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KR102511979B1 - 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법 - Google Patents

변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR102511979B1
KR102511979B1 KR1020227018427A KR20227018427A KR102511979B1 KR 102511979 B1 KR102511979 B1 KR 102511979B1 KR 1020227018427 A KR1020227018427 A KR 1020227018427A KR 20227018427 A KR20227018427 A KR 20227018427A KR 102511979 B1 KR102511979 B1 KR 102511979B1
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데이비드 브이. 샤퍼
죤 지. 플래너리
윌리엄 에이. 벨트란
리 씨. 번
마이케 비셀
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

본 개시내용은 변경된 캡시드 단백질을 갖는 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 비리온을 제공하되, 상기 AAV 비리온을 야생형 AAV와 비교하여 망막 세포의 더 큰 감염성을 나타낸다. 본 개시내용은 또한, 개체에서 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법, 및 안구 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법 {ADENO-ASSOCIATED VIRUS VIRIONS WITH VARIANT CAPSID AND METHODS OF USE THEREOF}
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교차-참조
본원은 미국 특허 가출원 번호 62/368,929(2016년 7월 29일 출원)의 이점을 주장하며, 상기 공보는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입되어 있다.
연방 지원된 연구에 관한 서술
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 계약/수여 번호 EY022975, EY018241 및 EY06855 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리는 갖는다.
광수용체는, 광변조를 통해 가시 전자기 복사를 과분극된 응답으로 전환시키는, 시각 정보를 수용 및 처리하기 위한 망막내 제1 뉴런이다. 유전성 망막 질환의 압도적 다수는 로돕신 단백질 폴딩에 영향을 미치는 우세한 돌연변이처럼 직접적으로, 또는 망막 색소 상피(RPE)의 망막 재활용 경로에 영향을 미치는 열성 돌연변이처럼 간접적으로 이러한 세포들의 손실을 초래한다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 파보비리다애 과 및 데펜도바이러스 속에 속하며, 그 구성원은 복제를 촉진시키기 위해 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와 함께 공-감염되어야 하며, AAV는 헬퍼의 부재 하에서 잠복성 감염을 설정한다. 비리온은 2개의 개방형 판독 프레임: rep 및 cap이 있는 4.9 kb 단일-가닥 DNA 게놈을 포괄하는 25 nm 이십면체 캡시드로 구성된다. 비-구조적 rep 유전자는 바이러스 복제에 필수적인 4개의 조절 단백질을 인코딩하고, 반면 cap은 60-mer 캡시드 쉘로 조립되는 3개의 구조 단백질(VP1-3)을 인코딩한다. 이러한 바이러스 캡시드는 세포 표면 수용체 결합, 내포작용, 세포내 교환, 및 핵에서 언패키징을 포함하는 - 바이러스 형질도입의 생물학적 장벽의 다수를 극복하기 위해 AAV 벡터의 능력을 매개한다.
본 개시내용은 재조합 변경된 캡시드 단백질을 갖는 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 비리온을 제공하되, 상기 재조합 AAV (rAAV) 비리온은 야생형 AAV와 비교하여 망막 세포의 더 큰 감염성을 나타내고, 그리고 상기 rAAV 비리온은 이종성 핵산을 포함한다. 본 개시내용은 추가로, 개체에서 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법, 및 안구 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 rAAV 비리온을 제공하되, 상기 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의해, 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 또는 망막 색소 상피에 대한 국제화의 정도와 비교하여, 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 및 망막 색소 상피 중 하나 이상에 대해 적어도 5-배수 증가된 국재화를 나타낸다.
도 1는 친계 AAV와 비교하여 안구 세포 (예를 들어, 망막 세포)의 증가된 감염성을 나타내는 AAV 변이체를 개발하기 위해 사용된 직접 진화 방법의 도식적 묘사이다.
도 2는 녹색 형광 단백질 (GFP)-바코드 작제물을 함유하는 AAV 변이체의 심화 서열분석의 도식적 묘사이다.
도 3은 18-구성원 AAV 변이체 라이브러리에 의해, 신경절 세포 층, 내부 핵 층, 광수용체 층, 및 망막 색소 상피 (RPE) 층에서 세포의 감염을 도시한다.
도 4는 AAV2 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열을 제공한다. 아미노산 587 내지 588 (NP)은 굵고 밑줄쳐져 있다.
도 5는 다양한 AAV 혈청형의 AAV 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 570-610에 상응하는 아미노산 서열을 제공한다.
도 6A-6C는 AAV 캡시드 단백질 루프 IV (GH 루프) 영역의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다. 삽입 부위는 굵은 밑줄로 나타낸다. AAV1: 서열번호:35; AAV6: 서열번호:36; AAV3: 서열번호:37; AAV2: 서열번호:38; AAV8: 서열번호:39; AAV8.1: 서열번호:40; AAV8 rh8: 서열번호:41; AAV10: 서열번호:42; AAV7: 서열번호:43; AAV9: 서열번호:44; AAV 9.1: 서열번호:45; AAV5: 서열번호:46.
도 7A-7V는 예시적인 이종성 유전자 산물의 아미노산 서열을 제공한다.
도 8A- 8C는의 아미노산 서열을 제공한다 예시적인 가이드-RNA-지향된 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열을 제공한다.
정의
용어 "망막 세포"는 본 명세서에서, 망막, 예컨대 망막 신경절 세포; 무축삭 세포; 수평 세포; 두극 세포; 간상 및 원뿔을 포함하는 광수용체 세포; 뮐러 신경교 세포; 별아교세포 (예를 들어, 망막 별아교세포); 및 망막 색소 상피를 포함하는 세포 유형 중 임의의 것을 지칭할 수 있다.
"AAV"는 아데노-관련된 바이러스에 대한 약어이고, 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고 모든 하위유형 및 자연 발생 및 재조합 형태 둘 모두를 포함한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-관련된 바이러스, 또한 일명 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")을 지칭한다. 용어 "AAV"는 AAV 1형 (AAV-1), AAV 2형 (AAV-2), AAV 유형 3 (AAV-3), AAV 유형 4 (AAV-4), AAV 유형 5 (AAV-5), AAV 유형 6 (AAV-6), AAV 유형 7 (AAV-7), AAV 유형 8 (AAV-8), AAV 유형 9 (AAV-9), 조류 AAV, 소과 AAV, 갯과 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV을 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류로부터 단리된 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물 로부터 단리된 AAV르르 지칭하고, "소과 AAV"는 소과 포유동물 (예를 들어, 소), 등 로부터 단리된 AAV를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오타이드 서열 (즉, AAV에 대해 이종성인 폴리뉴클레오타이드), 전형적으로 세포의 유전적 전환을 위한 관심 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나에 의해 측접되고, 그리고 일반적으로 2종의 AAV 역전된 말단 반복 서열 (ITRs)에 의해 측접된다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드 둘 모두를 포괄한다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 (전형적으로 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의한) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉 야생형 AAV 게놈, 예컨대 포유동물 세포로 전달될 이식유전자 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하면, 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"로 칭한다. 따라서, rAAV 입자의 생산은 반드시 rAAV 벡터의 생산을 포함하는데, 그와 같은 벡터는 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.
"패키징"은 AAV 입자의 어셈블리 및 캡시드화를 초래하는 일련의 세포내 사건을 지칭한다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-관련된 바이러스의 복제 및 캡시드화 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본 명세서에서 일명 AAV "패키징 유전자"이다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는, AAV (예를 들어 야생형 AAV)가 포유동물 세포에 의해 복제 및 포장될 수 있는 바이러스를 지칭한다. AAV에 대한 다양한 그와 같은 헬퍼 바이러스는 당해 기술에 공지되어 있고, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스 예컨대 백시니아를 포함한다. 아데노바이러스는 수많은 상이한 하위그룹을 포괄하지만, 하위그룹 C의 아데노바이러스 유형 5는 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스는 공지되어 있고 보관소 예컨대 ATCC로부터 이용가능하다. 헤르페스 계열의 바이러스는, 예를 들어, 단순 포진 바이러스 (HSV) 및 엡슈타인-바르 바이러스 (EBV), 뿐만 아니라 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 가성광견병 바이러스 (PRV)을 포함하는데; 이들은 또한 보관소 예컨대 ATCC로부터 이용가능하다.
"헬퍼 바이러스 기능(들)"는 (본 명세서에 기재된 복제 및 패키징에 대한 다른 요건과 관련하여) AAV 복제 및 패키징을 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈 에서 인코딩된 기능(들)을 지칭한다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 헬퍼 바이러스를 제공하거나 또는, 예를 들어, 트랜스에서 생산제 세포에 대한 필수 기능(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것을 포함하여 수 많은 방법으롤 제공될 수 있다.
"감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는, 바이러스성 종이 굴성인 세포에 전달할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 성분을 포함하는 것이다. 상기 용어가 바이러스의 임의의 복제 수용력을 반드시 암시하는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는 표적 세포에 접근하고, 표적 세포를 감염시키고 그리고 표적 세포에서 이종성 핵산을 발현시킬 수 있는 것이다. 따라서, "감염성"는 표적 세포에 접근하고, 표적 세포를 감염시키고 그리고 표적 세포에서 이종성 핵산을 발현시키기 위한 바이러스 입자의 능력을 지칭한다. 감염성은 시험관내 감염성 또는 생체내 감염성을 지칭할 수 있다. 감염성 바이러스성 입자를 계수하기 위한 검정은 본 개시내용의 다른 곳에 그리고 기술 분야에 기재되어 있다. 바이러스성 감염성은 감염성 바이러스성 입자 대 총 바이러스성 입자의 비로서 표현될 수 있다. 총 바이러스성 입자는 바이러스 게놈 (vg) 복제물의 수로 표현될 수 있다. 세포에서 이종성 핵산을 발현시키기 위한 바이러스 입자의 능력은 "형질도입"으로 칭할 수 있다. 세포에서 이종성 핵산을 발현시키기 위한 바이러스 입자의 능력은 마커 유전자의 평가, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP) 검정 (예를 들어, 상기 바이러스는 뉴클레오타이드 서열 인코딩 GFP을 포함하는, 경우, GFP는 바이러스 입자로 감염된 세포에서 생산되고 검출되고/거나 측정되는 경우; 또는 예를 들어 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 생상된 단백질의 측정으르 포함하는 수많은 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 바이러스성 감염성은 감염성 바이러스성 입자 대 총 바이러스성 입자의 비로서 표현될 수 있다. 감염성 바이러스 입자 대 총 바이러스 입자의 비를 결정하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고, 예를 들어, Grainger 등 (2005) Mol . Ther . 11:S337 (TCID50 감염성 역가 검정을 기재함); 및 Zolotukhin 등 (1999) Gene Ther . 6:973.
"복제 가능" 바이러스 (예를 들어 복제 가능 AAV)는 감염성이고, (즉 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 기능의 존재에서) 감염된 세포에서 복제될 수 있는 표현형 야생형 바이러스를 지칭한다. AAV의 경우에, 복제 능숙도는 일반적으로 기능적 AAV 패키징 유전자의 존재를 필요로 한다. 일반적으로, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 패키징 유전자의 결여 때문에 포유동물 세포에서 (특히 인간 세포에서) 복제 불능이다. 전형적으로, 그와 같은 rAAV 벡터는, 복제 가능 AAV이 AAV 패키징 유전자와 유입 rAAV 벡터 사이의 재조합에 의해 생성된 가능성을 최소화하기 위해 임의의 AAV 패키징 유전자 서열이 결여되어 있다. 많은 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 제조는, 있다면, 임의의 복제 가능 AAV를 거의 함유하지 않는 것들이다 (rcAAV, 또한 일명 RCA) (예를 들어, 약 1 rcAAV/102 rAAV 미만의 입자, 약 1 rcAAV/104 rAAV 미만의 입자, 약 1 rcAAV/108 rAAV 미만의 입자, 약 1 rcAAV/1012 rAAV 미만의 입자, 또는 rcAAV 없음).
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 그것의 유사체를 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변경은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 폴리뉴클레오타이드는, 상호교환적으로 이중- 및 단일가닥 분자를 지칭한다. 달리 구체화되지 않거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 구현예는 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예상된 이중-가닥 형태 및 각각의 2종의 상보적 단일가닥 형태 둘 모두를 포괄한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는, 정렬된 경우, 염기 또는 아미노산의 백분율이 2개의 서열을 비교하는 경우, 동일하다는 것을 의미하는, 또 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 특정 비율의 "서열 동일성"을 갖는다. 서열 유사성은 여러 가지 다른 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열은, ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 월드와이드웹으로 이용가능한, BLAST를 포함하는, 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정렬될 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은, Oxford Molecular Group, Inc.의 전체 지분 보유 자회사인, Madison, Wisconsin, USA로부터, Genetics Computing Group (GCG) 패키지에서 이용가능한, FASTA이다. 다른 정렬 기술은 하기에서 기재된다: Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. 특히 흥미로운 것은 서열에서 갭을 허용하는 정렬 프로그램이다. Smith-Waterman은 서열 정렬에서 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다. 참조 Meth . Mol . Biol . 70: 173-187 (1997). 또한, Needleman 및 Wunsch 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램은 서열을 정렬하는데 이용될 수 있다. 참조 J. Mol . Biol. 48: 443-453 (1970)
관심 대상은 서열 동일성을 얻기 위해 Smith Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘 을 사용하는 BestFit 프로그램이다. 갭 생성 페널티는 일반적으로 1 내지 5, 일반적으로 2 내지 4의 범위일 것이고, 많은 구현예에서 3일 것이다. 갭 연장 패널티는 일반적으로 약 0.01 내지 0.20의 범위일 것이고, 많은 사례에서 0.10일 것이다. 프로그램은 비교하기 위해 입력된 서열에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 프로그램에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 이러한 프로그램은 또한 Genetics Computing Group (GCG) 패키지 (Madison, Wisconsin, USA)로부터 이용가능하다.
관심 또 다른 프로그램은 FastDB 알고리즘이다. FastDB는 하기에 기재된다: Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc. 퍼센트 서열 동일성은 하기 파라미터를 기반으로 하는 FastDB에 의해 계산된다:
미스매치 페널티: 1.00;
갭 페널티: 1.00;
갭 크기 페널티: 0.33; 및
결합 페널티: 30.0.
"유전자"는 전사되고 번역된 후 특정 단백질을 인코딩할 수 있는 적어도 하나의 열린 해독틀 을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
용어 "가이드 RNA"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하기를 포함하는 RNA를 지칭한다: i) 가이드 RNA-지향된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 예컨대 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제)에 결합하고 RNA-지향된 엔도뉴클레아제를 활성화시키는 "활성제" 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) 표적 핵산과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "타겟터" 뉴클레오타이드 서열. "활성제" 뉴클레오타이드 서열 및 "타겟터" 뉴클레오타이드 서열은 별개의 RNA 분자 (예를 들어, "이중-가이드 RNA") 상에 있을 수 있거나; 또는 동일한 RNA 분자 ("단일-가이드 RNA") 상에 있을 수 있다.
"작은 간섭하는" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 siRNA는 관심 유전자 ("표적 유전자")에 표적화된 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 2개의 영역 사이의 상보적 짝짓기에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는, siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오타이드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적이라는 점에서 유전자에 대해 "표적화된다". 일부 구현예에서, siRNA의 듀플렉스의 길이는 30 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 구현예에서, 듀플렉스는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 길이는 19-25 개의 뉴클레오타이드이다. RNA siRNA의 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 듀플렉스 부분 외에, 헤어핀 구조는 듀플렉스를 형성하는 2개의 서열 사이에 배치된 루프부를 함유할 수 있다. 루프는 그 길이가 변할 수 있다. 일부 구현예에서 루프는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 개의 뉴클레오타이드. 헤어핀 구조는 또한 3' 또는 5' 돌출부를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌출부는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 뉴클레오타이드의3' 또는 5' 돌출부이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "microRNA"는 내인성 microRNA 및 인공 microRNA (예를 들어, 합성 miRNA)를 비제한적으로 포함하는 임의의 유형의 간섭 RNA를 지칭한다. 내인성 microRNA은 mRNA의 생산적 이용을 조절할 수 있는 게놈에서 자연 인코딩된 작은 RNA 이다. 인공 microRNA는 mRNA의 활성을 조절할 수 있는, 내인성 microRNA 이외의 임의의 유형의 RNA 서열 일 수 있다. microRNA 서열은 이들 서열 중 하나 이상으로 구성된 RNA 분자일 수 있다. MicroRNA (또는 "miRNA") 서열은 하기의 예의 공보에서 기재되었다: Lim, 등, 2003, Genes & Development, 17, 991-1008, Lim 등, 2003, Science, 299, 1540, Lee 및 Ambrose, 2001, Science, 294, 862, Lau 등, 2001, Science 294, 858-861, Lagos-Quintana 등, 2002, Current Biology, 12, 735-739, Lagos-Quintana 등, 2001, Science, 294, 853-857, 및 Lagos-Quintana 등, 2003, RNA, 9, 175-179. microRNA의 예는 더 큰 RNA의 단편이거나 miRNA, siRNA, stRNA, sncRNA, tncRNA, snoRNA, smRNA, shRNA, snRNA, 또는 다른 작은 비-코딩 RNA인 임의의 RNA을 포함한다. 참고, 예를 들어, US 특허 출원 20050272923, 20050266552, 20050142581, 및 20050075492. "microRNA 전구체" (또는 "pre-miRNA")는 본 명세서에 편입된 microRNA 서열을 갖는 스템-루프 구조를 갖는 핵산을 지칭한다. "성숙한 microRNA" (또는 "성숙한 miRNA")는 microRNA 전구체 ("사전-miRNA")로부터 절단되었거나, 또는 합성되었고 (예를 들어, 무세포 합성에 의해 실험실에서 합성되었고), 그리고 약 19 뉴클레오타이드 내지 약 27 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 예를 들어, 성숙한 microRNA는 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt, 또는 27 nt의 길이를 가질 수 있는 microRNA을 포함한다. 성숙한 microRNA는 표적 mRNA에 결합하고 상기 표적 mRNA의 번역을 억제할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에 적용되는 "재조합"은, 폴리뉴클레오타이드가 클로닝, 제한 또는 결찰 단계, 및 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드로부터 구별되는 작제물을 생성하는 다른 절차의 다양한 조합의 산물임을 의미한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자이다. 용어들 각각은 최초 폴리뉴클레오타이드 복제물 및 최초 바이러스 작제물의 자손을 포함한다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 폴리뉴클레오타이드의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱, 번역, 또는 열화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용과 관련된 뉴클레오타이드 서열이다. 조절은 과정의 빈도, 속도, 또는 특이성에 영향을 줄 수 있고, 본질적으로 증진 또는 억제성일 수 있다. 기술 분야에서 공지된 조절 요소는, 예를 들어, 전사 조절 서열 예컨대 프로모터 및 증진제를 포함한다. 프로모터는 특정 조건 하에서 RNA 중합효소에 결합할 수 있고 위치한 프로모터로부터 다운스트림으로 (3' 방향으로) 일반적으로 위치한 코딩 영역의 전사를 개시할 수 있는 DNA 영역이다.
"작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 유전 요소의 병치를 언급하고, 여기서 상기 요소는 예상된 방식으로 이들을 작동시키는 관계에 있다. 예를 들면, 프로모터가 코딩 서열의 전사 개시를 도우면 프로모터는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역 사이 개입하는 잔기가 있을 수 있다.
"발현 벡터"는 관심의 폴리펩타이드를 인코딩하는 영역을 구성하는 벡터이고, 의도된 표적 세포에서 단백질의 발현에 영향을 미치는 데 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 인코딩 영역에 작동가능하게 연결된 제어 요소를 포함한다. 제어 요소와 이들이 발현을 위하여 작동가능하게 연결되는 유전자 또는 유전자들과의 조합은 때때로 "발현 카셋트"로서 지칭되고, 다수의 이들은 종래기술에서 공지되고 이용가능하거나 종래기술에서 이용가능한 성분으로부터 용이하게 작제될 수 있다.
"이종성"은 비교되고 있는 나머지 실체의 것으로부터 유전자형질적으로 구별되는 실체로부터 파생된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 다른 종에서 파생된 플라스미드나 벡터에 도입된 폴리뉴클레오타이드는 이종성 폴리뉴클레오타이드이다. 연결된 채 자연적으로 발견되지 않은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 그리고 이의 자연 코딩 서열에서 제거된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 따라서, 예를 들어, 이종성 유전자 생성물을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV는 자연-발생, 야생형 AAV에서 정상적으로 포함되지 않는 핵산을 포함하는 rAAV이고, 인코딩된 이종성 유전자 생성물은 자연-발생, 야생형 AAV에 의해 정상적으로 인코딩되지 않는 유전자 생성물이다. 또 다른 예로서, 캡시드 단백질의 GH 루프에 삽입된 이종성 펩타이드를 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 자연-발생, 야생형 AAV에서 정상적으로 포함되지 않는 펩타이드의 삽입을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질이다.
용어 "유전적 변경" 및 "유전적 변형" (및 이의 문법적 변형)은 유전적 요소 (예를 들면, 폴리뉴클레오타이드)가 유사분열 또는 감수분열에 의한 것 이외에 세포에 도입되는 공정을 지칭하기 위해 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다. 요소는 세포에 이종성일 수 있거나, 세포에서 이미 존재하는 요소의 추가의 카피 또는 개량된 버전일 수 있다. 유전적 변경은, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, 또는 폴리뉴클레오타이드-리포솜 복합체와 접촉과 같은, 종래기술에서 공지된 임의의 공정을 통해 재조합 플라스미드 또는 다른 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질감염시킴으로써, 영향받을 수 있다. 유전적 변경은, 예를 들어, DNA 또는 RNA 바이러스 혹은 바이러스 벡터로 형질도입 또는 감염시킴으로써, 또한 영향받을 수 있다. 일반적으로, 유전적 요소는 세포에서 염색체 또는 미니-염색체에 도입되지만; 세포 및 이의 자손의 표현형 및/또는 유전자형을 변화시키는 임의의 변경은 이 용어에 포함된다.
세포는, 서열이 세포 시험관내 세포의 연장된 배양 동안에 그것의 기능 수행하기 위해 이용가능하면 "안정적으로" 변경되고, 형질도입되고, 유전자 변형되거나, 또는 유전적 서열로 전환된 것으로 언급된다. 일반적으로, 그와 같은 세포는, 변화된 세포의 자손에 의해 상속되는 유전적 변이가 도입된다는 점에서 "상속에 의하여 " 변경된다 (유전자 변형된다).
용어들 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 용어들은 또한 변형되었던 아미노산 중합체; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 당화, 지질화, 인산화, 또는 표지 성분과의 콘주게이션을 포괄한다. 폴리펩타이드 예컨대 항-혈관신생 폴리펩타이드, 신경보호성 폴리펩타이드, 및 등은, 유전자 산물을 포유동물 대상체에게 전달하는 것과 관련하여 논의할 때, 및 그의 조성물은, 온전한 단백질의 원하는 생화학적 기능을 유지하는, 각각의 온전한 폴리펩타이드, 또는 이의 임의의 단편 또는 유전자적으로 조작된 유도체를 지칭한다. 유사하게, 항-혈관신생 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 신경보호성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 및 유전자 산물의 포유동물 대상체에의 전달에 사용하기 위한 다른 그와 같은 핵산 (이는 수령체 세포에 전달될 "이식유전자"로 칭할 수 있음)에 대한 언급은, 원하는 생화학적 기능을 보유하고 있는 온전한 폴리펩타이드 또는 임의의 단편 또는 유전자적으로 조작된 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"단리된" 플라스미드, 핵산, 벡터, 바이러스, 비리온, 숙주 세포, 또는 다른 서브스턴스는 서브스턴스 또는 유사한 서브스턴스가 자연적으로 발생하거나 그로부터 초기에 제조되는 경우 또한 존재할 수 있는 다른 성분의 적어도 일부가 없는 서브스턴스의 제조물을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 서브스턴스는 공급원 혼합물로부터 그것을 농축시키기 위해 정제 기술을 사용함으로써 제조될 수 있다. 농축은, 절대 기준, 예컨대 용액의 체적당 중량으로 측정될 수 있거나, 공급원 혼합물에서 존재하는 제2, 잠재적으로 방해 서브스턴스에 관련하여 측정될 수 있다. 본 발명의 구현예의 증가하는 농축은 증가적으로 더욱 단리된다. 단리된 플라스미드, 핵산, 벡터, 바이러스, 숙주 세포, 또는 다른 서브스턴스는 일부 구현예에서, 예를 들어, 약 80% 내지 약 90% 순수, 적어도 약 90% 순수, 적어도 약 95% 순수, 적어도 약 98% 순수, 또는 적어도 약 99%, 또는 초과 순수하게 정제된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "치료", "치료하는", 및 등은, 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환에 대한 부정적 영향에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "치료"는, 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고, 하기를 포함한다: (a) 질환에 취약하거나 질병을 습득할 위험에 있으나, 질환을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 예방함; (b) 질환을 억제함, 즉, 그것의 발달의 저지; 및 (c) 질환을 경감시킴, 즉, 질환의 퇴행을 야기함.
용어들 "개체", "숙주", "대상체", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 유인원 및 인간; 포유동물 스포츠용 동물 (예를 들어, 말, 낙타, 등); 포유동물 농장 동물 (예를 들어, 양, 염소, 소, 등); 포유동물 애완동물 (개, 고양이, 등); 및 설치류 (예를 들어, 마우스, 랫트, 등)을 포함하는 인간 및 비-인간 영장류를 비제한적으로 포함하는 포유동물을 지칭한다. 일부 경우에, 개체는 인간이다.
본 발명이 추가로 기재되기 전, 본 발명이 기재된 특정한 구현예에 제한되지 않고, 자체로, 물론, 다양할 수 있다는 것이 이해된다. 본 명세서에서 사용된 용어들이 단지 특정한 구현예 기재의 목적을 위한 것이 또한 이해되고, 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 제한되지 않을 것이기 때문에, 제한되는 의도는 아니다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위 그리고 그 명시된 범위내 임의의 다른 명시된 또는 개재하는 값의 상한과 하한 사이, 문맥이 명확히 달리 나타내지 않는 한 하한의 단위의 10분의 1까지, 각각의 개재하는 값이 본 발명 내에 포괄되는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에서 포함될 수 있고, 또한 명시된 범위에서 특별히 제외된 한계에 따라 발명에 포괄된다. 명시된 범위가 한쪽 또는 양쪽 한계를 포함하는 경우, 포함된 어느 한쪽 또는 양쪽 한계를 제외한 범위는 또한 본 발명에서 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 종래기술에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사한 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있어도, 바람직한 방법 및 물질은 이제 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보는 그 공보가 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시 및 기재하기 위해 참조로 본 명세서에서 편입된다.
본 명세서에서 그리고 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시물을 포함하는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "AAV 캡시드" 지칭은 복수의 그와 같은 캡시드를 포함하고 "AAV 비리온" 지칭은 하나 이상의 AAV 비리온 그리고 종래기술의 당업자에 공지된 이의 등가물, 및 기타 등등 지칭을 포함한다. 청구항이 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것이 추가로 주목된다. 이와 같이, 이러한 명시는 청구항 요소의 인용과 관련하여 "단독으로", "단지" 및 기타 등등과 같은 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행 기준으로서 제공하기 위한 의도이다.
명확화를 위하여, 개별 구현예의 문맥에서 기재되는, 본 발명의 특정 피쳐가 또한 단일 구현예에서 조합으로 제공될 수 있다는 것이 인정된다. 반대로, 간결함을 위하여, 단일 구현예의 맥락에서 기재되는, 본 발명의 다양한 피쳐가 별도로 또는 임의의 적절한 하위-조합으로 또한 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되고 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에서 개시된다. 게다가, 이의 다양한 구현예 및 요소의 모든 하위-조합은 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되고 각각의 및 모든 이와 같은 하위-조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본 명세서에서 개시된 것처럼 본 명세서에서 개시된다.
본 명세서에서 논의된 공보는 본원의 출원일에 앞서 이들의 개시를 위하여 단독으로 제공된다. 본 발명이 선행 발명의 덕택으로 이와 같은 공보를 전치할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되는 것이 본 명세서에서 없다. 추가로, 제공된 공보의 일자는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공보 일자와 상이할 수 있다.
상세한 설명
본 개시내용은 재조합 변경된 캡시드 단백질을 갖는 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 비리온을 제공하되, 상기 재조합 AAV (rAAV) 비리온은 야생형 AAV와 비교하여 망막 세포의 더 큰 감염성을 나타내고; 그리고 상기 rAAV 비리온은 이종성 핵산을 포함한다. rAAV 비리온은 망막 세포에 대한 상응하는 야생형 AAV의 감염성과 비교하여 망막 세포의 더 큰 감염성을 나타낸다. 망막 세포는 광수용체 (예를 들어, 간상체; 추상체), 망막 신경절 세포 (RGC), 뮐러 세포 (뮐러 신경교 세포), 별아교세포 (예를 들어, 망막 별아교세포), 두극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 (RPE) 세포일 수 있다. 본 개시내용은 추가로, 개체에서 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법, 및 안구 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 변경된 캡시드 단백질을 갖는 rAAV 비리온을 제공하되, 상기 rAAV 비리온은 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 또는 망막 색소 상피에 대한 국제화의 정도와 비교하여, 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의해 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 및 망막 색소 상피 중 하나 이상에 대해 적어도 5-배수 증가된 국재화를 나타내고; 그리고 상기 rAAV 비리온은 이종성 핵산을 포함한다.
변이체 AAV 캡시드 폴리펩타이드
본 개시내용은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 제공한다. 본 개시내용의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 친계 AAV 캡시드 단백질의 표면-접근가능한 (예를 들어, 용매-접근가능한) 부분에서의 삽입 부위에서 5개의 아미노산 내지 20개 길이의 아미노산의 이종성 펩타이드의 삽입을 포함하고, 이로써, 상기 변이체 캡시드 단백질은, AAV 비리온 내에 존재할 때, 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 상기 망막 세포의 감염성과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염성을 부여한다. 다른 사례에서, 망막 세포는 뮐러 세포. 다른 망막 세포는 무축삭 세포, 두극 세포, 및 수평 세포를 포함한다. "약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산의 삽입"은 또한 본 명세서에서 일명 "펩타이드 삽입" (예를 들어, 이종성 펩타이드 삽입)이다. "상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질"은 펩타이드 삽입없는 동일한 AAV 혈청형의 AAV 캡시드 단백질 을 지칭한다. 많은 사례에서, 변이체 AAV 캡시드는 5개의 아미노산 내지 20개 길이의 아미노산 (예를 들어, 5 내지 7, 7 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 15, 또는 15 내지 20개 길이의 아미노산)의 단일 이종성 펩타이드 삽입물을 포함한다.
삽입 부위는 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV 내에, 예를 들어, AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV의 용매-접근가능한 부분 내에 있다. AAV 캡시드의 GH 루프/루프 IV에 대해, 참고, 예를 들어, van Vliet 등 (2006) Mol. Ther . 14:809; Padron 등 (2005) J. Virol . 79:5047; 및 Shen 등 (2007) Mol . Ther. 15:1955. 예를 들어, 삽입 부위는 도 6A-6C에서 묘사된 바와 같이 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 411-650 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 삽입 부위는 도 5에서 묘사된 바와 같이, AAV2의 아미노산 570-611 내에, AAV1의 아미노산 571-612 내에, AAV5의 아미노산 560-601 내에, AAV6의 아미노산 571 내지 612 내에, AAV7의 아미노산 572 내지 613 내에, AAV8의 아미노산 573 내지 614 내에, AAV9의 아미노산 571 내지 612 내에, 또는 AAV10의 아미노산 573 내지 614 내에 있을 수 있다. 일부 경우에, 삽입 부위는 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 588 내지 589, 또는 상이한 혈청형의 AAV에서의 상응하는 삽입 부위 사이에 있다. 일부 경우에, 삽입 부위는 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 587 내지 588, 또는 상이한 혈청형의 AAV에서의 상응하는 삽입 부위 사이에 있다.
일부 경우에, 약 5개의 아미노산 내지 약 20개 길이의 아미노산 (예를 들어, 5 내지 7, 7 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 15, 또는 15 내지 20개 길이의 아미노산)의 이종성 펩타이드는 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 캡시드 단백질의 GH 루프 또는 루프 IV에서의 삽입 부위 내에 삽입된다. 예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587 내지 588, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 하위단위의 상응하는 위치일 수 있다. 삽입 부위 587/588이 AAV2 캡시드 단백질을 기반으로 함을 유의해야 한다. 5개의 아미노산 내지 약 20개 길이의 아미노산 (예를 들어, 5 내지 7, 7 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 15, 또는 15 내지 20개 길이의 아미노산)의 이종성 펩타이드는 AAV2 (예를 들어, AAV8, AAV9, 등) 이외의 AAV 혈청형에서의 상응하는 부위 내에 삽입될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 다양한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교를 기반으로 공지되어 있고, "AAV2의 아미노산 587-588에 상응하는" 삽입 부위는 임의의 주어진 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내에 있다. 다양한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 AAV2의 VP1의 아미노산 570-611에 상응하는 서열 (참조 도 4)은 도 5에 도시되어 있다. 참고, 예를 들어, 유전자은행 수탁 번호 NP_049542 for AAV1; 유전자은행 수탁 번호 AAD13756 for AAV5; 유전자은행 수탁 번호 AAB95459 for AAV6; 유전자은행 수탁 번호 YP_077178 for AAV7; 유전자은행 수탁 번호 YP_077180 for AAV8; 유전자은행 수탁 번호 AAS99264 for AAV9 및 유전자은행 수탁 번호 AAT46337 for AAV10.
예를 들어, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587 내지 588, AAV1의 아미노산 590 내지 591, AAV5의 아미노산 575 내지 576, AAV6의 아미노산 590 내지 591, AAV7의 아미노산 589 내지 590, AAV8의 아미노산 590 내지 591, AAV9의 아미노산 588 내지 589, 또는 AAV10의 아미노산 588 내지 589일 수 있다. 삽입 부위는 도 5에서 밑줄쳐져 있고; 상기 아미노산 넘버링은 도 5에서 묘사된 넘버링을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 당해 캡시드 단백질은 도 6A-6C에서 제시된 아미노산 서열 에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 5 내지 20개 길이의 아미노산 (예를 들어, 5 내지 7, 7 내지 10, 10 내지 12, 12 내지 15, 또는 15 내지 20개 길이의 아미노산)의 이종성 펩타이드의 삽입을 갖는 GH 루프를 포함한다.
삽입 펩타이드
전술한 바와 같이, 길이가 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산인 이종성 펩타이드는 AAV 캡시드의 GH 루프에 삽입된다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 5개의 아미노산 내지 20개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 7개의 아미노산 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 9개의 아미노산 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 9개의 아미노산 내지 12개의 아미노산. 삽입 펩타이드는 5개의 아미노산, 6개의 아미노산, 7개의 아미노산, 8개의 아미노산, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 12개의 아미노산, 13개의 아미노산, 14개의 아미노산, 15개의 아미노산, 16개의 아미노산, 17개의 아미노산, 18개의 아미노산, 19개의 아미노산, 또는 20개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 7개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 8개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 9개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 10개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 11개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 12개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 13개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 14개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 삽입 펩타이드는 15개의 아미노산의 길이를 갖는다.
펩타이드 삽입물은, 일부 경우에, 식 I의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중,
X1는 Leu, Ile, Pro, 또는 Gln이고;
X2는 Ala, Pro, Ser, Asp, Gly, Thr, 또는 Val이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, 또는 Tyr이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, Asn, Glu, Lys, 또는 Arg이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, Ala, Asn, Lys, 또는 Tyr이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, Pro, 또는 Ile;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, 또는 Cys이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, Thr, Ala, Glu, Ile, 또는 Asn이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala, Phe, Asp, Thr, Val, 또는 Met이다.
식 I의 펩타이드 삽입물은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (19) LAAQGTAKKPA (서열번호:65); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (21) LAASDSTKAA (서열번호:67); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (23) LAKADETRPA (서열번호:69); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTNA (서열번호:75); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); (32) LAISDQSKPA (서열번호:78); (33) LADATKTA (서열번호:79); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81); (36) LAPQDTKKNA (서열번호:82); (37) LATSDSTKAA (서열번호:83); (38) LAVDGSQRSA (서열번호:84); (39) LPISDQTKHA (서열번호:85); (40) LPKDATKTIA (서열번호:86); (41) LPPQDTTKNA (서열번호:87); (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88); (43) QAHQDTTKNA (서열번호:89); (44) LAHETSPRPA (서열번호:90); (45) LAKSTSTAPA (서열번호:91); (46) LADQDTTKNA (서열번호:92); (47) LAESDQSKPA (서열번호:93); (48) LAHKDTTKNA (서열번호:94); (49) LAHKTQQKM (서열번호:95); (50) LAHQDTTENA (서열번호:96); (51) LAHQDTTINA (서열번호:97); (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98); (53) LAHQDTTKND (서열번호:99); (54) LAHQDTTKNT (서열번호:100); (55) LAHQDTTKNV (서열번호:101); (56) LAHQDTTKTM (서열번호:102); (57) LAHQNTTKNA (서열번호:103); (58) LAHRDTTKNA (서열번호:104); (59) LAISDQTNHA (서열번호:105); (60) LAKQKSASTA (서열번호:106); (61) LAKSDQCKPA (서열번호:107); (62) LAKSDQSKPD (서열번호:108); (63) LAKSDQSNPA(서열번호:109); (64) LAKSYQSKPA (서열번호:110); (65) LANQDTTKNA (서열번호:111); (66) LAPQNTTKNA (서열번호:112); (67) LAPSSIQKPA (서열번호:113); (68) LAQQDTTKNA (서열번호:114); (69) LAYQDTTKNA (서열번호:115); (70) LDHQDTTKNA (서열번호:116); (71) LDHQDTTKSA (서열번호:117); (72) LGHQDTTKNA (서열번호:118); (73) LPHQDTTKND (서열번호:119); (74) LPHQDTTKNT (서열번호:120); (75) LPHQDTTNNA (서열번호:121); (76) LTHQDTTKNA (서열번호:122); (77) LTKDATKTIA (서열번호:123); (78) LTPQDTTKNA (서열번호:124); 및 (79) LVHQDTTKNA (서열번호:125).
펩타이드 삽입물은, 일부 경우에, 식 II의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중,
X1는 Leu, Ile, 또는 Pro이고;
X2는 Ala, Pro, 또는 Ser이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, 또는 Ala이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, 또는 Asn이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, 또는 Ala이고;
X6은 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, 또는 Pro이고;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, 또는 Ala이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, 또는 Thr이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala이다.
식 II의 펩타이드 삽입물은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA(서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (19) LAAQGTAKKPA (서열번호:65); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (21) LAASDSTKAA (서열번호:67); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (23) LAKADETRPA (서열번호:69); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTNA (서열번호:75); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); (32) LAISDQSKPA (서열번호:78); (33) LADATKTA (서열번호:79); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81); (36) LAPQDTKKNA (서열번호:82); (37) LATSDSTKAA (서열번호:83); (38) LAVDGSQRSA (서열번호:84); (39) LPISDQTKHA (서열번호:85); (40) LPKDATKTIA (서열번호:86); (41) LPPQDTTKNA (서열번호:87); 및 (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88).
식 II의 펩타이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); 및 (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64). 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (1) LAKDATKNA (서열번호:47)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (4) LATTSQNKPA (서열번호:50)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (5) LAISDQTKHA (서열번호:51)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (6) IARGVAPSSA (서열번호:52)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (8) LAKGTELKPA (서열번호:54)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (9) LAIIDATKNA (서열번호:55)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (13) LAKDATKTIA (서열번호:59)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (14) LAKQQSASTA (서열번호:60)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (17) LAANQPSKPA (서열번호:63)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64)이다.
펩타이드 삽입물은, 일부 경우에, 식 III의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중,
X1는 Leu, Ile, 또는 Pro이고;
X2는 Ala, Pro, 또는 Ser이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, 또는 Ala이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, 또는 Asn이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, 또는 Ala이고;
X6은 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, 또는 Pro이고;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, 또는 Ala이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, 또는 Thr이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala, Thr, Asp Val, 또는 Met이다.
식 III의 펩타이드 삽입물은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52);(7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60);(16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (19) LAAQGTAKPA (서열번호:65); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTTNA (서열번호:75); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (21) LAASDSTKAA (서열번호:67); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); (33) LAKDATKTA (서열번호:79); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); (36) LAPQDTKKNA (서열번호:82); (37) LATSDSTKAA (서열번호:83); (38) LAVDGSQRSA (서열번호:84); (41) LPPQDTTKNA (서열번호:87); (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88); (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98); (53) LAHQDTTKND (서열번호:99); (54) LAHQDTTKNT (서열번호:100); (55) LAHQDTTKNV (서열번호:101); (56) LAHQDTTKTM (서열번호:102); (73) LPHQDTTKND (서열번호:119); 및 (74) LPHQDTTKNT (서열번호:120).
펩타이드 삽입물은, 일부 경우에, 식 IV의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중,
X1는 Leu이고;
X2는 Ala이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, 또는 Val이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, 또는 Gly이고;
X5는 Asp, Ser, 또는 Gln이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, 또는 Ser이고;
X7는 Thr 또는 Ser이고;
X8는 Lys, Ser, 또는 Arg이고;
X9는 Asn, Pro, 또는 Ser이고; 그리고
X10는 Ala이다.
식 IV의 펩타이드 삽입물은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68) ;(28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (32) LAISDQSKPA (서열번호:78); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); 및 (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81).
펩타이드 삽입물은, 일부 경우에, 식 V의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중,
X1는 Leu이고;
X2는 Ala이고;
X3는 Lys 또는 His이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, 또는 Gly이고;
X5는 Asp, Ser, 또는 Gln이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, 또는 Ser이고;
X7는 Thr 또는 Ser이고;
X8는 Lys, Ser, 또는 Arg이고;
X9는 Asn, Pro, 또는 Ser이고; 그리고
X10는 Ala이다.
식 V의 펩타이드 삽입물은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:51); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); 및 (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81).
펩타이드 삽입물은, 일부 경우에, 식 VI의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중,
X1는 Leu이고;
X2는 Ala이고;
X3는 Asn, Lys, Thr, Gln, Ser, Ile, 또는 Leu이고;
X4는 Ser, Ala, Thr, Glu, Gln, Gly, Lys, 또는 Pro이고;
X5는 Asp, Pro, Glu, Thr, Asn, 또는 Arg이고;
X6는 Ile, His, Thr, Gln, Asn, Tyr, Asp, 또는 Glu이고;
X7는 Gln, Thr, Asn, Ala, 또는 Lys이고;
X8는 Lys, Thr, Arg, 또는 Asp이고;
X9는 Pro, Asn, Thr, Arg, Lys, 또는 Ser이고; 그리고
X10는 Ala이다.
식 VI의 펩타이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: (80) LAKANQNTPA (서열번호:126); (81) LATTPITKPA (서열번호:127); (82) LATTPIAKPA (서열번호:128); (83) LAIEDHTKSA (서열번호:129); (84) LAQSEHQRPA (서열번호:130); (85) LAKSPNKDNA (서열번호:131); (86) LANQDYTKTA (서열번호:132); (87) LANSTDQTRA (서열번호:133); (88) LALGETTRPA (서열번호:134); (89) LANSTEQTRA (서열번호:135); (90) LAQADTTKNA (서열번호:136); (91) LASKDITKTA (서열번호:137); 및 (92) LASPRHNKKC (서열번호:138).
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 식 VII: LAHQDTTKX1X2X3 (서열번호:148)의 펩타이드이되, 상기 X1는 Lys, Thr, Asn, 또는 His이고; X2는 Ala, Thr, Val, Ile, Met, 또는 Asp이고; 그리고 X3는, 존재한다면, Ala이다. 식 VII의 펩타이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98); (53) LAHQDTTKND (서열번호:99); (54) LAHQDTTKNT (서열번호:100); (55) LAHQDTTKNV (서열번호:101); (56) LAHQDTTKTM (서열번호:102); 및 (93) LAHQDTTKTIA (서열번호:139).
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 식 VIII: LAX1QX2TX3X4X5X6 (서열번호:149)의 펩타이드이되, 상기 X1는 Ala, Pro, Asp, 또는 His이고; X2는 Gly 또는 Asp이고; X3는 Ala, Thr, 또는 Lys이고; X4는 Asn, Glu, Lys, Arg, 또는 Thr이고; X5는 Leu, Asn, Lys, 또는 Thr이고; 그리고 X6는, 존재한다면, Ala, Thr, Asp, Val, 또는 Met이다. 식 VIII는의 펩타이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: (94) LAAQGTANL (서열번호:140); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (46) LADQDTTKNA (서열번호:92); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTTNA (서열번호:75); (50) LAHQDTTENA (서열번호:96); (51) LAHQDTTINA (서열번호:97); (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98); (53) LAHQDTTKND (서열번호:99); (54) LAHQDTTKNT (서열번호:100); (55) LAHQDTTKNV (서열번호:101); 및 (56) LAHQDTTKTM (서열번호:102).
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 식 IX: X1AX2X3DX4TKX5A (서열번호:150)의 펩타이드이되, 상기 X1는 Val 또는 Leu이고; X2는 Ile, Val, His, 또는 Asp이고; X3는 Glu, Ser, Lys, 또는 Gln이고; X4는 His, Ser, 또는 Thr이고; 그리고 X5는 Ser, Ala, Asn, His, 또는 Lys이다. 식 IX의 펩타이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: (95) VAIEDHTKSA (서열번호:141); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (46) LADQDTTKNA (서열번호:92); (48) LAHKDTTKNA (서열번호:94); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); 및 (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73).
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 식 X: X1X2X3AX4QX5TX6KNA (서열번호:151)의 펩타이드이되, 상기 X1는, 존재한다면, Leu이고; X2는, 존재한다면, Ala이고; X3는 Lys, Leu, 또는 Pro이고; X4는 Asn, His, Pro, 또는 Tyr이고; X5는 Asn, Gly, Val, 또는 Asp이고; 그리고 X6는 Pro 또는 Thr이다. 식 X의 펩타이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: (96) LAKANQNTPKNA (서열번호:142); (57) LAHQNTTKNA (서열번호:103); (66) LAPQNTTKNA (서열번호:112); (69) LAYQDTTKNA (서열번호:115); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); 및 (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88).
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 LAHQDTTKKX (서열번호:143)이되, 상기 X는 임의의 아미노산. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 LAHQDTTKKX (서열번호:143)이되, 상기 X는 Ala, Thr, Asp, Val, 또는 Met이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 LAHQDTTKKD (서열번호:144)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 LAHQDTTKKV (서열번호:145)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 LAHQDTTKKM (서열번호:146)이다.
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (88) LALGETTRPA (서열번호:134)가 아니다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 LGETTRP (서열번호:147)가 아니다.
적합한 펩타이드 삽입물은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (19) LAAQGTAKKPA (서열번호:65); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (21) LAASDSTKAA (서열번호:67); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (23) LAKADETRPA (서열번호:69); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTNA (서열번호:75); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); (32) LAISDQSKPA (서열번호:78); (33) LADATKTA (서열번호:79); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81); (36) LAPQDTKKNA (서열번호:82); (37) LATSDSTKAA (서열번호:83); (38) LAVDGSQRSA (서열번호:84); (39) LPISDQTKHA (서열번호:85); (40) LPKDATKTIA (서열번호:86); (41) LPPQDTTKNA (서열번호:87); (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88); (43) QAHQDTTKNA (서열번호:89); (44) LAHETSPRPA (서열번호:90); (45) LAKSTSTAPA (서열번호:91); (46) LADQDTTKNA (서열번호:92); (47) LAESDQSKPA (서열번호:93); (48) LAHKDTTKNA (서열번호:94); (49) LAHKTQQKM (서열번호:95); (50) LAHQDTTENA (서열번호:96); (51) LAHQDTTINA (서열번호:97); (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98); (53) LAHQDTTKND (서열번호:99); (54) LAHQDTTKNT (서열번호:100); (55) LAHQDTTKNV (서열번호:101); (56) LAHQDTTKTM (서열번호:102); (57) LAHQNTTKNA (서열번호:103); (58) LAHRDTTKNA (서열번호:104); (59) LAISDQTNHA (서열번호:105); (60) LAKQKSASTA (서열번호:106); (61) LAKSDQCKPA (서열번호:107); (62) LAKSDQSKPD (서열번호:108); (63) LAKSDQSNPA(서열번호:109); (64) LAKSYQSKPA (서열번호:110); (65) LANQDTTKNA (서열번호:111); (66) LAPQNTTKNA (서열번호:112); (67) LAPSSIQKPA (서열번호:113); (68) LAQQDTTKNA (서열번호:114); (69) LAYQDTTKNA (서열번호:115); (70) LDHQDTTKNA (서열번호:116); (71) LDHQDTTKSA (서열번호:117); (72) LGHQDTTKNA (서열번호:118); (73) LPHQDTTKND (서열번호:119); (74) LPHQDTTKNT (서열번호:120); (75) LPHQDTTNNA (서열번호:121); (76) LTHQDTTKNA (서열번호:122); (77) LTKDATKTIA (서열번호:123); (78) LTPQDTTKNA (서열번호:124); (79) LVHQDTTKNA (서열번호:125); (80) LAKANQNTPA (서열번호:126); (81) LATTPITKPA (서열번호:127); (82) LATTPIAKPA (서열번호:128); (83) LAIEDHTKSA (서열번호:129); (84) LAQSEHQRPA (서열번호:130); (85) LAKSPNKDNA (서열번호:131); (86) LANQDYTKTA (서열번호:132); (87) LANSTDQTRA (서열번호:133); (88) LALGETTRPA (서열번호:134); (89) LANSTEQTRA (서열번호:135); (90) LAQADTTKNA (서열번호:136); (91) LASKDITKTA (서열번호:137); (92) LASPRHNKKC (서열번호:138); (93) LAHQDTTKTIA (서열번호:139); (94) LAAQGTANL (서열번호:140); (95) VAIEDHTKSA (서열번호:141); 및 (96) LAKANQNTPKNA (서열번호:142).
일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57)이다. 일부 경우에, 펩타이드 삽입물은 (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53)이다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온 캡시드는 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입 외의 임의의 다른 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 당해 rAAV 비리온 캡시드는, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입 외에, 친계 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 1 내지 약 25개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온 캡시드는 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입 외에, 친계 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 1 내지 약 5, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 또는 약 20 내지 약 25개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다.
일부 경우에, 당해 rAAV 비리온 캡시드는 하기 아미노산 치환: Y273F, Y444F, Y500F, 및 Y730F 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 당해 변이체 캡시드 폴리펩타이드는, 상기에 기재된 바와 같은 삽입 펩타이드 외에, 하기 아미노산 치환: Y273F, Y444F, Y500F, 및 Y730F 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다.
일부 경우에, 당해 rAAV 비리온 캡시드는 키메라성 캡시드이고, 예를 들어, 캡시드는 제1 AAV 혈청형의 AAV 캡시드의 부분 및 제2 혈청형의 AAV 캡시드의 부분을 포함하고; 그리고 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 하기를 포함한다: 도 4에서 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입. 일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 하기를 포함한다: 도 4에서 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 도 4에서 묘사된 아미노산 서열에 관한 아미노산 587 내지 588의 사이, 또는 친계 AAV 캡시드 단백질에 관한 상응하는 부위에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 도 5에서 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 굵고 밑줄친 아미노산 사이에 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입을 포함하는 GH 루프를 포함하는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 하기를 포함한다: 도 6A-6C에서 제공된 아미노산 서열 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 AAV2의 아미노산 587 내지 588의 사이, 또는 또 다른 AAV 유전자형에 관한 상응하는 부위에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산; 예를 들어, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 또는 12개의 아미노산)의 삽입. 일부 경우에, 상응하는 삽입 부위는 도 6B에서 볼드체 및 밑줄 친 것으로 나타낸 부위이다.
당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 상기 망막 세포의 감염성과 비교하여, 망막 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 상기 망막 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때, 망막 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 광수용체 세포의 감염성과 비교하여, 광수용체 (간상 또는 원뿔) 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 광수용체 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 광수용체 (간상 또는 원뿔) 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 RGC의 감염성과 비교하여, RGC의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 RGC의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 RGC의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 RPE 세포의 감염성과 비교하여, RPE 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 RPE 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때, RPE 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 뮐러 세포의 감염성과 비교하여, 뮐러 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 뮐러 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 뮐러 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 두극 세포의 감염성과 비교하여, 두극 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 두극 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 두극 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 무축삭 세포의 감염성과 비교하여, 무축삭 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 무축삭 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 무축삭 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 수평 세포의 감염성과 비교하여, 수평 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 수평 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 수평 세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 별아교세포의 감염성과 비교하여, 망막 별아교세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 별아교세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 망막 별아교세포의 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은 ILM을 가로 지르기 위한 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교하여, 내경계막 (ILM)을 가로지르기 위해 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 능력을 나타낸다.
일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은 유리체내 주사를 통해 투여될 때 ILM을 가로 지르기 위한 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때 ILM을 가로지르기 위해 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 능력을 나타낸다.
당해 rAAV 비리온은 ILM를 가로지를 수 있고, 또한 광수용체 세포 및/또는 RPE 세포에 도달하기 위해 뮐러 세포, 무축삭 세포, 등을 포함하는 세포 층을 횡단할 수 있다. 예를 들어, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내 주사를 통해 투여될 때, ILM을 가로지를 수 있고, 또한 광수용체 세포 및 또는 RPE 세포에 도딜하기 위해 뮐러 세포, 무축삭 세포, 등을 포함하는 세포 층을 횡단할 수 있다.
일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내로 주사될 때, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유리체내로 주사된 대조군 AAV 비리온에 의한 ILM을 넘어스는 국재와의 정도와 비교하여, ILM을 넘어서는, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 국재화를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내로 주사될 때, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유리체내로 주사된 대조군 AAV 비리온에 의한 RPE 층에 대한 국재화의 정도와 비교하여, 망막 색소 상피 (RPE)에 대한 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 국재화를 나타낸다. 또 다른 예로서, 일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내로 주사될 때, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유리체내로 주사된 대조군 AAV 비리온에 의한 PR 층에 대한 국재화의 정도와 비교하여, 광수용체 (PR) 층에 대한 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 국재화를 나타낸다. 또 다른 예로서, 일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내로 주사될 때, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유리체내로 주사된 대조군 AAV 비리온에 의한 내부 핵 층에 대한 국재화의 정도와 비교하여, 내부 핵 층 에 대한 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 국재화를 나타낸다. 또 다른 예로서, 일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내로 주사될 때, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유리체내로 주사된 대조군 AAV 비리온에 의한 외부 핵 층에 대한 국재화의 정도와 비교하여, 외부 핵 층 에 대한 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 국재화를 나타낸다. 또 다른 예로서, 일부 경우에, 당해 rAAV 비리온은, 유리체내로 주사될 때, 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유리체내로 주사된 대조군 AAV 비리온에 의한 신경절 세포 층에 대한 국재화의 정도 와 비교하여, 신경절 세포 층 에 대한 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 국재화를 나타낸다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 선택적으로 망막 세포를 감염시키고, 예를 들어, 당해 rAAV 비리온은 비-망막 세포, 예를 들어, 눈 외부의 세포 보다 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 50-배 초과의 특이성으로 망막 세포를 감염시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 선택적으로 i망막 세포를 감염시키고, 예를 들어, 당해 rAAV 비리온은 비-망막 세포, 예를 들어, 눈 외부의 세포보다 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 50-배 초과의 특이성으로 광수용체 세포를 감염시킨다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 선택적으로 광수용체 세포를 감염시키고, 예를 들어, 당해 rAAV 비리온은 눈에 존재하는 비-광수용체 세포, 예를 들어, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 등보다 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 50-배 초과의 특이성으로 광수용체 세포를 감염시킨다.
일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 to 유리체내 주사를 통해 투여될 때 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 광수용체 세포의 감염성과 비교하여, 유리체내 주사를 통해 투여될 때, 광수용체 세포의 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 또는 50-배 초과의 증가된 감염성을 나타낸다.
유전자 산물
당해 rAAV 비리온은 유전자 산물 (이종성 유전자 산물)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 유전자 산물은 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 유전자 산물은 RNA이다. 유전자 산물이 RNA인 경우, 일부 경우에, RNA 유전자 산물은 encode 폴리펩타이드을 인코딩한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 rAAV 비리온은 단일 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 을 포함하는 단일 이종성 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 rAAV 비리온은 2종의 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 이종성 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 rAAV 비리온은 2종의 이종성 핵산을 포함하되, 이들 각각은 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 간섭 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 압타머이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 유전자기능의 부위-특이적인 넉다운을 제공하는 부위-특이적인 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 표적 핵산의 변경을 제공하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다.
간섭 RNA
유전자 산물이 간섭 RNA (RNAi)인 경우, 적합한 RNAi는 세포에서 세포자멸적 또는 혈관신생 인자의 수준을 감소시키는 RNAi를 포함한다. 예를 들어, RNAi는 또는 촉진하다 세포에서 세포자멸사를 유도하거나 촉진하는 유전자 산물의 수준을 감소시키는 shRNA 또는 siRNA일 수 있다. 유전자 산물이 세포자멸사를 유도하거나 촉진하는 유전자는 본 명세서에서 일명 "세포자멸유도 유전자"이고, 그리고 유전자 (mRNA; 단백질)의 산물은 "세포자멸유도 유전자 산물"로 칭한다. 세포자멸유도 유전자 산물은, 예를 들어, Bax, Bid, Bak, 및 Bad 유전자 산물을 포함한다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,846,730.
간섭 RNA는 또한 하기에 대항할 수 있다: 혈관신생 생성물, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (예를 들어, Cand5; 참고, 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2011/0143400; 미국 특허 공보 번호 2008/0188437; 및 Reich 등 (2003) Mol . Vis . 9:210); VEGF 수용체-1 (VEGFR1) (예를 들어, Sirna-027; 참고, 예를 들어, Kaiser 등 (2010) Am. J. Ophthalmol . 150:33; and Shen 등 (2006) Gene Ther . 13:225); 또는 VEGF 수용체-2 (VEGFR2) (Kou 등 (2005) Biochem . 44:15064). 또한 하기를 참조한다: U.S. 특허 번호 6,649,596, 6,399,586, 5,661,135, 5,639,872, 내지 5,639,736; 및 U.S. 특허 번호 7,947,659 및 7,919,473.
압타머
유전자 산물이 압타머인 경우, 관심 예시적인 압타머는 VEGF에 대항하는 압타머를 포함한다. 참고, 예를 들어, Ng 등 (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123; 및 Lee 등 (2005) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102:18902. 예를 들어, VEGF 압타머는 the 뉴클레오타이드 서열 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (서열번호://)를 포함할 수 있다. 또한 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF)-특정 압타머, 예를 들어, E10030가 사용하기에 적합하다; 참고, 예를 들어, Ni 및 Hui (2009) Ophthalmologica 223:401; 및 Akiyama 등 (2006) J. Cell Physiol . 207:407).
폴리펩타이드
유전자 산물이 폴리펩타이드인 경우, 폴리펩타이드는 일반적으로 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드, 예를 들어, 간상체 또는 원추 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포의 기능이다. 예시적인 폴리펩타이드는 하기를 포함한다: 신경보호성 폴리펩타이드 (예를 들어, 신경교 세포 유래된 신경친화성 인자 (GDNF), 섬모 신경친화성 인자 (CNTF), 뉴로트로핀-4 (NT4), 신경 성장 인자 (NGF), 및 뉴르투린 (NTN)); 항-혈관신생 폴리펩타이드 (예를 들어, 가용성 VEGF 수용체; VEGF-결합 항체; VEGF-결합 항체 단편 (예를 들어, 단일 사슬 항-VEGF 항체); 엔도스타틴; 텀스타틴; 안지오스타틴; 가용성 Flt 폴리펩타이드 (Lai 등 (2005) Mol . Ther . 12:659); 가용성 Flt 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질 (참고, 예를 들어, Pechan 등 (2009) Gene Ther . 16:10); 안료 상피-유래 인자 (PEDF); 가용성 Tie-2 수용체; 등); 메탈로프로테이나제-3 (TIMP-3)의 조직 억제제; 광-반응성 옵신, 예를 들어, 로돕신; 항-세포자멸적 폴리펩타이드 (예를 들어, Bcl-2, Bcl-Xl; XIAP); 및 기타 동종의 것. 적합한 폴리펩타이드는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 신경교 유래된 신경친화성 인자 (GDNF); 섬유모세포 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자 2; 뉴르투린 (NTN); 섬모 신경친화성 인자 (CNTF); 신경 성장 인자 (NGF); 뉴로트로핀-4 (NT4); 뇌 유래된 신경친화성 인자 (BDNF; 예를 들어, 도 7B에서 묘사된 아미노산 서열 (서열번호:11)의 약 200개의 아미노산 내지 247개의 아미노산의 인접 스트레치에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드); 표피 성장 인자; 로돕신; 세포자멸사의 X-연결된 억제제; 및 소닉 헤지혹.
적합한 광-반응성 옵신은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 광-반응성 옵신을 포함한다: 미국 특허 공보 번호 2007/0261127 (예를 들어, 채널로돕신-2; ChR2; Chop2); 미국 특허 공보 번호 2001/0086421; 미국 특허 공보 번호 2010/0015095; 미국 특허 공보 번호 2016/0002302; 미국 특허 공보 번호 2013/0347137; 미국 특허 공보 번호 2013/0019325; 및 Diester 등 (2011) Nat. Neurosci. 14:387. 참고, Thyagarajan 등 (2010) J Neurosci. 30(26):8745-8758; Lagali 등 (2008) Nat Neurosci. 11(6):667-675; Doroudchi 등 (2011) Mol Ther. 19(7):1220-1229; Henriksen 등 (2014) J. Ophthalmic Vis . Res. 9:374; Tomita 등 (2014) Mol . Ther . 22:1434.
적합한 폴리펩타이드는 광-관문 이온 채널 폴리펩타이드를 포함한다. 참고, 예를 들어, Gaub 등 (2014) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 111:E5574. 예를 들어, 적합한 폴리펩타이드는 광-관문 이온요구성 글루타메이트 수용체 (LiGluR)이다. 망막 신경절 세포 및 ON-두극 세포 중 LiGluR의 발현은, 광이성질체성 화합물의 존재에서, 광에 대한 세포 반응성을 부여한다. LiGluR은 L439C 치환을 포함한다; 참고, Caporale 등 (2011) Mol Ther. 19:1212-1219; Volgraf 등 (2006) Nat Chem Biol. 2:47-52; 및 Gorostiza 등 (2007) Proc Natl Acad Sci USA. 104:10865-10870. 광이성질체성 화합물은, 예를 들어, 460 nm에서의 피크 효율 (MAG0460)을 갖는 말레이미드-아조벤젠-글루타메이트 0을 포함한다. MAG0460는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112022057388841-pat00001
적합한 폴리펩타이드는 또한 레티노쉬신 (예를 들어, 도 7A에서 묘사된 아미노산 서열 (서열번호:10)의 약 200개의 아미노산 내지 224개의 아미노산의 인접 스트레치에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 폴리펩타이드는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 색소성 망막염 GTPase 조절자 (RPGR)-상호작용 단백질-1 (참고, 예를 들어, 유전자은행 수탁 번호 Q96KN7, Q9EPQ2, 및 Q9GLM3) (예를 들어, 도 7F에서 묘사된 아미노산 서열 (서열번호:15)의 약 1150개의 아미노산 내지 약 1200개의 아미노산, 또는 약 1200개의 아미노산 내지 1286개의 아미노산의 인접 스트레치에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 페리페린-2 (Prph2) (참고, 예를 들어, 유전자은행 수탁 번호 NP_000313 (예를 들어, 도 7D에서 묘사된 아미노산 서열 (서열번호:13)의 약 300개의 아미노산 내지 346개의 아미노산의 인접 스트레치에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및 Travis 등 (1991) Genomics 10:733); 페리페린 (예를 들어, 도 7E에서 묘사된 아미노산 서열 (서열번호:14)의 약 400개의 아미노산 내지 약 470개의 아미노산의 인접 스트레치에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 망막 색소 상피-특이 단백질 (RPE65), (예를 들어, 도 7C에서 묘사된 아미노산 서열 (서열번호:12)의 약 200개의 아미노산 내지 247개의 아미노산의 인접 스트레치에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드) (참고, 예를 들어, 유전자은행 AAC39660; 및 Morimura 등 (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:3088); 간상체-유래된 추상체 생존력 인자 (RdCVF) (예를 들어, 도 7H, 7I, 및 7J 중 임의의 하나에서 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 맥락막결손 (예를 들어, 도 7G에서 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드); 색소성 망막염 GTPase 조절자 (RPGR) (예를 들어, 도 7S-7V 중 하나에 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드); 및 기타 동종의 것. 예를 들어, 일부 경우에, 적합한 RPGR 폴리펩타이드는 도 7S에서 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에, 적합한 RPGR 폴리펩타이드는 도 7T에서 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예로서, 일부 경우에, 적합한 RPGR 폴리펩타이드는 도 7U에서 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예로서, 일부 경우에, 적합한 RPGR 폴리펩타이드는 도 7V에서 묘사된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적합한 폴리펩타이드는 또한 하기를 포함한다: CHM (맥락막결손 (Rab 호송 단백질 1 (REP1))), 결함있거나 없을 때, 맥락막결손을 야기하는 폴리펩타이드 (참고, 예를 들어, Donnelly 등 (1994) Hum. Mol . Genet. 3:1017; 및 van Bokhoven 등 (1994) Hum. Mol . Genet. 3:1041); 및 크럼버스 동족체 1 (CRB1), 결함있거나 없을 때, 레버 선천성 흑내장 및 색소성 망막염을 야기하는 폴리펩타이드 (참고, 예를 들어, den Hollander 등 (1999) Nat. Genet. 23:217; 및 유전자은행 수탁 번호 CAM23328). 예를 들어, 적합한 REP1 폴리펩타이드는 도 7G에서 묘사된 아미노산 서열 세트 에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다.
적합한 폴리펩타이드는 간상체 cGMP-특정 3',5'-환형 포스포디에스테라제 하위단위 알파 (PDE6α), 간상체 cGMP-특정 3',5'-환형 포스포디에스테라제 하위단위 베타 동형체 1 (PDE6β 동형체 1), 간상체 cGMP-특정 3',5'-환형 포스포디에스테라제 하위단위 베타 동형체 2 (PDE6β 동형체 2), 간상체 cGMP-특정 3',5'-환형 포스포디에스테라제 하위단위 베타 동형체 3 (PDE6β 동형체 3)를 포함한다. 예를 들어, 적합한 PDE6α 폴리펩타이드는 도 7K에서 묘사된 아미노산 서열 세트에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 적합한 PDE6β6 동형체 1 폴리펩타이드는 도 7L에서 묘사된 아미노산 서열 세트에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 적합한 PDE6β6 동형체 2 폴리펩타이드는 도 7M에서 묘사된 아미노산 서열 세트 에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 적합한 PDE6β6 동형체 3 폴리펩타이드는 도 7N에서 묘사된 아미노산 서열 세트에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다.
적합한 폴리펩타이드는 또한, 결함있거나 없을 때, 색맹으로 이어지는 폴리펩타이드 를 포함하고, 그와 같은 폴리펩타이드는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 원추 광수용체 cGMP-관문 채널 하위단위 알파 (CNGA3) (참고, 예를 들어, 유전자은행 수탁 번호 NP_001289; 및 Booij 등 (2011) Ophthalmology 118:160-167); 원추 광수용체 cGMP-게이팅된 양이온 통로 베타-하위단위 (CNGB3) (참고, 예를 들어, Kohl 등(2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302); 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질 (G 단백질), 알파 형질도입 활성 폴리펩타이드 2 (GNAT2) (ACHM4); 및 ACHM5; 및 결함있거나 없을 때, 다양한 형태의 색상 시각상실로 이어지는 폴리펩타이드 (예를 들어, L-옵신, M-옵신, 및 S-옵신). 참고 Mancuso 등 (2009) Nature 461(7265):784-787.
예를 들어, 적합한 CNGA3 (ACHM2 로도 공지됨) 동형체 1 폴리펩타이드는 도 7O에서 묘사된 아미노산 서열 세트 에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 적합한 CNGA3 (ACHM2로도 공지됨) 동형체 2 폴리펩타이드는 도 7P에서 묘사된 아미노산 서열 세트 에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 적합한 CNGB3 (로도 공지된다 ACHM3) 폴리펩타이드는 도 7Q에서 묘사된 아미노산 서열 세트 에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, GNAT2 (로도 공지된다 ACHM4)는 도 7R에서 묘사된 아미노산 서열 세트 에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다.
부위-특이적인 엔도뉴클레아제
일부 경우에, 관심 유전자 산물은 유전자 기능의 부위-특이적인 넉다운을 제공하는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제이되, 예를 들어, 상기 엔도뉴클레아제는 망막 질환과 관련된 대립유전자를 녹아웃시킨다. 예를 들어, 우세한 대립유전자는, 야생형일 때, 망막 구조 단백질이고/거나 정상 망막 기능을 제공하는 유전자의 결함있는 복제물 을 인코딩하는 경우, 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는 결함있는 대립유전자를 표적으로 할 수 있고 결함있는 대립유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 일부 경우에, 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다.
결함있는 대립유전자를 녹아웃시키는 것 외에, 부위-특이적인 뉴클레아제는 또한 결함있는 대립유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 기능적 복제물을 인코딩하는 공여체 DNA와의 상동성 재조합을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당해 rAAV 비리온은 c 결함있는 대립유전자를 녹아웃시키는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제 둘 모두를 전달하기 위해 사용될 수 있고, 결함있는 대립유전자의 기능적 복제물을 전달하여, 결함있는 대립유전자의 회복을 초래하고, 그렇게 함으로써 기능적 망막 단백질 (예를 들어, 기능적 레티노쉬신, 기능적 RPE65, 기능적 페리페린, 등)의 생산을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 참고, 예를 들어, Li 등 (2011) Nature 475:217. 일부 구현예에서, 당해 rAAV 비리온은 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 이종성 뉴클레오타이드 서열; 및 결함있는 대립유전자의 기능적 복제물을 인코딩하는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 기능적 복제물은 기능적 망막 단백질을 인코딩한다. 기능적 망막 단백질은, 예를 들어, 레티노쉬신, RPE65, 색소성 망막염 GTPase 조절자 (RGPR)-상호작용 단백질-1, 페리페린, 페리페린-2, RdCVF, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
사용하는데 적합한 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs); 메가뉴클레아제; 및 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALENs)을 포함하되, 그와 같은 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는 비-자연 발생적이고, 변형되어 특이 유전자를 표적으로 한다. 그와 같은 부위-특이적인 뉴클레아제는 조작되어 게놈 내의 특정 위치를 절단할 수 있고, 비-상동성 말단 연결는 그 다음 몇 개의 뉴클레오타이드를 삽입 또는 결실시키면서 중단을 복구할 수 있다. 그와 같은 부위-특이적인 엔도뉴클레아제 (또한 일명 "INDELs")은 그 다음 단백질을 프렘임 밖으로 던지고 효과적으로 유전자를 녹아웃시킨다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2011/0301073. 적합한 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는 조작된 메가뉴클레아제 재-조작된 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 적합한 엔도뉴클레아제는 I-Tevl 뉴클레아제를 포함한다. 적합한 메가뉴클레아제는 I-Sce1을 포함한다 (참고, 예를 들어, Bellaiche 등 (1999) Genetics 152:1037); 및 I-Cre1 (참고, 예를 들어, Heath 등 (1997) Nature Sructural Biology 4:468).
RNA-유도된 엔도뉴클레아제
일부 경우에, 유전자 산물은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우에, 유전자 산물은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA이다. 일부 경우에, 유전자 산물은 가이드 RNA, 예를 들어, 단일-가이드 RNA이다. 일부 경우에, 유전자 산물은 하기이다: 1) 가이드 RNA; 및 2) RNA-유도된 엔도뉴클레아제. 가이드 RNA는 하기를 포함할 수 있다: a) RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 결합하는 단백질-결합 영역; 및 b) 표적 핵산에 결합하는 영역. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 또한 본 명세서에서 일명 "게놈 편집 뉴클레아제"이다.
적합한 게놈 편집 뉴클레아제의 예는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 예컨대 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제)이다. 따라서, 게놈 표적화 조성물은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 예컨대 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 게놈 표적화 조성물은 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 경우에, 게놈 표적화 조성물은 부류 2 유형 II CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 단백질) 를 포함한다. 일부 경우에, 게놈 표적화 조성물은 부류 2 유형 V CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, 또는 C2c3 단백질) 를 포함한다. 일부 경우에, 게놈 표적화 조성물은 부류 2 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, C2c2 단백질) 를 포함한다.
일부 경우에, 게놈 편집 뉴클레아제는 이종성 폴리펩타이드 (또한 일명 "융합 파트너")에 융합된 융합 단백질이다. 일부 경우에, 게놈 편집 뉴클레아제는 세포하 국재화를 제공하는 아미노산 서열 (융합 파트너)에 융합되고, 즉, 융합 파트너는 세포하 국재화 서열 (예를 들어, 핵, 2종 이상의 NLSs, 3 또는 그 초과 NLSs, 등을 표적으로 하기 위한 하나 이상의 핵 국재화 신호 (NLSs))이다.
일부 경우에, 게놈-편집 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Case 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우에, 게놈-편집 엔도뉴클레아제는 Cas9 폴리펩타이드이다. Cas9 단백질은 Cas9 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트와의 회합 덕분에 표적 핵산 서열 (예를 들어, 염색체 서열 또는 염색체외 서열, 예를 들어, 에피솜 서열, 미니서클 서열, 미토콘드리아 서열, 엽록체 서열, 등) 내의 표적 부위 (예를 들어, 표적 부위에서 안정화됨)로 유도된다. 일부 경우에, Cas9 폴리펩타이드는 도 8A에서 묘사된 연쇄상구균 파이오제네스 Cas9에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 99% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조성물 또는 방법에서 사용된 Cas9 폴리펩타이드는 스타필로코쿠스 아우레스 Cas9 (saCas9) 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, saCas9 폴리펩타이드는 도 8B에서 묘사된 saCas9 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 적합한 Cas9 폴리펩타이드는 고-충실도 (HF) Cas9 폴리펩타이드이다. Kleinstiver 등 (2016) Nature 529:490. 예를 들어, 도 8A에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 N497, R661, Q695, 및 Q926은 예를 들어, 알라닌으로 치환된다. 예를 들어, HF Cas9 폴리펩타이드는 도 8A에서 묘하된 아미노산 서열 에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있되, 상기 아미노산 N497, R661, Q695, 및 Q926은 예를 들어, 알라닌으로 치환된다.
일부 경우에, 적합한 Cas9 폴리펩타이드는 변경된 PAM 특이성을 나타낸다. 참고, 예를 들어, Kleinstiver 등 (2015) Nature 523:481.
일부 경우에, 게놈-편집 엔도뉴클레아제는 유형 V CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우에 유형 V CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 Cpf1 단백질이다. 일부 경우에, Cpf1 단백질은 도 8C에서 묘사된 Cpf1개의 아미노산 서열에 대해 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 90%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 단백질; 유형 V 또는 유형 VI CRISPR/Cas 단백질; Cpf1 단백질; 등)에 결합하고 복합체를 표적 핵산 내의 특정 위치로 표적화하는 핵산은 본 명세서에서 일명 "가이드 RNA" 또는 "CRISPR/Cas 가이드 핵산" 또는 "CRISPR/Cas 가이드 RNA"이다. 가이드 RNA는 표적 핵산의 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열인 가이드 서열 (또한 본 명세서에서 일명 표적화 서열)을 포함하는 표적화 분절을 포함함으로써 복합체 (RNP 복합체)에 대해 표적 특이성을 제공한다.
일부 경우에, 가이드 RNA는 2개의 별개의 핵산 분자: "활성제" 및 "타겟터"를 포함하고, 본 명세서에서 일명 "이중 가이드 RNA", "이중-분자 가이드 RNA", "2-분자 가이드 RNA", 또는 "dgRNA"이다. 일부 경우에, 가이드 RNA는 하나의 분자 (예를 들어, 일부 부류 2 CRISPR/Cas 단백질에 대해, 상응하는 가이드 RNA는 단일 분자이고; 그리고 일부 경우에, 활성제 및 타겟터는, 예를 들어, 개입 뉴클레오타이드를 통해 서로 공유결합됨)이고, 그리고 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA", "단일-분자 가이드 RNA", "1-분자 가이드 RNA" 또는 간단히 "sgRNA"로 칭한다.
유전자 산물이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이거나 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA 둘 모두인 경우, 유전자 산물은 표적 핵산을 변형시킬 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 표적 핵산이 결함있는 대립유전자에서 유해한 돌연변이 (예를 들어, 망막 세포 표적 핵산에서 유해한 돌연변이)를 포함하는 경우, RNA-유도된 엔도뉴클레아제/가이드 RNA 복합체는, 유해한 돌연변이 (예를 들어, 결함있는 대립유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 기능적 복제물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열를 공여체 핵산)을 수정하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 공여체 핵산과 함께, 예를 들어, 상동 지정 복구 (HDR)를 통해 유해한 돌연변이를 수정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 유전자 산물은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 2 별개의 sgRNA이되, 상기 2개의 별개 sgRNA는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)를 통해 표적 핵산의 결실을 제공한다.
본 개시내용은 개체의 망막 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공하되, 상기 표적 핵산은 유해한 돌연변이를 포함하고, 상기 방법은 상기 개체에게 (예를 들어, 안구내에 의해; 유리체내; 등 투여) 본 개시내용의 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함하고, 상기 rAAV 비리온은 하기를 포함하는 이종성 핵산을 포함한다: i) RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제); ii) 상기 표적 핵산에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 sgRNA 을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 iii) 유해한 돌연변이를 정정하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 공여체 DNA 템플레이트를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열. rAAV 비리온의 투여는 HDR에 의해 상기 표적 핵산에서의 유해한 돌연변이의 정정을 초래한다.
본 개시내용은 개체의 망막 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공하되, 상기 표적 핵산은 유해한 돌연변이를 포함하고, 상기 방법은 상기 개체에게 (예를 들어, 안구내에 의해; 유리체내; 등 투여) 본 개시내용의 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함하고, 상기 rAAV 비리온은 하기를 포함하는 이종성 핵산을 포함한다: i) RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제); ii) 상기 표적 핵산에서 제1 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 sgRNA 을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 iii) 상기 표적 핵산에서 제2 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 sgRNA 을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열. rAAV 비리온의 투여는 NHEJ에 의해 상기 표적 핵산에서의 유해한 돌연변이의 절개를 초래한다.
조절 서열
일부 경우에, 관심 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 조절 요소 에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 일부 경우에, 관심 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 항시성 프로모터 에 작동가능하게 연결된다. 다른 사례에서, 관심 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 유도성 프로모터 에 작동가능하게 연결된다. 일부 사례에서, 관심 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 조직-특정 또는 세포 유형-특정 조절 인자 에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 일부 사례에서, 관심 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 망막 세포 특이적 프로모터 에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 일부 사례에서, 관심 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 광수용체-특정 조절 인자 (예를 들어, 광수용체-특정 프로모터), 예를 들어, 광수용체 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을 부여하는 조절 인자 에 작동가능하게 연결된다. 적합한 광수용체-특정 조절 인자는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 로돕신 프로모터; 로돕신 키나제 프로모터 (Young 등 (2003) Ophthalmol . Vis . Sci. 44:4076); 베타 포스포디에스테라제 유전자 프로모터 (Nicoud 등 (2007) J. Gene Med . 9:1015); 색소성 망막염 유전자 프로모터 (Nicoud 등 (2007) supra); 인터포토리셉터 레티노이드-결합 단백질 (IRBP) 유전자 증진제 (Nicoud 등 (2007) supra); IRBP 유전자 프로모터 (Yokoyama 등 (1992) Exp Eye Res. 55:225).
약제학적 조성물
본 개시내용은 하기를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다: a) 당해 rAAV 비리온, 상기에 기재된 바와 같이; 및 b) 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 완충액. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 완충액은 인간에 사용하기에 적합하다.
그와 같은 부형제, 캐리어, 희석제, 및 완충액은 과도한 독성 없이투여될 수 있는 임의의 약제학적 제제를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 액체 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올. 약제학적으로 허용가능한 염는 본 명세서에 내에 포함될 수 있고, 그 예는 무기산 염 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트, 및 기타 동종의 것; 및 유기 산의 염 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트, 및 기타 동종의 것이다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질, 및 등은, 그와 같은 비히클 내에 존재할 수 있다. 다양한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당해 기술에 공지되어 있고 본 명세서에서 상세히 논의될 필요는 없다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 예를 들어 하기를 포함하는 다양한 공보에 충분히 기재되었다: A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel 등, eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe 등, eds., 제3판. Amer. Pharmaceutical Assoc.
유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법 및 치료 방법
본 개시내용은 개체에서 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기에 기재된 바와 같은 당해 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함한다. 유전자 산물은 상기에 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 간섭 RNA (예를 들어, shRNA, siRNA, 및 기타 동종의 것), 압타머, 또는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제 (예를 들어, RNA-유도된 엔도뉴클레아제)일 수 있다. 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 것은 망막 질환의 치료를 제공할 수 있다. 망막 세포는 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 두극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포일 수 있다. 일부 경우에, 망막 세포는 광수용체 세포, 예를 들어, 간상 또는 원뿔 세포이다.
본 개시내용은 망막 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 망막 세포를 하기와 접촉시키는 것을 포함한다: 1) 본 개시내용의 rAAV 비리온으로서, 가이드 RNA에 결합하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 상기 rAAV 비리온; 및 2) 가이드 RNA. 본 개시내용은 망막 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 망막 세포를 본 개시내용의 rAAV 비리온과 접촉시키는 것을 포함하되, 상기 rAAV 비리온은 하기를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함한다: i) 가이드 RNA에 결합하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제; 및 ii) 가이드 RNA. 일부 경우에, 상기 방법은 망막 세포를 공여체 DNA 템플레이트와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 가이드 RNA는 단일-가이드 RNA이다.
본 개시내용은 안구 질환 (예를 들어, 망막 질환)을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그것이 필요한 개체에게 상기에 기재된 바와 같은 당해 rAAV 비리온의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 당해 rAAV 비리온은 안구내 주사를 통해, 유리체내 주사에 의해, 또는 임의의 다른 편리한 방식 또는 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 편리한 방식 또는 투여 경로는, 예를 들어, 정맥내, 비강내, 등을 포함한다.
"치료적 유효량"은 실험과정 및/또는 임상시험을 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위 내에 있을 것이다. 예를 들어, 생체내 주사, 즉, 눈에 직접 주사에 대해, 치료적으로 효과적인 용량은 대략 약 106 내지 약 1015의 rAAV 비리온, 예를 들어, 약 108 내지 1012 rAAV 비리온일 것이다. 시험관내 형질도입에 대해, 세포에 전달될 rAAV 비리온의 유효량은 대략 약 108 내지 약 1013의 rAAV 비리온일 것이다. 다른 효과적인 투약량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시험을 통해 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 확립될 수 있다.
일부 구현예에서, 1회 초과의 투여 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 초과 투여)는 유전자 발현의 원하는 수준을 달성하기 위해 이용될 수 있다. 일부 경우에, 1회 초과의 투여는 다양한 간격, 예를 들어, 매일, 매주, 매달 2회, 매월, 매 3 개월, 매 6 개월, 매년, 등으로 투여된다. 일부 경우에, 다중 투여는 1 개월 내지 2 개월, 2 개월 내지 4 개월, 4 개월 내지 8 개월, 8 개월 내지 12 개월, 1 년 내지 2 년, 2 년 내지 5 년, 또는 5 년 초과의 일정 기간에 걸쳐 투여된다.
본 발명을 사용하여 치료될 수 있는 안구 질환은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 급성 황반 신경망막증; 베체트병; 맥락막 신생혈관형성; 당뇨병성 포도막염; 히스토플라마증; 황반 변성, 예컨대 급성 황반 변성, 비-삼출성 연령 관련 황반 변성 및 삼출성 연령 관련 황반 변성; 부종, 예컨대 황반 부종, 포낭 황반 부종 및 당뇨병성 황반 부종; 다초점 맥락막염; 안구 트라우마 which 영향을 주다 안구 뒤쪽 부위 또는 위치; 안구 종양; 망막 장애, 예컨대 중심 망막 정맥 폐색, 당뇨 망막병증 (증식성 당뇨 망막병증 포함), 증식성 유리체망막병증 (PVR), 망막 동맥 폐쇄성 질환, 망막 탈착, 포도막 망막 질환; 교감성 안염; 보고트(Vogt) 고야나기-하라다 (VKH) 증후군; 포도막 확산; 안구 레이저 치료에 의해 야기되거나 영향을 받은 후측 안구 병태; 광역학적 요법에 의해 야기되거나 영향을 받은 후측 안구 병태; 광응고, 방사선 망막증; 망막앞 막 장애; 망막 분지 정맥 폐색; 전측 허혈성 시신경병증; 비-망막증 당뇨병성 망막 기능이상; 망막층간분리; 색소성 망막염; 녹내장; 어셔 증후군, 추상체-간상체 이상증; 스타가르트 질환 (황반 안저); 선천적 황반 변성; 맥락망막 퇴행; 레버 선천성 흑내장; 선천성 정지된 야맹증; 맥락막결손; 바데트-비들 증후군; 황반 모세혈관확장증; 레버 선천성 시신경병증; 미숙아 망막증; 색맹, 적색맹, 녹색맹, 및 청색맹을 포함하는 색각의 장애; 및 비에티 결정 이상증.
핵산 및 숙주세포
본 개시내용은 상기에 기재된 바와 같은 당해 변이체 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공하되, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 대한 GH 루프 또는 루프 IV에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산의 삽입을 포함하고, 그리고 상기 변이체 캡시드 단백질은, AAV 비리온 내에서 존재할 때, 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 상기 망막 세포의 감염성과 비교하여, 망막 세포의 증가된 감염성을 제공한다. 딩해 단리된 핵산는 AAV 벡터, 예를 들어, 재조합 AAV 벡터일 수 있다.
삽입 펩타이드
당해 핵산에 의해 인코딩된 변이체 AAV 캡시드 단백질은 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 길이의 삽입 펩타이드를 가지며, 이는 AAV 캡시드의 GH 루프에 삽입된다. 삽입 펩타이드는 5개의 아미노산, 6개의 아미노산, 7개의 아미노산, 8개의 아미노산, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 12개의 아미노산, 13개의 아미노산, 14개의 아미노산, 15개의 아미노산, 16개의 아미노산, 17개의 아미노산, 18개의 아미노산, 19개의 아미노산, 또는 20개의 아미노산의 길이를 갖는다. 적합한 삽입 펩타이드는 상기에 기재된 바와 같다. 적합한 삽입 펩타이드는 상기에 기재된 바와 같은 식 I-X 중 임의의 것의 펩타이드를 포함한다.
당해 재조합 AAV 벡터는 상기에 기재된 바와 같은 당해 재조합 AAV 비리온을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은, 적합한 세포에 도입될 때, 당해 재조합 AAV 비리온의 생산을 제공할 수 있는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로, 당해 핵산을 포함하는 숙주세포, 예를 들어, 단리된 (유전자 변형된) 숙주세포를 제공한다. 당해 숙주세포는 시험관내 배양에서, 단리된 세포, 예를 들어, 세포일 수 있다. 당해 숙주세포는 아래에 기재된 바와 같은 당해 rAAV 비리온을 생산하는데 유용하다. 당해 숙주세포가 당해 rAAV 비리온을 생산하기 위해 사용되는 경우, "포장 세포"라 칭한다. 일부 구현예에서, 당해 숙주세포는 당해 핵산으로 안정적으로 유전자 변형된다. 다른 구현예에서, 당해 숙주세포는 당해 핵산으로 일시적으로 유전자 변형된다.
당해 핵산은, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀-매개된 형질감염, 및 기타 동종의 것을 비제한적으로 포함하는 확립된 기숭을 사용하여 안정적으로 또는 일시적으로 숙주세포에 도입된다. 안정한 전환에 대해, 당해 핵산은 일반적으로 추가로, 선별 마커, 예를 들어, 몇 개의 공지된 선별 마커 중 임의의 것 예컨대 네오마이신 저항, 및 기타 동종의 것을 포함할 것이다.
당해 숙주세포는 당해 핵산을, 다양한 세포, 예를 들어, 쥣과 세포, 및 영장류 세포 (예를 들어, 인간 세포)를 포함하는 포유동물 세포 중 임의의 것에 도입함으로써 생성된다. 적합한 포유동물 세포는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 일차 세포 및 세포주를 포함하되, 적합한 세포주는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 293 세포, COS 세포, HeLa 세포, 베로(Vero) 세포, 3T3 마우스 섬유모세포, C3H10T1/2 섬유모세포, CHO 세포, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 적합한 숙주세포의 비-제한적인 예는, 예를 들어, HeLa 세포 (예를 들어, 미국 종균 협회 (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예를 들어, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1573), 베로(Vero) 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들어, ATCC No. CCL10), PC12 세포 (ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포 (ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 당해 숙주세포는 또한 AAV를 생산하는 곤충 세포 예컨대 Sf9 세포를을 감염시키기 위해 배큘로바이러스를 사용하여 제조될 수 있다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,271,002; US 특허 출원 12/297,958)
일부 구현예에서, 당해 유전자 변형된 숙주세포는 상기에 기재된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 외에, 하나 이상의 AAV rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 당해 숙주세포는 추가로 rAAV 벡터를 포함한다. rAAV 비리온은 당해 숙주세포를 사용하여 생성될 수 있다. rAAV 비리온을 생성하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2005/0053922 및 미국 특허 공보 번호 2009/0202490에 기재되어 있다.
개시내용의 비제한적인 양태의 예
상기 기재된 본 주제의, 구현예를 포함하는, 양태는, 하나 이상의 다른 양태 또는 구현예로, 단독으로 또는 조합으로 유익할 수 있다. 선행 기재의 제한 없이, 1-34 넘버링된 본 개시내용의 특정 비-제한 양태는 아래 제공된다. 본 개시내용 판독시 종래기술의 숙련가에 명백할 바와 같이, 개별적으로 넘버링된 양태의 각각은 선행 또는 후행 개별적으로 넘버링된 양태의 어느 하나와 조합될 수 있거나 사용될 수 있다. 이것은 양태의 모든 그와 같은 조합을 위하여 뒷받침을 제공하기 위한 의도이고 아래 명확하게 제공된 양태의 조합에 제한되지 않는다:
양태 1. 하기를 포함하는, 재조합 아데노-관련된 바이러스 (rAAV) 비리온: a) 변이체 AAV 캡시드 단백질로서, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 대해 상기 캡시드 단백질 GH 루프에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산의 길이를 갖는 이종성 펩타이드의 삽입을 포함하고, 그리고 상기 변이체 캡시드 단백질은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 대조군 AAV 비리온에 의해 상기 망막 세포의 감염성과 비교된 망막 세포의 증가된 감염성을 부여하는, 변이체 AAV 캡시드 단백질; 및 b) 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산.
양태 2. 양태 1의 rAAV 비리온으로서, 상기 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 대조군 AAV 비리온에 의해 상기 망막 세포의 감염성과 비교된 망막 세포의 적어도 5-배수 증가된 감염성을 나타낸다.
양태 3. 양태 1의 rAAV 비리온으로서, 상기 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의해 상기 망막 세포의 감염성과 비교된 망막 세포의 적어도 10-배수 증가된 감염성을 나타낸다.
양태 4. 양태 1 내지 3 중 임의의 하나의 rAAV 비리온으로서, 상기 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의해 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 또는 망막 색소 상피에 대한 국제화의 정도와 비교하여, 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 및 망막 색소 상피 중 하나 이상에 대해 적어도 5-배수 증가된 국재화를 나타낸다.
양태 5. 양태 1 내지 4 중 임의의 하나의 rAAV 비리온으로서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 VP1의 아미노산 570 및 611에 상응하는 아미노산, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 있다.
양태 6. 양태 1 내지 5 중 임의의 하나의 rAAV 비리온으로서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 VP1의 아미노산 587 내지 588에 상응하는 아미노산, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 있다.
양태 7. 양태 1 내지 6 중 임의의 하나의 rAAV 비리온으로서, 상기 유전자 산물은 간섭 RNA 또는 압타머이다.
양태 8. 양태 1 내지 6 중 임의의 하나의 rAAV 비리온으로서, 상기 유전자 산물은 폴리펩타이드이다.
양태 9. 양태 8의 rAAV 비리온으로서, 상기 폴리펩타이드는 신경보호성 폴리펩타이드, 항-혈관신생 폴리펩타이드, 또는 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드이다.
양태 10. 양태 8의 rAAV 비리온으로서, 상기 폴리펩타이드는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다.
양태 11. 양태 10의 rAAV 비리온으로서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 폴리펩타이드이다.
양태 12. 양태 10의 rAAV 비리온으로서, 상기 유전자 산물은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA이다.
양태 13. 양태 1 내지 12 중 임의의 것의 rAAV 비리온으로서, 상기 GH 루프에 삽입된 이종성 펩타이드는 식 I-X 중 임의의 하나의 것이다.
양태 14. 양태 1 내지 12 중 임의의 것의 rAAV 비리온으로서, 상기 이종성 펩타이드는 하기 식 I의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
식 중:
X1는 Leu, Ile, Pro, 또는 Gln이고;
X2는 Ala, Pro, Ser, Asp, Gly, Thr, 또는 Val이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, 또는 Tyr이고;
X4는, 존재한다면, Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, Asn, Glu, Lys, 또는 Arg이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, Ala, Asn, Lys, 또는 Tyr이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, Pro, 또는 Ile;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, 또는 Cys이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, Thr, Ala, Glu, Ile, 또는 Asn이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala, Phe, Asp, Thr, Val, 또는 Met이다.
양태 15. 양태 14의 rAAV 비리온으로서, 상기 이종성 펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (19) LAAQGTAKKPA (서열번호:65); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (21) LAASDSTKAA (서열번호:67); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (23) LAKADETRPA (서열번호:69); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTNA (서열번호:75); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); (32) LAISDQSKPA (서열번호:78); (33) LADATKTA (서열번호:79); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81); (36) LAPQDTKKNA (서열번호:82); (37) LATSDSTKAA (서열번호:83); (38) LAVDGSQRSA (서열번호:84); (39) LPISDQTKHA (서열번호:85); (40) LPKDATKTIA (서열번호:86); (41) LPPQDTTKNA (서열번호:87); (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88); (43) QAHQDTTKNA (서열번호:89); (44) LAHETSPRPA (서열번호:90); (45) LAKSTSTAPA (서열번호:91); (46) LADQDTTKNA (서열번호:92); (47) LAESDQSKPA (서열번호:93); (48) LAHKDTTKNA (서열번호:94); (49) LAHKTQQKM (서열번호:95); (50) LAHQDTTENA (서열번호:96); (51) LAHQDTTINA (서열번호:97); (52) LAHQDTTKKT (서열번호:98); (53) LAHQDTTKND (서열번호:99); (54) LAHQDTTKNT (서열번호:100); (55) LAHQDTTKNV (서열번호:101); (56) LAHQDTTKTM (서열번호:102); (57) LAHQNTTKNA (서열번호:103); (58) LAHRDTTKNA (서열번호:104); (59) LAISDQTNHA (서열번호:105); (60) LAKQKSASTA (서열번호:106); (61) LAKSDQCKPA (서열번호:107); (62) LAKSDQSKPD (서열번호:108); (63) LAKSDQSNPA(서열번호:109); (64) LAKSYQSKPA (서열번호:110); (65) LANQDTTKNA (서열번호:111); (66) LAPQNTTKNA (서열번호:112); (67) LAPSSIQKPA (서열번호:113); (68) LAQQDTTKNA (서열번호:114); (69) LAYQDTTKNA (서열번호:115); (70) LDHQDTTKNA (서열번호:116); (71) LDHQDTTKSA (서열번호:117); (72) LGHQDTTKNA (서열번호:118); (73) LPHQDTTKND (서열번호:119); (74) LPHQDTTKNT (서열번호:120); (75) LPHQDTTNNA (서열번호:121); (76) LTHQDTTKNA (서열번호:122); (77) LTKDATKTIA (서열번호:123); (78) LTPQDTTKNA (서열번호:124); 및 (79) LVHQDTTKNA (서열번호:125).
양태 16. 양태 1 내지 12 중 임의의 것의 rAAV 비리온으로서, 상기 이종성 펩타이드는 하기 식 II의 펩타이드이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10,
X1는 Leu, Ile, 또는 Pro이고;
X2는 Ala, Pro, 또는 Ser이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, 또는 Ala이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, 또는 Asn이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, 또는 Ala이고;
X6은 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, 또는 Pro이고;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, 또는 Ala이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, 또는 Thr이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala이다.
양태 17. 양태 16의 rAAV 비리온으로서, 상기 펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64); (19) LAAQGTAKKPA (서열번호:65); (20) LAPDQTTRNA (서열번호:66); (21) LAASDSTKAA (서열번호:67); (22) LAPQDTTKNA (서열번호:68); (23) LAKADETRPA (서열번호:69); (24) LAHQDTAKNA (서열번호:70); (25) LAHQDTKKNA (서열번호:71); (26) LAHQDTTKHA (서열번호:72); (27) LAHQDTTKKA (서열번호:73); (28) LAHQDTTRNA (서열번호:74); (29) LAHQDTTNA (서열번호:75); (30) LAHQGTTKNA (서열번호:76); (31) LAHQVTTKNA (서열번호:77); (32) LAISDQSKPA (서열번호:78); (33) LADATKTA (서열번호:79); (34) LAKDTTKNA (서열번호:80); (35) LAKSDQSRPA (서열번호:81); (36) LAPQDTKKNA (서열번호:82); (37) LATSDSTKAA (서열번호:83); (38) LAVDGSQRSA (서열번호:84); (39) LPISDQTKHA (서열번호:85); (40) LPKDATKTIA (서열번호:86); (41) LPPQDTTKNA (서열번호:87); 및 (42) PAPQDTTKNA (서열번호:88);.
양태 18. 양태 16의 rAAV 비리온으로서, 상기 펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함한다: (1) LAKDATKNA (서열번호:47); (2) PAHQDTTKNA (서열번호:48); (3) LAHQDTTKNA (서열번호:49); (4) LATTSQNKPA (서열번호:50); (5) LAISDQTKHA (서열번호:51); (6) IARGVAPSSA (서열번호:52); (7) LAPDSTTRSA (서열번호:53); (8) LAKGTELKPA (서열번호:54); (9) LAIIDATKNA (서열번호:55); (10) LAVDGAQRSA (서열번호:56); (11) PAPQDTTKKA (서열번호:57); (12) LPHQDTTKNA (서열번호:58); (13) LAKDATKTIA (서열번호:59); (14) LAKQQSASTA (서열번호:60); (15) LAKSDQSKPA (서열번호:61); (16) LSHQDTTKNA (서열번호:62); (17) LAANQPSKPA (서열번호:63); 및 (18) LAVSDSTKAA (서열번호:64).
양태 19. 하기를 포함하는 약제학적 조성물: a) 양태 1 내지 18 중 임의의 하나의 재조합 아데노-관련된 바이러스 비리온; 및 b) 약제학적으로 허용가능한 부형제.
양태 20. 개체에서 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개체에게 양태 1 내지 18 중 임의의 하나에 따른 재조합 아데노-관련된 바이러스 (rAAV) 비리온을 투여하는 것을 포함한다.
양태 21. 양태 20의 방법으로서, 상기 유전자 산물은 폴리펩타이드이다.
양태 22. 양태 20의 방법으로서, 상기 유전자 산물은 짧은 간섭 RNA 또는 압타머이다.
양태 23. 양태 21의 방법으로서, 상기 폴리펩타이드는 신경보호성 인자, 항-혈관신생 폴리펩타이드, 항-세포자멸적 인자, 또는 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드이다.
양태 24. 양태 21의 방법으로서, 상기 폴리펩타이드는 신경교 유래된 신경친화성 인자, 섬유모세포 성장 인자 2, 뉴르투린, 섬모 신경친화성 인자, 신경 성장 인자, 뇌 유래된 신경친화성 인자, 표피 성장 인자, 로돕신, 세포자멸사의 X-연결된 억제제, 레티노쉬신, RPE65, 색소성 망막염 GTPase-상호작용 단백질-1, 페리페린, 페리페린-2, 로돕신, RdCVF, 색소성 망막염 GTPase 조절자 (RPGR), 또는 소닉 헤지혹이다.
양태 25. 양태 21의 방법으로서, 상기 폴리펩타이드는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다.
양태 26. 안구 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 그것이 필요한 개체에게 양태 1 내지 18 중 임의의 하나에 따른 재조합 아데노-관련된 바이러스 (rAAV) 비리온의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
양태 27. 양태 26의 방법으로서, 상기 투여는 안구내 주사에 의한 것이다.
양태 28. 양태 26의 방법으로서, 상기 투여는 유리체내 주사에 의한 것이다.
양태 29. 양태 26의 방법으로서, 상기 안구 질환은 녹내장, 색소성 망막염, 황반 변성, 망막층간분리, 레버 선천성 흑내장, 당뇨 망막병증, 색맹, 또는 색상 시각상실이다.
양태 30. 변이체 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산으로서, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 대해 캡시드 단백질 GH 루프에서 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산의 삽입을 포함하고, 그리고 상기 변이체 캡시드 단백질은, AAV 비리온 내에서 존재할 때, 망막 세포의 AAV 비리온의 증가된 감염성을 제공하고, 그리고 상기 아미노산 삽입은 천연 AAV 캡시드의 GH 루프에 있고, 상기 삽입은 식 I-X 중 임의의 것의 펩타이드이다.
양태 31. 양태 30의 단리된 핵산으로서, 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587 내지 588, AAV1의 아미노산 590 내지 591, AAV5의 아미노산 575 내지 576, AAV6의 아미노산 590 내지 591, AAV7의 아미노산 589 내지 590, AAV8의 아미노산 590 내지 591, AAV9의 아미노산 588 내지 589, 또는 AAV10의 아미노산 588 내지 589이다.
양태 32. 양태 30 또는 양태 31의 핵산을 포함하는, 단리된, 유전자 변형된 숙주세포.
양태 33. 변이체 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산의 삽입을 포함하고, 상기 아미노산 삽입은 천연 AAV 캡시드의 GH 루프에 있고, 상기 삽입은 식 I-X 중 임의의 것의 펩타이드이다.
양태 34. 양태 1 내지 33 중 임의의 것에서, 상기 GH 루프에 삽입된 이종성 펩타이드 식 I-X 중 하나일 수 있다,
식 I은 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10이되,
X1는 Leu, Ile, Pro, 또는 Gln이고;
X2는 Ala, Pro, Ser, Asp, Gly, Thr, 또는 Val이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, 또는 Tyr이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, Asn, Glu, Lys, 또는 Arg이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, Ala, Asn, Lys, 또는 Tyr이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, Pro, 또는 Ile;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, 또는 Cys이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, Thr, Ala, Glu, Ile, 또는 Asn이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala, Phe, Asp, Thr, Val, 또는 Met이고;
식 II는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10이되,
X1는 Leu, Ile, 또는 Pro이고;
X2는 Ala, Pro, 또는 Ser이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, 또는 Ala이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, 또는 Asn이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, 또는 Ala이고;
X6은 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, 또는 Pro이고;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, 또는 Ala이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, 또는 Thr이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala이고;
식 III는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10이되,
X1는 Leu, Ile, 또는 Pro이고;
X2는 Ala, Pro, 또는 Ser이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, Val, Arg, 또는 Ala이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, Gly, Thr, Ile, 또는 Asn이고;
X5는 Asp, Ser, Gln, Val, Thr, Gly, 또는 Ala이고;
X6은 Thr, Ala, Gln, Ser, Glu, 또는 Pro이고;
X7는 Thr, Ser, Asn, Pro, Leu, Gln, Lys, 또는 Ala이고;
X8는 Lys, Ser, Arg, 또는 Thr이고;
X9는 Asn, Pro, Ser, Lys, His, Ile, Thr, 또는 Ala이고; 그리고
X10는 Ala, Thr, Asp Val, 또는 Met이고;
식 IV는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10이되,
X1는 Leu이고;
X2는 Ala이고;
X3는 Lys, His, Thr, Ile, Pro, 또는 Val이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, 또는 Gly이고;
X5는 Asp, Ser, 또는 Gln이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, 또는 Ser이고;
X7는 Thr 또는 Ser이고;
X8는 Lys, Ser, 또는 Arg이고;
X9는 Asn, Pro, 또는 Ser이고; 그리고
X10는 Ala이고;
식 V는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10이되,
X1는 Leu이고;
X2는 Ala이고;
X3는 Lys 또는 His이고;
X4 (존재하면)는 Gln, Asp, Ser, 또는 Gly이고;
X5는 Asp, Ser, 또는 Gln이고;
X6는 Thr, Ala, Gln, 또는 Ser이고;
X7는 Thr 또는 Ser이고;
X8는 Lys, Ser, 또는 Arg이고;
X9는 Asn, Pro, 또는 Ser이고; 그리고
X10는 Ala이고;
식 VI은 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10이되,
X1는 Leu이고;
X2는 Ala이고;
X3는 Asn, Lys, Thr, Gln, Ser, Ile, 또는 Leu이고;
X4는 Ser, Ala, Thr, Glu, Gln, Gly, Lys, 또는 Pro이고;
X5는 Asp, Pro, Glu, Thr, Asn, 또는 Arg이고;
X6는 Ile, His, Thr, Gln, Asn, Tyr, Asp, 또는 Glu이고;
X7는 Gln, Thr, Asn, Ala, 또는 Lys이고;
X8는 Lys, Thr, Arg, 또는 Asp이고;
X9는 Pro, Asn, Thr, Arg, Lys, 또는 Ser이고; 그리고
X10는 Ala이고;
식 VII는 LAHQDTTKX1X2X3 (서열번호:148)이되, 상기 X1는 Lys, Thr, Asn, 또는 His이고; X2는 Ala, Thr, Val, Ile, Met, 또는 Asp이고; 그리고 X3는, 존재한다면, Ala이고;
식 VIII는 LAX1QX2TX3X4X5X6 (서열번호:149)이되, 상기 X1는 Ala, Pro, Asp, 또는 His이고; X2는 Gly 또는 Asp이고; X3는 Ala, Thr, 또는 Lys이고; X4는 Asn, Glu, Lys, Arg, 또는 Thr이고; X5는 Leu, Asn, Lys, 또는 Thr이고; 그리고 X6는, 존재한다면, Ala, Thr, Asp, Val, 또는 Met이고;
식 IX는 X1AX2X3DX4TKX5A (서열번호:150)이되, 상기 X1는 Val 또는 Leu이고; X2는 Ile, Val, His, 또는 Asp이고; X3는 Glu, Ser, Lys, 또는 Gln이고; X4는 His, Ser, 또는 Thr이고; 그리고 X5는 Ser, Ala, Asn, His, 또는 Lys이고; 그리고
식 X는 X1X2X3AX4QX5TX6KNA (서열번호:151)이되, 상기 X1는, 존재한다면, Leu이고; X2는, 존재한다면, Ala이고; X3는 Lys, Leu, 또는 Pro이고; X4는 Asn, His, Pro, 또는 Tyr이고; X5는 Asn, Gly, Val, 또는 Asp이고; 그리고 X6는 Pro 또는 Thr이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 제조 방법 및 사용 방법의 완전한 개시 및 기재를 종래기술의 숙련가에 제공하기 위해 제시되고, 본 발명가가 그들의 발명으로서 고려하였던 것의 범위를 제한하기 위한 의도도 아니고 이들이 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내기 위한 의도도 아니다. 사용된 숫자(예를 들면, 양, 온도, 등)에 관하여 정확성을 확보하기 위해 노력하였지만 일부 실험 오차 및 편차는 고려될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 근처이다. 표준 약어는 사용될 수 있다, 예를 들어, bp, 염기 쌍(들); kb, 킬로염기(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로염기(들); bp, 염기 쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c., 피하(로); 기타 동종.
실시예 1: AAV 캡시드 변이체를 가진 AAV 비리온의 일반화 및 특성화
반복 생체내 스크리닝 방법론은 대형 동물 눈에서 범망막 AAV 감염을 예방하는 중요한 그리고 복잡한 장벽을 극복할 수 있는 캡시드 변이체를 가진 AAV를 창출하는데 사용되었다. 개는, 인간과 유사한 눈 크기 및 구조를 가진, 망막 변성 질환에 대하여 중요한 전임상 모델이고, 망막 질환의 많은 형태가 다양한 개 품종에서 자연적으로 발생하고 있다. 스크리닝 방법은 개 망막에서 범망막 감염할 수 있는 96 AAV 변이체를 확인하는데 사용되었다. 심층 서열분석은 개 망막내 스크리닝된 AAV의 풀로부터 이들 변이체의 18의 성능을 정량화하는데 사용되었다. 감염성은 유리체내 주사 이후 망막 세포에서 바이러스 DNA 및 mRNA의 수준을 기준으로 하여 정량화되었다. 이들 변이체는 대형 동물 및 인간 눈에서 광범위의 유전자 전달 전략에 사용될 수 있다.
AAV 캡시드상의 표면 노출된 위치에서 (5' 6-뉴클레오타이드 링커 및 3' 3-뉴클레오타이드 링커에 의해 둘러싸인) 랜덤 21-뉴클레오타이드 삽입물을 함유하는 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 창출되었다. 각각의 바이러스 게놈이 그 게놈이 인코딩하였던 캡시드 단백질 쉘 내에 캡시드화되었던 정도로 바이러스는 패키징되었다. 그러므로 선택을 통해 확인된 기능적 개량은 바이러스 캡시드 내에 함유된 게놈 서열에 연결될 수 있다. 이러한 라이브러리로부터, 반복 생체내 스크리닝 선택 공정은 유리체로부터 개 망막을 감염시키는 능력을 가진 변이체를 확인하는데 사용되었다 (도 1). 개 눈은 ~250 μL의 10E+13 - 10E+14 바이러스 게놈/mL (vg/mL) 역가 바이러스로 각각의 라운드에서 주사되었다. 주사 3주 후, 눈은 적출되었고, 망막 펀치는 망막의 중심 및 주변 영역으로부터 실시되었다. RPE 세포는 망막 조직으로부터 분리되었고, 조직은 냉동되었다. DNA는 그 다음 망막 세포로부터 수집되었고, cap 유전자는 단리된 샘플로부터 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 증폭되었다. Cap 유전자는 후속 AAV 패키징에 사용되었다.
도 1. 개 망막 AAV 변이체를 개발하는데 사용된 지향성 진화 방법론의 예시. 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 창출되었고, AAV 벡터에 패키징되었고, 유리체내 주사를 통해 개 눈에 주사되었다. 선택의 반복 라운드는 벡터의 풀로부터 AAV 변이체를 양성적으로 선택하는데 사용되었다. 선택의 3 라운드는 오류 발생이 쉬운 PCR의 라운드가 뒤따랐고, 추가의 선택 라운드가 뒤따랐다.
선택의 5 라운드 이후, 일루미나 심층 서열분석은 AAV 변이체의 라이브러리에서 관련 표시에서 라운드에 걸쳐 증가하였던 변이체를 확인하는데 사용되었다. 바이러스 라이브러리에서 표시의 증가는 유리체로부터 개 망막을 감염시키는 능력 및 양성 선택을 나타낸다. ~10E+7 변이체의 라이브러리 중에서, 생체내 스크린에서 선택되었던 상위 96 변이체는 표 1에서 제공된다.
Figure 112022057388841-pat00002
Figure 112022057388841-pat00003
Figure 112022057388841-pat00004
Figure 112022057388841-pat00005
표 1에서 묘사된 96 변이체 중 상위 18 변이체의 개 망막을 감염시키는 능력은 고 처리 서열분석을 사용하여 추가로 정량화되었다. 표 2는 추가 정량화를 위하여 선택된 상위 18 변이체를 묘사한다.
Figure 112022057388841-pat00006
18 변이체는 GFP의 유비쿼터스 CAG 프로모터 구동 발현으로 패키징되었다. GFP cDNA는 고유 25 염기-쌍 바 코드 식별기에 융합되었다. 각각의 18 변이체는 고유 GFP 바코드로 패키징되었다. 패키징된 변이체는 동일 비율로 혼합되었고, 대조군 AAV2-기반 벡터 (자연적으로 발생하는 친계 혈청형을 나타내는 음성 대조군)과 함께, 망막 속에 주사되었다. 주사 후, DNA 및 mRNA는 광수용체 및 RPE 세포로부터 수집되었다. DNA 및 mRNA 수준은 망막에 DNA를 전달하기 위한 그리고 전이유전자 발현을 초래하기 위한 개-유도된 벡터의 능력을 결정하기 위해 정량화되었다 (도 2).
도 2. GFP-바코드 작제물을 함유하는 변이체의 심층 서열분석. 개-유도된 변이체에 의한 개 망막의 감염은 태깅된 GFP cDNA 및 mRNA의 심층 서열분석에 의해 정량화되었다.
18-구성원 라이브러리의 발현은 냉동된 망막 부문의 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. GFP 발현은 내부 망막에서 망막 세포, 그리고 외부 망막에서 광수용체가 18-구성원 라이브러리로 표적화되었다는 것을 보여주었다 (도 3).
도 3. 18-구성원 개-유도된 AAV 변이체 라이브러리는 결절종 세포층, 내부 핵층, 광수용체 층, 및 RPE 층에서 세포를 감염시킨다.
시험된 상위 18 변이체 중에서, 2 변이체는 최고 수준의 DNA 및 mRNA 회수를 초래하였다. 최고 수준의 DNA 회수를 초래하는 변이체는 삽입 서열 ~588- PAPQDTTKKA (서열번호:57) 을 가졌다. 최고 수준의 mRNA 발현을 초래하는 변이체는 삽입 서열 ~588- LAPDSTTRSA (서열번호:53)을 가졌다.
본 발명이 이의 특정 구현예를 참조로 기재되어 있는 동안, 본 발명의 진정한 사상 및 범위에서 이탈 없이 다양한 변화가 실시될 수 있고 등가물이 치환될 수 있다는 것이 종래기술의 숙련가에 의해 이해되어야 한다. 게다가, 특정한 상황, 물질, 당해 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을, 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 적응시키기 위해 다수 변형이 실시될 수 있다. 모든 그와 같은 변형은 여기에 첨부된 청구항의 범위 내이도록 의도된다.
<110> The Regents of the University of California <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS VIRIONS WITH VARIANT CAPSID AND METHODS OF USE THEREOF <130> BERK-335WO <150> 62/368,929 <151> 2016-07-29 <160> 152 <170> KoPatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 733 <212> PRT <213> Adeno-associated virus-2 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Adeno-associated virus-2 <400> 2 Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg 1 5 10 15 Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu 20 25 30 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 119 Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Asp 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 120 Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Thr 1 5 10 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 121 Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Asn Asn Ala 1 5 10 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 122 Leu Thr His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 123 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 123 Leu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile Ala 1 5 10 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 124 Leu Thr Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 125 Leu Val His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 126 Leu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Thr Pro Ala 1 5 10 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 127 Leu Ala Thr Thr Pro Ile Thr Lys Pro Ala 1 5 10 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 128 Leu Ala Thr Thr Pro Ile Ala Lys Pro Ala 1 5 10 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 129 Leu Ala Ile Glu Asp His Thr Lys Ser Ala 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 130 Leu Ala Gln Ser Glu His Gln Arg Pro Ala 1 5 10 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 131 Leu Ala Lys Ser Pro Asn Lys Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 132 Leu Ala Asn Gln Asp Tyr Thr Lys Thr Ala 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 133 Leu Ala Asn Ser Thr Asp Gln Thr Arg Ala 1 5 10 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 134 Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro Ala 1 5 10 <210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 135 Leu Ala Asn Ser Thr Glu Gln Thr Arg Ala 1 5 10 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 136 Leu Ala Gln Ala Asp Thr Thr Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 137 Leu Ala Ser Lys Asp Ile Thr Lys Thr Ala 1 5 10 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 138 Leu Ala Ser Pro Arg His Asn Lys Lys Cys 1 5 10 <210> 139 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 139 Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Thr Ile Ala 1 5 10 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 140 Leu Ala Ala Gln Gly Thr Ala Asn Leu 1 5 <210> 141 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 141 Val Ala Ile Glu Asp His Thr Lys Ser Ala 1 5 10 <210> 142 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 142 Leu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Thr Pro Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is any amino acid <400> 143 Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Xaa 1 5 10 <210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 144 Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Asp 1 5 10 <210> 145 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 145 Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Val 1 5 10 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 146 Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Met 1 5 10 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 147 Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro 1 5 <210> 148 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Lys, Thr, Asn, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is Ala, Thr, Val, Ile, Met, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is Ala <400> 148 Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Ala, Pro, Asp, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Ala, Thr, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Asn, Glu, Lys, Arg, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Leu, Asn, Lys, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is Ala, Thr, Asp, Val, or Met <400> 149 Leu Ala Xaa Gln Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 150 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Ile, Val, His, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa is Glu, Ser, Lys, or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is His, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Ser, Ala, Asn, His, or Lys <400> 150 Xaa Ala Xaa Xaa Asp Xaa Thr Lys Xaa Ala 1 5 10 <210> 151 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Lys, Leu, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is Asn, His, Pro, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Asn, Gly, Val, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Pro or Thr <400> 151 Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Thr Xaa Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 152 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 152 cgcaaucagu gaaugcuuau acauccg 27

Claims (33)

  1. 하기를 포함하는, 재조합 아데노-관련된 바이러스 (rAAV) 비리온:
    a) 변이체 AAV 캡시드 단백질로써, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 대해 상기 캡시드 단백질 GH 루프에서 10개의 아미노산 내지 20개의 아미노산의 길이를 갖는 이종성 펩타이드의 삽입을 포함하고,
    여기에서 상기 이종성 펩타이드는 LAPDSTTRSA (서열번호:53)의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 변이체 캡시드 단백질은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 대조군 AAV 비리온에 의해 망막 세포의 감염성과 비교된 망막 세포의 증가된 감염성을 부여하는, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질; 및
    b) 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 대조군 AAV 비리온에 의해 상기 망막 세포의 감염성과 비교된 망막 세포의 적어도 5-배수 증가된 감염성을 나타내거나, 또는 상기 rAAV 비리온은 상기 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의해, 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 또는 망막 색소 상피에 대한 국재화의 정도와 비교하여, 내부 핵 층, 외부 핵 층, 광수용체 층, 신경절 세포 층, 및 망막 색소 상피 중 하나 이상에 대해 적어도 5-배수 증가된 국재화를 나타내는 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온
  3. 제1 항에 있어서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 VP1의 아미노산 570 및 611에 상응하는 아미노산, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 있는 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온.
  4. 제3 항에 있어서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 VP1의 아미노산 587 및 588에 상응하는 아미노산, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 있는 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온.
  5. 제1 항에 있어서, 유전자 산물은
    a) 간섭 RNA 또는 압타머;
    b) 선택적으로 신경보호성 폴리펩타이드, 항-혈관신생 폴리펩타이드, 항-세포자멸적 폴리펩타이드, 또는 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드, 또는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제인 폴리펩타이드인 폴리펩타이드; 또는
    c) RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA
    인 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온.
  6. 제1 항에 있어서, 이종성 유전자 산물은 신경교 유래된 신경친화성 인자, 섬유모세포 성장 인자 2, 뉴르투린, 섬모 신경친화성 인자, 신경 성장 인자, 뇌 유래된 신경친화성 인자, 표피 성장 인자, 로돕신, 세포자멸사의 X-연결된 억제제, 레티노쉬신, RPE65, 색소성 망막염 GTPase-상호작용 단백질-1, 페리페린, 페리페린-2, 로돕신, RdCVF, 색소성 망막염 GTPase 조절자 (RPGR), 또는 소닉 헤지혹인 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온.
  7. 제1 항에 있어서, 이종성 펩타이드는 LAPDSTTRSA (서열번호:53)의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온.
  8. 제1 항에 있어서, 상기 유전자 산물은 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 rAAV 비리온.
  9. a) 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노-관련된 바이러스 (rAAV) 비리온; 및
    b) 약제학적으로 허용가능한 부형제
    를 포함하는 안구 질환 치료용 약제학적 조성물.
  10. 인간을 제외한 개체에서 유전자 산물을 망막 세포에 전달하는 방법으로써, 상기 개체에게 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노-관련된 바이러스 (rAAV) 비리온을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제9 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온의 유효량이 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제11 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온은 안구내 주사되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제11 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온은 유리체내 주사되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제9 항에 있어서, 상기 안구 질환은 녹내장, 색소성 망막염, 황반 변성, 망막층간분리, 레버 선천성 흑내장, 당뇨 망막병증, 색맹, 또는 색상 시각상실인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 변이체 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산으로써, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 대해 캡시드 단백질 GH 루프에서 이종성 펩타이드의 삽입을 포함하고,
    여기에서 상기 이종성 펩타이드는 LAPDSTTRSA (서열번호:53)의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 변이체 캡시드 단백질은, AAV 비리온 내에서 존재할 때, 망막 세포의 AAV 비리온의 증가된 감염성을 제공하는, 단리된 핵산.
  16. 제15 항에 있어서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 VP1의 아미노산 570 및 611에 상응하는 아미노산, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 있는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  17. 제16 항에 있어서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587 및 588, AAV1의 아미노산 590 및 591, AAV5의 아미노산 575 및 576, AAV6의 아미노산 590 및 591, AAV7의 아미노산 589 및 590, AAV8의 아미노산 590 및 591, AAV9의 아미노산 588 및 589, 또는 AAV10의 아미노산 588 및 589인 것을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  18. 제15 항에 있어서, 상기 이종성 펩타이드는 LAPDSTTRSA (서열번호:53)의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  19. 제15 항에 있어서, 상기 이종성 펩타이드는 12개의 아미노산 내지 20개의 아미노산의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  20. 제15 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는, 단리된, 유전자 변형된 숙주 세포.
  21. 제20 항에 있어서, AAV rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된, 유전자 변형된 숙주 세포.
  22. 변이체 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질로써, 상기 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 친계 AAV 캡시드 단백질에 대해 캡시드 단백질 GH 루프에서 이종성 펩타이드의 삽입을 포함하고,
    여기에서 상기 이종성 펩타이드는 LAPDSTTRSA (서열번호:53)의 아미노산 서열을 포함하는, 변이체 AAV 캡시드 단백질.
  23. 제22 항에 있어서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 아미노산 587 및 588, AAV1의 아미노산 590 및 591, AAV5의 아미노산 575 및 576, AAV6의 아미노산 590 및 591, AAV7의 아미노산 589 및 590, AAV8의 아미노산 590 및 591, AAV9의 아미노산 588 및 589, 또는 AAV10의 아미노산 588 및 589인 것을 특징으로 하는 변이체 AAV 캡시드 단백질.
  24. 제23 항에 있어서, 상기 삽입 부위는 AAV2의 VP1의 아미노산 570 및 611에 상응하는 아미노산, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치 사이에 있는 것을 특징으로 하는 변이체 AAV 캡시드 단백질.
  25. 제22 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 펩타이드는 LAPDSTTRSA (서열번호:53)의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 변이체 AAV 캡시드 단백질.
  26. 제22 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 펩타이드는 12개의 아미노산 내지 20개의 아미노산의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 변이체 AAV 캡시드 단백질.
  27. 제1 항 내지 제7 항에 따른 rAAV 비리온을 생산하는 숙주 세포.
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