KR102525011B1 - Touch Button Activated Microfluidic Microdroplet Generator - Google Patents
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Abstract
본 발명은 터치버튼 작동방식의 미세유체 기반 미세액적 생성기에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 별도의 값비싸고 부피가 큰 복잡한 장비 없이 균일한 크기의 미세액적을 고효율로 생성할 수 있는 장치를 제공하여, 디지털 PCR, 디지털 ELISA, FACS 등의 미세액적을 활용한 분석과정들을 보다 정확하고, 용이하게 수행할 수 있다.The present invention relates to a microfluidic-based microdroplet generator with a touch button operation method. According to the present invention, a device capable of generating uniformly sized microdroplets with high efficiency without expensive, bulky and complicated equipment is provided. Thus, analysis processes using microdroplets such as digital PCR, digital ELISA, and FACS can be performed more accurately and easily.
Description
본 발명은 터치버튼 작동방식의 미세유체 기반 미세액적 생성기에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 디지털 PCR, 디지털 ELISA, 단일세포 분석 등의 미세액적을 활용한 분석과정들에 사용되는 미세액적을 균일한 크기로 고효율로 생성시키기 위한 미세액적 생성기에 관한 것이다. The present invention relates to a microfluidic-based microdroplet generator with a touch button operation method, and more particularly, to generate microdroplets of uniform size used in analysis processes using microdroplets such as digital PCR, digital ELISA, and single cell analysis. It relates to a microdroplet generator for generating with high efficiency.
미세유체 기반 미세액적 생성기술은 수 마이크로리터의 시료를 수십만 개의 미세액적으로 구획화할 수 있으므로, 디지털 중합효소연쇄반응(PCR), 디지털 면역분석법, 그리고 단일세포 분석을 위해 매우 널리 사용되는 기술이다. 이를 위해서는 균일한 크기의 미세액적을 고효율로 생성할 수 있어야 하며, 이를 위해서 값비싸고 부피가 크며 복잡한 외부 펌핑시스템이 포함된 장비가 필요하다. 그러나 이러한 외부 펌핑시스템은 전문가들만이 사용할 수 있으며 값이 비싸기 때문에 미세액적 생성을 위한 미세유체장치들의 보급화가 제한되고 있다.Microfluidic-based microdroplet generation technology can compartmentalize a few microliters of sample into hundreds of thousands of microdroplets, so it is a very widely used technology for digital polymerase chain reaction (PCR), digital immunoassay, and single cell analysis. am. To this end, it is necessary to be able to generate uniformly sized microdroplets with high efficiency, and for this purpose, expensive, bulky and complicated equipment including an external pumping system is required. However, since such an external pumping system can only be used by experts and is expensive, the spread of microfluidic devices for generating microdroplets is limited.
따라서, 별도의 외부 펌핑시스템 없이 미세유체장치를 작동할 수 있는 다양한 기술들이 개발되어 왔고, 이러한 기술들에 기반하여 미세액적을 생성하는 기술들 또한 개발되었다. 마이크로 파이펫을 이용한 미세액적 생성기술(Langer et al., Biomicrofluidics, 2018), 탈기화된 PDMS 를 이용한 미세액적 생성기술(Li et al., Microfluid. Nanofluid.,2015) 이 개발되었지만, 기 개발된 기술들은 여전히 작동과정이 복잡하고 반복적인 작동이 불가하여, 누구나 손쉽게 사용할 수 없고, 균일한 크기의 미세액적을 고효율로 생성하기 힘들다는 한계점이 있다.Accordingly, various techniques capable of operating a microfluidic device without a separate external pumping system have been developed, and techniques for generating microdroplets based on these techniques have also been developed. A microdroplet generation technology using a micropipette (Langer et al., Biomicrofluidics, 2018) and a microdroplet generation technology using degassed PDMS (Li et al., Microfluid. Nanofluid., 2015) have been developed. The developed technologies still have limitations in that the operation process is complicated and repetitive operation is not possible, so that anyone cannot easily use them, and it is difficult to generate uniformly sized microdroplets with high efficiency.
한편, 인간이 취할 수 있는 가장 간단한 동작 중 하나인 손가락 작동을 이용한 미세유체구동을 통해 포도당 검사, 혈액형 검사, 항생제 내성 검사, 미세액적 생성 등에 사용한 사례가 보고된바 있다(US 2016-0109467, Xu K et al., Lab Chip., 15:867, 2015, Glynn MT et al., Lab Chip.,14:2844, 2014).On the other hand, cases have been reported in which microfluidic driving using finger operation, one of the simplest actions that humans can take, has been used for glucose testing, blood type testing, antibiotic resistance testing, and microdroplet generation (US 2016-0109467, Xu K et al ., Lab Chip. , 15:867, 2015; Glynn MT et al., Lab Chip ., 14:2844, 2014).
그러나 상기 보고된 기술들은 단순히 손가락 작동으로 미세유체 채널 내에 압력을 가하여 미세유체를 일시적으로 구동시키거나, 공압밸브를 이용하여 반복적인 미세유체의 구동을 가능하게 하게 하여, 다양한 랩온어칩 시스템들을 구현하였으나, 손가락 구동을 통한 정교한 조절이 힘들기 때문에 사용자들의 다양한 손가락 작동 특성에 따라 미세유체의 특성이 영향을 받게 되는 단점이 있었다. 즉 사용자들의 다양한 손가락 작동 특성을 고려하여 정교하고 표준화된 지침을 제공하는 데에 한계가 있다. 더불어, 손가락 작동을 이용해 압력을 가하는 압력 챔버가 미세유체 채널과 직접적으로 연결되어 있기 때문에, 미세유체 채널들의 집적을 통한 랩온어칩 시스템을 설계할 때 압력챔버의 위치를 고려해야 한다. 따라서, 미세유체 채널들의 집적이 제한된다는 한계점이 있다. 추가적으로 압력챔버 내부로 흘러들어온 유체로 인해, 손가락 작동에 영향을 미칠 수 있다. However, the technologies reported above implement various lab-on-a-chip systems by temporarily driving the microfluid by simply applying pressure in the microfluidic channel with a finger operation, or enabling repetitive driving of the microfluid using a pneumatic valve. However, since precise control through finger drive is difficult, there is a disadvantage in that the characteristics of microfluids are affected by various finger operation characteristics of users. That is, there is a limit to providing sophisticated and standardized guidelines in consideration of various finger operation characteristics of users. In addition, since the pressure chamber, which applies pressure using a finger operation, is directly connected to the microfluidic channel, the position of the pressure chamber should be considered when designing a lab-on-a-chip system through the integration of microfluidic channels. Therefore, there is a limitation that the integration of microfluidic channels is limited. In addition, due to the fluid flowing into the pressure chamber, the finger operation may be affected.
또한, 본 발명자들은 손가락 구동을 기반으로 한 미세유체 제어를 이용한 랩온어칩 시스템을 개발한 바 있으나, 이는 손가락 구동에 의하여 발생하는 양압에 의하여 미세유체를 이송시키는 시스템으로는 보다 더 복잡한 미세유체 채널 구성이 필요하며, 그로 인해 여러 유닛의 미세액적 생성부를 집적할 수 없을 뿐만 아니라 미세유체 채널 저항에 따라 미세액적의 크기를 조절할 수 없다 (대한민국 특허 공개10-2019-0087842).In addition, the present inventors have developed a lab-on-a-chip system using microfluidic control based on finger driving, but this is a microfluidic channel that is more complex than a system that transfers microfluids by positive pressure generated by finger driving. A configuration is required, so that the microdroplet generating units of several units cannot be integrated, and the size of the microdroplets cannot be adjusted according to the microfluidic channel resistance (Korean Patent Publication 10-2019-0087842).
이에, 본 발명자들은 손가락 작동 특성에 영향을 받지 않고 균일한 압력으로, 미세액적을 생성시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 폴리머 박막을 이용한 터치버튼 작동방식을 미세유체 회로에 적용하여, 미세액적 생성기의 접지부를 손가락으로 눌렀다 떼어내면서 생성되는 압력과, 이 압력에 의해 발생하는 공압채널의 공기흐름으로 인한 유체채널의 압력변화를 이용하여 미세액적을 생성시키는 경우, 종래 알려진 마이크로 파이펫을 이용한 미세액적 생성기술이나 탈기화된 PDMS를 이용한 미세액적 생성기술들보다, 간단하게 일정한 크기의 미세액적을 제조할 수 있고, 미세액적의 크기도 조절할 수 있어, 디지털 PCR, 디지털 ELISA, FACS 등의 분석에 적용 가능한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have made an earnest effort to develop a method capable of generating microdroplets with uniform pressure without being affected by finger operation characteristics, and as a result, a touch button operation method using a polymer thin film is applied to a microfluidic circuit, In the case of generating microdroplets using the pressure generated by pressing and removing the grounding part of the droplet generator with a finger and the pressure change in the fluid channel due to the air flow in the pneumatic channel generated by this pressure, a conventionally known micro pipette Compared to the microdroplet generation technology using degassed PDMS or the microdroplet generation technology using degassed PDMS, it is possible to simply produce microdroplets of a certain size and control the size of the microdroplets, such as digital PCR, digital ELISA, and FACS. It was confirmed that it was applicable to the analysis of the like, and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 손가락 구동으로 간단하게 일정한 크기의 미세액적을 생성하여 분석기기에 바로 로딩할 수 있는 미세액적 생성기를 제공하는데 있다. An object of the present invention is to provide a micro-droplet generator capable of generating micro-droplets of a certain size simply by driving a finger and directly loading them into an analysis device.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세액적 생성기를 이용한 미세액적의 제조방법을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for producing micro-droplets using the micro-droplet generator.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 터치버튼 작동식 미세유체기반 미세액적 생성기를 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a touch button-operated microfluidic-based microdroplet generator comprising:
(a) 접지부를 구비하고, 접지부를 누르는 압력에 의하여 공압채널의 공기 흐름을 생성시키는 터치버튼;(a) a touch button having a grounding part and generating an air flow in a pneumatic channel by pressing the grounding part;
(b) 상기 터치버튼과 연결되고, 상기 터치버튼에 가해지는 압력에 의하여 공기가 이동하는 공압채널이 형성되어 있는 공압채널 층; (b) a pneumatic channel layer connected to the touch button and formed with a pneumatic channel through which air moves by the pressure applied to the touch button;
(c) 상기 공압채널 층의 상부에 위치하여 공기 흐름에 의하여 상기 작동챔버, 상기 제1공압밸브 및 상기 제2 공압밸브가 개폐되도록 하는 폴리머 박막층;(c) a polymer thin film layer positioned on the pneumatic channel layer to open and close the operation chamber, the first pneumatic valve, and the second pneumatic valve by air flow;
(d) 상기 폴리머 박막층의 상부에 위치하고, 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부를 구비하고 상기 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부의 액체가 혼합되면서 유체 채널로 이동하도록 하는 미세액적 생성부; 공기흐름에 의하여 개폐가 조절되는 작동챔버; 제1 공압밸브; 및 제2 공압밸브로 구성되는 펌핑유닛; 상기 미세액적 생성부에서 이동된 유체가 제1공압밸브, 작동챔버 및 제 2공압밸브의 순서를 거처 배출부로 이동하면서 최종적으로 미세액적이 형성되도록 하는 유체채널이 구비된 유체 채널층; 및(d) a microdroplet generating unit located on the upper part of the polymer thin film layer, having an oil-soluble liquid-supporting part and a water-soluble liquid-supporting part, and allowing the liquid of the oil-soluble liquid-supporting part and the water-soluble liquid-bearing part to move into a fluid channel while being mixed; an operating chamber whose opening and closing is controlled by air flow; a first pneumatic valve; And a pumping unit consisting of a second pneumatic valve; a fluid channel layer provided with a fluid channel through which the fluid moved from the microdroplet generating unit moves to the discharge unit through the first pneumatic valve, the operation chamber, and the second pneumatic valve in order so that microdroplets are finally formed; and
(e) 유체 채널층의 상부에 위치하고, 접지되는 터치버튼의 상판을 형성하는 덥개층.(e) a covering layer located on top of the fluid channel layer and forming an upper plate of a grounded touch button.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 미세액적의 제조방법을 제공한다:The present invention also provides a method for producing microdroplets comprising the following steps:
(a) 상기 미세액적 생성기의 접지부에 압력을 가해 공압채널의 공기를 배출시키고 공기배출부를 막아준 후, 접지부에 가해진 압력을 제거하여 공압채널에 음압을 형성시키는 단계;(a) applying pressure to the grounding part of the microdroplet generator to discharge air from the pneumatic channel, block the air discharge part, and remove the pressure applied to the grounding part to form a negative pressure in the pneumatic channel;
(b) 상기 미세액적 생성기의 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부에 지용성 액체 시료와 수용성 액체 시료를 각각 주입하는 단계; (b) injecting an oil-soluble liquid sample and a water-soluble liquid sample into the oil-soluble liquid-supporting part and the water-soluble liquid-supporting part of the microdroplet generator, respectively;
(c) 터치버튼에 외부 압력을 가하는 단계; (c) applying external pressure to the touch button;
(d) 상기 가해진 압력에 의하여 펌핑유닛의 제1 밸브와 작동챔버가 닫히면서 유체채널에 머물러 있던 공기가 제2밸브를 거쳐 배출부로 배출되는 단계;(d) closing the first valve of the pumping unit and the working chamber by the applied pressure and discharging the air remaining in the fluid channel to the discharge unit through the second valve;
(e) 터치버튼에 가해진 외부압력을 해지하는 단계;(e) releasing the external pressure applied to the touch button;
(f) 해지된 압력에 의해 제1 밸브와 작동챔버가 열리면서 지용성 액체와 수용성 액체가 미세액적 생성부를 거치며 미세액적이 생성되고 생성된 미세액적이 작동챔버에 모이는 단계; 및(f) opening the first valve and the operation chamber by the released pressure, allowing the oil-soluble liquid and the water-soluble liquid to pass through the microdroplet generating unit to generate microdroplets, and collecting the generated microdroplets in the operation chamber; and
(g) 상기 가해진 압력에 의하여 펌핑유닛의 제1 밸브와 작동챔버가 닫히면서 작동챔버에 모여있던 미세액적들이 제2밸브를 거쳐 배출부로 배출되는 단계.(g) the first valve of the pumping unit and the operation chamber are closed by the applied pressure, and the fine liquid droplets collected in the operation chamber are discharged to the discharge unit through the second valve.
본 발명에 따르면, 별도의 값비싸고 부피가 큰 복잡한 장비 없이 균일한 크기의 미세액적을 고효율로 생성할 수 있는 장치를 제공하여, 디지털 PCR, 디지털 ELISA, FACS 등의 미세액적을 활용한 분석과정들을 보다 정확하고, 용이하게 수행할 수 있다.According to the present invention, by providing a device capable of generating uniformly sized microdroplets with high efficiency without separate expensive, bulky and complicated equipment, analysis processes using microdroplets such as digital PCR, digital ELISA, and FACS are simplified. More accurate and easier to do.
도 1은 본 발명은 터치버튼 작동식 미세유체기반 미세액적 생성기의 구성을 나타낸 것으로, A와 C는 터치버튼 작동식 미세유체기반 미세액적 생성기의 구조를 나타낸 것이고, B와 E는 분해도를 나타낸 것이며, D는 본 발명의 미세액적 생성기작동예를 나타낸 것이고, F는 본 발명의 미세액적 생성기를 PCR 분석에 사용하였을 때, 유전자 증폭이 일어난 핵산을 포함하는 미세액적들의 형광신호를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 미세액적 생성기를 나타낸 것으로, A는 본 발명은 미세액적 생성기의 미세액적 생성부와 펌핑유닛을 나타낸 것이고, B는 미세액적 생성부의 지용성 액체(예를 들면, 오일) 담지부에 연결되는 채널과 수용성 액체(예를 들면, PCR mixture) 담지부에 연결되는 채널이 만나는 접합부를 나타낸 것이고, 도 2C는 미세액적 생성기를 통해 생성된 균일한 크기의 미세액적을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 미세액적 생성기의 터치버튼 작동식 펌핑유닛의 작동원리를 나타낸 것으로, A는 펌핑유닛의 도면을 나타낸 것이고, B는 터치버튼 누름과 놓음에 따른 펌핑유닛의 작동원리를 나타낸 것이다.
도 4는 터치버튼 누름과 놓음에 따라 각 구성부품에서 미세액적이 생성되고 있는 것을 나타낸 것으로, A는 미세액적 생성부에서 수용성 유체 흐름(water flow)과 지용성 유체 흐름(oil flow)을 통해 미세액적이 생성되는 과정을 나타낸 것이고, B는 펌핑유닛의 제1밸브, 작동챔버 및 제2밸브가 터치버튼 누름과 놓음에 개폐되면서, 생성된 미세액적이 파쇄되지 않고 배출부로 이동하고 있는 것을 나타낸 것이다.
도 5는 미세액적 생성부의 채널 폭에 따라 달라지는 미세액적 크기를 분석한 것으로, A는 채널 폭에 따른 생성된 미세액적의 크기를 나타낸 사진이고, B는 채널 폭에 따른 미세액적 크기의 분포도를 나타낸 것이며, C는 수용성 유체 채널의 길이가 증가함에 따라 생성된 미세액적의 크기가 감소하는 것을 나타낸 것이고, D는 채널 폭이 증가함에 따라 미세액적 크기가 증가하는 것을 나타낸 것이며, E는 작동챔버의 부피에 따라 형성된 미세액적 크기를 비교한 그래프이다(Lw = 수용성 유체 채널(water flow channel)의 길이, W = 미세액적 생성 채널의 폭).
도 6은 본 발명에 따른 미세액적 생성기를 사용하여 생성된 미세액적과 바이오라드(BioRad)사의 미세액적 생성기(QX200)를 통해 생성된 미세액적의 크기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 미세액적 생성기(A)와 바이오라드(BioRad)사의 미세액적 생성기(QX200)(B)를 사용하여, 디지털 PCR 분석을 진행하는 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 미세액적 생성기(A)와 바이오라드(BioRad)사의 미세액적 생성기(QX200)(B)를 사용하여, 다양한 농도의 대장균 O157:H7의 게놈 DNA에 대한 디지털 PCR을 진행한 결과를 나타낸 것이다. C는 분석된 미세액적의 개수를 비교한 결과를 나타낸 것이고, D는 양성 시그널을 나타낸 미세액적의 비율을 비교한 결과를 나타낸 것이며, E는 상기 결과를 바탕으로, 시그널 분석기에서 분석한 DNA 카피수를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 1 shows the configuration of a touch button-operated microfluidic-based microdroplet generator according to the present invention, A and C show the structure of a touch-button operated microfluidic-based microdroplet generator, and B and E are exploded views. D is an example of the operation of the microdroplet generator of the present invention, and F is the fluorescence signal of microdroplets containing nucleic acids in which gene amplification was performed when the microdroplet generator of the present invention was used for PCR analysis. it is shown
2 shows a microdroplet generator according to the present invention, A is a microdroplet generator and a pumping unit of the microdroplet generator according to the present invention, B is a lipid-soluble liquid (for example, a microdroplet generator) , Oil) shows the junction where the channel connected to the supporting part and the channel connected to the water-soluble liquid (eg, PCR mixture) supporting part meet. It represents the enemy.
Figure 3 shows the operating principle of the touch button operated pumping unit of the microdroplet generator according to the present invention, A is a drawing of the pumping unit, B is the operating principle of the pumping unit according to pressing and releasing the touch button it is shown
4 shows that microdroplets are generated in each component as the touch button is pressed and released, and A shows microdroplets through water flow and oil flow in the microdroplet generator It shows the process of generating three droplets, and B shows that the first valve, operation chamber, and second valve of the pumping unit are opened and closed by pressing and releasing the touch button, and the generated fine droplets are moving to the discharge unit without being crushed. .
5 is an analysis of the size of microdroplets that varies according to the channel width of the microdroplet generating unit, A is a photograph showing the size of the generated microdroplets according to the channel width, and B is the size of the microdroplets according to the channel width. It shows a distribution diagram, C shows that the size of the generated microdroplets decreases as the length of the aqueous fluid channel increases, D shows that the size of the microdroplets increases as the channel width increases, and E shows that the size of the microdroplets increases. It is a graph comparing the sizes of microdroplets formed according to the volume of the working chamber (Lw = length of water flow channel, W = width of microdroplet generation channel).
Figure 6 shows the results of comparing the sizes of microdroplets generated using the microdroplet generator according to the present invention and microdroplets generated using the microdroplet generator (QX200) of BioRad.
7 shows a process of digital PCR analysis using a microdroplet generator (A) according to the present invention and a microdroplet generator (QX200) of BioRad (B).
8 shows digital PCR for genomic DNA of E. coli O157:H7 at various concentrations using the microdroplet generator (A) and the microdroplet generator (QX200) of BioRad (B) according to the present invention. It shows the results of the process. C shows the result of comparing the number of analyzed microdroplets, D shows the result of comparing the ratio of microdroplets showing a positive signal, and E shows the number of DNA copies analyzed by the signal analyzer based on the above results. shows the result of comparison.
디지털 중합효소연쇄반응(PCR), 디지털 면역분석법 및 단일 세포 분석을 위해서는 수 마이크로리터의 시료를 미세액적으로 구획화하여 반응을 수행하는 단계가 필요하며, 이를 위해서는 균일한 크기의 미세액적을 고효율로 생성할 수 있어야 한다. 종래에는 이러한 미세액적 생성을 위하여, 값비싸고 부피가 크며 복잡한 외부 펌핑시스템이 필요하고, 제한된 전문가만이 이를 사용할 수 있었다. For digital polymerase chain reaction (PCR), digital immunoassay, and single cell analysis, it is necessary to compartmentalize a few microliters of sample into microdroplets and carry out the reaction. should be able to create Conventionally, in order to generate such microdroplets, an expensive, bulky, and complex external pumping system is required, and only limited experts can use it.
본 발명에서는 손가락으로 터치버튼을 눌러 발생하는 압력에 의한 박막의 편향에 기반한 미세유체 제어를 통해 별도의 장비 없이 휴대형 미세유체 장치만을 사용하여 손쉽게 균일한 크기의 미세액적을 고효율로 생성할 수 있으며, 본 발명의 기술은 누구나 손쉽게 사용가능하고, 다양한 사용자에 관계없이 일정한 양의 미세유체를 제어할 수 있어, 디지털 PCR, 디지털 ELISA, 단일세포 분석등의 과정을 용이하게 수행할 수 있다. 또한, 기존의 외부 펌핑시스템에 기반한 미세액적 생성기와 비교하여, 부피가 작고 값싸기 때문에 미세유체기반 미세액적 생성기술의 키트화, 보급화를 가능하게 할 수 있다.In the present invention, through microfluidic control based on deflection of a thin film by pressure generated by pressing a touch button with a finger, microdroplets of a uniform size can be easily generated with high efficiency using only a portable microfluidic device without additional equipment, The technology of the present invention can be easily used by anyone, and can control a certain amount of microfluid regardless of various users, so that processes such as digital PCR, digital ELISA, and single cell analysis can be easily performed. In addition, compared to the microdroplet generator based on the existing external pumping system, since the volume is small and inexpensive, it is possible to kit and popularize the microfluidic-based microdroplet generation technology.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음을 포함하는 터치버튼 작동식 미세유체기반 미세액적 생성기에 관한 것이다:Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a touch-button operated microfluidic-based microdroplet generator comprising:
(a) 접지부를 구비하고, 접지부를 누르는 압력에 의하여 공압채널의 공기 흐름을 생성시키는 터치버튼;(a) a touch button having a grounding part and generating an air flow in a pneumatic channel by pressing the grounding part;
(b) 상기 터치버튼과 연결되고, 상기 터치버튼에 가해지는 압력에 의하여 공기가 이동하는 공압채널이 형성되어 있는 공압채널 층; (b) a pneumatic channel layer connected to the touch button and formed with a pneumatic channel through which air moves by the pressure applied to the touch button;
(c) 상기 공압채널 층의 상부에 위치하여 공기 흐름에 의하여 상기 작동챔버, 상기 제1공압밸브 및 상기 제2 공압밸브가 개폐되도록 하는 폴리머 박막층;(c) a polymer thin film layer positioned on the pneumatic channel layer to open and close the operation chamber, the first pneumatic valve, and the second pneumatic valve by air flow;
(d) 상기 폴리머 박막층의 상부에 위치하고, 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부를 구비하고 상기 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부의 액체가 혼합되면서 유체 채널로 이동하도록 하는 미세액적 생성부; 공기흐름에 의하여 개폐가 조절되는 작동챔버; 1 공압밸브; 및 제2 공압밸브로 구성되는 펌핑유닛; 및 상기 미세액적 생성부에서 이동된 유체가 제1공압밸브, 작동챔버 및 제 2공압밸브의 순서를 거처 배출부로 이동하면서 최종적으로 미세액적이 형성되도록 하는 유체채널이 구비된 유체 채널층; 및(d) a microdroplet generating unit located on the upper part of the polymer thin film layer, having an oil-soluble liquid-supporting part and a water-soluble liquid-supporting part, and allowing the liquid of the oil-soluble liquid-supporting part and the water-soluble liquid-bearing part to move into a fluid channel while being mixed; an operating chamber whose opening and closing is controlled by air flow; 1 pneumatic valve; And a pumping unit consisting of a second pneumatic valve; and a fluid channel layer provided with a fluid channel through which the fluid transferred from the microdroplet generating unit moves to the discharge unit through the order of the first pneumatic valve, the operation chamber, and the second pneumatic valve so that microdroplets are finally formed. and
(e) 유체 채널층의 상부에 위치하고, 접지되는 터치버튼의 상판을 형성하는 덥개층.(e) a covering layer located on top of the fluid channel layer and forming an upper plate of a grounded touch button.
본 발명에 있어서, 터치버튼에 압력이 가해지는 경우, 제1밸브와 작동챔버가 수축되고, 상기 유체채널에 머물러 있던 액체가 배출부로 배출되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 터치버튼의 압력이 해제되는 경우, 제1밸브와 작동챔버는 팽창하고, 제2밸브는 잠겨 주입부에 있던 지용성 액체와 수용성액체가 미세액적 생성부를 지나면서 미세액적이 생성되고 생성된 미세액적이 팽창된 작동챔버에 보관되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, when pressure is applied to the touch button, the first valve and the operation chamber are contracted, and the liquid remaining in the fluid channel is discharged to the discharge unit, and the pressure of the touch button is released In this case, the first valve and the operation chamber are inflated, and the second valve is closed, so that the oil-soluble liquid and the water-soluble liquid in the injection part pass through the micro-droplet generating unit to generate micro-droplets, and the generated micro-droplets enter the expanded operation chamber. It can be characterized as being stored.
본 발명에 있어서, 상기 제1밸브 상기 작동챔버 및 상기 제2밸브의 개폐는 폴리머 박막의 압축 및 감압에 의하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the opening and closing of the first valve, the operation chamber and the second valve may be performed by compression and decompression of the polymer thin film.
본 발명에 있어서, 상기 폴리머 박막의 폴리머는 폴리디메틸실록산(PDMS), 선상저밀도 폴리에틸렌(LLD-PE) 및 고무로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the polymer of the polymer thin film may be characterized in that it is selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), linear low-density polyethylene (LLD-PE) and rubber.
본 발명에 있어서, 상기 지용성 액체는 계면활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the oil-soluble liquid may be characterized in that it further comprises a surfactant.
본 발명에 있어서, 상기 배출부에는 별도의 반응 및 로딩용 튜브가 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, it may be characterized in that a separate reaction and loading tube is connected to the discharge unit.
본 발명에 있어서, 상기 미세액적 생성부는 상기 지용성 액체 담지부에 연결되는 채널과 수용성 액체 담지부에 연결되는 채널이 만나는 접합부를 가지고, 상기 접합부가 유체 채널과 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the microdroplet generating unit may have a junction where a channel connected to the oil-soluble liquid-supporting unit and a channel connected to the water-soluble liquid-supporting unit meet, and the junction is connected to the fluid channel.
본 발명에 있어서, 상기 미세액적 생성기는 하나의 터치버튼에 하나 이상의 미세액적 생성부와 펌핑유닛이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 할 수 있다. In the present invention, the micro-droplet generator may be characterized in that one or more micro-droplet generators and a pumping unit are connected to one touch button.
일반적으로 미세액적을 생성하기 위해서는 부피가 크며 값비싼 미세액적생성기계를 사용하며, 생성된 미세액적을 다른 분석기기로 옮기기 위해 마이크로피펫을 이용한 정교한 작업이 필요하나, 본 발명의 미세액적 생성기는 터치버튼을 작동방식의 간단한 휴대형 미세유체장치만을 사용하여 생성된 미세액적을 별도의 정교한 피펫팅 없이 분석기기에 바로 로딩할 수 있다(도 1).In general, a bulky and expensive microdroplet generator is used to generate microdroplets, and sophisticated work using a micropipette is required to transfer the generated microdroplets to another analysis device, but the microdroplet generator of the present invention can directly load microdroplets generated by using only a simple portable microfluidic device operated by a touch button into an analysis device without additional elaborate pipetting (FIG. 1).
본 발명의 일 양태에서는 도 1C~도 1E는 4개의 미세액적 생성부와 펌핑유닛을 하나의 터치버튼에 연결하여 사용하였지만, 사용자의 용도에 따라 더 많은 유닛들을 하나의 터치버튼에 연결하여 디자인할 수 있다. In one aspect of the present invention, FIGS. 1C to 1E use four microdroplet generating units and a pumping unit connected to one touch button, but design by connecting more units to one touch button according to the user's use can do.
본 발명의 미세액적 생성기는 droplet 디지털 PCR을 위한 샘플 제조용 툴(tool)로 사용될 수 있다. The microdroplet generator of the present invention can be used as a sample preparation tool for droplet digital PCR.
본 발명의 일 양태에서는 PCR 튜브에 수집된 핵산을 포함하고 있는 미세액적들은 thermal cycling을 통해서 유전자 증폭이 일어나게 되고, 핵산을 포함하고 있는 미세액적들은 형광신호를 나타내게 되며, 형광신호가 나타난 미세액적의 개수를 분석하여 핵산이 얼마나 포함되어 있는지 절대정량법으로 분석할 수 있다(도 1F).In one aspect of the present invention, the microdroplets containing nucleic acids collected in the PCR tube undergo gene amplification through thermal cycling, and the microdroplets containing nucleic acids show a fluorescence signal. By analyzing the number of three droplets, the amount of nucleic acid contained can be analyzed by absolute quantification (FIG. 1F).
본 발명에 따른 미세액적 생성기는 도 1B 및 도 1F에 나타난 바와 같이, 총 4개의 층으로 이루어져 있고, 배출부 부분에 별도의 tubing을 연결하여 피펫의 기능을 부가할 수 있다. As shown in FIGS. 1B and 1F, the microdroplet generator according to the present invention consists of a total of four layers, and a pipette function can be added by connecting a separate tubing to the discharge part.
본 발명의 다른 양태에서는 도 2에 나타난 바와 같이, 미세액적 생성채널의 높이는 50㎛, 펌핑 유닛의 높이는 150㎛이며, 미세액적 생성부는 미세액적 생성을 위한 오일 주입부와 분석하고자 하는 물질(PCR mixture)의 주입부를 포함할 수 있으며, 도 2A의 붉은색 점선 박스를 확대해 보면 도 2B와 같이 오일 흐름과 PCR mixture 흐림이 십자 연결부(junction)을 구비하고 있다. 이 연결부에서 수용성 물질인 PCR mixture와 지용성 물질인 미세액적생성 오일 만나게 되는데, 두 성분이 서로 섞이지 않고 수용성물질의 표면장력으로 인해 미세액적이 형성되게 된다(기름 위에 물을 떨어뜨렸을 때 물방울이 형성되는 현상과 같음). 형성된 미세액적의 안정성을 위해 통상적으로 미세액적 생성용 지용성 액체(예를 들면, oil)는 별도의 계면활성제(surfactant)를 포함하고 있는 것이 바람직하며, 또한 수용성 물질의 유량과 지용성 물질의 유량 비율에 따라 생성된 미세액적의 크기가 달라진다. In another aspect of the present invention, as shown in FIG. 2, the height of the microdroplet generation channel is 50 μm and the height of the pumping unit is 150 μm, and the microdroplet generation unit includes an oil injection unit for generating microdroplets and a substance to be analyzed (PCR mixture) may include an injection part, and when the red dotted line box of FIG. 2A is enlarged, the oil flow and the PCR mixture blur have a cross junction as shown in FIG. 2B. At this junction, the PCR mixture, a water-soluble substance, and the microdroplet-generating oil, a fat-soluble substance, meet. same phenomenon). For the stability of the formed microdroplets, it is generally preferable that the oil-soluble liquid (eg, oil) for generating microdroplets contains a separate surfactant, and the ratio of the flow rate of the water-soluble material to the flow rate of the oil-soluble material Depending on the size of the generated microdroplet is different.
본 발명의 미세액적 생성기를 통해 생성된 미세액적은 도 2C에 나타난 바와 같이 비교적 균일한 크기를 가진다. The microdroplets generated through the microdroplet generator of the present invention have a relatively uniform size, as shown in FIG. 2C.
본 발명의 미세액적 생성기의 펌핑유닛의 작동원리는 도 3에 나타내었다. 펌핑유닛은 2개의 밸브와 하나의 작동챔버(Actuation chamber)로 구성되어 있으며, 밸브 1과 작동챔버는 터치버튼 작동을 통해 변화하는 공압채널(pneumatic channel)의 압력에 의해 직접적으로 작동하게 되고, 밸브 2는 터치버튼 작동을 통해 변화하는 유체채널(fluidic channel) 내의 압력에 의해 간접적으로 작동하게 된다. 먼저, 공압채널에 음압을 잡아주기 위해 터치버튼을 누른 상태로 vent hole을 막아주어 공압채널에 음압을 잡아준다. 버튼을 누르게 되면 밸브 1이 닫히고, 작동챔버가 수축하여 유체 채널 내부의 압력을 증가시키게 되며, 증가된 유체 채널 내부의 압력으로 인해 밸브 2가 열리게 되고, 작동 챔버 내부에 있던 유체가 배출부를 통해 빠져나가게 된다. 반대로 눌렀던 버튼을 높으면(release), 밸브 1이 열리고 작동챔버가 팽창하게 된다. 이로 인해 유체채널 내부의 압력이 낮아지게 되고, 밸브 2가 닫히게 된다. 따라서 미세액적 생성부에 음압이 가해지게 되고 이를 통해 성성된 미세액적들은 작동챔버에 모이게 된다. 이후에 다시 버튼을 누르면 작동 챔버에 모여있는 미세액적들이 배출부에 연결되어 있는 타이곤 튜브(tygon tube)를 통해 분석기기로 옮겨지게 된다. 터치버튼을 반복적으로 작동시켜 미세액적을 생성하고 미세액적을 분주할 수 있다. The operating principle of the pumping unit of the microdroplet generator of the present invention is shown in FIG. The pumping unit consists of two valves and one actuation chamber.
다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 미세액적의 제조방법에 관한 것이다:In another aspect, the present invention relates to a method for producing microdroplets comprising the following steps:
(a) 상기 미세액적 생성기의 접지부에 압력을 가해 공압채널의 공기를 배출시키고 공기배출부를 막아준 후, 접지부에 가해진 압력을 제거하여 공압채널에 음압을 형성시키는 단계;(a) applying pressure to the grounding part of the microdroplet generator to discharge air from the pneumatic channel, block the air discharge part, and remove the pressure applied to the grounding part to form a negative pressure in the pneumatic channel;
(b) 상기 미세액적 생성기의 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부에 지용성 액체 시료와 수용성 액체 시료를 각각 주입하는 단계; (b) injecting an oil-soluble liquid sample and a water-soluble liquid sample into the oil-soluble liquid-supporting part and the water-soluble liquid-supporting part of the microdroplet generator, respectively;
(c) 터치버튼에 외부 압력을 가하는 단계; (c) applying external pressure to the touch button;
(d) 상기 가해진 압력에 의하여 펌핑유닛의 제1 밸브와 작동챔버가 닫히면서 유체채널에 머물러 있던 공기가 제2밸브를 거쳐 배출부로 배출되는 단계;(d) closing the first valve of the pumping unit and the working chamber by the applied pressure and discharging the air remaining in the fluid channel to the discharge unit through the second valve;
(e) 터치버튼에 가해진 외부압력을 해지하는 단계;(e) releasing the external pressure applied to the touch button;
(f) 해지된 압력에 의해 제1 밸브와 작동챔버가 열리면서 지용성 액체와 수용성 액체가 미세액적 생성부를 거치며 미세액적이 생성되고 생성된 미세액적이 작동챔버에 모이는 단계; 및(f) opening the first valve and the operation chamber by the released pressure, allowing the oil-soluble liquid and the water-soluble liquid to pass through the microdroplet generating unit to generate microdroplets, and collecting the generated microdroplets in the operation chamber; and
(g) 상기 가해진 압력에 의하여 펌핑유닛의 제1 밸브와 작동챔버가 닫히면서 작동챔버에 모여있던 미세액적들이 제2밸브를 거쳐 배출부로 배출되는 단계.(g) the first valve of the pumping unit and the operation chamber are closed by the applied pressure, and the fine liquid droplets collected in the operation chamber are discharged to the discharge unit through the second valve.
본 발명의 도 4에는 터치버튼 누름과 놓음에 따라 각 구성부품에서 미세액적이 생성되고 있는 것을 나타내었다. 도 4A는 미세액적 생성부에서 수용성 유체 흐름(water flow)과 지용성 유체 흐름(oil flow)을 통해 미세액적이 생성되고는 과정을 나타내었으며, 도 4B는 펌핑유닛의 제1밸브, 작동챔버 및 제2밸브가 터치버튼 누름과 놓음에 개폐되면서, 생성된 미세액적이 파쇄되지 않고 배출부로 이동하고 있는 것을 나타내었다. 4 of the present invention shows that microdroplets are generated in each component according to pressing and releasing the touch button. 4A shows a process in which microdroplets are generated through a water soluble fluid flow and an oil flow in the microdroplet generating unit, and FIG. 4B shows a first valve of the pumping unit, an operating chamber, and As the second valve was opened and closed by pressing and releasing the touch button, it was shown that the generated microdroplets moved to the discharge unit without being crushed.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 미세액적 생성기는 다양한 크기의 미세액적을 생성할 수 있다. 오일 흐름과 물 흐름의 비율을 지용성 유체 채널의 길이는 고정하고, 수용성 액체의 채널의 길이를 변화시키거나, 미세액적 생성 채널의 폭을 조절하는 경우, 다양한 크기의 미세액적을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다(도 5A 및 도 5B).In another aspect of the present invention, the microdroplet generator of the present invention can generate microdroplets of various sizes. When the ratio of the oil flow to the water flow is fixed, the length of the oil-soluble fluid channel is changed, the length of the water-soluble liquid channel is changed, or the width of the microdroplet generation channel is adjusted, microdroplets of various sizes can be obtained. It was confirmed (FIGS. 5A and 5B).
따라서, 본 발명의 지용성 유체(Oil flow) 채널의 길이와 수용성 유체(water flow) 채널의 길이 비율은 1: 0.1~1:10일 수 있으며, 바람직하게는 1:1~1:4일 수 있다.Therefore, the ratio of the length of the oil flow channel and the length of the water flow channel of the present invention may be 1:0.1 to 1:10, preferably 1:1 to 1:4. .
본 발명에 있어서, 미세액적 생성 채널의 폭은 10~200㎛일 수 있으며, 바람직하게는 30~100㎛일 수 있다. In the present invention, the width of the microdroplet generating channel may be 10 to 200 μm, preferably 30 to 100 μm.
또한, 수용성 유체 채널의 길이기 증가함에 따라 생성된 미세액적의 크기가 감소하였고, 채널 폭이 증가함에 따라 미세액적의 크기가 증가하였다(도 5C 및 도 5D). 또한, 작동 챔버의 부피가 증가함에 따라 전체적인 유량은 증가하지만, 지용성 유체 채널과 수용성 유체 채널의 유량비율은 변하지 않으므로, 일정한 크기의 미세액적이 형성되는 것을 확인하였다 (도 5E). In addition, as the length of the aqueous fluid channel increased, the size of the generated microdroplets decreased, and as the channel width increased, the size of the microdroplets increased (FIGS. 5C and 5D). In addition, although the overall flow rate increased as the volume of the working chamber increased, the flow rate ratio between the oil-soluble fluid channel and the water-soluble fluid channel did not change, confirming that microdroplets of a constant size were formed (FIG. 5E).
본 발명의 일 양태에서는 Biorad 사의 미세액적 생성기(QX200)에서 생성되는 미세액적과 비슷한 크기의 미세액적을 생성할 수 있도록 본 발명의 미세액적 생성기의 생성채널을 디자인하고, 수용성 유체로 PCR mixture를 이용하여, 생성되는 미세액적을 QX200에서 생성되는 미세액적과 비교한 결과, 본 발명의 미세액적 생성기를 통해 생성된 미세액적과 QX200에서 생성된 미세액적의 크기에 차이가 없었는 것을 확인하였다(도 6). In one aspect of the present invention, the production channel of the microdroplet generator of the present invention is designed to generate microdroplets of a similar size to the microdroplets produced by Biorad's microdroplet generator (QX200), and the PCR mixture as a water-soluble fluid As a result of comparing the generated microdroplets with the microdroplets generated by the QX200 using , it was confirmed that there was no difference in size between the microdroplets generated through the microdroplet generator of the present invention and the microdroplets generated by the QX200 ( Fig. 6).
본 발명의 다른 양태에서는 도 7과 같이 PCR mixture를 본 발명에 따른 미세액적 생성기와 Biorad 사의 미세액적 생성기(QX200)를 이용하여 미세액적으로 만들고, 디지털 PCR을 진행하고, signal analyzer에서 분석한 DNA 카피 수를 비교하는 경우, 발명에 따른 미세액적 생성기를 통해 분석한 값과 기존방법(QX200 & Automatic pipetting)을 사용하여 분석한 값이 거의 일치하는 것을 확인할 수 있었다(도 8E).In another aspect of the present invention, as shown in FIG. 7, the PCR mixture is made into microdroplets using the microdroplet generator according to the present invention and the microdroplet generator (QX200) of Biorad, digital PCR is performed, and analysis in a signal analyzer When comparing the number of copies of one DNA, it was confirmed that the value analyzed using the microdroplet generator according to the present invention and the value analyzed using the conventional method (QX200 & Automatic pipetting) were almost identical (FIG. 8E).
따라서, QX200과 같은 종래의 값비싸고 부피가 큰 미세액적 생성기와 자동 피펫팅 또는 수동의 정교한 피펫팅을 본 발명의 미세액적 생성기가 대체하여 분자진단기기 간소화에 기여할 수 있을 것으로 판단된다. Therefore, it is believed that the microdroplet generator of the present invention can contribute to the simplification of molecular diagnostic devices by replacing expensive and bulky microdroplet generators such as the QX200 and automatic or manual sophisticated pipetting.
[실시예][Example]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1: 본 발명의 미세액적 생성기를 이용한 다양한 크기의 미세액적 생성 확인Example 1: Confirmation of generation of microdroplets of various sizes using the microdroplet generator of the present invention
미세액적 생성용 오일과 물을 이용하여 다양한 크기의 미세액적을 제작 가능한 지 확인하였다. It was confirmed whether microdroplets of various sizes could be produced using oil and water for microdroplet generation.
지용성 유체(Oil flow)와 수용성 유체(water flow)의 비율을 지용성 유체 채널의 길이는 고정하고, 수용성 유체 채널의 길이를 변화시키거나, 미세액적 생성 채널의 폭을 조절하여 미세액적을 생성시켰다. The ratio of oil flow and water flow was fixed, the length of the oil-soluble fluid channel was changed, or the width of the microdroplet generation channel was adjusted to generate microdroplets. .
그 결과, 도 5A 및 도 5B에 나타난 바와 같이, 수용성 유체 채널의 길이를 변화시키거나, 미세액적 생성 채널의 폭을 조절하는 경우, 다양한 크기의 미세액적을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIGS. 5A and 5B , it was confirmed that microdroplets of various sizes could be obtained by changing the length of the water-soluble fluid channel or adjusting the width of the microdroplet generating channel.
아울러, 지용성 유체 채널의 길이 변화에 따른 미세액적의 크기를 확인한 결과, 도 5C에 나타난 바와 같이, 수용성 유체 채널의 길이기 증가함에 따라 생성된 미세액적의 크기가 감소하였다. In addition, as a result of confirming the size of the microdroplet according to the change in the length of the fat-soluble fluid channel, as shown in FIG. 5C, the size of the generated microdroplet decreased as the length of the water-soluble fluid channel increased.
또한, 유체채널의 폭을 50㎛, 75㎛ 및 100㎛로 변화시켰을 때 미세액적의 크기를 확인한 결과, 도 5D에 나타난 바와 같이, 채널 폭이 증가함에 따라 증가하는 것을 확인하였다. In addition, when the width of the fluidic channel was changed to 50 μm, 75 μm, and 100 μm, the size of the microdroplet was confirmed to increase as the channel width increased, as shown in FIG. 5D.
또한, 작동 챔버의 부피(volume)를 달리하여 형성된 미세액적의 크기를 비교하였다. In addition, the sizes of microdroplets formed by varying the volume of the operating chamber were compared.
그 결과, 도 5E에 나타난 바와 같이, 작동챔버의 부피와 미세액적의 직경은 특별한 관련성을 나타내지 않았으며, 작동챔버의 부피가 증가함에 따라 전체적인 유량은 증가하지만, 지용성 유체 채널과 수용성 유체 채널의 유량비율은 변하지 않으므로, 일정한 크기의 미세액적이 형성되는 것으로 확인되었다. As a result, as shown in FIG. 5E, the volume of the working chamber and the diameter of the microdroplet did not show a particular relationship, and the overall flow rate increased as the volume of the working chamber increased, but the flow rate of the oil-soluble fluid channel and the water-soluble fluid channel Since the ratio did not change, it was confirmed that microdroplets of a constant size were formed.
실시예 2: 종래 미세액적 생성기와 본 발명에 따른 미세액적 생성기의 미세액적 생성능 비교Example 2: Comparison of microdroplet generating ability between the conventional microdroplet generator and the microdroplet generator according to the present invention
디지털 PCR 분석에 사용되는 BioRad 사의 signal analyzer를 사용하기 위해서는 특정 크기의 미세액적을 이용해야 하며, 종래에는 Biorad 사의 미세액적 생성기(QX200)를 통해 생성되는 미세액적을 사용해 왔다. 본 실시예에서는 Biorad 사의 미세액적 생성기(QX200)에서 생성되는 미세액적과 비슷한 크기의 미세액적을 생성할 수 있도록 본 발명의 미세액적 생성기의 생성채널을 디자인하고, 수용성 유체로 PCR mixture (2x EvaGreen Supermix (BioRad), Forward & Reverse primer)를 이용하여, 생성되는 미세액적을 QX200에서 생성되는 미세액적과 비교하였다. In order to use BioRad's signal analyzer used for digital PCR analysis, it is necessary to use microdroplets of a specific size, and conventionally, microdroplets generated through Biorad's microdroplet generator (QX200) have been used. In this embodiment, the generation channel of the microdroplet generator of the present invention is designed to generate microdroplets of a similar size to the microdroplets produced by Biorad's microdroplet generator (QX200), and the PCR mixture (2x) is used as a water-soluble fluid. Microdroplets generated using EvaGreen Supermix (BioRad, Forward & Reverse primer) were compared with those generated by QX200.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미세액적 생성기를 통해 생성된 미세액적(도 6A)과 QX200에서 생성된 미세액적(도 6B)의 크기에 차이가 없었으며, 또한, 본 발명의 미세액적 생성기의 각 유닛에서 생성된 미세액적의 크기에서도 별차이가 없는 것을 확인하였다(도 6C). As a result, as shown in FIG. 6, there was no difference in the size of the microdroplets (FIG. 6A) generated by the microdroplet generator of the present invention and the microdroplets (FIG. 6B) generated by the QX200, and also, It was confirmed that there was no significant difference in the size of the microdroplets generated in each unit of the microdroplet generator of the present invention (FIG. 6C).
실시예 3: 본 발명에 따른 미세액적 생성기를 이용한 PCR 분석Example 3: PCR analysis using the microdroplet generator according to the present invention
본 실시예에서는 본 발명에 따른 미세액적 생성기에서 PCR mixture를 미세액적으로 만들어 디지털 PCR 분석을 수행하였다. In this embodiment, digital PCR analysis was performed by making the PCR mixture into microdroplets in the microdroplet generator according to the present invention.
다양한 농도의 대장균 O157:H7의 게놈 DNA를 이용하여 digital PCR을 진행하였으며, 대조군으로 QX200 미세액적 생성기(BioRad, 미국)를 사용하였다(도 7). Digital PCR was performed using genomic DNA of E. coli O157:H7 at various concentrations, and a QX200 microdroplet generator (BioRad, USA) was used as a control (FIG. 7).
QX200을 통해 생성된 미세액적을 자동 피펫팅을 통해 PCR 튜브로 옮겨주어 디지털 PCR을 진행한 결과값(도 8B)과, 본 발명에 따른 미세액적 생성기를 통해 배출된 미세액적을 PCR 튜브에 로딩하여, 디지털 PCR을 진행한 결과값(도 8A)을 비교하였다. 그 결과, DNA 농도가 증가함에 따라 신호를 나타내는 미세액적(파란색) 의 개수가 증가하였고 신호를 나타내지 않는 미세액적(회색)의 개수는 감소하였다.Microdroplets generated through the QX200 were transferred to a PCR tube through automatic pipetting, and digital PCR was performed (Fig. 8B), and the microdroplets discharged through the microdroplet generator according to the present invention were loaded into the PCR tube. Then, the results obtained by digital PCR (FIG. 8A) were compared. As a result, as the DNA concentration increased, the number of microdroplets (blue) exhibiting a signal increased, and the number of microdroplets (grey) not exhibiting a signal decreased.
20㎕의 PCR mixture를 주입부에 로딩해 주었고 분석된 미세액적의 개수를 비교해 보면 본 발명의 미세액적 생성기에서 소량의 미세액적 손실이 발생하는 것을 확인하였다(도 8C). 그러나 양성 시그널을 나타낸 미세액적의 비율은 큰 차이가 없었다(도 8D). 이를 기반으로 signal analyzer에서 분석한 DNA 카피 수를 비교해 보면, 도 8의 E에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 미세액적 생성기를 통해 분석한 값과 기존방법(QX200 & Automatic pipetting)을 사용하여 분석한 값이 거의 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 20 μl of the PCR mixture was loaded into the injection unit, and when the number of analyzed microdroplets was compared, it was confirmed that a small amount of microdroplet loss occurred in the microdroplet generator of the present invention (FIG. 8C). However, there was no significant difference in the ratio of microdroplets showing positive signals (FIG. 8D). Based on this, when comparing the number of DNA copies analyzed by the signal analyzer, as shown in E of FIG. 8, the value analyzed through the microdroplet generator according to the present invention and the existing method (QX200 & Automatic pipetting) It was found that the values were almost identical.
따라서, QX200과 같은 종래의 값비싸고 부피가 큰 미세액적 생성기와 자동 피펫팅 또는 수동의 정교한 피펫팅을 본 발명의 미세액적 생성기가 대체하여 분자진단기기 간소화에 기여할 수 있을 것으로 판단된다. Therefore, it is believed that the microdroplet generator of the present invention can contribute to the simplification of molecular diagnostic devices by replacing expensive and bulky microdroplet generators such as the QX200 and automatic or manual sophisticated pipetting.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it will be clear to those skilled in the art that these specific descriptions are merely preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (9)
(a) 접지부를 구비하고, 접지부를 누르는 압력에 의하여 공압채널의 공기 흐름을 생성시키는 터치버튼;
(b) 상기 터치버튼과 연결되고, 상기 터치버튼에 가해지는 압력에 의하여 공기가 이동하는 공압채널이 형성되어 있는 공압채널 층;
(c) 상기 공압채널 층의 상부에 위치하며, 공기흐름에 의하여 개폐가 조절되는 작동챔버, 제1공압밸브 및 제2 공압밸브가 개폐되도록 하는 폴리머 박막층;
(d) 상기 폴리머 박막층의 상부에 위치하고, 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부를 구비하고 상기 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부의 액체가 혼합되면서 유체 채널로 이동하도록 하는 미세액적 생성부; 공기흐름에 의하여 개폐가 조절되는 작동챔버; 제1 공압밸브; 및 제2 공압밸브로 구성되는 펌핑유닛; 상기 미세액적 생성부에서 이동된 유체가 제1공압밸브, 작동챔버 및 제 2공압밸브의 순서를 거처 배출부로 이동하면서 최종적으로 미세액적이 형성되도록 하는 유체채널이 구비된 유체 채널층; 및
(e) 유체 채널층의 상부에 위치하고, 접지되는 터치버튼의 상판을 형성하는 덮개층.
여기서, 상기 터치버튼의 압력이 해제되는 경우, 제1공압밸브가 열리고 작동챔버는 팽창되고, 제2공압밸브는 잠겨 주입부에 있던 유체가 흘러 미세액적 생성부를 통해 생성된 미세액적들이 작동챔버에 채워지고; 터치버튼에 압력이 가해지는 경우, 제1공압밸브는 닫히고, 작동챔버는 수축되고, 제2공압밸브는 열려 상기 작동챔버에 머물러 있던 미세액적을 포함하는 액체가 배출부로 배출되는 것을 특징으로 함.
A touch button-operated microfluidic-based microdroplet generator comprising the following;
(a) a touch button having a grounding part and generating an air flow in a pneumatic channel by pressing the grounding part;
(b) a pneumatic channel layer connected to the touch button and formed with a pneumatic channel through which air moves by the pressure applied to the touch button;
(c) a polymer film layer located on the upper part of the pneumatic channel layer and opening and closing the operation chamber controlled by the air flow, and opening and closing the first pneumatic valve and the second pneumatic valve;
(d) a microdroplet generating unit located on the upper part of the polymer thin film layer, having an oil-soluble liquid-supporting part and a water-soluble liquid-supporting part, and allowing the liquid of the oil-soluble liquid-supporting part and the water-soluble liquid-bearing part to move into a fluid channel while being mixed; an operating chamber whose opening and closing is controlled by air flow; a first pneumatic valve; And a pumping unit consisting of a second pneumatic valve; a fluid channel layer provided with a fluid channel through which the fluid moved from the microdroplet generating unit moves to the discharge unit through the first pneumatic valve, the operation chamber, and the second pneumatic valve in order so that microdroplets are finally formed; and
(e) a cover layer located on top of the fluid channel layer and forming an upper plate of a touch button that is grounded;
Here, when the pressure of the touch button is released, the first pneumatic valve opens, the operation chamber expands, and the second pneumatic valve closes, allowing the fluid in the inlet to flow and the microdroplets generated through the microdroplet generator to operate. filled in the chamber; When pressure is applied to the touch button, the first pneumatic valve is closed, the operation chamber is contracted, and the second pneumatic valve is opened to discharge the liquid containing the microdroplets remaining in the operation chamber to the discharge unit.
The micro-droplet generator according to claim 1, wherein the opening and closing of the first pneumatic valve, the operation chamber, and the second pneumatic valve are performed by compressing and decompressing the polymer thin film.
The microdroplet generator according to claim 1, wherein the polymer of the polymer thin film is selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), linear low-density polyethylene (LLD-PE), and rubber.
The microdroplet generator according to claim 1, wherein the oil-soluble liquid further comprises a surfactant.
The micro-droplet generator according to claim 1, wherein a separate reaction tube is connected to the discharge unit.
The microfluid according to claim 1, wherein the micro-droplet generating unit has a junction where a channel connected to the oil-soluble liquid-supporting unit and a channel connected to the water-soluble liquid-supporting unit meet, and the junction is connected to the pumping unit. enemy spawner.
The micro-droplet generator according to claim 1, wherein one or more micro-droplet generators and a pumping unit are connected to one touch button.
(a) 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미세액적 생성기의 접지부에 압력을 가해 공압채널의 공기를 배출시키고 공기배출부를 막아준 후, 접지부에 가해진 압력을 제거하여 공압채널에 음압을 형성시키는 단계;
(b) 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미세액적 생성기의 지용성 액체 담지부와 수용성 액체 담지부에 지용성 액체 시료와 수용성 액체 시료를 각각 주입하는 단계;
(c) 터치버튼에 외부 압력을 가하는 단계;
(d) 상기 가해진 압력에 의하여 펌핑유닛의 제1 공압밸브와 작동챔버가 닫히면서 유체채널에 머물러 있던 공기가 제2 공압밸브를 거쳐 배출부로 배출되는 단계;
(e) 터치버튼에 가해진 외부압력을 해지하는 단계;
(f) 해지된 압력에 의해 제1 공압밸브와 작동챔버가 열리면서 지용성 액체와 수용성 액체가 미세액적 생성부를 거치며 미세액적이 생성되고 생성된 미세액적이 작동챔버에 모이는 단계; 및
(g) 상기 가해진 압력에 의하여 펌핑유닛의 제1 공압밸브와 작동챔버가 닫히면서 작동챔버에 모여있던 미세액적들이 제2 공압밸브를 거쳐 배출부로 배출되는 단계.A method for producing microdroplets comprising the following steps;
(a) Apply pressure to the grounding part of the microdroplet generator according to any one of claims 1 and 3 to 8 to discharge air from the pneumatic channel, block the air discharge part, and then remove the pressure applied to the grounding part forming a negative pressure in the pneumatic channel;
(b) injecting a fat-soluble liquid sample and a water-soluble liquid sample into the oil-soluble liquid-supporting part and the water-soluble liquid-supporting part of the microdroplet generator according to any one of claims 1 and 3 to 8, respectively;
(c) applying external pressure to the touch button;
(d) closing the first pneumatic valve and the working chamber of the pumping unit by the applied pressure and discharging the air remaining in the fluid channel through the second pneumatic valve to the discharge unit;
(e) releasing the external pressure applied to the touch button;
(f) the first pneumatic valve and the operating chamber are opened by the released pressure, and the oil-soluble liquid and the water-soluble liquid pass through the microdroplet generating unit to generate the microdroplets and collect the generated microdroplets in the operating chamber; and
(g) the first pneumatic valve of the pumping unit and the working chamber are closed by the applied pressure, and the fine droplets collected in the working chamber are discharged to the discharge unit through the second pneumatic valve.
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