KR102526287B1

KR102526287B1 - 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102526287B1
Application number: KR1020200166781A
Authority: KR
Inventors: 정찬헌; 임현지; 박인선; 정승일; 유강열
Original assignee: 재단법인 전주농생명소재연구원
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2023-04-27
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: KR20220077991A

Abstract

본 발명은 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 항염 활성이 있으며 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성이 우수하므로, 항염증 및 주름 개선용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 조성물{Composition for anti-inflammation and anti-wrinkle comprising fermentative product of Gryllus bimaculatus extract as effective component}

본 발명은 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 일컫는 것으로, 연령이 증가함에 따라 자연적으로 유발되는 내인성 생리적 노화와 장기간 자외선 노출에 의해 진행되는 외인성 광노화(photoaging)로 구분할 수 있다. 내인성 피부 노화의 임상적 특징은 피부가 얇아지고 탄력성이 감소하는 것이며, 조직학적 소견으로는 표피 및 진피의 두께가 얇아지고 혈관이 감소하며 진피 내의 섬유아세포의 수가 감소하는 것이다. 또한, 외인성 피부 노화인 광노화의 임상적 특징은 피부가 거칠어지고 탄력성이 없어지며, 불규칙한 색소 침착이 발생하고 깊은 주름살이 증가하는 것이다.

주름의 생성 원인으로는 여러 가지가 보고되고 있는데, 우선 피부가 과다한 자외선에 노출되면 피부의 구성성분인 콜라겐(collagen) 분해가 촉진되어 피부가 탄력을 잃고 주름이 생성될 수 있다. 또한, 피부가 과도한 온도 변화, 습도 저하 또는 바람 등에 의해 지나치게 건조해지면 외부에 대한 방어벽으로서의 피부 기능이 저하되어 주름이 생기기도 한다. 그리고 피부가 활성 산소종이나 자유 라디칼에 노출되면 산화 작용에 의해 과산화 지질이 생성되고 그로 인해 콜라겐 등의 피부 구성 단백질이 변형되어 주름이 생길 수 있다. 이러한 외부적 요인과 내부적 요인에 의한 주름 발생을 억제하고자 다양한 화장품 조성물에 대한 연구가 이루어지고 있다. 하지만 화학 성분이 함유된 기능성 화장품의 경우, 피부 자극을 유발하여 민감성 피부에 적합하지 않은 문제점이 있는 바, 피부에 자극이 적고 친환경적인 천연 식물 유래의 기능성 화장품에 대한 관심이 집중되고 있다.

쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)는 메뚜기목 귀뚜라미과의 곤충으로, 생육기간이 90일 정도로 짧은 편이라 연중 실내 대량 사육이 가능하다. 갈색거저리의 유충인 밀웜처럼 애완동물의 먹이용이나 애완곤충용으로 사용되고 있으며, 최근 식품의약품안전처에서 한시적 식품원료로 인정받았다.

한편, 한국등록특허 제2085577호에는 '쌍별귀뚜라미 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2020-0069250호에는 '쌍별귀뚜라미 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올에 의한 간손상 보호용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 조성물'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 항염 효과를 확인하였고, 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성 분석을 통한 우수한 피부주름 개선 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 항염 활성을 가지며, 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성이 우수하므로, 항염증 및 피부주름 개선을 위한 화장료 또는 건강기능식품 조성물의 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 쌍별귀뚜라미 추출물에 B. subtilis JB PMB-18 균주를 접종하여 96시간 발효시키는 동안의 생균수(A) 및 pH(B)를 확인한 결과이다.
도 2는 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 RAW 264.7 세포에서의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 NO 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 COX-2(A) 및 iNOS(B) 발현 억제능을 확인한 결과로 β-actin에 대한 상대적 발현양으로 나타내었다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 염증성 사이토카인 생성 억제능을 확인한 결과로, A는 TNF-α의 생성량이고, B는 IL-1β의 생성량이며, C는 IL-6의 생성량이다.
도 6은 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 주름 개선 효과를 확인한 결과로, A는 콜라게나아제 저해 활성을 나타낸 것이고, B는 엘라스타아제 저해 활성을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 쌍별귀뚜라미 추출물에 바실러스(Bacillus) 속의 균주를 접종하고 발효시켜 제조된 것으로, 상기 바실러스 속 균주는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주일 수 있으며, 가장 바람직하게는 전주농생명소재연구원에서 보유하고 있는 Bacillus subtilis JB PMB-18 균주일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.

또한, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 쌍별귀뚜라미 추출물에 Bacillus subtilis JB PMB-18 균주를 접종하여 30~40℃에서 1~3일 동안 발효시키는 것이 바람직하며, 37℃에서 2일 동안 발효시키는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물의 추출 용매는 당업계에 공지된 통상적인 추출용매를 사용할 수 있다. 바람직한 추출용매로는 C₁~C₄의 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합물을 용매일 수 있으며, 가장 바람직한 추출용매로는 물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 쌍별귀뚜라미 추출물의 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용하여 추출할 수 있고, 바람직한 추출방법은 열수 추출이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액; 추출액의 희석액 또는 농축액; 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물; 조정제물; 또는 정제물 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.

본 발명에 있어서, '주름 개선'이라 함은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.

본 발명의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 NO, COX-2, iNOS 및 다양한 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있으며 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 활성을 저해하는 활성이 우수한 것이 특징이다.

본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 쌍별귀뚜라미 추출물 제조

쌍별귀뚜라미는 (주)MG내추럴에서 구매하여 실험에 사용하였다. 분쇄한 쌍별귀뚜라미 500 g을 3차 멸균 증류수 5 ℓ에 혼합하여 80℃에서 3시간 동안 열수 추출하였다. 이후, 8,000 rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액을 취해 여과지(Adventec, No.2)를 이용하여 필터한 뒤, 동결건조하여 총 59.09 g의 추출물을 수득하였다.

제조예 2. 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물 제조

상기 방법으로 제조된 쌍별귀뚜라미 추출물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 접종하고 발효시켜 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 제조하였다. 발효에 사용한 균주는 (재)전주농생명소재연구원에서 보유하고 있는 B. subtilis JB PMB-18 균주이며, 100 ㎖의 NB(Nutrient Broth) 배지에 접종하여 37℃, 200 rpm으로 24시간 동안 전배양하고 5,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤, PBS로 1회 세척하여 발효를 위한 균주를 준비하였다. 100 ㎖의 증류수에 제조예 1의 쌍별귀뚜라미 추출물 0.5 g을 넣고, 준비한 균주를 2%(v/v)의 농도로 접종하여 37℃, 200 rpm으로 48시간 동안 발효시켰다. 이후, 8,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고 0.45 ㎛ 필터에 여과한 뒤 동결건조하여 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 수득하였다.

실시예 1. 생균수 및 pH 변화 측정

제조예 1의 쌍별귀뚜라미 추출물에 B. subtilis JB PMB-18 균주를 접종하여 96시간 발효시키는 동안의 생균수 및 pH를 측정하였다. 생균수는 시료 1 ㎖에 멸균 식염수로 10배씩 단계별 희석한 후 100 ㎕를 취하여 NB 고체배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생성된 콜로니 수를 계수하였다. pH는 시료 1 ㎖을 취하여 pH 미터기를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효 초기 생균수는 5.42 log CFU/㎖이였고, 발효 48시간에 9.88 log CFU/㎖로 가장 많은 생균수를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 발효 전 쌍별귀뚜라미 추출물의 pH는 6.5였으며 발효하는 동안 점점 증가하여 발효 종료시에는 pH 8.2를 나타내는 것을 확인하였다(도 1).

따라서, 48시간 동안 발효시키는 것이 균의 증식이 가장 활발한 것으로 확인하고 이후 실험을 진행하였다.

실시예 2. 세포독성 분석

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB, No. 40071)에서 분양받아 사용하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum, USA)가 함유된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였고, 3일에 한 번씩 계대배양을 수행하였다. RAW 264.7 세포를 5×10⁴ cells/웰로 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 5 mg/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 각 웰에 넣고 4시간 동안 배양한 후, 상등액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 ㎕씩 분주하여 각 웰에 생성된 결정체를 모두 용해시키고, 마이크로플레이트 리더기(Multiskan Go, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 계산식을 통해 세포생존율을 분석하였다.

세포생존율(%)=[시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도]X100

그 결과, 50, 100, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 RAW 264.7 세포에서 90% 이상의 생존율을 보여, 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 2).

실시예 3. 항염 활성 분석

LPS(lipopolysaccharide)로 염증이 유도된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 항염 활성을 분석하였다.

(1) NO 생성 억제능 측정

NO(nitric oxide)는 면역계에서 방어분자로서 중요한 역할을 하지만, 과도하게 증가하면 NO를 생성하는 세포자신과 주위의 세포와 조직, 기관에 손상을 초래하여 면역질환을 포함한 관절염, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적반응을 일으킨다. 따라서, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 항염 활성을 분석하기 위하여 NO 생성 억제능을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 5×10⁴ cells/웰로 96 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 2시간 동안 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리스 시약(Griess Reagent System, Promega, USA)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 50 ㎕에 그리스 시약 100 ㎕를 처리하고 30분 내에 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, LPS 단독 처리군의 NO 생성량은 대조군 대비 현저하게 증가하였고, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물 처리군의 NO 생성량은 감소하였으며 특히, 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물 처리군은 LPS 단독 처리군 대비 약 79.1%, 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물 처리군 대비 약 67% 가량의 NO 생성 억제능을 보이는 것을 확인하였다(도 3).

(2) COX-2 및 iNOS 생성 억제능 측정

COX-2(Cyclooxygenase-2) 및 iNOS(Inducible nitric oxide synthases)는 대식세포에서 염증반응에 의해 생성되는 NO 및 PGE2(Prostaglandin2)의 생성 경로에 관여하는 단백질이다. COX-2는 정상 생리학적인 조건에서는 발현되지 않지만 암 발생 촉진물질(tumor promotor), 성장인자(growth factor) 및 사이토카인(cytokine) 등에 의해 발현된다고 알려져 있다. iNOS는 LPS, IFN-γ, IL-1 및 TNF-α 등의 자극에 의해 발현되며 NO를 생성하는데 관여한다고 알려져 있다. RAW 264.7 세포를 1×10⁶ cells/웰로 6 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 100, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 2시간 동안 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 펠렛에서 RNA를 추출하고 정량하였다. 1 ㎍의 RNA로 cDNA를 합성하여 프라이머, 멸균수 및 마스터 믹스(master mix)와 혼합하여 총 20 ㎕의 반응액으로 PCR을 수행하였고, 사용한 프라이머는 아래 표 1과 같다.

본 발명에 사용한 프라이머 정보

유전자	서열(5'-3')	서열번호
COX-2	(F)CTCTACAACAACTCCATCCT	1
COX-2	(R)ATTCTGCAGCCATTTCCTTC	2
iNOS	(F)CGAAACGCTTCACTTCCAA	3
iNOS	(R)TGAGCCTATATTGCTGTGGCT	4
β-actin	(F)CGGTTCCGATGCCCTGAGGCTCTT	5
β-actin	(R)CGTCACACTTCATGATGGAATTGA	6

그 결과, LPS 단독 처리군의 COX-2 및 iNOS의 발현양은 대조군 대비 현저하게 증가하였고, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물 처리군의 발현양은 감소하였다. 특히, 100 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물 처리군은 쌍별귀뚜라미 추출물 처리군 대비 COX-2 발현은 약 55% 가량 감소하였고, iNOS 발현은 약 46.1% 가량 감소하여, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물이 쌍별귀뚜라미 추출물보다 COX-2 및 iNOS 생성 억제능이 우수한 것을 확인하였다(도 4).

(3) 염증성 사이토카인의 생성 억제능 측정

RAW 264.7 세포를 5×10⁵cells/웰로 24웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 2시간 동안 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 염증성 사이토카인 TNF-α(tumor necrosis factor alpha), IL-1β(Interleukin 1 beta) 및 IL-6(Interleukin 6)의 생성량을 측정하였다. 각 사이토카인은 ELISA 키트(R&D systems Inc., USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R² 값이 0.9 이상이었다.

그 결과, LPS 단독 처리군은 대조군 대비 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성량이 현저하게 증가하였고, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물 처리군의 염증성 사이토카인 생성량은 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 처리했을 때 아무것도 처리하지 않은 대조군과 유사한 수준의 사이토카인 생성량이 검출되는 것을 확인하였다. 특히, 쌍별귀뚜라미 추출물보다 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물의 염증성 사이토카인 생성 억제능이 현저하게 우수한 것을 확인하였다(도 5).

실시예 4. 주름개선 효과 분석

콜라게나아제 및 엘라스타아제는 세포외 기질 단백질을 분해하여 피부의 주름 생성을 촉진시키는 효소이므로, 본 발명의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물에 의한 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성을 측정하였다.

(1) 콜라게나아제의 저해 활성 측정

콜라게나아제(collagenase) 저해 활성은 EnzChek^® 젤라티나아제/콜라게나아제 어세이 키트(ThermoFisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 100 및 500 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 준비한 다음, 키트 내 기질과 콜라게나아제 효소를 96 웰 플레이트에 넣고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 형광 플레이트 분석기를 이용하여 흡수 파장은 495 nm이고, 발광 파장은 515 nm로 하는 조건으로 형광강도를 측정하였고, 콜라게나아제 저해 활성은 하기 계산식을 통해 산출하였다.

콜라게나아제 저해 활성(%) = {1-(S-B)/C}×100

(S: 시료의 흡광도, B: blank의 흡광도, C: control의 흡광도)

그 결과, 쌍별귀뚜라미 추출물은 콜라게나아제 저해 활성이 거의 없는 반면,쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 콜라게나아제 저해 활성이 매우 우수한 것을 확인하였다(도 6A).

(2) 엘라스타아제의 저해 활성 측정

엘라스타아제(elastase) 저해 활성은 EnzChek^® 엘라스타아제 어세이 키트(ThermoFisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 50, 100 및 500 ㎍/㎖의 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물을 준비한 다음, 키트 내 기질과 엘라스타아제 효소를 96 웰 플레이트에 넣고 25℃에서 50분간 반응시켰다. 형광 플레이트 분석기를 이용하여 흡수 파장은 505 nm이고, 발광 파장은 515 nm로 하는 조건으로 형광강도를 측정하였고, 엘라스타제 저해 활성은 하기 계산식을 통해 산출하였다.

엘라스타아제 저해 활성(%) = {1-(S-B)/C}×100

(S: 시료의 흡광도, B: blank의 흡광도, C: control의 흡광도)

그 결과, 쌍별귀뚜라미 추출물은 엘라스타아제 저해 활성이 거의 없는 반면,쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 엘라스타아제 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 6B).

상기의 결과를 통해 쌍별귀뚜라미 추출물은 주름 개선 효과가 거의 없는 반면, 쌍별귀뚜라미 추출물의 발효물은 주름 개선 효과가 우수한 것을 알 수 있었다.

<110> JEONJU BIOMATERIALS INSTITUTE <120> Composition for anti-inflammation and anti-wrinkle comprising fermentative product of Gryllus bimaculatus extract as effective component <130> PN20305 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctctacaaca actccatcct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 attctgcagc catttccttc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgaaacgctt cacttccaa 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgagcctata ttgctgtggc t 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggttccgat gccctgaggc tctt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtcacactt catgatggaa ttga 24

Claims

쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) 열수 추출물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 접종하여 발효시켜 제조한 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 발효는 30~40℃에서 1~3일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 항염증 및 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 주름 개선은 콜라게나아제 및 엘라스타아제 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 항염증 및 주름 개선용 화장료 조성물.
쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) 열수 추출물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 접종하여 발효시켜 제조한 발효물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 주름 개선용 건강기능식품 조성물.