명은 하기 실시예에서 더 설명될 것이며, 이는 청구범위에 기재되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예

본 발명이 더 잘 이해되도록 하기 위해, 하기 실시예를 나타낸다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예 1: Ab1의 TGF-β-결합 특성

모든 인간 및 쥐과 TGF-β 이소형에 대한 Ab1의 친화도를 덱스트란-코팅 카복시-메틸화(CM5) 시리즈 S 칩을 사용하여 Biacore T200 Biosensor 기기(GE Healthcare) 상에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. 일련의 농도(1.11, 3.33, 10, 및 30 nM)의 Ab1을 고정화된 재조합 TGF-β 상에 주사하여 실시간으로 결합 상호작용을 측정하였다. TGF-β 단독이량체를 저밀도로 고정하여 결합력 효과를 감소시켰다. 주입을 3회씩 수행하고 결합 검정을 3회 반복하였다. 동력학 실험으로부터의 데이터를 Biacore T200 Biaevaluation v2.0 소프트웨어를 사용해서 가공하였다. 생성 센소그램을 제로화하고, 정렬하고, 이중 참조하고, 1:1 결합 모델을 사용하여 곡선 피팅 분석을 위해 단축화하여, 연합 속도 상수(k_a), 해리 속도 상수(k_d), 및 평형 해리 상수(K_D)를 결정하였다.

재조합 단백질을 내부적으로 생산하거나(인간 TGF-β1, 2 및 3) R&D Systems에서 입수하였다(쥐과 TGF-β1 및 2). 아래의 표 1은 붉은털 원숭이, 마우스, 또는 래트 및 인간 간의 3개의 활성 TGF-β 이소형의 아미노산 서열 상동성을 나타낸다(상동성은 전체 아미노산에 걸쳐 보존된 아미노산의 백분율로 보고됨).

인간과의 TGF-β 활성 이소형의 상동성

	상동성 백분율
	TGF-β1	TGF-β2	TGF-β3
붉은털 원숭이	100%(112/112)	100%(112/112)		100%(112/112)
마우스	99.1%(111/112)*	97%(109/112)*		100%(112/112)
래트	99.1%(111/112)*	97%(109/112)*		99.1%(111/112)
*래트 및 마우스 TGFβ1은 서로 100% 상동성이며, 래트 및 마우스 TGFβ2는 서로 100% 상동성임

인간 TGF-β3 및 쥐과 TGF-β3은 아미노산 서열이 동일하므로, 이들 두 단백질에 대해서는 별도의 친화도 측정을 계산하지 않았다. 마찬가지로, 쥐과 및 래트 TGF-β1 및 2는 아미노산 서열이 동일하며 또한 별도의 친화도 측정을 계산하지 않았다.

상기 방법에 의해 결정되는 Ab1의 k_a, k_d, 및 K_D 값을 아래의 표 2에 나타낸다. 인간 TGF-β1, 2, 및 3에 대한 Ab1의 K_D 값은 각각 1.48, 3.00, 및 1.65 nM로 결정되었다. 쥐과/래트 TGF-β1 및 2에 대한 Ab1의 K_D 값은 각각 2.80 및 1.88 nM로 결정되었다. 이들 결합 특성은 프레솔리무맵에서와 유사하다.

TGF-β에 대한 Ab1의 평형 상수 및 친화도

	인간		쥐과 및 래트		인간 및 쥐과
	TGF-β1	TGF-β2	TGF-β1	TGF-β2	TGF-β3
k_a(×10⁵M^-1s^-1)	3.11 ± 0.3	2.86 ± 0.3	2.98 ± 0.07	3.48 ± 0.24	2.23 ± 0.6
k_d(×10^-4s^-1)	3.43 ± 2.9	8.23 ± 5.0	8.35 ± 0.38	6.45 ± 1.44	3.72 ± 2.3
K_D(nM)	1.48 ± 1.1	3.00 ± 2.0	2.80 ± 0.08	1.88 ± 0.56	1.65 ± 1.1

상기 데이터는 Ab1이 강력하고 선택적인 범-TGF-β 억제제임을 실증한다. 표면 플라즈몬 공명을 사용한 측정은 Ab1이 모든 인간 및 쥐과 TGF-β 이소형에 대해 1 내지 5 nM의 친화도를 가짐을 실증한다. 일반 래트, 게잡이 원숭이 및 인간 조직을 사용하는 GLP 면역조직화학(IHC) 조직 교차-반응성 연구에 의해 고수준의 특이성이 확인되었다.

실시예 2: Ab1의 TGF-β-중화 역가

TGF-β 활성의 중화에서 Ab1의 시험관내 역가를 세포-기반 검정에서 측정하였다. 상기 검정은 형질전환되지 않은 밍크 폐 상피 세포(Mv 1 Lu 세포)의 증식을 억제하는 TGF-β의 능력을 측정하였다. 예컨대, WO 2006/086469 및 문헌[Mazzieri, et al., Eds, "Methods in Molecular Biology," Vol. 142, "Transforming Growth Factor-β Protocols"]을 참고한다. Ab1, 프레솔리무맵, 및 1D11(그 중쇄 및 경쇄 서열이 본원에서 SEQ ID NO: 9 및 10으로 개시되는 쥐과 항-TGF-β 항체)이 인간 TGF-β1, 2, 3 및 쥐과 TGF-β1 및 2를 중화시키는 능력을 평가하였다. 재조합 TGF-β 단백질을 내부적으로 생산하거나(인간 TGF-β1, 2 및 3) R&D Systems에서 입수하였다(쥐과 TGF-β1 및 2).

모든 인간 및 쥐과 TGF-β 이소형은 0.02 pg/㎖ 내지 10 ng/㎖의 범위에서 용량-의존적 방식으로 밍크 폐 세포의 증식을 억제하였다. Ab1의 역가를 정량하기 위해, 프레솔리무맵, 및 1D11, 1 ng/㎖의 지정된 TGF-β 및 연속-희석된 항체를 밍크 폐 세포와 인큐베이션하였다. 3일 인큐베이션 후, DNA에 결합 시 형광을 내는 CyQUANT 염료에 의해 세포의 증식을 정량하였다(도 1a~e). 데이터는 Ab1, 프레솔리무맵, 및 이의 쥐과 대리물 1D11이 유사한 정도로 모든 인간 및 쥐과 TGF-β 이소형을 억제하였음을 나타낸다.

실시예 3: Ab1에 의한 유도성 T 조절 세포 분화의 억제

조절 T 세포(Treg)는 면역억제성이며 암 환자에서 부정적 결과와 관련되었다. 아래에 기재된 연구에서, 본 발명자들은 Ab1이 인간 CD4⁺ T 세포의 유도성 조절 T 세포(iTreg)로의 TGF-β-유도 분화를 억제할 수 있는지를 조사하였다. 일차 인간 CD4⁺ T 세포를 건강한 일반 공여자로부터 단리하였다. 인간 TGF-β1은 R&D Systems에서 구매하였다.

배양된 세포에 의해 내인적으로 생성되는 TGF-β에 대한 Ab1의 길항제 활성을 조사하기 위해, 외인성 TGF-β의 첨가 없이 전체 CD4⁺ T 세포를 6일 동안 자극(항-CD3, 항-CD28, 및 IL-2)의 존재 또는 부재 하에 50 ㎍/㎖의 이소형 대조군(인간 IgG4, 카파 항-계란 라이소자임(HEL) 항체, Crown Biosience), Ab1 또는 프레솔리무맵으로 처리 후 유세포 측정으로 분석하였다. CD25⁺FOXP3⁺ 집단의 평균 백분율 및 표준 편차를 3개씩 모집단(림프구/살아있는/단세포/CD4⁺CD127^-)으로부터 계산하였다. 전체 인간 CD4⁺ T 세포의 항-CD3, 항-CD28, 및 IL-2로의 자극은 배양에서의 FOXP3⁺CD25⁺(iTreg)의 백분율을 0%에서 15%로 증가시켰다. 50 ㎍/㎖ Ab1 또는 50 ㎍/㎖ 프레솔리무맵으로의 처리는 iTreg의 백분율을 유사한 정도로 감소시켰다(각각 8% 및 7%; 도 2). 대조적으로, 이소형 인간 IgG₄(hIgG₄) 대조군으로의 처리는 iTreg 분화에 대해 최소 효과를 가졌다(20% iTreg)(도 2). 제2의 건강한 일반 자원자로부터 단리된 CD4⁺ T 세포는 유사한 결과를 생성하였다.

외인성, TGF-β에 대한 Ab1의 길항제 활성을 조사하기 위해, 2 ng/㎖ 인간 TGF-β1과 인큐베이션된 전체 CD4⁺ T 세포를 6일 동안 자극(항-CD3, 항-CD28, 및 IL-2)의 존재 또는 부재 하에 다양한 항체 농도의 이소형 대조군, Ab1, 또는 프레솔리무맵으로 처리한 후 유세포 측정으로 분석하였다. CD25⁺FOXP3⁺ 집단의 평균 백분율 및 표준 편차를 주지된 경우를 제외하고 3개씩 모집단(림프구/살아있는/단세포/CD4⁺CD127^-)으로부터 계산하였다. 자극받은 전체 인간 CD4⁺ T 세포에 대한 외인성 TGF-β1(2 ng/㎖)의 첨가는 배양에서 iTreg의 백분율을 15%에서 55%로 증가시켰다. 증가하는 농도의 Ab1로의 처리는 200 ㎍/㎖에서는 55%에서 15%로 그리고 6.25 ㎍/㎖에서는 43%로 iTreg의 백분율을 동시적 방식으로 감소시켰다. 프레솔리무맵으로의 처리는 iTreg의 백분율을 Ab1과 유사한 정도로(200 ㎍/㎖에서는 55%에서 16%로 그리고 6.25 ㎍/㎖에서는 32%로) 감소시켰다. 변하는 농도의 이소형 대조군 항체로의 처리는 200 ㎍/㎖ 및 6.25 ㎍/㎖에서 60%를 갖는 iTreg의 백분율에 효과를 갖지 않았다. 도 3을 참고한다. 제2의 건강한 일반 자원자로부터 단리된 CD4⁺ T 세포는 유사한 결과를 생성하였다.

본 연구는 Ab1이 TGF-β에 의해 유도된 iTreg 분화를 억제하며 이에 따라 면역억제성 종양 미세환경을 경감시킴으로써 임상적 이익을 가져올 수 있음을 실증한다.

실시예 4: 시험관내 Ab1 및 항-PD-1 항체 조합의 효과

본 연구에서, 본 발명자들은 TGF-β가 항-PD-1 처리 후 시험관내 T 세포의 최대 자극을 예방할 것인지, 만약 그렇다면 Ab1이 상기 예방에 반작용할 수 있는지를 조사하였다. NFATc(활성화된 T 세포 핵 인자, 세포질 1) 조절 서열의 전사 제어 하의 발현 구축물로부터의 루시퍼라제 발현을 사용해서 T 세포 활성화 수준을 측정하였다.

본 발명자들은 본 연구를 위해 Promega로부터 구매한 세포 검정 시스템을 사용하였다. 상기 시스템은 2개의 세포 유형을 포함한다: 1) NFAT 반응 요소에 의해 유도되는 루시퍼라제 리포터 및 인간 PD-1을 발현하는 Jurkat T 세포, 및 2) 항원-독립적 방식으로 인지체 T 세포 수용체를 활성화하도록 설계된 조작된 세포 표면 단백질 및 인간 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포. 공동-배양 시, Jurkat T 세포는 CHO-K1 세포와 상호작용하여, T 세포 수용체 자극 및 NFATc의 핵 내로의 전위를 유도하며, 이것은 여기서 루시퍼라제 발현을 유도한다. 그러나, PD-1/PD-L1의 관여는 T 세포 수용체 복합체로 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 11(SHP2)을 모집하여, NFATc 핵 전위 및 후속 루시퍼라제 발현을 억제한다. PD-1 신호전달의 차단은 SHP2-의존적 억제를 완화하며 이에 따라 최대 루시퍼라제 발현을 허용한다. 따라서 시스템은 T 세포 신호전달에 대한 TGF-β의 효과 및 T 세포의 항-PD-1 처리에 대한 Ab1의 영향을 결정하기 위한 기능적 방법을 제공한다.

TGF-β-의존적 효과와 연관된 느린 동역학으로 인해, Jurkat T 세포를 T 세포 수용체 자극 전에 TGF-β로 사전-처리하였다. 인간 TGF-β1은 R&D Systems에서 구매하였다. Ab1에 대한 이소형 대조군 항체(항-HEL hIgG₄)는 Crown Bioscience에서 구매하였다(Cat#C0004-5). 마우스 항-hPD-1 IgG 및 그 이소형 대조군 항체는 BioLegend에서 구매하였다(Cat#329912). 각각의 샘플에 대해 14개의 반복시료를 분석하였다.

이 결과는 24시간 동안 CHO-K1 세포와 공동-배양된 Jurkat T 세포에 대한 항-hPD-1 항체의 첨가가 루시퍼라제 활성(865794 상대 발광 단위[RLU])을, 이소형 대조군의 첨가(234963 RLU, 배율 변화 = 3.685, p-값<0.0001) 또는 단지 항체의 부재(206043 RLU, 배율 변화 = 4.202, p-값<0.0001)보다 더 크게 유도함을 나타내었다. 12일 동안의 18 ng/㎖ TGF-β1로의 Jurkat T 세포의 사전-처리는 TGF-β1로 처리되지 않은 Jurkat T 세포(865794 RLU, 배율 변화 = -1.355, p-값<0.0001)에 비해 항-hPD-1 항체의 존재 하에 CHO-K1 세포 공동-배양에서 더 적은 루시퍼라제 활성(638866 RLU)을 유도하였다(도 4).

Ab1의 길항 역가를 평가하기 위해, Jurkat T 세포를 12일 동안 Ab1, 이소형 대조군 Ab의 존재 하에, 또는 Ab 없이 18 ng/㎖ TGF-β1로 사전-처리한 후 24시간 동안 항-PD-1의 존재 하에 CHO-K1 세포와 공동-배양하였다. Ab1의 존재(924186 RLU)는 이소형 대조군 Ab(639440 RLU, 배율 변화=1.445, p-값<0.0001) 및 Ab 대조군 부재(638866 RLU, 배율 변화=1.447, p-값<0.0001)에 비해 루시퍼라제 활성의 TGF-β-의존적 억제를 완화하였다. 항-PD-1 Ab의 존재 하에 CHO-K1 세포 공동-배양물과 공동-배양되고 TGF-β1로 사전-처리되지 않은 Jurkat T 세포에 첨가된 이소형 대조군(955717 RLU) 또는 Ab1을 포함하는 대조군(975654 RLU)은, Ab 대조군의 부재에 비해 통계적으로 상승된 루시퍼라제 활성을 가졌지만 배율 변화는 최소 수준이었다(865794 RLU, 각각 배율-변화=1.127 및 1.104, p-값=0.0023 및 0.001284)(도 4). RLU 값을 또한 아래의 표 3에 제시한다.

T 세포 활성화 검정에서의 상대 발광 단위

	항-PD-1 Ab		항-PD-1 Ab 이소형 대조군	비히클 (PBS)
	TGF-β1 사전-처리 없음	TGF-β1 사전-처리	항-PD-1 Ab 이소형 대조군	비히클 (PBS)
Ab1 부재	865794	638866	234963	206043
Ab1	975654	924186	-	-
항-HEL hIgG₄	955717	639440	-	-

Jurkat T 세포의 TGF-β1 사전-처리가 감소된 증식 또는 생활성을 야기했고 이에 따라 CHO-K1 세포와의 24시간 공동-배양 동안 루시퍼라제 활성이 감소되었을 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 7일 동안 Ab1, 항-HEL hIgG₄의 존재 하에, 또는 항체의 부재(비히클) 하에 Jurkat T 세포를 18 ng/㎖ TGF-β1 또는 PBS와 인큐베이션하였다. 2 내지 3일마다 동일 부피의 각각의 군을 사용하여 TGF-β1 및 항체가 모두 리프레시되는 시점에 새로운 플라스크에 접종하였다(총 2회 재-접종 사례가 있었음). 최종 배양의 평가는 모든 처리군의 생활성이 변화되지 않음을 실증하였다(94% 내지 96% 범위). 또한, 각 처리군의 최종 배양에서 Jurkat T 세포의 총 수는 매우 유사하였다(2500만 개 내지 2900만 개).

상기 연구는 항-PD-1 처리 후 T 세포 수용체 하류의 신호전달의 증가가 TGF-β에 의해 억제되어, 최적-미만의 T 세포 자극을 야기함을 실증한다. 본 발명자들의 데이터는 TGF-β의 억제가 면역억제성 종양 미세환경을 경감시키며 체크포인트 조정제, 예컨대 항-PD-1 제제가 면역 반응을 더 잘 유도하고, 이에 따라 면역 종양학 치료로부터 이익을 얻을 환자의 비율을 증가시킬 수 있음을 제시한다.

실시예 5: 생체내 Ab1 및 항-PD1 항체 조합의 효과

다음으로 본 발명자들은 C57BL/6 마우스 암 모델에서 조합된 항-TGF-β 및 항-PD-1 처리의 효과를 연구하였다.

관용성/예비 안전성

물질 및 방법

단일 제제 및 조합으로서의 Ab1 및 항-마우스 PD-1(mPD-1) 모노클로날 항체(mAb)의 관용성을 C57BL/6 암컷 마우스에서 평가하였다. Ab1(10, 20, 및 50 ㎎/㎏) 또는 이소형 대조군 Ab(Crown Bioscience에서 구매한 항-HEL hIgG₄; 10 및 20 ㎎/㎏으로 사용함)를 단일 제제로서 3일마다(Q3D) IV로 또는 5 ㎎/㎏의 항-PD1 Mab와의 조합으로 주 2회 IV로 투여하였다. 본 연구에 사용된 항-PD1 Ab는 "antimPD1_hyb_RMP114_mIgG1LCfullrat"(또는 x-항-mPD-1 Mab)로 명명되었다. 래트 IgG_2a 클론 RMP1-14(BioXcell, Cat. #BE0146)의 래트 Fc 영역을 마우스 IgG₁ Fc로 대체함으로써 생성된 키메라 래트 항-mPD-1 항체였다. 상기 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노 서열을 SEQ ID NO: 7 및 8에 나타낸다. 동물 체중 및 임상적 관찰사항을 측정함으로써 관용성을 평가하였다. 3주 처리의 말기에, 최종 처리 4시간 후, 말단 샘플링을 수행하고 조직(심장, 신장, 간, 폐, 및 비장)을 포름알데하이드 중에 고정하고 조직병리학적 분석을 위해 보냈다.

개별 마우스에서 3일 연속 15% 체중 감소, 1일 동안 20% 체중 감소, 또는 10% 이상의 약물-관련 사망을 일으키는 경우, 체중 감소를 야기하는 종양-유도 악액질이 대조군 비히클-처리군에서 관찰되지 않는 한, 투여량이 과도하게 독성인 것으로 간주되었다. 동물 체중에는 종양 중량이 포함되었다.

독성/안전성 결과

C57BL/6 마우스에서의 관용성 연구는 Ab1 및 x-항-mPD-1 Mab의 단일 제제 및 조합의 모든 평가된 용량 수준이 잘 관용됨을 나타내었다. 평가된 모든 용량에서 어느 처리군에서도 큰 체중 변화가 관찰되지 않았다. 연구 동안 중증 또는 주요 임상 관찰사항은 관찰되지 않았다. 조직병리학적 분석으로 조합이 무엇이건 임의의 용량-상관관계 없이, 이소형 대조군 항체 처리군을 포함하는 모든 처리군의 비장(백색 속질)에서 증가된 수의 림프구를 확인하였다. 다른 유의미한 현미경 소견은 관찰되지 않았다. 조합군, 이소형 대조군 Ab(10 ㎎/㎏) 및 항-PD-1 Mab(5 ㎎/㎏)으로부터 2마리가 연구 마지막 날 최종 투여 후 사망한 것으로 확인되었다. 조직병리학적 분석으로는 어떤 약물 관련 사망 원인도 확인하지 못했다.

유효성 연구

피하 MC38 통계 결장 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서 항-TGF-β 및 항-PD-1 처리의 조합 효과를 평가하였다. 마우스에 3주 동안 Q3D로, Ab1 25 ㎎/㎏, x-항-mPD-1 Mab 5 ㎎/㎏, 또는 둘 다를 제공하였다. 본 연구는 Ab1 및 항-mPD-1 Mab 조합이 단일 제제 단독에 비해 유의미하게 더 큰 항종양 활성을 가졌음을 실증한다. 본 연구의 물질 및 방법 그리고 데이터를 아래에 상세히 기재한다.

물질 및 방법

동물

암컷 C57BL/6 마우스를 Charles River Labs(Wilmington, MA, USA)에서 입수하였다. 연구 등록 전에 적어도 3일 동안 동물이 순응하도록 두었다. 마우스는 11주령이었고, 체중은 연구 시작 시 17.0 내지 20.9 g이었다. 이들은 음식(Harlan 2916 설치류 식이, Massachusetts, USA) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 12시간 명/암 주기로 수용하였다.

종양 세포

MC38은 결장 선암종 세포주이다. 세포를 국립 암 연구소(Bethesda, MD, USA)에서 입수하여 10% 열-비활성화 우태 혈청(HI FBS)(Gibco, Cat# 10438026)이 보충된 L-글루타민(Gibco, Cat#11875) 함유 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI)-1640을 포함하는 완전 배지(CM) 중 37℃에서 5% CO₂로 배양하였다. 세포를 수확하고 Dulbecco 인산염-완충 식염수(DPBS)(Gibco, Cat#14190) 중에 재현탁하고, 마우스당 1 × 10⁶ 세포/200 ㎕를 암컷 C57BL/6 마우스의 오른쪽 넙다리 내로 피하(SC) 이식하였다.

화합물

Ab1을 수용액 중에 동물에게 투여하였다. 이를 PES를 통해 0.22 ㎛-여과하고 2 내지 10℃에서 멸균 분취물로 보관하였다. 항체를 동물에게 10 ㎖/㎏으로 복강내(IP), 25 ㎎/㎏으로 제공하였다.

항-HEL hIgG₄(Crown Bioscience)를 Ab1에 대한 이소형 대조군으로 사용하였다. 상기 항체를 대조군 동물에 IP로 10 ㎖/㎏으로 IP에 의해 25 ㎎/㎏으로 제공하였다.

x-항-mPD-1 Mab(상기 문헌)을 DPBS(Gibco, Cat#14190-094) 중에 제공하고, 10 ㎖/㎏, 5 ㎎/㎏으로 IP에 의해 동물에 제공하였다.

연구 설계

0일차에, 60마리 동물에 MC38 종양 세포를 이식하였다. 이식 후 8일차에, 50~75 ㎣의 평균 종양 크기를 갖는 마우스를 풀링하고, 대조군 및 처리군으로 무작위 배분하였다(군당 10마리 마우스). 비히클(PBS, pH 7.2), 항-HEL hIgG₄, Ab1, 및 상술된 용량의 항-mPD-1 Mab로의 처리를 9일차에 개시하고 12, 15, 18, 21, 및 27일차에 반복하였다. 비히클- 및 항-HEL hIgG₄-처리 동물을 대조군으로 사용하였다. 매일 마우스를 확인하고 유해 임상 반응을 기록하였다. 개별 마우스를 실험 종료 시까지 주 3 내지 4회 칭량하였다.

병적 상태 또는 20% 이상의 체중 감소가 관찰되는 경우 마우스를 안락사시켰다. 종양을 최종 희생 시까지 캘리퍼로 주 2회 측정하였다. 종양 크기가 대략 2000 ㎣에 도달하거나 동물 건강 문제(종양의 20% 면적이 궤양화됨)가 존재하는 경우, 동물을 안락사시키고 사망일을 기록하였다. 고형 종양 부피를 2차원 종양 측정으로부터 추정하여 하기 공식에 따라 계산하였다:

종양 부피(㎣) = [길이(㎜) × 폭²(㎟)] / 2

이어서 정해진 날에 군의 각 동물에 대해 계산된 개별 퇴행 백분율의 중앙값을 취해, 이 날의 군에 대한 중앙값 퇴행 백분율을 수득하였다. 중앙값 퇴행 백분율이 군의 활성을 나타내지 않는 경우를 제외하고, 계산일은 ΔT/ΔC(즉, 처리군 및 대조군 간 기준선으로부터의 종양 부피 변화의 중앙값의 비)가 계산되는 날에 결정하였다. 그 경우, 이 날은 중앙값 퇴행 백분율이 최대인 첫 날에 결정하였다. 퇴행은, 종양 부피가 처리 시작 시 종양 부피의 50%까지 감소하는 경우, 부분적인(PR) 것으로 정의하였다. 완전 퇴행(CR)은 종양 부피가 14 ㎣ 미만이거나 이를 기록할 수 없을 때 달성된 것으로 간주되었다.

유효성

일차 유효성 종결점은 ΔT/ΔC, 중앙값 퇴행 백분율, 부분 퇴행, 및 완전 퇴행으로 나타내는, 기준선으로부터의 종양 부피 변화였다. 특정된 관찰일의 종양 부피로부터 제1 처리일(시작일)의 종양 부피를 감산하여 각각의 처리군(T) 및 대조군(C)에 대한 종양 부피 변화를 각각의 동물에 대해 매일 계산하였다. 중앙값 ΔT를 처리군에 대해 계산하였고, 중앙값 ΔC를 대조군에 대해 계산하였다. 비 ΔT/ΔC를 계산하고 백분율로 나타낸다:

ΔT/ΔC = (중앙값 델타T/중앙값 델타C) × 100

40% 이하의 ΔT/ΔC 비는 치료 활성으로 간주되었다. ΔT/ΔC 비 0%는 종양 정체로 간주되었다. 0% 미만 ΔT/ΔC 비는 종양 퇴행으로 간주되었다.

종양 퇴행 백분율은 연구 시작 시(t₀) 종양 부피에 비해 특정된 관찰일에 처리군에서의 종양 부피 감소 백분율로 정의하였다. 특정된 시점(t)에 각각의 동물에 대해, 퇴행 백분율을 하기 공식을 사용하여 계산하였다:

(t에서의)퇴행% = [(부피_t0 - 부피_t)/부피_t0] × 100

이어서 군에서의 각 동물에 대해 계산된 개별 퇴행 값%의 중앙값을 취해 정해진 날의 군에 대한 중앙값 퇴행 백분율을 계산하였다. 중앙값 퇴행 백분율이 군의 활성을 나타내지 않는 경우를 제외하고, 계산일은 ΔT/ΔC가 계산되는 날로 결정하였다. 그 경우, 이 날은 중앙값 퇴행 백분율이 최대인 첫 날로 결정하였다.

통계학적 분석

처리 및 날짜(반복) 인자를 포함하는 투-웨이 ANOVA 유형을 기준선으로부터의 종양 부피 변화에 대해 수행하였다. 유의미한 처리*날짜 상호작용 또는 처리 효과가 있는 경우, 8일차부터 27일차까지의 각 날짜에 모든 처리군을 대조군과 비교하기 위해 다중성에 대한 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm) 교정을 포함하는 대조 분석이 뒤따랐다. 특정된 관찰일의 종양 부피로부터 제1 처리일(8일차)의 종양 부피를 감산함으로써 각각의 동물 및 각각의 날에 대해 기준선으로부터의 종양 부피 변화를 계산하였다.

군 간에 분산의 이종성이 관찰되었으므로, ANOVA 유형 모델(SAS Institute Inc. (2008) SAS/STAT 9.2 User's Guide by Cary NC)을 위해 군=옵션의 화합물 대칭(CS) 공분산 구조를 선택하였다. 도 5 및 6에서, 각 군의 중앙값 및 중앙값 절대 편차(MAD)를 각 측정일에 대해 나타낸다. 아래의 표 4~6에서, 각 군의 중앙값 및 정상화된 MAD(nMAD = 1.4826*MAD)를 각 측정일에 대해 보고한다. 모든 통계 분석을 SAS version v9.2 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 5% 미만의 개연성(p<0.05)이 유의미한 것으로 간주되었다.

유효성 결과

Ab1, 항-PD-1 Mab, 또는 둘의 조합으로의 종양-보유 C57BL/6 마우스의 처리도 동물의 일반 건강 및 활동 그리고 체중에서의 유의미한 변화의 부재로 시사되는 바와 같이 잘 관용되었고 무독성이었다. 단일 제제로서, Ab1 25 ㎎/㎏ Q3D 및 항-PD-1 Mab 5 ㎎/㎏ Q3D는 각각 단지 3.4%(9일차) 및 2.1%(9일차)의 nadir의 체중 감소값을 유도하였다. Ab1(25 ㎎/㎏ Q3D) 및 항-PD-1 Mab(5 ㎎/㎏ Q3D)의 조합도 잘 관용되어, 1.3%의 nadir의 체중 감소값(9일차)을 나타내었다(표 4).

단일 제제로서, Ab1(25 ㎎/㎏ Q3D) 및 항-PD-1 Mab(5 ㎎/㎏ Q3D)는 Ab1 이소형 대조군(항-HEL hIgG₄)으로 처리된 동물에 비해 종양 성장에 대한 교란을 나타내지 않았다. 처리 27일차의 ΔT/ΔC 비는 각각 93% 및 109%였다(표 4). 항-PD-1 Mab 및 항-HEL hIgG₄의 조합은 처리 27일차에 31%의 ΔT/ΔC를 가지며 최소 항-종양 활성을 실증하였고(대조군과 통계적으로 상이하지 않음) 10마리 마우스 중 2마리에서만 완전 퇴행이 관찰되었다. 그러나, 항-PD-1 Mab 및 Ab1의 조합은 27일차에 -1 ΔT/ΔC를 가지며 15일차부터 27일차까지 더 우수한 항-종양 활성을 실증하였고(대조군과 통계적으로 상이함) 10마리 마우스 중 6마리에서 완전 퇴행이 관찰되었다(표 4).

C57BL/6 MC38 암 모델에서 Ab1 및 X-항-mPD-1 Mab의 활성

제제	ΔW* (nadir 날짜)	ΔT/ΔC% (27일차)	퇴행% 중앙값 (27일차)	p값** (27일차)	퇴행 (27일차)
제제	ΔW* (nadir 날짜)	ΔT/ΔC% (27일차)	퇴행% 중앙값 (27일차)	p값** (27일차)	PR	CR
비히클	-1.8(D9)	100	-	-	0/10	0/10
항-HEL hIgG₄ (25 ㎎/㎏)	-	104	-	0.7914	1/10	1/10
Ab1(25 ㎎/㎏)	-3.4(D9)	93	-	0.9953	0/10	0/10
x-항-mPD-1(5 ㎎/㎏)	-2.1(D9)	109	-	0.5435	2/10	1/10
Ab1(25 ㎎/㎏) + x-항-mPD-1(5 ㎎/㎏)	-1.3(D9)	-1	24.5	<0.0001	6/10	6/10
항-HEL hIgG₄ (25 ㎎/㎏) + x-항-mPD-1(5 ㎎/㎏)	-3.0(D9)	31	-	0.4020	2/10	2/10

* ΔW는 nadir에서 군당 평균 체중 변화%를 나타낸다.

** 각각의 처리군을 대조군과 비교하기 위해 기준선으로부터의 종양 부피 변화에 대한 반복 측정과 함께 투-웨이 ANOVA-유형 후 다중성에 대한 본페로니-홀름 조정을 사용하는 대조 분석으로 p-값을 수득하였다. 5% 미만의 개연성(p<0.05)이 유의미한 것으로 간주되었다.

표 5 및 6 그리고 도 5~7은 마우스 모델에서 종양 부피에 대한 단독 또는 조합된 항체의 활성을 나타내는 추가 데이터를 제공한다.

처리군과 대조군의 비교

기준선으로부터의 종양 부피 변화 ㎣: 중앙값(nMAD), n, 및 p-값*
처리군	전체	12일차	15일차	19일차	23일차	27일차
비히클	-	26.0 (20.02) n=10	71.5 (53.37) n=10	220.5 (117.87) n=10	528.0 (157.16) n=10	1610.0 (413.65) n=9
항-HEL hIgG₄ (25 ㎎/㎏)	- 0.9629	17.0 (17.79) n=10 0.5197	65.5 (51.89) n=10 1.0000	182.5 (113.42) n=10 0.8858	491.5 (358.05) n=10 1.0000	1675.0 (621.21) n=9 0.7914
Ab1 (25 ㎎/㎏)	- 0.9629	17.0 (15.57) n=10 0.4754	79.0 (43.74) n=10 1.0000	218.0 (83.03) n=10 0.8858	567.0 (344.70) n=10 1.0000	1496.5 (472.21) n=8 0.9953
X-항-mPD1 Mab (5 ㎎/㎏)	- 0.2439	-2.0 (21.50) n=10 0.0224	38.5 (68.20) n=10 0.1235	147.5 (149.74) n=10 0.2259	458.0 (280.21) n=10 0.2228	1748.0 (851.01) n=9 0.5435
Ab1 (25 ㎎/㎏) + x-항-mPD-1 Mab (5 ㎎/㎏)	- 0.0007	-3.5 (10.38) n=10 0.0743	20.0 (20.02) n=10 0.0121	-0.5 (69.68) n=10 <.0001	-17.0 (51.15) n=10 <.0001	-9.0 (86.73) n=10 <.0001
항-HEL hIgG₄ (25 ㎎/㎏) + x-항-m-PD-1 (5 ㎎/㎏)	- 0.2531	19.0 (37.81) n=10 0.5197	61.5 (65.98) n=10 0.2848	145.0(160.12) n=10 0.2259	266.0 (398.82) n=10 0.1979	503.0 (841.38) n=8 0.4020

* 기준선으로부터의 종양 부피 변화에 대한 투-웨이 Anova-유형 후 다중성에 대한 본페로니-홀름 조정을 이용하는 각 날 짜의 대조 분석으로 p-값을 수득하였다.

단일 제제 대 조합으로서의 Ab1 및 X-항-mPD-1 Mab

기준선으로부터의 종양 부피 변화 ㎣: 중앙값(nMAD), n 및 p-값*
처리군	전체	12일차	15일차	19일차	23일차	27일차
Ab1 (25 ㎎/㎏) + x-항-mPD-1 Mab (5 ㎎/㎏)	-	-3.5 (10.38) n=10	20.0 (20.02) n=10	-0.5 (69.68) n=10	-17.0 (51.15) n=10	-9.0 (86.73) n=10
X-항-mPD-1 (5 ㎎/㎏)	- 0.0405	-2.0 (21.50) n=10 1.0000	38.5 (68.20) n=10 0.7631	147.5 (149.74) n=1 0.0276	458.0 (280.21) n=10 0.0004	1748.0 (851.01) n=9 0.0024
Ab1 (25 ㎎/㎏)	- 0.0017	17.0 (15.57) n=10 1.0000	79.0 (43.74) n=10 0.0694	218.0 (83.03) n=10 0.0007	567.0 (344.70) n=10 <.0001	1496.5 (472.21) n=8 <.0001
항-HEL hIgG₄ (25 ㎎/㎏) + x-항-mPD-1 Mab (5 ㎎/㎏)	-	19.0 (37.81) n=10	61.5 (65.98) n=10	145.0 (160.12) n=10	266.0 (398.82) n=10	503.0 (841.38) n=8
X-항-mPD-1 Mab (5 ㎎/㎏)	- 0.8680	-2.0 (21.50) n=10 0.2024	38.5 (68.20) n=10 0.7631	147.5 (149.74) n=10 0.9476	458.0 (280.21) n=10 0.8576	1748.0 (851.01) n=9 0.8491
항-HEL hIgG₄ (25 ㎎/㎏)	- 0.5691	17.0 (17.79) n=10 1.0000	65.5 (51.89) n=10 0.5743	182.5 (113.42) n=10 0.4761	491.5 (358.05) n=10 0.2357	1675.0 (621.21) n=9 0.8491

*기준선으로부터의 종양 부피 변화에 대한 투-웨이 Anova-유형 후 다중성에 대한 본페로니-홀름 조정을 이용해서 각 날짜에 Ab1, 항-HEL hIgG₄ 및 x-항-mPD-1 조합 대 조합에 관여된 용량의 각각의 단일 제제를 비교하기 위한 대조 분석으로 p-값을 수득하였다.

표 및 도면에 나타낸 데이터는 Ab1 25 ㎎/㎏ Q3D 및 x-항-mPD-1 Mab 5 ㎎/㎏ Q3D의 조합이 이들 용량의 어느 한 항체에 비해 더 큰 항종양 효과를 가졌음을 나타낸다. 조합을 단일 제제로서의 Ab1과 비교하는 경우, 19일, 23일, 및 27일차의 p 값은 각각 0.0007, <0.0001, 및 <0.0001로, 상기 차이는 통계적으로 유의미하였다. 조합을 단일 제제로서의 x-항-mPD-1 Mab과 비교하는 경우, 19일, 23일 및 27일차의 p 값은 각각 0.0276, 0.0004, 및 0.0024로, 상기 차이도 통계적으로 유의미하였다(표 6). 항-HEL hIgG₄ 25 ㎎/㎏ Q3D 및 x-항-mPD-1 Mab 5 ㎎/㎏ Q3D의 조합 군에 있어서, 기준선으로부터의 종양 부피 변화에 대한 처리 효과는 임의의 측정일의 어느 한 제제만으로의 효과와 유의미하게 상이하지 않았다.

요약하면, Ab1 25 ㎎/㎏ Q3D 및 항-mPD-1 Mab 5 ㎎/㎏ Q3D의 조합은 15일차부터 27일차까지 단독 사용되는 어느 한 제제에 비해 유의미하게 더 큰 항종양 효과를 가졌다.

또 다른 연구에서, 본 발명자들은 C57BL/6J 마우스에서 피하 MC38 마우스 결장암 모델에 대해 1, 10, 또는 25 ㎎/㎏ 용량의 Ab1 및 5 ㎎/㎏ 용량의 마우스 PD-1 항체 조합의 항종양 활성을 평가하였다. 지수 성장 중인 MC38 결장 선암종 세포(NCI, Frederick, MD)를 가습 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% FBS가 보충된 RPMI-1640에서 배양한 후 암컷 C57/Bl6J 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)의 넙다리 내로 피하 이식하였다(1×10⁶ 세포). 종양이 평균 크기 50~75 ㎣에 도달하면, 마우스를 풀링하고, 대조군 및 처리군으로 무작위 배분하였다(군당 10마리 마우스). 이어서 각각의 마우스가 총 6 내지 7개 용량을 수여받을 때까지, 종양-보유 마우스에 주 3회 PBS, IgG4 이소형 대조군 항체(25 ㎎/㎏), 또는 Ab1(1, 10, 및 25 ㎎/㎏)를 복강내 처리하였다. 종양을 주 2회 디지털 캘리퍼로 측정하고 종양 부피를 계산하고(㎣ = L × W × H) GraphPad Prism을 사용해서 그래프화하였다. 연구 종료 시, 종양이 2000 ㎣ 초과로 성장하는 경우, 또는 종양이 종양 표면의 20%를 초과하는 궤양을 나타내는 경우, 마우스를 CO₂로 안락사시켰다.

단일 제제로서의, Ab1 25 ㎎/㎏ Q3D 및 마우스 α-PD-1 항체 5 ㎎/㎏은 MC38 종양 보유 마우스에서, 2/8 및 4/8 완전 퇴행 각각과 부분 활성이라는 것을 실증하였다. Ab1 1, 10, 또는 25 ㎎/㎏ Q3D 및 마우스 α-PD-1 항체 5 ㎎/㎏ Q3D의 조합은 치료 활성이 있었다. 이식 후 24일차에, 기준선으로부터의 종양 부피를 비교하는 경우, Ab1의 모든 평가 용량 및 마우스 α-PD-1 항체 5 ㎎/㎏ Q3 조합의 효과는 각각 1, 10, 및 25 ㎎/㎏의 Ab1에 있어서 5/8, 6/8 및 7/8 완전 퇴행을 갖는 각각의 단일 제제의 효과에 비해 컸다. 표 6a는 결과의 요약을 제공한다.

[표 6a]

요약하면, 이들 전임상 데이터는 PD-1 억제와 TGF-β억제의 조합이 체크포인트 억제제 차단 단독의 경우에 비해 더 크게 종양 성장을 억제할 수 있음을 실증한다.

실시예 6: 종양내 TGF-β1 수준

종양내 TGF-β1 수준을 LoVo 결장직장암 피하 이종이식편-이식 BALB/c 마우스 모델에서 연구하였다. 종양 부피가 100 ㎣ 미만일 때 시작해서, 총 8회 IV 투여에 대해 3일마다 Ab1 또는 이소형 대조군 Mab 10, 25, 또는 50 ㎎/㎏을 마우스에 정맥내 주사하였다.

2.8 ㎜ 세라믹 볼(MoBio 13114-50)을 포함하는 2 ㎖ 플라스틱 튜브 중 -80℃에 보관한 종양 샘플을 실온에서 해동하였다. 1×Halt™ 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo 78440)이 보충된 1 밀리리터(㎖)의 저온 Meso Scale Diagnostic(MSD) 트리스 용해 완충액(R60TX-2)을 조직에 첨가한 후, 4℃에서 각각 20초씩, 6500 rpm에서 2회 Precellys® 24 Dual 호모게나이저(Bertin Instruments)를 사용하여 균질화하였다. 용해액을 4℃에서 에펜도르프(Eppendorf) 5417C 원심분리기에서 20,000 × g로 10분 동안 원심분리에 의해 청정화하였다. 상청액을 깨끗한 냉각 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 상술된 바와 같이 추가 20분 동안 원심분리에 의해 추가 청정화하였다. 그 후, 상청액을 플라스틱 96-웰 보관 블록 내로 옮겨, 액체 질소 중에 급속 냉동하고, -80℃에 보관하였다.

다음 날 샘플을 실온에서 해동하고 얼음 상에 배치하였다. 용해액 중의 단백질 농도를 제조업체의 지침에 따라 비신코닌산(BCA) 단백질 검정 키트(Thermo 23225)를 사용하여 측정하였다. 용해액을 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 포함하는 MSD 트리스 용해 완충액(상기 참고)을 사용하여 대략 8 ㎎/㎖의 단백질 농도로 정상화하고, 플라스틱 마이크로튜브에 분취하였다.

정상화된 종양 용해액 중 TGF-β1 농도를 전기화학발광 검정을 이용하는 인간 TGF-β1 키트(MSD, K151IUC-2)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다. MSD 용해 완충액 중 연속 희석된 재조합 마우스 TGF-β1(R&D Systems, Cat. #7666-MB-005)을 보정인자로서 사용하였다. 샘플을 2개씩 플레이트에 로딩하였다. 전기화학발광 신호를 MESO SECTOR S 600 플레이트 판독장치(MSD)를 사용하여 측정하고, 샘플 중 TGF-β1 농도를 표준 곡선에 기반하여 MSD Discovery Workbench 소프트웨어 v4.0을 사용하여 정량하였다.

동일한 샘플에 대한 평균 농도를 소프트웨어에 의해 계산하였다. 소프트웨어에 의해 "피팅 곡선 범위 미만" 또는 "검출 범위 미만"으로 결정된 농도 값은 제로 값으로 대체하였다. 총 단백질 ㎎당 TGF-β1 농도를 계산하기 위해, 검정에서 측정된 농도(pg/㎖)를 샘플 중 단백질 농도(㎎/㎖)로 나누었다.

결과는 이소형 대조군이 주사된 마우스에서의 종양내 TGF-β1 수준이 21.4 pg/총 단백질 ㎎의 중앙값을 가짐을 나타내었으며, Ab1이 주사된 마우스에서의 대응 수준은 검출 불가능하였다(도 8).

인간에서 상기 발견의 관련성을 실증하기 위해, 본 발명자들은 상술된 방법을 사용하여 상술된 바와 같이 종양내 TGF-β1 수준에 대해 10개의 인간 결장직장 종양 샘플 및 10개의 인간 흑색종 종양 샘플을 평가하였다. 인간 CRC 샘플에 있어서, TGF-β1 수준은 약 7 내지 25 pg/㎎ 범위였다. 인간 흑색종 샘플에 있어서, TGF-β1 수준은 약 1 pg/㎎ 내지 43 pg/㎎만큼 높은 범위였다. 이들 데이터는 단독으로 또는 다른 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1 항체와의 조합으로의 항-TGF-β1 치료제, 예컨대 Ab1의 종양 치료에서의 용도를 추가로 뒷받침한다.

실시예 7: Ab1의 약동학 연구

본 실시예는 Ab1의 약동학(PK) 프로필을 특성규명하고 이를 프레솔리무맵의 프로필과 비교한 연구를 기재한다. 하나의 연구에서, 5개 군의 캐뉼라가 삽관된 Sprague-Dawley 래트에 단회 용량의 Ab1 또는 프레솔리무맵 5 ㎎/㎏을 정맥내 제공하였다. 각 군은 5마리의 암컷 및 5마리의 수컷으로 이루어졌다. 래트로부터 혈액을 투여 후 0.25, 6, 24, 48, 72, 144, 192, 및 240시간 후에 수집하였다. Ab1 및 프레솔리무맵 혈청 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. (평가 물질 대 참조물의) AUC 비에 대한 90% 신뢰도 구간이 80% 내지 125% 범위 내에 있는 경우 필적성이 결정되었다.

5개 군의 래트로부터의 경시적인 항체 혈청 농도를 도 9a에 나타낸다. 군 2, 4, 및 5로부터의 PK 파라미터(도 9a의 주석 참고)를 아래의 표 7에 나타낸다. 본 연구는 Ab1이 프레솔리무맵에 비해 훨씬 더 긴 반감기(반감기 T_1/2 7.1일 대 4.3일) 및 더 낮은 제거율(CL 0.30 ㎖/hr/㎏ 대 0.51 ㎖/hr/㎏)과 함께 선형 거동을 가짐을 나타내었다. 이 데이터는 Ab1이 프레솔리무맵에 비해 래트에서 1.7배 더 높은 노출을 가짐을 나타내었다.

프레솔리무맵 및 Ab1 간 PK 비교

PK 파라미터	프레솔리무맵 (배치 2)	Ab1 (배치 1)	Ab1 (배치 2)
t_1/2(hr)	103.21 ± 12.98	181.83 ± 80.92*	158.38 ± 66.73
Cmax(㎍/㎖)	114.56 ± 16.42	116.60 ± 16.78	109.72 ± 18.49
Vz(㎖/㎏)	75.22 ± 15.21	78.35 ± 26.33	63.47 ± 10.65
CL(㎖/hr/㎏)	0.51 ± 0.10	0.31 ± 0.04*	0.30 ± 0.05*
AUC_last(hr*㎍/㎖)	8046 ± 1210	10007 ± 1180*	11223 ± 1035*
AUC_0-INF(hr*㎍/㎖)	10107 ± 1613	16322 ± 2523*	17553 ± 4130*

*이 군은 평균±SD가 "프레솔리무맵(B2)"군과 통계적으로 상이함을 의미한다(도 9a의 군 2).

Ab1 상의 추가 PK 연구(연구 2)를 게잡이 원숭이 군에서 수행하였다. 각 군은 5마리의 암컷 및 5마리의 수컷으로 이루어졌고, Ab1 1 ㎎/㎏(도 9b) 또는 10 ㎎/㎏(도 9d)의 단회 용량, 또는 용량당 Ab1 1 ㎎/㎏(도 9c) 또는 10 ㎎/㎏(도 9e)의 5주 1회 용량이 정맥내 주입에 의해 제공되었다. 원숭이에서 Ab1의 경시적인 혈청 농도를 도 9b~e에 나타낸다. 이전 연구에서 단회 또는 반복 Q2W(2주 1회) 용량으로 원숭이에게 제공된 프레솔리무맵의 경시적인 혈청 농도를 또한 비교를 위해 도면에 나타낸다. 이들 데이터는 Ab1이 또한 원숭이에서 선형 PK 거동을 가짐을 보여주었고 용량당 1 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏ 모두에서 프레솔리무맵에 비해 단회 및 반복 투여 후에 모두 더 높은 노출을 나타내었다. 10 ㎎/㎏의 단회 투여 후, Ab1은 13일의 반감기를 가진 반면, 프레솔리무맵은 4.5일의 반감기를 가졌다; Ab1은 약 0.40 ㎖/hr/㎏의 CL을 가진 반면, 프레솔리무맵은 0.66 ㎖/hr/㎏의 CL을 가졌다. 래트 연구와 유사하게, 원숭이 연구도 Ab1이 프레솔리무맵에 비해 약 1.7배 더 높은 노출을 가짐을 나타내었다.

상술된 연구는 Ab1이 프레솔리무맵에 비해 생체내에서 통계적으로 유의미한 더 긴 반감기, 더 긴 제거 시간, 및 더 높은 생물학적 노출을 가짐을 실증한다.

또한, Ab12 종양 보유 Balb/C 마우스에서의 연구는 Ab1이 정맥내로 투여되건 복강내로 투여되건 유사한 PK 프로필을 가짐을 나타내었다.

2-구획 모델에 대한 상대성장 스케일링을 사용해서, 본 발명자들은 원숭이 데이터에 기반하여 70 ㎏의 인간에서 하기 PK 파라미터를 예측하였다(표 8):

PK 파라미터에 대한 상대성장 모델링

PK 파라미터	원숭이에서의 Ab1	인간에서의 Ab1
T_1/2(일)	13.1	20.9
CL(㎖/hr/㎏)	0.392	5.7
V1(중앙 구획)(L)	0.104	2.43
Q(㎖/hr)	3.18	46
V2(말초 구획)(L)	0.0693	1.62

Ab1의 예측되는 PK 파라미터도 인간에서의 프레솔리무맵에서보다 바람직하다. 예를 들어, 인간에서 12.3 ㎖/hr/㎏의 CL을 갖는 프레솔리무맵은 Ab1에 비해 더 빠른 제거율을 갖는다.

실시예 8: Ab1의 독성학적 연구

Ab1의 독성학적 연구를 래트 및 게잡이 원숭이에서 수행하였다. 안전성 약리학 종결점을 5주 동안 주 1회 반복-용량 GLP(의약품 임상시험 관리기준)로 평가하였다. 원숭이에서 최대 10 ㎎/㎏/용량(2 ㎎/㎖ 농도) 및 래트에서 최대 30 ㎎/㎏/용량(6 ㎎/㎖ 농도)에서는, 주사 부위에서 Ab1-관련 조직병리학적 소견이 나타나지 않았다. 본 연구에서는 신경학적 검사에서 평가된 모든 용량 수준에서 체온, 호흡율, 혈압 및 ECG 파라미터에 대해 Ab1-관련 효과가 주지되지 않았다.

래트에 대한 NOAEL(유해 효과 수준이 관찰되지 않음)은 5주 동안 주 1회 반복 투여에서 3 ㎎/㎏/용량으로 확인되었고, STD10(동물의 10%에서 사망 또는 비가역적 중증 독성을 유도하는 중증 독성 용량)은 래트에 대해 3 내지 10 ㎎/㎏/용량으로 확인되었다. 독성에는 다발성 비후 결절을 특징으로 하는 심장 판막 증식; 및 비정상적 폐 질환, 예컨대 혼합 세포 폐포 삼출물, 혼합 세포 혈관주위 침윤물, 근육 동맥의 비대, 출혈, 및/또는 증가된 폐 중량이 포함되었다.

5주 동안 주 1회 반복 투여에서 원숭이에 대한 NOAEL 및 HNSTD(즉, 치사성, 생명을 위협하는 독성, 또는 비가역적인 독성을 넘어서 일어나는 최고 비중증 독성 용량) 용량은 10 ㎎/㎏/용량으로 확인되었다(cf. 프레솔리무맵은 7 또는 13개 용량에 대해 2주 1회 또는 4주 동안 Q3D로 투여되는 경우, 원숭이에서의 NOAEL이 1 ㎎/㎏으로 나타남). 또한 아래의 표 9에 나타낸 데이터를 참고한다.

래트 및 원숭이에서 독성학적 연구의 요약

독성학적 파라미터	래트	원숭이
LD(치사 용량)	50 ㎎/㎏/용량¹	10 ㎎/㎏/용량 초과
HNLD(최고 비-치사 용량)	30 ㎎/㎏/용량	10 ㎎/㎏/용량
STD10	3~10 ㎎/㎏/용량	NA
HNSTD	NA	10 ㎎/㎏/용량
NOAEL	3 ㎎/㎏/용량 미만	10 ㎎/㎏/용량
주요 표적 기관(조직병리학)	심장, 폐, 뼈, 치아	확인되지 않음
¹: 탐색 연구에 기반함 NA: 해당 없음

상기 독성학적 데이터에 기반하여, Ab1은 1주 1회 또는 덜 빈번하게, 예컨대 2주 1회 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 0.5 ㎎/kg의 투여량 수준으로 안전하게 인간 환자에 투여될 수 있는 것으로 예상된다.

실시예 9: 항-TGF-β 단독치료법의 생체내 유효성

본 연구에서, 본 발명자들은 전이성 동계 종양 모델에서, 인간 및 마우스 TGF-β1, 2, 및 3과 교차-반응하는 1D11, 마우스 IgG₁ 항-소 TGF-β 항체의 효과를 조사하였다. 상기 모델에서, B16-F10 마우스 흑색종 세포를 IV에 의해 C57BL/6 마우스의 발바닥 내로 도입하여 마우스의 배액 림프절에 전이를 형성하였다. 대조군 항체, 13C4로의 처리는 효과가 없었지만, 종양 접종 1일 후 시작해서 주 3회 50 ㎎/㎏ 1D11로의 처리는 전이를 완전 제거하였다.

면역 반응의 역할을 조사하기 위해, β2-마이크로글로불린 유전자가 결핍되고, 이에 따라 CD8⁺ 세포독성 T 세포 반응이 없는 마우스의 발바닥에 B16-F10을 이식하고 앞에서와 같이 처리하였다. 면역 적격 마우스에서 나타난 결과와 대조적으로, 1D11은 이들 마우스의 배액 림프절에서의 전이의 수에 대해 효과가 없었다. 이들 결과는 TGF-β 억제의 작용 메커니즘이 적응 세포 면역성에 의존함을 제시한다.

실시예 10: 암에서의 TGF-β 특징부

이전 연구는 항-PD-1 치료법에 반응하지 못한 흑색종 환자가 전사 특징부 IPRES를 가짐을 나타내었다(Hugo et al., Cell (2016) 165:35-44). 항-PD-1 단독치료법에 대한 선천성 내성 메커니즘을 조사하기 위해, 본 발명자들은 비반응자 대 반응자의 전사 특징부를 연구하였다. 본 발명자들은 Gene Set Enrichment 분석을 사용한 이들 프로필과 1 M 초과 프로필을 갖는 데이터베이스의 비교가 종양에서 항-PD-1 반응 및 TGF-β 신호전달의 활성화 간 강한 상관관계를 드러냄을 확인하였다. 이들 데이터는 흑색종의 기준선에서, TGF-β가 항-PD-1 단독치료법에 대한 선천성 내성과 연관됨을 제시한다.

또한, 본 발명자들은 항-PD-1 반응 및 TGF-β 신호전달의 활성화 간 상관관계가 존재할뿐만 아니라 이 상관관계가 강력함을 확인하였다(R=0.59, t-테스트에 의한 p-값 <9E-4). 따라서, 본 발명자들은 관문 시사 1: 흑색종(예컨대, 전이성 흑색종)에서의 TGF-β 매개 면역 억제가 선천성 내성에 기여할 수 있음에 도달하였다. 또한, 본 발명자들은 TGF-β 유도 유전자 발현 변화가 1D11 처리에 의해 켄칭될 수 있음을 확인하여, TGF-β 활성화 특징부의 특이성을 확인하였다. 이들 결과는 항-PD-1 단독치료법에 반응하지 않는 암 환자를 치료하기 위해 항-TGF-β 및 항-PD-1 치료제 조합을 사용하는 이익을 뒷받침한다.

흑색종 이외의 다른 종양 유형에 걸친 상기 상관관계의 분석은 중간엽 종양(예컨대, CRC, HCC, 두부경부 편평상피세포 암종, 및 난소암)이 또한 TGF-β 활성화 및 예측되는 항-PD-1 내성 모두에 대해 강화됨을 드러내었다. 상기 발견은 EMT에서 TGF-β 신호전달의 역할과 일치하였다. 따라서, 본 발명자들은 관문 시사 2: 중간엽 종양, 특히 면역 침윤을 갖는 종양이 항-TGF-β 및 항-PD-1 조합 치료법으로부터 이익을 얻을 수 있음에 도달하였다. 머신 러닝 방법을 사용하여 30개를 초과하는 EMT 마커 유전자로부터 중간엽 종양을 선택하기 위해 사용될 수 있는 더 적은 수의 유전자, 예를 들어, ACTA2, VIM, MGP, ZEB2, 및 ZWINT를 확인하였다. ACTA2 및 VIM은, 예를 들어, 여러 종양 유형에 걸쳐 수송 가능한 것으로 확인되었다. 따라서, TGF-β 활성화 전사 특징부 및 이 특징부 내의 유전자는 항-TGF-β 및 항-PD-1 항체 조합 치료법을 위해 기준선에서 암 환자 선택에 유용한 바이오마커로 작용할 수 있다.

종양 미세환경에서의 바이오마커를 연구하기 위해, 환자 종양의 면역 구조를 CRC 및 흑색종에서 MultiOmyx, 멀티플렉스 IHC 검정을 사용해서 평가하였다. 각각의 종양 샘플로부터의 단일 FFPE 섹션 상에서 12개의 바이오마커(연합해서 22개의 면역 세포 유형을 설명함)로 멀티플렉스화를 수행하였다. 연구에는 분석학이 각각의 종양 유형을 얼마나 잘 평가하고 가능한 치료 효과와 관련시키는지를 평가하기 위해 염증 범위가 포함되었다. 반복시료 색인, 분산 분석용 볼케이노 그래프, 및 상관관계 매트릭스를 포함하는 세포 집단 수준에서의 차이를 평가하기 위한 통계 방법을 개발하였다. MultiOmyx 검정은 뛰어난 기술적 재현성 및 정밀도, 바람직한 다이내믹 범위, 선택 면역 세포 및 관심 영역에서의 염증 상태 차이를 실증하였고 세포 집단 간 양성적 및 음성적 상관관계를 모두 포함하였다.

실시예 11: 항-PD1을 포함하거나 포함하지 않는 Ab1로의 처리 후 MC38 종양에서 TGF-β1, MIP-2 및 KC/GRO의 변화

TGF-β의 중화를 실증하기 위해, 종양에서 사이토카인의 발현에 영향을 미치는 Ab1(항-PD-1을 포함하거나 포함하지 않음)의 능력을 평가하였다.

종양의 부피가 61 내지 110 ㎣인 경우, MC38 종양-보유 마우스를 단회 용량의 PBS 또는 항-PD-1 단독(5 ㎎/㎏), 또는 항-PD-1(5 ㎎/㎏)과 조합된 증가하는 용량의 Ab1(10, 25 또는 50 ㎎/㎏, i.p.)로 처리하였다. 종양을 처리 1시간, 6시간, 10시간, 24시간, 72시간, 및 168시간 후 수집하고, 2.8 ㎜ 세라믹 볼(Precyllys KT3961-1007.2)을 포함하는 2 ㎖ 플라스틱 튜브 중에 급속 냉동하고 -80℃에 보관하였다. 용해액을 제조하기 위해, 종양을 실온에서 해동하였다. 1×Halt™ 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo 78440)이 보충된 1 ㎖의 저온 Meso Scale Diagnostic(MSD) 트리스 용해 완충액(R60TX-2)을 조직에 첨가한 후, 4℃에서 각각 20 s, 6,500 rpm에서 2회 Precellys® 24 Dual 호모게나이저(Bertin Instruments)를 사용하여 균질화하였다. 용해액을 4℃에서 에펜도르프 5417C 원심분리기에서 20,000 × g로 10분 동안 원심분리에 의해 청정화하였다. 상청액을 깨끗한 냉각 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 상술된 바와 같이 추가 30분 동안 원심분리에 의해 추가 청정화하였다. 상청액을 96-웰 보관 블록 내로 옮겨, 얼음 상에 배치하였다. 용해액 중의 단백질 농도를 제조업체의 지침에 따라 비신코닌산(BCA) 단백질 검정 키트(Thermo 23225)를 사용하여 측정하였다. 용해액을 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 MSD 트리스 용해 완충액(상기 참고)을 사용하여 대략 5 ㎎/㎖ 단백질 농도로 정상화하고, 플라스틱 마이크로튜브에 분취하고, 액체 질소 중에 급속 냉동하고, -80℃에 보관하였다.

종양 용해액 중 활성 TGFβ-1의 농도를 전기화학발광 검정을 이용하는 인간 TGFβ-1 키트(MSD, K151IUC-2)를 사용하여 측정하였다. MSD 용해 완충액 중 연속 희석된 재조합 마우스 TGFβ-1(R&D Systems 7666-MB-005)을 보정인자로서 사용하였다. 상술된 바와 같이 제조된 정상화된 종양 용해액을 해동하고, 제조업체의 지침에 따라 검정을 수행하였다. 잠복 연관 펩타이드와의 복합체로 TGFβ-1을 포함하는 총 TGFβ-1이 아닌 종양에 존재하는 TGFβ-1의 활성 형태만 정량하기 위해, 샘플의 산 처리를 수행하지 않았다. 샘플을 2개씩 플레이트에 로딩하였다. 전기화학발광 신호를 MESO SECTOR S 600 플레이트 판독장치(MSD)를 사용하여 측정하고, 샘플 중 TGFβ-1 농도를 표준 곡선에 기반한 MSD Discovery Workbench 소프트웨어 v4.0을 사용하여 정량하였다.

PBS 또는 항-PD-1 단독으로 처리된 동물에 비해, 항-PD-1(5 ㎎/㎏)과 함께 모든 투여 수준(10, 25, 또는 50 ㎎/㎏)의 Ab1로 처리된 동물은 종양에서 감소된 수준의 활성 TGF-β1을 갖는 것으로 나타나, Ab1과 생체내 그 표적의 연루를 실증하였다(도 10a). 1시간 내에 감소된 수준의 활성 TGF-β1이 관찰되고 적어도 168시간 동안 지속되었다.

MIP-2(CXCL2) 및 KC/GRO(CXCL1)는 호중구를 포함하는 과립구에 대한 화학주성 케모카인이다. MIP-2 및 KC/GRO의 수준을 또한 이들 동일 샘플에서 평가하였다. 항-PD-1과 함께 Ab1의 처리 후, MIP-2의 종양내 수준은 PBS 또는 항-PD-1로 단독 처리된 동물에서에 비해, 항-PD-1과 함께 Ab1로 처리된 동물에서 적어도 4배 증가하는 것으로 나타났다; 그리고 MIP-2 수준의 상승은 적어도 168시간 동안 지속하는 것으로 나타났다(도 10b). 유사하게, KC/GRO의 수준은 MIP-2에 비해, 72 및 168시간 이후의 시점에서이기는 하나, 증가하는 것으로 나타났다(도 10c). 따라서, Ab1 및 항-PD-1 mAb 조합은 MIP-2 및 KC/GRO 수준 증가보다 빠르게 활성 TGF-β1 수준 감소를 유도하였다. 이들 결과는 Ab1이 종양 미세환경 내에서 TGF-β 수준을 감소시키고 억제할 수 있음을 실증한다. 또한, MIP-2 및 KC/GRO 수준에서 관찰된 증가는 이들이 TGF-β의 중화에 의해 영향받고 이에 따라 Ab1로 처리된 환자에서 잠재적 바이오마커로서 기능할 수 있음을 시사한다.

실시예 12: Ab1 처리에 의한 NK 세포 클러스터링의 복원

TGF-β는 상이한 면역 세포 유형의 활성을 억제함으로써 면역계에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. TGF-β는 자연 살해(NK) 세포 활성 및 NK 세포-매개 ADCC를 억제하는 것으로 보고되었다(Trotta et al., Journal of immunology (2008) 181:3784-3792). NK 세포는 최근에 조밀 패킹된 클러스터 내에서 IL-2의 국소화를 통해 이의 활성 및 활성화를 증강시키는 메커니즘으로서 조밀한 클러스터를 형성하는 것으로 보고되었다(Kim et al., Scientific Reports (2017) 7:40623). IL2의 존재 하에 시험관내 배양된 정제된 인간 NK 세포는 이러한 조밀하게 패킹된 클러스터를 형성하는 것으로 나타난다.

본 연구에서, 본 발명자들은 NK 세포 "클러스터링"에 대한 Ab1의 부재 또는 존재 하에 TGF-β의 효과를 평가하였다. NK 세포를 제조업체의 프로토콜(Stem Cell Technologies)에 따라 NK 세포 RosetteSep 시약으로의 음성 선별에 의해 건강한 공여자의 혈액으로부터 신선 단리하였다. NK 세포를 둥근 바닥 검정 플레이트(Costar)에서 IL-2(100 IU/㎖)가 보충된 Myelocult(Stem Cell Technologies) 중 1.2×10⁵ 세포/웰로 배양하였다. 나타낸 바와 같이, TGF-β1을 무관한 IgG4 또는 Ab1 100 ㎍/㎖의 존재 하에 0.1, 1 또는 10 ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 72시간 동안 배양하고 Nikon 현미경 상 이미지를 포착하여 NK 세포 클러스터링을 가시화하였다.

증가 용량의 TGF-β1의 첨가는 NK 세포 클러스터링을 억제하는 것으로 나타났다. IgG4 대조군 항체가 아니라 Ab1을 NK 세포 배양에 첨가하는 경우, NK 세포 클러스터가 발생하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 TGF-β 중화가 NK 세포 활성화에 영향을 미쳐, NK 세포의 증가된 활성 및 증식을 야기함으로써 면역계의 항-종양 반응을 뒷받침함을 실증한다.

실시예 13: Ab1 처리에 의한 증식 CD8 ⁺ T 세포에서 IFN-γ 생산의 TGF-β-매개 억제의 역전

선천성 면역계에 부가하여, TGF-β는 CD8⁺ T 세포의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다(Flavell et al., Nature Reviews Immunology (2010) 10:554-567). CD8⁺ T 세포 활성에 대한 TGF-β 및 Ab1의 역할을 탐색하기 위해, 정제된 인간 CD3⁺ 세포가 BLCL 세포와 혼합된 MLR(혼합 림프구 반응) 검정 시스템을 확립하였다. CD8⁺ 세포 증식 및 IFN-γ 생산을 먼저 TGF-β의 존재 하에 평가하였다. 구체적으로, Ficoll 구배 단리 후 건강한 일반 공여자로부터 분획화된 PBMC로부터 EasySep T 세포 농축 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 CD3⁺ 세포를 단리하였다. 이어서 CD3⁺ 세포를 제조업체의 프로토콜(ThermoFisher)에 따라 CellTrace Violet으로 표지하였다. 10% FBS가 보충된 RPMI 중 표지된 CD3⁺ 세포(2×10⁵ 세포)를 조사된 BLCL 세포(Astarte Bio)(2×10⁴ 세포; 2분)와 혼합함으로써 MLR 검정을 수행하였다. TGF-β1, IgG4 대조군 항체 및/또는 Ab1을 나타낸 바와 같이 배양에 첨가하고, 배양을 4일 동안 5% CO₂로 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로 세포를 PMA 세포 자극 칵테일(eBioscience) 및 단백질 트랜스포터 억제제 칵테일(eBioscience)의 존재 하에 4시간 동안 자극하였다. 얼음 상에서 Zombie NIR 생활성 염료(BioLegend)로 염색하고 FACS 완충액으로 세척함으로써 살아있는 세포를 구별하였다. 세포를 True-Nuclear 완충액(BioLegend)으로 고정하고, 세척하고, 펠렛화하고, FACs 완충액 중에 재현탁하였다. 세포를 BV650 항-huCD4, PERCP/Cy5.5 항-huCD8, FITC 항-huCD3, 및 PE 항-huIFNγ(BioLegend)로 염색함으로써 유세포 측정을 위해 준비시켰다. 유세포 측정을 BD Canto 상에서 수행하고 결과를 FlowJo 소프트웨어에서 살아있는 세포, 단일선(singlet), 및 CD3⁺ 세포에 대한 관문화로 분석하였다. IFNγ⁺CD8⁺ T 세포의 백분율을 감소된 CellTrace Violet 염색에 기반하여 증식했고 IFN-γ 염색에 대해 양성인 CD8⁺ 세포 상 관문화에 의해 정량하였다. FMO를 모든 항체 염색에 대한 대조군으로 사용하였다.

MLR 검정에서 TGF-β의 도입은 IFN-γ에 대해 양성인 CD8⁺ T 세포의 백분율을 대략 4배만큼 감소시키는 것으로 나타났다(도 11a). Ab1 또는 대조군 Ab의 도입은 TGF-β의 부재 하에 이들 IFNγ⁺ 증식 CD8+ 세포의 발생에 효과를 갖지 않았다(도 11b). 그러나, 대조군 항체가 아닌 Ab1의 도입은 용량-의존적 방식으로 IFNγ⁺CD8⁺ 세포의 증식을 복원할 수 있었다. 이들 결과는 TGF-β 중화가 IFN-γ를 발현하는 효과기 CD8⁺ 세포의 증식에 대한 TGF-β의 면역억제성 효과를 차단함으로써 적응 면역계에 영향을 미칠 수 있음을 실증한다. 이들 IFNγ⁺CD8⁺ T 세포는 항-종양 면역성에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 제시되었다(Ikeda et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002) 13:95-109).

실시예 14: 항-TGF-β 치료법에 대한 동계 마우스 모델의 반응

본 연구에서, 본 발명자들은 어느 동계 마우스 모델이 항-TGF-β 항체 Ab1 및 항-PD-1로의 처리에 대한 반응을 예측하기 위해 사용될 수 있는지를 조사하였다. 마우스 모델을 계층화하기 위해, 본 발명자들은 마우스에서 종양 내로의 CD8⁺ T 세포 침윤 및 TGF-β 경로 활성화를 평가하였다. CD8⁺ T 세포 침윤을 RNASeq에서 획득한 데이터로부터의 CD8⁺ T 세포 특징부에 기반하여 검정하였다. 몇몇 적응증으로부터 발생한 종양 세포(도 12a 및 12b에서 x축 아래에 나타냄)를 포함하는 17개의 개별 마우스 동계 모델을 전체-트랜스크립톰 RNAseq를 사용하여 전사적으로 프로필 분석하였다. 동계 모델의 상기 "개략"을 공통 배경 계통 C57/BL6 상에 구축되었고, 모델당 5개 내지 7개의 생물학적 반복시료를 포함하였다. Illumina 2000 서열분석 후, STAR 정렬기 및 Cufflinks 전사체 풍부도 추정기를 사용하여, 미가공 서열 판독치의 표준 가공에 의해 백만 개당 전사체(TPM)로 표현되는 유전자 발현 프로필을 생성하였다. 생성된 다중-샘플 데이터 매트릭스를 최종 사분위 정상화하였다.

도 12a는 개략에 걸친 CD8⁺ T 세포(log2-변환됨)의 상대 풍부도를 나타낸다. CD8 T 세포 존재의 고도로 특이적인 표시자인 것으로 나타난, 고유 마커 유전자 CD8B를 사용하여 상대 CD8⁺ T 세포 풍부도를 추정하였다(Becht et al., Curr Opin Immunol (2016) 39:7-13; 및 Becht et al., Genome Biol (2016) 17:218). 각각의 박스 그래프는 생물학적 반복시료에 걸친 값 범위를 요약한다. MC38 모델은 EMT6 모델에 비해 약 2배 더 많은 CD8⁺ T 세포 침윤을 나타내었다(각각 왼쪽 및 오른쪽 박스). A20 및 EL4 림프종 모델은 EL4에서 무시할 만한 CD8⁺ T 세포를 가지며, 각각 전체 최고 및 최저 수준의 CD8⁺ T 세포 침윤을 디스플레이하였다.

MC38, MC38.ova, CT26, 및 L1210 쥐과 세포주는 최고 수준의 CD8 유전자 특징부를 나타내었다. 또한, EMT-6 유방암 세포주는 기준선에 가까운 T 세포 침윤을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 EMT6 종양이 면역-배제 표현형을 갖는다는 최근 보고와 일치한다(S. Mariathasan et al. 2017, ESMO Immuno-Oncology Congress, Geneva, Geneva Switzerland).

도 12b는 개략에 걸친 TGF-β 경로 활성화를 나타낸다. TGF-β에 의한 MCF7 세포의 시험관내 자극으로부터 유도되고 몇몇 다른 TGF-β 특징부와의 비교에 의해 검증된, TGFβ 경로 활성화의 170-유전자 전사 특징부를 사용하여 개략에서의 각 프로필에 대해 경로 활성화 스코어를 할당하였다. 스코어를 "조절 유전자 세트 농축 분석"(rGSEA, Theilhaber et al. 2014)을 사용해서 연산하고, 유전자 배경에 대한 특징부 유전자의 log2 농축으로 표현하였다. MC38 모델은 평균 활성화를 디스플레이하였으나, EMT6 모델은 매우 높은 TGF-β 경로 활성화(각각 왼쪽 및 오른쪽 박스)를 디스플레이하였다.

실시예 15: 마우스 유방암 모델에 대한 Ab1 및 항-PD1 항체 조합의 효과

본 연구에서, 본 발명자들은 항-PD-1을 포함하거나 포함하지 않는 Ab1의 치료 효과를 조사하였다. 지수 성장 중인 EMT-6 유방암 세포(CRL-2755, ATCC)를 가습 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% FBS FBS가 보충된 RPMI-1640에서 배양한 후 암컷 BALB/c 마우스(Shanghai Lingchang Bio-Technology Co. Ltd, Shanghai, China)의 넙다리 내로 피하 이식하였다(0.5×10⁶ 세포/마우스). 종양이 평균 크기 68~116 ㎣에 도달하면, 마우스를 풀링하고, 대조군 및 처리군으로 무작위 배분하였다(군당 10마리 마우스). 이어서 종양-보유 마우스를 총 6회 용량에 대해 각 동물에 있어서 주 3회 PBS, Ab1(10 및 25 ㎎/㎏)로 복강내 처리하였다. 종양을 주 2회 디지털 캘리퍼로 측정하고 종양 부피를 계산하고(㎣ = L × W × H) GraphPad Prism을 사용하여 그래프화하였다. 연구 종료 시, 종양이 3000 ㎣ 초과로 성장하는 경우, 또는 종양이 종양 표면의 20%를 초과하는 궤양을 나타내는 경우, 마우스를 CO₂로 안락사시켰다.

단일 제제로서의, 10 또는 25 ㎎/㎏ 용량의 Q3D Ab1 및 5 ㎎/㎏ 용량의 마우스 α-PD-1 항체는 EMT-6 종양-보유 마우스에서, 1/10, 2/10 및 2/10 완전 퇴행 각각과 부분 활성이라는 것을 실증하였다. 10 또는 25 ㎎/㎏ 용량의 Q3D Ab1 및 5 ㎎/㎏의 Q3D 마우스 α-PD-1 항체의 조합은 치료 활성이 있었다. 이식 후 31일차에 기준선으로부터의 종양 부피 변화를 비교하는 경우, 모든 평가 용량의 Ab1과 마우스 α-PD-1 항체 5 ㎎/㎏ Q3D 조합의 효과는, 10, 및 25 ㎎/㎏의 Ab1에 각각에 대해 7/10 및 4/10 완전 퇴행을 갖는 각각의 단일 제제의 효과에 비해 컸다. 표 10은 결과 요약이다.

EMT-6 마우스 모델에 대한 Ab1/ 항-mPD-1 조합의 효과

군	처리	마우스의 총 수	완전 반응의 수(완전 반응율)
1.	PBS	10	0(0%)
2.	5 ㎎/㎏ x-항-mPD-1 Mab	10	2(20%)
3.	10 ㎎/㎏ Ab1	10	1(10%)
4.	25 ㎎/㎏ Ab1	10	2(20%)
5.	10 ㎎/㎏ Ab1 + 5 ㎎/㎏ x-항-mPD-1 Mab	10	7(70%)
6.	25 ㎎/㎏ Ab1 + 5 ㎎/㎏ x-항-mPD-1 Mab	10	4(40%)

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본원에 기재된 서열이 아래에 기재된다.

서열 목록

SEQ ID NO: 1(Ab1 중쇄)

SEQ ID NO: 2(Ab1 경쇄)

SEQ ID NO: 3(프레솔리무맵 중쇄, 리더 서열 - 잔기 1~19 포함)

SEQ ID NO: 4(프레솔리무맵 경쇄, 리더 서열 - 잔기 1~19 포함)

SEQ ID NO: 5(항-PD-1 Mab 중쇄)

SEQ ID NO: 6(항-PD-1 Mab 경쇄)

SEQ ID NO: 7(x-항-mPD-1 Mab 중쇄)

SEQ ID NO: 8(x-항-mPD-1 Mab 경쇄)

SEQ ID NO: 9(1D11 중쇄)

SEQ ID NO: 10(1D11 경쇄)

SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> ANTI-TGF-BETA ANTIBODIES AND THEIR USE <130> 022548.WO011 <140> <141> <150> EP 17305061.8 <151> 2017-01-20 <150> 62/448,800 <151> 2017-01-20 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 3 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Asn Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Thr Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala 100 105 110 Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 5 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Ser Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Asn Thr Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 210 215 220 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 290 295 300 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 305 310 315 320 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 340 345 350 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 355 360 365 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 405 410 415 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 420 425 430 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 435 440 <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Thr Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly 85 90 95 Leu Glu Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln 115 120 125 Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg 145 150 155 160 Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser 180 185 190 His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro 195 200 205 Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 9 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 His Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 290 295 300 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 305 310 315 320 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 340 345 350 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 355 360 365 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 405 410 415 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 420 425 430 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 115 120 125 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 180 185 190 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 195 200 205 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims

각각 SEQ ID NO: 1의 잔기 31 내지 35, 잔기 50 내지 66, 및 잔기 99 내지 109에 해당하는 중쇄 상보성-결정 영역(CDR) 1~3 및
각각 SEQ ID NO: 2의 잔기 24 내지 35, 잔기 51 내지 57, 및 잔기 90 내지 98에 해당하는 경쇄 CDR1~3
을 포함하며, 위치 228(EU 넘버링)에서 프롤린을 갖는 인간 IgG₄ 불변 영역을 포함하는,
인간 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항-TGF-β 항체.
제1항에 있어서,
SEQ ID NO: 1의 잔기 1~120에 해당하는 중쇄 가변 도메인(V_H) 아미노산 서열 및
SEQ ID NO: 2의 잔기 1~108에 해당하는 경쇄 가변 도메인(V_L) 아미노산 서열
을 포함하는 항-TGF-β 항체.
제2항에 있어서,
SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및
SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열
을 포함하는 항-TGF-β 항체.
제1항의 항-TGF-β 항체의 항원-결합 단편이며, F(ab')₂인 항원-결합 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-TGF-β 항체 또는 제4항의 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 1% 미만의 절반 항체(half antibody) 또는 단편을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-TGF-β 항체 또는 제4항의 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하기 위한 약제.
제6항에 있어서, 상기 항-TGF-β 항체 또는 상기 그의 항원-결합 단편이 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 사용되는 것인 약제.
제6항에 있어서, 암이 항-PD-1 항체 치료에 불응성인 약제.
제7항에 있어서, 암이 항-PD-1 항체 치료에 불응성인 약제.
제6항에 있어서, 암이 중간엽 서브타입의 고형 종양인 약제.
제7항에 있어서, 암이 중간엽 서브타입의 고형 종양인 약제.
제6항에 있어서, 암이 ACTA2, VIM, MGP, 및 ZWINT 중 하나 이상의 과발현을 특징으로 하는 것인 약제.
제7항에 있어서, 암이 ACTA2, VIM, MGP, 및 ZWINT 중 하나 이상의 과발현을 특징으로 하는 것인 약제.
제6항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 피부 편평상피세포 암종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두부경부암, 간세포 암종, 췌장암, 전립샘암, 요로상피암, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 약제.
제7항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 피부 편평상피세포 암종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두부경부암, 간세포 암종, 췌장암, 전립샘암, 요로상피암, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 약제.
제6항에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종, 또는 피부 편평상피세포 암종인 약제.
제7항에 있어서, 암이 진행성 또는 전이성 흑색종, 또는 피부 편평상피세포 암종인 약제.
제6항에 있어서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 면역억제성 종양 미세환경을 경감시키는 것인 약제.
제7항에 있어서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 면역억제성 종양 미세환경을 경감시키는 것인 약제.
제7항에 있어서, 항-TGF-β 항체 및 항-PD-1 항체가 환자에게 같은 날 투여되는 것인 약제.
제7항에 있어서, 항-TGF-β항체 및 항-PD-1 항체가 환자에게 2주 1회 투여되는 것인 약제.
제7항에 있어서, 항-TGF-β 항체 및 항-PD-1 항체가 0.05~20 ㎎/체중 ㎏의 용량으로 각각 투여되는 것인 약제.
제7항에 있어서, 항-PD-1 항체가
a) 각각 SEQ ID NO: 5의 잔기 26 내지 33, 잔기 51 내지 58, 및 잔기 97 내지 106에 해당하는 HCDR1~3 및
각각 SEQ ID NO: 6의 잔기 27 내지 32, 잔기 50 내지 52, 및 잔기 89 내지 97에 해당하는 LCDR1~3;
b) SEQ ID NO: 5의 잔기 1~117에 해당하는 V_H 아미노산 서열 및
SEQ ID NO: 6의 잔기 1~107에 해당하는 V_L 아미노산 서열; 또는
c) SEQ ID NO: 5에 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및
SEQ ID NO: 6에 나타낸 경쇄 아미노산 서열
을 포함하는 것인 약제.
제6항에 있어서, 항-TGF-β 항체가
SEQ ID NO: 1에 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및
SEQ ID NO: 2에 나타낸 경쇄 아미노산 서열
을 포함하는 것인 약제.
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