[go: up one dir, main page]

KR102560876B1 - 조건부 활성 항-epcam 항체, 항체 단편, 이들의 면역접합체 및 이의 용도 - Google Patents

조건부 활성 항-epcam 항체, 항체 단편, 이들의 면역접합체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102560876B1
KR102560876B1 KR1020227000242A KR20227000242A KR102560876B1 KR 102560876 B1 KR102560876 B1 KR 102560876B1 KR 1020227000242 A KR1020227000242 A KR 1020227000242A KR 20227000242 A KR20227000242 A KR 20227000242A KR 102560876 B1 KR102560876 B1 KR 102560876B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
epcam
ser
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020227000242A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220019761A (ko
Inventor
제이 엠 쇼트
게르하르트 프레이
화이 웬 창
Original Assignee
바이오아트라, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오아트라, 인코퍼레이티드 filed Critical 바이오아트라, 인코퍼레이티드
Publication of KR20220019761A publication Critical patent/KR20220019761A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102560876B1 publication Critical patent/KR102560876B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/33—Antibodies; T-cell engagers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

EpCAM 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 폴리펩티드 뿐만 아니라 EpCAM 단백질에 결합하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 함유하는 항체 및 항체 단편. 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 함유하는 항체 및 항체 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 또한 제공된다.

Description

조건부 활성 항-EPCAM 항체, 항체 단편, 이들의 면역접합체 및 이의 용도
본 개시는 항-EpCAM 항체, 항체 단편 및 이러한 항체 및 항체 단편의 면역접합체, 및 진단 및 치료 방법에서의 항체, 항체 단편 및 면역접합체의 용도에 관한 것이다.
상피세포 부착/활성화 분자 (EpCAM, 또한 CD326, HEA125, MK-1, EGP-2, EGP34, GA733-2, KSA, TROP-1, KS1/4 및 ESA로도 알려짐)는 상이한 기원의 대부분의 암종에 대한 그의 높은 수준 및 빈번한 발현으로 인해, 암 치료에서 첫번째 및 가장 중요한 면역요법 표적 중 하나이다 (Herlyn 등, Proc Natl Acad Sci USA, 76:1438-1442, 1979; Went 등, Hum Pathol, 35:122-128, 2004). 이 분자는 길이가 314개 아미노산 (aa)인 비교적 작은 타입 I 막관통 당단백질로, 진화 동안 고도로 보존된 것이다. 이는 칼슘-비의존성 동종형 세포-세포 부착을 매개하는 것으로 보고되어 있다 (Litvinov 등, J Cell Biology, 125:437-446, 1994). 분자는 α-액티닌에 대한 2개의 결합 부위가 액틴 세포골격과의 상호작용을 위해 존재하는 26 aa의 짧은 세포내 도메인 (Balzar 등, Mol Cell Biol., 18(8): 4833-4843, 1998), 23-aa 막관통 도메인, 242-aa 세포외 도메인 (ECD), 및 이의 성숙 형태로부터 절단되는 23-aa 신호 펩티드로 이루어진다. EpCAM의 세포외 도메인은 3개의 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 정상 조직과 악성 조직 사이의 차별적인 글리코실화 상태는 특정 유형의 암에서 보고되었다(Pauli 등, Cancer Lett, 193:25-32, 2003).
세포외 도메인은 3개의 도메인을 함유한다. 처음 2개는 표피 성장 인자 (EGF)-유사 반복체와 유사한 것으로 여겨지며, 이들 사이에 12개의 시스테인 잔기가 존재한다 (Balzar 등, Mol Cell Biol, 21:2570-2580, 2001). 그러나, 일부 연구는 EpCAM의 두 번째 EGF-유사 반복이 사실 티로글로불린 (TY) 도메인임을 시사한다 (Linnenbach 등, Proc Natl Acad Sci USA, 86:27-31, 1989; Chong 및 Speicher, J Biol Chem, 276:5804-5813, 2001). 제3 도메인은 임의의 공지된 분자와 관련이 없는 독특한 시스테인-결핍 영역 (CPR)이다 (Baeuerle 및 Gires, Br J Cancer, 96:417-423, 2007). EpCAM은 세포-세포 부착, 세포 신호전달, 이동, 증식 및 분화의 예방에서 중요한 역할을 한다 (도 1).
인간에서의 EpCAM 발현은 상피-특이적이다. 대부분의 인간 상피 세포는 편평 상피 및 일부 특정 상피 세포 유형, 예컨대 상피 각질세포, 간세포, 위 벽세포 및 근상피 세포를 제외하고는 EpCAM을 발현한다 (Balzar 등, J Mol Med, 77: 699-712, 1999; Momburg 등, Cancer Res, 47:2883-2891, 1987). 상피 기원의 종양에서, 일반적으로 더 높은 발현 수준이 관찰된다 (Balzar 등, J Mol Med, 77: 699-712, 1999; Winter 등, Am J Pathol, 163:2139-2148, 2003; Went 등, Hum Pathol, 35:122-128, 2004; Went 등, Br J Cancer, 94:128-135, 2006). 예를 들어, EpCAM 단백질은 매우 다양한 인간 선암종 및 편평 세포 암종에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Went 등, Hum Pathol, 35:122-128, 2004). 마이크로어레이 기술과 함께 면역조직화학 (IHC) 염색을 사용하는 최근의 연구는 유방암, 난소암, 신장암, 식도암, 결장암, 위암, 전립선암 및 폐암을 갖는 환자로부터의 매우 많은 수의 샘플에서 EpCAM 발현을 발견하였다 (Spizzo 등, Breast Cancer Res Treat, 86:207-213, 2004; Spizzo 등, Gynecol Oncol, 103:483-488, 2006; Stoecklein 등, BMC Cancer, 6:165, 2006; Kimura 등, Int J Oncol, 30:171-179, 2007; Went 등, Am J Surg Pathol, 29:83-88, 2005; Went 등, Br J Cancer, 94:128-135, 2006). 데이터는 인간 암의 치료를 위한 면역치료학적 표적으로서 EpCAM의 잠재적 유용성을 강조한다.
상피 세포는 인간 악성 종양의 발달에서 가장 중요한 세포 유형인 것으로 알려져 있고, 모든 악성 종양 중 90% 이상은 상피 기원의 것이고 (Birchmeiera 등, Acta Anatomica, 156 (3):217-226, 1996), EpCAM은 현재 가장 빈번하게 그리고 강하게 발현되는 종양-관련 항원 중 하나인 것으로 간주된다. 분자는 단클론성 항체의 발달을 위한 면역원성 종양-관련 항원으로서 종종 독립적으로 발견되었다 (Gottlinger 등, Int J Cancer, 38:47-53, 1986; Edwards 등, Cancer Res, 46:1306-1317, 1986; Spurr 등, Int J Cancer, 38:631-636, 1986; Momburg 등, Cancer Res, 47:2883-2891, 1987; Schon 등, J Investig Dermatol, 102: 987-991, 1994; Bumol 등, Hybridoma, 7:407-415, 1988; Quak 등, Hybridoma, 9:377-387, 1990).
실제로, 인간 암 치료를 위해 적용된 첫 번째 단클론성 항체는 EpCAM을 표적으로 하는 mAb 17-1A (이하, 에드레콜로맙 및 파노렉스로 명명됨)로 불리는 뮤린 IgG2a 항체였다 (Sears 등, Lancet, 1(8275):762-765, 1982; Sears 등, J Biol Response Mod, 3(2):138-150, 1984). 이후로, 에드레콜로맙 및 다른 EpCAM-특이적 뮤린, 키메라 및 인간화 단클론성 항체는 또한 암 치료를 위해 천연 (네이키드) 항체, 하이브리드 이중특이성 (삼기능성) 항체의 형태로 또는 독소, 방사성동위원소, 또는 시토카인 (IL-2 또는 GM-CSF)과의 접합체로서 전임상적으로 및 임상적으로 테스트되었다 (Velders 등, Cancer Res, 54(7):1753-1759, 1994; Raum 등, Cancer Immunol Immunother, 50(3):141-150, 2001; Elias 등, Am J Respir Crit Care Med, 150:1114-1122, 1994; Di Paolo 등, Clin Cancer Res, 9:2837-2848, 2003; Andratschke 등, Anticancer Res, 27(1A):431-436, 2007; Xiang 등, Cancer Res, 57(21):4948-4955, 1997; Schanzer 등, J Immunother, 29(5):477-488, 2006; Wimberger 등, Int J Cancer, 105(2):241-248, 2003; Amann 등, Cancer Res, 68(1):143-151, 2008). 지금까지, EpCAM을 표적화하는 수많은 상이한 면역치료학적 접근법이 여전히 현재 임상 시험 중이다 (Baeuerle 및 Gires, Br J Cancer, 96:417-423, 2007). 임상 시험으로부터의 데이터는 네이키드 항-EpCAM 항체, 예컨대 에드레콜로맙 (17-1A; 파노렉스) 및 아데카투무맙 (MT201)이 단지 제한된 항-종양 효과 (Punt 등, Lancet, 360: 671-677, 2002)를 갖고, 아마도 보체 시스템 (CDC)의 활성화 및 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 효과를 통해 가능하다는 것을 제시하였다 (Schwartzberg, Crit Rev Oncol Hematol, 40(1):17-24, 2001; Naundorf 등, Int J Cancer, 100(1):101-110, 2002; Prang 등, Br J Cancer, 92(2):342-349, 2005; Oberneder 등, Eur J Cancer, 42(15):2530-2538, 2006). IL-2, PE 독소, 또는 항-CD3와 같은 매우 강력한 이펙터 메카니즘과 접합된 항체는 더 양호한 항-종양 효과를 갖는 것으로 보인다. 그러나, 일부 부작용은 이러한 항-EpCAM 항체의 전신 사용을 제한한다 (Baeuerle 및 Gires, Br J Cancer, 96:417-423, 2007).
ING-1은 EpCAM 양성 세포를 표적화하는 고친화성 인간 조작 단클론성 항체이다. 이는 표준 요법에 대해 불응성인 진행된 선암종을 갖는 환자에서 I기 임상 시험에서 사용되었고, 이 연구로부터의 데이터는 EpCAM에 대해 고친화성을 갖는 항체가 종양 세포에 대해 더 세포독성이면서 급속한 췌장 독성 손상을 또한 유도할 수 있고, 따라서 전신 투여를 위한 이의 치료적 윈도우를 제한할 수 있다는 것을 제시하였다 (De Bono 등, Clin Cancer Res, 10(22):7555-65, 2004). 고친화성 항-EpCAM 항체의 치료적 사용과 관련된 가능한 전신 독성 효과는 주어진 시간에 순환 항체를 제거하기 위한 추적 단계를 포함하는 사전-표적화 전략에 의해 감소될 수 있다. 대안적으로, 고친화성 항-EpCAM 항체의 사용은 국소-부위 치료에 제한될 수 있다.
공지된 항-EpCAM 항체의 부작용은 종양 세포와 비교하여 밀도가 낮지만, 정상 상피 세포에 대한 EpCAM의 존재와 연관된다 (Kim 등, Clin Cancer Res, 10:5464-5471, 2004; Osta 등, Cancer Res, 64:5818-5824, 2004). 따라서, 항-EpCAM 항체의 친화성 또는 특이성을 증가시키는 것은 부작용을 생성하는 EpCAM을 발현하는 정상 조직에서 항-EpCAM 항체의 감소로 이어지지 않는다.
본 발명은 치료 및 진단 용도, 특히 암의 진단 및 치료에 적합한 부작용이 감소되거나 최소화된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 중 일부는 정상 조직에 존재하는 EpCAM과 비교하여 종양에서 EpCAM에 대해 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 이러한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 전형적으로 공지된 항-EpCAM 항체와 적어도 비슷한 효능을 갖는다. 또한, 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 정상 조직에서 EpCAM에 대해 상대적으로 낮은 결합 친화성을 갖는 것으로 당업계에 공지된 단클론성 항-EpCAM 항체과 비교하여 감소된 부작용을 나타낼 수 있다. 이러한 이점은 종양에 대한 EpCAM의 보다 선택적인 표적화를 제공할 수 있고, 종양에 존재하는 EpCAM에 대한 항체의 선택성의 결과로서 이러한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 더 높은 투여량의 사용을 허용할 수 있으며, 이에 따라 바람직하지 않은 부작용의 상응하는 증가 없이 보다 효과적인 치료요법적 치료가 실현될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 EpCAM에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 서열 H1, H2, 및 H3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서:
H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되;
상기 X1은 Y 또는 D이다.
이전 구현예에서, 상기 H2 서열은 YIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 22)일 수 있거나, 상기 H2 서열은 DIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 23)일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 L1, L2, 및 L3을 갖는 3개의 CDR을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드와 전술된 임의의 단리된 폴리펩티드의 조합에 의해 형성된 생성물을 포함하며, 여기서:
L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되;
상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 EpCAM, 특히 인간 EpCAM 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 H1, H2, 및 H3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하고, 여기서:
H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되; 상기 X1은 Y 또는 D이고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열 L1, L2, 및 L3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되; 상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이고, 단, X1, X2, X3 및 X4는 동시에 Y, A, H, 및 H일 수 없다.
이전 구현예에서, 상기 H2 서열은 YIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 22)일 수 있거나, 상기 H2 서열은 DIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 23)일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 상기 L2 서열은 STSNLAS (서열번호 24)일 수 있거나, 상기 L2 서열은 STSNLHS (서열번호 25)일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 상기 L3 서열은 HQWSTYHT (서열번호 26)일 수 있고, 상기 L3 서열은 HQWSTYET (서열번호 27)일 수 있거나, 상기 L3 서열은 EQWSTYHT (서열번호 28)일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7 내지 13으로부터 선택되는 서열을 가질 수 있다.
각각의 전술한 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 14 내지 21로부터 선택되는 서열을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 임의의 한 쌍의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 각 영역은 각각 독립적으로 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며; 상기 단리된 폴리펩티드는 인간 EpCAM 단백질에 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 H1, H2, 및 H3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하고, 여기서:
H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되;
상기 X1은 Y 또는 D이고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열 L1, L2, 및 L3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되;
상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이고, 단, X1, X2, X3 및 X4는 각각 동시에 Y, A, H, 및 H일 수 없다.
이전 구현예에서, 상기 H2 서열은 YIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 22)일 수 있거나, 상기 H2 서열은 DIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 23)일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 상기 L2 서열은 STSNLAS (서열번호 24)일 수 있거나, 상기 L2 서열은 STSNLHS (서열번호 25)일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 상기 L3 서열은 HQWSTYHT (서열번호 26)일 수 있거나, 상기 L3 서열은 HQWSTYET (서열번호 27)일 수 있거나, 상기 L3 서열은 EQWSTYHT (서열번호 28)일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7 내지 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
각각의 상기 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 14 내지 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
각각의 상기 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 임의의 한 쌍의 서열을 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 각 영역은 각각 독립적으로 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며; 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 EpCAM 단백질에 특이적으로 결합한다.
각각의 이전 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 비-종양 미세환경에서 발생하는 동일한 조건의 상이한 값과 비교하여 종양 미세환경에서의 조건 값에서 EpCAM 단백질에 대해 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조건은 pH이다.
각각의 이전 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 비-종양 미세환경에서 발생하는 동일한 조건의 상이한 값과 비교하여 종양 미세환경에서의 조건 값에서 EpCAM 단백질에 대해 더 높은 항원 결합 활성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조건은 pH이다.
각각의 이전 구현예에서, 조건부 활성 항체 또는 항체 단편은 pH 6.0에서 모 항체 또는 항체 단편의 동일한 항원 결합 활성과 비교하여 pH 6.0에서 적어도 70%의 항원 결합 활성을 가질 수 있으며, 상기 조건부 활성 항체 또는 항체 단편은 pH 7.4에서 모 항체 또는 항체 단편의 동일한 항원 결합 활성과 비교하여 pH 7.4에서 50% 미만, 또는 40% 미만, 또는 30% 미만, 또는 20% 미만 또는 10% 미만의 항원 결합 활성을 가질 수 있다. 상기 항원 결합 활성은 EpCAM 단백질에 대한 결합 또는 CD3에 대한 결합일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 항원 결합 활성은 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 상기 면역접합체에서, 항체 또는 항체 단편은 화학요법제, 방사성 원자, 세포증식 억제제 및 세포독성제로부터 선택되는 제제에 접합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물의 일회 용량은 약 135 mg, 235 mg, 335 mg, 435 mg, 535 mg, 635 mg, 735 mg, 835 mg, 935 mg, 1035 mg, 1135 mg, 1235 mg, 또는 1387 mg의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체의 양을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 일회 용량은 135 내지 235 mg, 235 내지 335 mg, 335 내지 435 mg, 435 내지 535 mg, 535 내지 635 mg, 635 내지 735 mg, 735 내지 835 mg, 835 내지 935 mg, 935 내지 1035 mg, 1035 내지 1135 mg, 1135 내지 1235 mg, 또는 1235 내지 1387 mg 범위의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체의 양을 포함할 수 있다.
각각의 전술한 약학적 조성물은 면역관문 억제제 분자를 더 포함할 수 있다. 상기 면역관문 억제제 분자는 면역관문에 대한 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 상기 면역관문은 LAG3, TIM3, TIGIT, VISTA, BTLA, OX40, CD40, 4-1BB, CTLA4, PD-1, PD-L1, GITR, B7-H3, B7-H4, KIR, A2aR, CD27, CD70, DR3, 및 ICOS로부터 선택될 수 있거나, 상기 면역관문은 CTLA4, PD-1 또는 PD-L1일 수 있다.
각각의 전술한 약학적 조성물은 PD1, PD-L1, CTLA4, AXL, ROR2, CD3, HER2, B7-H3, ROR1, SFRP4 및 WNT 단백질로부터 선택되는 항원에 대한 항체 또는 항체 단편을 더 포함할 수 있다. 상기 WNT 단백질은 WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11 및 WNT16으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술한 본 발명의 임의의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 포함하는 진단 또는 치료용 키트를 제공한다.
도 1은 암 전이 및 진행에서 EpCAM의 기능의 도식적 표현을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 항-EpCAM 항체의 예시적인 중쇄 가변 영역의 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 항-EpCAM 항체의 예시적인 경쇄 가변 영역의 서열 정렬을 나타낸다.
도 4는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정된, 상이한 pH의 값에서 인간 EpCAM에 대한 본 발명의 예시적인 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)에 의해 측정된, 2가지 상이한 양의 항체에 대해 상이한 pH의 값에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 본 발명의 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 FACS에 의해 측정된, 2가지 상이한 양의 항체에 대해 상이한 pH의 값에서 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 본 발명의 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포를 사멸시키기 위한 본 발명의 MMAE 접합된 항-EpCAM 항체의 세포 사멸 활성을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 본 발명의 접합된 항-EpCAM 항체를 사용하여 종양 이종이식 마우스의 치료 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9e는 ELISA에 의해 측정된, 인간 EpCAM에 대한 본 발명의 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 10은 ELISA에 의해 측정된, pH 적정 하에 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 11a 내지 도 11e는 ELISA에 의해 측정된, cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 12는 ELISA에 의해 측정된, pH 적정 하에 cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13b는 ELISA에 의해 측정된, 상이한 온도로 열처리 후 pH 6.0 (도 13a) 및 pH 7.4 (도 13b)에서 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14b는 FACS에 의해 측정된, 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 15a 내지 도 15b는 FACS에 의해 측정된, 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 16a 내지 도 16b는 FACS에 의해 측정된, cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 17a 내지 도 17b는 ELISA에 의해 측정된, 인간 EpCAM에 대한 본 발명의 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 18a 내지 도 18b는 ELISA에 의해 측정된, cyno EpCAM에 대한 본 발명의 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 19a는 pH 적정과 ELISA에 의해 측정된, 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 19b는 pH 적정과 ELISA에 의해 측정된, cyno EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 20a 내지 도 20b는 ELISA에 의해 측정된, 상이한 온도로 열처리 후 pH 6.0 (도 20a) 및 pH 7.4 (도 20b)에서 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21b는 FACS에 의해 측정된, pH 6.0 (도 21a) 및 pH 7.4 (도 21b)에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 22a 내지 도 22b는 FACS에 의해 측정된, pH 6.0 (도 22a) 및 pH 7.4 (도 22b)에서 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 23a 내지 도 23b는 FACS에 의해 측정된, pH 6.0 (도 23a) 및 pH 7.4 (도 23b)에서 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 24a 내지 도 24c는 pH 6.0 (도 24a), pH 6.5 (도 24b) 및 pH 7.4 (도 24c)에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 세포 사멸 활성을 나타낸다.
도 25a 내지 도 25c는 pH 6.0 (도 25a), pH 6.5 (도 25b) 및 pH 7.4 (도 25c)에서 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 세포 사멸 활성을 나타낸다.
도 26a 내지 도 26c는 pH 6.0 (도 26a), pH 6.5 (도 26b) 및 pH 7.4 (도 26c)에서 인간 EpCAM이 없는 293F 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 세포 사멸 활성을 나타낸다.
도 27a 내지 도 27c는 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체를 사용하여 종양 이종이식 마우스의 치료 결과를 나타낸다.
도 28a 내지 도 28b는 종양 미세환경의 pH (도 28a) 및 정상 생리학적 pH (도 28b)에서 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 29a 내지 도 29b는 pH 6.0 (도 29a) 및 pH 7.4 (도 29b)에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포의 억제에 있어서 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 세포독성을 나타낸다.
도 29c는 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체를 사용하여 종양 이종이식 마우스의 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.
도 30a 내지 도 30c는 ELISA에 의해 측정된, 인간 EpCAM에 대한 본 발명의 추가적인 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 30d 내지 도 30e는 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포를 사멸시키기 위한 본 발명의 MMAE 접합된 항-EpCAM 조건부 활성 항체의 세포 사멸 활성을 나타낸다.
도 31a 내지 도 31c는 ELISA에 의해 측정된, cyno EpCAM에 대한 추가적인 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 31d 내지 도 31e는 cyno EpCAM을 발현하는 HEK293 세포를 사멸시키기 위한 본 발명의 MMAE 접합된 항-EpCAM 조건부 활성 항체의 세포 사멸 활성을 나타낸다.
도 32a는 비히클, 비-조건부 활성 항체 벤치마크 BA-150-06-BF1 및 동종형 대조군과 비교하여, 본 발명의 이중특이성 항체 (WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3)에 의한 종양 이종이식 마우스의 치료에 대한 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 32b는 비히클, 비-조건부 활성 항체 벤치마크 BA-150-06-BF1 및 이소형 대조군과 비교하여, 본 발명의 이중특이성 항체 (WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3)에 의한 말초 순환 시스템에서 감소된 T-세포 활성화를 나타낸다.
도 33은 비히클, 비-조건부 활성 항체 벤치마크 BA-150-15-01-03-BF1 및 동종형 대조군과 비교하여, 본 발명의 단일 조건부 활성 이중특이성 항체 (WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-15-01-03-BF46) 및 본 발명의 이중 조건부 활성 이중특이성 항체 (CAB EpCAM x CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45)에 의한 종양 이종이식 마우스의 치료에 대한 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 34는 독성, 인터루킨-6(IL6) 수준에 대한 효과 및 CD3+ 수준에 대한 효과에 대해 야생형 WT EpCAM x WT CD3 BA-150-06-BF1 항체에 대비 단일 조건부 활성 이중특이성 항체 WT E pCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3을 테스트한 결과를 나타낸다.
도 35는 구축된 4개의 키메라 인간/마우스 EpCAM-ECD 분자에 대한 서열 정렬을 나타내며, 인간 EpCAM-ECD(상단)은 참조로서 사용된다. 아미노산 차이만 나타낸다. 정렬에서의 아미노산 넘버링은 도 39에 나타낸 PDB 엔트리 4mvz에서의 넘버링과 일치한다.
도 36은 ELISA에 의해 결정된, 상이한 EpCAM ECD에 대한 항-EpCAM 클론 BA-105-04-01-05 (BAP-105.4-01-05로도 지칭됨)의 결합 데이터를 나타낸다.
도 37은 인간 EpCAM의 치밀한, 시스테인-풍부 N-도메인 (잔기 24-62) 내의 BA-105-04-01-05에 대한 결합 영역 및 항-EpCAM 클론 BA-105-04-01-05의 7개의 돌연변이체 (M1-M7)의 결합 영역을 나타낸다. 정렬에서의 아미노산 넘버링은 도 39에 나타낸 PDB 엔트리 4mvz에서의 넘버링과 일치한다.
도 38은 ELISA에 의해 결정된, huEpCAM에 대한 7개의 돌연변이체 M1-M7에 대한 결합 데이터를 나타낸다.
도 39는 Pavsic 등, Nature Commun. (2014)에서와 같이, 아미노산 넘버링 및 PyMol로 시각화된 PDB 엔트리 4mzv로부터의 구조를 사용하여 huEpCAM 구조 상에 매핑된 에피토프를 나타낸다.
정의
본원에 제공된 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해, 자주 나타나는 특정 용어가 본원에 정의된다.
측정된 양과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "약"은 측정 목적 및 사용된 측정 장비의 정밀도에 상응하는 수준의 주의를 기울이고, 측정을 수행하는 숙련된 기술자에 의해 예상될 수 있는 측정된 양의 정상적인 변동을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, "약"은 제공된 값의 +/- 10% 변동을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "친화성"은 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기술된 것을 포함하여, 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예시적이고 바람직한 구현예가 하기에 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "친화성 성숙된" 항체는 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여, 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체 친화성의 개선을 초래한다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 아미노기 (--NH2) 및 카르복실기 (--COOH)를; 바람직하게는 유리기로서 또는 대안적으로 축합 후 펩티드 결합의 일부로서 함유하는 임의의 유기 화합물을 지칭한다. "20개의 자연적으로 암호화된 폴리펩티드 형성 알파-아미노산"은 당업계에서 이해되고, 하기를 지칭한다: 알라닌 (ala 또는 A), 아르기닌 (arg 또는 R), 아스파라긴 (asn 또는 N), 아스파르트산 (asp 또는 D), 시스테인 (cys 또는 C), 글루탐산 (glu 또는 E), 글루타민 (gin 또는 Q), 글리신 (gly 또는 G), 히스티딘 (his 또는 H), 이소류신 (ile 또는 I), 류신 (leu 또는 L), 라이신 (lys 또는 K), 메티오닌 (met 또는 M), 페닐알라닌 (phe 또는 F), 프롤린 (pro 또는 P), 세린 (ser 또는 S), 트레오닌 (thr 또는 T), 트립토판 (tip 또는 W), 티로신 (tyr 또는 Y), 및 발린 (val 또는 V).
본원에 사용된 용어 "항체"는 온전한(intact) 면역글로불린 분자뿐만 아니라 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자의 단편, 예컨대, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 SCA 단편을 지칭한다. 이들이 유래된 항체의 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 항원)에 선택적으로 결합하는 일부 능력을 유지하는 이러한 항체 단편은 당업계에 널리 공지된 방법 (예를 들어, Harlow 및 Lane, 상기 참조)을 사용하여 제조할 수 있으며, 하기에 추가로 기술되어 있다. 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 항원의 분취량을 단리하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체의 다양한 다른 용도는 질환 (예를 들어, 신생물)을 진단 및/또는 병기결정하고, 예를 들어 신생물, 자가면역 질환, AIDS, 심혈관 질환, 감염 등과 같은 질환을 치료하기 위한 치료적 적용을 위한 것이다. 키메라, 인간-유사, 인간화 또는 완전 인간 항체는 인간 환자에게 투여하는데 특히 유용하다. 본 발명의 항체 및 항체 단편은 동일한 유형의 활성, 예를 들어 EpCAM 단백질에 대한 결합 활성 또는 친화성을 갖는 모 항체 또는 항체 단편의 진화 또는 돌연변이에 의해 수득될 수 있다.
Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원-결합 단편으로 구성되며, 전체 항체 분자를 효소 파파인으로 분해하여 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 단편을 생성함으로써 생산할 수 있다.
항체 분자의 Fab' 단편은 전체 항체 분자를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 분자를 생성함으로써 수득할 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체 분자 당 2개의 Fab' 단편이 수득된다.
항체의 (Fab')2 단편은 후속 환원없이 효소 펩신으로 전체 항체 분자를 처리함으로써 수득할 수 있다. (Fab')2 단편은 2개의 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편의 이량체이다.
Fv 단편은 2개의 사슬로서 표현되는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작된 단편으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "항-EpCAM 항체", "EpCAM 항체" 및 "EpCAM에 결합하는 항체"는 항체가 EpCAM을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 EpCAM에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 관련되지 않은 비-EpCAM 단백질에 대한 항-EpCAM 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정 시, EpCAM에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, EpCAM에 결합하는 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13　M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-EpCAM 항체는 상이한 종으로부터의 EpCAM 중에서 보존되는 EpCAM의 에피토프, 예를 들어, EpCAM의 세포외 도메인에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "결합"은 항원 상의 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 따른 상호작용으로 항원과 항체의 가변 영역 또는 Fv의 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 항체 가변 영역 또는 Fv는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 본원에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체 가변 영역 또는 Fv가 다른 단백질보다 특정 항원과 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 지속기간 동안 및/또는 더 큰 친화성으로 결합하거나 회합(association)하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체 가변 영역 또는 Fv는 다른 항원에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력(avidity)으로, 더 용이하게, 및/또는 더 긴 지속기간 동안 이의 항원에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예로서, 항체 가변 영역 또는 Fv는 관련 단백질 또는 다른 세포 표면 단백질 또는 다중반응성 천연 항체 (즉, 인간에서 자연적으로 발견되는 다양한 항원에 결합하는 것으로 공지된 자연 발생의 항체)에 의해 통상적으로 인식되는 항원에 대한 것보다, 실질적으로 더 큰 친화성으로 세포 표면 단백질 (항원)에 결합한다. 그러나, "특이적으로 결합하는"은 반드시 다른 항원의 배타적 결합 또는 검출 불가능한 결합을 필요로 하지 않으며, 이는 용어 "선택적 결합"을 의미한다. 일례에서, 항원에 대한 항체 가변 영역 또는 Fv (또는 다른 결합 영역) 결합의 "특이적 결합"은 항체 가변 영역 또는 Fv가 100 nM 이하, 예컨대, 50 nM 이하, 예를 들어 20 nM 이하, 예컨대, 15 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 또는 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 평형 상수 (KD)로 항원에 결합하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간세포 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 일 구현예에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 용어 "화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드(CYTOXAN®); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대, 인다인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마 1I 및 칼리케아미신 오메가 I1 (예를 들어, Nicolaou 등, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질(chromoprotein) 인다인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (DOXIL®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®), 페길화된 리포솜 독소루비신 (CAELYX®), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대, 메토트렉세이트, 젬시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르 (UFTORAL®), 카페시타빈 (XELODA®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 배당체; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (ABRAXANE™), 및 도세탁셀 (TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대, 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, ELOXATIN®), 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®), 빈크리스틴 (ONCOVIN®), 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®), 및 비노렐빈 (NAVELBINE®)을 포함하는, 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카스(vincas); 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMF®); 벡사로텐 (TARGRETIN®)을 포함하는, 레티노이드, 예컨대, 레티노산; 비스포스포네이트, 예컨대, 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 파미드로네이트 (AREDIA®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리세드로네이트 (ACTONEL®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)와 같은 비정상적인 세포 증식과 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것; 백신, 예컨대, THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); BAY439006 (소라페닙; Bayer); SU-11248 (수니티닙, SUTENT®, Pfizer); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (VELCADE®), CCI-779; 티피파닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대, 오블리머센 나트륨 (GENASENSE®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (하기 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대, 라파마이신 (시롤리무스, RAPAMUNE®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대, 로나파르닙 (SCH 6636, SARASAR™); 및 상기 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산, 또는 유도체; 뿐만 아니라, 상기 2개 이상의 조합물, 예컨대, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)을 사용한 치료 요법의 약어인 FOLFOX를 포함한다.
본원에 정의된 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단, 또는 억제하는 작용을 하는, "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는 호르몬 자체일 수 있다: 타목시펜 (NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜, 토레미펜 (FARESTON®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (EVISTA®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대, SERM3를 포함하는, 혼합 작용제/길항제 프로파일을 갖는 항-에스트로겐; 작용제 특성이 없는 순수 항-에스트로겐, 예컨대, 풀베스트란트 (FASLODEX®), 및 EM800 (이러한 제제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고, DNA 결합을 억제하며, ER 턴오버(turnover)를 증가시키고/시키거나 ER 수준을 저해할 수 있음); 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대, 포르메스탄 및 엑세메스탄 (AROMASIN®)을 포함하는, 아로마타제 억제제, 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대, 아나스트라졸 (ARIMIDEX®), 레트로졸 (FEMARA®) 및 아미노글루테티미드, 및 보로졸 (RIVISOR®), 메게스트롤 아세테이트 (MEGASE®), 파드로졸, 및 4(5)-이미다졸을 포함하는, 다른 아로마타제 억제제; 류프롤라이드 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린, 부세렐린, 및 트립토렐린을 포함하는, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 작용제; 프로게스틴, 예컨대, 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대, 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대, 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티노산 및 펜레티나이드을 포함하는, 성 스테로이드; 오나프리스톤; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 항-안드로겐, 예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 및 비칼루타미드; 및 상기 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 2개 이상의 조합.
본원에 사용된 용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종에서 유래되는 반면, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 상이한 공급원 또는 종에서 유래되는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조건부 활성 항체(conditionally active antibody)"는 비-종양 미세환경에서의 조건 하에 비해 종양 미세환경에서의 조건 하에 더 활성인 항-EpCAM 항체를 지칭한다. 종양 미세환경의 조건은 비-종양 미세환경과 비교하여 더 낮은 pH, 더 높은 농도의 락테이트 및 피루베이트, 저산소증, 더 낮은 농도의 글루코스 및 다소 높은 온도를 포함한다. 예를 들어, 조건부 활성 항체는 정상 체온에서 사실상 비활성이지만, 종양 미세환경의 더 높은 온도에서는 활성이다. 또 다른 측면에서, 조건부 활성 항체는 정상적인 산소화된 혈액에서 덜 활성이지만, 종양에 존재하는 덜 산소화된 환경 하에서는 더 활성이다. 또 다른 측면에서, 조건부 활성 항체는 정상적인 생리학적 pH 7.2-7.8에서 덜 활성이지만, 종양 미세환경에 존재하는 산성 pH 5.8-7.0, 또는 6.0-6.8 하에서는 더 활성이다. 당업자에게 공지된 종양 미세환경에서의 다른 조건이 또한 본 발명에서 항-EpCAM 항체가 EpCAM에 대해 상이한 결합 친화성을 갖는 조건으로서 사용될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "세포증식 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 정지시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 세포증식 억제제는 S기에서 세포의 퍼센트를 유의적으로 감소시키는 하나일 수 있다. 세포증식 억제제의 추가 예는 G0/G1 정지 또는 M-기 정지를 유도함으로써 세포 주기 진행을 차단하는 제제를 포함한다. 인간화 항-Her2 항체 트라스투주맙 (HERCEPTIN®)은 G0/G1 정지를 유도하는 세포증식 억제제의 예이다. 전통적인 M-기 차단제는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 특정 제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C는 또한 S-기 정지까지 파급된다. 추가 정보는 Mendelsohn 및 Israel, eds., Murakami 등에 의해 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)로 제목 붙여진 The Molecular Basis of Cancer, 1장, 예를 들어, p. 13에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 모두 주목나무에서 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목나무에서 유래된 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세소관의 조립(assembly)을 촉진하고, 해중합을 방지하여 미세소관을 안정화시키며, 이는 세포에서 유사분열의 억제를 야기한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵산 분해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대 단편 및/또는 이의 변이체를 포함하는, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "디아바디(diabody)"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다.
본원에 사용된 용어 "검출가능한 표지"는 물리적 또는 화학적 수단에 의한 직접적이거나 간접적인 검출 또는 측정이 샘플 중 항원의 존재를 나타내는 임의의 물질을 지칭한다. 유용한 검출가능한 표지의 대표적인 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 흡광, 형광, 반사, 광 산란, 인광, 또는 발광 특성을 기반으로 하여 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 분자 또는 이온; 이들의 방사성 특성에 의해 검출가능한 분자 또는 이온; 이들의 핵자기공명 또는 상자성(paramagnetic) 특성에 의해 검출가능한 분자 또는 이온. 예를 들어, 흡광성 또는 형광성을 기반으로 간접적으로 검출가능한 분자의 그룹 중에는 적절한 기질을, 예를 들어 비-흡광성 분자에서 흡광성 분자로, 또는 비-형광성 분자에서 형광성 분자로 전환되도록 하는 다양한 효소가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "진단"은 질환 또는 장애에 대한 대상체의 감수성 결정, 대상체가 현재 질환 또는 장애에 의해 영향을 받는지의 여부에 대한 결정, 질환 또는 장애에 의해 영향을 받은 대상체의 예후 (예를 들어, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 확인, 암의 병기결정, 또는 치료법에 대한 암 반응성), 및 테라메트릭스(therametrics) (예를 들어, 치료 효과 또는 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 대상체의 상태를 모니터닝하는 것)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 진단 방법은 초기 암 단계를 검출하는 데 특히 유용하다.
본원에 사용된 용어 "진단제"는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있고, 진단 목적을 위해 사용되는 분자를 지칭한다. 진단제는 대상체 또는 샘플에 투여될 수 있다. 진단제는 그 자체로 제공될 수 있거나, 조건부 활성 항체와 같은 비히클에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 동종형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에 사용된 제제, 예를 들어 약학적 제형의 "유효량"이라는 용어는, 소정의 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991에 기술된 바와 같이, EU 인덱스라고도 하는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역 (중쇄에서의 CDR 또는 H1-3 및 경쇄에서의 L1-3) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 또는 "전체 항체"는 항원-결합 가변 영역 (VH 또는 VL) 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 항체를 지칭한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 이들의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 전장 항체는 상이한 "클래스"로 지정될 수 있다. 전장 항체에는 5가지 주요 클래스, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 "서브클래스"(동종형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭된다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 용어 "기능-보존적 변이체"는 단백질 또는 효소 내의 주어진 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 전체 입체구조 및 기능을 변경함 없이 변화된 것을 지칭하는 것으로, 이는 (예를 들어, 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등과 같은) 유사한 특성을 갖는 아미노산으로의 대체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유사한 기능의 임의의 두 단백질 간의 단백질 또는 아미노산 서열 유사성 퍼센트는 다양할 수 있고, 예를 들어, 유사성이 MEGALIGN 알고리즘을 기반으로 하는, 클러스터 방법에 의한 것과 같은 정렬 체계에 따라 결정시 70% 내지 99%일 수 있도록 보존적인 것으로서 나타낸 것 이외에 아미노산은 단백질에서 상이할 수 있다. "기능-보존적 변이체"는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정시 적어도 60% 아미노산 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖고, 비교되는 천연 또는 모 단백질과 동일하거나, 또는 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 세포의 자손(progeny)을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어 모 세포와 완전히 동일할 수 없고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초에 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특이적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
본원에 사용된 용어 "인간화" 항체는 비-인간 CDR 유래의 아미노산 잔기 및 인간 FR 유래의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-인간 항체의 CDR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체"는 세포독성제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에 사용된 용어 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "세포 성장 또는 증식을 억제하는"은 세포의 성장 또는 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 감소시키는 것을 의미하고, 세포 사멸을 유도하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC))에 의해 결정된 바와 같이, 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토를 위해, 예를 들어 Flatman 등,　J. Chromatogr. B, vol.　848, pp. 79-87, 2007을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "항-EpCAM 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하는 것으로서, 단일 벡터 또는 별개의 벡터들에 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 암세포가 원발성 종양으로부터 분산되어, 림프 및/또는 혈관 내로 침투하고, 혈류를 통해 순환하여, 신체의 다른 곳의 정상 조직 중 원거리 병소에 성장 (전이)하도록 지원하는 모든 EpCAM-관여 과정을 지칭한다. 특히, 이는 전이의 기초가 되고 EpCAM에 의해 자극되거나 매개되는 증식, 이동, 부착(anchorage) 비의존성, 아폽토시스 회피 또는 혈관신생 인자의 분비와 같은 종양 세포의 세포 이벤트를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "미세환경"은 신체 조직 또는 영역 중 다른 영역과 지속적인 또는 일시적인, 물리적 또는 화학적 차이를 갖는 조직 또는 신체의 임의의 부위 또는 영역을 의미한다. 종양의 경우, 본원에 사용된 용어 "종양 미세환경"은 종양이 존재하는 환경을 지칭하며, 이는 종양 내의 비-세포 영역 및 종양성 조직 바로 외부의 영역이나, 암세포 자체의 세포내 구획에 속하지 않는다. 종양 및 종양 미세환경은 밀접한 관련이 있고 지속적으로 상호작용한다. 종양은 그 미세환경을 변화시킬 수 있고, 그 미세환경은 종양이 성장하고 확산되는 방식에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 종양 미세환경은 5.0 내지 7.0 범위, 또는 5.0 내지 6.8 범위, 또는 5.8 내지 6.8 범위, 또는 6.2 내지 6.8 범위의 낮은 pH를 갖는다. 한편, 정상적인 생리학적 pH는 7.2 내지 7.8 범위이다. 종양 미세환경은 또한 혈장과 비교하여 더 낮은 농도의 글루코스 및 다른 영양소를 갖지만, 더 높은 농도의 젖산을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 종양 미세환경은 정상적인 생리학적 온도보다 0.3 내지 1℃ 더 높은 온도를 가질 수 있다. 종양 미세환경은 Gillies. 등, "MRI of the Tumor Microenvironment," Journal of Magnetic Resonance Imaging, vol. 16, pp.430-450, 2002에서 논의되었으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 용어 "비-종양 미세환경"은 종양 이외의 부위에서의 미세환경을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단에 포함되는 개별 항체는 예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단클론성 항체 제제의 생산 동안 발생하는, 가능한 변이체 항체를 제외하고는, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 이는 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본원에 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "네이키드 항체(naked antibody)"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학적 제형에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "패키지 삽입물(package insert)"은 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 지침서를 지칭하는데 사용되며, 이는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용량, 투여량, 투여, 조합 치료법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
본원에 사용된 참조 폴리펩티드 서열에 관한 용어 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 서열 동일성의 최대 퍼센트를 달성하기 위해 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센티지로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해 아미노산 서열 동일성% 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용함으로써 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 소스 코드는 워싱턴 D.C. 20559에 소재하는 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는, UNIX 운영 시스템 상에서 사용되도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 변동되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 적용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그 서열 B와, 또는 그 서열 B 대비 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성% (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그 서열 B와, 또는 그 서열 B 대비 특정 아미노산 서열 동일성%를 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수도 있음)는 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2가 해당 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 동일한 일치(match)로서 점수를 매긴 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B의 총 아미노산 잔기의 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성%와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성% 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기술된 바와 같이 수득된다.
본원에 사용된 용어 "약학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이고, 상기 제형이 투여될 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외에 약학적 제형의 성분을 지칭하며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "정제된" 및 "단리된"은 지시된 분자인, 본 발명에 따른 항체 또는 뉴클레오티드 서열이 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재함을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "정제된"은 바람직하게는 동일한 유형의 생물학적 거대분자가 적어도 75 중량%, 보다 바람직하게는 적어도 85 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95 중량%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98 중량%로 존재함을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 상기 폴리펩티드를 암호화하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다; 그러나, 상기 분자는 조성물의 기본 특징에 유해한 영향을 미치지 않는 일부 추가의 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 항체"는 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 지칭한다. 재조합 항체를 생산하기 위한 "숙주 세포"의 예는 (1) 포유동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO), COS, 골수종 세포 (Y0 및 NS0 세포 포함), 새끼 햄스터 신장 (BHK), Hela 및 Vero 세포; (2) 곤충 세포, 예를 들어, sf9, sf21 및 Tn5; (3) 식물 세포, 예를 들어, 니코티아나 속에 속하는 식물 (예를 들어, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); (4) 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 속 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)) 또는 아스퍼질러스 속 (예를 들어, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger))에 속하는 것; (5) 박테리아 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia. coli) 세포 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단일 사슬 Fv"("scFv")는 펩티드-암호화 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 일반적으로 발현되는 공유결합된 VH::VL 이종이량체이다. "dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정화된 VH::VL 이종이량체이다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv의 회합에 의해 자발적으로 형성될 수 있거나, 또는 2가 sc(Fv)2와 같은 펩티드 링커에 의해 1가 scFv를 커플링시킴으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 항체의 "치료적 유효량"이란 용어는 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율로 상기 암을 치료하는데 충분한 항체의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 항체 및 조성물의 총 1일 사용량은 타당한 의료적 판단 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특정 항체의 활성; 적용되는 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식이; 적용되는 특정 항체의 투여 시간, 투여 경로, 및 배설 속도; 치료 기간; 적용되는 특정 항체와 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의료 분야에 널리 공지된 유사 요인을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 소정의 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준보다 낮은 수준에서 화합물의 용량을 개시하고, 소정의 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 기술 내에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 치료되는 개체의 자연적 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 중재를 지칭하며, 이는 예방을 위해, 또는 임상 병리학적 경과 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 예방, 질환의 진행 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
본원에 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. (예를 들어, Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 페이지 91 (2007). 참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, Portolano 등,　J. Immunol., vol.　150, pp. 880-887, 1993; Clarkson 등,　Nature, vol.　352, pp. 624-628, 1991을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제성 핵산 구조로서의 벡터, 뿐만 아니라 이가 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
상세한 설명
예시적인 목적을 위해, 본 발명의 원리는 다양한 예시적인 구현예를 참조하여 기술된다. 본 발명의 특정 구현예가 본원에서 구체적으로 기술되지만, 당업자는 동일한 원리가 다른 시스템 및 방법에 동일하게 적용되고 사용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 본 발명의 개시된 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 도시된 임의의 특정 구현예의 세부사항에 이의 적용이 제한되지 않음을 이해해야 한다. 추가적으로, 본원에 사용된 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한을 위한 것이 아니다. 더욱이, 특정 방법이 특정 순서로 본원에 제시되는 단계를 참조하여 기술되지만, 많은 경우에 이러한 단계는 당업자에 의해 인식될 수 있는 임의의 순서로 수행될 수 있다; 따라서 신규 방법은 본원에 개시된 단계의 특정 배열에 제한되지 않는다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "한(a)", "하나(an)", 및 "그(the)"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 또한, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하여(including)", "갖는(having)" 및 "로 구성된(constructed from)"은 또한 상호교환적으로 사용될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 퍼센트, 비율, 반응 조건 등을 나타내는 모든 수치는 용어 "약"이 존재하든지 또는 존재하지 않든지 간에, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 본 개시에 의해 얻고자 하는 소정의 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 숫자의 수치에 비추어, 그리고 통상의 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다. 본 개시의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 매개변수는 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로, 이들의 각 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인하는 특정 오차를 함유한다.
본원에 개시된 각 성분, 화합물, 치환기, 또는 매개변수는 단독으로 또는 본원에 개시된 각각 및 모든 다른 성분, 화합물, 치환기, 또는 매개변수 중 하나 이상과 조합하여 사용하기 위해 개시된 것으로서 해석되어야 함을 이해해야 한다.
본원에 개시된 각각의 성분, 화합물, 치환기, 또는 매개변수에 대한 각각의 양/값 또는 양/값의 범위는 또한 본원에 개시된 임의의 다른 성분(들), 화합물(들), 치환기(들), 또는 매개변수(들)에 대해 개시된 각각의 양/값 또는 양/값의 범위와 조합하여 개시되어 있는 것으로도 해석되어야 하고, 이에 따라 본원에 개시된 2개 이상의 성분(들), 화합물(들), 치환기(들), 또는 매개변수에 대한 양/값 또는 양/값의 범위의 임의의 조합은 또한 본 명세서의 목적을 위해 서로 조합하여 개시되는 것으로도 이해되어야 한다.
추가로, 본원에 개시된 각 범위의 각각의 하한은 동일한 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수에 대해 본원에 개시된 각 범위의 각각의 상한과 조합하여 개시되는 바와 같이 해석되어야 하는 것으로 이해된다. 따라서, 2개 범위의 개시는 각 범위의 각각의 하한과 각 범위의 각각의 상한을 조합함으로써 유도되는 4개 범위의 개시로서 해석되어야 한다. 3개 범위의 개시는 각 범위의 각각의 하한과 각 범위의 각각의 상한을 조합함으로써 유도되는 9개 범위의 개시 등으로서 해석되어야 한다. 또한, 본 명세서 또는 실시예에 개시된 성분, 화합물, 치환기, 또는 매개변수의 특정 양/값은 범위의 하한 또는 상한의 개시로서 해석되어야 하며, 따라서 본 출원의 다른 부분에 개시되어 있는 동일한 성분, 화합물, 치환기, 또는 매개변수에 대한 범위의 임의의 다른 하한 또는 상한, 또는 특정 양/값과 조합되어 해당 성분, 화합물, 치환기, 또는 매개변수에 대한 범위를 형성할 수 있다.
A. 항-EpCAM 폴리펩티드 및 항체
일 측면에서, 본 발명은 EpCAM, 특히 인간 EpCAM 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 중쇄 가변 영역은 서열 H1, H2, 및 H3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되;
상기 X1은 Y 또는 D이다.
상기 H2 서열은 YIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 22), 및 DIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 23)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 예시적인 중쇄 가변 영역의 정렬은 도 2에 도시되어 있으며, 여기서 상보성 결정 영역 H1, H2, 및 H3은 박스로 둘러싸여 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 EpCAM에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 경쇄 가변 영역은 서열 L1, L2, 및 L3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되;
상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이다.
상기 L2 서열은 STSNLAS (서열번호 24), 및 STSNLHS (서열번호 25)로부터 선택될 수 있다. 상기 L3 서열은 HQWSTYHT (서열번호 26), HQWSTYET (서열번호 27), 및 EQWSTYHT (서열번호 28)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 예시적인 경쇄 가변 영역의 정렬은 도 3에 도시되어 있으며, 여기서 상보성 결정 영역 L1, L2, 및 L3은 박스로 둘러싸여 있다.
본 발명의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 미국 특허 제8,709,755호에 개시된 방법을 사용하여 모 항체로부터 수득하였다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 생성하는 방법, 뿐만 아니라 미국 특허 제8,709,755호에 개시된 항체 및 항체 단편을 생성하는 방법은 이로써 본원에 참조로 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 도 2에 도시되는 중쇄 가변 영역 및 도 3에 도시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 도 2의 7개 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7 내지 13에 제시되어 있다. 도 3의 8개 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 14 내지 21에 제시되어 있다.
보다 구체적인 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 H1, H2, 및 H3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하고, 여기서:
H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되;
상기 X1은 Y 또는 D이고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열 L1, L2, 및 L3을 갖는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되;
상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이고, 단, X1, X2, X3 및 X4는 동시에 Y, A, H, 및 H일 수 없다.
일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 임의의 한 쌍의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 각 영역은 각각 독립적으로 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 EpCAM에 특이적으로 결합한다.
이러한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 및 항체 단편은 EpCAM, 특히 인간 EpCAM에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 중쇄 가변 영역 중 하나 및 이러한 경쇄 가변 영역 중 하나의 조합을 포함하는 항체 또는 항체 단편은 비-종양 미세환경 (예를 들어, pH 7.0-7.6)에서의 pH보다 종양 미세환경 (예를 들어, pH 6.0-6.8)에서의 pH에서 EpCAM에 대한 더 높은 결합 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그 결과, 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 전형적인 정상 조직 미세환경에서 EpCAM에 대한 이들의 결합 친화성과 비교하여 종양 미세환경에서 EpCAM에 대한 더 높은 결합 친화성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 정상 조직 미세환경에서 EpCAM에 대한 이들의 감소된 결합 친화성으로 인해, 비-조건부 활성인 항-EpCAM 항체에 비해 감소된 부작용을 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 또한 당업계에 공지된 단클론성 항-EpCAM 항체에 필적하는 효능을 가질 것으로 예상된다. 이러한 특징의 조합은 감소된 부작용으로 인해, 이러한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 더 높은 투여량의 사용을 허용하며, 이는 보다 효과적인 치료 옵션을 제공할 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 비-종양 미세환경에서 발생하는 동일한 조건의 상이한 값과 비교하여 종양 미세환경에서의 조건 값에서 EpCAM 단백질에 대해 더 높은 항원 결합 활성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조건은 pH이다.
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 또한 pH 6.0에서 이가 유래되는 모 항체 또는 항체 단편의 동일한 항원 결합 활성과 비교하여 pH 6.0에서 적어도 70%의 항원 결합 활성을 가질 수 있으며, 상기 항체 또는 항체 단편은 pH 7.4에서 이가 유래되는 모 항체 또는 항체 단편의 동일한 항원 결합 활성과 비교하여 pH 7.4에서 50% 미만, 또는 40% 미만, 또는 30% 미만, 또는 20% 미만 또는 10% 미만의 항원 결합 활성을 가질 수 있다. 상기 항원 결합 활성은 예를 들어, EpCAM 단백질에 대한 결합 또는 CD3에 대한 결합일 수 있다.
각각의 이전 구현예에서, 항원 결합 활성은 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 도 2 및 도 3에 제시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 7 내지 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 도 2 및 도 3에 제시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 변이체, 및 EpCAM, 특히 인간 EpCAM에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 7 내지 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 변이체는 상이한 H1, H2, H3, L1, L2 또는 L3 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 상보성 결정 영역 외부의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 이러한 변이체를 제공하기 위해, 본 출원에서 논의된 바와 같이 치환, 삽입 및 결실의 원리에 따라 돌연변이될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 불변 영역은 이러한 변이체를 제공하기 위해 변형될 수 있다.
이러한 변이체를 유도함에 있어서, 하나는 본원에 기술된 바와 같은 공정에 의해 유도된다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 변이체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열 내로의 삽입 및/또는 상기 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 이르도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단, 이들은 소정의 특성, 예를 들어, 인간 EpCAM에 대한 항원-결합 및/또는 조건부 활성을 보유한다.
치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 또는 항체 단편 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 부위는 CDR 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 1에 제공되며, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 더 기술된다. 아미노산 치환은 관심 항체 또는 항체 단편에 도입될 수 있으며, 소정의 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 항원 결합, 또는 감소된 면역원성에 대해 생성물이 스크리닝된다.
표 1: 아미노산 치환
아미노산은 일반적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 하나의 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 상보성 결정 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성 변이체(들)은 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/것이거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙 항체이며, 이는 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 CDR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지 상에 디스플레이시켜, 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화성을 개선하기 위해 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol., vol. 207, pp. 179-196, 2008 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 테스트된다. 2차 라이브러리를 구성하고 이로부터 재선택함에 의한 친화성 성숙은 예를 들어 Hoogenboom 등 Methods in Molecular Biology, vol. 178, pp. 1-37, 2001)에 기술되어 있다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) PCR, 사슬 셔플링(shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 그 다음, 2차 라이브러리가 생성된다. 그 다음, 라이브러리를 스크리닝하여 소정의 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 여러 CDR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화되는 CDR-지정 접근법을 수반한다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3은 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그러한 변경이 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 보존적 치환)은 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟(hotspot)" 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각 CDR은 변경되지 않거나, 또는 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 Cunningham 및 Wells, Science, vol. 244, pp. 1081-1085, 1989에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 지칭된다. 이 방법에서, 표적 잔기 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu과 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 그룹을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여, 항체 또는 항체 단편과 항원의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 결정한다. 추가 치환은 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체 또는 항체 단편 및 항원 간의 접점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 소정의 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C- 말단으로의 융합을 포함한다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 이는 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 인간화 항체가 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 비-인간 동물에서 유래되는 항체의 VH 및 VL 중 CDR만을 간단히 접목시킴으로써 생산되는 경우, 항원 결합 활성은 비-인간 동물에서 유래된 원래 항체의 것과 비교하여 감소되는 것으로 알려져 있다. 비-인간 항체의 VH 및 VL의 여러 아미노산 잔기는 CDR 뿐만 아니라 FR에서도, 항원 결합 활성과 직접적으로 또는 간접적으로 관련이 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 이러한 아미노산 잔기를 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에서 유래되는 상이한 아미노산 잔기로의 치환은 결합 활성을 감소시킬 것이다. 이 문제를 해결하기 위해, 인간 CDR과 접목된 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중, 항체에 대한 결합과 직접적으로 관련이 있거나, CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 항체의 3차원 구조를 유지하고 항원에 대한 결합과 직접적으로 관련이 있는 아미노산 잔기를 확인하기 위한 시도가 이루어져야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 확인된 아미노산을 비-인간 동물에서 유래된 원래 항체의 아미노산 잔기로 대체함으로써 증가될 수 있다.
변형 및 변화는 본 발명의 항체의 구조, 및 이를 암호화하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있고, 여전히 바람직한 특징을 갖는 항체를 암호화하는 기능성 분자를 수득할 수 있다.
아미노 서열에 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치 아미노산 지수(hydropathic amino acid index)의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다. 아미노산의 상대적 수치 특성은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하고, 이는 결국 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 정의하는 것으로 인정된다. 각 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특징을 기반으로 하여 수치 지수가 지정된다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
본 발명의 추가 목적은 또한 본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체를 포괄한다.
2개의 아미노산 서열은 아미노산의 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 바람직하게는 90% 초과가 동일하거나, 더 짧은 서열의 전체 길이에 걸쳐 약 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과가 유사 (기능적으로 동일)한 경우, "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적으로 유사한" 것이다. 바람직하게는, 유사 또는 상동성 서열은 예를 들어 GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.) 파일업(pileup) 프로그램, 또는 BLAST, FASTA 등과 같은 임의의 서열 비교 알고리즘을 사용하여 정렬함으로써 확인된다.
예를 들어, 특정 아미노산은 상당한 활성의 손실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 성질은 단백질의 생물학적 기능성 활성을 정의하기 때문에, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열에서, 그리고 물론 이의 DNA를 암호화하는 서열에서 이루어질 수 있으나, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 서열, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 상응하는 DNA 서열에서 이들의 생물학적 활성의 상당한 손실 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 고려된다.
특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성하며, 즉, 여전히 생물학적 기능적으로 동등한 단백질이 수득되는 것으로 당업계에 알려져 있다.
따라서, 상기에 개략적으로 설명된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 다양한 전술한 특징을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편이 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 바이안테나리(biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, Wright 등　TIBTECH, vol.　15, pp. 26-32, 1997 참조. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 뿐만 아니라, 바이안테나리 올리고당 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn297에 부착된 모든 당구조(glycostructure) (예를 들어, 복합, 혼성 및 고 만노스 구조)의 합에 대해, Asn297에서의 당 사슬 내 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 297번 위치 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭한다; 그러나, Asn297은 또한 항체의 아주 적은 서열 변이로 인해, 297번 위치의 약 ±3개 아미노산 상류 또는 하류, 즉, 294번과 300번 위치 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국특허 공개번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참조. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 등　J. Mol. Biol., vol.　336, pp. 1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki 등　Biotech. Bioeng., vol.　87, pp. 614-622, 2004. 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 등　Arch. Biochem. Biophys., vol.　249, pp. 533-545, 1986; 미국특허 출원번호 US 2003/0157108 A; 및 WO 2004/056312 A1, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki 등　Biotech. Bioeng., vol.　87, pp. 614-622, 2004; Kanda, Y. 등,　Biotechnol. Bioeng.,　vol. 94, pp. 680-688, 2006; 및 WO2003/085107)를 포함한다.
항체 변이체는 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된 것인, 이등분된 올리고당과 함께 더 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; 미국 특허 제6,602,684호; 및 US 2005/0123546에 기술되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기술되어 있다.
Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대, ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용에 대해 바람직한 후보가 되도록 하는, 전부가 아닌 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 결여되어 있으나 (따라서, ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음), FcRn 결합 활성을 유지하는지 확인하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인, NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol., vol. 9, pp. 457-492, 1991의 464쪽 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호 (예를 들어, Hellstrom 등　Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol.　83, pp. 7059-7063, 1986 참조) 및 Hellstrom, I 등,　Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol.　82, pp. 1499-1502, 1985; 미국 특허 제5,821,337호 (또한, Bruggemann 등,　J. Exp. Med.,　vol. 166, pp. 1351-1361, 1987 참조)에 기술되어 있다. 대안적으로, 비방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, Wis.) 참조. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes 등 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 652-656, 1998에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인하기 위해 C1q 결합 검정을 수행할 수도 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro 등,　J. Immunol. Methods, vol.　202, pp.163-171, 1996; Cragg, M. S. 등,　Blood, vol. 101, pp. 1045-1052, 2003; 및 Cragg, M. S, 및 M. J. Glennie,　Blood, vol. 103, pp. 2738-2743, 2004). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수도 있다 (예를 들어, Petkova, S. B. 등, Int'l. Immunol., vol.　18, pp. 1759-1769, 2006 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 항체 단편의 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하며, 이는 잔기 265 및 297이 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 제7,332,581호).
FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 특정 항체 변이체는 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 Shields 등,　J. Biol. Chem., vol. 9, pp. 6591-6604, 2001 참조).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 치환 (잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, WO 99/51642, 및 Idusogie 등　J. Immunol., vol.　164, pp. 4178-4184, 2000에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 초래하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기 및 태아로 모체 IgG의 전달을 담당하는 (Guyer 등,　J. Immunol., vol.　117, pp. 587-593, 1976 및 Kim 등,　J. Immunol., vol.　24, p. 249, 1994) 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체는 US2005/0014934에 기술되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 다음과 같은 Fc 영역 잔기 중 하나 이상에서 치환을 갖는 것을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환 (미국 특허 제7,371,826호). 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 Duncan & Winter,　Nature, vol.　322, pp. 738-740; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351을 참조한다.
시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 이에 의해 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고, 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜, 본원에 추가로 기술된 바와 같은 면역접합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 5400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 당업계에 공지되어 있고, 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 이에 제한되지는 않으나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 수중에서 이의 안정성으로 인해 제조에 있어 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체 또는 항체 단편에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체 또는 항체 단편의 특별한 특성 또는 기능, 유도체가 정의된 조건 하에서 치료법에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 또는 항체 단편 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.　102, pp. 11600-11605, 2005). 방사선은 임의의 파장인 것일 수 있고, 일반 세포에 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편, 또는 이들의 변이체는 비-종양 미세환경의 조건 하에서 보다 종양 미세환경의 조건 하에서 EpCAM에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 일 구현예에서, 종양 미세환경에서의 조건 및 비-종양 미세환경에서의 조건은 둘 다 pH이다. 따라서, 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 pH 약 5.0-6.8에서 EpCAM에 선택적으로 결합할 수 있지만, 비-종양 미세환경에서 접하는 pH 약 7.2-7.8에서 EpCAM에 대해 더 낮은 결합 친화성을 가질 것이다. 실시예 3 및 6에 나타낸 바와 같이, 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 EpCAM에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 종양 미세환경의 조건 하에서 약 1μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-8M 이하, 또는 10-8M 내지 10-13M, 또는 10-9M 내지 10-13　M)의 EpCAM과의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일 구현예에서, 종양 미세환경의 조건에서 EpCAM과 항체 또는 항체 단편의 Kd 대 비-종양 미세환경의 동일한 조건에서의 Kd의 비율은 적어도 약 1.5:1, 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 70:1, 또는 적어도 약 100:1이다.
일 구현예에서, Kd는 하기 검정을 사용하여 관심 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행되는 방사성표지 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 적정 시리즈의 미표지된 항원의 존재 하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, Chen 등,　J. Mol. Biol.293:865-881 (1999) 참조). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 밤새 코팅한 다음, PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 블로킹한다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, Presta 등, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 관심 Fab는 이후 밤새 인큐베이션한다: 그러나, 인큐베이션은 평형에 도달하는 것을 보장하도록 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속될 수 있다. 이후, 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션을 위해 포획 플레이트로 옮겨진다. 그 다음, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20™; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNT™ 감마 계수기 (Packard) 상에서 10분 동안 계수한다. 20% 이하의 최대 결합을 제공하는 각 Fab의 농도는 경쟁적 결합 검정에 사용하기 위해 선택된다.
다른 구현예에 따르면, Kd는 약 10 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩과 함께, 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)을 공급업체의 지침서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 5 μl/분의 유속으로 주입하기 전에 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 4.8)으로 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석하여, 결합된 단백질의 대략 10 반응 단위(RU)를 달성한다. 항원 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 블로킹한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제 (PBST)가 있는 PBS에 25℃에서 대략 25 μl/분의 유속으로 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써, 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비율로서 계산한다. 예를 들어, Chen 등,　J. Mol. Biol.　293:865-881 (1999) 참조. 만일 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 온-레이트(on-rate)가 106　M-1　s-1을 초과하면, 이 온-레이트는, 분광계, 예컨대 스탑-플로우(stop-flow)가 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정되는 바와 같이 항원의 증가하는 농도의 존재 하에서, 25℃에서 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 발광 세기의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술(fluorescent quenching technique) (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역 통과)을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 항-EpCAM 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 항-EpCAM 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 F(ab')2 단편 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 사용된다. 다른 구현예에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 온전한 IgG 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 동종형이다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해, Hudson 등　Nat. Med., vol.　9, pp. 129-134, 2003을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해, 예를 들어, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 구원(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의를 위해, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다.
본 발명의 디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있다. 예를 들어, 디아바디의 예에 대해서는 EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger 등,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.　90, pp. 6444-6448, 1993을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디의 예는 또한 Hudson 등,　Nat. Med., vol.　9, pp. 129-134, 2003에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일-도메인 항체 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 예를 들어, 미국 특허 6,248,516 B1 참조)이다.
항체 단편은 본원에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질 가수분해성 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, E. coli 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EpCAM 항체는 키메라 항체일 수 있다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　vol. 81, pp. 6851-6855, 1984)에 기술되어 있다. 일례에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 항체의 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 클래스 또는 서브클래스에 비해 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 이러한 비-인간 항체는 모체의 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR (또는 이의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하도록, 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci., vol. 13, pp. 1619-1633, 2008에 검토되어 있으며, 또한, 예를 들어, Riechmann 등,　Nature, vol.　332, pp. 323-329, 1988; Queen 등,　Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 86, pp. 10029-10033, 1989; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri 등, Methods, vol. 36, pp. 25-34, 2005 (SDR (a-CDR) 접목에 대해 기술함); Padlan,　Mol. Immunol., vol.　28, pp. 489-498, 1991 ("재표면화"에 대해 기술함); Dall'Acqua 등,　Methods, vol.　36, pp. 43-60, 2005 ("FR 셔플링"에 대해 기술함); 및 Osbourn 등,　Methods, vol. 36, pp. 61-68, 2005 및 Klimka 등,　Br. J. Cancer,　vol. 83, pp. 252-260, 2000 (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법에 대해 기술함)]에 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적 적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, Sims 등　J. Immunol., vol.　151, p. 2296, 1993); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, Carter 등　Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 4285, 1992; 및 Presta 등　J. Immunol.,　vol. 151, p. 2623, 1993); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (예를 들어, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci., vol. 13, pp. 1619-1633, 2008 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, Baca 등,　J. Biol. Chem., vol. 272, pp. 10678-10684, 1997 및 Rosok 등,　J. Biol. Chem., vol.　271, pp. 22611-22618, 1996)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EpCAM 항체는 다중특이성, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 EpCAM에 대한 것이고 다른 하나는 또 다른 항원, 예컨대 CD3에 대한 것이다. 이의 하나의 특이적 예는 EpCAM 및 CD3+에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체이다. 이중특이성 조건부 활성 항체는 단일 조건부 활성 또는 이중 조건부 활성일 수 있다. 따라서, 단일 조건부 활성 이중특이성 항체의 경우에, 결합 부위 중 하나는 조건부 활성이고, 다른 하나는 그렇지 않은데, 예를 들어, 조건부 활성 (CAB) CD3+와 쌍을 이루는 야생형 (WT) EpCAM 또는 WT CD3+와 쌍을 이루는 CAB EpCAM이다. 이중 조건부 활성 항체의 경우에는, 두 결합 부위 모두 CAB EpCAM x CAB CD3+에서와 같이 조건부 활성이다.
본 발명의 이중특이성 항체는 하기 표에 제시된 바와 같은 항체를 포함할 수 있다:
이중특이성 항체 또는 항체 단편은 VK 영역 또는 전체 경쇄에 의해 특정될 수 있다. 따라서, 이중특이성 항체는 또한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이성 항체 또는 항체 단편일 수 있으며, 각 영역은 독립적으로 서열번호 35, 43 및 47로 구성된 군으로부터 선택되는 VK 영역 및 서열번호 37, 45 및 49로 구성된 군으로부터 선택되는 VH 영역의 조합에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는다. 동일한 이중특이성 항체 또는 항체 단편은 대신에 서열번호 36, 44 및 48로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 동일한 이중특이성 항체 또는 항체 단편은 대신에 서열번호 38, 46 및 50으로 구성된 군으로부터 선택되는 항-CD3-scFv에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 항-CD3-scFv을 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는 단일, 이중, 삼중- 등 조건부 활성일 수 있다. 따라서, 다중특이성 항체의 임의의 하나 이상의 결합 영역은 조건부 활성일 수 있다.
특정 구현예에서, 이중특이성 항체는 EpCAM의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 EpCAM을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수도 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (Milstein 및 Cuello,　Nature,　vol. 305, pp. 537-540, 1983), WO 93/08829, 및 Traunecker 등,　EMBO J.　vol. 10, pp. 3655-3659, 1991 참조) 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다중-특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과(electrostatic steering effect) 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교결합 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan 등,　Science, vol.　229, pp. 81-83, 1985 참조); 이중-특이성 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, Kostelny 등, J. Immunol., vol. 148, pp. 1547-1553, 1992 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, Hollinger 등,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　vol. 90, pp. 6444-6448, 1993 참조); 및 단일-사슬 Fv (scFv) 이량체 사용 (예를 들어, Gruber 등,　J. Immunol., vol. 152, pp. 5368-5374, 1994 참조); 및 예를 들어 Tutt 등　J. Immunol., vol.　147, pp. 60-69, 1991에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체의 제조에 의해 만들 수 있다.
"옥토퍼스 항체(Octopus antibody)"를 포함하는, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작 항체도 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 US 2016/0017040에 상세히 기술되어 있는, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성은 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 시험 및 측정될 수 있다. 이러한 검정 중 일부는 미국 특허 제8,853,369호에 기술되어 있다.
B. 면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대, 화학요법제 또는 약물, 성장억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 이의 단편), 및 방사성 동위원소에 접합된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일 구현예에서, 면역접합체는 항체 또는 항체 단편이 메이탄시노이드 (미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호; Hinman 등, Cancer Res., vol. 53, pp. 3336-3342, 1993; 및 Lode 등, Cancer Res., vol. 58, pp. 2925-2928, 1998 참조); 안트라사이클린 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz 등, Current Med. Chem., vol. 13, pp. 477-523, 2006; Jeffrey 등, Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol. 16, pp 358-362, 2006; Torgov 등, Bioconj. Chem., vol. 16, pp. 717-721, 2005; Nagy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, pp. 829-834, 2000; Dubowchik 등, Bioorg. & Med. Chem. Letters, vol.12, vol.1529-1532, 2002; King 등, J. Med. Chem., vol.45, pp. 4336-4343, 2002; 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065을 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 구현예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에루지노사 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트라이코테센을 포함하나 이에 제한되지 않는, 효소적 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성접합체의 생산에 이용될 수 있다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우, 이는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 핵자기공명 (NMR) 이미징 (자기공명 이미징, MRI라고도 알려짐)을 위한 스핀 표지, 예컨대, 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역접합체는 알파 방출체, 베타 방출체 및 감마 방출체로부터 선택될 수 있는, 방사성 제제를 포함한다. 알파 방출체의 예는 211At,　210Bi,　212Bi,　211Bi,　223Ra,　224Ra,　225Ac 및 227Th이다. 베타-방출제의 예는 67Cu,　90Y,　131I,　153Sm, l66Ho 및　186Re이다. 감마 방출체의 예는 60Co, 137Ce, 55Fe, 54Mg, 203Hg, 및 133Ba이다.
항체/항체 단편과 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, l,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 등, Science, vol. 238, pp. 1098-, 1987에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026 참조. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커 (Chari 등, Cancer Res., vol. 52, pp. 127-131, 1992; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본원에서 면역접합체는 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A로부터) 상업적으로 이용가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 가교-링커 시약으로 제조된 접합체를 명시적으로 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다.
ADC의 예시적인 구현예는 종양 세포를 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 및/또는 시스테인을 통해 링커 모이어티 (L)에 부착된다.
예시적인 ADC는 Ab-(L-D)p와 같은 화학식 I을 가지며, 여기서 p는 1 내지 약 20이다. 일부 구현예에서, 항체에 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 일부 구현예에서, 유리 시스테인 잔기는 본원에 기술된 방법에 의해 항체 아미노산 서열 내로 도입된다. 화학식 I의 예시적인 ADC는 1, 2, 3 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Lyon 등, Methods in Enzym., vol. 502, pp. 123-138, 2012). 일부 구현예에서, 하나 이상의 유리 시스테인 잔기는 조작의 사용 없이 항체에 이미 존재하며, 이 경우 기존의 유리 시스테인 잔기는 항체를 약물에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 유리 시스테인 잔기를 생성하기 위해 항체의 접합 전에 환원 조건에 노출된다.
링커는 모이어티를 항체에 접합시켜, 면역접합체, 예컨대 ADC를 형성하는데 사용된다. 적합한 링커는 WO 2017/180842에 기술되어 있다.
항체에 접합될 수 있는 일부 약물 모이어티는 WO 2017/180842에 기술되어 있다.
약물 모이어티는 또한 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역접합체는 고준위 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역접합체가 검출에 사용되는 경우, 이는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc99 또는 1123, 또는 핵자기공명 (NMR) 이미징 (자기공명 이미징, MRI라고도 알려짐)을 위한 스핀 표지, 예컨대, 지르코늄-89, 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이트제와 착화될 수 있으며, 예를 들어, PET 이미징을 위해 항체와 접합될 수 있다 (WO 2011/056983).
방사성- 또는 다른 표지는 공지의 방법으로 면역접합체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 예를 들어 하나 이상의 수소 대신에 하나 이상의 불소-19 원자를 포함하는, 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 생합성되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지, 예컨대 Tc99, I123, Re186, Re188　및 In111은 항체 내 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 이트륨-90은 항체의 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, IODOGEN 방법 (Fraker 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.　80, pp. 49-57, 1978)은 아이오딘-123을 혼입하기 위해 사용될 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)에는 특정 다른 방법들이 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 면역접합체는 전구약물-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 전구약물-활성화 효소는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 약물, 예컨대 항암 약물로 전환시킨다. 이러한 면역접합체는 일부 구현예에서, 항체-의존성 효소-매개 전구약물 치료법(antibody-dependent enzyme-mediated prodrug therapy, "ADEPT")에 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 아릴설파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물, 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 시토신 디아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 서모리시스(thermolysis), 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환하는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 당화된(glycosylated) 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 이들의 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 효소는 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, Neuberger 등,　Nature, vol. 312, pp. 604-608, 1984를 참조한다.
접합체 내 약물 로딩(loading)은 항체 당 약물 모이어티의 평균 수인, p로 나타낸다. 약물 로딩은 항체 당 1개 내지 20개의 약물 모이어티의 범위일 수 있다. 본 발명의 접합체는 1개 내지 20개의 약물 모이어티의 범위를 가질 수 있다. 접합 반응으로부터 접합체의 제조에 사용되는 항체 당 약물 모이어티의 평균 수는 종래의 방법, 예컨대 질량 분광법, ELISA 검정 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체 (ADC)의 경우, 약물 로딩은 항체 상의 부착 부위 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 부착이 시스테인 티올인 경우, 상기 특정 예시적인 구현예에서와 같이, 항체는 오로지 1개 또는 수 개의 시스테인 티올기를 가질 수 있거나, 부착될 수 있는 링커를 통해 오로지 1개 또는 수 개의 충분히 반응성인 티올기를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 더 높은 약물 로딩, 예를 들어 p>5는 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성의 손실을 야기할 수 있다. 특정 구현예에서, ADC에 대한 평균 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5의 범위이다. 실제로, 이는 특정 ADC의 경우 항체 당 약물 모이어티의 최적 비율은 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 나타났다 (미국 특허 제7,498,298호).
특정 구현예에서, 이론적 최대치보다 적은 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는 예를 들어, 하기 논의되는 바와 같이, 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 라이신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올기를 함유하지 않는다. 실제로, 항체에서 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 가교로서 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는 부분 또는 전체 환원 조건 하에서, 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원되어 시스테인 티올기를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 변성 조건에 적용되어 반응성 친핵성기, 예컨대 라이신 또는 시스테인을 나타낸다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비율)은 상이한 방식으로, 예를 들어, (i) 항체에 대한 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰 과량을 제한하고, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하며, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 환원성 조건을 부분적으로 또는 제한함으로써 제어될 수 있다.
C. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 생물학적 샘플에서 EpCAM의 존재를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 유방, 췌장, 식도, 폐 및/또는 뇌 세포 또는 조직을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 EpCAM 발현 수준이 체내의 적어도 하나의 위치에서의 정상 생리학적 수준으로부터 증가 또는 감소되는 암 또는 다른 질환을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 검출가능한 분자 또는 물질, 예컨대 형광 분자, 방사성 분자, 또는 상기 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 다른 표지로 표지될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 방사성 분자로 표지될 수 있다. 예를 들어, 적합한 방사성 분자는 섬광조영술 연구에 사용되는 방사성 원자, 예컨대 123I, 124I, 111In, 186Re, 및 188Re를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 핵자기공명(NMR) 이미징을 위한 스핀 표지, 예컨대 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철로 표지될 수 있다. 항체 투여 후, 환자 내에서 방사성 표지된 항체의 분포가 검출된다. 임의의 적합한 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 비-제한적인 예는 전산화 단층촬영 (CT), 양전자 방출 단층촬영 (PET), 자기공명 이미징 (MRI), 형광, 화학발광 및 초음파촬영을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 EpCAM 과발현과 관련된 암 및 질환의 진단 및 병기결정에 유용할 수 있다. EpCAM 과발현과 관련된 암은 편평세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 위암, 췌장암, 신경교세포 종양, 예컨대 교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 흑색종, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 콩팥암, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 육종, 혈액암 (백혈병), 성상세포종, 및 다양한 유형의 두경부암, 또는 다른 EpCAM 발현 또는 과발현 과증식성 질환을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 EpCAM 발현이 증가 또는 감소된 암 이외의 질환을 진단하는데 유용할 수 있다. (용해성 또는 세포성 EpCAM 형태 모두 이러한 진단에 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 진단 방법은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플의 사용을 수반한다. 생물학적 샘플은 진단 또는 모니터링 검정에 사용될 수 있는 대상체로부터 수득한 다양한 샘플 유형을 포괄한다. 생물학적 샘플은 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 고체 조직 샘플, 예컨대, 생검 표본 또는 조직 배양물, 또는 그로부터 유래된 세포, 및 이의 자손을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 EpCAM 과발현과 관련된 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수집된 조직 샘플에서 수득된 세포를 포함하고, 바람직한 구현예에서 신경교종, 위, 폐, 췌장, 유방, 전립선, 신장, 간 및 자궁내막에서 수득된 세포를 포함한다. 생물학적 샘플은 임상 샘플, 배양물 중의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포괄한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 대상체로부터의 세포 상에서 EpCAM을 검출함으로써 대상체에서 EpCAM 과발현과 관련된 암을 진단하는 방법이다. 특히, 상기 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다:
1) 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편이 EpCAM을 발현하는 생물학적 샘플 중의 세포와 복합체를 형성하는데 적합한 조건 하에서 상기 항체 또는 항체 단편과 대상체의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 복합체를 검출 및/또는 정량하여, 상기 복합체의 검출이 EpCAM 과발현과 관련된 암을 나타내는 단계.
암의 진행을 모니터링하기 위해, 본 발명에 따른 방법을 상이한 시간에 반복하여 샘플에 대한 항체 결합이 증가 또는 감소하는지를 결정할 수 있고, 이로부터 암이 진행성, 퇴행성 또는 안정성인지의 여부를 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 EpCAM의 발현 또는 과발현과 관련된 질환을 진단하는 방법이다. 이러한 질환의 예는 암, 인간 면역 장애, 혈전성 질환 (혈전증 및 죽상혈전증), 및 심혈관 질환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 EpCAM4의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 EpCAM의 양을 정량화하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 EpCAM에 대한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 결합을 허용하는 조건 하에서 본원에 기술된 바와 같은 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편과 EpCAM 간에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 항-EpCAM4 항체 또는 항체 단편은 치료법에 적격인 대상체를 선택하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 치료법은 대상체에 대한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 투여를 포함할 것이다.
특정 구현예에서, 표지된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색단, 고전자밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해, 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P,　14C,　125I,　3H, 및 131I, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인과 같은 형광단 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 과산화수소를 이용하여 염료 전구체, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제를 산화시키는 효소와 결합된, 헤테로사이클릭 산화효소, 예컨대 유리카제 및 잔틴 산화효소, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
D. 약학적 제형
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 세포 사멸 활성을 갖는다. 이 세포 사멸 활성은 다수의 상이한 유형의 세포주까지 확대된다. 또한, 이러한 항체 또는 항체 단편은 일단 세포독성제에 접합되면 종양 크기를 감소시킬 수 있고 감소된 독성을 나타낼 수 있다. 따라서, 항-EpCAM 항체, 이의 단편 또는 면역접합체는 EpCAM 발현과 관련된 증식성 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다. 항체, 단편 또는 면역접합체는 단독으로 또는 임의의 적합한 제제 또는 다른 종래의 치료와 조합하여 사용될 수 있다.
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 EpCAM 발현, 과발현 또는 활성화와 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. EpCAM 발현 요건 외에는 치료될 수 있는 암 또는 조직의 유형에 대한 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 편평세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 위암, 췌장암, 신경교세포 종양, 예컨대, 교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포종, 유방암, 결장암, 흑색종, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 콩팥암, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 육종, 혈액암 (백혈병), 성상세포종, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 보다 바람직한 암은 신경교종, 위암, 폐암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 신장 암, 간암 및 자궁내막암이다.
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 선천적 면역 반응의 잠재적 활성제이고, 따라서 인간 면역 장애, 예컨대 패혈증의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 또한 면역화를 위한 보조제, 예컨대 백신으로서, 그리고 예를 들어, 박테리아, 바이러스 및 기생충에 대한 항-감염제로서 사용될 수 있다.
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 혈전성 질환, 예컨대 정맥 및 동맥 혈전증 및 죽상혈전증을 보호, 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 또한 심혈관 질환을 보호, 예방 또는 치료할 뿐만 아니라 바이러스, 예컨대 라사(Lassa) 및 에볼라(Ebola) 바이러스의 진입을 예방 또는 억제하고 바이러스 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 치료 방법의 각각의 구현예에서, 항-EpCAM 항체, 항체 단편 또는 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 면역접합체는 치료가 요구되는 질환 또는 장애의 관리와 관련된 종래의 방법론과 일치하는 방식으로 전달될 수 있다. 본원의 개시에 따르면, 유효량의 항체, 항체 단편 또는 면역접합체가 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 본 발명의 치료적 유효량의 항체, 항체 단편 또는 면역접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 EpCAM의 발현과 관련된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
투여를 위해, 항-EpCAM 항체, 항체 단편 또는 면역접합체는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 항-EpCAM 항체, 항체 단편 또는 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 방법에서, 치료 분자는 전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 혼합물, 용액 또는 조성물과 조합된다.
약학적으로 허용가능한 담체는 수용 환자가 견딜 수 있는 물질이다. 멸균 인산염 완충 식염수는 약학적으로 허용가능한 담체의 일례이다. 다른 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. (예를 들어, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) 참조). 제형은 하나 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면 상의 단백질 손실을 방지하는 알부민 등을 더 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 물론 치료되어야 하는 상태, 병의 중증도, 환자의 연령, 체중, 및 성별 등에 따라 달라진다. 이러한 고려사항은 적합한 약학적 조성물을 제형화하기 위해 당업자에 의해 고려될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안구내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
바람직하게, 본 약학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 염류 용액 (제1 인산나트륨 또는 제2 인산나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 또는 염화 마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 예를 들어, 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시, 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 때때로 "안정화제"로 알려진 등장화제(tonicity agent)는 조성물 중 액체의 강장성(tonicity)을 조정 또는 유지하기 위해 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 크고 하전된 생체분자와 함께 사용되는 경우, 이들은 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용할 수 있고, 이에 따라 분자내 및 분자간 상호작용의 가능성을 감소시킬 수 있기 때문에, 이들은 종종 "안정화제"로 지칭된다. 등장화제는 약학적 조성물의 0.1 중량% 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 내지 5%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 등장화제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가 부형제는 하기 중 하나 이상으로서 작용할 수 있는 제제를 포함한다: (1) 증량제, (2) 용해 촉진제, (3) 안정화제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 부착을 방지하는 제제. 이러한 부형제는 다가 당 알코올 (상기 열거됨); 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨 (예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산 나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (예를 들어, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류 (예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트린 또는 덱스트란을 포함할 수 있다.
비-이온성 계면활성제 또는 청정제 ("습윤제"로도 알려짐)는 치료제를 가용화하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 교반-유도된 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 또한 제형이 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성 유발 없이 전단 표면 응력에 노출되도록 허용한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 ㎎/ml 내지 약 1.0 ㎎/ml, 바람직하게는 약 0.07 ㎎/ml 내지 약 0.2 ㎎/ml의 농도 범위로 존재할 수 있다.
적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 청정제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 청정제는 염화 벤잘코늄 또는 염화 벤제토늄을 포함한다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개변수의 함수로서, 특히 사용되는 투여 방식, 관련 병리, 또는 대안적으로 소정의 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다. 약학적 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 항체 또는 항체 단편은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산될 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨유, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사가능성(syringability)이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이는, 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물, 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함하며, 이는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염은, 또한, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사 용액은 요구될 수 있는 바와 같이, 상기 열거된 하나 이상의 다른 성분과 함께 요구되는 양의 활성 화합물을 적절한 용매에 혼입시킨 다음, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이는 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 소정의 성분의 분말을 산출한다.
직접 주사를 위한 보다 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려되며, 이 경우 용매로서 디메틸 설폭사이드 (DMSO)의 사용은 극히 신속한 침투를 초래하여 작은 종양 영역에 고농도의 활성제를 전달할 것으로 예상된다.
제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로, 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대 전술한 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 사용될 수 있다.
수용액으로 비경구 투여하는 경우, 예를 들어, 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고, 1000 ml의 대량피하주사액(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나, 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15판, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투여량의 일부 변동은 치료받는 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는 임의의 경우에 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
항체 또는 항체 단편은 용량 당 약 0.0001 내지 10.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 5 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 1 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 밀리그램을 전달하도록 치료 혼합물 내에 제형화될 수 있다. 다회 용량은 또한 선택된 시간 간격으로 투여될 수 있다.
비경구 투여, 예컨대 정맥내 또는 근육내 주사용으로 제형화된 화합물 이외에, 다른 약학적으로 허용가능한 형태는, 예를 들어, 경구 투여용 정제 또는 다른 고체; 시간 방출 캡슐; 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.
특정 구현예에서, 리포솜 및/또는 나노입자의 사용은 항체 또는 항체 단편을 숙주세포 내로 도입하기 위해 고려된다. 리포솜 및/또는 나노입자의 형성 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 일반적으로 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계된다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자는 본 발명에 사용하기 위해 고려되며, 이러한 입자는 용이하게 제조될 수 있다.
리포솜은 수성 매질에 분산되어 자발적으로 다중층 동심원 이중층 소포체 (다중층 소포체 (MultiLamellar Vesicles; MLV)로도 칭해짐)를 형성하는 인지질로부터 형성된다. 일반적으로 MLV는 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어 내에 수용액을 함유하는, 200 내지 500 Å 범위의 직경을 갖는 소형 단층 소포체 (Small Unilamellar Vesicle; SUV)의 형성을 초래한다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
본원에 기술된 바와 같은 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약학적 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 소정의 순도를 갖는 이러한 항체 또는 항체 단편을 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980)) 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 예컨대 인산염, 구연산염 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제 (예컨대, 염화 옥타데실디메틸벤질암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄; 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)를 더 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기술되어 있다. 일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기술된 것을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 징후에 필요한 경우 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 서로 악영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분은 단일 제형으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CTLA4 항체, 항체 단편 또는 면역접합체 외에 EGFR 길항제 (예컨대, 엘로티닙), 항-혈관신생제 (예컨대, 항-VEGF 항체일 수 있는 VEGF 길항제) 또는 화학요법제 (예컨대, 탁소이드 또는 백금 제제)를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-EpCAM 항체, 항체 단편 또는 면역접합체는 CTLA4, PD1, PD-L1, AXL, ROR2, CD3, HER2, B7-H3, ROR1, SFRP4 및 WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16을 포함하는 WNT 단백질로부터 선택되는 항원에 대한 다른 항체 또는 항체 단편과 제형으로 조합된다. 이 조합은 2개의 별도 분자 형태일 수 있다: 본 발명의 항-EpCAM 항체, 항체 단편 또는 면역접합체, 및 다른 항체 또는 항체 단편. 대안적으로, 조합은 또한 EpCAM 및 다른 항원 둘 모두에 대해 결합 친화성을 갖는 단일 분자의 형태일 수 있으며, 따라서 다중특이성 (예를 들어, 이중특이성) 항체를 형성한다.
활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐은 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이는 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태일 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균이다. 멸균성은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
E. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 치료 방법에 사용될 수 있다. 일 측면에서, 약제로서 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 추가 측면에서, 암 (예를 들어, 유방암, 비소세포폐암, 췌장암, 뇌암, 췌장의 암, 뇌, 신장, 난소, 위, 백혈병, 자궁 내막, 결장, 전립선, 갑상선, 간, 골육종 및/또는 흑색종) 치료에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 장애), 심혈관 장애 (예를 들어, 죽상경화증, 고혈압, 혈전증), 감염성 질환 (예를 들어, 에볼라 바이러스, 마르부르크(Marburg) 바이러스) 또는 당뇨병을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같이, 개체에게 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 억제, 종양 혈관구조 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 억제, 종양 혈관구조 발달 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능을 억제하기 위해 효과적인 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 억제, 종양 혈관구조 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에 있어서 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 약제는 암 (일부 구현예에서, 유방암, 비소세포폐암, 췌장암, 뇌암, 췌장의 암, 뇌, 신장, 난소, 위, 백혈병, 자궁 내막, 결장, 전립선, 갑상선, 간, 골육종 및/또는 흑색종)의 치료를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 유효량의 약제를 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 개체에게 유효량의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 장애), 심혈관 장애 (예를 들어, 죽상경화증, 고혈압, 혈전증), 감염성 질환 (예를 들어, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스) 또는 당뇨병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같이, 개체에게 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 추가 구현예에서, 약제는 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 억제, 종양 혈관구조 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 촉진, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 유도, 종양 혈관구조 발달 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능을 억제하기 위해 유효량의 약제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 억제, 종양 혈관구조 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 이러한 암을 갖는 개체에게 유효량의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 하기에 기술된 바와 같이, 개체에게 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 장애), 심혈관 장애 (예를 들어, 죽상경화증, 고혈압, 혈전증), 감염성 질환 (예를 들어, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스) 또는 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 하기에 기술된 바와 같이, 개체에게 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 억제, 종양 혈관구조 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능을 억제하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 촉진, (예를 들어, 종양-관련 대식세포로부터) 염증성 사이토카인 분비 유도, 종양 혈관구조 발달 (예를 들어, 종양내 혈관구조 또는 종양-관련 혈관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능을 억제하기 위해 유효량의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, "개체"는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 상기 임의의 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 약학적 제형은 본원에 제공된 임의의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학적 제형은 본원에 제공된 임의의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 및 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
상기 기술된 각각 및 모든 치료에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 단독으로, 면역접합체로서 또는 치료법에서 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 항-혈관신생제이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 VEGF 길항제 (일부 구현예에서, 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙)이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 EGFR 길항제 (일부 구현예에서, 엘로티닙)이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 화학요법제 및/또는 세포증식 억제제이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 탁소이드 (예를 들어, 파클리탁셀) 및/또는 백금 제제 (예를 들어, 카르보플래티넘)이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 환자의 면역 또는 면역계를 향상시키는 제제이다.
상기 언급된 이러한 조합 치료법은 조합 투여 (2개 이상의 치료제가 동일 제형 또는 별도 제형에 포함되는 경우), 및 별도 투여를 포괄하고, 이 경우, 항체 또는 항체 단편의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제(adjuvant)의 투여 전에, 동시에, 및/또는 후에 일어날 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 방사선 치료법과 조합하여 사용될 수도 있다.
항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 모범 의료행위 지침(good medical practice)과 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 고려할 요인은 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 다른 요인을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 반드시 필요한 것은 아니나, 문제의 장애를 예방 또는 치료하는 데 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 선택적으로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체 또는 항체 단편의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 다른 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 동일한 투여량 및 투여 경로, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체 또는 항체 단편의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체 또는 항체 단편의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체 또는 항체 단편이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료법, 환자의 임상 이력 및 항체 또는 항체 단편에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체 또는 항체 단편은 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg의 항체 또는 항체 단편/환자의 체중 kg 내지 40 mg의 항체 또는 항체 단편/환자의 체중 kg은, 예를 들어, 하나 이상의 별도 투여에 의해서든, 또는 지속적인 주입에 의해서든 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기에 언급된 요인에 따라, 약 1 μg의 항체 또는 항체 단편/환자의 체중 kg 내지 100 mg의 항체 또는 항체 단편/환자의 체중 kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상 동안 반복 투여하는 경우, 상태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 소정의 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 항체 또는 항체 단편을 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어, 약 6회 용량을 받도록) 투여될 수 있다. 초기에 더 높은 로딩 용량에 뒤이어, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
대상체에서 질환의 예방 또는 치료를 위해 투여될 수 있는 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 특이적 투여량은 환자의 체중 kg 당 약 0.3, 0.6, 1.2, 18, 2.4, 3.0, 3.6, 4.2, 4.8, 5.4, 6.0, 6.6, 7.2, 7.8, 8.4, 9.0, 9.6 또는 10.2 mg의 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 환자의 체중 kg 당 0.3-2.4, 2.4-4.2, 4.2-6.0, 6.0-7.8, 7.8-10.2, 10.2-12, 12-14, 14-16, 16-18 또는 18-20 mg 범위의 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 투여량은 이중특이성 항체의 형태로, 다른 면역관문 억제제 또는 다른 항체 또는 항체 단편과 조합으로 또는 면역접합체로서 투여되는 경우, 동일하게 유지될 것이다. 또한, 항-EpCAM 활성을 갖는 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편과 동일한 양으로 투여될 것이다.
본 발명의 약학적 제형의 일회 용량은 약 13,600 mg에서 약 45 μg의 항체 또는 항체 단편, 또는 약 5440 mg에서 약 45 μg의 항체 또는 항체 단편으로 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 양을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 약학적 제형의 일회 용량은 135 mg 내지 1,387 mg, 또는 135, 235, 335, 435, 535, 635, 735, 835, 935, 1035, 1135, 1235, 1387 mg과 같은 양의 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 제형의 일회 용량 중 본 발명의 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 양은 135-235, 235-335, 335-435, 435-535, 535-635, 635-735, 735-835, 835-935, 935-1035, 1035-1135, 1135-1235, 1235-1387 mg 범위이다. 약학적 제형의 일회 용량 중 항체 또는 항체 단편의 양은 이중특이성 항체의 형태로, 다른 면역관문 억제제와 조합으로 또는 면역접합체로서, 또는 본원에 개시된 다른 항원에 대한 다른 항체 또는 항체 단편과 조합으로 투여되는 경우 동일하게 유지될 것이다. 또한, 항-EpCAM 활성을 갖는 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편과 동일한 양으로 약학적 제형의 일회 용량에 포함될 것이다.
일례에서, 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 면역관문 억제제 분자에 접합될 수 있거나 면역관문 억제제와 이중특이성 항체의 일부를 형성할 수 있다.
조합은 본 출원에 개시된 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 및 별개의 분자로서 또는 이중특이성 항체로서 투여되는 면역관문 억제제 분자일 수 있다. 이러한 이중특이성 항체는 EpCAM에 대한 결합 활성 및 면역관문에 대한 제2 결합 활성을 갖는다.
면역관문은 CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, VISTA, BTLA, OX40, CD40, 4-1BB, PD-1, PD-L1 및 GITR (Zahavi 및 Weiner, International Journal of Molecular Sciences, vol. 20, 158, 2019)로부터 선택될 수 있다. 추가 면역관문은 B7-H3, B7-H4, KIR, A2aR, CD27, CD70, DR3, 및 ICOS를 포함한다 (Manni 등, Immune checkpoint blockade and its combination therapy with small-molecule inhibitors for cancer treatment, Bbacan, https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2018.12.002, 2018).
면역관문은 바람직하게는 CTLA4, PD-1 또는 PD-L1이다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 항-EpCAM 항체 대신에 또는 추가로 본 발명의 항체 단편 또는 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
종양을 퇴치하기 위해 숙주의 면역 기능을 향상시키는 것은 관심이 증가하고 있는 대상이다. 종래의 방법은 (i) APC 향상, 예컨대 (a) 종양 내로 외래 MHC 동종항원을 암호화하는 DNA의 주입, 또는 (b) 생검된 종양 세포를 종양의 면역 항원 인식 가능성을 증가시키는 유전자 (예를 들어, 면역 자극 사이토카인, GM-CSF, 공동-자극 분자 B7.1, B7.2)로 형질감염, (iii) 입양 세포 면역요법, 또는 활성화된 종양-특이적 T 세포를 사용한 치료를 포함한다. 입양 세포 면역요법은 종양-침윤성 숙주 T-림프구를 분리하고, 이 집단을 시험관내에서, 예컨대, IL-2 또는 종양 또는 둘 모두에 의한 자극을 통해 증식시키는 것을 포함한다. 추가로, 기능장애인 분리된 T-세포는 또한 본 발명의 항-PD-L1 항체의 시험관내 적용에 의해 활성화될 수 있다. 이와 같이 활성화된 T-세포는 이후 숙주에 재투여될 수 있다. 이러한 방법 중 하나 이상은 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 면역접합체의 투여와 조합하여 사용될 수 있다.
암에 대한 전통적인 치료법에는 다음을 포함한다: (i) 방사선 치료법 (예를 들어, 방사선요법, X-선 치료법, 조사) 또는 암세포를 사멸시키고 종양을 수축시키는 이온화 방사선의 사용. 방사선 요법은 외부 빔 방사선요법 (EBRT)을 통해 외부적으로 또는 근접요법을 통해 내부적으로 투여될 수 있다; (ii) 화학요법, 또는 일반적으로 빠르게 분열하는 세포에 영향을 미치는 세포독성 약물의 적용; (iii) 표적 치료법, 또는 암세포의 탈조절된 단백질에 특이적으로 영향을 미치는 제제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제 이마티닙, 제피티닙; 단클론성 항체, 광역학 요법); (iv) 면역요법, 또는 숙주의 면역 반응 향상 (예를 들어, 백신); (v) 호르몬 요법, 또는 호르몬의 차단 (예를 들어, 종양이 호르몬 민감성인 경우), (vi) 혈관신생 억제제, 또는 혈관 형성 및 성장의 차단, 및 (vii) 완화 치료, 또는 통증, 메스꺼움, 구토, 설사 및 출혈을 감소시키기 위해 치유의 질을 개선시키도록 지정된 치료. 모르핀 및 옥시코돈과 같은 진통제, 온단세트론 및 아프레피탄트와 같은 항구토제는 보다 적극적인 치료 요법을 허용할 수 있다.
암 치료에서, 암 면역의 치료를 위한 이전에 기술된 임의의 종래의 치료는 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편의 투여 이전, 이후 또는 동시에 수행될 수 있다. 추가로, 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편은 종래의 암 치료, 예컨대 종양-결합 항체 (예를 들어, 단클론성 항체, 독소-접합 단클론성 항체)의 투여 및/또는 화학요법제의 투여 이전, 이후 또는 동시에 투여될 수 있다.
F. 제조 물품 및 키트
본 발명의 또 다른 측면에서, 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 및 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 다른 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 상기 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 조합되는 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 항체 단편이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물이 그 내부에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 그 내부에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예에서 제조 물품은 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 항-EpCAM 항체 또는 항체 단편 대신에 또는 추가로 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
마지막으로, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 항체 약물 접합체를 함유하는 키트는 EpCAM 발현 (증가 또는 감소)을 검출하거나, 치료 또는 진단 검정에 사용된다. 본 발명의 키트는 고체 지지체, 예를 들어 조직 배양 플레이트 또는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항체를 함유할 수 있다. 시험관내, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 EpCAM의 검출 및 정량화를 위한 항체를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 검출에 유용한 이러한 항체는 형광성 또는 방사성표지와 같은 표지와 함께 제공될 수 있다.
키트는 이의 사용에 대한 지침서를 더 함유한다. 일부 구현예에서, 지침서는 시험관내 진단 키트에 대해 미국 식품의약국에서 요구하는 지침서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 상기 샘플에서 EpCAM의 존재 또는 부재에 기반하여 샘플 중 뇌척수액의 존재 또는 부재를 진단하기 위한 지침서를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 하나 이상의 효소, 효소 억제제 또는 효소 활성화제를 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 하나 이상의 크로마토그래피 화합물을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 분광 검정을 위한 샘플을 준비하는 데 사용되는 하나 이상의 화합물을 더 포함한다. 추가 구현예에서, 키트는 지표의 강도, 색상 스펙트럼, 또는 다른 물리적 속성에 따라 EpCAM의 존재 또는 부재를 해석하기 위한 비교 참조 물질을 더 포함한다.
하기 실시예는 본 개시의 항-EPCAM 항체의 예시이나, 이에 제한되지는 않는다. 이 분야에서 일반적으로 접하고 당업자에게 자명한 다양한 조건 및 매개변수의 다른 적합한 변형 및 수정은 본 개시의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: EpCAM으로 면역화된 마우스로부터의 하이브리도마 클론
마우스를 재조합 인간 EpCAM 세포외 도메인 (ECD)으로 면역화시켰다. 면역화된 마우스의 B 세포를 사용하여 생성된 하이브리도마 클론을 인간 EpCAM ECD 및 인간 EpCAM을 발현하는 안정한 CHO 세포 둘 다로 스크리닝하였다. 하이브리도마 클론은 인간 EpCAM ECD, cyno EpCAM 및 마우스 또는 랫트 EpCAM은 아니나, 인간 EpCAM을 발현하는 CHO 세포에 결합하는 이들의 능력을 기반으로 하여 선택하였다. 선택된 하이브리도마 클론을 표 2에 나타내었다.
표 2. 항-EpCAM 항체를 발현하는 선택된 하이브리도마 클론
실시예 2: 조건부 활성 생물학적 (CAB) 항-EpCAM 항체
하이브리도마 클론 12C10F12에 의해 발현된 항-EpCAM 항체는 조건부 활성 항-EpCAM 항체를 생성하기 위한 주형 항체로서 사용되었다. 주형 항체를 암호화하는 DNA를 포괄적인 위치 진화 (CPETM)를 사용하여 돌연변이시켜 돌연변이 항체를 생산하였다. 돌연변이 항체는 도 4 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 비-종양 미세환경에 존재하는 정상 생리학적 pH에서 EpCAM에 대한 결합 활성과 비교하여 종양 미세환경의 더 낮은 pH에서 인간 EpCAM에 대한 증가된 결합 활성을 갖는 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 대해 스크리닝하였다. 항체 클론 BAP-105-01-01은 도 4에 나타낸 바와 같은 주형 항체(WT)이다.
표 3. 조건부 활성 항-EpCAM 항체
이러한 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 추가로 특성화되었다.
실시예 3: 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성
BAP-105-01-03 및 BAP-105-01-06으로 예시되는, 선택된 조건부 활성 항-EpCAM 항체를 BAP-105-01-01을 대조군으로 사용하여 EpCAM에 대한 결합을 분석하였다. EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 이들 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 6.0 및 7.4의 2개의 상이한 pH 값에서 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)에 의해 측정하였다. 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL 및 0.01 μg/mL의 항체의 상이한 투여량을 사용하였다. 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 5a 내지 도 5d를 참조한다.
유사한 FACS 분석을 또한 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포를 사용하여 수행하였다. 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 또한 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 EpCAM 발현 293 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 6a 내지 도 6d를 참조한다.
실시예 4: 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체의 세포 사멸
선택된 조건부 활성 항-EpCAM 항체 BAP-105-01-03 및 BAP-105-01-06을 강력한 항유사분열제인 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)에 접합시켜 항체 약물 접합체 (ADC)를 생성하였다. 항체 BAP-105-01-01을 비-조건부 활성 항체 대조군으로서 사용하고, B12를 음성 대조군으로서 사용하였다. EpCAM을 발현하는 Colo205 세포의 시험관내 세포 사멸을 6.0, 6.2 및 7.4의 3개의 pH 값에서 측정하였다. 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 Colo205 세포의 시험관내 사멸에 대한 IC50이 또한 결정되었다. 도 7a 내지 도 7c를 참조한다.
조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC에 의한 생체내 세포 사멸을 또한 Colo205 이종이식 마우스 모델을 사용하여 측정하였다. 이종이식 마우스 모델을 IV 주사에 의해 간헐적 스케줄 Q4Dx4 (4일마다 4회)로 처리하였다. 2가지 투여량, 1 mg/kg 및 6 mg/ kg을 사용하였다. 여덟 (8)마리의 마우스를 각 처리 그룹에 사용하였다. 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC는 종양의 부피를 유의하게 감소시켰지만, 대조군과 비교하여 6 mg/kg의 용량에서 동물의 중량을 유의하게 감소시키지 않았다. 도 8a 내지 8b를 참조한다. 이는 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC가 감소된 부작용을 나타내면서 종양을 치료하는데 효과적임을 나타낸다.
실시예 5: 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 인간화
조건부 활성 항-EpCAM 항체 중 하나인, BAP-1-5-01-06는 인간화되어 추가의 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체를 생산하였다. 표 4을 참조한다.
표 4. EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체
실시예 6: 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성
인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 대조군으로서 주형 항체 BAP 105-01-01을 사용하여 ELISA로 측정하였다. 도 9a 내지 도 9e를 참조한다. pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 EpCAM에 결합하기 위한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50 값은 표 5에 요약되어 있다.
표 5. 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
pH 적정과 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 ELISA로 측정하였다. 도 10을 참조한다. 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 pH 변곡점은 표 6에 요약되어 있다.
표 6. 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 pH 변곡점
실시예 7: cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성
cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 유사하게 측정하였다. 도 11a 내지 도 11e를 참조한다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 대한 pH 6.0 및 pH 7.4에서 cyno EpCAM에 결합하기 위한 EC50은 표 7에 요약되어 있다.
표 7. cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
pH 적정과 cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 유사하게 ELISA로 측정하였다. 도 12를 참조한다. cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 pH 변곡점은 표 8에 요약되어 있다.
표 8. cyno EpCAM 에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 변곡점
실시예 8: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 열안정성
인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 열안정성은 열처리 후 이들의 결합 활성을 측정함으로써 평가되었다. pH 6.0 및 pH 7.4에서 상이한 온도로 한 (1)시간 동안 열처리 후 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 ELISA로 측정하였다. 도 13a 내지 도 13b를 참조한다. 45℃ 온도까지의 열처리는 이들 온도에서 양호한 열 안정성을 나타내는 결합 친화성에 현저하게 영향을 미치지 않았다.
실시예 9: FACS에 의해 측정된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성
인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 FACS로 측정하였다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 14a 내지 도 14b를 참조한다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 결합하기 위한 EC50 값은 표 9에 요약되어 있다.
표 9. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 EC50
유사한 FACS 분석을 또한 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포를 사용하여 수행하였다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 또한 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 15a 내지 도 15b를 참조한다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 결합하는 EC50 값은 표 10에 요약되어 있다.
표 10. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 EC50
유사한 FACS 분석을 또한 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포를 사용하여 수행하였다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 또한 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 16a 내지 도 16b를 참조한다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 결합하기 위한 EC50 값은 표 11에 요약되어 있다.
표 11. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 EC50
실시예 10: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC의 결합 활성
인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 MMAE에 접합되어 항체 약물 접합체를 생성하였다. 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성은 상이한 항체 농도로 pH 6.0 및 pH 7.4에서 ELISA에 의해 측정되었다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 인간 EpCAM에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 17a 내지 17b를 참조한다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 인간 EpCAM에 대해 결합하는 EC50 값은 표 12에 요약되어 있다.
표 12. 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 친화성을 측정하고자, 유사한 ELISA 분석을 또한 cyno EpCAM을 사용하여 수행하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 또한 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 cyno EpCAM에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 18a 내지 도 18b를 참조한다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 cyno EpCAM에 대해 결합하는 EC50 값은 표 13에 요약되어 있다.
표 13. cyno EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
실시예 11: pH 적정과 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC의 결합 활성
인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 pH 적정과 함께 ELISA로 측정하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 pH가 pH 5.5로부터 증가함에 따라 인간 EpCAM에 대해 감소하는 결합 활성을 나타내었다. 도 19a를 참조한다. pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성의 비율 뿐만 아니라, 이들의 pH 변곡점은 표 14에 요약되어 있다.
표 14. 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 특징
cyno EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성은 또한 pH 적정과 함께 ELISA에 의해 측정되었다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 pH가 pH 5.5로부터 증가함에 따라 cyno EpCAM에 대해 유사한 감소하는 결합 활성을 나타내었다. 도 19b를 참조한다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 cyno EpCAM에 대한 pH 6.0 및 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율 뿐만 아니라 이들의 pH 변곡점은 표 15에 요약되어 있다.
표 15. cyno EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 특징
실시예 12: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC의 열안정성
접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 (MMAE와 함께)의 열안정성은 열처리 후 이들의 결합 활성을 측정함으로써 평가되었다. 상이한 온도로 한 (1) 시간 동안 열처리 후 인간 EpCAM에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 ELISA에 의해 pH 6.0 및 pH 7.4에서 결정하였다. 도 20a 내지 도 20b를 참조한다. 45℃ 온도까지의 열처리는 이들 온도에서 양호한 열 안정성을 나타내는 결합 친화성에 현저하게 영향을 미치지 않았다.
실시예 13: FACS에 의한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC의 결합 활성
인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 (MMAE와 함께)의 결합 활성을 2개의 상이한 pH: 6.0 및 7.4에서 FACS로 측정하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 21a 내지 도 21b를 참조한다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대해 결합하는 EC50 값은 표 16에 요약되어 있다.
표 16. 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
유사한 FACS 분석을 또한 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포를 사용하여 수행하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 또한 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 22a 내지 도 22b를 참조한다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 결합하는 EC50 값은 표 17에 요약되어 있다.
표 17. 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
유사한 FACS 분석을 또한 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포를 사용하여 수행하였다. 접합된 인간 조건부 활성 항-EpCAM 항체 (MMAE와 함께)는 또한 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 더 높은 결합 활성을 일관되게 나타내었다. 도 23a 내지 23b를 참조한다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의해 cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대해 결합하는 EC50 값은 표 18에 요약되어 있다.
표 18. cyno EpCAM을 발현하는 293 세포에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50
실시예 14: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC의 세포 사멸
접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 (MMAE와 함께)를 세포 사멸에 대해 분석하였다. 항체 BAP-105-01-01을 비-조건부 활성 항체 대조군으로서 사용하고, B12를 음성 대조군으로서 사용하였다. 6.0, 6.5 및 7.4의 3개의 pH 값에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포를 사용하여 시험관내 세포 사멸을 분석하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포의 시험관내 사멸은 도 24a 내지 24c에 나타내었다. 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포의 세포 사멸에 대한 IC50 값은 표 19에 나타내었다.
표 19. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체에 의한 Colo205 세포의 세포 사멸을 대한 IC50
인간 EpCAM을 발현하는 293 세포의 시험관내 세포 사멸을 6.0, 6.5 및 7.4의 3개의 pH 값에서 인간 EpCAM을 발현하는 293 세포를 사용하여 유사하게 분석하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 인간 EPCAM을 발현하는 293 세포의 시험관내 사멸은 도 25a 내지 도 25c에 나타내었다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 인간 EPCAM을 발현하는 293 세포의 세포 사멸에 대한 IC50 값은 표 20에 나타내었다.
표 20. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체에 의한 293 세포의 세포 사멸을 대한 IC50
인간 EpCAM이 없는 293F 세포의 시험관내 세포 사멸을 6.0, 6.2 및 7.4의 3개의 pH 값에서 EpCAM이 없는 239F 세포를 사용하여 유사하게 분석하였다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 293F 세포의 시험관내 사멸은 도 26a 내지 도 26c에 나타내었다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 세포 사멸은 대조군과 유의하게 상이하지 않았다. 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 293F 세포의 세포 사멸에 대한 IC50 값은 표 21에 나타내었다.
표 21. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체에 의한 293F 세포의 세포 사멸을 대한 IC50
실시예 15: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC에 의한 종양의 치료
접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 (MMAE와 함께)에 의한 종양의 생체내 치료를 Colo205 이종이식 마우스 모델에서 측정하였다. 항체 BAP-105-01-01을 비-조건부 활성 항체 대조군으로서 사용하고, B12를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이종이식 모델을 IV 주사에 의해 간헐적 스케줄 Q4Dx4 (4일마다 4회)로 처리하였다. 3 mg/kg 및 6 mg/kg의 2가지 투여량을 사용하였다. 여덟 (8)마리의 마우스를 각 처리 그룹에 사용하였다. 접합된 조건부 활성 항-EpCAM 항체 (BAP-105.4-01-02, BAP-105.4-01-05, 및 BAP-105.4-02-01)는 종양의 부피를 유의하게 감소시켰지만, 대조군과 비교하여 3 및 6 mg/kg의 용량에서 동물의 중량을 유의하게 감소시키지 않았으며, 이는 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 대한 보다 효과적인 치료 및 감소된 부작용 모두를 나타낸다. 도 27a 내지 도 27c를 참조한다.
실시예 16: 종양 미세환경에서 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 ADC의 결합 활성
선택된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체를 MMAE에 접합시켜 항체 약물 접합체 (ADC)를 생산하였다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 BAP-105.4-01-02, BAP-105.4-01-05, 및 BAP-205.4-02-01이었다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체의 결합 활성을 pH 6.0에서 측정하여 종양 미세환경에서 pH를 모방하고, 7.4의 정상 생리학적 pH에서 측정하였다. 비-조건부 활성 항체 항체를 또한 MMAE에 접합시키고 음성 대조군으로서 사용하였다. 재조합 인간 EpCAM 세포외 도메인에 대한 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 상이한 ADC 농도에서 ELISA를 사용하여 측정하였다. ADC는 정상 생리학적 pH에서의 결합 활성과 비교하여 종양 미세환경 pH에서 더 높은 결합 활성을 나타내었다. 도 28a 내지 도 28b를 참조한다.
실시예 17: 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포의 억제에서 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체의 세포독성
실시예 16의 ADC를 사용하여 종양 미세환경 pH 6.0 및 정상 생리학적 pH 7.4에서 인간 EpCAM을 발현하는 Colo205 세포를 치료하였다. ADC는 정상 생리학적 pH에서보다 종양 미세환경 pH에서 더 큰 억제율 (IR%)을 유도하였다. 도 29a 내지 29b.
ADC는 또한 Colo205 세포 유도된 암 이종이식 모델을 치료하는데 사용되었다. Colo205 세포를 면역결핍성 마우스에 이식하여 80-100 mm3의 부피로 종양을 유도하였다. 종양-함유 동물을 그룹당 8마리의 마우스로 치료 그룹으로 무작위화하였다. 2개의 다른 음성 대조군을 치료에 사용하였다: 비히클 및 이소형 매치된 대조군 ADC (이소형 ctrl. ADC). ADC를 3 mg/kg Q4Dx4의 용량으로(4일마다 4회) 투여하였다. 본 발명의 접합된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 이종이식 모델에서 완전한 종양 퇴행을 달성하였다. 도 29c 참조.
실시예 18: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 인간 EpCAM에 대한 결합 활성
인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 대조군으로서 주형 항체 BAP 105-01-01을 사용하여 ELISA로 측정하였다. 도 30a 내지 도 30c를 참조한다. 본 실시예에서 사용된 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체는 하기와 같다:
pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 EpCAM에 결합하기 위한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 EC50 값은 표 22에 요약되어 있다.
표 22. 인간 EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 IC50
실시예 19: 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 cyno EpCAM에 대한 결합 활성
인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 cyno EpCAM에 대한 결합 활성을 유사하게 측정하였다. 도 31a 내지 도 31c를 참조한다. 실시예 18의 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 대한 pH 6.0 및 pH 7.4에서 cyno EpCAM에 결합하기 위한 IC50은 표 23에 요약되어 있다.
표 23. cyno EpCAM에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 IC50
실시예 20: 조건부 활성 항-EpCAM 항체 접합체의 세포 사멸
선택된 조건부 활성 항-EpCAM 항체 BAP-105-06-01 및 BAP-105-06-02를 강력한 항유사분열제인 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)에 접합시켜 항체 약물 접합체 (ADC)를 생성하였다. 항체 BAP-105-01-01을 비-조건부 활성 항체 대조군으로서 사용하고, B12를 음성 대조군으로서 사용하였다. EpCAM을 발현하는 Colo205 세포의 시험관내 세포 사멸을 6.0 및 7.4의 pH 값에서 측정하였다. 도 32a 내지 도 32b를 참조한다. 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체에 의한 Colo205 세포의 시험관내 사멸에 대한 IC50이 또한 결정되었고, 하기 표 24에 나타내었다.
표 24. 시험관내 Colo205 세포의 사멸에 대한 인간화 조건부 활성 항-EpCAM 항체의 IC50
실시예 21: 이중특이성 단일 조건부 활성 항체
조건부 활성이 아닌 항-EpCAM 항체는 단일 사슬 조건부 활성 항-CD3 항체에 연결되어 EpCAM 및 CD3 모두에 대해 특이성을 갖는 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3 (서열번호 35-38)를 형성하였다. 이중특이성 항체는 Crown Bioscience (San Diego, CA)에 의해 생산된 MiXeno 마우스 모델에서 종양 이종이식 마우스 모델을 치료하는데 사용되었다. 구체적으로, 결장암 세포주 HCT116 세포 (EpCAM 양성)를 인간 말초혈액 단핵세포로 이식된 삼중 면역결핍성 마우스에 이식하여 마우스 모델에서 종양을 유도하였다. 종양 부피가 대략 150 mm3에 도달하였을 때, 종양 보유 동물을 4개의 처리 그룹으로 무작위화하였다. 4개의 처리 그룹을 음성 대조군으로서 비히클 (그룹 1), 양성 대조군으로서 비-CAB-CD3 벤치마크 항체 BA-150-06-BF1 (서열번호 31-34) (그룹 2), 이중특이성 항체 BA-150-06-BF3 (그룹 3) 또는 음성 대조군으로서의 동종형 매칭 항체 (그룹 4)로 처리하였다. 항체를 4주 동안 격주로 2.5 mg/kg의 용량으로 투여하였다.
이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3은 이종이식 마우스 모델에서 완전한 종양 퇴행을 야기하는데 있어서 양성 대조군 비-CAB-CD3 벤치마크 항체 BA-150-06-BF1만큼 효과적이었지만, 2개의 음성 대조군은 종양 퇴행을 야기하지 못하고 음성 대조군에 대해 종양의 크기가 계속 증가하였다. 도 32a를 참조한다.
항-CD3 항체는 전형적으로 말초 순환계에서 T-세포 활성화를 일으키는 부작용을 가지며, 이는 중규모 디스커버리(Meso Scale Discovery, MSD) 검정을 사용하여 혈청 INF-γ 수준에 의해 측정될 수 있다. 도 32b를 참조한다. 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3는 양성 대조군 비-CAB-CD3 벤치마크 항체 BA-150-06-BF1과 비교하여 유의하게 감소된 T-세포 활성화를 야기하였다. 도 32b를 참조한다. 따라서, 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3은 조건부 활성 항-CD3 항체 성분을 갖기 때문에, 양성 대조군 비-CAB-CD3 벤치마크 항체 BA-15-06-BF1과 비교하여, 유의하게 감소된 부작용을 유발하지만, 유사한 치료 효과를 보였다.
실시예 22: 이중특이성 이중 조건부 활성 항체
조건부 활성 항-EpCAM 항체는 단일 사슬 조건부 활성 항-CD3 항체에 연결되어 EpCAM 및 CD3 모두에 대해 특이성을 갖는 이중 조건부 활성 이중특이성 항체 (CAB EpCAM x CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45 - 서열번호 47-50)를 형성하였다. 또한, 단일 사슬 조건부 활성 항-CD3 항체에 조건부 활성이 아닌 항-EpCAM 항체에 연결되어 EpCAM 및 CD3 모두에 대해 특이성을 갖는 이중특이성 항체 (WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-15-01-03-BF46 - 서열번호 43-46)를 형성함으로써, 단일 조건부 활성 이중특이성 항-EpCAM 항체를 제조하였다. 이중특이성 항체 BA-150-16-01-02-BF45 및 BA-150-15-01-03-BF46은 Crown Bioscience (San Diego, CA)에 의해 생산된 MiXeno 마우스 모델에서 종양 이종이식 마우스 모델을 치료하는데 사용되었다. 구체적으로, 결장암 세포주 HCT116 세포 (EpCAM 양성)를 인간 말초혈액 단핵세포로 이식된 삼중 면역결핍성 마우스에 이식하여 마우스 모델에서 종양을 유도하였다. 종양 부피가 대략 150 mm3에 도달하였을 때, 종양 보유 동물을 5개의 처리 그룹으로 무작위화하였다. 5개의 처리군을 음성 대조군으로서 비히클 (그룹 1), 양성 대조군으로서 비-CAB-CD3 벤치마크 항체 BA-150-15-01-03-BF1 (서열번호 39-42) (그룹 2), 이중 조건부 활성 이중특이성 항체 CAB EpCAM x CAB-CD3 BA-BA-150-16-01-02-BF45 (그룹 3), 음성 대조군으로서의 동종형 매칭 항체 (그룹 4) 또는 단일 조건부 활성 이중특이성 항체 WT EpCA x CAB-CD3 BA-150-15-01-O3-BF46 (그룹 5)으로 처리하였다. 항체를 4주 동안 격주로 2.5 mg/kg의 용량으로 투여하였다.
이중 조건부 활성 이중특이성 항체 CAB EpCAM x CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45는 이종이식 마우스 모델에서 완전한 종양 퇴행을 야기하는데 있어서 양성 대조군 비-CAB-CD3 벤치마크 항체 BA-150-15-01-03-BF1만큼 효과적이었지만, 2개의 음성 대조군은 종양 퇴행을 야기하지 못하고 음성 대조군에 대해 종양의 크기가 계속 증가하였다. 이중 조건부 활성 이중특이성 항체 CAB EpCAM x CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45는 단일 조건부 활성 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-15-01-03-BF46보다 약간 더 효과적이었다. 도 33 참조.
단일 조건부 활성 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3을 야생형 WT EpCAM x WT CD3 BA-150-06-BF1 항체에 대해 테스트하여 독성, 인터루킨-6 (IL6) 수준에 대한 효과 및 CD3+ 수준에 대한 효과를 측정하였다. 결과를 도 34에 나타내었다. 이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 단일 조건부 활성 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3는 야생형 WT EpCAM x WT CD3 BA-150-06-BF1 항체보다 상당히 덜 독성이었다. 또한, 단일 조건부 활성 이중특이성 항체 WT EpCAM x CAB-CD3 BA-150-06-BF3은 바람직하지 않은 IL-6의 수준을 유의하게 더 낮추고, 테스트 2일째에 CD3+의 감소를 유의하게 개선시켜, 종양 치료에서 유효성을 나타내었다.
항체, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 항-CD3 scFv의 서열은 하기와 같다:
서열번호 31 = BA-150-06-BF1-VK (항-EpCAM)
서열번호 32 = BA-150-06-BF1 경쇄
서열번호 33 = BA-150-06-BF1-항-CD3-scFv
서열번호 34 = BA-150-06-BF1-VH (항-EpCAM)
서열번호 35 = BA-150-06-BF3-VK (항-EpCAM)
서열번호 36 = BA-150-06-BF3 경쇄
서열번호 37 = BA-150-06-BF3-항-CD3-scFv
서열번호 38 = BA-150-06-BF3-VH (항-EpCAM)
서열번호 39 = BA-150-15-01-03-BF1-VK (항-EpCAM)
서열번호 40 = BA-150-15-01-03-BF1 경쇄
서열번호 41 = BA-150-15-01-03-BF1 항-CD3-scFv
서열번호 42 = BA-150-15-01-03-BF1-VH (항-EpCAM)
서열번호 43 = BA-150-15-01-03-BF46-VK (항-EpCAM)
서열번호 44 = BA-150-15-01-03-BF46 경쇄
서열번호 45 = BA-150-15-01-03-BF46-항CD3-scFV
서열번호 46 = BA-150-15-01-03-BF46-VH (항-EpCAM)
서열번호 47 = BA-150-16-01-02-BF45-VK (항-EpCAM)
서열번호 48 = BA-150-16-01-02-BF45 경쇄
서열번호 49 = BA-150-16-01-02-BF45-항CD3-scFv
서열번호 50 = BA-150-16-01-02-BF45-VH (항-EpCAM)
상기 VK 서열은 EpCAM 결합을 위한 경쇄 가변 도메인이다.
상기 경쇄 서열은 EpCAM 결합을 위한 VK 경쇄 가변 도메인, 카파 불변 영역 및 항-CD3-scFv를 포함하는 전장 경쇄이다.
상기 항-CD3-scFv 서열은 항-CD3-scFv 도메인이다.
상기 VH 서열은 EpCAM 결합을 위한 중쇄 가변 도메인이다.
실시예 23: 에피토프 매핑
인간/마우스 EpCAM-ECD 키메라의 구축 및 테스트
클론은 인간 및 사이노몰구스 EpCAM 세포외 도메인에 강력하게 결합하지만, 마우스 EpCAM-ECD와 교차 반응하지 않는다. 인간 EpCAM-ECD 상의 결합 영역을 확인하기 위해 4개의 키메라 인간/마우스 EpCAM-ECD 분자를 구축하였다. 인간 EPCAM-ECD의 단편은 PCR에 의해 마우스 EpCAM-ECD의 단편으로 대체되었다. 개별 마우스 단편은 도 35와 같이 검은색 세로선으로 표시된다. 도 35의 서열 정렬에서, 인간 EpCAM-ECD (상단)가 참조로 사용된다. 다른 분자의 동일한 아미노산은 점으로 나타내었으며, 아미노산 차이만 나타내었다. 정렬의 아미노산 넘버링은 도 39에 나타낸 PDB 엔트리 4mvz의 넘버링과 일치한다.
인간, 마우스 및 4개의 키메라 EpCAM 세포외 도메인을 CHO 세포에서 C-말단 His-태그로 발현시키고 정제하였다. 상이한 EpCAM ECD에 대한 클론 BA-105-04-01-05의 결합을 ELISA로 측정하였다.
인간 EpCAM-ECD 및 키메라 분자 2, 3 및 4에 대해 양호한 결합이 관찰되었다. 도 36에 나타낸 바와 같이, 키메라 EpCAM-ECD 1 (ch1EpCAM-his) 및 마우스 EpCAM-ECD에서는 결합이 관찰되지 않았다. ELISA 데이터는 BA-105-04-01-05에 대한 결합 영역이 도 37에 나타낸 바와 같이 인간 EpCAM (잔기 24-62)의 치밀한, 시스테인-풍부 N-도메인 내에 있음을 분명히 보여준다.
인간 EpCAM-ECD 돌연변이의 구축 및 테스트
에피토프 분석의 분해능을 증가시키기 위해, 인간, 사이노몰구스 및 마우스 EpCAM-ECD.N-도메인 간의 서열 차이를 기반으로 하여 인간 EpCAM에 돌연변이를 도입하였다. 총 7개의 돌연변이체 (M1-M7)를 구축하고 테스트하였다. 도 37에 나타낸 서열 정렬에서, 인간 EpCAM-ECD (상단)를 참조로 사용하였다. 다른 분자의 동일한 아미노산은 점으로 나타내었으며, 아미노산 차이만 나타내었다. 정렬의 아미노산 넘버링은 도 39에 나타낸 PDB 엔트리 4mvz의 넘버링과 일치한다.
잔기 25/26 및/또는 51을 마우스 서열로 변경하면 결합이 다소 감소한 반면, 잔기 36/37을 변경하면 결합이 완전히 제거되었다. 이는 잔기 25/26이 주요 접점임을 나타낸다 (도 39에 나타낸 구조에서 빨간색으로 표시됨). 이러한 2개의 잔기는 BA-105-04-01-05가 인간 EpCAM의 세포외 도메인의 N-도메인 내의 비-선형 에피토프를 인식함을 나타내는 잔기 25/26 및 51 (도 39에서 주황색으로 표시됨)이 표면에 인접해 있다.
실시예에서 사용된 방법
ELISA 검정은 하기 프로토콜을 사용하여 수행하였다:
1) ELISA 플레이트를 탄산염-중탄산염 코팅 완충액 중 0.5 μg/mL (06_20_17 및 06_28_17 실험) 또는 1 μg/mL (07_06_17 및 07_ll_17 실험)의 재조합 EpCAM 항원 100 μL로 코팅한다.
2) 플레이트를 밀봉 필름으로 씌우고 4℃에서 밤새 인큐베이션한다.
3) 플레이트를 기울여 따라내고 잔여 액체를 종이 타월 더미 위에 두드린다.
4) 샘플 지도에 따라 200 μL의 다양한 pH 인큐베이션 완충액을 웰에 분주하여 웰을 2회 세척하고 내용물을 완전히 흡인시킨다.
5) 200 μL의 다양한 pH 인큐베이션 완충액을 샘플 지도에 따라 웰에 첨가한다. 밀봉 필름을 씌우고 플레이트를 실온에서 60분 동안 플레이트 쉐이커 (200 rpm으로 설정) 위에 놓는다.
6) 플레이트를 기울여 따라내고 잔여 액체를 종이 타월 더미 위에 두드린다.
7) 다양한 pH 인큐베이션 완충액에 테스트 물질을 250 ng/mL, 100 ng/mL 또는 25 ng/mL로 연속 희석한다.
8) 플레이트에 100 μL/웰의 희석된 테스트 물질을 샘플 지도에 따라 첨가한다.
9) 밀봉 필름을 씌우고 플레이트를 실온에서 60분 동안 플레이트 쉐이커 (200 rpm으로 설정) 위에 놓는다.
10) 플레이트를 기울여 따라내고 잔여 액체를 종이 타월 더미 위에 두드린다.
11) 샘플 지도에 따라 200 μL의 다양한 pH 세척 완충액을 웰에 분주하여 웰을 3회 세척하고 내용물을 완전히 흡인시킨다.
12) HRP 2차 항체를 다양한 pH 인큐베이션 완충액에서 1:2500으로 희석한다.
13) 샘플 지도에 따라 각 웰에 다양한 pH 인큐베이션 완충액에 희석된 100 μL HRP 2차 항체를 첨가한다.
14) 밀봉 필름을 씌우고 플레이트를 실온에서 60분 동안 플레이트 쉐이커 (200 rpm으로 설정) 위에 놓는다.
15) 플레이트를 기울여 따라내고 잔여 액체를 종이 타월 더미 위에 두드린다.
16) 샘플 지도에 따라 200 μL의 다양한 pH 세척 완충액을 웰에 분주하여 웰을 3회 세척하고 내용물을 완전히 흡인시킨다.
17) 플레이트의 모든 웰에 TMB 기질 용액을 웰당 50 μL 분주한다. 실온에서 3분 동안 인큐베이션한다.
18) 플레이트의 모든 웰에 1N HCl을 웰당 50 μL 첨가한다. Molecular Device SpectraMax 190 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 플레이트를 판독한다.
19) OD450 nm 원 데이터를 측정한다.
20) Softmax Pro 소프트웨어 (Molecular Devices)를 사용하여 완충액의 pH에 대하여 상이한 pH 값에서의 평균 OD 값 (2회 반복 값)을 플로팅하였다. 곡선 피팅(Curve fitting)은 소프트웨어에 내장된 4-매개변수 모델을 사용하여 수행하였다. pH 곡선의 변곡점 (50% 결합 활성)은 피팅 방정식의 매개변수 C와 같다. pH 6.0에서의 결합 활성을 100%로 설정하였다. 90% 결합 활성에 대한 pH는 Softmax Pro 소프트웨어의 "InterpX" 함수를 사용하여 피팅된 곡선으로부터 보간되었다.
표면 플라즈마 공명 (SPR) 검정은 하기 프로토콜을 사용하여 수행하였다:
SPR 2/4 기기, SPR Affinity Sensor - Amine Flat, 및 고정화(Immobilization) 완충액 키트는 Sirra Sensors에서 제조된 것이다. SPR 센서는 4개의 플로우 셀 (FC1- FC4)을 함유하고, 각 셀은 개별적으로 또는 그룹으로 처리될 수 있다. EpCAM 세포외 도메인은 FC2 및 FC4에 고정화시킨 반면, BSA는 FC1 및 FC3 (대조군 표면)에 고정시켰다.
고정화는 공급업체가 제안한 하기 프로토콜에 따라 수행하였다:
(1) 활성화제는 주입 직전에 200 mM EDC 및 50 mM NHS (Sierra Sensors)를 혼합하여 제조하였다. 아민 센서 칩은 25 μL/분 유속의 혼합물을 이용하여 480초 동안 활성화시켰다.
(2) 10 mM NaAc (pH 5.0) 중 25 μg/mL의 인간 EpCAM을 FC2 및 FC4에 각각 480초 동안 25 μL/분의 유속으로 주입하였다. 칩 표면은 FC1 내지 4를 통해 1 M 에탄올아민-HCl (Sierra Sensors)을 25 μL/분의 유속으로 480초 동안 통과시켜 불활성화시켰다.
(3) 대조군 표면은 단백질의 주입 없이 동일한 조건을 사용하여 활성화 및 불활성화시켰다.
(4) 실행 완충액은 분석물 주입 전에 필요한 pH를 가진 PBST로 전환시켰다. 기기는 1차 분석물 주입 전에 1시간 동안 실행 완충액으로 평형화시켰다.
(5) 모든 분석물 주입은 25℃에서 25 μL/분으로 수행하였다.
고정화된 단백질 없이 유동 셀 1 (또는 3)은 참조군 차감을 위한 대조용 표면으로서 사용하였다. 또한, 분석물로서 완충액만을 사용한 데이터 (0 nM 분석물)를 각 실행으로부터 차감하였다. 이중 차감된 데이터를 1:1 결합 모델을 사용하여 제공된 분석 소프트웨어 Analyzer R2 (Sierra Sensors)에 피팅시켰다. 146 kDa의 분자량은 분석물의 몰 농도를 계산하는데 사용하였다.
형광-활성화 세포 분류 (FACS) 검정은 하기 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
인간 또는 사이노몰구스(cynomolgus) EpCAM의 표면 발현을 결정하기 위한 세포 염색
1) 3 x 106 세포를 T-75 플라스크에 시딩하고 공급업체의 지침에 따라 배양한다.
2) FACS 분석일에, 배양 배지를 제거하고 폐기한다.
3) 세포 층을 PBS 용액으로 간단히 헹군다.
4) 각 T-75 플라스크에 1.5 mL의 데타킨(Detachin) 용액을 첨가한다. 셀 층이 분산될 때까지 기다린다.
5) 해당 세포주에 4.5 mL의 배양 배지를 첨가하고, 부드럽게 피펫팅함으로써 세포를 재현탁시킨다.
6) 세포를 모으고 세포 현탁액을 50-mL 원뿔형 튜브로 이동시킨다.
7) 4℃에서 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리하기 전에 트립판 블루 염색으로 세포를 계수한다.
8) PBS로 세포를 한 번 세척하고, 3 x 105 세포를 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 이동시킨다.
9) 튜브 당 1% BSA가 포함된 PBS 용액 100 μL에 2 μL의 마우스 항-EpCAM (PE 접합된 마우스 IgG1) 또는 PE-동종형 마우스 IgG1을 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 100 RPM으로 쉐이킹한다.
10) 세포를 150 μL PBS 용액으로 3회 세척한다.
11) 주위 온도에서 10분 동안 4% PFA를 이용하여 세포를 고정시킨 다음, PBS로 세포를 1회 세척한다.
12) 100 μL PBS에 세포를 재현탁하고, NovoCyte 유세포분석기 상에서 세포를 분석한다.
테스트된 항체를 사용하여 인간 EpCAM 또는 사이노몰구스 EpCAM을 발현하는 CHO 세포의 FACS 분석.
1) 세포를 수확하고 (3.3, 단계 1 내지 7과 같이), PBS로 세포를 한 번 세척한다.
2) 세포를 3 x 106 세포/mL 농도로 pH 6.0 또는 pH 7.4 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
3) 96-웰 U-바닥 플레이트 중의 100 μL pH 6.0 또는 pH 7.4 FACS 완충액에 3 x 105 세포를 분취한다.
4) 세포를 스핀다운시키고, 완충액을 폐기한다.
5) pH 6.0 또는 pH 7.4 FACS 완충액에서 테스트 물품을 10 μg/mL에서 시작하여 3배 희석물로 연속 희석한다.
6) 희석된 테스트 물품 100 μL/웰을 세포에 첨가하고, 부드럽게 잘 혼합한 다음, 얼음 상에서 쉐이킹 (100 rpm) 하면서 1시간 동안 인큐베이션한다.
7) 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리한다. 150 μL의 pH 6.0 또는 pH 7.4 세척 완충액으로 세포를 두 번 세척한다.
8) 염소 항-인간 IgG AF488 항체를 pH 6.0 또는 pH 7.4 FACS 완충액에서 1:300으로 희석한다.
9) 상기 단계 8)로부터의 희석된 항체 100 μL를 세포에 첨가하고, 빛을 차단하면서 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션한다.
10) 세포를 펠릿화하고 150 μL의 pH 6.0 또는 pH 7.4 세척 완충액으로 3회 세척한다.
11) 1X PBS에 희석된 4% PFA로 주변 온도에서 10분 동안 세포를 고정한 다음, 1X PBS로 세포를 세척한다.
12) 1X PBS 100 μL에 세포를 재현탁한다.
13) Ex488nm/Em530nm를 사용한 NovoCyte Flow Cytometer를 사용하여 세포를 분석한다. 적어도 20,000개의 세포를 수집한다.
FACS 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 7.03에 내장된 비선형 피팅 (가변 기울기, 4개의 매개변수) 모델을 사용하여 분석하였다.
그러나, 비록 본 발명의 다수의 특성들과 이점들이 본 발명의 구조 및 기능에 관한 상세한 설명과 함께 상기 발명의 설명 중에 제시되었을지라도, 본 개시는 오로지 예시를 위한 것일 뿐, 특히 본 발명의 원리 안에 속하는 부분들의 형상, 크기 및 정렬에 관한 사항 중 본원에 첨부된 청구범위에 표현된 용어들의 광범위하고 일반적인 의미에 의해 명시되는 한 어떤 경우라도 상세한 부분까지 변화가 가하여질 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 인용된 모든 문헌들은, 본원에 그 전체로서, 또는 대안적으로 이 문헌들을 구체적으로 필요로하면서 본 개시를 제공하기 위해 참조로 인용되어 있다. 본 출원인(들)은 본원에 개시된 구현예들 그 어떠한 것도 공중에게 헌사할 의향이 없으며, 본원에 개시된 임의의 변형이나 변경이 청구범위 내에 문자 그대로 포함될 수 없을지라도, 이러한 변형이나 변경은 균등 원칙 하에 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> BiatAtla LLC <120> Conditionally active anti-EpCAM antibodies <130> BIAT-1029 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> This position may be Y or D <400> 2 Xaa Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> Variant <222> (6)..(6) <223> This position may be A or H <400> 5 Ser Thr Ser Asn Leu Xaa Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> This position may be H or E <220> <221> Variant <222> (7)..(7) <223> This position may be H or E <400> 6 Xaa Gln Trp Ser Thr Tyr Xaa Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Asp Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 14 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 15 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 16 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys Glu Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 17 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 18 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 19 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 20 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 21 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 22 Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 23 Asp Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 24 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 25 Ser Thr Ser Asn Leu His Ser 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 26 His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 27 His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 Glu Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr 1 5 <210> 29 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 31 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val 210 215 220 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 225 230 235 240 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 245 250 255 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser 260 265 270 Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg 275 280 285 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 290 295 300 Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His 305 310 315 320 Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 325 330 335 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu 355 360 365 Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr 370 375 380 Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro 385 390 395 400 Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 405 410 415 Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala 420 425 430 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 435 440 445 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Thr Val Leu Ser Arg 465 <210> 33 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 130 135 140 Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp 165 170 175 Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 180 185 190 Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 195 200 205 Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg 245 250 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 34 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 35 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 36 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val 210 215 220 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 225 230 235 240 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 245 250 255 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser 260 265 270 Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg 275 280 285 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 290 295 300 Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His 305 310 315 320 Ser Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 325 330 335 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu 355 360 365 Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr 370 375 380 Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro 385 390 395 400 Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 405 410 415 Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala 420 425 430 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 435 440 445 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Thr Val Leu Ser Arg 465 <210> 37 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Ser Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 130 135 140 Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp 165 170 175 Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 180 185 190 Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 195 200 205 Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg 245 250 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val 210 215 220 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 225 230 235 240 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 245 250 255 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser 260 265 270 Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg 275 280 285 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 290 295 300 Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His 305 310 315 320 Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 325 330 335 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu 355 360 365 Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr 370 375 380 Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro 385 390 395 400 Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 405 410 415 Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala 420 425 430 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 435 440 445 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Thr Val Leu Ser Arg 465 <210> 41 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 130 135 140 Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp 165 170 175 Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 180 185 190 Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 195 200 205 Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg 245 250 <210> 42 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 44 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val 210 215 220 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 225 230 235 240 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 245 250 255 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser 260 265 270 Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg 275 280 285 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 290 295 300 Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His 305 310 315 320 Thr Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 325 330 335 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu 355 360 365 Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Ala 370 375 380 Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro 385 390 395 400 Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 405 410 415 Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala 420 425 430 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 435 440 445 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Thr Val Leu Ser Arg 465 <210> 45 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Thr Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 130 135 140 Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ser Ser Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp 165 170 175 Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 180 185 190 Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 195 200 205 Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg 245 250 <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 47 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val 210 215 220 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 225 230 235 240 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 245 250 255 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser 260 265 270 Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg 275 280 285 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 290 295 300 Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His 305 310 315 320 Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 325 330 335 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu 355 360 365 Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Ala 370 375 380 Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro 385 390 395 400 Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 405 410 415 Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala 420 425 430 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 435 440 445 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 450 455 460 Thr Val Leu Ser Arg 465 <210> 49 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 130 135 140 Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ser Ser Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp 165 170 175 Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 180 185 190 Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 195 200 205 Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg 245 250 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (51)

  1. 인간 EpCAM에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 H1, H2, 및 H3을 갖는 3개의 항원 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
    H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
    H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
    H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되; 상기 X1은 Y 또는 D이고;
    경쇄 가변 영역은 서열 L1, L2, 및 L3을 갖는 3개의 항원 상보성 결정 영역을 포함하며, 여기서:
    L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
    L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
    L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되; 상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이고; 단, X1, X2, X3 및 X4는, 각각, 동시에 Y, A, H, 및 H일 수 없는 것인, 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 H2 서열은 YIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 22)인, 단리된 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 H2 서열은 DIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 23)인, 단리된 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7 내지 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 단리된 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 L2 서열은 STSNLAS (서열번호 24)인, 단리된 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 L2 서열은 STSNLHS (서열번호 25)인, 단리된 폴리펩티드.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L3 서열은 HQWSTYHT (서열번호 26)인, 단리된 폴리펩티드.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L3 서열은 HQWSTYET (서열번호 27)인, 단리된 폴리펩티드.
  9. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L3 서열은 EQWSTYHT (서열번호 28)인, 단리된 폴리펩티드.
  10. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 14 내지 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 단리된 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드(들)을 포함하는 항-EpCAM 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  12. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 EpCAM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 중쇄 가변 영역은 3개의 항원 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 영역은 서열 H1, H2, 및 H3을 가지며, 여기서:
    H1 서열은 GYTFTSYWMH (서열번호 1)이고;
    H2 서열은 X1IRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 2)이며;
    H3 서열은 GDNWVGFAN (서열번호 3)이되;
    상기 X1은 Y 또는 D이고,
    경쇄 가변 영역은 3개의 항원 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 영역은 서열 L1, L2, 및 L3을 가지며, 여기서:
    L1 서열은 SASSSISYMH (서열번호 4)이고;
    L2 서열은 STSNLX2S (서열번호 5)이며;
    L3 서열은 X3QWSTYX4T (서열번호 6)이되;
    상기 X2는 A 또는 H이고; X3은 H 또는 E이며; X4는 H 또는 E이고; 단, X1, X2, X3 및 X4는 각각, 동시에 Y, A, H, 및 H일 수 없는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 H2 서열은 YIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 22)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  14. 제12항에 있어서, 상기 H2 서열은 DIRPSTGYTEYNQKFKD (서열번호 23)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  15. 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7 내지 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L2 서열은 STSNLAS (서열번호 24)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L2 서열은 STSNLHS (서열번호 25)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  18. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L3 서열은 HQWSTYHT (서열번호 26)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L3 서열은 HQWSTYET (서열번호 27)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  20. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L3 서열은 EQWSTYHT (서열번호 28)인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  21. 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 14 내지 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  22. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 항체 단편으로서, 각 영역은 각각 독립적으로 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 및 서열번호 10 및 19로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며; 여기서 상기 항체 또는 항체-결합 항체 단편의 6개 항원 상보성 결정 영역의 각각의 아미노산 서열은 변형되지 않은 것이고; 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 EpCAM 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  23. 제22항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 서열번호 8 및 14, 서열번호 9 및 14, 서열번호 7 및 15, 서열번호 7 및 16, 서열번호 7 및 17, 서열번호 11 및 20, 서열번호 12 및 21, 서열번호 11 및 18, 서열번호 13 및 18, 서열번호 10 및 19; 쌍으로부터 선택되는 임의의 한 쌍의 서열을 갖는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  24. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 종양 미세환경의 조건 값에서 비-종양 미세환경에서 나타나는 동일한 조건의 상이한 값과 비교하여 EpCAM 단백질에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조건은 pH인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  26. 제25항에 있어서, 상기 종양 미세환경의 pH는 5.0 내지 6.8의 범위이고, 비-종양 미세환경의 pH는 7.0 내지 7.6의 범위인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 종양 미세환경의 조건 값에서의 EpCAM 단백질에 대한 결합 친화성 대 비-종양 미세환경의 동일한 조건의 상이한 값에서의 EpCAM 단백질에 대한 결합 친화성의 비율이 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 20:1, 적어도 30:1, 적어도 50:1, 적어도 70:1, 또는 적어도 100:1인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  28. 제12항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다중특이성 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  29. 제12항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이성 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  30. 제29항에 있어서, 상기 이중특이성 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 항-CD3-ScFv를 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
  31. 제12항의 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 면역접합체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 면역접합체는 화학요법제, 방사성 원자, 세포증식 억제제 및 세포독성제로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함하는 것인, 면역접합체.
  33. 제32항에 있어서, 적어도 2종의 상기 제제를 포함하는, 면역접합체.
  34. 제32항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 방사성 제제인, 면역접합체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 방사성 제제는 알파 방출체, 베타 방출체 및 감마 방출체로부터 선택되는 것인, 면역접합체.
  36. 제32항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 항체 단편 및 적어도 하나의 제제는 링커 분자에 공유 결합되어 있는 것인, 면역접합체.
  37. 제32항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 칼리키아마이신, 피롤로벤조디아제핀 및 안트라사이클린으로부터 선택되는 것인, 면역접합체.
  38. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제12항 내지 제15항 및 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항의 면역접합체; 및 약학적으로 허용가능한 담체:를 포함하며, 선택적으로 등장화제를 더 포함하는, EpCAM을 발현하는 암의 치료를 위한 약학적 조성물.
  39. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제12항 내지 제15항 및 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항의 면역접합체의 일회 용량; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, EpCAM을 발현하는 암의 치료를 위한 약학적 조성물로,
    상기 일회 용량은 상기 폴리펩티드, 항체, 항체 단편 또는 면역접합체를 135 내지 235 mg, 235 내지 335 mg, 335 내지 435 mg, 435 내지 535 mg, 535 내지 635 mg, 635 내지 735 mg, 735 내지 835 mg, 835 내지 935 mg, 935 내지 1035 mg, 1035 내지 1135 mg, 1135 내지 1235 mg, 또는 1235 내지 1387 mg 범위의 양으로 포함하는, 약학적 조성물.
  40. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제12항 내지 제15항 및 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항의 면역접합체; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, EpCAM을 발현하는 암의 치료를 위한 단일 용량 제형(unit dosage form)으로,
    단일 용량 제형에 포함되는 상기 폴리펩티드, 항체, 항체 단편 또는 면역접합체의 용량은 135 내지 235 mg, 235 내지 335 mg, 335 내지 435 mg, 435 내지 535 mg, 535 내지 635 mg, 635 내지 735 mg, 735 내지 835 mg, 835 내지 935 mg, 935 내지 1035 mg, 1035 내지 1135 mg, 1135 내지 1235 mg, 또는 1235 내지 1387 mg 범위인, 단일 용량 제형.
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
KR1020227000242A 2019-06-11 2020-06-10 조건부 활성 항-epcam 항체, 항체 단편, 이들의 면역접합체 및 이의 용도 Active KR102560876B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962860092P 2019-06-11 2019-06-11
US62/860,092 2019-06-11
PCT/US2020/037096 WO2020252095A1 (en) 2019-06-11 2020-06-10 Conditionally active anti-epcam antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220019761A KR20220019761A (ko) 2022-02-17
KR102560876B1 true KR102560876B1 (ko) 2023-07-28

Family

ID=73781730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227000242A Active KR102560876B1 (ko) 2019-06-11 2020-06-10 조건부 활성 항-epcam 항체, 항체 단편, 이들의 면역접합체 및 이의 용도

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11851499B2 (ko)
EP (1) EP3983446A4 (ko)
JP (1) JP7387196B2 (ko)
KR (1) KR102560876B1 (ko)
CN (1) CN114026127B (ko)
AU (1) AU2020292304B2 (ko)
CA (1) CA3143039A1 (ko)
IL (1) IL288753B2 (ko)
MX (1) MX2021015356A (ko)
TW (1) TWI844690B (ko)
WO (1) WO2020252095A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7387196B2 (ja) * 2019-06-11 2023-11-28 バイオアトラ インコーポレイテッド 条件付きで活性な抗ｅｐｃａｍ抗体、抗体フラグメント、それらのイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
WO2023001987A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 University Of Dundee Therapeutic muteins
TW202502825A (zh) * 2023-03-02 2025-01-16 美商拜奧亞特拉公司 條件性活性抗epcam抗體、抗體片段及併入其之構築體

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701039A (zh) 2009-11-06 2010-05-05 中国人民解放军第四军医大学 Fmu-epcam-2a9单克隆抗体的轻链和重链可变区
US20140288275A1 (en) 2013-01-14 2014-09-25 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US20160090426A1 (en) 2014-07-21 2016-03-31 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAMxCD3
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
US20170247447A1 (en) 2014-11-10 2017-08-31 Hoffmann-La Roche Inc. ANTI-IL-1beta ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7557190B2 (en) * 2005-07-08 2009-07-07 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
AU2008235566B2 (en) 2007-04-04 2013-06-06 Alfasigma S.p.A Anti-EpCAM antibody and uses thereof
HUE036081T2 (hu) 2009-03-09 2018-06-28 Bioatla Llc Mirac proteinek
WO2011079283A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Bioalliance C.V. Anti-epcam antibodies that induce apoptosis of cancer cells and methods using same
KR20220082104A (ko) 2010-11-30 2022-06-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
WO2013131001A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Academia Sinica ANTI-EPITHELIAL CELL ADHESION MOLECULE (EpCAM) ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
PL3052525T3 (pl) 2013-10-02 2020-03-31 Viventia Bio Inc. Przeciwciała anty- EpCAM i sposoby wykorzystania
EP3186284B1 (en) 2014-08-28 2022-04-06 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
MX386703B (es) 2014-09-03 2025-03-19 Bioatla Llc Descubrimiento y producción de proteínas biológicas condicionalmente activas en las mismas células hospederas eucariotas de producción.
AU2015346330A1 (en) 2014-11-11 2017-05-11 Amunix Operating Inc. Targeted XTEN conjugate compositions and methods of making same
JP7387196B2 (ja) * 2019-06-11 2023-11-28 バイオアトラ インコーポレイテッド 条件付きで活性な抗ｅｐｃａｍ抗体、抗体フラグメント、それらのイムノコンジュゲート、及びそれらの使用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701039A (zh) 2009-11-06 2010-05-05 中国人民解放军第四军医大学 Fmu-epcam-2a9单克隆抗体的轻链和重链可变区
US20140288275A1 (en) 2013-01-14 2014-09-25 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
US20160090426A1 (en) 2014-07-21 2016-03-31 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAMxCD3
US20170247447A1 (en) 2014-11-10 2017-08-31 Hoffmann-La Roche Inc. ANTI-IL-1beta ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Also Published As

Publication number Publication date
TWI844690B (zh) 2024-06-11
TW202112820A (zh) 2021-04-01
AU2020292304B2 (en) 2023-03-30
JP2022531504A (ja) 2022-07-06
KR20220019761A (ko) 2022-02-17
US20220315664A1 (en) 2022-10-06
CN114026127A (zh) 2022-02-08
EP3983446A1 (en) 2022-04-20
WO2020252095A1 (en) 2020-12-17
IL288753A (en) 2022-02-01
IL288753B1 (en) 2025-01-01
EP3983446A4 (en) 2023-04-19
MX2021015356A (es) 2022-04-06
IL288753B2 (en) 2025-05-01
JP7387196B2 (ja) 2023-11-28
US11851499B2 (en) 2023-12-26
CN114026127B (zh) 2024-10-29
CA3143039A1 (en) 2020-12-17
AU2020292304A1 (en) 2022-01-06
US20240117067A1 (en) 2024-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230235054A1 (en) Conditionally active anti-nectin-4 antibodies
US20240117067A1 (en) Conditionally active anti-epcam antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
US20230109218A1 (en) Conditionally Active Anti-Her2 Antibodies, Antibody Fragments Their Immunoconjugates And Uses Thereof
US20230242662A1 (en) Conditionally active anti-cd46 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
WO2024226567A1 (en) Linkers for drug conjugates and antibody drug conjugates
HK40064777A (en) Conditionally active anti-epcam antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
HK40081768A (en) Conditionally active anti-nectin-4 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20220104

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
AMND Amendment
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20220308

Comment text: Request for Examination of Application

PA0302 Request for accelerated examination

Patent event date: 20220308

Patent event code: PA03022R01D

Comment text: Request for Accelerated Examination

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20220720

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20221227

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20220720

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20221227

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20221018

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20220308

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20230518

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20230418

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20221227

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20221018

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20220308

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20230725

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20230725

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration