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KR102562878B1 - 질환 항원이 융합된 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

질환 항원이 융합된 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR102562878B1
KR102562878B1 KR1020200144570A KR20200144570A KR102562878B1 KR 102562878 B1 KR102562878 B1 KR 102562878B1 KR 1020200144570 A KR1020200144570 A KR 1020200144570A KR 20200144570 A KR20200144570 A KR 20200144570A KR 102562878 B1 KR102562878 B1 KR 102562878B1
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Abstract

본 발명은 질환 항원이 융합된 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어진다. 본 발명의 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 우수한 결합력을 나타내므로 다양한 종류 및 길이의 질환 항원 에피토프를 항원 제시 세포에 제공하여 해당 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다.

Description

질환 항원이 융합된 단백질 및 이의 용도{ANTIGEN FUSED PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 질환 항원이 융합된 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대에 들어 의학 기술이 발달하면서 치료가 불가능한 병은 거의 없어졌지만 암은 다른 질병 치료와는 달리 매우 힘들고 복잡한 치료가 요구되고 있다. 현재 암 치료에 사용되고 있는 방법은 크게 수술, 방사선 치료 및 화학적 치료가 있다. 암이 다른 부위로 전이되지 않고 국소적으로 발병한 경우, 암 제거 수술을 통해 암을 치료할 수 있다. 그러나 암 환자의 70% 이상에서 암 전이가 발생하기 때문에 보조적인 치료 요법이 병행되어야 한다.
상기 보조 치료 요법 중 하나로 고 에너지 방사선을 이용하여 암 세포를 죽이는 방사선 치료가 수행되는데, 상기 방사선 치료법은 암 세포에 방사선을 조사할 때 암 세포의 증식이 억제되어 새로운 암 세포가 생성되지 못하고 암 세포가 더 이상 분열하지 못하게 한다. 그러나 이 방법은 암 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 영향을 끼친다는 부작용이 존재하는 문제점이 있다.
화학적 치료 요법은 수술 후에 약물을 사용하여 암 세포를 죽이는 보조 치료법으로 눈에 보이지 않는 암 세포를 죽이기 위한 목적으로 수행된다. 그러나 상기 화학적 치료 요법은 구토, 설사, 탈모 등의 부작용이 뒤따른다는 문제가 있다.
이러한 부작용들을 최소화하고자 최근 면역치료 방법이 대두되고 있다. 면역치료 방법은 환자의 면역 반응을 이용하여 암을 치료하는 방법으로서, 암의 예방까지도 꾀할 수 있다. 암 면역치료는 백신의 원리와 같이 종양 형성의 원인이 되는 항원을 투여하여 암에 특이적인 면역세포들을 활성화시킨 후, 활성화된 면역세포들이 체내에서 암을 특이적으로 공격하게 하는 치료 방법이다. 또한, 암에 걸리지 않았더라도 암에 특이적인 항원을 체내에 투여함으로써 비활성화의 면역세포를 암 특이적 기억 면역세포로 활성화하여 암이 발병되었을 때 암 세포를 특이적으로 공격할 수 있게 한다.
암 면역치료를 위해서는 면역세포들이 밀집되어 있는 림프절로 암 특이적 항원(종양 연관 항원(Tumor-associated antigen; TAA, 종양 특이 항원(Tumor-specific antigen; TSA))을 운반하는 것이 중요하다. 특히 종양 특이 항원 중, 폐암, 신장암과 같은 다양한 종양 타입에서 발견되지만 주로 흑색종에서 발견되는 신생항원(neo-antigen)은 암 환자 개인의 잠재적 유전자 활성 혹은 DNA 부분의 변이에 의해 새롭게 생성되는 항원으로서, 이 항원은 환자 개인의 유전정보를 바탕으로 '맞춤형 암 백신'을 제작하는데 있어 매우 중요하다.
그러나 암 특이적 항원 자체만을 림프절로 운반하려는 종래의 시도는 그다지 효과적이지 못했다. 종양 항원 자체만으로는 종양 항원의 길이가 다소 짧고, 종양 항원 특이 면역세포를 증폭 및 활성화하기 위한 종양 항원 제시 효율이 현저히 낮아 종양 항원 특이 면역 유도 효율도 현저히 낮았기 때문이다 (비특허문헌 1). 이러한 암 특이적 항원의 체내 운반체로서 고분자들이 많이 사용되고 있으며, 암 특이적 항원의 체내 운반을 위해 고분자의 표면에 암 항원을 고정시키는 경우, 입자 표면에 암 특이적 항원을 화학적 결합을 통해 노출시켜야 한다. 그러나, 입자 표면에 암 특이적 항원을 고밀도로 균일하게 노출시키는 부분에 있어서 아직까지 한계가 있는 실정이다.
암 면역 치료는 종래의 항암 치료방법과 비교하여 환자의 면역체계를 이용하기 때문에 부작용이 낮고, 면역 기억 형성으로 치료 효과가 장기간 지속될 수 있으며, 종양 항원 특이적 인식 원리에 의해 일반 세포에는 영향력이 낮아 부작용이 거의 없는 장점이 있다. 또한 최근 재발성 혹은 항암제 저항성을 갖는 암 환자들에 대한 임상 성공사례들로 인해 암 면역치료는 사이언스지(Science)가 Breakthrough of the year 2013으로 선정할 만큼 폭발적인 주목을 받고 있다.
Christopher M. Jewell, et al., Insitu engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles, PNAS September 20, 2011, 108 (38),15745015750.
본 발명은 인간 트랜스페린 수용체에 대해 높은 결합력을 갖는 신규 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 질환 항원을 수지상 세포에 효과적으로 제시될 수 있도록 하는 신규 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 위의 신규 단백질을 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 위의 신규 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어지고, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족하는 단백질을 제공한다:
[수학식 1]
K ≤ 125 nM
(식 중, K = [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 상기 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 상기 인간 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
본 발명의 단백질은 K ≤ 100nM 일 수 있다.
본 발명의 단백질은 K ≤ 50nM 일 수 있다.
본 발명의 단백질은 K ≤ 30nM 일 수 있다.
본 발명의 단백질은 K ≤ 20nM 일 수 있다.
본 발명에서 상기 질환 항원 에피토프는 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4 및 신생항원(neoantigen)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 페리틴 단량체는 인간 페리틴 중쇄로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 단백질은 페리틴 단량체 24개가 자기 조립된 구형 형상일 수 있다.
본 발명에서 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합될 수 있다.
본 발명에서 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본 발명에서 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합될 수 있다.
본 발명에서 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합될 수 있다.
본 발명에서 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 헬릭스 중 적어도 하나의 내부에 융합될 수 있다.
본 발명에서 질환 항원 에피토프는 아미노산의 길이가 25aa 이하일 수 있다.
본 발명의 단백질은 대장균 생산 시스템에서 40% 이상이 수용성 분획으로 존재할 수 있다.
본 발명의 질환 항원 에피토프는 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양으로 이루지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 흑색종, 폐암, 대장암, 간암, 교모세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 담낭암, 췌장암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사 제형일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단백질을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법으로 흑색종, 폐암, 대장암, 간암, 교모세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 담낭암, 췌장암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 치료할 수 있다.
본 발명의 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 우수하다.
본 발명의 단백질은 융합된 항원 에피토프를 항원 제시 세포에 제공하여 해당 항원에 대한 면역 작용을 유발한다.
본 발명의 단백질은 다양한 위치에 다양한 길이의 항원 에피토프를 융합시킬 수 있다.
본 발명의 단백질은 질환 항원이 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 대략 구형의 형상을 갖는다.
본 발명의 단백질은 나노 입자이다. 항체 등에 비해 크기가 현저히 작다.
본 발명의 단백질은 대장균 등의 미생물을 통해 쉽게 생산 가능하고 높은 비율의 soluble form으로 얻어진다.
본 발명의 단백질은 면역 항암제로 활용될 수 있다.
본 발명의 단백질에 질환 항원을 융합시키면 그 질환의 치료에 필요한 면역 반응을 유발시킬 수 있다.
도 1의 A는 종양 항원이 발현된 본 발명의 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이며 B는 제조된 단백질의 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 gp100-huHF 나노입자 표면의 종양 항원과 트랜스페린 수용체(TfR)와의 결합 위치를 표시한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 gp100-huHF 단백질의 TEM 이미지와 DLS 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 gp100-huHF 단백질과 트랜스페린 수용체(TfR)과의 결합능을 측정한 결과이다.
도 5는 PD-L1과 결합 가능한 PD1 도메인이 삽입된 면역관문억제제 (huHF-PD1 단백질)를 제조하기 위한 발현 벡터의 모식도; gp100-huHF 단백질의 구조; 본 발명의 gp100-huHF 단백질의 TEM 이미지; 본 발명의 gp100-huHF 단백질의 직경 분포도; 및 huHF-PD1 단백질과 PD1 리간드(PD-L1), huHF-TPP1(AB loop, CD loop) 및 αPD-L1 HCDR3(CD loop, C-말단)와의 결합능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 단백질의 수지상 세포에 의한 cellular uptake 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 huHF 단백질과 huHF-PD1 단백질의 암 세포 CT-26 및 B16F10에 대한 타겟팅 효율을 형광 이미지를 통해 비교한 결과이고; 도 7b는 huHF 단백질과 huHF-αPD-L1 HCDR3(CD loop, C-말단)의 CT-26 세포에 대한 타겟팅 효율을 형광 이미지를 통해 비교한 것이며; 도 7c는 huHF 단백질과 huHF-TPP1, huHF-smPD1의 CT-26 세포에 대한 타겟팅 효율을 형광 이미지를 통해 비교한 것이다.
도 8은 gp100-huHF의 림프절로의 전달 효율을 확인한 결과이다.
도 9는 huHF, PD-L1 항체 및 huHF-PD1 단백질의 암 세포 CT-26에 대한 암 타겟팅 효율을 비교한 결과이다. 상대 형광 강도의 각 장기에서의 막대 그래프에서 왼쪽부터 huHF, α-PD-L1, PD1-huHF의 결과이다.
도 10은 gp100-huHF 단백질에서 gp100의 삽입 위치에 따른 면역 효율을 비교한 결과이다. 각 그룹의 막대 그래프에서 왼쪽이 without gp100, 오른쪽이 with gp100의 결과이다.
도 11의 A는 OVA-huHF 단백질이 항원 제시 세포의 OVA 펩타이드 항원 제시를 증가시킬 수 있는지를 FACS(flow cytometry)를 통해 확인한 결과이고, B는 상기 단백질의 DC maturation marker 발현 정도를 확인한 결과이다. B의 각 그룹의 막대 그래프에서 왼쪽부터 MHC-II, CD80, CD40, CD86의 결과이다.
도 12는 gp100-huHF 단백질의 종양 항원 억제능을 확인하기 위한 실험 방법의 모식도와 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 huHF-PD1 단백질의 CT26(대장암 세포)와 B16F10(흑색종 세포)에서의 종양 형성 억제 효과를 동물 모델에서 확인하기 위한 실험 방법의 모식도와 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 huHF-PD1 단백질과 gp100-huHF 및 AH1-huHF 단백질의 병용 치료 효과로 인한 CT26(대장암 세포)와 B16F10(흑색종 세포)에서의 종양 형성 억제 효과를 동물 모델에서 확인하기 위한 실험 방법의 모식도와 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 15의 A는 PD-L1 항체와 huHF-PD1 단백질의 암 세포 CT26 및 B16F10에서의 T-세포 매개 세포사멸 효율을 비교한 것이고; B는 PD-L1 항체와 huHF-PD1 단백질의 암 세포 CT26 및 B16F10에서의 T-세포 활성 반응을 비교한 것이며; C는 AH1-huHF 단백질, gp100-huHF 단백질 및 huHF-PD1의 병용 치료에 의해 각각 종양 항원에 대한 T-세포 활성 반응을 나타낸 것이다.
도 16은 기존 항체 치료제와의 면역 부작용 유발을 확인한 결과이다.
도 17은 AH1-huHF 단백질 및/또는 huHF-PD1 단백질의 처리에 따른 CT26(대장암 세포)에서의 종양 재발 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 huHF-PD1 단백질의 종양 rechallenge 후 종양 형성 억제 유도를 위한 T 세포 활성을 측정하기 위하여 실험군 쥐들의 체내에서 T 세포들을 추출하여 검증한 결과이다. 왼쪽부터 PBS, AH1-huHF, α-PD-L1, PD1-huHF, AH1-huHF + α-PD-L1, AH1-huHF + PD1-huHF의 결과이다.
도 19는 NA-gp100-huHF, 도 20은 EC-gp100-huHF, 도 21은 Din-gp100-huHF, 도 22는 Ein0gp100-huHF, 도 23은 msmPD1-huHF의 각 제조를 위한 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조를 확인한 것이다.
도 24는 PD1-huHF의 종양 억제능을 확인한 것이다.
도 25는 huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker의 종양 억제능 평가를 위한 스케쥴이다.
도 26 및 27은 huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker의 종양 억제능 평가 결과이다.
도 28 및 29는 huHF-α-PD-L1 HCDR3의 페리틴 단량체의 결합 위치에 따른 타겟팅능을 평가한 것이다.
도 30은 huHF-αPD-L1 HCDR3의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
도 31은 huHF-αPD1 HCDR3의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
도 32는 huHF-αCTLA4 HCDR3의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
도 33은 huHF-αTIGIT HCDR3의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
도 34는 huHF-αLAG3 HCDR3의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
도 35는 huHF-αTIM3 HCDR3의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
도 36은 huHF-αPD-L1-αTIGIT의 벡터 모식도 및 그 단백질의 제조 및 자가 조립 여부를 확인한 것이다.
본 발명은 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어지고 트랜스페린 수용체에 결합하는 단백질에 관한 것이다.
페리틴(Ferritin)은 인간, 동물 및 미생물 유래의 페리틴일 수 있다.
인간 페리틴은 중쇄(heavy chain, 21 kDa)와 경쇄(light chain, 19 kDa)로 구성되며, 상기 페리틴을 이루고 있는 단량체의 자가조립 능력을 통해 구형의 나노입자를 형성하는 특성을 나타낸다. 페리틴은 24개의 단량체가 모여 구 형상의 입체 구조를 갖는 자기조립체를 형성할 수 있다.
인간 페리틴의 경우 외경은 약 12 nm이고 내경은 약 8 nm이다. 페리틴 단량체의 구조는 5개의 α-헬릭스 구조, 즉 A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스 및 E 헬릭스가 순차적으로 연결된 형태이며, 루프(loop)라 불리는 각각의 α-헬릭스 구조의 폴리펩타이드를 연결하는 비정형 폴리펩타이드 부분을 포함한다.
루프는 페리틴에 펩타이드 또는 작은 단백질 항원 등이 삽입되더라도 구조적으로 망가지지 않는 지역(region)이다. 여기에 펩타이드를 클로닝을 이용하여 융합시킴으로써 페리틴의 단량체에 에피토프 등의 펩타이드가 위치한 펩타이드-페리틴 융합 단백질 단량체를 제조할 수 있다. A 헬릭스와 B 헬릭스를 연결하는 루프를 A-B루프, B 헬릭스와 C 헬릭스를 연결하는 루프를 B-C루프, C 헬릭스와 D 헬릭스를 연결하는 루프를 C-D루프, D 헬릭스와 E 헬릭스를 연결하는 루프를 D-E루프라 한다.
페리틴의 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank Accession No. NM_000146, NM_002032 등).
페리틴은 페리틴 중쇄일 수 있으며, 구체적으로, 인간 페리틴 중쇄일 수 있다. 상기 인간 페리틴 중쇄는 사람으로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질일 수 있으며, 본 명세서에서 서열번호 1의 페리틴은 '인간 페리틴 중쇄' 또는 'huHF'와 혼용되어 사용될 수 있다.
질환 항원은 면역 반응에 의해 예방, 치료, 완화 또는 개선될 수 있는 모든 질환의 항원일 수 있다. 예를 들면 질환 항원은 암세포, 병원체 세포 또는 병원체에 감염된 세포의 세포 표면 항원일 수 있다. 질환 항원의 항원 특이성을 결정하는 특정 부위가 질환 항원 에피토프이다.
질환은 예컨대 암 또는 감염성 질환이다.
암은 예컨대 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양으로 이루진 군에서 선택된 것이다.
감염성 질환은 예를 들면 바이러스, 세균, 진균, 기생충 또는 프리온 감염증일 수 있다.
암 항원 에피토프는 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4 또는 신생항원(neoantigen)일 수 있다.
신생항원은 종양세포 내의 체성 돌연변이에 의해 유도되어 형성되는 면역원성 펩타이드를 의미한다. 신생항원은 MHC I과 복합체를 형성하고 종양세포의 표면으로 이동하여 항원 에피토프로 표시될 수 있는데, T-세포의 수용기(T-cell receptor, TCR)가 신생항원-MHCI 복합체를 인식하여 면역반응을 유도한다.
질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체에 융합될 수 있는 것이면 그 길이가 특정의 것으로 한정되지 않는다.
질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체가 자기조립되는데 방해가 되지 않는 것이면 그 길이가 특정의 것으로 한정되지 않는다.
질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체 어느 곳에도 융합될 수 있다. 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체가 자기조립되는데 방해가 되지 않는 위치에 융합된다. 질환 항원 에피토프는 인간 트랜스페린 수용체와의 결합을 위해 단백질 표면에 노출되도록 페리틴 단량체에 융합되는 것이 바람직하다.
질환 항원 에피토프는 예컨대 그 아미노산의 길이가 25aa 이하, 24aa 이하, 23aa 이하, 22aa 이하, 21aa 이하, 20aa 이하, 19aa 이하, 18aa 이하, 17aa 이하, 16aa 이하, 15aa 이하, 14aa 이하, 13aa 이하, 12aa 이하, 11aa 이하, 10aa 이하, 9aa 이하, 8aa 이하, 7aa 이하, 6aa 이하, 5aa 이하일 수 있다.
질환 항원 에피토프는 예컨대 그 아미노산의 길이가 3aa 이상, 4aa 이상, 5aa 이상, 6aa 이상, 7aa 이상, 8aa 이상, 9aa 이상, 10aa 이상일 수 있다.
페리틴 단량체에 질환 항원 에피토프가 융합됨으로써 페리틴 단량체가 자기조립된 단백질의 인간 트랜스페린 수용체와의 결합력이 향상될 수 있다. 페리틴 단량체의 각 구성 부분 중 내부로 함입되어 있는 부분이 질환 항원 에피토프의 결합 후에 외부로 돌출될 수 있다.
질환 항원 에피토프의 페린틴 단량체에서의 융합 위치는 특정한 위치로 제한되지 않으며, 예컨대 인접한 α-헬릭스들 사이, N-말단, C-말단, A-B루프, B-C루프, C-D루프, D-E루프, N-말단과 A 헬릭스 사이, E 헬릭스와 C-말단 사이, 헬릭스 내부 등에 융합될 수 있다.
질환 항원 에피토프는 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합될 수 있다. 또한, 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 또한, 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합될 수 있다. 또한, 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합될 수 있다. 또한, 질환 항원 에피토프는 페리틴 단량체의 각 헬릭스 중 적어도 하나의 내부에 융합될 수 있다.
본 발명의 단백질은 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어진 것이다.
페리틴은 그 단량체 수 개가 모였을 때, 이들이 스스로 조직적인 구조 또는 패턴을 형성하여 집합체를 형성하는 자기 조립형 단백질로서, 별도의 조작 없이도 나노 스케일의 단백질의 형성이 가능하다.
본 발명에 따른 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체도 자가 조립된 단백질 형태를 이룬다. 예컨대 24개의 페리린 단량체가 자기조립되어 구형의 입자를 형성할 수 있다.
본 발명 단백질이 입자를 이루는 경우, 그 입경은 예를 들면 8 내지 50nm일 수 있다. 구체적으로, 8nm 내지 50nm, 8nm 내지 45nm, 8nm 내지 40nm, 8nm 내지 35nmm, 8nm 내지 30nm, 8nm 내지 25nm, 8nm 내지 20nm, 8nm 내지 15nm 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단백질은 항원 제시 세포인 수지상 세포의 표면에 존재하는 트랜스페린 수용체(transferrin receptor 1, TfR)와의 결합능이 있다. 이에 의해 융합된 항원 에피토프의 항원이 제시되고, 면역계가 해당 항원을 인식하여 면역 반응을 수행할 수 있도록 한다.
본 발명의 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족할 수 있다:
[수학식 1]
K ≤ 125 nM
(식 중, K = [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 상기 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 상기 인간 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
본 발명의 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 125nM 이하, 120nM 이하, 110nM 이하, 100nM 이하, 90nM 이하, 80nM 이하, 70nM 이하, 60nM 이하, 50nM 이하, 40nM 이하, 30nM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하 등일 수 있다. 수학식 1의 농도값이 작을수록 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 높음을 의미한다.
본 발명의 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 1nM 이상, 2nM 이상, 3nM 이상, 4nM 이상, 5nM 이상일 수 있다.
인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)은 본원의 단백질과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서 측정된다. 평형 상태에서의 본원의 단백질의 농도([P]), 인간 트랜스페린 수용체의 농도([T]) 및 본원의 단백질과 인간 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도([PT])는 공지된 다양한 방법으로 측정될 수 있다.
인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)은 예컨대 MST(Microscale Thermophoresis) 방법에 따라 측정될 수 있다. MST 측정 장치로는 Monolith NT.115가 있다.
수학식 1의 농도는 다음 수학식 2 및 3을 활용하여 얻어진 것일 수 있다.
[수학식 2]
[PT]= 1/2 x (([P0]+[A0]+[P][T]/[PT])-(([P0]+[T0]+ ([P][T]/[PT])2)-4 x [P0] x [T0])1/2)
(식 중, [PT]는 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체의 복합체의 반응 평행 상태에서의 농도, P0는 상기 단백질의 최초 농도, T0는 인간 트랜스페린 수용체의 최초 농도, [P]는 상기 단백질의 반응 평행 상태에서의 농도, [T]는 상기 인간 트랜스페린 수용체의 반응 평행 상태에서의 농도를 각각 나타냄).
[수학식 3]
X= [PT]/[P0]
(식 중, [PT]는 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체의 복합체의 반응 평행 상태에서의 농도, P0는 상기 단백질의 최초 농도이고, X는 상기 단백질 중 트랜스페린 수용체와 복합체를 이룬 단백질의 비율임).
본 발명의 단백질은 해당 단백질을 코딩하는 서열을 발현하는 미생물 내에서 제조되는 것일 수 있다.
미생물은 당 분야에 공지된 미생물이 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들면 대장균일 수 있고, 구체적으로는 BL21(DE3) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
미생물 시스템으로 단백질을 제조하는 경우에 얻어지는 단백질이 세포질에 용해된 상태로 존재해야 분리/정제가 용이하다. 많은 경우 제조된 단백질이 봉입체(inclusion body) 등으로 응집된 상태로 존재한다. 본 발명의 단백질은 미생물 생산 시스템에서 세포질에 용해된 비율이 높게 나타난다. 분리/정제 및 활용이 용이하다.
본 발명의 단백질은 예를 들면 이를 제조하는 대장균 시스템에서 전체 단백질 중 수용성 분획비율이 40% 이상인 상태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상일 수 있다. 그 상한은 예를 들면 100%, 99%, 98%, 97%, 96% 등일 수 있다.
본 발명의 단백질은 인간 페리틴 중쇄 단백질과 질환 항원 에피토프 사이에 링커 펩타이드가 추가로 포함된 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 에피토프에 유연성을 부여하여 단백질의 표면 표출성을 높이기 위한 서열이면 제한이 없으나, 예컨대 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
링커 펩타이드는 질환 항원 에피토프 간의 적절한 공간을 확보해줄 수 있는 길이를 가질 수 있다. 예컨대, 링커 펩타이드는 1 내지 20개, 3 내지 18개, 4 내지 15개, 8 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 링커 펩타이드의 길이 및/또는 아미노산 조성을 조절하여 질환 항원 에피토프 간의 간격 및 배향을 조절할 수 있다.
본 발명은 이상의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이상의 단백질에 관하여 설명된 사항은 모두 본원의 약학 조성물의 유효성분으로서의 단백질에 그대로 적용된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, “약학적으로 허용 가능한 담체”란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리 식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 또는 활택제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 주사 제형일 수 있으며, 정맥내 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “유효량”은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나, 전적으로 증진시키는데 필요한 양을 의미한다.
본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 약학적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적인 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서가 수반될 수 있으며, 상기 지시서는 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 관하여 사익 기관의 승인을 나타내고 있고, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이상의 단백질과 함께, 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질(면역관문억제제)을 더 포함할 수 있다.
면역 반응을 위해 암세포를 제거하기 위해서는 T세포가 항원제시세포에 올려진 암세포의 항원을 인식하여 활성화되어야 하는데, 면역 관문 분자(Immune checkpoint)는 T 세포에 결합하여 T세포를 불활성화시키는 역할을 한다.
이러한 면역 관문 분자는 예를 들면 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1, NTRK2 등일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 예를 들면 면역 관문 분자에 대한 리간드 또는 상기 리간드의 면역 관문 분자와의 결합 도메인을 포함하는 단편일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 예를 들면 면역 관문 분자에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체에 융합될 수 있는 것이면 그 길이가 특정의 것으로 한정되지 않는다. 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체가 자기조립되는데 방해가 되지 않는 것이면 그 길이가 특정의 것으로 한정되지 않는다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 인간 트랜스페린 수용체와의 결합을 위해 단백질 표면에 노출되도록 페리틴 단량체에 융합되는 것이 바람직하다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체에 융합된 것으로서, 그 융합 위치는 제한되지 않으며, 예를 들면 인접한 α-헬릭스들 사이, N-말단, C-말단, A-B루프, B-C루프, C-D루프, D-E루프, N-말단과 A 헬릭스 사이, E 헬릭스와 C-말단 사이, 헬릭스 내부 등에 융합될 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합될 수 있다. 또한 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 또한 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합될 수 있다. 또한 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합될 수 있다. 또한 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 각 헬릭스 중 적어도 하나의 내부에 융합될 수 있다.
면역 관문 억제제는 면역 관문 분자와 결합해야 하므로, 트랜스페린 수용체에 대한 결합력은 낮은 것이 바람직하다. 트랜스페린 수용체는 예를 들면 인간 트랜스페린 수용체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
면역 관문 억제제에서 트랜스페린 수용체와의 결합력을 낮추기 위해, 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴의 트랜스페린 수용체에 대한 결합에 관여하는 부위에 융합된 것일 수 있다.
또한, 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질에서 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합에 관여하는 부위가 돌연변이 된 것일 수 잇다.
페리틴 단량체에서 트랜스페린 수용체에 결합에 관여하는 부위가 있는데, 상기 페리틴 단량체는 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 저하되도록 해당 부위가 돌연변이 된 것일 수 있다.
서열번호 1의 서열을 사용하는 경우의 구체적인 예를 들자면, 서열번호 1의 서열에서 14번, 15번, 22번, 81번 및 83번으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이 다른 아미노산으로 치환 돌연변이된 것일 수 있다. 치환되는 아미노산은 예를 들면 알라닌, 글라이신, 발린, 류신 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 이상의 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 이상의 단백질에 관하여 설명된 사항은 모두 본원의 암의 치료 방법의 유효성분으로서의 단백질에 그대로 적용된다.
본 발명의 방법은 암에 걸린 개체에 상기 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
암에 걸린 개체는 암에 걸린 동물, 구체적으로 암에 걸린 포유류일 수 있고, 보다 구체적으로는 암에 걸린 인간일 수 있다.
단백질은 치료상 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 상기 개체에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
면역 관문 분자 및 이와 결합 가능한 분자는 전술한 범위 내의 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질은 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어진 단백질과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
순차적으로 투여되는 경우에 그 순서는 제한되지 않으며, 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어진 단백질의 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 후보 단백질의 합성을 위한 발현 벡터 제조
huHF는 24개의 단량체로 구성된 구형 단백질(12 nm)로서 각 단량체는 총 5개의 α-helix로 구성되어 있다. 본 발명자는 huHF 단량체의 각 α-helix 사이 loop(PDB 3AJO sequence 기준 huHF 5T 내지 176G 중 AB loop; 45D/46V 사이, BC loop; 92D/93W, CD loop; 126D/127P, DE loop; 162E/163S)와 N-말단 및 C-말단에 실제 종양항원 중 하나인 gp100 펩타이드를 유전자 클로닝을 통해 삽입하여 huHF의 다양한 위치에 gp100 펩타이드가 삽입된 전달체를 확보하였다(도 1 및 도 2). 본 발명자는 이전 연구(US 등록특허 10,206,987)를 통해 감시림프절 표적 효율이 가장 좋은 huHF 나노입자의 표면 구성을 암 특이 항원 전달 나노입자로 선정한 바 있다.
이에, 하기 표 1의 후보 단백질을 하기 표 2의 벡터 모식도에 따라 PCR을 수행하여 단백질 huHF, huHF-gp100(서열번호 2; melanoma 특이항원), OVA(서열번호 3), AH1(서열번호 4) (AB; 45D/46V, BC; 92D/93W, CD; 126D/127P, DE; 162E/163S, N-말단, C-말단), huHF-PD1(서열번호 5; PD1 도메인 중 활성부위), huHF-TPP1(서열번호 6) (AB, CD loop), huHF-αPD-L1 HCDR3(서열번호 7) (CD loop, C-말단) 및 huHF-smPD1(서열번호 8) 입자를 제작하였다. 이때, 상기 OVA은 면역 특이 항원이며, AH1은 대장암 세포의 종양 특이 항원, gp100은 흑색종 세포의 종양 특이 항원으로 사용하였다. 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 아가로스 젤에서 정제한 다음, 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.
구체적으로, 표 3의 프라이머 세트를 이용하여 각각의 발현 벡터 제조에 필요한 PCR 산물을 순차적으로 플라스미드 pT7-7 벡터에 삽입하여 각각의 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다. 이때 추가로 하기 표 4의 링커 펩타이드를 포함할 수 있다.
서열번호 후보 단백질
2 Gp100
3 Ovalbumin
4 AH1
5 PD1
6 TPP1
7 αPD-L1 HCDR3
8 smPD1 (small PD1 domain)
9 RFP
단백질 발현 벡터
huHF NH2-NdeI-(His)6-huHF-HindIII-COOH
[gp100/AH1/OVA]-huHF loops AB(45D/46V), BC(92D/93W), CD(126D/127P), DE(162E/163S):NH2-NdeI-(His)6-huHF-[gp100(KVPRNQDWL)/OVA(SIINFEKL)/AH1(SPSYVYHQF)]-huHF-HindIII-COOH
N-말단: NH2-NdeI-(His)6-[gp100(KVPRNQDWL)/OVA(SIINFEKL)/AH1(SPSYVYHQF)]-huHF-HindIII-COOH
C-말단: NH2-NdeI-(His)6-huHF-[gp100(KVPRNQDWL)/OVA(SIINFEKL)/AH1(SPSYVYHQF)]-HindIII-COOH
N-말단과 A helix 사이(6S/7Q), D helix 중간(156R/157K), E helix 중간(173H/174T), E helix와 C-말단 사이(178S/179D)
NH2-NdeI-(His)6-[gp100(KVPRNQDWL)]-huHF-HindIII-COOH
huHF-PD1 NH2-NdeI-huHF-PD1(22-170)-HindIII-COOH
huHF-TPP1 (AB, CD loop) NH2-NdeI-huHF-linker-TPP1-linker-HindIII-COOH
huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD
loop, C-말단)		 NH2-NdeI-huHF-αPD-L1 HCDR3-HindIII-COOH
huHF-smPD1 NH2-NdeI-huHF-smPD1-HindIII-COOH
huHF-RFP NH2-NdeI-(His)6-huHF-Xho1-linker(G3SG3TG3SG3T)-RFP-HindIII-COOH
서열번호 명칭 삽입부위
10 N-gp100_F N-말단
11 N-gp100_R
12 AB-gp100_F AB loop
13 AB-gp100_R
14 BC-gp100_F BC loop
15 BC-gp100_R
16 CD-gp100_F CD loop
17 CD-gp100_R
18 DE-gp100_F DE loop
19 DE-gp100_R1
20 DE-gp100_R2
21 DE-gp100_R3
22 C-gp100_F C-말단
23 C-gp100_R
24 NA-gp100_F_1 N-말단과 A-helix 사이
25 NA-gp100_F_2
26 NA-gp100_F_3
27 NA-gp100_R
28 intD-gp100_F D helix 중간
29 intD-gp100_R_1
30 intD-gp100_R_2
31 intE-gp100_F E helix 중간
32 intE-gp100_R_1
33 intE-gp100_R_2
34 EC-gp100_F E-helix와 C-말단 사이
35 EC-gp100_R
서열번호 명칭
36 Linker1
37 Linker2
38 Linker3
2. 후보 단백질의 생합성
대장균 균주 BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]를 상기 제조된 발현벡터로 각각 형질 전환하고, 앰피실린-저항성 형질 전환체를 선택하였다. 형질 전환된 대장균을 50 mL의 Luria-Bertani (LB) 배지(100 mg L-1앰피실린 함유)를 함유하는 플라스크(250 mL Erlenmeyer flasks, 37 ℃, 150 rpm)에서 배양하였다. 배지 탁도(O.D600)가 약 0.5-0.7에 도달할 때, IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid) (1.0 mM)을 주입하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다.
20 ℃에서 16~18 시간 배양한 후, 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수하고 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 추후 실험에 이용하였다.
3. 후보 단백질의 정제 및 형광물질 부착
상기 실시예 2에서 획득한 상등액을 3단계의 과정을 거쳐 정제하였다. 먼저 1) 재조합 단백질에 융합된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 진행한 후, 2) 재조합 단백질을 농축하고 버퍼 교환을 통하여 형광물질을 부착하였으며, 3) 마지막으로 형광물질이 부착된 자가 조립된 단백질만을 분리하기 위하여 수크로스 구배 초원심분리(ultracentifugation)를 진행하였다. 각 단계별 상세한 기재는 아래와 같다.
1) Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피
재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 5 mL 라이시스 버퍼(pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다 (세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300mM NaCl, 200 mM imidazole).
2) 농축과 버퍼교환 및 형광물질 부착과정
이미징을 위하여 huHF-gp100 입자들과 huHF-PD1 입자는 Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 거쳐 용출된 3ml의 재조합 단백질을 Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) 에 담아 5,000 g로 컬럼 위에 1ml 의 용액이 남을 때까지 5,000 g 로 원심 분리를 진행하였다. 그 후에 NIR 형광 물질인 cy5.5및 FITC(플루오레세인이소티오시안산염)를 부착하기 위하여 단백질 입자를 sodium bicarbonate (0.1 M, pH 8.5) 버퍼로 버퍼교환을 해주었고, 상온에서 12시간 형광물질을 부착하였다.
3) 수크로스 구배 초고속 원심 분리
PBS(2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 2 mM KH2PO4, 10mM Na2HPO4, pH7.4) 버퍼에 수크로스를 농도별로 각각 첨가하여 40%, 35%, 30%, 25%, 20%의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비한 후 초고속 원심 분리용 튜브 (ultraclear 13.2ml tube, Beckman)에 각 농도별 (45~20%) 수크로스 용액을 농도가 높은 용액부터 2 ml씩 담은 다음, 준비된 자가조립용 버퍼에 존재하는 재조합 단백질 용액을 1ml 채운 후 35,000rpm으로 16시간 동안 4℃로 초고속 원심 분리를 시행하였다(Ultracentrifuge L-90k, Beckman). 원심 분리 후 조심스럽게 파이펫을 이용하여 위 층 (20-25% 수크로스 용액 부분)을 2)에 명시된 바와 같이 ultracentrifugal filter와 PBS 버퍼를 이용하여 재조합 단백질의 버퍼를 교체해 주었다.
4. 단백질 입자의 조립 검증
실시예 3에서 제작한 각각의 단백질(gp100-huHF-loops, huHF-PD1, huHF-TPP1, huHF-αPD-L1 HCDR3, huHF-smPD1)의 정제된 재조합 단백질의 구조 분석을 위하여 투과전자현미경 (TEM) 재조합 단백질을 촬영하였다. 먼저 염색하지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids) 올린 후 자연 건조하였다. 단백질의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 단백질 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과, 각각의 입자들이 구형 나노입자를 형성함을 확인하였다(도 3 및 도 5). 또한 DLS (dynamic light scattering) 측정을 통하여 각 gp100-huHF-loops, huHF-PD1, huHF-TPP1 (AB, CD loops), huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loop, C-말단), huHF-smPD1입자들의 직경을 솔루션상에서 측정하였다(도 3 및 도 5).
5. OVA-huHF-loops 단백질과 TfR과의 결합능 측정 및 huHF-PD1, huHF-TPP1 (AB, CD loops), huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loop, C-말단), huHF-smPD1 단백질과 PD-L1의 결합능 측정
본 연구진은 huHF 전달체의 면역세포 활성증진 효능을 증명하기 위하여 실시예 3에서 제작한 각각의 단백질(gp100-huHF-loops)의 정제된 재조합 단백질과 TfR(transferrin receptor)과의 결합능을 MST(Microscale Thermophoresis) 기계를 통하여 측정하였다. 그 결과 종양항원이 들어있지 않은 huHF 나노입자가 가장 TfR과의 결합능이 뛰어났으며, CD helix 사이에 종양항원이 삽입된 CD-loop-gp100 나노입자의 결합능이 그 다음으로 뛰어남을 확인하였다. 이를 통하여 CD-loop-gp100 입자가 가장 TfR과의 결합을 방해하지 않음을 간접적으로 확인하였다(도 4).
Programmed cell death protein 1 (PD-1)은 T-세포의 표면에 있는 단백질로써, 암 세포의 표면에 발현되는 PD-L1과 결합하여 T-세포의 활성 저하를 유도한다. 따라서 암 세포 표면에 발현되는 PD-L1과 결합할 PD-1의 결합 부위가 표면 표출된 단백질을 이용하여 T 세포의 PD-1과 PD-L1의 결합 억제를 유도할 경우, T-세포 활성 억제 저하를 통해 항암면역 치료 효율 증가를 기대할 수 있다. 본 발명자들이 개발하고자 했던 PD-1, CTLA-4 항체 작용 부위를 단백질 표면에 표출시키는 것보다, PD-L1과 결합하는 PD-1의 결합 부위를 단백질의 표면에 표출시켜 자가조립을 유도하는 것이 단백질 발현량 측면에서 효율적이라고 판단하여 PD-1의 PD-L1 결합 부위를 huHF에 합성하였다(PD-1 sequence 중 결합 활성 부위 22G-170V), PD-L1 타겟팅 능 펩타이드 TPP1, PD-L1 항체의 HCDR3 시퀀스, PD-L1의 결합 활성 부위 (small PD1 도메인)).
나노입자의 유전자 클로닝을 진행한 후 이를 발현하여 단백질 자가조립을 통하여 입자 합성을 유도하였다. 이는 TEM image를 통하여 확인하고, 실제 합성한 huHF-PD1 단백질이 PD-1 ligand (PD-L1)과 실제 결합을 하는지 확인하기 위해 실시예 3에서 제작한 huHF-PD1 단백질과 PD-L1의 결합능(binding affinity; Kd)을 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다. 2 ug/ml 농도로 PDL1 재조합 단백질을 96-well plate 에 16-18 시간 동안 바인딩 한 후, 현재 사용되고 있는 면역 항체 치료제인 PD-L1 항체 및 huHF-PD1 단백질과 PD-L1의 결합능을 Langmuir equation을 이용하여 계산하였다.
결합능 측정 결과, huHF-PD1과 재조합 단백질 PD-L1의 Kd값이 PD1-PDL1 결합 affinity 문헌 값인 770 nM 보다 높은 327.59 nM로 측정되었고, 이는 PD-L1과 PD-L1 항체의 Kd값인 255.10 nM과 유사했다. 이를 통하여 PD-1 결합 도메인을 huHF 표면 위에 표출시켜 만든 단백질이 PD-L1과의 결합능을 가짐을 확인하였다(도 5).
추가적으로, 실제 합성한 huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loop, C 말단) 단백질과 PD-L1과의 결합능 또한 ELISA 기법으로 측정하였고, huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loop) 입자는 71.24 nM, huHF-αPD-L1 HCDR3 (C 말단) 입자는 38.43 nM로 각각 측정되어, 이 단백질들 또한 PD-L1과의 결합능을 가짐을 확인하였다. (도 5)
추가적으로, 실제 합성한 huHF-TPP1 (AB, CD loops) 단백질이 PD-1 ligand (PD-L1)과 실제 결합을 하는지 확인하기 위해 실시예 3에서 제작한 huHF-TPP1 단백질과 PD-L1의 결합능(binding affinity; Kd)을 MST(Microscale Thermophoresis) 기계를 통하여 측정하였다.
측정 결과, huHF-TPP1 (AB loop)의 PD-L1과의 Kd값은 72.105 nM, huHF-TPP1 (CD loop)의 PD-L1과의 Kd값은 115.16 nM, huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loop)의 Kd값은 71.24 nM, huHF-αPD-L1 HCDR3 (C-말단)의 Kd 값은 38.43 nM로 측정되었다(도 5).
6. gp100-huHF-loops 단백질의 수지상 세포 uptake 실험과 huHF, huHF-PD1, huHF-TPP1 (AB, CD loops), huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loop, C-말단), huHF-smPD1 PDL1 항체 치료제의 대장암 세포 타겟팅능 검증
실시예 3에서 제작한 형광물질이 부착된 gp100-huHF-loops 각 단백질들과 huHF 단백질의 수지상 세포 uptake 효율을 비교하였다.
각 나노입자를 300 nM로 30분 동안 수지상 세포에 반응시킨 후, 형광 시그널을 confocal (LSM 700) 기계를 통하여 측정하였다. CD helix 사이에 종양항원이 삽입된 CD-loop-gp100 단백질의 결합능이 huHF 자체의 단백질 다음으로 뛰어남을 확인하였다. 이를 통하여 CD-loop-gp100 단백질이 가장 TfR과의 결합을 방해하지 않음을 또한 간접적으로 확인하였다(도 6).
실시예 3에서 제작한 형광물질이 부착된 huHF, huHF-PD1, huHF-TPP1 (AB, CD loops), huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loops, C-말단), huHF-smPD1 단백질의 CT26 대장암 및 B16F10흑색종에 대한 타겟팅 효율을 비교하기 위하여 CT26 대장암 세포 및 B16F10흑색종 세포에 300 nM 농도로 단백질을 반응시킨 후 형광 시그널을 비교하여 cell uptake 효율을 확인하였다. 그 결과, 도 7a 내지 도 7c에서 보는 것과 같이, 대조군인 huHF 단백질보다 huHF-PD1(도 7a), huHF-αPD-L1 HCDR3 (CD loops, C-말단)(도 7b), huHF-TPP1 (AB, CD loops)(도 7c), huHF-smPD1(도 7c) 단백질이 암 세포와 결합하여 형광 시그널을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 20분동안 암 세포 표면에 발현된 PD-L1을 마스킹 할 수 있는 PD-L1 항체를 처리한 후 huHF단백질, huHF-PD1단백질, 및 huHF-αPD-L1 HCDR3 단백질, huHF-smPD1단백질을 각각 반응시켰을 때는 둘 다 결합하지 않음을 확인하였다.
7. 제조된 단백질들을 이용한 NIR 이미지 분석
위의 실험 결과들을 토대로, 상기 실시예 3에서 제작한 5가지의 단백질들을 형광도를 맞춘 후 5 주 된 누드 마우스(각 실험군당 n=3)에 주입한 후, gp100 항원 발현 종양을 피하주사법(foot pad injection)으로 주입하고, 일정 기간동안 종양의 성장 정도를 분석하여 huHF-gp100 loop 단백질들이 모두 림프절에 타겟팅 효율이 좋은지 확인하였다. 각각의 입자를 20㎕씩 쥐의 오른쪽 발에 주입을 하여 1시간 동안 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 것과 같이, AB loop, BC loop, CD loop, DE loop, N-말단, C-말단에 암 특이적 항원 펩타이드를 삽입하였을 때 모든 단백질에서 림프절에 대한 나노입자 전달효율이 좋음을 확인하였으며, 암 항원 특이적 면역 세포의 활성을 가장 증진시켰던 gp100-huHF(126 loop) 나노입자를 주입한 그룹에서 종양 성장 억제 효과가 가장 높은 것을 확인하였다.
또한, huHF-PD1 단백질이 실제 종양 세포의 표면에 도출되어 있는 PD-L1과 결합하는지를 확인하기 위해 cy5.5 형광물질을 부착한 huHF 단백질과 huHF-PD1단백질을 CT-26 대장암 세포가 자란 생쥐에 주입하여 암 타겟팅 효율을 비교하였다. 이때, 비교군으로는 실제 임상에서 사용되고 있는 PD-L1 항체 치료제를 사용하였다. 생쥐에 주입한 후 2일 동안 체내에서 입자가 종양에 타겟팅되는 양상을 Cy5.5 bandpass emission filater 및 special Cmount lens 또는 IVIS spectrum imaging system(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)로 관찰하였다(도 9; 오른쪽 하단 그래프에서 Y축은 체내 유지시간을 나타냄).
그 결과, 도 9에 나타난 것과 같이, 대조군인 huHF 단백질 보다 huHF-PD1단백질이 암 세포 타겟팅 효율이 좋음을 알 수 있었다. 그러나, 상기 결과에서는 실제 항체 치료제가 huHF-PD1 단백질보다 암 타겟팅 효율과 체내 유지시간이 좋게 보였으나, 이는 항체 치료제의 체내 유지시간이 너무 길어 나타나는 결과이며, 이는 체내 면역 부작용 문제와 직결된다. 따라서 본 발명에 따른 단백질이 부작용 효과와 부작용 측면에서 모두 다 장점이 있음을 확인하였다.
8. CD 8+ T cell assay를 통한 특정 사이토카인 분비 확인 실험
실시예 1 내지 3의 방법으로 PBS(버퍼)와 huHF-gp100 loops 단백질을 만들어 C57BL/6에 1주에 1회씩 총 3주간 백신 주입을 통하여 림프절 속 면역 세포의 면역 반응을 부스팅(boosting)한 다음, 그 면역 세포들이 모이는 비장을 적출하여 분쇄하였다. 그 후 분쇄한 비장 안에서 gp100 흑색종 특이적 항원에 의해 특이적으로 면역 반응이 유도된 CD8+ T-세포를 추출해 낸 후, in vitro 상에서 면역 반응을 일으킨다고 알려져 있는 gp100의 특정 부분 항원 펩타이드(KVPRNQDWL)를 이용하여, T-세포와 반응시켜 gp100 특이적인 사이토카인이 분비되는지 여부를 FACS 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 126-gp100-huHF 단백질을 주입한 마우스의 비장에서 추출한 CD8+ T-세포에서 사이토카인이 가장 많이 분비되는 것을 확인하였다(도10).
9. MHC-OVA presentation 확인 및 수지상 세포 표면의 costimulatory effector 발현 검증 실험
실시예 1 내지 3의 방법으로 PBS(버퍼)와 huHF-OVA loops 단백질을 만들어 C57BL/6에 1주에 1회씩 총 3주간 백신 주입을 통하여 림프절 속 면역 세포의 면역 반응을 부스팅(boosting)한 다음, 그 면역 세포들이 모이는 비장을 적출하여 분쇄하였다. 그 후 분쇄한 비장 안에서 OVA 면역 펩타이드가 MHC-I을 통하여 표면 표출된 수지상 세포(DC)를 잡는 항체를 이용하여 가장 수지상 세포 표면에 펩타이드 노출을 잘 시키는 단백질을 확인하였다.
그 결과 CD-loop에 OVA 펩타이드를 넣은 나노입자가 MHC-I위에 펩타이드 표면 표출을 가장 잘 유도하는 것을 확인하였고, 이는 면역 치료를 함에 있어서 cytotoxic T 세포의 활성을 가장 효과적으로 할 수 있음을 반증하는 결과이다.
이 실험은 FACS(flow cytometry)를 통하여 진행하였다(도 11A).
또한, huHF 단백질 자체가 면역반응 효율 증진에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 같은 입자들로 수지상 세포 표면에 표출되는 MHC-II, CD40, CD80 및 CD86의 발현율을 비교하였다.
그 결과, CD, DE, C-말단 순으로 공동 자극 작동 인자(costimulatory effector)들이 발현됨을 확인하였다(도 11B).
10. 암 성장 저해 실험 I (Vaccination; 예방)
위의 실험 결과들을 토대로, huHF, huHF-gp100 loops (10 μM) 단백질들과 그리고 PBS 버퍼만 있는 샘플을 각각 C57BL/6 마우스(n=3)에 1주일 간격으로 3번 피하주사법으로 주입한 후, 1주일 동안 면역반응이 일어나도록 시간을 둔 후, 각각의 마우스에 B16F10 세포주를 심고 암의 성장 속도를 관찰하였다.
암 세포의 크기는 하기의 식으로 계산하였다:
[수학식 4]
(tumor volume)=(major axis) X (minor axis)2 X 0.52
그 결과, huHF-CD-gp100, huHF-DE-gp100, huHF-gp100-C 말단 입자 순서대로 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다 (도 12).
11. 암 성장 저해 실험 II (치료)
본 발명자들은 상기 huHF-PD1 단백질이 실제 항체 치료제인 PD-L1 항체에 비하여 면역관문 억제를 통한 암 치료 효능이 있는지 여부를 판단하기 위하여 일정 크기의 대장암 종양(CT26)이 형성된 마우스 Balb/c를 이용하여 3일 간격으로 PBS, PD-L1 항체, huHF-PD1 단백질을 정맥 주사로 주입하였다. 관찰 결과 huHF-PD1 단백질이 항체 치료제와 유사한 종양 치료 효능을 보임을 관찰할 수 있었다(도 13).
다음으로, 제 1 단백질 (CD loop-huHF)와 제 2 단백질 (huHF-PD1)가 생체 내에서 실제 종양 성장 억제 및 병용 치료시 시너지 효과가 있는지 확인하였다. 이에, 일정 크기의 종양이 형성된 마우스에 가장 우수한 종양 성장 억제 효과를 보였던 CD-loop에 해당 암 특이적 항원 에피토프(gp100 및 AH1)가 삽입된 huHF-CD loop-gp100 및 huHF-CD loop-AH1 (10 μM) 단백질을 마우스에 3일 간격으로 피하주입법으로 주입하였고, 그와 동시에 huHF-PD1(5μM)과 대조군인 PD-L1 항체 치료제 샘플은 정맥주사 방식으로 3일 간격으로 주입하였다. huHF-CD loop-gp100 단백질을 사용한 실험은 B16F10 흑색종이 형성된 C57BL/6 마우스를 이용하였고, huHF-CD loop-AH1 단백질을 사용한 실험은 CT26 대장암이 형성된 Balb/c 마우스를 이용하였다. 각 실험들은 실험군당 5마리를 이용하였고, 암 세포의 크기는 하기의 식으로 계산하였다:
[수학식 4]
(tumor volume)=(major axis) X (minor axis)2 X 0.52
이때, 실험군은 1) 무처리군(No treat), 2) 제 1 단백질 처리군(AH1-huHF 및 gp100-huHF), 3) 항체 치료제 처리군(α-PD-L1), 4) 제 2 단백질 처리군(huHF-PD1), 5) 제 1 단백질과 항체 치료제의 병용 투여군(AH1-huHF+α-PD-L1 및 gp100-huHF+α-PD-L1) 및 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1-huHF+huHF-PD1 및 gp100-huHF+huHF-PD1)을 사용하였다.
실험 결과, 본 발명에 따른 제 1단백질(CD-loop-gp100 또는 AH1)와 제 2 단백질(huHF-PD1)를 처리한 실험군 6번의 종양 치료 효과가 가장 뛰어남을 확인하였고, 또한 각 실험군의 생존률 또한 측정하였다(도 14).
12. 암 성장 저해 확인을 위한 in vitro 면역 실험
본 발명자들은 huHF-PD1 단백질이 실제 항체 치료제인 PDL1 항체에 비하여 면역관문 억제를 통한 암 치료 효능이 있는지 여부를 판단하기 위하여, PD-L1 항체와 huHF-PD1 단백질의 암 세포와의 반응시 T-세포의 활성 반응과 암 세포의 사멸 효율을 비교하였다. 대장암 및 흑색종 암 세포에 PDL1 항체와 huHF-PD1 단백질을 처리한 후, in vitro 상에서 T-세포의 반응을 관찰하였을 때, huHF-PD1 단백질을 처리한 실험군에서 PD-L1 항체를 처리한 실험군 보다 CD8+ 세포에서 유도되는 암 세포 사멸가능 특이 사이토카인 IFN-gamma가 더 검출됨을 확인하였고, 추가적으로 암 세포 사멸율도 더 높았음을 확인하였다. 이를 통하여 huHF-PD1 단백질이 PD-L1 항체의 암 세포 치료 효능 보다 좋을 것으로 예측하였다(도 15A, B). 또한 실험군 1) 무처리군(No treat), 2) 제 1 단백질 처리군(AH1-huHF 및 gp100-huHF), 3) 항체 치료제 처리군(α-PD-L1), 4) 제 2 단백질 처리군(huHF-PD1), 5) 제 1 단백질과 항체 치료제의 병용 투여군(AH1-huHF+α-PD-L1 및 gp100-huHF+α-PD-L1) 및 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1-huHF+huHF-PD1 및 gp100-huHF+huHF-PD1)에 대한 T-세포의 활성 반응 또한 관찰하였고, 그 결과 종양성장억제 결과가 가장 좋았던 6번 실험군(AH1-huHF+huHF-PD1 및 gp100-huHF+huHF-PD1)에서 가장 T-세포의 활성이 뛰어남을 또한 확인하였다(도15 C).
13. 현재 항체치료제와 본 연구진이 개발한 대체 치료제 huHF-PD1의 면역 부작용 비교 실험
본 발명자들은 huHF-PD1 단백질이 실제 항체 치료제인 PDL1 항체에 비해 면역관문 억제를 통한 암 치료 효능이 있음과 동시에 생체내 주입시 면역 부작용 유발 정도 또한 감소됨을 증명하였다. 현재의 항체 치료제의 가장 큰 문제점은 단백질 투입시 체내 장기 축적으로 인한 면역 부작용 유발 문제이며, 이 면역 부작용을 일으키는 가장 대표적인 사이토카인은 IL-17으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 실시예 11에서 설명한 실험군 1 내지 6번의 혈액 샘플을 이용하여 IL-17 검출테스트를 진행하였다.
그 결과 항체 치료제를 사용한 실험군인 3번과 5번에서만 IL-17이 검출됨을 확인하였다. 이를 통하여 본 발명에 따른 단백질은 면역 부작용 유발이 보다 낮음을 확인하였다(도 16).
14. 암 성장 저해 실험 III (수술 후 rechallenge)
실시예 11에서 암 성장 저해실험 결과 제 1 단백질 (CD loop-huHF)와 제 2 단백질 (huHF-PD1)가 생체 내에서 실제 종양 성장 억제 및 병용 치료시 시너지 효과가 있는지 확인하였고, 이에 상기 결과를 바탕으로 수술 후에도 암이 재발하는지 여부를 보기 위하여 실험을 진행하였다. 이때, 실험군은 실시예 11과 동일하게 1) 무처리군(No treat), 2) 제 1 단백질 처리군(AH1-huHF), 3) 항체 치료제 처리군(α-PD-L1), 4) 제 2 단백질 처리군(huHF-PD1), 5) 제 1 단백질과 항체 치료제의 병용 투여군(AH1-huHF+α-PD-L1) 및 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1-huHF+huHF-PD1)을 사용하였다. 종양이 자라고 치료가 진행되어 종양 특이적인 면역 세포가 몸에 생성되었다고 판단된 3주 후, 모든 실험군의 종양을 수술로 제거하였다. 그 이후 다시 CT26대장암 세포를 모든 실험군에 처리하여 암이 발생하는지 결과를 관찰하였다.
그 결과 1) 무처리군(No treat)은 지속적으로 암이 성장하는데 반해, 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1- huHF+huHF-PD)의 모든 쥐는 암이 자라지 않거나 혹은 자라다가 며칠 만에 사라지는 것을 확인하였다.
본 실험은 Balb/c 마우스를 이용하였다. 각 실험들은 실험군당 5마리를 이용하였고, 암 세포의 크기는 하기의 식으로 계산하였다:
[수학식 4]
(tumor volume)=(major axis) X (minor axis)2 X 0.52
실험 결과, 본 발명에 따른 제 1단백질(CD-loop-AH1)와 제2 단백질(huHF-PD1)를 처리한 실험군 6번의 종양 치료 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다(도 17).
또한, 수술 후에도 암이 전이되는지 여부를 보기 위하여 실험을 진행하였다. 이때, 실험군은 실시예 11과 동일하게 1) 무처리군(No treat), 2) 제 1 단백질 처리군(AH1-huHF), 3) 항체 치료제 처리군(α-PD-L1), 4) 제 2 단백질 처리군(huHF-PD1), 5) 제 1 단백질과 항체 치료제의 병용 투여군(AH1-huHF+α-PD-L1) 및 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1-huHF+huHF-PD1)을 사용하였다. 종양이 자라고 치료가 진행되어 종양 특이적인 면역 세포가 몸에 생성되었다고 판단된 3주 후, 모든 실험군의 종양을 수술로 제거하였다. 그 이후 다시 CT26대장암 세포를 모든 실험군에 정맥 주사로 처리하여 암이 발생하는지 결과를 관찰하였다.
그 결과 1) 무처리군(No treat)은 지속적으로 암이 성장하는데 반해, 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1- huHF+huHF-PD1)의 모든 쥐는 암이 자라지 않거나 혹은 자라다가 며칠 만에 사라지는 것을 확인하였다.
본 실험은 Balb/c 마우스를 이용하였다. 각 실험들은 실험군당 5마리를 이용하였고, 암 세포의 전이여부는 상기의 모든 실험군에서 사용된 쥐의 폐를 적출하여 암 nodule을 세어 암 전이여부를 판단하였다(도 17).
15. 암 성장 저해 확인을 위한 in vitro 면역 실험 II
상기 실시예 12와 동일한 방법으로 해당 실험군(1) 무처리군(No treat), 2) 제 1 단백질 처리군(AH1-huHF 및 gp100-huHF), 3) 항체 치료제 처리군(α-PD-L1), 4) 제 2 단백질 처리군(huHF-PD1), 5) 제 1 단백질과 항체 치료제의 병용 투여군(AH1-huHF+α-PD-L1 및 gp100-huHF+α-PD-L1) 및 6) 제 1 단백질과 제 2 단백질의 병용 투여군(AH1-huHF+huHF-PD1 및 gp100-huHF+huHF-PD1)들의 T-세포의 활성 반응을 관찰하였다.
그 결과 종양 rechallenge 후에도 상기 실시예 12에서 종양 성장 억제 결과가 가장 좋았던 6번 실험군(AH1-huHF+huHF-PD1 및 gp100-huHF+huHF-PD1)에서 T-세포의 활성이 가장 뛰어남을 다시 한번 확인하였다(도 18).
16. 페리틴 단량체의 다양한 위치에 질환 항원 에피토프가 융합된 단백질 제조
페리틴의 N-터미널과 A 헬릭스 사이에 gp100이 융합된 구조, E 헬릭스와 C-터미널 사이에 gp100이 융합된 구조, D 헬릭스 내부에 gp100이 융합된 구조, E 헬릭스 내부에 gp100이 융합된 구조를 제조하였다.
도 19 내지 도22, 표 2에 기재된 벡터를 실시예 1의 방법에 따라 제조하고, 이때 표 3의 프라이머 세트를 사용하였다.
단백질은 실시예 2의 방법에 따라 합성하였고, 후술할 실시예 18의 방법에 따라 용해성, 불용성 부분을 확인하였고, 실시예 4의 방법에 따라 단백질이 자가조립됨을 확인하였다.
17. 트랜스페린에 대한 결합력 측정
제조된 단백질의 트랜스페린에 대한 결합력 A를 하기 방법에 따라 측정하였다.
먼저, hexa-His tag에 특이적으로 결합하는 염료(RED-tris-NTA 2nd Generation Dye)를 50nM의 농도로 100㎕를 준비하고, 제조된 단백질을 200nM의 농도로 100㎕ 준비하여, 이들을 섞고 상온에서 30분동안 인큐베이션하였다. 이를 원심분리기로 13000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하여, 염료 라벨링된 단백질을 얻었다.
그리고, 9.65 μM 트랜스페린 수용체 25㎕를 제1 PCR 튜브에 첨가하고, 제2 내지 제16 PCR 튜브에 PBS-T (PBS + tween20 0.5 %) 버퍼를 10㎕ 첨가하고, 제1 PCR 튜브의 트랜스페린 10㎕를 제2 PCR 튜브에 옮기고, 제2 PCR 튜브에서 10㎕를 다시 제3 PCR 튜브에서 옮기고, 이를 제16 PCR 튜브까지 수행하여, 제2부터 제16 PCR 튜브까지 각각 20㎕가 되도록 1/2 순차희석을 수행하였다.
이후, 각 PCR 튜브에 상기 염료 라벨링된 단백질을 10㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응을 수행하였다.
이후 각 튜브의 반응액을 Microscale thermophoresis 장치의 캐필러리에 넣고 레이저를 조사하지 않은 상태에서의 형광 강도(homogeneous fluorescence intensity) Fcold를 얻었다. 그리고 Microscale thermophoresis 장치(Monolith NT.115)를 MST 파워 40%, LED 파워는 얻어지는 형광 강도의 값이 10,000 내지 15,000 범위 안에 되도록 세팅하여, 각 캐필러리마다 30초간 레이저를 조사하여 가열된 상태에서의 형광 강도 Fhot를 얻었다.
Fnorm(‰)(=(Fhot/Fcold) x 1000)을 얻고 이로부터 반응 평형 상태(steady state)의 캐필러리를 찾아, 수학식 1로 표시되는 농도를 얻었다.
TSA
삽입위치		 TfR gp100
N Human 18.484±1.13
Mouse 48.323±2.86
AB Human 29.663±0.71
Mouse 40.787±2.85
BC Human 14.043±3.27
Mouse 48.021±3.37
CD Human 4.8943±2.98
Mouse 15.94±2.52
DE Human 9.7809±1.97
Mouse 30.485±1.11
C Human 5.6533±1.33
Mouse 34.795±0.98
EC Human 5.6768±1.29
Din Human 29.288±3.71
Ein Human 6.276±1.76
TSA
삽입위치		 TfR AH1
N Human 84.648±0.83
AB Human 10.933±0.32
BC Human 106.64±0.74
CD Human 3.4503±3.49
DE Human 6.1146±4.11
C Human 5.3748±1.25
TSA
삽입위치		 TfR PD1
C Human 265.84±0.98
Mouse 667.51±2.34
샘플 TfR 결합력
모델항원RFP-huHF
(TSA 삽입위치 C)		 Human 127.23±0.71
WT huHF Human 2.498±1.77
Mouse 7.59±2.72
18. 단백질의 수용성 분획의 비율 측정
pT7-7 기반 각종 발현 벡터를 BL21 (DE3) competent cell을 형질전환 (transformation)시켰다. 단일 콜로니를 앰피실린 100 mg/L이 첨가된 LB 액체 배지(50 mL)에 접종하여 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 37℃, 130 rpm의 조건에서 배양하였다. 탁도(turbidity/optical density at 600 nm)가 0.5에 도달하면, IPTG 1 mM 투여를 통해 타겟 단백질의 발현을 유도하였다. 이후 20℃에서 12~16 시간 배양 후, 배양액 속의 세포들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)을 통하여 spun-down되고, 세포 펠릿을 수거하여 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4) 버퍼에 재부유시켰다. 재부유된 세포들은 Branson Sonifier (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT)를 이용하여 파열되었다. 음파처리 후, 용해성 단백질을 포함한 상층액과 불용성 단백질을 포함한 응집체들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)로 분리되었다. 분리된 용해성, 불용성 단백질 분획의 SDS-PAGE 분석을 통해 용해도를 분석하였다. 즉, Coomassie로 염색된 타겟 단백질 밴드들은 densitometer (Duoscan T1200, Bio-Rad, Hercules, CA)로 스캔 후 수용성 분획의 비율을 정량화하였다. 구체적으로, 스캔한 SDS-PAGE 겔 이미지를 이용하여 ‘Quantity One’ program ‘Volume Rect. Tool’로 밴드 굵기와 백그라운드 값을 설정한 후, ‘Volume Analysis Report’를 이용하여 용해성, 불용성 단백질 분획의 합을 100 %로 설정하고 용해도를 정량화하였다.
단백질 수용성 분획 비율(%) 단백질 수용성 분획 비율(%)
N-OVA-huHF 89.35 N-gp100-huHF 92.48
AB-OVA-huHF 93.81 AB-gp100-huHF 93.86
BC-OVA-huHF 95.74 BC-gp100-huHF 94.43
CD-OVA-huHF 98.73 CD-gp100-huHF 95.57
DE-OVA-huHF 96.82 DE-gp100-huHF 95.39
C-OVA-huHF 96.62 C-gp100-huHF 96.40
N-AH1-huHF 81.74 NA-gp100-huHF 67.22
AB-AH1-huHF 94.63 EC-gp100-huHF 96.27
BC-AH1-huHF 92.53 Din-gp100-huHF 48.21
CD-AH1-huHF 98.47 Ein-gp100-huHF 93.00
DE-AH1-huHF 98.71 PD1-huHF 74.25
C-AH1-huHF 87.90 RFP-huHF 98.31
19. 면역 관문 분자에 결합하는 분자의 사용
(1) huHF의 C-말단에 mouse small PD1(서열번호 8)이 융합된 단백질을 제조하여, 그 효능을 확인하였다(도 23).
단백질은 실시예 2의 방법에 따라 합성하였고, 실시예 19의 방법에 따라 용해성, 불용성 부분을 확인하였고, 실시예 4의 방법에 따라 단백질이 자가조립됨을 확인하였다.
제조되는 단백질의 트랜스페린 수용체에 대한 결합력은 실시예 17의 방법에 따라 측정하였고, 수학식 1로 표시되는 농도는 44.649±1.34 nM로 확인되었다.
단백질의 종양 억제능은 실시예 11의 방법에 따라 평가하였다.
구체적으로, 일정 크기의 대장암 종양(CT26)이 형성된 마우스 Balb/c를 이용하여 3일 간격으로 PBS, PD-L1 항체, huHF-PD1, huHF-msmPD1 단백질을 정맥 주사로 주입하였다. 관찰 결과 huHF-msmPD1 단백질이 항체 치료제와 유사한 종양 치료 효능을 보임을 관찰할 수 있었다. 실험은 실험군당 3마리를 이용하였고, 암 세포의 크기는 하기의 식으로 계산하였다:
[수학식 4]
(tumor volume)=(major axis) X (minor axis)2 X 0.52
이때, 실험군은 1) PBS군, 2) 항체 치료제 처리군(α-PD-L1), 3) 제 1 단백질 처리군(huHF-PD1), 4) 제 2 단백질 처리군(huHF-msmPD1) 을 사용하였다.
그 결과는 도 24에 나타내었다.
이를 참고하면, 면역 관문 분자에 결합하는 분자가 융합된 페리틴의 사용시의 우수한 항암능을 확인할 수 있다.
(2) huHF의 C-말단에 hsmPD1이 융합된 단백질을 제조하여, 그 효능을 확인하였다.
huHF는 트랜스페린과의 결합 부위(BC loop에 존재)의 일부 아미노산을 치환한 것으로서, 서열번호 1의 서열에서 81, 83번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 단백질을 사용하였다.
이는 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix에 forward primer(서열번호 39), reverse primer(서열번호 40) 10 μM, template DNA인 huHF-hsmPD1를 혼합하여 유전자의 돌연변이를 수행하여 얻었다. 이후 실시예 2의 방법에 따라 단백질을 얻었다.
hsmPD1으로는 서열번호 41의 서열을 사용하였다.
제조된 단백질의 h-PD-L1 및 m-PD-L1에 대한 결합력을 실시예 17의 방법에 따라 측정하였고, h-PD-L1에 대한 결합력은 13.417±1.97 nM, m-PD-L1에 대한 결합력은 177.14±3.32 nM로 확인되었다.
(3) 페리틴에 면역 관문 분자 PD-L1과 TIGIT에 결합하는 분자가 융합된 단백질을 제조하여, 그 효능을 확인하였다.
면역 관문 분자에 결합하는 분자로는 항체의 HCDR3 서열을 사용하였고, 사용한 서열은 하기 표 10과 같다.
서열번호 명칭
42 huHF-αPD-L1*
43 huHF-αTIGIT*
단백질 발현 벡터
huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker BC(92D/93W): NH2-NdeI-(His)6-huHF-[αTIGIT HCDR3]-huHF- αPD-L1 HCDR3-HindIII-COOH
서열번호 명칭 삽입부위
44 BC_α_PD-L1_F BC loop
45 BC_α_PD-L1_R
46 C_α_TIGIT_F C-말단
47 C_α_TIGIT_R
표 8의 벡터를 실시예 1의 방법에 따라 제조하고, 이때 표 9의 프라이머 세트를 사용하였다. 단백질은 실시예 2의 방법에 따라 합성하였다.
단백질의 종양 억제능은 대장암 세포주(CT26)을 BALB/c 마우스에 피하접종하고 도 25의 스케쥴에 따라 단백질을 주사하여, 실시예 11의 방법에 따라 평가하였다(도 26).
구체적으로, 일정 크기의 대장암 종양(CT26)이 형성된 마우스 Balb/c를 이용하여 3일 간격으로 PBS, PD-L1 항체와 TIGIT 항체, huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker 단백질을 정맥 주사로 주입하였다. 관찰 결과 huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker 단백질이 항체 치료제와 유사한 종양 치료 효능을 보임을 관찰할 수 있었다. 실험은 실험군당 4마리를 이용하였고, 암 세포의 크기는 하기의 식으로 계산하였다:
[수학식 4]
(tumor volume)=(major axis) X (minor axis)2 X 0.52
이때, 실험군은 1) PBS군, 2) 항체 치료제 병용 처리군(α-PD-L1, α-TIGIT), 3) 단백질 처리군(huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker)을 사용하였다.
또한, 각 처리군별로 종양 조직을 적출하여 무게를 측정하였고, 그 결과는 도 27에 나타내었다. 이로부터 PD-L1과 TIGIT에 결합하는 분자가 융합된 단백질의 우수한 항암 효능을 확인할 수 있다.
(4) 면역 관문 분자에 결합하는 분자의 페리틴 단량체에의 융합 위치에 따른 효율 분석
α-PD-L1 HCDR3가 페리틴 단량체의 서로 다른 위치에 융합된 단백질을 제조하여 종양 억제능을 확인하였다.
α-PD-L1 HCDR3가 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, C-말단에 융합된 단백질을 제조하였다(PDB 3AJO sequence 기준 huHF 5T 내지 176G 중 AB loop; 45D/46V 사이, BC loop; 92D/93W, CD loop; 126D/127P, DE loop; 162E/163S). 이는 상기 표 7의 서열을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1, 2와 동일 방법으로 제조하였다.
제조된 단백질의 대장암 세포 타겟팅능을 실시예 6의 방법으로 확인하였다.
구체적으로, FITC 형광물질이 부착된 huHF-αPD-L1 HCDR3 (AB, BC, CD, DE loops, C-말단) 단백질의 CT26 대장암에 대한 타겟팅 효율을 비교하기 위하여 CT26 대장암 세포에 300 nM 농도로 단백질을 반응시킨 후 형광 시그널을 비교하여 cell uptake 효율을 확인하였다. 대조군인 huHF 단백질보다 huHF-αPD-L1 HCDR3 (AB, BC, CD, DE loops, C-말단) 단백질이 암 세포와 결합하여 형광 시그널을 나타내는 것을 확인하였다.
결과는 도 28, 그 상대적 형광 세기를 도 29에 나타내었다.
확인 결과, 융합 부위에 관계 없이, huHF 단백질에 비해 강한 타겟팅능을 나타내는 것을 확인하였다.
20. 면역 관문 분자에 결합하는 분자로서 항체 CDR의 사용
(1) 단백질 제조용 발현 벡터 구성
하기 표 13의 서열을 사용하였고, 하기 도 29 내지 36, 표 14의 벡터 모식도에 따라 PCR을 수행하여, huHF-αPD1 HCDR3 (C-말단), huHF-αCTLA4 HCDR3 (C-말단), huHF αTIGIT HCDR3 (C-말단), huHF-αLAG3 HCDR3 (C-말단), huHF-αTIM3 HCDR3 (C-말단), huHF-αPD-L1 HCDR3 (AB루프)-αTIGIT HCDR3 (C-말단) (dual blocker)를 제조하였다. 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 아가로스 젤에서 정제한 다음, 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.
구체적으로, 표 15의 프라이머 세트를 이용하여 각각의 발현 벡터 제조에 필요한 PCR 산물을 순차적으로 플라스미드 pT7-7 벡터에 삽입하여 각각의 단백질 나노입자를 발현할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다.
서열번호 명칭
48 huHF-αPD-L1
49 huHF-αPD1
50 huHF-αCTLA4
51 huHF-αLAG3
52 huHF-αTIM3
53 huHF αTIGIT
단백질 발현 벡터
huHF-αPD-L1 NH2-NdeI-huHF-αPD-L1 HCDR3-HindIII-COOH
huHF-αPD1 NH2-NdeI-huHF-αPD1 HCDR3-HindIII-COOH
huHF-αCTLA4 NH2-NdeI-huHF-αCTLA4 HCDR3-HindIII-COOH
huHF-αLAG3 NH2-NdeI-huHF-αLAG3 HCDR3-HindIII-COOH
huHF-αTIM3 NH2-NdeI-huHF-αTIM3 HCDR3-HindIII-COOH
huHF-αTIGIT NH2-NdeI-huHF-αTIGIT HCDR3-HindIII-COOH
huHF-PD-L1-TIGIT dual blocker BC(92D/93W): NH2-NdeI-(His)6-huHF-[αTIGIT HCDR3]-huHF- αPD-L1 HCDR3-HindIII-COOH
서열번호 명칭 삽입부위
54 α_PD-L1_F C-말단
55 α_PD-L1_R
56 α_PD1_F C-말단
57 α_PD1_R
58 α_CTLA4_F C-말단
59 α_CTLA4_R
60 α_LAG3_F C-말단
61 α_LAG3-R
62 α_TIM3_F C-말단
63 α_TIM3_R
64 α_TIGIT_F C-말단
65 α_TIGIT_R
66 BC_α_PD-L1_F BC loop
67 BC_α_PD-L1_R
(2) 단백질의 합성, 정제 및 조립 검증
실시예 2 내지 4와 동일한 방법으로 단백질의 제조 및 수용성 분획을 확인하고, 실시예 5와 동일한 방법으로 구형의 나노입자 형성 여부를 확인하였다(도 29 내지 36).
(3) 항원에 대한 결합력 측정
각 항체에 대한 항원을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6과 동일한 방법으로 항원에 대한 결합력을 측정하였다.
항체의 결합력은 표 16에, 실시예의 단백질의 결합력은 표 17 및 18에 나타내었다. 이를 참조하면, 실시예의 단백질들이 인간 항원에 대한 우수한 결합력을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
Human Ab Kd (nM) Catalog #
αPD-L1 5.8227±0.52 10084-MM02
(Sino biological)
αPD1 9.2096±1 MBS154625(Mybiosource)
αCTLA4 3.4228±1.81 11159-MM06(Sino biological)
αTIM3 7.9993±1.01 MBS4156568(Mybiosource)
αTIGIT 10.32±1.27 MBS154627(Mybiosource)
Sample murine IC molecule
(standard)		 Kd
(nM)
huHF-αPD-L1 PD-L1 3.1692±2.56
huHF-αPD1 PD1 87.889±2.47
huHF-αCTLA4 CTLA4 17.513±0.462
huHF-αLAG3 LAG3 37.817±1.82
huHF-αTIM3 TIM3 7.0831±1.64
huHF-αTIGIT TIGIT 3.9997±2.29
huHF-α PD-L1-
αTIGIT		 PD-L1 4.9956±2.79
TIGIT 4.7343±2.52
Sample human IC molecule
(standard)		 Kd
(nM)
huHF-αPD-L1 PD-L1 10.708±4.52
huHF-αPD1 PD1 17.776±4.38
huHF-αCTLA4 CTLA4 10.167±3.11
huHF-αLAG3 LAG3 18.498±3.17
huHF-αTIM3 TIM3 13.03±4.21
huHF-αTIGIT TIGIT 7.1276±2.16
huHF-αPD-L1-αTIGIT PD-L1 3.5605±1.07
TIGIT 6.6423±3.46
<110> Cellemedy Co. Ltd <120> ANTIGEN FUSED PROTEIN AND USE THEREOF <130> 20P11003 <150> KR 10-2019-0138580 <151> 2019-11-01 <160> 67 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 5 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr 20 25 30 Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg 35 40 45 Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly 50 55 60 Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro 65 70 75 80 Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp 85 90 95 Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys 100 105 110 Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu 115 120 125 Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg 130 135 140 Phe Gln Gly Met Val 145 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Gly Gln Tyr Ala Ser Tyr His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Gly Gly Ser Lys 20 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Gly His Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 52 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Mouse <400> 8 Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln 1 5 10 15 Ala Ala Phe Cys Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Ser 50 <210> 9 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RFP antigen <400> 9 Met Asp Asn Thr Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Gln Phe Lys Val 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Tyr Phe Glu Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Ser 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Glu Val Gln Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Gln Asp Gly Thr Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Lys Gly Val Asn 115 120 125 Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Ala Gly Trp Glu 130 135 140 Pro Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu 145 150 155 160 Ile Ser His Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Asp 165 170 175 Phe Lys Thr Val Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Asn 180 185 190 His Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Asn His Asn Glu Asp Tyr 195 200 205 Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu His Ala Glu Ala Arg His Ser Gly Ser 210 215 220 Gln 225 <210> 10 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N gp100 F <400> 10 catatgcacc atcaccatca ccataaggtt ccacgtaatc aagactggct ggaattcacg 60 accgcgtcca cc 72 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N gp100 R <400> 11 aagcttctag ctttcattat cactgtc 27 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AB gp100 F <400> 12 tcaagactgg ctggaattcg tggctttgaa gaactttg 38 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AB gp100 R <400> 13 ttacgtggaa ccttggatcc atcatcgcgg tcaaagtag 39 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC gp100 F <400> 14 tcaagactgg ctggaattct gggagagcgg gctgaat 37 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC gp100 R <400> 15 ttacgtggaa ccttggatcc gtcatcacag tctggtttct tgatatc 47 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD gp100 F <400> 16 tcaagactgg ctggaattcc cccatttgtg tgacttc 37 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD gp100 R <400> 17 ttacgtggaa ccttggatcc gtcatttttg tcagtggc 38 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DE gp100 F <400> 18 catatgcacc atcaccatca ccatctcgag acgacc 36 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DE gp100 R1 <400> 19 aagcttctag ctttcattat cactgtctcc cagggtgtgc ttgtcaaa 48 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DE gp100 R2 <400> 20 gtgcttgtca aagagatatt ccgccaatcc agagaattcc agccagtc 48 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DE gp100 R3 <400> 21 ttccagccag tcttgattac gtggaacctt ggatccttcg ggcgctcc 48 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C gp100 F <400> 22 catatgacga ccgcgtccac ctcgcaggtg cgccagaac 39 <210> 23 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C gp100 R <400> 23 aagcttctaa tggtgatggt gatggtgcag ccagtcttga ttacgtggaa ccttgctttc 60 attatc 66 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA gp100 F1 <400> 24 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA gp100 F2 <400> 25 ccacgtaatc aagactggct gcaggtgcgc cag 33 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA gp100 F3 <400> 26 acgaccgcgt ccacctcgaa ggttccacgt aatcaa 36 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA gp100 R <400> 27 aagcttctag ctttcattat cactgtctcc cagggt 36 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intD gp100 F <400> 28 catatgcacc atcaccatca ccatgaattc acgaccgcgt cc 42 <210> 29 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intD gp100 R1 <400> 29 tcccatcttc agccagtctt gattacgtgg aaccttgcgc aagttggt 48 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intD gp100 R2 <400> 30 aaagagatat tccgccaatc cagattcggg cgctcccatc ttcag 45 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intE gp100 F <400> 31 catatgcacc atcaccatca ccatgaattc acgaccgcgt cc 42 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intE gp100 R1 <400> 32 cagccagtct tgattacgtg gaaccttgtg cttgtcaaa 39 <210> 33 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> intE gp100 R2 <400> 33 aagcttctag ctttcattat cactgtctcc cagggtcagc cagtcttg 48 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EC gp100 F <400> 34 catatgcacc atcaccatca ccatgaattc acgaccgcgt cc 42 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EC gp100 R <400> 35 aagcttctag ctttcattat ccagccagtc ttgattacgt ggaaccttac tgtctcccag 60 60 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker1 <400> 36 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker2 <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker3 <400> 38 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer <400> 39 tgcagatatc aagaaaccag actgtgatg 29 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer <400> 40 agcgcgattc ggccacctcg ttg 23 <210> 41 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu 1 5 10 15 Ala Ala Phe Pro Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln 35 40 45 Ile Lys Glu Ser 50 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 43 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Pro Ser Phe Ile Thr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Trp Glu Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Asp Phe <210> 44 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC alpha PDL1 F <400> 44 ctgtatgcgt ttgatattga attctgggag agcgggctga at 42 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC alpha PDL1 R <400> 45 agaaccataa gaaccaccgg atccgtcatc acagtctggt ttcttgatat c 51 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C alpha TIGIT F <400> 46 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 47 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C alpha TIGIT R <400> 47 aagcttctaa aaatcaaaat agccttccca ggtgctcagg ctcgccaggg taataaagct 60 cggcatgctt tcattatc 78 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asp Leu Gly Ala Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Lys Asp Val 1 5 10 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Thr Ala Gln Phe Ala Tyr 1 5 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Val Gly Gly Ala Phe Pro Met Asp Tyr 1 5 <210> 53 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Pro Ser Phe Ile Thr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Trp Glu Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Asp Phe <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha PDL1 F <400> 54 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 55 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha PDL1 R <400> 55 aagcttctaa atatcaaacg catacagaga accataagaa ccaccgcttt cattatc 57 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha PD1 F <400> 56 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha PD1 R <400> 57 aagcttctac acatctttgc catagtaata cgggcccgcg cccagatcgc tttcattatc 60 60 <210> 58 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha CTLA4 F <400> 58 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 59 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha CTLA4 R <400> 59 aagcttctaa tacgcaaact gcgcggtctc gaggctttca ttatc 45 <210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha LAG3 F <400> 60 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 61 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha LAG3 R <400> 61 aagcttctac ggatcaaacc agttatattc ataatcgcta tagccgcttt cattatc 57 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha TIM3 F <400> 62 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 63 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha TIM3 R <400> 63 aagcttctaa taatccatcg gaaatgcacc gccaacgctt tcattatc 48 <210> 64 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha TIGIT F <400> 64 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtcc 36 <210> 65 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha TIGIT R <400> 65 aagcttctaa aaatcaaaat agccttccca ggtgctcagg ctcgccaggg taataaagct 60 cggcatgctt tcattatc 78 <210> 66 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC alpha PDL1 F <400> 66 ctgtatgcgt ttgatattga attctgggag agcgggctga at 42 <210> 67 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC alpha PDL1 R <400> 67 agaaccataa gaaccaccgg atccgtcatc acagtctggt ttcttgatat c 51

Claims (18)

  1. 질환 항원 에피토프가 융합된 페리틴 단량체가 자기 조립되어 이루어지는 단백질을 포함하고,
    상기 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족하고,
    상기 질환 항원 에피토프는 아미노산의 길이가 25aa 이하인 암 항원 에피토프이며, 상기 페리틴 단량체의 C-D 루프에 융합된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [수학식 1]
    K ≤ 20 nM
    (식 중, K = [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 상기 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 상기 인간 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 상기 단백질과 상기 인간 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 질환 항원 에피토프는 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4 및 신생항원(neoantigen)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 페리틴은 인간 페리틴 중쇄인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 페리틴 단량체 24개가 자기 조립된 구형 형상인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 대장균 생산 시스템에서 수용성 분획 비율이 40% 이상으로 존재하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 질환 항원 에피토프는 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양으로 이루지는 군에서 선택되는 어느 하나인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 삭제
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 흑색종, 폐암, 대장암, 간암, 교모세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 담낭암, 췌장암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 약학 조성물이 주사 제형인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 약학 조성물이 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Patent event date: 20220822

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20230526

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20230125

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20230726

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20230619

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20230526

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20230125

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
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Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20230731

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Payment date: 20230731

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