KR102555461B1

KR102555461B1 - 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용하여 제조한 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 포함하는 당뇨 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102555461B1
Application number: KR1020200160214A
Authority: KR
Inventors: 박보람; 박지영; 이소희; 정지혜; 최지호; 박신영; 김영민; 홍성진; 이하늘
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: KR20220072944A

Abstract

본 발명은 당전이효소를 덱스트린에 첨가하여 반응시켜 제조한 지소화성이 우수한 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 포함하는 당뇨 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당은 지소화성이 우수하여 환자식 또는 장기간 에너지 공급이 가능한 조성물로서 활용되기에 유용하다.

Description

고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용하여 제조한 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 포함하는 당뇨 개선용 조성물{Composition for alleviating diabetes comprising dextrin-derived highly polymerized isomaltooligosaccharide prepared by using a sugar transferase for preparing highly polymerized isomaltooligosaccharide}

고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용하여 제조한 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 포함하는 당뇨 개선용 조성물에 관한 것이다.

단맛을 내는 물질인 당류는 당분자의 개수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 나뉜다. 포도당(glucose)과 과당(fructose)은 분자가 하나로 된 단당류이고, 설탕(sucrose sugar)은 분자가 2개인 이당류, 올리고당(oligosaccharide)은 3개 이상의 분자가 뭉쳐진 다당류에 속한다. 당류는 대부분의 과일, 유제품, 곡류 등에 함유되어 있기 때문에 식품을 통하여 섭취될 수 있으며 에너지를 공급하고, 정신적인 만족감을 주는 기능을 한다. 입자가 작은 단당류일수록 소화와 섭취가 빠르나, 다당류는 소화와 섭취가 어려워 설탕의 3분의 1 수준으로 칼로리가 낮은데다 장내에 공생하는 또는 유리한 미생물의 성장을 자극시켜 개인에 생물학적 효과를 발휘하는 프리바이오틱스로 불리우기도 하며, 체내에서 수용성 식이섬유와 같은 작용을 한다고 알려져 있다.

당류 중 많은 양을 차지하는 설탕과 과당의 과잉 섭취는 열량을 높여 비만을 유발하거나, 혈중 중성 지방을 높여 심혈관질환 등 성인병 발생 위험성을 증가시킬 수 있고, 어린이의 경우에는 충치, 과잉행동장애와 같은 질병 발생 위험과 관련이 있는 것으로 보고되고 있는등 유해성 논란이 계속되면서, 건강을 위해 단맛을 내기 위한 설탕의 대체제로 올리고당을 사용하는 소비자가 늘어나고 있다. 국내에서 쉽게 접할 수 있는 올리고당의 예로는 프락토올리고당과 이소말토올리고당이 있다.

프락토올리고당(fructo-oligosaccharide)은 설탕의 과당(Fructose) 잔기에 1~3개의 과당이 결합된, 설탕과 유사한 구조를 가진 당류의 혼합물을 말한다. 그 구성 성분은 1-케스토스 (1-Kestose, GF2), 니스토스 (Nystose, GF3), 프락토실 니스토스 (Fructosyl nystose, GF4)이다. 이소말토올리고당(Isomalto-oligosaccharide, IMO)은 포도당이 α-(1,4)- 및/또는 α-(1,6)-글루코시드 결합 형태의 분지결합으로 중합도(degree of polymerization, DP) 2 내지 10 인 당류를 말하는 것으로 이소말토스 (isomaltose), 파노스(panose), 이소말토트리오스(isomaltotriose), 이소말토테트라오스(isomaltotetraose) 및 이소파노스(isopanose)와 같은 기타 고급 분지형 올리고당을 포함하며 장내 유용균으로 대표되는 비피더스균의 증식인자로 알려져 있다. 프락토올리고당과 이소말토올리고당은 모두 다당류인 올리고당에 속하지만 둘의 차이는 올리고당을 구성하는 성분에서 나타난다. 프락토올리고당은 설탕(과당+포도당)을 가공해 포도당을 연결하여 제조하고, 이소말토올리고당은 쌀이나 옥수수 등의 녹말가루(포도당+포도당)를 가공해 포도당을 연결하여 만든 것이다.

장내의 비피더스균은 영양, 면역, 노화, 장내 부패물질 억제, 비타민 합성 등 숙주의 건강과 밀접한 관계를 갖고 있다. 비피더스균을 증식시키기 위해 비피더스 균 및 비피더스 생육 촉진물질을 식품에 첨가한 식품이 판매되고 있으며 비피더스의 촉진물질로서 여러 종류의 올리고당이 개발되고 있다. 프락토올리고당은 대부분 난소화성으로 소장에서 분해되지 않고 대장까지 도달하여 장내 서식하는 비피더스 균에 선택적으로 이용됨으로써 증식을 촉진하는데, 과다복용시는 설사를 유발하는 것으로 알려져 있다. 그에 반해 이소말토올리고당은 난소화성과 소화성의 중간 위치에 있으므로 장관에 대한 자극이 약하여 최대 무작용량이 설탕과 유사한 수준인 1.5g/kg 정도로 안전성이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 최근에는 국내에도 올리고당 및 비피더스균에 대한 인식이 확대됨에 따라 음료, 유제품, 장류 등 다양한 종류의 식품에 올리고당이 첨가되고 있다. 특히, 중합도가 높은 이소말토올리고당은 건강기능성 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Toshiyuki Kaneko et al. Biosci. Biotech. Biochem., 58(12): 2288-2290, 1994).

본 발명자들은 덱스트린을 기질로 하여 올리고당을 제조하는 방법에 대해 연구한 결과, 고중합 이소말토올리고당 제조효소가 덱스트린과 반응하여 신규한 올리고당 생성할 수 있는 활성이 있으며, 이로부터 덱스트린 유래 신규한 고중합 이소말토올리고당 제조가 가능함을 확인하였으며, 제조된 이소말토올리고당이 지소화성이 효능이 매우 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 지소화성이 우수한 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 유효성분으로 포함하는 당뇨 개선용 조성물을 제공하는 것이다. 이때, 상기 고중합 이소말토올리고당은 시판되는 이소말토올리고당 대비 포도당 함량이 20~25% 수준으로 절반에 가깝고, α-1,6결합 형태의 올리고당의 구성당 종류 및 함량, 중합비가 월등히 증가하여 지소화성이 우수한 특성이 있다

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 당전이효소를 덱스트린(Dextrin)에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 제조 방법으로 제조된, 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 개선용 조성물을 제공한다.

이때, 상기 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당은 구성당 성분 중 α-1,6 결합 만으로 이루어진 성분을 포함하고, 중합도(degree of polymerization, DP)가 7 내지 13이고, 구성당 성분 중 α-1,6 결합 만으로 이루어진 성분을 포함하고, 중합도(degree of polymerization, DP)가 7 내지 13인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 당전이효소를 덱스트린에 첨가하여 반응시켜 제조한 지소화성이 우수한 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 포함하는 당뇨 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당은 지소화성이 우수하여 섭취시 혈중 인슐린 농도의 증감이 완만히 이루어져 당뇨병식 등의 환자식으로 이용하거나 스포츠인 등 장기간 에너지 공급이 필요한 경우에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 써모안아에로박터 써모코프리애 (Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주 유래의 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열이 클로닝된 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 재조합 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 전기영동 분석을 통해 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당 제조효소가 성공적으로 제조되었음을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 고중합 이소말토올리고당의 제조를 위한 기질 탐색을 위해 시간 경과에 따른 TG(시중효소, 실선) 및 TtLIMO(점선)에 의한 말토오스(M2, 왼쪽 그래프) 및 말토테트라오스(M4, 오른쪽 그래프)와의 반응 생성물의 상대적 조성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 여러가지 중합도의 덱스트린 기질 (D1, D2 및 D3)를 HPAEC-PAD 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 덱스트린 표준품 (STD 1, STD 2)을 HPAEC-PAD를 통해 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 여러가지 중합도의 덱스트린 기질로부터 유래한 고중합 이소말토올리고당의 생성을 HPAEC-PAD를 통해 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 덱스트린 기질의 중합도별 반응 생성물의 구성당을 분석한 결과를 나타태는 도면이다.
도 9는 덱스트린 기질와 LIMOzyme의 반응 시간에 따른 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 생성 비율을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 덱스트린 기질, 시판 이소말토올리고당 및 본 발명에 따른 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 구성당을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 MALDI-TOF MS 분석을 통해 구성당 중합도를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 α-1,4/α-1,6 결합 비율을 분석하기 위하여 덱스트린 기질, 이소말토올리고당 및 본 발명에 따른 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 ¹H-NMR 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명에 따른 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 지소화 특성을 확인하기 위하여 글루코스 생성 비율을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명에 따른 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 지소화 특성을 확인하기 위하여 포도당 부하 내성검사, 혈당 변화에 대한 혈당 면적, 혈당 수치를 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 당전이효소는 써모안아에로박터 써모코프리애 (Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주 유래일 수 있다.

상기 당전이효소는 서열번호 1의 고리형 이소말토올리고당 당전이효소(Cycloisomaltooligosacharride glucanotransferase, TPCITase) 중 서열번호 2의 C -말단을 포함하는 포함하며, 덱스트린을 기질로하여 당전이 생성물을 제조하는 당전이효소일 수 있다.

상기 반응은 당전이효소에 의해 수행되는 반응을 지칭한다. 반응 용액은 일반적으로 기질인 덱스트린과 가용화 전분, 물, 임의의 다른 성분을 포함하는 용액 중 적어도 하나 이상을 포함하고 여기에 활성 당전이효소를 더 포함하는 용액을 지칭한다. 물, 기질로서 덱스트린과 가용화 전분 및 당전이효소를 접촉시키는 단계가 수행되는 곳은 반응 용액이다. 상기 반응에서는 당전이효소의 활성을 통해 덱스트린에 가용화 전분을 전달하여 결합을 형성시켜 지소화성이 우수한 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 생성하는 반응이 일어난다.

상기 단계의 기질들과 당전이효소의 반응은 20 내지 60℃에서 이루어지는 것일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 50℃에서 이루어지는 것일 수 있다.

상기 단계의 기질과 당전이효소의 반응은 0.2 내지 80시간 동안 이루어질 수 있고, 0.2 내지 10시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 3 내지 9시간, EH는 4 내지 8시간 동안 이루어지는 것일 수도 있다. 다만, 반드시 상기 반응시간에 제한되는 것은 아니고, 기질인 덱스트린의 농도에 따라 통상의 기술자가 실험을 통해 적절한 반응시간을 선택할 수 있는데, 예를 들면 덱스트린의 농도가 약 30%일 때는 3일(72시간)

상기 단계의 당전이효소는 20 내지 80㎕ 첨가될 수 있고, 바람직하게는 30 내지 70㎕ 첨가될 수 있으며, 더 바람직하게는 40 내지 60㎕ 첨가될 수 있다.

상기 방법으로 생성된 지소화성이 우수한 고중합 이소말토올리고당은 중합도(Degree of polymerization, DP)가 5 내지 20인 이소말토올리고당일 수 있다. 또는 예를 들면, 중합도가 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11일 수도 있다.

상기 방법으로 생성된 이소말토올리고당은 α-1,6 결합으로만 구성된 이소말토올리고당 일 수도 있고, α-1,6 결합과 α-1,4 결합의 비가 2:1 내지 5:1이거나, 2:1 내지 4:1일 수도 있다. 상기 고중합 이소말토올리고당은 구성당 성분 중 α-1,6 결합만으로 이루어진 성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 고중합 이소말토올리고당은 포도당을 20 내지 25% 함량으로 포함하여, 시판 이소말토올리고당의 포도당 함량이 40 내지 50%인 것과 대비하여 낮을 것을 특징으로 한다.

상기 당전이효소를 덱스트린에 첨가하여 반응시키는 단계 전에,

1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 당전이효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계; 및

2) 상기 배양물로부터 당전이효소를 수득하는 단계;를 더 포함하여 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 덱스트린 유래 올리고당 제조효소(Tt-LIMO)는 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소와 같은 의미로 사용된다.

상기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소는 덱스트린을 기질로 이용하여 이소말토올리고당을 제조할 수 있다.

상기 이소말토올리고당은 중합도가 2인 이소말토오스는 화학식 1, 중합도가 3인 이소말토트리오스는 화학식 2 또는 중합도가 4 내지 10인 이소말토올리고당은 화학식 3의 구조를 갖는 것이 바람직하다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

상기 당전이효소는 덱스트란 덱스트리나아제(Dextran dextrinase)일 수도 있다.

당 전이 반응이 일어나는 탄수화물 활성 효소로는 크게 glycosyl transferase(GTase), transglucosidases(TGase), glycoside phosphorylase(GPase) 및 glycoside hydrolases(GHase) 등 네 가지로 분류되며 이 중 glycosyl transferase(GTase)는 당 전이 효율이 좋고 다양한 수용체에 당을 전이할 수 있는 능력이 뛰어나다.

상기 당전이효소(glycosyl transferase, GTase)는 비환원 말단인 α-1,4 결합의 글루코실기 말단을 α-1,6 결합으로 전이한다. 상기 α-1,4 결합은 α-D 포도당 분자가 인접한 α-D 포도당 분자 고리와 탄소 1 및 4를 통해 서로 연결된 공유 결합의 유형을 지칭한다. 상기 α-1,6 결합은 α-D 포도당 분자가 인접한 α-D 포도당 분자 고리와 탄소 1 및 6을 통해 서로 연결된 공유 결합의 유형을 지칭한다.

본 발명의 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당은 포도당이 α-(1,4)- 및/또는 α-(1,6)-글루코시드의 분지결합으로 이루어진 중합도가 7 내지 13인 다당류를 지칭하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이소말토올리고당의 분자량은 중량 평균 중합도(DPw) 또는 수 평균 중합도(DPn)로 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서 당전이효소는 중합도 2 내지 6의 중합도가 낮은 이소말토올리고당 뿐만 아니라 중합도가 7 내지 13인 중합도가 높은 고중합 이소말토올리고당까지 생성할 수 있다.

또한, 상기 당전이효소는 '변이체'를 포함하며, '변이체'는 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 당전이효소와 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 말한다.

"상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 당전이효소(TP-DDase)를 코딩하는 아미노산 서열(서열번호 5)과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 본 발명의 당전이효소 또는 이의 상동체는 효소 활성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이지 않는 강산성에서도 효소 활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 당전이효소의 기질 특이성을 강화되거나 효소와 반응하는 기질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.

본 발명의 당전이효소는 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산될 수 있다. 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 당전이효소 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현 벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 다 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pET28a, pET 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있고, 상기 당전이효소(TP-DDase) 유전자의 효율적인 발현을 위해서는 상기 대장균 유래 플라스미드(pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로,목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

본 발명에 있어서 형질전환체는 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 라셀라(Moraxella)속, 트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 사용할 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로 사용할 수 있다. 본 발명에서는 BL21(DE3), Rosetta(DE3), Rosetta2(DE3), ArcticExpress(DE3), STAR(DE3), C41(DE3) 및 C43(DE3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 대장균을 숙주로 이용하는 것이 보다 바람직하다. 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명의 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 당전이효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. atl.Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 63-168(1983)) 등이 이용 가능하다.

또한, 재조합벡터는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 포함하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서 당전이효소의 제조는 상기 형질전환체를 배양한 배양물(배양균체 또는 배양상층액) 속에 유전자 산물인 당전이효소를 생성, 축적시킨 후, 상기 배양물로부터 당전이효소를 취득함으로써 행하여진다. 본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적정 온도의 범위에서 배양함으로써 당전이효소를 균체 내에 축적시키고 회수할 수 있다.

미생물의 증식에 필요한 탄소원은 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류;글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산 제1칼륨,인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 또한, 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가할 수 있다.

형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하여 목적하는 단백질을 생산할 수 있다. 유도물질의 예로, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로 사용할 수 있다. 당전이효소의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상층액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다. 얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴블랏팅(western blotting) 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 당전이효소(TP-DDase)의 생산과 균체 내에의 축적, 및 균체로부터의 당전이효소(TP-DDase)의 회수는 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

상기 덱스트린은, D.E.(Dextrose equivalent)에 따라 종류를 구분할 수 있는데, 예를 들면 1 내지 20의 범위에서 적절히 선택하여 제조하거나 사용할 수 있다. 예를 들면 3 내지 7, 13 내지 17, 16.5 내지 19.5일 수 있다. 또한 덱스트린은 중합도(DP, Degree of polymerization)에 따라 종류를 구분할 수 있는데, 예를 들면 3 내지 50, 5 내지 20, 15 내지 30, 25 내지 50, 10 내지 20, 15 내지 25, 25 내지 35일 수 있고, 15 이하이거나, 20 이하이거나, 30 이하일 수 있다. 바람직하게는 상기 덱스트린은 말토덱스트린(maltodextrin)을 사용할 수 있다.

상기 덱스트린은 2 이상의 중합도(degree of polymerization, DP)를 가지는 포도당이 α-1,4 형태로 결합된 단일물질 또는 혼합물일 수 있다.

상기 덱스트린의 농도는 0.5 내지 60%(w/v)로 사용할 수 있는데, 0.5 내지 20%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 0.5 내지 1.5%(w/v), 4 내지 6%(w/v), 8 내지 12%(w/v), 5 내지 15%(w/v), 15 내지 25%(w/v), 25 내지 35%(w/v), 35 내지 45%(w/v), 약 1%(w/v), 약 5%(w/v), 약 10%(w/v), 약 20%(w/v), 약 30%(w/v), 약 40%(w/v)의 농도로 사용할 수 있으나 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 당전이효소를 덱스트린(Dextrin)에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 제조 방법으로 제조된, 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 유효성분으로 포함하는, 환자 식이 조성물을 제공한다.

본 발명은, 당전이효소를 덱스트린(Dextrin)에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 제조 방법으로 제조된, 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 유효성분으로 포함하는, 지소화성 지속형 에너지 보급제를 제공한다.

이때 상기 환자식이 조성물 및 지소화성 지속형 에너지 보급제는 상기 당뇨 개선용 조성물에 관한 상세한 설명이 적용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 써모안아에로박터 써모코프리애 균주로부터 분리한 해당효소 Tt-LIMO를 코딩하는 유전자를 이용하여 제한효소 EcoRI 및 XhoI로 절단한 2463bp의 Tt-ILMO를 코딩하는 염기 서열을 포함한 재조합 벡터를 제작하고(도 1 및 도 2 참조), 상기 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 제작한 형질전환체에서 당전이효소인 덱스트린 유래 올리고당 제조효소를 생산하였다. 또한 상기 방법으로 제조한 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당은 지소화성이 뛰어남을 실험을 통해 확인하였다(도 13 및 도 14 참조).

상기 지소화성이 있는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당은 일반 이소말토올리고당 대비 포도당함량이 20~25%수준으로 절반에 가깝고, α-1,6결합 형태의 올리고당의 구성당 종류 및 함량, 중합비가 월등히 증가하였으며, 지소화성이 우수한 특성이 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명에 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소( Tt - LIMO )를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환체의 제조

<1-1> 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소( Tt - LIMO )를 암호화하는 염기 서열의 증폭

당전이효소인 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 단백질을 생산하기 위해 상기 효소를 암호화하는 염기 서열을 증폭하였다.

구체적으로, 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주(RIKEN, Tokyo, Japan)로부터 분리한 DNA를 주형으로 사용하여, 제한효소 사이트(EcoRI, XhoI)를 포함하는 하기 표 1의 염기 서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다.

그 결과, 전체 유전자(고리형 이소말토올리고당 당전이효소, cyclo-isomaltooligosacharride glucanotransferase, TPCITase ; 4680bp)(서열번호 1) 중 C-말단의 2463bp(서열번호 2)를 포함하는 TP-DDase를 암호화하는 염기서열의 PCR 산물을 수득하였다(도 1).

서열번호	서열(5'-3')
서열번호3 (정방향)	GGATCCCCGGAATTCATGATTTATGTAAAGCGTACGATAACCAC
서열번호4 (역방향)	ATGCGGCCGCTCGAGTTAAAAATCAGGTAATCGTAGATCAAACC

<1-2> 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조

당전이효소의 클로닝을 위해 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 대량으로 수득한 PCR 산물을 발현벡터인 pET28a에 제한효소인 NdeI와 XhoI을 이용하여 재조합 벡터(Tt-LIMO plasmid vector)를 제작하였다.

제작한 재조합 벡터를 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였다. 제작된 형질전환체의 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)의 활성을 분석한 후, 가장 높은 활성을 보이는 형질전환체를 분리하였으며, 상기 도입된 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열을 분석하여 서열번호 5의 아미노산 서열을 획득하였다.

< 실시예 2> 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당 제조효소( Tt - LIMO )의 제조 및 회수

상기 <실시예 1-2>에서 제작한 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열이 도입된 형질전환체를 50㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 500㎖의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지가 함유된 플라스크에 도말하고 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 형질전환체의 콜로니를 수득하여 37℃에서 전배양하였다. 배양시 배양액의 흡광도(optial density, OD)가 600nm에서 0.5가 되었을 때, 단백질 발현 유도제인 0.1mM의 IPTG(isoprophyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 18℃에서 21시간 동안 150 rev/min으로 교반하면서 배양하였다. 상기 배양된 세포는 10000rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 회수하였고, 25㎖의 lysis 완충용액로 현탁하여 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 12,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 수득한 상층액을 DEAE-650M 컬럼에 로딩하여 정제하였다. 단백질용 흡착제는 20mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 사용하였으며, 컬럼에 흡착되지 않은 단백질을 취하여 정제를 완료하였다. 최종적으로 정제된 단백질의 순도는 10% Tris-Glycine SDS-PAGE Gel 분석으로 확인하였다. 상기 분석 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과를 도 3에 나타내었다(M, 사이즈 마커(size marker); 1, 25℃에서 하룻밤 배양한 pET28a(+)를 포함하는 E. coli BL21 (DE3)의 가용성 분획; 2, IPTG 유도 후 25℃에서 하룻밤 배양한 pET28a(+)를 포함하는 E. coli BL21 (DE3)의 가용성 분획; 3, 25℃에서 하룻밤 배양한 pET28a-LIMO를 포함하는 E. coli BL21 (DE3)의 가용성 분획; 4, IPTG 유도 후 25℃에서 하룻밤 배양한 pET28a(+)를 포함하는 E. coli BL21 (DE3)의 가용성 분획; 5, His Trap HP column으로 정제된 TtTG. A 10% (w/v) 아크릴아마이드 겔이 사용되었으며, Coomassie Brilliant Blue을 이용하여 확인함). 그 결과, 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 재조합 단백질이 성공적으로 생산됨을 확인할 수 있었다(도 3). 이하 상기 효소는 고중합(긴)이소말토올리고당(L-IMO)을 생성하는 효소라는 의미로서 LIMOzyme라고도 기재하였다.

< 실시예 3> 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당 제조효소( Tt - LIMO )를 이용한 고중합 이소말토올리고당의 제조를 위한 기질 탐색

본래 이소말토올리고당을 제조하기 위한 원료로는 중합도(DP) 2의 말토오스를 기질로 이용하여 전이효소(TG)와 반응시켜 말토오스를 구성하는 포도당 중 비환원성 말단에 위치한 포도당이 다른 말토오스에 당전이 되어 α-1,6결합으로 구성된 이소말토올리고당인 파노오스(Panose), 이소말토오스(Isomaltose), 이소말토트리오스(Isomaltotriose)를 생성한다. 한편 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 고중합 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)는 기질특이성이 기존과 다른 것으로 확인되어 다양한 중합도의 기질을 이용하여 기질 소비 정도 및 생성물 전환물질을 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 말토오스(M2) 및 말토테트라오스(M4)의 시간 경과에 따른 반응을 나타낸 것으로, TG(시중효소, 실선) 및 TtLIMO(점선)에 의한 M2(A) 및 M4(B)와의 반응 생성물의 상대적 조성을 그래프로 나타내었다 (왼쪽 그래프에서 ●, G1; ○, IG2; ▼, IG3; △, G2; ■, IG4; □, P; 오른쪽 그래프에서 : ●, G1; ○, IG2; ▼, G2; △, P; ■, G3; □, G4; ◆, O-GMT; ◇, G5; ▲, G6).

실험 구체적으로, 각 기질용액으로 1 % (w / v) 말토오스(M2), 1 % (w / v) 말토 테트라오스(M4)를 함유하는 80 mM BR 완충액 (pH 4.0)에서 정제된 Tt-LIMO와 함께 50 ℃에서 3시간 동안 배양 후 생성물을 5분마다 샘플링, 비활성화하여 생성물을 HPAEC-PAD (ICS 5000 Dionex)을 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 4를 통해 확인할 수 있듯이 시판 TG효소는 말토오스를 급속히 기질로 소비하여 가수분해 및 당전이 생성물로 전환된 반면 개발 Tt-LIMO효소는 M2는 기질로 이용하지 못하고, M4를 이용하여 다양한 당전이 생성물로 전환하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Tt-LIMO는 중합도가 낮은 M2 대신 M4 이상의 다당류를 잘 이용하는 것을 확인하여 하기 실험을 통해 말토덱스트린 이용 생성물을 분석하였다.

< 실시예 4> HPAEC -PAD(High Performance Anion Exchange Chromatography with pulsed amperometric detection) 분석을 이용한 덱스트린 유래 이소말토올리고당 제조효소에 의한 기질별 생성물 분석

<4-1> 여러 가지 중합도의 덱스트린 HPAEC 분석

기질인 덱스트린을 이용하여 LIMOzyme 최적 생산 조건을 탐색하기 위해, 여러 가지 중합도를 갖는 덱스트린를 HPAEC-PAD 분석하였다. 덱스트린은 중합도 별로 3가지 수준으로 구분하여, D.E(dextrose equivalent)가 각각 3-7, 13-17, 16.5-19.5인 덱스트린을 D1, D2, D3로 명하고 3차 증류수에 0.1% (w/v) 용액으로 제조하였으며 완전히 용해시키기 위하여 전자레인지(800W, Daewoo, Korea)에 30초간 가열하여 내용물이 투명해질 때까지 완전히 녹여 사용하였다.

분석 기기로는 DIONEX ICS-5000+ SP(Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 DIONEX ICS-5000+ DC(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 하기 표 2의 분석 조건에 따라 HPAEC-PAD 분석을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

컬럼 (Column)	CarboPacPA-200
용리액 1 ( eluent 1)	D.W.
용리액 2 ( eluent 2)	500mM NaOH
용리액 3 ( eluent 3)	1M Na-Acetate
기울기 조건(Gradient)	시간	E1	E2	E3
	0.00	78.0	22.0	00.0
	20.00	80.0	18.0	02.0
	30.00	65.0	20.0	15.0
	70.00	00.0	30.0	70.0
	80.00	78.0	22.0	00.0
유속(Flow Rate)	0.5㎖/min
검출(Detection)	Pulsed amperometry, gold electrode

분석 결과, 말토덱스트린 기질의 구성 당 중합도(Degree of polymerization)은 D1이 30, D2가 20, D3이 15로 정도로 확인되었다. 고중합이소말토올리고당 효소에 대한 최적 기질의 중합도를 탐색하기 위하여 기질 D1, D2 및 D3와 LIMOzyme의 반응 결과 생성물의 구성 올리고당 결과를 다음과 같이 확인하였다.

<4-2> 덱스트린 중합도(D.E.)별 생성물 분석

덱스트린의 중합도(dextrose equivalent, D.E.) 별 LIMOzyme 효소 반응에 따른 고중합이소말토올리고당 제조에 대한 영향을 확인하기 위하여, 상기 <3-1>에서 준비한 D1, D2 및 D3를 각각 5% (w/v) 농도로 40 nM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 4.5)에 혼합한 후, 정제한 LIMOzyme의 단백질 농도가 10% (v/v) (0.05 mg/mL)이 되도록 반응물에 혼합하여 40℃에서 밤새도록 반응시킨 후 HPAEC-PAD로 분석하였다. 생성물 구성당 프로파일과 그 물질을 확인하기 위한 표준품 STD1, STD2 및 상기 분석 결과를 표 3, 도 6 및 도 7 에 나타내었다.

Abbreviation	Compound	Retention time(min)
G1	D-(+)-Glucose	2.23
IG2	isomaltose	2.85
IG3	isomaltotriose	4.11
G2	maltose	5.30
IG4	isomaltotetraose	6.55
P	Panose	9.96
IG5	isomaltopentaose	11.08
G3	maltotriose	13.30
IG6	isomaltohexaose	14.08
IG7	isomaltoheptaose	15.85
G4	maltotetraose	18.46
G5	maltopentaose	22.40
G6	maltohexaose	25.66
G7	maltoheptaose	28.28

그 결과 도 6 및 도 7에서 확인할 수 있듯이, 덱스트린의 중합도가 낮은 D3를 이용한 LIMOzyme 반응 생성물이 DP 값이 큰 이소말토올리고당 제조활성이 우수한 것을 알 수 있다. 또한, LIMOzyme 및 기질 혼합물의 반응생성물 구성당은, alpha 1,4-linked glucose가 LIMOzyme에 의해 NRE(non reducing end)로부터 한 분자의 포도당을 donor 기질에 전달하는 작용 방식으로 alpha 1,6-linked oligosaccharide를 생성하므로 alpha 1,6 결합 혹은 1,4 결합이 혼재된 당이 남아있는 것으로 추정되며, STD1 크로마토그램으로 확인할 수 있듯이 G4~G7과는 상이한 물질로 Anomalously linked oligosaccharide(ALO)로 불리우는 물질로 특정되는 linear type의 DP8~10으로 구성된 또는 α-1,6 결합을 포함하는 올리고당으로 추정할 수 있다. 반응 생성물 중합도 확인은 MALDI-TOF 분자량 분석을 통해 결과를 확인하였다.

<4-3> 덱스트린 중합도(D.E.)별 생성물의 구성당 분석

덱스트린 중합도별 생성물의 구성당을 분석하여 도 8에 그 결과를 나타내었다. 도 8에서 확인할 수 있듯이 5% 농도의 D1~D3 반응결과 고중합 이소말토올리고당 생성물의 피크는 D2, D3에서 함량이 높은 것으로 확인되었다. 또한 각 기질 및 효소반응 생성물을 포도당(Glucose)과, 포도당이 α-1,4결합만으로 이루어진 G2~G7등의 말토올리고당(MOs), α-1,6결합을 한 개이상 포함하며 중합도가 낮은(>=DP4) 이소말토올리고당(IMOs), α-1,6결합을 한 개 이상 포함하여 중합도가 높은(<DP5) 고중합 이소말토올리고당(LIMOs, ALOs)으로 구분하여 함량비율을 계산한 결과, D1 기질 반응 생성물 대비 D2, D3의 포도당 함량이 낮고, 고중합 이소말토올리고당의 함량은 더 높은 것으로 확인되어, 이를 통해 Tt-LIMO효소는 포도당량이 낮고 중합도가 높은 D1 덱스트린을 기질로 활용하는 것보다 D2, D3와 같은 중합도가 DP ~15, DP ~20 수준의 덱스트린을 기질로하여 효율적으로 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당을 생성할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 5> 덱스트린 기질의 농도별 고중합 이소말토올리고당 생성물 분석

덱스트린의 농도별 LIMOzyme 효소 반응에 따른 고중합 이소말토올리고당 제조 영향을 확인하기 위하여 D1, D2 및 D3를 각각 2%, 10%, 20%로 완전히 용해하고 반응물의 50%로 첨가하여 1, 5, 10 (w/v) 농도로 40 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 4.5)와 혼합한 후 정제된 LIMOzyme의 단백질 비율이 10% (v/v) (0.05 mg/mL)이 되도록 반응물에 혼합하여 40℃에서 밤새도록 반응시켜 분석에 사용하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

	1%			5%			10%
	D1	D2	D3	D1	D2	D3	D1	D2	D3
글루코스(부산물)	40.03	25.76	22.86	34.76	22.65	20.74	27.49	16.28	15.2
MOs(잔류기질)	5.66	8.54	9.69	4.98	7.49	9.24	7.05	8.5	9.7
IMO	27.36	17.99	25.97	14.45	17.20	17.68	12.27	16.14	17.19
LIMO	23.9	34.17	35.69	31.12	40.32	37.34	33.61	45.13	44.33

1%, 5%, 10% 덱스트린 기질 농도로 하여 총 반응액의 10% LIMOzyme 반응 (15시간) 결과 생성되는 이소말토올리고당을 확인할 수 있었다. 1%에 해당하는 낮은 농도의 기질에서도 효소-기질 간의 친화도(affinity, Km)가 낮아 생성물이 잘 해리됨을 알 수 있다. 5%, 10%의 충분한 기질 농도에서도 고중합 이소말토올리고당의 제조 활성이 우수하여 본 발명에 따른 LIMOzyme의 당전이 활성이 뛰어난 것을 알 수 있다. 또한, 기존 시판 이소말토올리고당 제조용 TG 효소와 달리 짧은 이소말토올리고당 외에 IG4-7 생성물의 구성이 많은 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 반응 시간에 따른 고중합 이소말토올리고당 생성물 분석

덱스트린과 LIMOzyme의 반응시간에 따른 고중합 이소말토올리고당 제조 양상을 확인하기 위하여 D2를 최종농도 1% (w/v) 농도로 80 mM B-R 완충액 (pH 4.0)에 혼합한 후, 정제한 LIMOzyme의 단백질의 농도가 0.05 mg/mL이 되도록 반응물에 10% 비율로 혼합하여 40℃에서 밤새도록(o/n) 반응시키면서, 0.5, 1, 3, 6, 시간이 되었을 때마다 HPAEC-PAD 분석을 진행하였다.

그 결과를 도 9에 나타내었다. 그 결과, 0.5시간 내지 1시간 동안 반응하였을 때 고중합 이소말토올리고당의 생성비율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7> 고농도의 기질을 이용한 고중합 이소말토올리고당 생성물 분석

1-10%의 저농도 기질에서의 고중합 이소말토올리고당 생성과 고농도 기질을 이용하여 제조한 고중합 이소말토올리고당 제조물을 비교하기 위해 D2를 각각 80%로 용해하였다. 고농도 말토덱스트린의 경우 물을 소량씩 첨가하면서 전자렌지로 짧은 시간 여러 번 작동하여 가열시 끓어 넘침을 방지하였다. 볼텍서를 이용하여 당액을 고루 섞어주며 맑은 용액이 될 때까지 완전 용해시켰다. 이후 1/8, 2/8, 3/8, 4/8 비율로 반응액에 넣어 10, 20, 30, 40% 농도로 맞추고 80 mM B-R buffer (pH 4.0)와 0.05 mg/mL 농도로 purified LIMOzyme을 혼합한 후 40℃에서 3일 반응 후 100℃에서 5분 가열로 불활성화 하였다. 반응물은 400배 이상 적절히 희석하여 HPAEC-PAD로 분석하였다. 1일 및 3일 동안 반응한 결과를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

1일 반응	D2
덱스트린 농도(%)	10%	20%	30%	40%
글루코스 (부산물)	24.92	29.27	27.11	24.18
MOs (non-iso, 잔류기질)	1.56	1.09	1.28	2.57
IMO+LIMO	62.25	66.32	62.75	59.94

3일 반응	D2
덱스트린 농도(%)	10%	20%	30%	40%
글루코스 (부산물)	38.57	27.66	24.79	22.01
MOs (non-iso, 잔류기질)	0.70	0.89	0.84	1.02
IMO+LIMO	59.90	68.38	70.27	67.31

그 결과, 30% 농도의 D2를 3일 동안 반응시킨 경우 IMO+LIMO 생성이 가장 많았다. 반면, 10% 농도에서는 1일 동안 반응시켰을 때에 비해 3일 동안 반응시킨 경우 IMO+LIMO 생성이 오히려 줄어들었으며, 20%, 30%, 40% 농도에서는 1일 동안 반응시킨 경우보다 3일 동안 반응시킨 경우 IMO+LIMO 생성이 증가하였다.

< 실시예 8> 덱스트린 기질 및 이소말토올리고당 생성물의 구성당 분석 및 α-1,4/α-1,6 결합비 분석

<8-1> 덱스트린 기질 및 이소말토올리고당 생성물의 구성당 분석

기질(말토덱스트린), 시판 이소말토올리고당 및 본 발명에 따른 고중합 이소말토올리고당의 구성당을 비교 분석하기 위하여, 상기 실시예 4-3과 같은 방법으로 구성당을 분석하였다. 구성당 분석을 위하여 기질로 30% 덱스트린 D.E. 13-17을 이용하여 80 mM B-R 완충액 (pH 4.0), 40℃, 3일 반응 조건 하에서 제조효소인 정제된 LIMOzyme을 0.05 mg/mL 농도로 혼합, 반응 후 100℃에서 5분 가열로 불활성화하여 제조하였으며, 그 반응 생성물을 400배 희석하여 분석하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

기질의 구성당 분석결과 단당(Glucose), 이당(Maltose) 및 DP15 범위의 말토올리고당(MOs, α-1,4 linked)을 확인하였으며, 말토오스 시럽을 기질로 사용하여 상업용 TG효소로 제조된 시판 이소말토올리고당의 구성당은 약 50%의 G1, G2외에 이소말토올리고당으로 간주되는 IG2(isomaltose), IG3(isomaltotriose), P(panose)로 구성됨을 확인함. 반면 덱스트린을 기질로 하여 신규 발굴효소 적용결과 약 20%의 포도당 외에 IG2, IG3, ~ IG5까지 DP5 이상의 선형 이소말토올리고당(linear type isomlatooligosacharide)을 확인하였으며, RT(retension time) 18분 이후의 Anomalously linked 올리고당이 생성됨을 확인할 수 있었다. 이는 덱스트린(MOs)과 달리 소화가 잘 안되는(indigestable) 특성을 지니는 올리고당으로 α-1,4/α-1,6 결합이 혼재되어있는 구성당으로 추정된다. 이 미지의 물질의 특성 확인을 위해 포도당 분자간 결합을 확인할 수 있도록 하기와 같이 H-NMR을 실시하였다.

<8-2> H-NMR 구조분석을 통한 α-1,4/α-1,6 결합비 분석

¹H-NMR 분석법 (DMX-500 spectrometer, Bruker, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 기질(말토덱스트린), 이소말토올리고당(IMO), 고중합 이소말토올리고당(LIMO) 및 고중합 이소말토올리고당 분획물의 α-1,4, α-1,6 결합의 상대적인 분율을 측정하였다. Freeze-dried enzyme-modified starch samples (20 ㎎/mL)을 D₂O에 용해시키고, 30분간 교반하며 가열하였다. 샘플을 다시 동결건조 시킨 후, 샘플을 D₂O에 20 ㎎/mL의 농도가 되도록 용해하여 ¹H-NMR 분석을 진행하였다. ¹H-NMR 분석결과는 75℃에서 수집되었고, 결합 퍼센테이지 (%)는 샘플의 branching ratio를 측정하여 계산하였다. 그 결과를 도 12 및 하기 표 7에 나타내었다.

그 결과, 고농도의 말토덱스트린에 비해 IMO와 LIMO의 α-1,6 결합 비율이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 LIMO는 IMO에 비해 약 2배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 포도당 분자 간 α-1,4 결합 형태의 전분, 덱스트린은 소화효소에 의해 빨리 분해되어 혈당을 증가시키게 되며 α-1,6은 쉽게 분해되지 않고 소장 상부 중부 하부를 지나며 천천히 방출되어 혈당을 급격히 높이지 않으면서 지속적으로 에너지를 공급할 수 있어 스포츠 선수, 환자식 등에 적용이 가능하다

샘플	Glycosidic linkage ratio
샘플	α-1,4	α-1,6
말토덱스트린(MD2)	1.00	0.0395
이소말토올리고당(IMO)	1.00	1.1363
30% 고중합이소말토올리고당(LIMO)	1.00	3.7037

< 실험예 1> 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 지소화 특성 확인을 위한 글루코스 생성 비율 분석 (Glucose generation rate test, GGR test)

<1-1> 랫트의 장(intestinal) α-글루코시다아제(α-glucosidase)의 제조

혈당 탄수화물(Glycemic carbohydrates)로부터 글루코스로의 가수분해를 측정하기 위하여, 포유류 유래 점막 α-글루코시다아제(mammalian mucosal α-glucosidase)의 공급원으로 intestinal acetone powder from Rat (RIAP, SIGMA, USA)를 사용하였다. RIAP (2g)을 100 mM 소듐 인산 완충액 (pH 6.8, 20 mL)에 혼합하고, 4℃에서 24시간 동안 보관하여 crude α-글루코시다아제를 추출하였다 (Yoshikawa &Kurihara, 2002). 혼합물을 원심분리(4℃, 6,000xg, 15분)하여 상등액을 1.5 ㎛ 나일론 필터 (Thermo scientific, USA)를 이용하여 필터하였고, 추출된 효소 용액은 crude α-글루코시다아제로 사용하였다. 이후, 효소 용액을 Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit (MWCO: 100kDa, Millipore, USA)를 사용하여 불순물과 오염물을 제거하여 정제하였고, 최종 여과액은 정제된 랫트의 장 α-글루코시다아제 용액으로 사용하였다.

<1-2> 포유류 유래 점막 α-글루코시다아제에 의해 생산된 글루코스 생산량 분석

점막 α-글루코시다아제(mucosal α-glucosidase)의 가수분해 특성 연구를 위하여, 다양한 크기와 연결패턴을 가진 탄수화물(IMO, LIMO, MD2(말토덱스트린 DP13.0-18.0), 말토오스)의 가수분해물로부터 글루코스 생성 비율(glucose generation rate, GGR)을 측정하였다. 샘플 용액 (100 μL, 10% w/v)은 0.2% 소듐 아자이드가 함유된 100 mM 인산 완충액 (pH 6.0)로 제조하였다. 준비된 샘플 용액에 제조된 α-글루코시다아제 용액 (100 μL)을 첨가하여 37℃에서 48시간 동안 가수분해를 진행하였고, 각 샘플은 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 및 48시간에 가열(boiling)하여 반응을 종료하였다. 점막 α-글루코시다아제 활성의 1unit은 1분당 말토오스 (1%, w/v)로부터 1 μmol의 가수분해된 포도당을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 여러 가지 기질의 가수분해물로부터 생성된 글루코스의 양은 Glucose Assay Kit (Megazyme, Wicklow, Ireland)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

포유류 소화효소 적용을 통한 말토/이소말토올리고당에서 분해되는 포도당량을 측정하여 분해속도를 확인하였다. 그 결과 말토올리고당의 경우 말토오스와 유사한 수준으로 1시간 내 급격하게 소화되어 모두 포도당으로 분해되었으나 이소말토올리고당의 경우 말토올리고당에 비해 조금 더 완만한 속도로 초기 포도당량이 측정되었고 10시간 이후에도 지속적으로 소화분해되어 지소화성 특성을 보였다. 이때 시판이소말토올리고당 내 함유된 포도당의 함량이 제외된 값이므로 20시간 이후 더 이상 포도당 분해가 없는 것은 20시간에 걸쳐 천천히 분해된 결과로 보인다. 이를 통해 본 발명에 따른 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 적용하여 생성된 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 경우 초기 시판 이소말토올리고당과 유사한 분해속도를 보였으며 10시간이 지난 20, 30시간 동안 천천히 당이 분해되어 환자식, 스포츠인 등 장기간에 에너지 공급이 필요한 경우 바람직하게 사용될 수 있는 지소화성 소재로서 활용이 가능할 것으로 보인다.

<실험예 2> 마우스 섭취에 따른 당 부하능 분석

본 발명에 따른 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용하여 제조한 덱스트린 유래 올리고당의 마우스 식이에 따른 혈당 증가 특성을 확인하기 위하여, ICR(Institute of Cancer Research) mouse 7주령을 이용하여, 2 g/kg이 되도록 섭취시켜 포도당 부하 내성검사를 실시하였다. 분석샘플은 대조군(글루코스), MD2(말토덱스트린 DP13-18, SIGMA, USA), IMO(이소말토올리고당), 30% LIMO(고중합 이소말토오리고당)이며, 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥 채혈을 통해 혈당을 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

그 결과, 대조군인 글루코스와 30% LIMO는 30분에서 정점을 찍고 점점 감소하는 경향을 보였으며 MD2와 IMO는 45분에서 정점을 찍고 감소하는 경량을 보였다. 또한 120분에는 포도당 투여 전 혈당 수치와 거의 유사한 수준을 나타냈다. 각각의 sample을 식이한 군들은 대조군과 거의 유사한 양상을 보였으며 당 투여 후 30분 이후에는 대조군에 비해 낮은 혈당 수치를 나타내었다. 포도당을 투여한 후의 혈당 변화에 대한 혈당 면적(area under curve, AUC)을 산출한 결과에서는 MD2, IMO, 30% LIMO 식이군들이 대조군에 비해 낮은 경향을 보였으나 MD2, IMO는 비슷한 경향을 보였고 30% LIMO는 나머지 식이군들에 비해 유의한 감소가 관찰되었다. (P<0.05) 이는 인슐린 저항성으로부터 오는 단내성의 감소를 개선하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

이상, 본 발명을 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특성 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for alleviating diabetes comprising dextrin-derived highly polymerized isomaltooligosaccharide prepared by using a sugar transferase for preparing highly polymerized isomaltooligosaccharide <130> 2020P-11-057 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4680 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPCITase coding sequence <400> 1 atgttgtctc tttatagaag aaaactcttt ataacaattt taatagtaat tttcgtgttg 60 tctaactttt tcacattatt tacttatcct atctcaccag gagtttctgt tgcttatgcc 120 gcttcaacag gtaatttgat tcaacgggtt tatacagata aagctcgata taatccaggg 180 gatcttgtta ccattagtgc tgatttaatt aataaaactg gttcgacatg gtccggcact 240 ttaactcttc agattaataa actagaaagc caaatttaca ctgcaagtca gtcagttact 300 cttgccaatg gggattcaac tacaatcaca tttacatgga ctgctccacc taccgacttt 360 gttggttatt atgccggaat tgcggcagga agtacagatt tcaatggaac aggtatcgat 420 gtaagttcct ctccgcttcg gtttcctcgc 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Ala Ile Asn Leu Asp Asn Leu Ile Val Leu Gln Gln Thr Thr Pro 130 135 140 Thr Arg Thr Ser Ala Arg Ser Phe Trp Met Asn Asn Trp Ser Asn Leu 145 150 155 160 Ile Gly Ile His Met Ala Ser Lys Leu Ser Pro Thr Asp Asn Gly Asn 165 170 175 Tyr Gly Pro Arg Leu Ala Glu Leu His Phe Arg Gly Asp Trp Pro Thr 180 185 190 Asn Gln Ile Val Asp Ala Thr Ala Phe Phe Arg Asp Glu Thr Asp Leu 195 200 205 Thr Pro Ile Lys Tyr Thr Asn Ala His Ser Phe Asp Ser Glu Ala Trp 210 215 220 Phe Glu Asn Asp Gly Thr Leu Thr Val Arg Tyr Leu Thr Tyr Asn Gly 225 230 235 240 Ser Ala Leu Pro Val Gln Ile Thr Lys Gln Tyr Ala Met Val Pro Asn 245 250 255 Gln Asn Phe Leu Val Ile Lys Tyr Thr Phe Leu Asn Gln Thr Ser Ser 260 265 270 Ala Arg Thr Leu Asn Phe Leu Glu Gln Val His Leu Asn Asn Arg Thr 275 280 285 Ser Ser Asp Pro Asn Pro Gly Trp Gln His Gly Trp Trp Asp Val Ser 290 295 300 Arg Asn Ala Leu Gly Thr Asp Met Ser Gln Thr Gly Gln Phe Tyr Ile 305 310 315 320 Glu Leu Gly Ala Phe Gln Thr Met Asp Ser Tyr Gln Val Gly Asn Asp 325 330 335 Ala Asp Ser Asn Pro Asn Ser Gln Thr Ser Ser Pro Trp Tyr Gln Phe 340 345 350 Asp Ala Asn Gly Val Leu Asn Arg Cys Gly Asp Leu Trp Ser Gln Asn 355 360 365 Leu Ser Met Gly Phe Gln Lys Leu Ile Thr Val Pro Ala Gly Gly Ser 370 375 380 Val Thr Leu Ala Phe Tyr Tyr Ala Ile Gly Ser Thr Gln Glu Glu Ala 385 390 395 400 Glu Ala Ala Ala Asp Leu Ala Arg Ser Gln Thr Ala Asp Tyr Trp Phe 405 410 415 Thr Gln Thr Ala Ala Glu Tyr Asn Asn Trp Leu Asn Ser Gly Gln Arg 420 425 430 Val Asn Thr Ser Asp Ile Gly Ile Asn Thr Ala Phe Asp Arg Ser Leu 435 440 445 Ile Ile Asn Lys Gln Ala Gln His Pro Glu Phe Gly Ser Trp Pro Ala 450 455 460 Ala Thr Asn Pro Ser Tyr Gln Tyr Lys Val Trp Val Arg Asp Ser Ala 465 470 475 480 Val Thr Ala Met Gly Met Asp Ala Ala Asn His Leu Ser Glu Ala Glu 485 490 495 Lys Tyr Trp Asn Trp Met Ala Ser Val Gln Asn Thr Asp Gly Thr Trp 500 505 510 His Thr Asn Tyr Asn Val Trp Lys Ala Asn Glu Trp Ile Ser Phe Val 515 520 525 Glu Pro Glu His Asp Ala Ile Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gln 530 535 540 His Tyr Ser Leu Leu Lys Ser Arg Asp Ser Ser Ala Ala Thr Thr Phe 545 550 555 560 Leu Asn Asn Ile Trp Thr Gln Ile Thr Arg Ala Gly Asp Phe Ile Tyr 565 570 575 Lys Asn Ile Gly Ala Ser Gly Phe Gly Pro Ala Asp Ala Ser Ile Trp 580 585 590 Glu Glu Gln Val Glu Tyr Asn Ile Phe Thr Gln Val Thr Tyr Ala Ala 595 600 605 Gly Leu Asn Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Glu Lys Gly Asp Ile Thr 610 615 620 Arg Ser Asn Asn Tyr Leu Ser Gly Ala Gln Thr Ile Lys Asp Ala Ile 625 630 635 640 Leu Arg Ser Phe Leu Ser Ser Pro Arg Gly Leu Trp Asn Lys Ser Asn 645 650 655 Arg Tyr Phe Asn Arg Ala Ile Asn Thr Asp Gly Thr Ala Arg Thr Thr 660 665 670 Val Asp Ala Ser Ser Asp Leu Ile Trp Val Phe Gly Leu Leu Ser Pro 675 680 685 Thr Asp Thr Arg Ile Arg Asp His Arg Ile Lys Val Leu Ser Arg Leu 690 695 700 Thr His Asp Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Tyr Glu Asn Asp Glu Phe Tyr 705 710 715 720 Tyr Ser Ser Pro Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Tyr Glu Ala Gly Ala Ala 725 730 735 Glu Pro Val Trp Pro Gln Met Thr Met Tyr Ala Ser Met Ile Glu His 740 745 750 Trp Arg Gly Asp Asp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Leu Lys Trp Tyr Val 755 760 765 Ser Arg Thr Ala Arg Gly Tyr Val Thr Pro Gly Glu Ala Val Asp Trp 770 775 780 Thr Asn Gly Gln Pro Leu Ile Ser Thr Ala Val Glu Pro Val Thr Gly 785 790 795 800 Ser Trp Phe Gln Met Ala Val Leu Thr Tyr Leu Asn Arg Phe Asp Leu 805 810 815 Arg Leu Pro Asp Phe 820

Claims

1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 당전이효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계;
2) 상기 배양물로부터 당전이효소를 수득하는 단계; 및
3) 상기 당전이효소를 덱스트린(Dextrin)에 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 덱스트린 유래 중합도 7 내지 13인 고중합 이소말토올리고당의 제조 방법으로 제조되고,
상기 덱스트린은 3 내지 25인 중합도(degree of polymerization, DP)를 가지는 포도당이 α-1,4 형태로 결합된 단일물질 또는 혼합물이고,
상기 고중합 이소말토올리고당(LIMO)은 전체 중량의 33 내지 46 중량 %이고,
지소화성이 있는 덱스트린 유래 중합도 7 내지 13인 고중합 이소말토올리고당(LIMO)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 당전이효소는 써모안아에로박터 써모코프리애 (Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주 유래인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 당전이효소는 고리형 이소말토올리고당 당전이효소(Cycloisomaltooligosacharride glucanotransferase, TPCITase)의 아미노산 서열을 암호화하는 전체 염기서열 서열번호 1에서 아미노산 C- 말단 서열을 암호화하는 서열번호 2를 포함하며, 덱스트린을 기질로하여 당전이 생성물을 제조하는 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

삭제

제1항에 있어서,
단계 1)의 재조합 벡터는 pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 벡터인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
단계 1)의 형질전환체는 BL21(DE3), Rosetta(DE3), Rosetta2(DE3), ArcticExpress(DE3), STAR(DE3), C41(DE3) 및 C43(DE3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 대장균에 형질전환된 것인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 덱스트린은 말토덱스트린(maltodextrin)인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

삭제

제1항에 있어서,
상기 덱스트린의 농도는 0.5 내지 60 %(w/v)인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 반응 시간은 0.2 내지 80시간인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 고중합 이소말토올리고당은 구성당 성분 중 α-1,6 결합 만으로 이루어진 성분을 포함하고, 중합도(degree of polymerization, DP)가 7 내지 13인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 고중합 이소말토올리고당의 α-1,6 결합과 α-1,4 결합의 비가 2:1 내지 5:1인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 고중합 이소말토올리고당은 포도당 함량이 20 내지 25%인 것을 특징으로 하는, 당뇨 개선용 조성물.

당전이효소를 덱스트린(Dextrin)에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 제조 방법으로 제조된, 지소화성이 있는 덱스트린 유래 중합도 7 내지 13인 고중합 이소말토올리고당(LIMO)을 유효성분으로 포함하는, 환자 식이 조성물.

당전이효소를 덱스트린(Dextrin)에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 덱스트린 유래 고중합 이소말토올리고당의 제조 방법으로 제조된, 지소화성이 있는 덱스트린 유래 중합도 7 내지 13인 고중합 이소말토올리고당(LIMO)을 유효성분으로 포함하는, 지소화성 지속형 에너지 보급제.