KR102528935B1 - 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 arp6 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 애기장대 유래 ARP6 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 지상부 재분화 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 ARP6 유전자 및 이의 용도{ARP6 gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof}

본 발명은 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물의 재분화 (regeneration)는 작물의 게놈 (genome) 편집, 형질전환 등 유전공학적 응용에 필수적인 기술로서, 낮은 재분화 효율은 게놈 편집의 주요한 허들로 알려져 있다. 고부가가치의 작물을 농생명공학적으로 육종하기 위해서는 게놈 편집 또는 형질전환후 조직의 탈분화 (캘러스 형성, callus formation)와 지상부 재분화 (shoot regeneration)가 순차적으로 수행된다. 이때 식물 재분화 과정의 효율이 매우 낮아 주요 작물의 형질개량이 매우 제한적으로 이루어지고 있는 상황이다.

최근 크리스퍼 (CRISPR) 기술의 발전과 함께 정밀 육종의 수요와 시장이 폭발적으로 성장하고 있으며, 식물 재분화 기술은 해당 시장에서 필수적으로 요구되는 바, 혁신적인 문제점 개선을 위해 전세계적으로 노력이 집중되고 있다. 일반적으로, 식물의 재분화 효율 증진을 위해 재분화 유도배지에 다양한 호르몬과 첨가물을 배합하는 방식으로 재분화 증진을 도모하였으나, 뚜렷한 한계에 직면하고 있다.

식물의 낮은 재분화 효율은 유전적 장벽 때문인 것으로 알려져 있는데, 식물의 유전적인 요인에 의해 재분화 효율이 이미 결정되는 상황이기 때문에 재분화 과정을 방해하는 유전자의 제거가 재분화 증진을 가능하게 하는 핵심기술로 알려지고 있다. 따라서 재분화 효율 조절에 관여하는 유전자를 확보하고 해당 유전자의 발현 조절을 통해 작물 재분화 효율을 증진하는 방법의 연구가 필요하다.

본 발명에서는 재분화에 관련된 중요 유전자를 선발하여 이 유전자의 발현을 조절하는 방식으로 재분화 효율을 개선할 수 있는 방법을 제안하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1898392호에는 '애기장대 유래 ATX4 유전자를 이용한 식물체의 재분화 효율 증가 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2125714호에는 '식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 DEMETER 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 ARP6 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 지상부 재분화 과정에서 발현변화가 동반되는 주요 유전자들을 선발하였고, 주요 유전자들의 녹아웃 (knock-out) 돌연변이체를 선발하여, 지상부 재분화 과정에 어떠한 영향이 있는지 분석한 결과, ARP6 유전자가 지상부 재분화 과정을 억제하는 기능을 하고 있음을 발견하였고, 해당 유전자의 녹아웃 돌연변이체 유래 캘러스가 조직 유래에 상관없이 지상부 재분화 효율이 현격하게 개선된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화 (regeneration) 효율을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 애기장대 유래 ARP6 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 재분화 효율이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물을 제공한다.

애기장대 유래 ARP6 유전자는 식물체의 재분화 효율을 효과적으로 개선할 수 있으므로, 작물 형질전환 효율 증진에 기여할 수 있을 것이며, 육종연한을 단축시키고 육종 과정의 효율화를 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 야생형(Col-0)과 ARP6 녹아웃 돌연변이체(arp6-1)의 잎(A), 하배축(B) 및 뿌리(C) 절편체 유래 캘러스를 신초 유도배지에 동일기간 배양하였을 때 형성된 신초의 모습과 개수를 보여준다. *** P<0.001.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화 (regeneration) 효율을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 애기장대 유래 ARP6 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 재분화 효율을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 애기장대 유래 ARP6 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 재분화 효율 조절 방법에 있어서, 상기 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절은 바람직하게는 ARP6 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해된 것으로, 식물세포에서 ARP6 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시켰다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 증가된 재분화 효율은 지상부 재분화 (shoot regeneration)일 수 있고, 구체적으로는 잎(leaf), 하배축(hypocotyl) 또는 뿌리(root) 유래 캘러스로부터 신초 형성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 ARP6 유전자는 캘러스가 유도된 조직 절편체 (explant)의 유래에 무관하게 재분화 효율을 증진시킬 수 있는 것이 특징이다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제는 ARP6 단백질 코딩 유전자에 T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), X-레이 또는 γ-레이 조사를 통한 돌연변이 유발, VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터, RNAi (RNA interference) 또는 안티센스 RNA, CRISPR/Cas9 유전자 교정 시스템을 이용하여 ARP6 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해(억제)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법은 상기 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 애기장대 유래 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터이다. VIGS는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후 (post-transcriptional), RNA 턴오버 (RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적 (nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(Nopaline synthase), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(Phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. tumefaciens)의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 전식물로 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 전식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 야생형에 비해 재분화 효율이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

(a) 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및

(b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 유전체 교정 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.

본 발명에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.

본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물세포에 도입하는 것은, 애기장대 유래 ARP6 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 애기장대 유래 ARP6 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 재분화 효율이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다. 상기 유전자의 발현 저해는 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하거나, ARP6 유전자를 포함하는 VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi (RNA interference) 벡터를 식물세포에 형질전환하여 ARP6 돌연변이체를 유도하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 식물 재료 및 성장 조건

본 발명에서는 Columbia-0 생태형 애기장대 (Col-0)를 야생형으로 사용하였다. 애기장대 종자의 표면을 멸균한 후, 1/2 MS (Murashige and Skoog)를 포함하는 0.7% 아가 플레이트에 심었다. 식물은 22-23℃에서 백색 형광등 (120 μmol photons·m^-2·s^-1)을 사용하여 장일조건 (16 시간 광/8 시간 암주기)으로 재배되었다. ARP6 녹아웃 돌연변이체(arp6-1)는 ABRC (https://abrc.osu.edu/)로부터 구매하여 사용하였다 (SAIL_599_G03/CS875280).

2. 지상부 재분화 (shoot regeneration)

지상부 재분화를 위해, 7일령 식물체의 첫 번째 및 두 번째 잎, 하배축, 및 뿌리의 절편체를 캘러스 유도배지 [callus-inducing medium (CIM); 0.5 ㎍/㎖ 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 및 0.05 ㎍/㎖ 키네틴이 보충된 MS 배지]에서 22℃의 조건으로 7일간 암배양하였다. 그 후, 상기 유도된 캘러스를 CIM에서 7일 동안 전배양한 후, 신초 유도배지 [shoot-inducing medium (SIM); 0.9 μmol/L 3-인돌아세트산, 2.5 μmol/L 2-이소펜테닐아데닌이 보충된 MS 배지]에서 25℃, 연속광 조건 하에서 18일 동안 배양하였다.

실시예 1. 야생형과 ARP6-6 돌연변이체의 지상부 재분화능 분석

식물체의 재분화는 캘러스 유도와 de novo 지상부 기관형성 (organogenesis)을 포함하는 두 단계 과정을 포함한다. 먼저 조직 절편체는 옥신이 풍부한 캘러스 유도배지에 배양하여 분화된 체세포로부터 캘러스 형성을 자극시킨다. 다능성 (pluripotent)의 캘러스는 그 후 옥신 대비 시토키닌 (cytokinin)의 높은 비율을 포함하는 신초 유도배지로 옮겨 de novo 신초 형성을 유도하게 된다. 신초 유도배지에서 배양함에 따라 시토키닌 신호전달의 양성 조절자인 type B-ARR (ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR)이 신초 줄기 세포 형성의 마스터 조절자인 WUS (WUSCHEL)를 활성화시킨다.

축적되는 증거들은 세포 운명의 전이는 유전체 수준 (genome-wide)의 후성적 변화 (epigenetic change)를 동반함을 보여주었다. 본 발명자는 염색질 (chromatin) 조절자가 캘러스 형성을 조절하는지 알아보기 위해, 다양한 염색질 조절자의 유전적 돌연변이체의 지상부 재분화능을 동정하였고, ARP6가 캘러스 증식을 음성적으로 조절함을 확인하였다.

야생형 애기장대와 ARP6 녹아웃 돌연변이체 (arp6-1)의 잎, 하배축, 또는 뿌리 절편체 유래 캘러스를 각각 사용하여 신초 유도배지에서 지상부 재분화를 살펴본 결과, 절편체의 종류에 무관하게 arp6-1 돌연변이체 유래 캘러스가 야생형에 비해 신초 형성 수가 현저히 많은 것을 확인할 수 있었다(도 1). 이의 결과를 통해, 본 발명의 ARP6 유전자는 절편체 조직에 대한 의존성이 없이, 어떤 조직에서 출발하더라도 재분화 효율을 증진시킬 수 있으므로, 형질전환 작물의 재분화 효율 증진에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> ARP6 gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof <130> PN20384 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1266 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtcaaaca tcgttgttct agacaacggc ggtggtctaa tcaaagccgg acaaggcggc 60 gagcgtgatc ccaccaccgt aatcccgaac tgtctctaca aacctctctc ttccaaaaaa 120 ttcatccacc catcaccact caccactctc tccgacgaaa tcgacctcac ctccgccgcc 180 gtacgccgcc caatcgaccg tggctacctc ataaactccg acctacaacg cgaaatctgg 240 tcacacctat tcacttccct cctccacata gctccttcct cctcctctct cctcctcacc 300 gaagcaccac tctcaatccc ttccgttcaa cgaaccaccg acgaactcgt cttcgaagat 360 ttcggattct cttctctcta tatagctcat cctcaatctc ttgttcatct ctatgaagct 420 agtcgtcagc ctgattcaat cctctcaaag actcagtgta gtctcgttgt tgattgtggt 480 ttctccttca ctcacgctgt tcctgttctt cacaatttca ctcttaatca cgccattaag 540 aggattgatt taggaggaaa agcttttact aattacttga aggaattggt ttcttataga 600 tctattaatg ttatggatga aactttttta gttgatgatg ctaaagagaa gctttgtttt 660 gtttcacttg atcttcttcg tgatctccgc cttgctagaa atgggaacac tcttatcaag 720 tctacttatg ttcttcctga tggtgttaca cataccaaag gctatgttaa agaccctcaa 780 gctgctaaga ggtttcttag tttgtcagag aaagagtctg tggtggtgat ggataaggtt 840 ggggagagaa agaaggctga catgaacaaa aatgagattg atttaacgaa tgagcgtttt 900 cttgtacctg agacgttatt ccagcctgca gatttaggga tgaatcaggc gggacttgca 960 gagtgcattg tccgagctat aaactcatgc cattcttact tgcaaccagt tttgtatcaa 1020 agcattatct taactggtgg aagtacatta tttccacaac ttaaggagag actagaagga 1080 gagcttcgac cacttgtccc agatcacttt gatgtgaaga taacaactca ggaggacccc 1140 atactaggtg tatggagagg tggttcactt ttggcttcca gcccggattt cgagtccatg 1200 tgtgtcacca aggctgagta cgaagaactt ggatcagctc ggtgtcgtag acgattcttt 1260 cattga 1266 <210> 2 <211> 421 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ser Asn Ile Val Val Leu Asp Asn Gly Gly Gly Leu Ile Lys Ala 1 5 10 15 Gly Gln Gly Gly Glu Arg Asp Pro Thr Thr Val Ile Pro Asn Cys Leu 20 25 30 Tyr Lys Pro Leu Ser Ser Lys Lys Phe Ile His Pro Ser Pro Leu Thr 35 40 45 Thr Leu Ser Asp Glu Ile Asp Leu Thr Ser Ala Ala Val Arg Arg Pro 50 55 60 Ile Asp Arg Gly Tyr Leu Ile Asn Ser Asp Leu Gln Arg Glu Ile Trp 65 70 75 80 Ser His Leu Phe Thr Ser Leu Leu His Ile Ala Pro Ser Ser Ser Ser 85 90 95 Leu Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Ser Ile Pro Ser Val Gln Arg Thr 100 105 110 Thr Asp Glu Leu Val Phe Glu Asp Phe Gly Phe Ser Ser Leu Tyr Ile 115 120 125 Ala His Pro Gln Ser Leu Val His Leu Tyr Glu Ala Ser Arg Gln Pro 130 135 140 Asp Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gln Cys Ser Leu Val Val Asp Cys Gly 145 150 155 160 Phe Ser Phe Thr His Ala Val Pro Val Leu His Asn Phe Thr Leu Asn 165 170 175 His Ala Ile Lys Arg Ile Asp Leu Gly Gly Lys Ala Phe Thr Asn Tyr 180 185 190 Leu Lys Glu Leu Val Ser Tyr Arg Ser Ile Asn Val Met Asp Glu Thr 195 200 205 Phe Leu Val Asp Asp Ala Lys Glu Lys Leu Cys Phe Val Ser Leu Asp 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Leu Arg Leu Ala Arg Asn Gly Asn Thr Leu Ile Lys 225 230 235 240 Ser Thr Tyr Val Leu Pro Asp Gly Val Thr His Thr Lys Gly Tyr Val 245 250 255 Lys Asp Pro Gln Ala Ala Lys Arg Phe Leu Ser Leu Ser Glu Lys Glu 260 265 270 Ser Val Val Val Met Asp Lys Val Gly Glu Arg Lys Lys Ala Asp Met 275 280 285 Asn Lys Asn Glu Ile Asp Leu Thr Asn Glu Arg Phe Leu Val Pro Glu 290 295 300 Thr Leu Phe Gln Pro Ala Asp Leu Gly Met Asn Gln Ala Gly Leu Ala 305 310 315 320 Glu Cys Ile Val Arg Ala Ile Asn Ser Cys His Ser Tyr Leu Gln Pro 325 330 335 Val Leu Tyr Gln Ser Ile Ile Leu Thr Gly Gly Ser Thr Leu Phe Pro 340 345 350 Gln Leu Lys Glu Arg Leu Glu Gly Glu Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp 355 360 365 His Phe Asp Val Lys Ile Thr Thr Gln Glu Asp Pro Ile Leu Gly Val 370 375 380 Trp Arg Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ser Ser Pro Asp Phe Glu Ser Met 385 390 395 400 Cys Val Thr Lys Ala Glu Tyr Glu Glu Leu Gly Ser Ala Arg Cys Arg 405 410 415 Arg Arg Phe Phe His 420

Claims (8)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화 (regeneration) 효율을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 ARP6 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 식물세포에서 ARP6 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 ARP6 단백질 코딩 유전자를 유전자교정 시스템을 이용하여 녹아웃(knock-out)시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 재분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 ARP6 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율이 증가된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
6. (a) 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
   (b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법.
7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 재분화 효율이 증가된 돌연변이 식물체.
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 ARP6 (Actin-Related Protein 6) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물.

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