KR102534472B1 - 케모카인 리셉터와 세포 접착 분자를 발현하는 cd3 음성 세포의 집단, 및 그 이용 그리고 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 세포 상해 활성이 보다 높은 면역 세포, 및 높은 효과를 기대할 수 있는 NK 세포 요법을 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는, 세포 집단을 제공한다. 본 발명은, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포가, 추가로 CD11c 고발현성인, 세포 집단을 제공한다. 본 발명은, 고형 종양에 침윤하고 있는, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 이와 같은 세포 집단 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물을 제공한다. 그리고, 본 발명은, 상기 세포 집단의 제조 방법을 제공한다.

Description

케모카인 리셉터와 세포 접착 분자를 발현하는 CD3 음성 세포의 집단, 및 그 이용 그리고 그 제조 방법

본 발명은, 케모카인 리셉터와 세포 접착 분자를 발현하는 CD3 음성 세포의 집단과 그 이용에 관한 것이다.

관련 출원의 상호 참조

본 출원은, 2018년 3월 27일 출원된 일본 특허출원 2018-59624호의 우선권을 주장하고, 그 전체 기재는, 여기에 특별히 개시로서 원용된다.

내추럴킬러 세포 (NK 세포) 는, 자연 면역의 주요 인자로서 작용하는 세포 상해성의 임파구이며, 종양 세포나 바이러스 감염에 대한 초기 방어 기구를 담당하고 있다.

환자 자신으로부터 채취한 NK 세포를, 밖에서의 배양에 의해 수백 배 ∼ 수천 배로 증식·활성화시켜, 환자에게 되돌리는 NK 세포 요법이, 부작용이 비교적 적은 치료 방법으로서 주목받고 있다. 통상적으로, 정상적인 성인의 말초혈의 1 회의 아페레시스에서는 약 1 × 10¹⁰ 개의 단핵구를 회수할 수 있고, 말초혈 단핵구 중의 NK 세포의 구성 비율을 약 7 ％ 로 하면, 7 × 10⁸ 개의 NK 세포가 얻어진다. 한편, 환자의 체중을 60 ㎏ 으로 하면, 6 × 10⁶ 개 ∼ 4.8 × 10⁹ 개의 NK 세포가 필요하다고 한다. 그래서, 도너로부터 얻은 NK 세포를 배양 증폭하여, 표적 세포를 사멸시키는 데에 충분한 NK 세포를 얻는 기술의 개발이 진행되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1 은, NK 세포를 함유하는 세포 집단을 조제하는 공정과, NK 세포를 함유하는 세포 집단으로부터 T 세포를 제거하는 공정과, 제거된 나머지 세포를, 2500 IU/㎖ 내지 2813 IU/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, NK 세포의 증폭 방법을 제안한다.

또, ex vivo 배양된 NK 세포는, in vitro 에서는 종양 세포주에 대해 세포 상해성을 나타내지만, 임상에서의 치료 효과가 충분하지 않은 경우가 있다. 그 때문에, NK 세포의 활성을 높이는 배양 기술이 제안되어 있다. 예를 들어, 특허문헌 2 는, NK 세포를 함유하는 세포의 집단을, 적어도 1 개의 증식 인자, 그리고, 효과적인 농도, 효과적인 노출 시기 및 효과적인 노출 계속 기간의 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 성분과 함께 배양하고, CD62L 의 상승된 발현, 상승된 유주 (遊走) 응답, 상승된 호밍 및 in vivo 유지, 보다 큰 증식, 증대한 세포 상해 활성 중의 적어도 1 개가 초래되는, NK 세포의 ex vivo 배양 방법을 제안한다.

면역 세포 요법용의 면역 세포로서, NK 세포 외에, 키메라 항원 수용체 발현하도록 유전적으로 개변된 T 세포 (CAR-T) 가 연구되고 있다. 이 기술에서는, 타깃이 되는 종양이 갖는 항원에 특이성을 갖지 않는 T 세포를 유전적으로 개변함으로써, 타깃이 되는 종양이 갖는 항원에 특이성을 획득한 이펙터 T 세포를 말초혈로부터 대량으로 제조할 수 있다. 그러나, CAR-T 세포 요법은 고형 종양에는 그다지 치료 효과가 없는 경우가 있고, 이 원인의 하나로서, CAR-T 세포가 고형 종양에 도달하지 않는 것을 들 수 있다 (비특허문헌 1). CAR-T 세포의 종양에 대한 호밍에 관해서는, 유전자 개변 동안에, 케모카인 리셉터가 결여되어, 종양 세포에 대한 주화성이 저하될 가능성이 있다고 보고되어 있다 (비특허문헌 2). 한편, CCR2b 를 형질 도입하여 기능적 케모카인 리셉터를 발현시킨 CAR-T 세포에서는, 종양에 대한 이행이 증가하고, 항종양 활성이 상승된 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 3).

비특허문헌 4 는, 가장 잘 알려져 있는 인간 말초혈 유래 CD56 양성의 NK 세포에 있어서의 케모카인 리셉터 발현을 조사하고 있다. 이 연구에서는, CD56^lowNK 세포는, 주로 CXCR1/CXCR2^＋ 및 CXCR3/CCR5^―/＋ 이고, 대부분의 CD56^highNK 세포가 CXCR1/CXCR2^― 및 CXCR3/CCR5^＋ 라고 보고되어 있다. 또, CD56^low 및 CD56^highNK 세포의 양방에서, CCR4^― 및 CCR6^― 였던 것도 보고되어 있다 (비특허문헌 4).

일본 공개특허공보 2013-27385호 (일본 특허 제5572863호) 일본 공표특허공보 2013-515497호

Melero I. et al., Cancer Discovery 2014 ; 4 : 522-526. Jena B. et al., Blood, 2018 ; 116 : 1035-1044. Moon E. et al., Clin Cancer Res, 2011 ; 17(14) : 4719-4730. Lima M. et al., Journal of Immunology Research, Volume 2015, Article ID 839684, 18 pages 특허문헌 1 ∼ 2 및 비특허문헌 1 ∼ 4 의 전체 기재는, 여기에 특별히 개시로서 원용된다.

CAR-T 세포는, 유전자 조작에 의해, 항원 특이성 외에, 주화성 등 원하는 기능을 획득할 가능성이 있지만, 유전자 치료용 제품으로서 다루어지고, 품질 및 안전성의 확보에 엄격한 지침이 정해져 있어, 개발에 비용과 시간이 든다는 문제가 있다.

또, NK 세포는 in vitro 에서 종양 세포주에 대해 세포 상해 활성을 나타내는 것이 확인되어도, in vivo 에서의 항종양 활성이 충분하지 않다는 문제가 있다. 이것은, NK 세포가, 종양에 대한 주화성이 약하고, 또한 고형 종양에 침윤하지 않는 것이 원인인 것으로 생각된다.

지금까지, NK 세포의 배양 효율을 높이는 기술이나, NK 세포의 활성을 높이는 배양 기술이 제안되어 있지만, 이들 기술에 의해 제조된 NK 세포는, 여전히 임상에서의 사용에 충분한 것은 아니다. 배양 기술을 사용하여, 보다 높은 항종양 활성을 갖는 면역 세포를 제공하는 것이 과제로 되어 있다.

본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.

[1] CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는, 세포 집단.

[2] 상기 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포가, 추가로 CD11a 고발현성 및 CD11c 고발현성이며, 고발현성은, 말초혈로부터 얻은, 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단에 있어서의 발현과의 비교에 의해 판단되는, [1] 에 기재된 세포 집단.

[3] 상기 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포가, 추가로 Integrin α1 양성, Integrin α3 양성 및 Integrin β3 음성인, [1] 또는 [2] 에 기재된 세포 집단.

[4] 상기 세포 집단 중, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율은 30 ％ 이상인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 세포 집단.

[5] CD3 및 CD19 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 5 ％ 미만인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 세포 집단.

[6] 상기 세포 집단에 있어서, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD36 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포가 제거된, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 세포 집단.

[7] 고형 종양에 대한 침윤에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 세포 집단.

[8] 고형 종양에 침윤하고 있는, CCR5 양성, CCR6 양성, CXCR3 양성, Integrin α1 양성, Integrin α3 양성 및 Integrin β3 음성이고 또한 CD3 음성인 세포.

[9] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물.

[10] 초대 단핵구 세포 집단을 조제하는 공정과,

초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과,

초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정과,

CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을, IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는,

[1] 내지 [7] 에 정의된 세포 집단의 제조 방법.

도 1a 는, 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 있어서의, 케모카인 리셉터의 발현. 대조는, 배양하고 있지 않은 primary NK 세포이다.
도 1b 는, 아이소타입·컨트롤 (Isotype control) 항체를 사용한 네거티브·컨트롤.
도 1c 는, 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 있어서의, 세포 접착 분자의 발현. 대조는, 배양하고 있지 않은 primary NK 세포이다.
도 1d 는, 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 있어서의, 세포 접착 분자의 발현. 대조는, 배양하고 있지 않은 primary NK 세포이다.
도 2 는, 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 있어서의 CD3 양성 세포 및 CD19 양성 세포의 함유율. 대조는, PBMC 이다.
도 3 은, 항 GD2 항체, primary NK 세포 및 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 의한, 고형 종양괴 (IMR32 spheroid) 의 세포 상해 어세이에 있어서, 1, 6, 12, 18, 21 시간의 타임 포인트로 촬영한, 고형 종양괴 (IMR32 spheroid) 의 사진.
도 4a 는, primary NK 세포 및 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 의한, 고형 종양괴 (IMR32 spheroid) 의 세포 상해 어세이에 있어서, 21 시간의 타임 포인트로 촬영한, 고형 종양괴 (IMR32 spheroid) 의 사진. 이펙터 세포가 없는 계에 있어서의 고형 종양괴 (IMR32 spheroid) 의 사진을 대조로서 나타낸다.
도 4b 는, 7AAD 염색에 의한 사세포의 플로사이토메트리 해석.
도 4c 는, primary NK 및 본 발명의 14 일간 배양 세포 (postcultured) 에 의한 세포 상해 활성.
도 5 는, in vivo 고형 종양 모델의 치료 스케줄.
도 6 은, in vivo 고형 종양 모델에 있어서의 치료 효과. 도 6(A) 는, 장간막의 전체 이미지. 장이 환상 (環狀) 으로 비쳐 있고, 그 내측에 장간막이 존재한다. 도 6(B) 는, 장간막의 GFP 양성 영역의 전체 화소의 총밀도.
도 7 은, 개량 제조 방법으로의 배양 개시 후 10 일째의 세포.
도 8(a) 는, NK 유사＋Mono, 농축 NK 유사, 및 농축 Mono 의 세포 상해 활성. 도 8(B) 는, CD107a 양성률.
도 9 는, 농축 NK 유사 세포 집단, 및 NK 유사＋mono 세포 집단을 재료로 하는 제조 방법으로 제조한 NK 유사 세포에 있어서의 케모카인 리셉터 발현 확인. CCR5, CCR6 및 CXCR3 에 대해, 농축 NK 유사 세포의 차트를 화살표로 나타낸다.

이하에 기재하는 본 발명의 설명은, 대표적인 실시형태나 구체예에 기초하여이루어지는 경우가 있지만, 본 발명은 그러한 실시형태에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 있어서 「∼」를 사용하여 나타내는 수치 범위는 「∼」의 전후에 기재되는 수치를 하한치 및 상한치로서 포함하는 범위를 의미한다.

[CCR5 양성, CCR6 양성, CXCR3 양성 및 CD3 음성인 세포의 집단]

본 발명은, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는, 세포 집단을 제공한다. CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를, 「CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포」, 또는 간단히 「CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―」로 나타내는 경우가 있다. 표면 항원 마커의 기재에 대해 사용하는 「/」는 「및, 또한」을 의미하고, 예를 들어 「CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―」는 「CCR5^＋ 이고, CCR6^＋ 이고, CXCR3^＋ 이고, 또한 CD3^― 이다」의 의미이다.

(케모카인 리셉터)

CCR5, CCR6 및 CXCR3 은, 케모카인 리셉터이다. 케모카인 및 케모카인 리셉터는, 염증이나 면역 응답에서의 세포 유주, 조혈 줄기 세포의 골수에 대한 호밍 등에 관계가 있다. 케모카인은, 백혈구, 임파구, NK 세포, T 세포 등을, 조직에 유주시키기 위해서 필요한 물질이며, 케모카인 리셉터는, 세포의 표면에서 케모카인을 받아들여 세포 내에 각종 시그널을 전달한다.

CCR5 및 CCR6 은, 단구, 매크로파지 및 수상 (樹狀) 세포 등이 갖는 것, 그리고 CXCR3 은 T 세포 및 NK 세포 등이 갖는 것이, 보고되어 있다 (Nagarsheth N, et al. Nat Rev Immunol. 2017). CCR5 에 관해서는, 상해성 T 세포의 고형 종양에 대한 호밍에 중요한 것이 보고되어 있다 (Gonzaelez-Martin A, et al. Oncoimmunology. 2012). CCR6 에 관해서는, CD103 과 함께 CCR6 의 종양 내 유도가, 종양 부위에 있어서의 T 세포의 유지에 역할을 하는 것이 보고되어 있다 (Franciszkiewicz K, et al. Cancer Res. 2012).

CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단은, 후술하는 바와 같이, 종양 세포주에 대한 상해 활성이 높다는 특징이 있다. 이것은, 이미 알려진 NK 세포에서도 관찰되는 특징이다. 그러나, 지금까지 CCR6 양성의 NK 세포는 보고되어 있지 않다. 예를 들어, 비특허문헌 4 는, CD56 양성 NK 세포가 CCR6 음성인 것을 보고하고 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단은, 이미 알려진 NK 세포의 집단과는, 적어도 CCR6 양성인 점에서 구별할 수 있다. 본 발명의 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단을, 특별히 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―NK 유사 세포의 집단, 또는 간단히 NK 유사 세포의 집단이라고 부르는 경우가 있다. 여기서, 이미 알려진 NK 세포는, T 세포 수용체 (TCR), T 세포 보편적 마커인 CD3 을 발현하고 있지 않고, 또한 막 면역 글로블린인 B 세포 수용체를 발현하고 있지 않은 대형의 과립성 임파구이며, 일부에는 CD16 음성 집단이 존재하지만 통상적인 인간에게서는 CD16 양성이며, 또한 CD56 양성이다. NK 세포인지의 여부는, 당업자라면, 세포 표면 마커의 발현 패턴 등에 기초하여 용이하게 판단할 수 있다.

표면 마커에 관해, 양성인 것은 ＋ 로 나타내고, 음성인 것은 ― 로 나타내는 경우가 있다. 예를 들어, CCR5 양성은, CCR5^＋ 로 나타내고, CCR5 음성은, CCR5^― 로 나타내는 경우가 있다. 양성은, 고발현성 (^high) 인 경우와 저발현성 (^low) 인 경우를 포함한다. 양성, 음성, 고발현성, 저발현성은, 플로사이토메트리법에 의해 얻어지는 차트에 기초하여 판단할 수 있다. 차트에 나타나는 위치는, 기기의 전압 설정, 감도 설정, 사용 항체 클론, 염색 조건, 사용 색소 등에 의해 변동되는 경우가 있지만, 당업자라면, 얻어진 차트에 있어서 1 군으로 확인되는 세포 집단을 분리하지 않도록 적절히 구분할 수 있다.

목적으로 하는 마커의 발현이, 양성인지 음성인지의 판단에는, 아이소타입·컨트롤 (Isotype control) 항체를 사용한 경우를 네거티브·컨트롤로서 사용하여 판단할 수 있다. Isotype control 항체는 특정한 항원과는 반응하지 않는 항체이다. 일반적으로, 항체를 사용한 실험에 있어서는, 타깃 이외의 단백질과의 비특이적 결합이나, 세포 표면 상의 Fc 리셉터와의 결합에 의해, 백그라운드가 발생할 가능성이 있다. 네거티브·컨트롤이 되는 항체를 사용한 계와 비교함으로써, 목적으로 하는 항원에 대한 일차 항체의 반응이 특이적인 것이 명확해진다. 또 백그라운드의 영향이 배제되어, 시그널의 강도를 정확하게 해석할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「세포 집단」이란, 복수 개의 세포, 예를 들어 1 × 10⁵ 세포 이상의 세포로 구성되는 1 군을 말한다. 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단은, 여러 가지 세포 밀도로 조제할 수 있다. 예를 들어, 1 × 10⁵ 세포/㎖ 이상으로 조제할 수 있다.

CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 세포의 수는, 바람직하게는 1 × 10⁶ 세포 이상이고, 보다 바람직하게는 5 × 10⁶ 세포 이상이며, 더욱 바람직하게는 1 × 10⁷ 세포 이상이다. CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 세포의 수는 또한, 인간에 대한 투여에 적합한 1 × 10⁶ 세포 ∼ 1 × 10¹⁰ 세포 로 할 수 있다. 또, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 있어서의 세포 밀도는, 1 × 10⁵ 세포/㎖ 이상이고, 바람직하게는 2 × 10⁵ 세포/㎖ 이상이며, 보다 바람직하게는 5 × 10⁵ 세포/㎖ 이상이다. 인간에 대한 점적 (点滴) 을 위해서는, 5 × 10⁵ 세포/㎖ 정도로 할 수 있다. 세포 밀도의 상한치는, 예를 들어 1 × 10¹⁰ 세포/㎖ 이하로 할 수 있다. CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 있어서의 세포 밀도의 범위는, 특별히 한정되지 않지만, 1 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 2 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 3 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 4 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 5 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 6 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 7 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 8 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 9 × 10⁵ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 1 × 10⁶ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 1 × 10⁷ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 1 × 10⁸ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포/㎖, 1 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 2 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 3 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 4 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 5 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 6 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 7 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 8 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 9 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 1 × 10⁶ ∼ 1 × 10⁸ 세포/㎖, 1 × 10⁶ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖, 또는 1 × 10⁷ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖ 로 할 수 있다. CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 있어서의 세포 밀도는 또한, 배양이나 동결 보존에 적합한 1 × 10⁶ ∼ 1 × 10⁸ 세포/㎖ 로 할 수 있고, 또 인간에 대한 투여에 적합한 1 × 10⁵ ∼ 1 × 10⁹ 세포/㎖ 로 할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 상기 세포 집단 중, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율은 (비율 (％) = CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 개수/전체 세포의 개수 × 100) 30 ％ 이상이어도 된다. 상기 세포 집단 중, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율이, 높을수록 치료 효과가 높은 것으로 생각되기 때문에, 비율은, 30 ％ 이상, 35 ％ 이상, 40 ％ 이상, 45 ％ 이상, 또는 50 ％ 이상인 것이 바람직하다. 또, 상기 세포 집단 중, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율은, 더욱 높아도 되고, 55 ％ 이상, 60 ％ 이상, 65 ％ 이상, 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 또는 95 ％ 이상이어도 된다.

목적으로 하는 마커의 발현의 정도 (저발현성인지, 고발현성인지) 는, 동일 조건에서 측정한 대조 세포의 집단의 결과와의 비교에 의해, 판단할 수 있다. 대조 세포의 집단의 예는, 본 명세서의 실시예에 기재한 primary NK 와 같은, 말초혈로부터 얻은, 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단이다.

일정 기간 배양된 세포의 집단에 있어서의 CCR6 의 발현의 정도는, 플로사이토메트리를 사용하고, 그 세포 집단에 있어서의 CCR6 발현량을, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단 (대조. CCR6 음성인 것이 알려져 있다.) 에 있어서의 CCR6 발현량과 비교하여 판단할 수 있다. 일정 기간 배양된 세포의 집단에 있어서의 CCR6 의 발현이 이봉성 (二峰性) 이 되어 있고, 이봉 모두 대조보다 발현량이 많은 경우, 저발현성과 고발현성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에서 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 세포는, CCR6 고발현성이거나, CCR6 저발현성일 수 있다. 또, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단은, CCR6 고발현성인 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단, 및 CCR6 저발현성인 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단의 쌍방을 함유하고 있어도 된다. 쌍방을 함유하는 세포 집단은, 플로사이토메트리법으로 CCR6 에 관해서 해석하면, 이봉성이 된다.

또, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 세포는, CCR5 양성 및 CXCR3 양성일 수 있다. 추가로, CCR5 고발현성 및 CXCR3 고발현성인 경우가 있어도 된다. 고발현성인 것은, 매크로파지나 MDSC 등의 골수구계 세포에 있어서의 CCR5 및 CXCR3 의 발현과의 비교에 의해 판단할 수 있다.

본 발명에서 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 세포는, CXCR1 및 CXCR2 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 음성일 수 있다. 본 발명에서 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 세포는, CCR2, CCR4 및 CXCR4 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 음성이거나, 혹은 매우 저발현성일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 후술하는 NK 유사 세포의 집단의 제조 방법에 의해 얻을 수 있다. 후술하는 NK 유사 세포의 집단의 제조 방법은, 초대 단핵구 세포의 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정을 포함하지만, 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 제거는 필요하지 않은 경우가 있다.

본 발명에서 제공되는 세포 집단에 함유되는 세포는, 천연 유래일 수 있다. 본 발명에 있어서, 천연 유래인 세포란, 비유전자 조작 세포이거나, 외래 유전자 도입 동물 혹은 형질 전환 세포에서 유래하지 않는 세포이거나, 또는 세포 융합 기술에 의해 제조되어 있지 않은 세포인 것을 나타내지만, 천연에 존재하는 세포 그 자체라는 의미가 아니고, 배양 기술에 의해 제조된 세포인 것을 의미한다. 비유전자 재조합 세포란, 본 발명에 있어서, 유전자 개변 기술을 사용하여 인위적으로 개체의 유전 정보를 변화시킨 동물의 혈액으로부터 분리한 단핵구를 사용하여 제조된 세포는 아닌 것을 의미한다. 또, 혈액으로부터 분리한 단핵구나 조혈 줄기 세포에 대해, 유전자 개변 기술을 사용하여 인위적으로 유전 정보를 개변하여 제조된 세포의 집단도 아니다. 외래 유전자 도입 동물 또는 형질 전환 세포에서 유래하지 않는 세포란, 본 발명에 있어서, 외래 유전자를 생물 또는 세포에 도입하는 공정을 거치지 않고 제조된 세포인 것을 의미한다. 세포 융합 기술에 의해 제조되어 있지 않은 세포란, 세포 융합에 의해 발생한 세포도, 거기에서 유래하는 세포도 아닌 것을 의미하고, 예를 들어 세포 융합 등에 의한 세포 표면 항원의 발현 조절을 실시하지 않은 것을 의미한다.

(세포 접착 분자)

본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 CD11c 고발현성일 수 있다 (CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high). CD11c 는, integrin αX 로서도 알려져 있는 세포 접착 분자이다. CD11c 는, 단구, 매크로파지, 과립구, 미엘로이드계 수상 세포에 발현하는 것이 알려져 있다. CD11c 는, CD18 과 결합하여, 세포 접착 등에 관여하는 것이 알려져 있다.

일정 기간 배양된 세포의 집단에 있어서의 CD11c 의 발현의 정도는, 플로사이토메트리를 사용하고, 그 세포 집단에 있어서의 CD11c 발현량을, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단 (대조. CD11c 저발현성인 것이 알려져 있다.) 에 있어서의 CD11c 발현량과 비교하여 판단할 수 있다. 일정 기간 배양된 세포의 집단에 있어서의 CD11c 의 발현이 대조보다 발현량이 많은 경우, 고발현성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 CD11a/CD18 고발현성일 수 있다 (CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11a^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD18^high). CD11a/CD18 은 별명 LFA-1 로 불리고, T 임파구에 분포하여, ICAM-1 또는 ICAM-4 와 상호 작용하여, 백혈구의 접착이나 주화성에 관여하여, 면역 관용을 유도하는 것이 알려져 있다.

일정 기간 배양된 세포의 집단에 있어서의 CD11a/CD18 의 발현의 정도는, 플로사이토메트리를 사용하고, 그 세포 집단에 있어서의 CD11a/CD18 발현량을, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단 (대조. CD11a/CD18 저발현성인 것이 알려져 있다.) 에 있어서의 CD11a/CD18 발현량과 비교하여 판단할 수 있다. 일정 기간 배양된 세포의 집단에 있어서의 CD11a/CD18 의 발현이 대조보다 발현량이 많은 경우, 고발현성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 추가로 Integrin α1, Integrin α3, Integrin α4, Integrin α5, ICAM-1, 및 Integrin β1 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 고발현성일 수 있다. 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단 (대조. Integrin α1, Integrin α3, Integrin α4, Integrin α5, ICAM-1, Integrin β1 이 음성 또는 저발현성인 것이 알려져 있다.) 과의 비교에 의해, 고발현성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

Integrin α4/Integrin β1 은 별명 VLA-4 로 불리고, 피브로넥틴, VCAM-1 등과 상호 작용하여, 임파구, 단구, 호산구의 염증 부위에 대한 유주에 관여하는 것이 알려져 있다. Integrin α1/Integrin β1 은 별명 VLA-1 로 불리고, 광범위한 세포에 분포되어, 콜라겐, 라미닌과 상호 작용하여, 신경 돌기 신장이나 임파구 침윤에 관여하는 것이 알려져 있다. Integrin α3/Integrin β1 은 별명 VLA-3 으로 불리고, 광범위한 세포에 분포되어, 라미닌-5, TSP, uPAR 과 상호 작용하여, 신장이나 폐의 형태 형성, 암의 침윤이나 전이에 관여하는 것이 알려져 있다.

본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포가, 또한 Integrin α1 양성, Integrin α3 양성 및 Integrin β3 음성일 수 있다. 후술하는 실시예 1 의 도 1c 및 d 에 기재된 바와 같이, 배양 전의 NK 세포 (primary NK) 는 Integrin α1, -α3 및 -β3 모두 음성이다. 한편, 2 주간 배양 후의 NK 세포가 Integrin α1, -α3 및 -β3 모두 양성인 것이 알려져 있다 (Maenpaa et al., Int. J. Cancer : 53, 850-855, 1993, Tables II, III, Figure 2). 본 발명에 의해 제공되는 세포 집단 중의, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포는, 종래의 NK 세포의 배양물로부터, 적어도 Integrin α1 양성, Integrin α3 양성 및 Integrin β3 음성인 점에서 상이하다.

본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 Integrin α4/Integrin β1 고발현성일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 Integrin α1/Integrin β1 고발현성일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하는 세포 집단은, 그 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 Integrin α3/Integrin β1 고발현성일 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high/Integrin α1^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high/Integrin α1^high/Integrin α3^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high/ICAM-1^high, 혹은 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^high/CD11a^high/CD18^high/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high/ICAM-1^high/Integrin β1^high, 또는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high/ICAM-1^high, 혹은

CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high/ICAM-1^high/Integrin β1^high 세포의 집단일 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단에 함유되는 상기의 특정한 NK 유사 세포는, CD16 및 CD56 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 양방이 양성일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단에 함유되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포는, CD16 및 CD56 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 양방이 양성일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단에 함유되는 상기의 특정한 NK 유사 세포는, CXCR1 및 CXCR4 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 양방이 음성일 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, CD3 및 CD19 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 10 ％ 미만일 수 있다. 세포 집단 중, 이들 세포의 비율은, 플로사이토메트리법에 의해 분석할 수 있다. 세포 집단 중의 CD3 및 CD19 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 5 ％ 미만인 것이 바람직하고, 2 ％ 미만인 것이 보다 바람직하다. 세포 집단 중의 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율이 보다 높은 편이, 종양 세포 상해 활성이 높은 것으로 생각되기 때문이다.

(주화성 및 침윤)

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, 종양 부위에 대한 상승된 주화성을 가질 수 있다. 또, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, 종양괴에 침윤할 수 있다. 종양괴에 대한 침윤이란, 종양괴의 내부에 세포 (예를 들어, 면역 세포) 가 침입하고 있는 상태를 의미한다.

종양 부위에 대한 주화성은, 세포 유주 어세이에 의해 평가할 수 있다. 세포 유주 어세이는, 종양 세포의 존재 하에서, 트랜스웰법 등에 의해 실시할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단과 비교하여, 종양 부위에 대한 상승된 주화성을 가질 수 있다. 본 발명자들의 검토에 의하면, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단과 비교하여, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단에 있어서, 케모카인 리셉터 CCR5, CXCR3 및 CCR6 의 발현이 높은 것이, 종양 부위에 대한 상승된 주화성과 관계하고 있는 것으로 생각된다.

종양괴에 대한 침윤은, 종양 세포주로부터 제조한 스페로이드에 대한 세포 상해 어세이에 의해 평가할 수 있다. 스페로이드는, 삼차원 세포 배양된 세포 응집 덩어리이며, 세포간의 상호 작용과, 세포 외 매트릭스가 발달되어 있다. 또, 외연부에는 타이트 정션이 존재하는 경우가 있고, 내부는 저산소 상태 또한 저 pH 가 됨으로써, 대사나 기능 활성이, 보다 생체 내의 조직에 가까운 것으로 생각된다. 종양 스페로이드는, 약물 개발을 위한 차세대의 in vitro 실험 모델로서 기대되고 있다 (Hirschhaeuser F. et al., J Biotechnol. 2010 Jul 1 ; 148(1) : 3-15 ; Xiang X. et al., 2011 PLoS ONE 6(1) : e14640.doi : 10.1371/journal.pone.0014640 ; Milotti E, Chignola R., 2010 PLoS ONE 5(11) : e13942.doi : 10.1371/journal.pone.0013942). 예를 들어, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포를 형광 표지하여, 스페로이드 내부로의 이행을 관찰할 수 있다. 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포는 스페로이드에 침윤하지 않지만, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포는 스페로이드에 침윤할 수 있다. 고형 종양에 대한 침윤에는 세포 접착 분자 LFA-1/VLA-4 가 중요하다고 생각되고 있다 (Sackstein R, et al. Lab Invest. 2017). 본 발명자들의 검토에 의하면, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단과 비교하여, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단에 있어서, 세포 접착 분자의 발현이 높은 것이, 스페로이드에 대한 침윤과 관계하고 있는 것으로 생각된다.

고형 종양괴로서, IMR32 세포주 (인간 MYCN 증폭 신경아종 세포주) 로 형성한 스페로이드를 사용한 세포 상해 어세이에 있어서, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포는, 스페로이드의 주변에 존재했지만, 침윤하지 않았다. 또, 항 GD2 항체 (Unituxin (등록 상표)) 는, 단독으로 IMR32 세포주를 상해 가능하다고 되어 있지만 (Doronin et al., BMC Cancer 2014, 14 : 295), 스페로이드를 형성한 IMR32 에 대해서는, 현미경 하에서는 세포가 상해된 것과 같은 형태 변화는 관찰되지 않았다. 한편 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단은, 스페로이드에 침윤하고 있고, 어세이 개시의 12 시간 이후에서 스페로이드가 붕괴되기 시작하였다.

추가로, 스페로이드에 대한 세포 상해 활성은, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포와 비교하여, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단에서는, 매우 높았다. 또, 스페로이드에 대한 세포 상해 활성은, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단과 항체를 병용한 계와 항체를 병용하지 않은 계의 양 계에 있어서, 유의차는 없었다.

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, 상기와 같이, 높은 세포 상해 활성을 발휘할 수 있다. 세포 상해 활성이란, 특별히 기재한 경우를 제외하고, 대상 세포 (이펙터 세포, E) 의 표적 세포 (T) 에 대한 용해능을 가리킨다. 세포 상해 활성은, 이펙터 세포에 의해 죽음에 이른 표적 세포의 백분율 (％) 로 나타낼 수 있고, 다음 식에 의해 구해진다.

(이펙터 세포와 공배양한 경우의 세포사 ― 자연 세포사 (음성 컨트롤))/(최대 세포사 (양성 컨트롤) ― 자연 세포사 (음성 컨트롤)) × 100

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포를 이펙터 세포로 하여, 고형 종양괴에 대한 세포 상해 활성을 측정하는 경우에는, 표적 세포는, IMR32 세포주의 스페로이드 외에, 글리오마, 유방암, 대장암, 난소암, 전립선암 등의 종양 세포주로부터 제조한 스페로이드 등을 사용할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 사용할 수 있는 스페로이드의 크기는, 직경 150 ∼ 500 ㎛ 정도일 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 이펙터 세포와 표적 세포, 생세포와 사세포는, 방사성 물질, 형광 색소 등으로 표지한 항체 등의 시약에 의해, 구별하고, 또 정량할 수 있다. NK 유사 세포를 이펙터 세포로 할 때의 세포 상해 활성은, 예를 들어 IMR32 세포주의 스페로이드를 표적으로 하고, 인큐베이트 시간은, 8 내지 48 시간, 바람직하게는 12 ∼ 24 시간의 조건에서 측정할 수 있다.

본 발명은, 고형 종양에 침윤하고 있는, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 제공한다. 종래의 NK 세포는 고형 종양에 대해 주공 (奏功) 하지 않는 것으로 생각되고 있지만, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단은, 고형 종양에 침윤하여, 종양 세포를 상해할 수 있다. 고형 종양에 대한 침윤은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포가 종양괴 (스페로이드) 의 내부로 이행하는 것이 관찰되고, 나아가 종양괴의 형상이 시간 경과적으로 변화되어, 종양괴가 붕괴되는 것에 의해 판단할 수 있다. 종양 세포가 상해된 것은, 플로사이토메트리에 의한 사세포의 수의 증가에 의해 확인할 수 있다.

(in vivo 에서의 고형 종양에 대한 치료 효과)

본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^{―NK 유사} 세포의 집단은, in vivo 에서의 고형 종양에 대한 치료 효과를 가질 수 있다.

in vivo 에서의 고형 종양에 대한 치료 효과는, 면역 부전 마우스 등의 동물에게 인간 종양 세포를 이식하여, 경과를 관찰함으로써 평가할 수 있다. 예방 효과에 대해서는, 이식과 동시에 NK 유사 세포의 집단의 투여를 실시하여 평가해도 된다. 또는, 치료 효과에 대해서는, 5 일 정도 종양의 성장을 확인하고 나서 NK 유사 세포의 집단 투여를 실시하여 평가해도 된다. 평가는, 안락사시킨 마우스를 해부하여, 형광 표지된 종양 세포를 관찰함으로써 실시할 수 있다.

in vivo 에서의 치료 계획은, 동물에 대해, 단회 또는 복수 회, 투여하는 경우가 있다. 독립적인 단회 투여에 의한 것인지, 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, NK 유사 세포의 집단은, 1 ㎏ 당 1 × 10⁵ 세포 ∼ 1 × 10⁸ 세포 가 초기 후보 용량이 된다. NK 유사 세포의 집단과 함께, IL-2 를 투여할 수 있다. IL-2 는, 투여된 NK 유사 세포의 활성을 동물 내에서 유지하기 위해서 투여될 수 있다. IL-2 는, 1 마리당 1,000 ∼ 10,000 IU 가 초기 후보 용량이 된다. In vivo 에서의 치료 계획에서는, 임의의 적절한 수단에 의해, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 또는 피하 투여를 채용할 수 있다. 치료 효과의 평가는, 형광 표지된 종양 세포를 관찰하는 것, 및/또는 형광 양성 영역의 화소수를 산출함으로써 실시할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단과 비교하여, 면역 부전 마우스에게 이식된 SKOV3 세포 (인간 난소암 세포주) 의 수를 감소시킬 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단은, 면역 부전 마우스에게 이식된 SKOV3 세포 (인간 난소암 세포주) 를 거의 소멸시킬 수 있다. 면역 부전 마우스에게 이식된 SKOV3 세포는, 무치료의 경우에는, 종양 결절을 형성하고 있는 것이 확인되어 있지만, 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포의 집단에서 치료된 마우스에서는, SKOV3 세포는 거의 소멸되어 있고, 종양 결절은 관찰되지 않았다. in vitro 에서 나타난 종양괴에 대한 침윤능과, in vivo 에서의 치료 효과의 결과로부터, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^{―NK 유사} 세포의 집단은, 고형 종양에 침윤하여 종양 세포를 상해할 수 있다고 할 수 있다.

[NK 유사 세포의 집단의 제조 방법]

본 발명은, 초대 단핵구 세포 집단을 조제하는 공정과, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정과, 당해 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을, IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 집단의 제조 방법을 제공한다.

(초대 단핵구 세포 집단)

본 발명의 제조 방법에 있어서, 초대 단핵구 세포 집단은, 피험자로부터 채취된 혈구 세포로부터 단핵구를 분리하는 공정에 의해 얻을 수 있다. 혈구 세포는, 말초혈, 제대혈, 골수 및 림프절로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것으로부터 채취되는 경우가 있다. 혈구 세포는 말초혈로부터 아페레시스법에 의해 채취되는 경우가 있다. 배양 전의 초대 단핵구 세포 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포를 함유하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 초대 단핵구 세포 집단은, 배성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 인공 다능성 줄기 (iPS) 세포로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 줄기 세포 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 말초혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 골수혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 단핵구와, 말초혈 단핵구로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류의 세포로 조제되는 경우가 있다. 초대 단핵구 세포 집단의 도너인 피험자는, 레시피언트인 환자 자신에게서, 그 환자의 근친자에게서, 환자와는 혈연 관계가 없는 사람에게서 유래하는 경우가 있다. 피험자는, 정상인과, 질환에 이환된 환자인 경우가 있다. 본 발명에 의해 제공되는 NK 유사 세포는, 레시피언트의 주요 조직 적합성 항원 (MHC) 과, 킬러 면역 글로블린형 수용체 (Killer Immunoglobulin-like Receptor : KIR) 가 불일치하는 도너에게서 유래하는 경우가 있다.

(CD3 양성의 제거, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 제거)

본 발명의 제조 방법에 있어서, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정에 의해, T 세포 및/또는 NKT 세포를 제거할 수 있는 경우가 있다. T 세포의 제거는, CD3 양성 세포 외, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포에서 선택되는 1 종, 또는 2 종을 제거하는 공정에 의해 달성되는 경우가 있다. 또, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정에 대해, 단구의 제거는, CD14 양성 세포, CD36 양성 세포, 및 HLA-DR 양성 세포에서 선택되는 1 종, 2 종, 또는 3 종의 세포를 제거하는 공정에 의해 달성되는 경우가 있다. B 세포의 제거는, CD19 양성 세포 및 CD20 양성 세포에서 선택되는 1 종 또는 2 종의 세포를 제거하는 공정에 의해 달성되는 경우가 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, CD3 양성 세포의 제거와, 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 제거는, 동시에 실시해도 되고, 다른 공정으로 실시해도 된다. 단구의 제거와 B 세포의 제거는, 동시에 실시해도 되고, 다른 공정으로 실시해도 된다.

본 발명의 NK 유사 세포의 제조 방법은, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 수상 세포, 과립구 및 매크로파지로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정을 포함하는 경우가 있다. 수상 세포, 과립구 및 매크로파지로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 제거는, CD66b 양성 세포, CD123 양성 세포, 및 HLA-DR 양성 세포에서 선택되는 1 종, 2 종 또는 3 종의 세포를 제거하는 공정에 의해 실시되는 경우가 있다.

본 발명의 NK 유사 세포의 제조 방법은, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 제거하는 공정을 포함하는 경우가 있다. 조혈 전구 세포를 제거하는 공정은, CD34 양성 세포를 제거하는 공정에 의해 달성되는 경우가 있다.

본 발명의 NK 유사 세포의 제조 방법은, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 적혈구 및 적아구계 전구 세포를 제거하는 공정을 포함하는 경우가 있다. 적혈구 및 적아구계 전구 세포를 제거하는 공정은, glycophorin A 양성 세포를 제거하는 공정에 의해 달성되는 경우가 있다.

초대 단핵구 세포 집단은, 당업자에게 알려진 다양한 순서를 사용하여 조제할 수 있다. 예를 들어, 제대혈 및 말초혈과 같은 혈액으로부터 단핵구를 회수할 때에는, 비중 원심법을 이용할 수 있다. 추가로 초대 단핵구 세포 집단, 및 초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단은, 세포 표면 마커에 대한 특이적 항체로 면역 형광 염색을 실시하고, 셀 소터 또는 플로 사이토미터를 사용하여 단리·동정할 수 있다. 또, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단은, Invitrogen 사로부터 판매되는 Dynal 사 제조 Dynabeads (상표) 나, 밀테니 바이오텍사의 CliniMACS (상표) 를 포함하지만 이것들에 한정되지 않는 면역 자기 비드를 사용하여, 특정한 세포 표면 항원을 발현하는 세포를 분리 제거하여 조제되어도 상관없다.

또, T 세포, NKT 세포, 단구, B 세포, 수상 세포, 과립구, 매크로파지, 적혈구, 적아구계 전구 세포 또는 조혈 전구 세포에 대한 특이적 결합 파트너를 이용하여, T 세포, NKT 세포, 단구, B 세포, 수상 세포, 과립구, 매크로파지, 적혈구, 적아구계 전구 세포 또는 조혈 전구 세포를 선택적으로 상해 또는 사멸시키는 경우가 있다.

또한, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과, 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정은, CD3 양성 세포, 단구 및 B 세포를 함께 제거하는 공정이어도 상관없다. CD3 양성 세포, 단구 및 B 세포를 제거하는 공정은, 다른 세포 타입, 예를 들어, 적혈구, 적아구계 전구 세포, 조혈 전구 세포, 수상 세포, 과립구, 매크로파지 및 NKT 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 CD3 양성 세포, 단구 및 B 세포와 함께 제거하는 공정이어도 상관없다.

(배지)

초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을 배양하기 위해서 사용하는 세포 배양용 배지는, KBM501 배지 (코진바이오 주식회사. IL-2 를 1,750 JRU/㎖ 함유한다. 인간 NK 세포 Primary Culture 용), CellGro SCGM 배지 (세르제닉스, 이와이 화학 약품 주식회사), X-VIVO15 배지 (론더, 다카라 바이오 주식회사), 코스메디움 008 (코스모바이오. IL-2 를 1,750 JRU/㎖ 함유한다. 인간 NK 세포 Primary Culture 용), CTS AIM V Medium Gibco^TM CTS^TM AIM V^TM Medium (써모피셔 사이언티픽. T 세포 및 수상 세포를 증식·조작하기 위한 이미 알려진 조성의 무혈청 배지), CTS OpTmizer T Cell Expansion Basal Medium (써모피셔 사이언티픽. 인간 T 임파구의 성장 및 증식용), IMDM, MEM, DMEM, RPMI-1640 등을 함유하지만, 이것들에 한정되지 않는다.

배지에는, 인터류킨-2 (IL-2) 가, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 농도로 첨가되는 경우가 있다. IL-2 의 농도는, 100 IU/㎖ ∼ 5000 IU/㎖ 인 경우가 있다. IL-2 의 농도는, 2500 IU/㎖ ∼ 2813 IU/㎖ 인 경우가 있어도 된다. IL-2 는, 인간의 아미노산 배열을 갖는 것이 바람직하고, 안전상, 재조합 DNA 기술로 생산되는 것이 바람직하다. IL-2 의 농도는, 국내 표준 단위 (JRU) 및 국제 단위 (IU) 로 나타내는 경우가 있다. 1 IU 가 약 0.622 JRU 이다.

배지에는, 피험자의 자가 혈청, BioWhittaker 사와 그 외로부터 입수 가능한 인간 AB 형 혈청이나, 일본 적십자사로부터 입수 가능한 헌혈 인간 혈청 알부민이 첨가되는 경우가 있다. 자가 혈청 및 인간 AB 형 혈청은 1 ∼ 10 ％ 의 농도로 첨가되는 것이 바람직하고, 헌혈 인간 혈청 알부민은 1 ∼ 10 ％ 의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다. 배지에 함유되는 혈청은, 인간 혈청 또는 비인간 동물 혈청일 수 있지만, 인간 혈청 알부민인 것이 바람직하다. 혈청 대신, 코어 프론트사와 그 외로부터 입수 가능한 혈소판 추출물 (UltraGro^TM 등) 을 사용할 수 있다. 혈소판 추출물은 1 ∼ 10 ％ 의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다.

배지에는, NK 유사 세포의 집단의 증폭 효과를 저해하지 않는 것을 조건으로 하여, 적절한 단백질, 사이토카인, 항체, 화합물과 그 밖의 성분이 함유되는 경우가 있다. 사이토카인은, 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-21 (IL-21), 줄기 세포 인자 (SCF), 및 FMS 형 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt3L) 로 이루어지는 군에서 선택되는 경우가 있다. IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, SCF 및 Flt3L 은, 인간의 아미노산 배열을 갖는 것이 바람직하고, 안전상, 재조합 DNA 기술로 생산되는 것이 바람직하다.

배지는, 무혈청 배지인 것이 바람직하다. 무혈청 배지는, 혈청 알부민, 트랜스페린, 및 인슐린을 함유하고 있는 것이 바람직하다. 임파구를 배양하기 위한 무혈청 배지가 개발, 시판되고 있고, 본 발명에 있어서 그것들을 이용할 수 있다. 무혈청 배지의 바람직한 예 중 하나는, 기초 배지에, 인간 T 세포의 증식을 서포트하는 조성으로서 시판되고 있는 CTS Immune Cell SR (써모피셔 사이언티픽) 을 첨가한 것이다. 배지에 함유되는 혈청 알부민은, 인간 혈청 알부민 또는 비인간 동물 혈청 알부민일 수 있지만, 인간 혈청 알부민인 것이 바람직하다.

배양은, 피더리스 배양에 의해 실시할 수 있다. 배양에 피더 세포를 사용하면, 제조된 세포의 집단에 감염의 리스크가 발생하기 때문이다.

배지의 교환 또는 첨가 혹은 보충은, 원하는 세포수의 NK 유사 세포가 얻어지는 것을 조건으로 하여, 배양 개시 후 언제 실시되어도 상관없지만, 3 ∼ 5 일마다가 바람직하다.

배양시에 사용하는 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디시, 배양용 백, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트를 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 배양 조건은, NK 유사 세포의 증폭 효과를 저해하지 않는 것을 조건으로 하여 특별히 한정되지 않지만, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하의 배양 조건이 일반적이다. 배양 기간은, NK 유사 세포의 집단 중의 세포를 원하는 세포수까지 증폭하는 것을 조건으로 하여, 특별히 한정되지 않는다. 배양 기간은, 배양 조건에 따라 변화되어도 된다. 37 ℃, 5 ％ CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하의 배양 조건이면, 배양 기간은 4 ∼ 15 일간일 수 있다. 배양 기간의 상한은, 21 일 전후일 수 있다.

배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋/Integrin α1^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋/Integrin α1^＋/Integrin α3^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋/Integrin α1^＋/Integrin α3^＋/Integrin α4^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋/Integrin α1^＋/Integrin α3^＋/Integrin α4^＋/Integrin α5^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋/Integrin α1^＋/Integrin α3^＋/Integrin α4^＋/Integrin α5^＋/ICAM-1^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/CD11c^＋/CD11a^＋/CD18^＋/Integrin α1^＋/Integrin α3^＋/Integrin α4^＋/Integrin α5^＋/ICAM-1^＋/Integrin β1^＋ 세포의 집단일 수 있다. 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^highhigh/Integrin α4^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high, CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high/ICAM-1^high, 혹은 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^―/Integrin α1^high/Integrin α3^high/Integrin α4^high/Integrin α5^high/ICAM-1^high/Integrin β1^high 집단일 수 있다. 또, 이들 NK 유사 세포의 집단에 함유되는 상기의 특정한 NK 유사 세포는, CD16 및 CD56 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 양방이 양성일 수 있다. 예를 들어 이들 NK 유사 세포의 집단에 함유되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^― 세포는, CD16 및 CD56 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 양방이 양성일 수 있다. 이들 NK 유사 세포의 집단에 함유되는 상기의 특정한 NK 유사 세포는, CXCR1 및 CXCR4 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 양방이 음성일 수 있다.

플로사이토메트리법에 의한 세포 집단의 세포 표면 항원의 발현 해석에서는, 각 표면 항원을 발현하고 있는 세포의 수를 계측할 수 있기 때문에, 세포 집단 내에서의 각 표면 항원을 발현하고 있는 세포의 비율 (양성률) 을 알 수 있다. 예를 들어, 산수적인 해석에서는, 세포 집단 내에 표면 항원 A 를 발현하는 세포가 전체 세포 중 50 ％ 존재하고, 표면 항원 B 를 발현하는 세포가 전체 세포 중 50 ％ 이면, 표면 항원 A 및 B 를 발현하는 세포가 전체 세포 중 0 ％ 일 가능성이 있다. 그러나, 표면 항원 A 를 발현하는 세포가 전체 세포 중 90 ％ 이고, 표면 항원 B 를 발현하는 세포가 전체 세포 중 90 ％ 이면, 표면 항원 A 및 B 를 함께 발현하는 세포가 전체 세포 중 0 ％ 일 가능성은 없다.

후술하는 실시예 1 의 플로사이토메트리법에 의한 세포 집단의 세포 표면 항원의 발현 해석에서는, 배양에 의해 얻어진 세포 집단 중, CCR5 양성 세포가 92.7 ％ 존재하고, CCR6 양성 세포가 96.3 ％ 존재하고, 및 CXCR3 양성 세포가 51.4 ％ 존재하는 것이 분명해졌다. 이 결과로부터, 세포 집단 내에 CCR5 와 CCR6 과 CXCR3 이 모두 양성인 세포는 존재하는 것이 나타나 있다. CD11a 양성 (고발현성) 세포 및 CD11c 양성 (고발현성) 세포에 대해서도, 배양에 의해 얻어진 세포 집단 중, 각각 99.8 ％ 및 96.8 ％ 존재하는 것이 분명해졌다. 이 결과로부터, 세포 집단 내에 CCR5 와 CCR6 과 CXCR3 과 CD11a 와 CD11c 가 모두 양성인 세포는 존재하는 것이 나타나 있다. Integrin α1 양성 세포 및 Integrin α3 양성 세포에 대해서도, 배양에 의해 얻어진 세포 집단 중, 각각 91.0 ％ 및 75.3 ％ 존재하는 것이 분명해졌다. 이 결과로부터, 세포 집단 내에 CCR5 와 CCR6 과 CXCR3 과 Integrin α1 과 Integrin α3 이 모두 양성인 세포는 존재하는 것이 나타나 있다.

배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단 중에 있어서의 상기의 특정한 NK 유사 세포의 순도는 (순도 (％) = 상기의 NK 유사 세포의 개수/전체 세포의 개수 × 100) 30 ％ 이상이어도 된다. 특정한 NK 유사 세포의 집단의 순도가, 높을수록 치료 효과가 높은 것으로 생각되기 때문에, 순도는, 30 ％ 이상, 35 ％ 이상, 40 ％ 이상, 45 ％ 이상, 또는 50 ％ 이상인 것이 바람직하다. 또, 상기의 특정한 NK 유사 세포의 집단의 순도는, 더욱 높아도 되고, 55 ％ 이상, 60 ％ 이상, 65 ％ 이상, 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 또는 95 ％ 이상이어도 된다.

배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하고, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD36 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포가 제거된, 세포 집단일 수 있다. 또, 배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하고, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD36 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 10 ％ 미만일 수 있다. 이들 세포의 비율은, 플로사이토메트리법에 의해 분석할 수 있다. 세포 집단 중의 CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD36 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 5 ％ 미만인 것이 바람직하고, 2 ％ 미만인 것이 보다 바람직하다. 세포 집단 중의 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율이 보다 높은 편이, 종양 세포 상해 활성이 높은 것으로 생각되기 때문이다.

본 발명의 제조 방법으로 얻어진 NK 유사 세포의 집단은, 원하는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^{―NK 유사} 세포의 집단을, 우선적으로 배양하여 증폭시킨다는 의미에 있어서, 농축 NK 유사 세포의 집단이라고 할 수 있다.

배양에 의해 얻어진 소정의 NK 유사 세포의 집단은, 목적으로 하는 NK 유사 세포에 추가로, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, 조혈 전구 세포 등을 함유하는 경우가 있다. 배양 후, 목적으로 하는 NK 유사 세포, 또는 그 집단이, 예를 들어 비중 원심법, 면역 자기 비드, FACS, 플로사이토메트리 등을 사용하여 선택되는 경우가 있다. 예를 들어, 항 CD3 항체, 항 CD16 항체, 항 CD34 항체, 항 CD36 항체, 항 CD69 항체, 항 CD94 항체, 항 CD107a 항체, 항 KIR3DL1 항체, 항 KIR3DL2 항체, 항 KIR2DL3 항체, 항 KIR2DL1 항체, 항 KIR2DS1 항체, 항 KIR2DL5 항체, 항 NKp46 항체, 항 NKp30 항체, 항 NKG2D 항체 등을 사용하여, 목적으로 하는 NK 유사 세포의 집단이 선택적으로 분리되는 경우가 있다. 항체는, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 등인 경우가 있다. 목적으로 하는 NK 유사 세포의 집단의 선택은, T 세포, NKT 세포, 조혈 전구 세포와 그 밖의 세포를 선택적으로 제거하여 실시되는 경우가 있다.

[NK 유사 세포의 집단의 이용]

본 발명은, NK 유사 세포의 집단, 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물을 제공한다. 의약으로서 허용되는 첨가물로는, 예를 들어 등장화제, pH 조정제, 완충제, 안정화제, 동결 보호제, 항생 물질 등을 예시할 수 있다. 구체적으로는, 물, 에탄올, 염화나트륨, 포도당, 알부민 등을 들 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 NK 유사 세포의 집단은, 상기의, 본 발명에 의해 제공되는 CCR5^＋/CCR6^＋/CXCR3^＋/CD3^{―NK 유사} 세포의 집단인 것이 바람직하다. 또 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 세포 집단은, 종양 세포 상해 활성이 높은 NK 유사 세포의 집단인 것이 바람직하고, 고형 종양에 침윤하는 NK 유사 세포의 집단인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 NK 유사 세포와 상이한 HLA 유전자형을 갖는, 환자에게 투여되는 경우가 있다.

의약 조성물은, 전형적으로는, NK 유사 세포를 용액에 현탁한 형태이다. NK 유사 세포를 현탁하기 위한 용액은, 예를 들어, DMSO 를 함유하는 동결용 보호액, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 배지, 혈청 등이 일반적이다. 용액은, 의약품 및 의약 부외품으로서 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 경우가 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 감염증, 또는 암을 치료하기 위해서 사용되는 경우가 있다. 본 발명의 의약 조성물은 또한, NK 유사 세포에 감수성을 갖는 다양한 질환의 치료에 적용할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 또한, NK 유사 세포에 감수성을 갖는 다양한 질환의 예방에 적용할 수 있다. 질환은, 예를 들어, 구강암, 담낭암, 담관암, 폐암, 간암, 대장암, 신장암, 방광암, 백혈병이나, 바이러스, 세균 등에 의한 감염증을 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 본 발명의 세포 요법은, 단독이거나, 혹은 외과 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 항체 의약품 등과 조합하여 실시되는 경우가 있다. 본 발명의 의약 조성물을 사용한 세포 요법에 있어서, NK 유사 세포는, 예를 들어, 정맥, 동맥, 피하, 복강 내 등에 투여되는 경우가 있다.

본 발명의 의약 조성물은, IL-2 제제와 함께 투여할 수 있다. IL-2 제제는, 유전자 재조합형이어도 되고, 테세루킨 (유전자 재조합) 일 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 반드시 항체 의약품과 병용하지 않아도, 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 이미 알려진 NK 세포에 의한 세포 상해의 기구의 하나로서, 항체 의존성 세포 상해 (Antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 가 알려져 있다. NK 세포는 그 세포 표면 상에 Fc 수용체 (CD16) 를 갖는데, ADCC 는, NK 세포가 Fc 수용체를 개재하여 표적 세포에 결합한 항체에 결합하여, 표적 세포의 상해를 실시하는 기구이다. ADCC 활성을 기대하여, 이미 알려진 NK 세포와 CD16 에 친화성이 높은 항체를 병용하는 경우가 있다. 그러나, 본 발명의 NK 유사 세포의 집단은, 항체를 병용하지 않아도 높은 세포 상해 활성을 갖는다. 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 NK 유사 세포의 집단은, 말초혈로부터 얻은 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단과 비교하여 종양 부위에 대한 상승된 주화성을 갖고, 나아가서는 종양괴에 침윤하는 것을 알 수 있다. 세포 상해 어세이에서는, NK 유사 세포의 집단과 항체를 병용한 계와 NK 유사 세포의 집단을 단독으로 사용한 계에 있어서, 양 계에서 높은 세포 상해 활성이 나타났지만, 유의차는 없었다. 이것은, ADCC 활성을 유발하지 않아도, NK 유사 세포가 종양 세포에 대해 높은 세포 상해 활성을 갖는 것을 나타내고 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 항체 의약품과 병용할 수 있는 경우가 있다. 본 발명의 의약 조성물과 병용할 수 있는 항체의 구체예로는, 이브리투모맙튜세탄 (ibritumomabtiuxetan), 아이오딘131 (iodine131), 카투막소맙 (catumaxomab), 블리나투모맙 (blinatumomab), 무로모납-CD3 (muromonab-CD3), 엡시시마브 (abciximab), 리툭시맙 (rituximab), 바실리시맙 (basiliximab), 인플릭시맵 (infliximab), 세툭시맙 (cetuximab), 브렌툭시맙 (brentuximab), 실툭시맙 (siltuximab), 디누툭시맙 (dinutuximab), 오빌톡삭시맙 (obiltoxaximab), 다크리주맙 (daclizumab), 팔리비주맙 (palivizumab), 트라스투주맙 (trastuzumab), 젬투주맙 (gemtuzumab), 알렘투주맙 (alemtuzumab), 오말리주맵 (omalizumab), 에팔리주맙 (efalizumab), 베바씨주맙 (bevacizumab), 나탈리주맙 (natalizumab), 토실리주맙 (tocilizumab), 라니비주맙 (ranibizumab), 에쿨리주맙 (eculizumab), 세톨리주맙페골 (certolizumabpegol), 모가물리주맙 (mogamulizumab), 퍼투주맙 (pertuzumab), 트라스투주맙 (trastuzumab), 오비누투주맙 (obinutuzumab), 베돌리주맙 (vedolizumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 이다루시주맙 (idarucizumab), 메폴리주맙 (mepolizumab), 엘로투주맙 (elotuzumab), 다라투무맙 (daratumumab), 익세키주맙 (ixekizumab), 레슬리주맙 (reslizumab), 아달리무맙 (adalimumab), 파니투무맙 (panitumumab), 골리무맵 (golimumab), 우스테키누맙 (ustekinumab), 카나키누맙 (canakinumab), 오파투무맙 (ofatumumab), 데노수맙 (denosumab), 이필리무맙 (ipilimumab), 벨리무맙 (belimumab), 락시바쿠맵 (raxibacumab), 라무시루맙 (ramucirumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세쿠키누맙 (secukinumab), 에볼로쿠맙 (evolocumab), 알리로쿠맙 (alirocumab), 및 네시투무맙 (necitumumab) 을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물과 병용할 수 있는 항체는, CD16 에 친화성이 높은 것인 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 의약 조성물에 있어서, 항체 중 적어도 일부는, NK 유사 세포에 결합하고 있어도 되는 경우가 있다.

본 발명의 의약 조성물의 제조는, 의약품 및 의약 부외품의 제조 관리 및 품질 관리 규칙에 적합한 조건 (good manufacturing practice, GMP) 및 재생 의료 등 제품의 제조 관리 및 품질 관리의 기준 (Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice, GCTP) 으로 실시되는 것이 바람직하다.

본 발명은, 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의, NK 유사 세포의 집단의 사용을 제공한다. 본 발명은, 고형 종양의 침윤에 사용하기 위한, NK 유사 세포의 집단을 제공한다.

본 발명은, 환자에게 치료적 유효량의 NK 유사 세포의 집단을 투여하는 공정을 포함하는, 환자의 고형 종양의 치료 및 예방을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 NK 유사 세포의 집단은, 고형 종양의 종양 세포를 상해할 수 있기 때문에, 환자의 고형 종양의 치료 및 예방에 유용하다.

본 발명은, 상기 치료 용도 또는 연구 용도에 있어서의 사용을 위한 키트를 제공한다. 키트는, 백, 바이알 및 튜브 등 1 개 또는 복수의 용기를 포함할 수 있다. 용기는, 본 발명에 의해 제공되는 세포 집단을, 임의 선택에 의해 의약으로서 허용되는 첨가물과 함께 함유하는 의약 조성물로서 포함할 수 있다. 키트는, 본 발명에 의해 제공되는 세포의 집단을 포함하는 용기를, 다른 약제 또는 항체 의약품과의 조합으로 포함할 수 있다. 키트는, 임의 선택에 의해, 본 명세서에 기재하는 치료 용도 또는 연구 용도에 관한 라벨 또는 설명서와 함께 세포 집단을 포함한다.

본 발명에 있어서, 제대혈 및 말초혈의 전혈의 채취와, 자가 혈청의 조제와, 전혈로부터의 단핵구의 조제와, 그 단핵구의 배양 전후의 세포수의 측정과, 배양 전후의 단핵구 중의 NK 세포, T 세포, 조혈 전구 세포와 그 밖의 세포 타입의 구성 비율의 측정과, NK 유사 세포의 증폭 배율의 산출과, 측정 오차나 유의성에 대한 통계 해석은, 당업자에게 주지된 어떠한 방법을 사용하여 실시되어도 상관없다.

이하에 설명하는 본 발명의 실시예는 예시만을 목적으로 하고, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 범위는 특허 청구의 범위의 기재에 의해서만 한정된다. 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 것을 조건으로 하여, 본 발명의 변경, 예를 들어, 본 발명의 구성 요건의 추가, 삭제 및 치환을 실시할 수 있다.

실시예

[실시예 1]

<<케모카인 리셉터의 발현 확인>>

정상인 볼런티어의 말초혈을 비중 원심에 의해 분리하고, 말초혈 단핵구 (이하, PBMC) 를 얻었다. PBMC 로부터, CliniMACS CD3 (밀테니 바이오텍사, 카탈로그 번호 130-017-601) 을 1 × 10⁷ 세포당 5 ㎕ 사용하여 CD3 양성 세포를 제거하고 (여기서 회수한 세포를 「Primary NK」로 나타낸다), 나머지 세포를 배양하였다. 배양은, 세포를 5 × 10⁵ 세포/㎖ 의 밀도로 KBM-501 (코진바이오, 5 ％ AB Serum 첨가) 에 현탁하고, 6 웰 플레이트 (써모피셔 사이언티픽, 140675) 또는, T-75 플라스크 (써모피셔 사이언티픽, 156499) 를 사용하여 14 일간 배양 (9 일째에 배지 첨가) 하였다. 이 세포 집단의 세포를, 「14 일간 배양 세포」및 「본 발명의 세포」로 나타낸다.

케모카인 리셉터의 해석은, 14 일간 배양 종료 후의 본 발명의 세포, 및 컨트롤로서 배양 전에 회수한 세포인 「Primary NK」를 사용하였다. 해석은, 플로사이토메트리법으로 실시하고, BD LSRFortessa^TM 셀 애널라이저 (BD 바이오사이언스사) 를 사용하였다. 14 일간 배양 세포 및 Primary NK 의 형광 표지는, 각 세포를, 표 1 에 나타내는 각 항체를 PBS (와코 순약 공업) 에 종 (終) 농도 1 ㎍/㎖ 으로 현탁한 항체 용액 중에서, 2 ∼ 8 ℃ 에서 30 분간, 암소 (暗所) 에서 인큐베이션함으로써 실시하였다.

결과를 도 1a 에 나타냈다. 14 일간 배양한 본 발명의 세포는, 케모카인 리셉터 CCR5, CCR6, 및 CXCR3 을 강발현하고, CCR2 를 약발현하였다. CXCR1 및 CXCR2 는 발현하지 않았다.

일반적으로 CCR5, CCR6, CXCR3 은 MDSC (Myeloid-derived suppressor cells) 나 Treg 와 같은 면역 억제성의 세포 집단이 갖고, 이들 세포는 생체 내에서는 Cold tumor 로 불리는 상태의 종양 조직에 많이 존재하는 것이 알려진다. 본 발명의 세포는 이것들과 동일한 주화성을 갖는 것이 생각되는 점에서, 면역 치료가 매우 주공하기 어렵다고 여겨지는 Cold tumor 에도 효율적으로 침윤하여, 상해가 가능한 것이 상정된다.

14 일간 배양 세포 집단 (postcultured) 중의 CCR5 양성 세포, CXCR3 양성 세포, CCR6 양성 세포의 비율은, 각각 92.7 ％, 96.3 ％, 51.4 ％ 였다 (도 1a). 따라서, 92.7 ％ × 96.3 ％ × 51.4 ％ = 45.88 ％ 이므로, 14 일간 배양 세포 집단 중의 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성의 세포는, 확률적으로 45.9 ％ 로 계산된다.

<<세포 접착 분자군의 발현 확인>>

세포 접착 분자군의 해석에는, 실시예 1 과 동일하게 14 일간 배양한 본 발명의 세포, 및 컨트롤로서 Primary NK 를 사용하였다. 플로사이토메트리법에 의해 해석을 실시하였다. 형광 표지에 사용한 항체를 표 2 에 기재한다. 형광 표지는, 상기와 동일한 순서로 실시하였다.

결과를 도 1c 및 d 에 나타냈다. 14 일간 배양한 본 발명의 세포는, 세포 접착 분자 ICAM1, Integrin α1, LFA-1α, Integrin β2, Integrin α3, Integrin αX, Integrin β2, PECAM-1, Integrin α5, Integrin α4 및 Integrin β1 을 강발현하였다.

종양 조직에 대한 침윤에는, 혈관 밖으로의 누출에 이어 간질 (間質) 의 통과, 종양 세포 덩어리에 대한 접착 그리고 침입과 같은 복수의 요소에서의 세포끼리의 접착 혹은 세포 외 매트릭스와의 접착이 필요해지고, 본 발명에서 얻어진 세포는 그 어느 것도 가능하게 하는 접착 분자 발현 패턴을 갖는 것으로 생각된다.

[실시예 2]

<<CD3 양성 세포 및 CD19 양성 세포의 함유율>>

CD3 양성 세포 및 CD19 양성 세포의 함유율을 해석하기 위해, 실시예 1 과 동일하게 14 일간 배양한 본 발명의 세포를 사용하고, 컨트롤로는 PBMC 를 사용하였다. 형광 표지에 사용한 항체는, PE 표지 항인간 CD3 항체 (Biolegend, 300408) 및 PerCP-Cy5.5 표지 항인간 CD19 항체 (Biolegend, 302230) 이다. 형광 표지는, 실시예 1 과 동일한 순서로 실시하였다.

결과를 도 2 에 나타낸다. 14 일간 배양한 본 발명의 세포에 함유되는 CD3 양성 세포는 0.025 ％ 이고, CD19 양성 세포는 0.28 ％ 였다. 한편, 배양을 하고 있지 않는 PBMC 에 함유되는 CD3 양성 세포는 64.7 ％ 이고, CD19 양성 세포는 8.57 ％ 였다.

[실시예 3]

<<고형 종양괴에 대한 침윤 확인>>

IMR32 spheroid 를 표적으로 하여, 본 발명의 세포의 침윤을 관찰하였다.

IMR32 세포 (인간 MYCN 증폭 신경 아종 세포주) 를 트립신 EDTA 에 의해 박리하고, RPMI (10 ％ FBS) 에서 100 ㎕ 중 3 × 10³ 세포가 되도록 조제하고, EZ-Bind Shut II (등록 상표) 마이크로 플레이트 (IWAKI, Cat. 4870-800LP) 에 파종하고, 37 ℃ 에서 48 ∼ 72 시간 배양하여 IMR32 spheroid 를 형성시켰다. IMR32 spheroid 는, 384 웰 마이크로 플레이트 (필름 보텀, 하이콘텐트 이미징용) (CORNING, Cat. 4518) 에 200 ㎕ 칩을 사용하여 1 웰당 1 개를 이식하고, 37 ℃ 에서 1 ∼ 2 시간 정도 인큐베이션하여 바닥면에 접착시켰다.

표적 세포의 세포 상해 어세이에 사용한 본 발명의 세포는, 실시예 1 에 기재된 방법으로 유도하였다. 컨트롤로서 사용한 NK 세포의 집단 (primary NK 로 나타낸다) 은 정상인 볼런티어의 말초혈로부터 비중 원심에 의해 분리한 PBMC 를 EasySep^TM Human NK Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies, Cat. 19055) 로 처리하여, 단리하였다. 본 발명의 세포와 primary NK 는, PKH26 Red 형광 세포 링커 키트 (일반 세포막용) (SIGMA-ALDOLICH, Cat. PKH26GL, 이하 PKH26) 로 염색하였다.

IMR32 spheroid 를 부착시킨 384 웰 마이크로 플레이트의 1 웰에 대해, 본 발명의 세포 또는 primary NK 를 각각 1 × 10⁴ 세포/20 ㎕ (KBM-501, 5 ％ AB Serum) 주입하고, 37 ℃ 에서 21 시간 인큐베이션함으로써, IMR32 spheroid 의 세포 상해 어세이를 실시하였다. 화상의 기록은 BZ-9000 (KEYENCE) 에서 IMR32 spheroid 에 본 발명의 세포, primary NK, 항 GD2 항체를 각각 어플라이 후, 1, 6, 12, 18, 21 시간의 타임 포인트로 촬영하여, 기록하였다. 항 GD2 항체는, dinutuximab (Unituxin^TM, UnitedTherapeutics 사) 를 사용하고, 종농도 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다.

결과를, 도 3 에 나타냈다. PKH26 염색한 본 발명의 세포가, IMR32 spheroid 내부에 침입하고 있는 것을 알 수 있다. 또, 어세이 개시의 12 시간 이후에 종양괴가 중심부를 포함하여 붕괴되기 시작하고 있다. PKH26 염색한 primary NK 는, IMR32 spheroid 표면에 모여 있지만, 내부에는 침입하고 있지 않다. 항 GD2 항체 (Unituxin (등록 상표)) 는, Spheroid 를 형성한 IMR32 에 대해서는, 현미경 하에서는 상해 활성은 관찰되지 않았다.

[실시예 4]

<<고형 종양괴에 대한 상해 활성 확인>>

표적인 IMR32 spheroid 는, 실시예 3 에 기재된 바와 같이 조제하고, 384 웰 마이크로 플레이트에 부착시켰다. 본 발명의 세포 및 primary NK 는, 실시예 3에 기재된 바와 같이 조제하고, PHK26 염색하였다. IMR32 spheroid 의 세포 상해 어세이는, 본 발명의 세포 또는 primary NK 만 첨가, 본 발명의 세포 또는 primary NK 와 항 GD2 항체를 첨가, 항 GD2 항체만 첨가의 5 군으로 실시하고, 이펙터 세포도 항 GD2 항체도 첨가하지 않은 것을 대조 (컨트롤) 로서 준비하였다. 본 발명의 세포 또는 primary NK 는, IMR32 spheroid 를 부착시킨 384 웰 마이크로 플레이트의 1 웰에 대해, 1 × 10⁴ 세포/20 ㎕ (KBM-501, 5 ％ AB Serum) 를 첨가하였다. 항 GD2 항체는, dinutuximab (Unituxin^TM, UnitedTherapeutics 사) 를 사용하고, 종농도 10 ㎍/㎖ 가 되도록 MR32 spheroid 를 부착시킨 384 웰 마이크로 플레이트에 첨가하였다. 세포 상해 어세이는 37 ℃ 에서 21 시간 인큐베이션함으로써 실시하였다.

세포 상해 어세이 후, 원심 분리 (500 g, 5 분간, 4 ℃) 하고, 상청을 제거 후, PBS 로 희석한 7-AAD 용액 (Beckman Coulter, A07704) 을 첨가, 현탁하고, 실온에서 10 분간 인큐베이트하였다. 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa, BD 바이오사이언스사) 를 사용하여 측정을 실시하고, FlowJo 소프트웨어로 해석하였다.

세포 상해 활성은, 다음 식으로 계산하였다. 또한, 이하의 실시예에서도 동일하게 계산하였다.

(이펙터 세포와 인큐베이트한 경우의 표적 세포의 세포사 ― 자연 세포사 (음성 컨트롤))/(최대 세포사 (양성 컨트롤) ― 자연 세포사 (음성 컨트롤)) × 100

결과를 도 4a ∼ c 에 나타낸다. 본 발명의 세포가, 항 GD2 항체의 유무에 상관없이, IMR32 spheroid 내부에 침입하고, 중심부를 포함하여 붕괴되기 시작하고 있다 (도 4a 하단). primary NK 는, 항 GD2 항체의 유무에 상관없이, IMR32 spheroid 표면에 모여 있기는 하지만 내부에는 침입하고 있지 않지만, 항 GD2 항체의 존재 하에서는 비존재 하와 비교하여 보다 IMR32 spheroid 의 주변에 집적하고 있는 것이 관찰되었다 (도 4a 중단).

본 발명의 세포는, 항 GD2 항체의 유무에 상관없이, primary NK 와 비교하여, 높은 세포 상해 활성을 나타냈다 (도 4c).

[실시예 5]

<<in vivo 고형 종양 모델에 의한 치료 효과 확인>>

GFP 도입된 인간 난소암 세포주인 SKOV3 세포를, RPMI1640 에서 배양하였다. 6 ∼ 7 주령의 NOG 마우스의 복강 내에, SKOV3 세포 (GFP 표지된 인간 난소 암세포주, RPMI1640 에서 배양) 를 1 × 10⁵ 세포/200 ㎕ (PBS 로 조제) 로 이식하였다. 이식한 날을 day 0 으로 한다. 그 후, day 5 (5 일 후) 에 본 발명의 세포 또는 Primary NK 를 2.5 × 10⁶ 세포/200 ㎕ (PBS 로 조제) 로, 복강 내 (i.p.) 투여하였다. 또, day 5, 6, 7 에는 hIL-2 (이무네스, 시오노기 제약 주식회사) 를 1 마리당 5,000 IU 투여하였다. 컨트롤군에는 day 0 이후, 세포 및 hIL-2 의 투여를 실시하지 않았다. 치료 스케줄을 도 5 에 나타낸다.

Day 21 에 마우스를 안락사시켜, 해부하고, 장간막을 BZ-9000 (키엔스) 에 의해 촬영하고, GFP 양성 영역을 ImageJ 로 정량하였다. 촬영시에는 10 ㎝ dish 상에 장간막을 펼쳐, 2 배의 대물 렌즈를 사용하여, 모든 촬영/해석을 일정 조건 (촬영 기재, 촬영 면적, 여기 파장, 노광 시간, 해석시의 필터링 그리고 Threshold) 하에서 실시하였다. 정량화된 데이터에 대해 JMP 소프트를 사용하여 통계 해석을 실시하였다. One-way ANOVA (분산 분석) 후, Tukey-Kramer 법 (다중 비교 검정) 을 이용하였다.

결과를 도 6A 및 B 에 나타낸다. 무치료 및 Primary NK 를 투여한 마우스의 장간막에는, 종양 결절이 관찰되지만, 본 발명의 세포를 투여한 마우스의 장간막에서는, 종양 결절이 관찰되지 않았다. 장간막의 GFP 양성 영역의 전체 화소의 총밀도는, 무치료의 마우스가 가장 높고, 이어서 Primary NK 가 투여된 마우스가 높고, 본 발명의 세포가 투여된 마우스에서는 낮다. 무치료의 마우스와 Primary NK 가 투여된 마우스 사이에 유의차가 없었지만, 무치료의 마우스 및 Primary NK 가 투여된 마우스와, 본 발명의 세포가 투여된 마우스 사이에는, 유의차가 있었다 (p < 0.01). 이들 결과는, 본 발명의 세포 투여에 의해, 면역 부전 마우스에게 이식된 SKOV3 세포가 소멸된 것을 나타내고 있다. in vivo 고형 종양 모델에 있어서의, 본 발명의 세포의 치료 효과가 확인되었다.

[실시예 6]

<<세포 집단의 개량 제조 방법>>

이하와 같이, 세포를 조제하고, 3 타입의 세포 집단을 제작하였다.

1) 이하에 나타내는 2) 및 3) 의 방법으로 얻어지는 세포를 1 : 1 로 혼합한 것 (이하, 「NK 유사 +mono」로 나타낸다).

2) PBMC 로부터 EasySep^TM Human Monocyte Enrichment Kit WITHOUT CD16 DEPLETION (STEMCELL, Cat. 19058) 을 사용하여 CD2, CD3, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin A 양성 세포를 제거 후, 5 × 10⁵ 세포/㎖ 의 밀도로 KBM-501 (5 ％ AB Serum) 에 현탁하고, Nunc Easy Flask 75 FILIT NUNCLON DSI (Thermo Fisher Scientific, Cat. 156944) 혹은 Nunc MULTIDISH 6 NUNCLON DELTA SI (Thermo Fisher Scientific, Cat. 140675) 에서 14 일간 배양한 것 (이하, 「농축 mono」로 나타낸다).

3) PBMC 로부터 EasySep^TM Human NK Cell Enrichment Kit (STEMCELL, Cat. 19055) 를 사용하여 CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD66b, CD123, HLA-DR, glycophorin A 양성 세포를 제거 후, 5 × 10⁵ 세포/㎖ 의 밀도로 KBM-501 (5 ％ AB Serum) 에 현탁하고, Nunc Easy Flask 75 FILIT NUNCLON DSI (Thermo Fisher Scientific, Cat. 156944) 혹은 Nunc MULTIDISH 6 NUNCLON DELTA SI (Thermo Fisher Scientific, Cat. 140675) 에서 14 일간 배양한 것 (이하, 「농축 NK 유사」으로 나타낸다).

배양 개시 후 10 일째의 세포의 사진을 도 7 에 나타낸다. 농축 Mono 군 이외의 2 군에서는 전형적인 활성화 임파구형의 형태를 한 세포가 다수 확인된다. 농축 Mono 군에 대해서는 대형이고 접착이 강한 골수구계의 세포가 다수 확인되지만, 부유한 비교적 소형의 세포도 확인할 수 있다. 모두 배양 컨디션은 양호하고, KBM-501 중에서의 증식이 적절히 실시되어 있어, 눈에 띈 아포토시스는 보이지 않는다.

<<상해 활성 측정, CD107a 양성률 측정>>

K562 세포 (인간 만성 골수성 백혈병 세포주) 를 10 ％ FBS (니치레이 바이오사이언스, 171012-500ML) 및 100 유닛의 페니실린, 100 ㎍/㎖ 의 스트렙토마이신 (나카라이테스크, 26253-84) 을 함유하는 RPMI1640 배지 (와코 순약 공업, 189-02025) (이하, 10 ％ FBS/RPMI1640 로 한다) 에서 1 × 10⁶ 세포/㎖ 의 농도로 조제하였다. 조제한 K562 세포에, PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma) 를 사용하여 염색하고, 2 × 10⁶ 세포/㎖ 가 되도록 조제하였다.

상기의 3 타입의 세포 집단 (NK 유사+mono, 농축 NK 유사, 농축 mono) 중 어느 1 타입과 K562 세포의 군, 상기의 3 타입의 세포 집단 (NK 유사+mono, 농축 NK 유사, 농축 mono) 중 어느 1 타입만의 군, 음성 컨트롤로서 K562 세포만의 군, 양성 컨트롤로서 K562 세포를 10 ％ 포르말린으로 고정시킨 군을 준비하였다.

상기의 3 타입의 세포 집단 (NK 유사+mono, 농축 NK 유사, 농축 mono) 중 어느 1 타입과 K562 세포는 세포수비로 1 : 1 이 되도록 96 웰 플레이트에 첨가 후, 혼합하고, 37 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 순서로는, 먼저 K562 세포를 플레이트에 첨가하고, 다음으로 200 ㎍/㎖ 의 APC 표지 항인간 CD107a 항체 ※ (Biolegend, 328620) 를 종농도 1 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 마지막으로 상기의 3 종류의 세포 집단 (NK 유사+mono, 농축 NK 유사, 농축 mono) 을 첨가하였다. 배양 후, 원심 분리 (500 g, 5 분간, 4 ℃) 하고, 상청을 제거 후, PBS 로 희석한 7-AAD 용액 (Beckman Coulter, A07704) 을 첨가, 현탁하고, 실온에서 10 분간 인큐베이트한 후에 세정하였다. 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa, BD 바이오사이언스사) 를 사용하여 측정을 실시하고, FlowJo 소프트웨어로 해석하였다.

결과를, 도 8A 및 B 에 나타낸다. NK 유사+mono 세포 집단 및 농축 NK 유사 세포 집단이, 높은 세포 상해 활성을 나타냈다.

※ : CD107a 는 NK 세포 내 과립에 존재하고, 탈과립 (퍼포린, 그란자임 방출) 시에 세포막 표면 상으로 이행하므로, CD107a 가 양성이라는 것은, 대상을 NK 가 공격한 것을 간접적으로 나타낸다.

<<케모카인 리셉터의 발현 확인>>

본 실시예의 개량 제조 방법 (농축 NK 유사 세포 집단, 및 NK 유사+mono 세포 집단을 재료로 하는 제조 방법) 으로 제조한 NK 유사 세포에 있어서의, 케모카인 리셉터 CCR4, CCR5, CCR6, CXCR3 및 CXCR4 의 발현에 대해, 실시예 1 에 기재된 순서로 실험을 실시하였다.

결과를 도 9 에 나타낸다. 본 실시예의 개량 제조 방법에 의해, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성의 세포를 함유하는 세포 집단을 얻을 수 있었다. 또, 도너에 의해, CCR6 의 발현성이 상이한 경우가 있는 것을 알 수 있었다.

Claims (56)

1. CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포를 함유하고,
   상기 CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포가,
   (i) CD11a 고발현성 및 CD11c 고발현성이며, 고발현성은, 말초혈로부터 얻은, 실질적인 배양을 실시하고 있지 않은 NK 세포의 집단에 있어서의 발현과의 비교에 의해 판단되고,
   (ii) Integrin α1 양성, Integrin α3 양성 및 Integrin β3 음성인, 세포 집단.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포 집단 중, CCR5 양성, CCR6 양성 및 CXCR3 양성이고 또한 CD3 음성인 세포의 비율은 30 ％ 이상인, 세포 집단.
3. 제 1 항에 있어서,
   CD3 및 CD19 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 5 ％ 미만인, 세포 집단.
4. 제 2 항에 있어서,
   CD3 및 CD19 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포의 비율이 5 ％ 미만인, 세포 집단.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포 집단에 있어서, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD36 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포가 제거된, 세포 집단.
6. 제 2 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 세포 집단에 있어서, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD36 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 양성인 세포가 제거된, 세포 집단.
7. 제 1 항에 있어서,
   고형 종양에 대한 침윤에 사용하기 위한, 세포 집단.
8. 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   고형 종양에 대한 침윤에 사용하기 위한, 세포 집단.
9. 제 6 항에 있어서,
   고형 종양에 대한 침윤에 사용하기 위한, 세포 집단.
10. 고형 종양에 침윤하고 있는, CCR5 양성, CCR6 양성, CXCR3 양성, Integrin α1 양성, Integrin α3 양성 및 Integrin β3 음성이고 또한 CD3 음성인 세포.
11. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단, 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물.
12. 제 6 항에 기재된 세포 집단, 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물.
13. 제 8 항에 기재된 세포 집단, 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물.
14. 제 9 항에 기재된 세포 집단, 및 의약으로서 허용되는 첨가물을 함유하는, 의약 조성물.
15. 초대 단핵구 세포 집단을 조제하는 공정과,
    초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과,
    자기 비드를 사용하여 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정과,
    상기 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을, IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하고, 상기 배지는 인간 AB 형 배지를 포함하는, 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 정의된 세포 집단의 제조 방법.
16. 초대 단핵구 세포 집단을 조제하는 공정과,
    초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과,
    자기 비드를 사용하여 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정과,
    상기 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을, IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하고, 상기 배지는 인간 AB 형 배지를 포함하는, 제 6 항에 정의된 세포 집단의 제조 방법.
17. 초대 단핵구 세포 집단을 조제하는 공정과,
    초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과,
    자기 비드를 사용하여 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정과,
    상기 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을, IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하고, 상기 배지는 인간 AB 형 배지를 포함하는, 제 8 항에 정의된 세포 집단의 제조 방법.
18. 초대 단핵구 세포 집단을 조제하는 공정과,
    초대 단핵구 세포 집단으로부터 CD3 양성 세포를 제거하는 공정과,
    자기 비드를 사용하여 초대 단핵구 세포 집단으로부터 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 제거하는 공정과,
    상기 CD3 양성 세포, 그리고 단구 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것이 제거된 나머지 세포 집단을, IL-2 를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하고, 상기 배지는 인간 AB 형 배지를 포함하는, 제 9 항에 정의된 세포 집단의 제조 방법.
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