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KR102507548B1 - 인삼 추출물 및 깻잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

인삼 추출물 및 깻잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR102507548B1
KR102507548B1 KR1020200184773A KR20200184773A KR102507548B1 KR 102507548 B1 KR102507548 B1 KR 102507548B1 KR 1020200184773 A KR1020200184773 A KR 1020200184773A KR 20200184773 A KR20200184773 A KR 20200184773A KR 102507548 B1 KR102507548 B1 KR 102507548B1
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fine dust
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ginseng
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최학주
이유진
조윤호
이지선
김진성
유대석
조상원
차선우
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재단법인 금산인삼약초산업진흥원
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Abstract

본 발명은 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물인, 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지 의한 호흡기 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 인삼 추출물의 진세노사이드와 깻잎 추출물의 로즈마리산 등의 활성성분 등으로 인하여 미세먼지 노출에 의한 모델에서 활성산소종(ROS) 생성 감소, 염증성 사이토카인 감소, 염증 활성 세포 감소 및 기도 염증 및 내피 기능장애 관련 바이오 마커(Biomarker) 및 기침 관련 유전자 발현의 감소효과가 확인되어 미세먼지 의한 호흡기 질환 예방 및 개선에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인삼 추출물 및 깻잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition comprising Panax ginseng extract and Perilla frutescens leaves　extract for preventing, ameliorating or treating of respiratory diseases caused by fine dust}
본 발명은 인삼 추출물 및 깻잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
경제협력개발기구(OECD) “2017년 건강통계”에 의하면 우리나라 인구 10만명당 호흡기질환 사망률은 2013년 70명으로 2010년 67.5명보다 2.5명 늘었으며 미세먼지, 오존 등 대기환경 악화가 영향을 미쳤을 것으로 분석되고 있다.
미세먼지는 공기 중의 총 부유분진 중 직경 10 ㎛ 이하의 먼지(particulate matter less than 10 μm in diameter, PM10)로서 미세먼지를 흡입하면 하부 기관지 및 폐 실질까지 침착하여 호흡기계에 손상을 일으키고 기존 질환의 증상악화와 유병률 및 사망률을 증가시킨다.
서울지역 미세먼지 농도가 호흡기계 및 심혈관계의 외래 방문 및 입원과 진료비에 미치는 영향 보고서(한국환경보건학회지 2016)에 따르면 미세먼지 농도가 높아질 때마다 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 협심증 등의 환자가 증가하는 것으로 나타났다. 또한 천식은 만성 염증성 기도질환으로 이로 인한 이환과 사망은 환자에 직접적인 고통을 초래할 뿐만 아니라 사회경제적으로도 심각한 문제로 대두되고 있으며 전 세계적인 추세에 따라 우리나라도 천식의 유병률이 빠르게 증가하여 약 5~10%의 유병률에 영 유아부터 노인에 이르기까지 모든 연령에서 문제가 되고 있다.
또한 미세먼지는 천식환자의 기도와 폐포에 직접 침착하여 기도 염증을 악화시키고 기관지수축을 유도하는 등 다양한 기전에 의해 천식을 일으키거나 악화시킨다. COPD는 전세계 사망원인 4위, 국내사망원인 7위 질환으로 미세먼지가 자연경과에 악영향을 주어 급성악화를 유발함으로써 COPD 환자의 입원 률 및 사망률의 증가를 가져오는 것으로 알려져 있다.
이와 같이, 미세먼지의 증가는 폐 기능의 감소와 유의한 연관관계를 나타내고 있으며, 미세먼지 노출 후 기관지 폐포 세척액에서 폐대식세포, 호중구, 림프구의 증가가 관찰되고, 폐 조직에 호중구의 증가와 기관 조직에 림프구, 비만세포, IL-8 mRNA 발현의 증가를 가져온다고 알려져 있으나 미세먼지로 인한 급성 악화를 대상으로 하는 약물치료의 연구는 매우 부족한 실정으로 급성 악화의 예방과 치료에 대한 방안의 마련이 요구되고 있다. 그러나 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 발생에 대한 뚜렷한 대책이 없다.
이에 본 발명자들은 미세먼지에 의한 호흡기 질환과 관련하여, 천연물 소재를 연구하던 중, 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물인, 복합 추출물이 미세먼지에 의한 호흡기 보호 효과를 나타냄을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 인삼 추출물과 깻잎 추출물이 혼합된 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 인삼 추출물과 깻잎 추출물이 혼합된 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인삼 추출물과 깻잎 추출물이 혼합된 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능식품을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
상기 복합 추출물은 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 복합 추출물은 복합 추출물 전체 중량에 대하여 인삼 추출물 10 내지 90 중량%; 및 깻잎 추출물 10 내지 90 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 인삼 추출물은 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 혼합물은 인삼 추출물 총 중량에 대하여, 1 내지 3 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 깻잎 추출물은 로즈마리산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 로즈마리산은 상기 깻잎 추출물 총 중량 중 1 내지 10 중량% 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 복합 추출물은
1) 인삼 및 깻잎을 주정으로 추출하여 인삼 추출액과 깻잎 추출액을 각각 제조하는 단계;
2) 인삼 추출액과 깻잎 추출액을 각각 진공 농축하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계 후 각각 건조시키는 단계;를 포함하여 수득된 것 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 깻잎 추출물은 깨순 추출물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 미세먼지에 의한 호흡기 질환은 호흡기 염증성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive PulmonaryDisease; COPD), 부비강염, 알레르기성 비염, 하기도 감염증, 급만성기관지염, 폐렴, 기관지 천식, 기관지 확장증, 폐기종, 폐결핵 후유증, 급성 호흡 궁박증후군, 기침, 중이염, 인후염, 편도염, 후두염 및 폐섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있다.
본 발명은 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능식품에 있어서,
상기 복합 추출물은 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 인삼 추출물과 깻잎 추출물의 혼합물인 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 천연물 소재로, 독성을 나타내지 않으면서 안전하게 미세먼지에 의한 호흡기 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 인삼 추출물과 깻잎 추출물의 혼합물인 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 In vitro assay 및 In vivo assay에서, 미세먼지에 의해 생성발생된 활성산소종(ROS), 염증성 사이토카인, 염증활성 세포 등의 생리활성물질, 기도 염증 및 내피 기능장애 관련 바이오 마커(Biomarker) 및 기침 관련 유전자 발현의 감소효과가 확인되어, 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 제조예 1-2에 따른 인삼 추출물의 인삼 지표 물질을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 제조예 2-1에 따른 깻잎 추출물의 지표물질을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따른 복합 추출물을 호흡기의 대식세포주에 처리한 후 활성산소(ROS) 생성량을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2 및 3에 따른 복합 추출물을 호흡기의 대식세포주에 처리한 후 ROS 생성량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따른 복합 추출물을 미세먼지로 자극된 호흡기의 대식 세포주에 처리한 후 세포의 배양배지에서, 염증성 사이토카인(IL-6 및 TNF-a)의 생산량 분석에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 5B는 본 발명의 실시예 2 및 3에 따른 복합 추출물을 미세먼지로 자극된 호흡기의 대식 세포주에 처리한 후, 세포에서 염증성 사이토카인(IL-6 및 TNF-a)의 생산량 분석에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 폐 세척액(BALF), 폐(lung), 비장(spleen) 및 호중성 과립구(Neutrophil) 세포수 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6A는 BALF cell, 도 6B는 lung cell, 도 6C는 spleen, 도 6D는 호중성 과립구(Neutrophil) 세포 수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 ELISA assay를 통하여, 기관지 세포 세척액의 염증성 사이토카인을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 7A는 CXCL1, 도 7B는 IL-17, 도 7C는 MIP-2, 도 7D는 TNF-a를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 만성폐쇄성폐질환에서 기도 염증 및 내피 기능장애 지표인, SDMA(Symmetric-dimethylarginine)와 기침(cough) 관련 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 8A는 SDMA, 도 8B는 MUC5AC, 도 8C는 TRPV1 도 8D는 TRPA1의 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 염증성 사이토카인 유전자 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 9A는 TNF-a, 도 9B는 TARC, 도 9C는 COX-2, 도 9 D는 NOS-II 도 9 E는 MIP-2, 도 9 F는 CXCL-1 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 미세먼지에 의한 알레르기 천식 신호전달체인 IRAK1과 CD11b 단백질 발현을 면역형광법(Immune histology fluorescent)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 10A는 면역형광법 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 10B는 IRAK1단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이고, 도 10C는 CD11b 단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 미세먼지에 의한 폐질환 병인 관련 매개물질인, TNF-α와 MCP-1의 단백질 발현을 면역형광법로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 11A는 TNF-α 단백질 발현에 대한 면역형광법 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 11B는 TNF-α 단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이다. 또한 도 11C는 MCP-1단백질 발현에 대한 면역형광법 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 11D는 MCP-1 단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 염색(H&E, MT, PAS staining assay) 방법을 통한 폐 조직(Lung tissue) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 3에 따른 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 abPAS staining assay 방법을 통한 기관지 조직(trachea tissue) 검사 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하에서 본 발명에 대해 내용을 구체적으로 설명한다
이하 첨부된 도면들을 포함한 제조예, 실시예 또는 시험예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 제조예, 실시예 또는 시험예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
또한 명세서 및 첨부된 특허 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명에서 사용되는 용어의 단수 형태는 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
또한 본 발명에서 특별한 언급 없이 불분명하게 사용된 %의 단위는 중량%를 의미한다.
또한 본 발명에서, 미세먼지에 의해 생성 발생되는 생리활성물질은, 염증성 사이토카인, 염증활성 세포, 활성산소종 등을 의미하며, 미세먼지 미립자 또는 대기 미립자로 자극된 생리학적 또는 약리학적 형태를 의미하기도 한다.
또한 본 발명에서, ###는 미세먼지에 의해 생성발생된 생리활성물질이 미세먼지 또는 대기 미립자에 의해 정상군 대비 p<0.01, 신뢰도 99%로 유의적으로 증가한 것을 의미하는 것이다.
또한, *는 미세먼지에 의한 생성발생된 생리활성물질이 시험군에 의해, 대조군 대비 p<0.05, 신뢰도 95%로 유의수준 5%로 유의적으로 감소한 것을 의미한다. 또한, **는 미세먼지에 의한 생성발생된 생리활성물질이 시험군에 의해, 대조군 대비 p<0.01, 신뢰도 99%로 유의적으로 감소한 것을 의미한다. 또한 ***는 미세먼지에 의한 생성 발생된 생리활성물질이 시험군에 의해 대조군 대비 p<0.001, 신뢰도 99.9%로 유의적으로 감소한 것을 의미한다.
본 발명은 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 복합 추출물은 인삼 추출물 및 깻잎 추출물 혼합물인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 ‘복합 추출물’이란 천연물인 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물을 의미하며, 복합 추출물을 이용하여 제형화 된 모든 형태를 포함한다. 구체적으로는 분말형태이다. 상기 복합 추출물이 분말형태 또는 분말 상일 경우, 미세먼지에 의한 호흡기 질환과 관련하여 활성산소종(ROS) 생성 감소, 염증성 사이토카인 감소, 염증 활성 세포 감소 등의 효과가 우수하게 나타날 수 있다.
본 명세서 사용된 용어 '예방'은 본 발명의 조성물의 투여로 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 발명의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서 사용된 용어 '치료'란, 본 발명의 조성물의 투여로 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 증세를 호전시키거나, 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 복합 추출물은 인삼 추출물 10 내지 90 중량%; 및 깻잎 추출물 10 내지 90 중량%로 포함할 수 있다. 바람직하게는 인삼 추출물 20 내지 50 중량%; 및 상기 깻잎 추출물 50 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 상기 함량 범위에서 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 염증 활성 감소 효과가 보다 우수하게 나타날 수 있다.
상기 인삼은 파낙스(Panax) 속에 속하는 다년생 식물로, 비제한적인 예로 고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicus), 히말라야삼(Panaxa pseudoginseng). 베트남삼(Panax vietnamensis), 파낙스 엘레가티오르(Panax elegatior), 파낙스 완지아누스(Panax wangianus), 파낙스 비핀라티피두스(Panax bipinratifidus), 파낙스 안구스티폴리움(Panax angustifolium) 등이 있으며, 바람직하게는 고려인삼일 수 있다.
상기 고려 인삼은 가공에 따라, 수삼 홍삼, 백삼으로 나뉠 수 있으며, 수삼은 땅에서 캐어내 말리지 않은 상태를 의미한다. 홍삼은 6년근 수삼을 선별하여 껍질을 벗기지 않은 상태에서 증기로 쪄서 수분함량이 14% 이하가 되도록 건조시킨 담갈색의 색상을 띤 인삼을 의미한다. 백삼은 수삼의 껍질이 있는 그대로 또는 수삼의 껍질을 벗겨 열을 가해 수분을 날린 것을 의미한다.
백삼은 가공형태 및 방법에 따라, 본삼과 미삼으로 나뉠 수 있다. 본삼은 인삼류의 제조기준에 있어, 머리 몸통 및 다리부분으로 세미를 제외한 부분 또는 인삼의 원형이 그대로 유지되어 있는 것을 의미한다.
또한 미삼은 본삼에서 머리와 몸통에서 분리된 다리 부분과 세미를 의미하거나, 몸통에서 분리한 다리 또는 잔뿌리로 제조한 것을 의미한다.
상기 인삼 추출물은 DNA 및 RNA 합성 촉진 작용 및 면역활성 지표 물질인 진세노사이드 Rg1과 RNA 합성 촉진, 혈청 단백질 합성 촉진 작용을 하는 지표 물질인 진세노사이드 Rb1의 혼합물을 포함하는 것 일 수 있으며, 상기 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 혼합물은 인삼 추출물 총 중량에 대하여, 1 내지 3 중량%로 포함하는 것 일 수 있다. 상기 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 혼합물의 함량 조건을 만족할 경우, 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 개선 효과가 보다 우수하게 나타날 수 있다.
상기 깻잎은 들깨의 잎을 의미하며, 상기 들깨 (Perilla frutescens var japonica)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 한해살이풀로, 광대나무과에 속하며, 1 년생 초본과 식물로 한국, 중국, 인도 등 동남아시아에서 광범위하게 재배되고 있다. 상기 들깨는 통상 기름을 짜내기 위하여 재배되는 작물이다.
더욱 구체적으로는 상기 들깨의 잎, 들깻잎은 깨순과 깻잎으로 나뉠 수 있다. 깻순은 어린순, 어린 날 잎 또는 어린잎을 의미하며, 깻잎은 큰 잎 또는 늙은 잎을 의미한다. 통상적으로 깨순은 나물 또는 샐러드로 사용되며 깻잎은 쌈, 짱아찌로 사용된다.
들깨의 활성 성분으로는 페릴라알데하이드, 로즈마리산, 안토시아닌, 카페인산 등이 보고된 바 있으며, 이들의 성분은 높은 수용성을 가져, 섭취할 경우 높은 이용율을 기대할 수 있다.
상기 깻잎 추출물은 로즈마리산을 포함하며, 상기 로즈마리산은 상기 깻잎 추출물 총 중량 중 1 내지 10 중량% 포함하는 것 일 수 있다. 상기 로즈마리산의 함량 조건을 만족할 경우, 미세먼지에 의한 호흡기 질환과 관련하여, 염증성 사이토카인의 감소, 백혈구 수의 감소, 기도염증 및 염증활성 세포의 감소 등의 효과가 우수하게 나타날 수 있다.
상기 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물인 복합 추출물은, 상기 복합 추출물의 Rg1, Rb1 및 로즈마리산의 함량에 따라, 미세먼지에 의한 염증 감소, 폐포 세포 파괴 비율 감소 등의 미세먼지에 의한 생리학적 및 약리학적 효과가 우수하게 나타날 수 있다.
상기 복합 추출물은 1) 인삼 및 깻잎을 주정으로 추출하여 인삼 추출액과 깻잎 추출액을 각각 제조하는 단계; 2) 인삼 추출액과 깻잎 추출액을 각각 진공 농축하는 단계; 및 3) 상기 2) 단계 후 각각 건조시키는 단계;를 포함하여 수득될 수 있다.
더욱 구체적으로는 상기 복합 추출물 중 상기 인삼 추출물은 ⅰ) 인삼을 주정으로 추출하여 인삼 추출액을 제조하는 단계; ⅱ) 상기 인삼 추출액을 진공 농축하는 단계; 및 ⅲ) 상기 ⅱ) 단계 후 건조시키는 단계;를 포함하여 수득될 수 있다.
상기 ⅰ) 단계에서 인삼은 백삼일 수 있으며, 상기 백삼은 본삼과 미삼이 혼합된, 백삼일 수 있다.
상기 ⅱ) 단계에서 40~80℃에서 3~30brix로 진공 농축 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 ⅲ) 단계에서의 건조는 스프레이 건조 또는 진공건조로 수행될 수 있다.
상기 스프레이 건조 일 경우 70 내지 120℃에서, 바람직하게는 90 내지 120℃에서, 800 내지 1800rpm 하에서 수행되는 것일 수 있다.
또한 상기 진공건조는 진공건조기를 이용하여 진행될 수 있으며, 구체적으로 약 200 내지 500 ㎜Hg의 압력 및 40 내지 80℃에서 진행될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 복합 추출물 중 상기 깻잎 추출물은 a) 깻잎을 주정으로 추출하여 깻잎 추출액을 제조하는 단계; b) 상기 깻잎 추출액을 진공 농축하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계 후 건조시키는 단계;를 포함하여 수득될 수 있다.
상기 a) 단계에서 깻잎을 30 내지 60℃에서 8 내지 48시간 동안 세척 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 a) 단계에서, 40 내지 80℃에서 4 내지 10시간 동안 1 내지 5회로 추출하는 과정을 더 포함할 수 있다.
상기 b) 단계에서, 40 내지 80℃에서 3 내지 30brix로 진공 농축할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 b) 단계와 c) 단계의 사이에서, 식품 첨가물로 폴리사카라이드를 추가적으로 첨가할 수 있다. 상기 폴리사카라이드는 덱스트린, 말토덱스트린, 사이클로덱스트린, 난소화성 덱스트린 일 수 있으나, 특별히 제한되지 않으나, 말토덱스트린이 바람직하며, 10 내지 90%(w/w), 바람직하게는 10 내지 50%(w/w) 더 첨가할 수 있으며, 상기 조건 일 경우 냉장, 실온 등 보관온도에 상관없이 깻잎 추출물의 저장성을 높일 수 있다. 또한 로즈마리산의 함량도 온도에 상관없이 일정하게 유지될 수 있다.
상기 c) 단계에서 건조는 스프레이 건조, 진공건조 또는 동결건조로 수행될 수 있다.
상기 스프레이 건조는 70 내지 120℃에서 800 내지 1800rpm 하에서 수행되는 것일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 진공건조는 진공건조기를 이용하여 진행될 수 있으며, 구체적으로 약 200 내지 500 ㎜Hg의 압력 및 40 내지 80℃에서 진행될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 동결건조는 -40 내지 -20℃에서 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 깻잎 추출물은 깨순 추출물을 더 포함할 수 있다. 상기 깨순 추출물을 더 포함함에 따라 깻잎 추출물에 인삼 추출물과 병용시 질환 개선효과가 우수할 수 있다. 상기 깨순 추출물은, a') 깨순을 열수 추출 또는 물-알코올 혼합용매에서 추출하여 깨순 추출액을 제조하는 단계; b') 상기 깨순 추출액을 진공 농축하는 단계; 및 c') 상기 b') 단계 후 스프레이 건조시키는 단계;를 포함하여 수득된 것일 수 있다.
상기 a') 단계에서 물-알코올 혼합용매의 중량비는 5:5 내지 8:2일 수 있으며 60 내지 80℃의 온도범위에서 추출되는 것일 수 있다. 열수 추출 또는 물-알코올 혼합용매의 추출방법 모두 약리 효과의 개선효과를 달성할 수 있으나 열수 추출방법이 약리 효과의 개선을 위해 더 바람직할 수 있다.
상기 b') 단계의 진공 농축 및 c') 단계의 스프레이 건조는 상기 깻잎 추출물의 b) 단계 및 c) 단계와 동일하다.
상기 깨순 추출물은 조성물 총 중량 중 5 내지 10 중량% 포함될 수 있으며, 구체적으로 깻잎 추출물 및 깨순 추출물은 100:5 내지 100:25의 중량비로 혼합되어 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로 100:10 내지 100:20의 중량비로 혼합되어 포함될 수 있다.
상기 미세먼지에 의한 호흡기 질환은 호흡기 염증성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD), 부비강염, 알레르기성 비염, 하기도 감염증, 급만성기관지염, 폐렴, 기관지 천식, 기관지 확장증, 폐기종, 폐결핵 후유증, 급성 호흡 궁박증후군, 기침, 중이염, 인후염, 편도염, 후두염 및 폐섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있으나, 미세먼지에 의한 호흡기 질환이면 모두 가능하다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합 뿐 만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 복합 추출물 1로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 복합 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 가장 바람직하게는 50 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능식품에 있어서, 상기 복합 추출물은 인삼 추출물 및 깻잎 추출물의 혼합물인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능식품을 제공한다.
본 발명에서 '건강 기능식품'은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강 기능식품은, 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
상기 건강 기능식품은 인간, 인간외 동물, 식물 등 생물에 대한 영양공급이나 생체기능 향상에 효과적인 식품으로, 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조할 수 있다. 건강 기능식품에는 감미료, 항료, 유화제, 조미료, 비타민, 미네랄, 아미노산, 방부제, 산화방지제, 착색제 등 다양한 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 건강 기능식품의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 음료이나 환(丸), 과자, 껌, 빵, 동물 사료, 식물 영양제 등 다양한 형태를 자유롭게 선택할 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 시험예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않으며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
제조예 1: 건조 방법에 의한 인삼 추출물(Panax ginseng) 제조
제조예 1-1: 진공 건조 방법에 의한 인삼 추출물 제조
본삼 1.4kg과 미삼 0.6kg을 혼합한 백삼 2kg을 상기 백삼의 10배량의 70% 주정을 첨가하여, 70℃에서 6시간 동안 1차 추출하고, 백삼의 5배량의 70% 주정을 첨가하여 70℃에서 6시간 동안 2차와 3차 추출을 하였다. 그 다음, 추출액을 60~70℃에서 20brix로 진공 농축 하였다. 그 다음, 진공건조기를 이용하여 200 내지 500 ㎜Hg의 압력 및 40 내지 80℃에서 진공 건조하여, 인삼 추출물을 분말상으로 7.19 내지 8.97g을 수득하였다.
제조예 1-2: 스프레이 건조 방법에 의한 인삼 추출물(Panax ginseng) 제조
본삼 1.4kg과 미삼 0.6kg을 혼합한 백삼 2kg을 상기 백삼의 10배량의 70% 주정을 첨가하여, 70℃에서 6시간 동안 1차 추출하고, 백삼의 5배량의 70% 주정을 첨가하여 70℃에서 6시간 동안 2차와 3차 추출을 하였다. 그 다음, 추출액을 60~70℃에서 20brix로 진공 농축 하였다. 그 다음, 110℃에서 1280rpm으로 스프레이 건조하여, 인삼 추출물을 분말상으로 214±36g 수득하였다.
상기 제조예 1-1의 진공 건조 방법과 상기 제조예 1-2의 스프레이 건조 방법에 의한 인삼 추출물 제조 방법 중 상기 제조예 1-2의 스프레이 건조 방법에 의한 제조방법에서 인삼 추출물의 수율이 더 확인되어, 본 발명에서는 상기 제조예 1-2의 스프레이 건조 방법에 의한 인삼 추출물을 복합 추출물로 사용하여 효과를 확인하였다. 또한 본 발명에서 상기 제조예 1-2의 스프레이 건조 방법에 의한 인삼 추출물에서 수득된 분말상의 인삼 추출물을 PG로 명명하였다.
LC를 이용하여 상기 제조예 1-2의 스프레이 건조 방법에 의한 인삼 추출물의 분말상의 인삼의 지표 물질을 확인하였으며, 그 결과를 도1에 도시하였다. 도1로부터 활성성분으로 Rg1과 Rb1 피크를 확인하였다.
상기 제조예 1-2의 스프레이 건조 방법에 의한 인삼 추출물에서 수득된 PG에 대하여 Rg1과 Rb1의 함량을 측정한 결과, PG는 29.6mg/g 의 Rg1과 Rb1의 혼합물을 포함하였다.
제조예 2: 건조 방법에 의한 깻잎 추출물 (Perilla frutesens) 제조
제조예 2-1: 스프레이 건조 방법에 의한 깻잎 추출물 (Perilla frutesens) 제조
깻잎을 맑은 물에 3회 세척한 다음 원적외선 건조기 50℃에서 24시간 동안 건조한 깻잎30.8g을 건조 깻잎의 10배량의 70% 주정을 혼합하여, 70℃에서 6시간 동안 3회 추출 추출하였다. 그 다음, 추출이 완료된 추출액을 300mesh의 여과포로 걸러진 다음, 60~70℃에서 20brix로 진공 농축하였다. 그 다음, 덱스트린을 20%(w/w)을 첨가한 후 110℃에서 1280rpm으로 스프레이 건조하여, 깻잎 추출물을 분말상으로 수득하였다(수율 3.08%).
제조예 2-2: 진공 건조 방법에 의한 깻잎 추출물 (Perilla frutesens) 제조
깻잎을 맑은 물에 3회 세척한 다음 원적외선 건조기 50℃에서 24시간 동안 건조한 깻잎30.8g을 건조 깻잎의 10배량의 70% 주정을 혼합하여, 70℃에서 6시간 동안 3회 추출 추출하였다. 그 다음, 추출이 완료된 추출액을 300mesh의 여과포로 걸러진 다음, 60~70℃에서 20brix로 진공 농축하였다. 그 다음, 진공건조기를 이용하여 200 내지 500 ㎜Hg의 압력 및 40 내지 80℃에서 진공 건조하여, 깻잎 추출물을 분말상으로 수득하였다
제조예 2-3: 동결 건조 방법에 의한 깻잎 추출물 (Perilla frutesens) 제조
깻잎을 맑은 물에 3회 세척한 다음 원적외선 건조기 50℃에서 24시간 동안 건조한 깻잎30.8g을 건조 깻잎의 10배량의 70% 주정을 혼합하여, 70℃에서 6시간 동안 3회 추출 추출하였다. 그 다음, 추출이 완료된 추출액을 300mesh의 여과포로 걸러진 다음, 60~70℃에서 20brix로 진공 농축하였다. 그 다음, 동결 건조기를 이용하여 -40 내지 -20℃에서 동결 건조를 하여 깻잎 추출물을 분말상으로 수득하였다
제조예 2-1의 스프레이 건조방법, 제조예 2-2의 진공 건조 방법 및 제조예 2-3의 동결 건조 방법에 의한 깻잎 추출물 제조 방법 중 추출물 보관 온도에 따른 로즈마리산 함량을 냉장과 실온에서 모두 확인한 결과, 상기 제조예2-2의 진공 건조 방법 및 상기 2-3의 동결건조 방법에 의해 수득된 깻잎 추출물 보다 상기 2-1의 스프레이 건조방법에 의해 수득된 깻잎 추출물의 로즈마리산 함량이 냉장과 실온에서 53.55(mg/g) 이내로 5일 이상 지속적으로 유지됨을 확인하여, 본 발명에서는 상기 제조예 2-1의 스프레이 건조 방법에 의한 깻잎 추출물에서 수득된 분말상의 깻잎 추출물을 복합 추출물로 사용하여 효과를 확인하였다.
상기 제조예 2-1의 스프레이 건조 방법에 의한 깻잎 추출물에서 수득된 분말상의 깻잎 추출물을 PF로 명명하였다. 상기 수득된 PF에 대하여 로즈마리산 함량을 측정한 결과, PF는 53.55 mg/g의 로즈마리산을 포함하였다. 또한 상기 제조예 2-1의 스프레이 건조 방법에 의한 깻잎 추출물을 LC로 활성성분을 확인한 결과, 로즈마리산의 피크가 나타나는 것을 도 2와 같이 확인하였다.
제조예 3: 깨순 추출물(Perilla frutesens Young leaves, PFY) 제조
깨순을 500g을 50℃에서 24시간 동안 세척 및 건조 3반복 한 다음, 6:4 중량비의 물-알코올 혼합용매를 사용하여, 70℃에서 6시간 동안 3회로 추출한 다음, 60~70℃에서 20brix로 진공 농축 하였다. 그 다음, 110℃에서 1280rpm으로 스프레이 건조하여, 깨순 추출분말을 수득하였다.
실시예 1: 복합 추출물 1 (PG:PF=1:9, 'CHJ1'이라 함)의 제조
제조예 1-2의 인삼 추출물(PG) 10 중량%과 제조예 2-1의 깻잎 추출물(PF) 90 중량%를 혼합하여, 복합추출물 1을 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ1으로 명명하였다.
실시예 2: 복합 추출물 2 (PG:PF=2:8, 'CHJ2'라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 20 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 80 중량%로 혼합하여, 복합추출물 2를 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ2으로 명명하였다.
실시예 3: 복합 추출물 3 (PG:PF=3:7, 'CHJ3'이라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 30 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 70 중량%로 혼합하여, 복합추출물 3을 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ3으로 명명하였다.
실시예 4: 복합 추출물 4 (PG:PF=4:6, 'CHJ4'라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 40 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 60 중량%로 혼합하여, 복합추출물 4를 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ4으로 명명하였다.
실시예 5: 복합 추출물 5 (PG:PF=5:5, 'CHJ5'라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 50 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 50 중량%로 혼합하여, 복합추출물 5를 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ5으로 명명하였다.
실시예 6: 복합 추출물 6 (PG:PF=6:4, 'CHJ6'이라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 60 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 40 중량%로 혼합하여, 복합추출물 6을 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ6으로 명명하였다.
실시예 7: 복합 추출물 7 (PG:PF=7:3, 'CHJ7'이라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 70 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 30 중량%로 혼합하여, 복합추출물 7을 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ7로 명명하였다.
실시예 8: 복합 추출물 8 (PG:PF=8:2, 'CHJ8'이라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 80 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 20 중량%로 혼합하여, 복합추출물 8을 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ8로 명명하였다.
실시예 9: 복합 추출물 9 (PG:PF=9:1, 'CHJ9'라 함)의 제조
제조예 1-2에 따른 인삼 추출물 10 중량%; 및 제조예 2-1에 따른, 깻잎 추출물 90 중량%로 혼합하여, 복합추출물 9를 제조하였다. In vitro assay에서 CHJ9로 명명하였다.
실시예 10: 복합 추출물 10 (PG: PF+PFY=3:7)의 제조
제조예 2-1의 깻잎 추출물(PF)과 제조예 3의 깨순 추출물(PFY)을 100:15의 중량비로 혼합하여 깻잎 추출물과 깨순 추출물의 혼합물(PF+PFY)을 제조하였다. 제조예 1-2의 인삼 추출물(PG) 30 중량%와 상기 깻잎 추출물과 깨순 추출물의 혼합물(PF+PFY) 70중량%를 혼합하여, 복합추출물 10을 제조하였다.
시험예 1: PG+PF의 복합 추출물의 효과 확인 ( In vitro assay)
호흡기관의 대식세포 세포주인 MH-S (Alveolar macrophage) 세포를 미세먼지로 자극을 시켜 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물 1 내지 9를 각각 처리하여 효과를 확인하였다. 이때 비교예 1로 제조예 1-2의 인삼 추출물(PG)을 사용하고, 비교예 2-1로 제조예 2의 깻잎 추출물(PF)를 사용하였다.
PG : PF의 중량비 PG : PF의 중량비
복합 추출물
(PG+PF)		 CHJ1
(실시예 1)		 1 : 9 CHJ6
(실시예 6)		 6 : 4
CHJ2
(실시예 2)		 2 : 8 CHJ7
(실시예 7)		 7 : 3
CHJ3(실시예 3) 3 : 7 CHJ8
(실시예 8)		 8 : 2
CHJ4(실시예 4) 4 : 6 CHJ9
(실시예 9)		 9 : 1
CHJ5(실시예 5) 5 : 5 - -
단일 추출물 PG
(비교예 1)		 1 : 0 PF
(비교예 2)		 0 : 1
활성산소인 ROS를 유세포기 (FACS)로 분석을 하였고, 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-a를 ELISA assay로 측정하였다. 상기 미세먼지는 대기 미립자 물질로, 유럽 표준물질인 PM10(ERM®-CZ120)을 50% 디엠에스오(DMSO)에 넣어, 농도가 50ug/ml로 한 다음 세포에 처리하여 사용하였다. 상기 MH-S 세포는 ATCC로부터 분양 받아, 세포 배양배지인 RPMI 1640 medium(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 10% fetal bovine serum(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% antibiotics (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 첨가하여 배양하였다. 또한 항온 (37℃)과 항습을 유지하는 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 2~4번 계대 배양 한 후, 12 well plate에 well당 2 × 104 cell이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 다음에, PM10 50ug/ml을 정상군을 제외하고 각 well에 처리 하였다. 그 다음 비교예 1의 인삼 추출분말, 비교예 2의 깻잎 추출분말, 및 실시예 1 내지 9의 각 복합 추출분말을 모두 1g이 되도록 한 후 50% DMSO에 넣어 혼합하여, 1g/10ml이 되도록 제조하였다. 그 다음 연속 희석법으로(serial dilution) 희석하여 최종 농도가 비교예 1의 PG와 비교예 2의 PF는 400ug/ml 및 200ug/ml의 농도가 되게 하였다. 실시예 1 내지 9의 PG+PG 복합 추출물은 400ug/ml, 200ug/ml 및 100ug/ml이 되도록 하였다. 그 다음 여과하여 각 well에 처리하였다. ROS 생성량을 확인하는 시험에서는 먼저 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물을 100ug/ml의 농도로 세포에 처리하여 효과를 확인하였고, 그 다음 효과가 좋았던 실시예 2와 실시예 3를 400ug/ml 및 200ug/ml이 되도록 한 다음, 세포에 처리하여 ROS에 대한 효과를 확인하였다. 또한 염증성 사이토카인 생산량을 분석하는 시험에서는 먼저 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물을 100ug 및 200ug/ml 농도로 세포에 처리 한 다음 배양배지에서 확인하였고 그 다음 효과가 좋았던 실시예 2와 실시예 3를 400ug/ml 및 200ug/ml이 되도록 한 다음, 세포에 처리하여 세포의 염증성 사이토카인의 생산량을 측정하였다.
하기 시험예 1-1의 활성산소종 ROS는 세포내 ROS를 분석이 가능한, DCFH-DA법으로 측정되었고, 상기와 같이 시험군인, 비교예 1의 PG, 비교예 2의 PF, 및 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물을 앞에 전술한 바와 같이 처리 한 다음, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 각 시험군에 DCFH-DA를 30분간 처리 한 다음 세포 회수 후 유세포 분석기로 측정하였다.
하기 시험예 1-2의 염증성 사이토카인 생산량 분석은, MH-S의 세포를 2~4번 계대 배양한 후, 12 well plate에 well당 2 × 104 cell이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 다음에, PM10 50ug/ml를 정상군을 제외하고 각 well에 처리한 다음, 상기 PM10을 처리한 well에, 비교예 1의 PG, 비교예 2의 PF 및 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물들을 전술한 방법과 같이 처리하였다. 그 다음 24시간 동안 배양한 다음 MH-S세포와 배양배지를 회수하여, ELISA assay로 염증성 사이토카인 생산량을 측정하였다.
PM10만 처리한 시험군은 대조군으로, PM10-like_CTL으로 명명하였다.
시험예 1-1 : ROS 생성량 확인
도 3의 결과에서와 같이, MH-S 세포주에 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물을 100ug/ml로 처리를 하였을 때, 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8)와 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7), 두 시험군에서 ROS가 감소되는 것을 확인하였으며, 실시예 5의 CHJ5(PG : PF=5 : 5)와 실시예 9의 CHJ9(PG : PF=9 : 1), 두 시험군에서 ROS가 약간 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 1 내지 9의 PG+PF 복합 추출물의 결과에서, 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8) 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7) PG+PF 복합 추출물의 결과가 가장 우수하여, 도 4와 같이, 400ug/ml과 200ug/ml의 농도별로 ROS 감소효과를 재확인하였다.
도 4의 결과에서, 마우스 폐의 대식세포인 MH-S 세포주에 정상군을 제외하고, PM10 50ug/ml를 처리한 다음, 비교예 1의 PG 및 비교예 2의 PF 각각을 400ug/ml로 처리한 시험군에서, 활성산소(ROS)가 대조군(PM10-like_CTL)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 63% 이상 감소하는 것을 확인하였다.
또한 도 4의 결과에서 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8)와 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에서 모두 ROS 감소 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 특히 상기 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)의 200ug/ml의 농도에서, 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8)의 200 ug/ml 보다도 ROS가 좀 더 감소되는 것을 확인하였고, 비교예 1의 PG 200ug/ml 과 비교예 2의 PF 200ug/ml 보다도 ROS 감소효과 더 우수한 것으로 확인되었다.
시험예 1-2: 염증성 사이토카인 생산량 분석
먼저 도 5A와 같이, MH-S 세포주에 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물을 100ug/ml 및 200ug/ml로 처리를 하여 배양배지의 염증성 사이토카인을 측정하였을 때 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8)와 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)의 200ug/ml 두 시험군에서 모두 염증성 사이토카인 억제 효과가 우수하게 나타내는 것을 확인하였다. 실시예 9의 CHJ9(PG : PF=9 : 1) 시험군에서도 염증성 사이토카인 억제효과가 나타나는 것을 확인하였다. 실시예 1 내지 9의 PG+PF 복합 추출물의 결과에서 실시예 2와 실시예 3의 염증성 사이토카인의 억제효과가 가장 우수하여 도 5B의 결과와 같이 400ug/ml과 200ug/ml의 농도별로 ROS 감소효과를 재확인하였다.
도 5B의 결과에서 비교예 1의 PG 및 비교예 2의 PF를 각각 400ug/ml 으로 처리한 시험군에서 IL-6와 TNF-a 생산량이 대조군(PM10-like_CTL)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다.
또한 도 5B의 결과에서, 실시예 1 내지 9의 PG+PF의 복합 추출물을 400ug/ml 농도로 처리한 시험군 중, 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8)와 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에서 염증성 사이토카인 억제효과를 우수하게 나타냄을 확인하였다.
특히 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200ug/ml으로 처리한 시험군에서 실시예 2의 CHJ2(PG : PF=2 : 8)를 200ug/ml으로 처리한 시험군 보다도 IL-6와 TNF-a 생산량이 더 감소되는 것을 확인하였다(도 5).
이와 같이 In vitro assay를 통하여, 효과가 가장 우수한 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)으로, 동물모델효능을 평가하였다.
시험예 2: PG+PF의 복합 추출물에 대한 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 호흡기 보호개선 동물모델효능 평가( In vivo assay)
실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에 대한 미세먼지의 노출에 대한 호흡기 보호개선의 효과를 비임상학적 평가인, 동물모델 평가를 이용하여 확인하였다.
7주령의 Balb/c 마우스에 표준 미세먼지(PM10)과 DEP(디젤연소분진)을 적용하여, 호흡기 손상 동물 모델을 구축 및 제작하여 미세먼지 노출에 대한 호흡기 보호개선 동물모델효능평가에 사용하였다. 상기 구축한 동물 모델을 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델로 명명하였다.
미세먼지(PM10)에 디젤연구소분진(Diesel exhaust particles, DEP)를 섞은 4 mg/ml 미세먼지 혼합물(PM10D+DEP)을 수산화알루미늄(aluminium hydroxide, Alum)에 희석시켜 기도 및 폐 주입방법(Intra-Nasal-Tracheal (INT) injection)을 이용하여 3일 간격으로 3회(약물투여 3일 후, 6일 후, 9일 후) INT 주입 방법으로 기도를 통해 폐로 직접 주입하는 동물모델을 제작하고, 최종 미세먼지 혼합물(PM10D+DEP) 주입 3일 후 분석하였다.
또한 비교예 1의 PG 및 비교예 2의 PF 를 각각 100 ㎎/㎏농도로 준비하여 이를 시험군으로 하였다.
또한 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏농도로, 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone, 3㎎/㎏)을 시험군으로 준비하였다.
또한 동물모델효능 평가에서는 각 시험군을 2 내지 3g으로 제조한 다음 멸균된 인산 완충 생리식염수인PBS(phosphate buffered saline)로 희석하여 200mg/kg 및 100mg/kg 농도가 되게 한 다음, 여과하여 동물모델효능 평가에 사용하였다.
11일간 매일 오전11시에 경구 투여하여, 미세먼지에 노출에 대한 호흡기 보호개선 효과를 동물모델을 이용하여 확인하였다. 11일 마지막날에 동물모델을 마취한 후, 심장에서 혈액을 채취하여 헤파린이 담긴 바이엘에 넣어 회수하였고, 폐 세척액, 폐 조직 등을 회수하여 분석하였다.
동물모델효능 평가에서, 정상군(Balb/c_Nr), 양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏, PM10D_Dexa 3mg/kg), 미세먼지 혼합물만 처리한 시험군을 대조군(PM10D_CTL)으로, 미세먼지 처리 후, 비교예 1의 PG을 경구 투여한 시험군을 (PM10D_PG)로, 미세먼지 처리 후 비교예 2의 PF 을 경구 투여한 시험군을 (PM10D_PF)로, 미세먼지 처리 후 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 투여한 시험군을 (PM10D_PG+PF)로 명명하였다. 또한 각 시험군당 동물모델 개체를 n=6으로 시험을 하였고, 11일 동안 상기 동물 모델은 이상현상을 전혀 보이지 않음을 확인하였다.
시험예 2-1: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 폐 세척액(BALF)과 폐(lung) 세포수 분석
미세먼지 또는 화학물질 등에 노출되면, 비장 비대증으로 인한 비장 세포수 증가 , 폐 세포수, 폐 세척액 세포수 및 호중구 세포가 증가하는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에 대한 효과를 확인하였다.
도 6A의 결과에서, 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델 실험 종료 후 BALF(폐 세척액) 총 세포수를 분석한 결과 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 유의성 있게 BAL 세포수의 증가를 나타내는 것을 확인하였다(p<0.001).
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, p<0.01, 150㎎/㎏, p<0.01)에서, 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
또한 비교예 1의 PG를 경구 투여한 시험군과, 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏, p<0.05)를 경구 투여한 시험군을 각각 경구 투여한 것보다도 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군에서 농도의존적으로 감소하는 상승효과가 더 나타나는 것을 확인하였다(도6A).
도 6B의 결과에서, 폐 조직(Lung)의 총 폐세포수는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 2배 이상 유의성 있게 Lung세포수의 증가를 나타나는 것을 확인하였다(p<0.001).
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏, p<0.01)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏, p<0.001)에서 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 비교예1의 PG와 비교예 2의 PF (100 ㎎/㎏, p<0.001)를, 각각 경구 투여한 시험군 보다도 농도의존적으로 감소하는 상승효과가 더 나타나는 것을 확인하였다(도 6B).
도 6C의 결과에서, 비장 조직(spleen)에서 총 세포수는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 3배 이상 유의성 있게 비장세포수의 증가를 나타내는 것을 확인하였다(p<0.001).
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏, p<0.001)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏ p<0.001, 100 ㎎/㎏, p<0.01)에서, 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
또한 비교예 1의 PG(100 ㎎/㎏, p<0.001)와 비교예 2의PF(100 ㎎/㎏, p<0.01)를 각각 경구 투여한 시험군 보다도 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군에서, 비장 조직의 세포수 감소효과를 더욱 더 나타내는 것을 확인하였다.
도 6D의 결과는, 폐세척액(BALF)에서 원심력을 이용하여 체액 내의 세포를 현미경 슬라이드에 농축하여 염색 및 검사할 수 있는 싸이토스핀(cytospin)에 의한 호중구(neutrophils) 세포 수를 분석한 결과이다. 상기 도 6D의 결과에서, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 현저한 하게 호중구 세포가 유의성 있는 증가를 나타내는 것을 확인하였다(p<0.001).
또한 양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏, p<0.001)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, p<0.001, 100 ㎎/㎏, p<0.001)에서, 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 농도의존적으로 감소하였고, 비교예 1의 PG(100 ㎎/㎏, p<0.001)와 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏, p<0.001)를 각각 경구 투여한 것보다도 농도의존적으로 감소효과가 더욱 더 나타내는 것을 확인하였다(도 6D).
시험예 2-2: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 기관지 폐 세척액(BALF)의 염증성 사이토카인을 ELISA assay로 분석
미세먼지 또는 화학물질 등에 노출되면 폐 세척액의 염증성 사이토카인이 증가하게 된다. 이와 관련하여, 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)대한 효과를 확인하였다.
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델 실험 종료 후 폐 세척액(BALF)에서 염증성 사이토카인을 ELISA assay로 측정 분석한 결과 도 7과 같이 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 유의성 있게 염증성 사이토카인 생산량이 증가하는 것을 확인하였다(p<0.001).
도 7A는 CXC 케모카인(CXCL1, chemokine (C-X-C motif) ligand 1), 도 7B는 인터루킨 17 (IL-17, Interleukin-17), 도 7C는 대식세포 염증성 단백질 -2　(MIP-2, macrophage inflammatory protein), 도 7D는 종양괴사인자 알파(TNF-a, tumor necrosis factor-α)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 200 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군은 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 염증성 사이토카인이, 유의성 있게 농도 의존적으로 감소되는 것을 도 7과 같이 확인하였다(p<0.001).
특히, 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 100 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군에서 염증성 사이토카인이, 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소되는 것을 도 7C의 MIP2 와 도 7D의 TNF-a에서 확인하였다(p<0.001).
또한 비교예1의 PG(100 ㎎/㎏)와 비교예 2의 PF (100 ㎎/㎏)를 각각 경구 투여한 시험군 보다도 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)에서 유의성 있게 염증성 사이토카인이 감소하는 상승효과를 나타내는 것을 확인하였다.
시험예 2-3: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 기도 염증 및 내피 기능 장애 바이오 마커(SDMA)와 기침(cough)관련 유전자 분석
미세먼지에 의한 질환과 관련하여, 기도 염증내피 기능장애 또는 기침과 관련하여 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)의 효과를 혈청 안에 포함된 SDMA 를 확인하였고 상기 SDMA를 ELISA assay 로 분석하였다. 또한 기침 관련 유전자를 유전자 발현 분석을 하여 효과를 확인하였다.
미세먼지 관련 기침, 만성 난치성 기침 또는 만성 특발성 기침과 관련하여, MUC5AC, TRPV1 및 TRPA1 발현이 상향 된다. 이와 관련하여 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에 대한 효과를 확인하였다.
도 8A는 SDMA(Symmetric-dimethylarginine), 도 8B는 MUC5AC(Mucin 5AC), 도 8C는 TRPV1(Transient receptor potential vanilloid 1), 도 8D는 TRPA1(Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily A Member 1)의 mRNA 발현을 real time PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델 실험 종료 후 동물모델의 혈액의 혈청(serum)에서 미세먼지에 의한 만성폐쇄성폐질환의 기도 염증 및 내피 기능장애 바이오 마커 인, SDMA(Symmetric-dimethylarginine)을, ELISA assay로 측정 분석한 결과, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 약 32% 이상 SDMA의 수준을 유의성 있게 증가를 나타내는 것을(p<0.001) 도 8A와 같이 확인하였다.
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏, p<0.05)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군은 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소되는 것을 도 8A와 같이 확인하였다(p<0.05).
또한 비교예 1의 PG (100 ㎎/㎏)와 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏)를 각각 경구 투여한 시험군 보다도 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군에서 유의성 있게 감소하는 효과를 도8A에서와 같이 확인하였다.
또한 폐 조직에서 기관지 염증 및 기침 (cough)관련 유전자 발현을 측정 분석한 결과, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)이 기침(cough)관련 유전자(MUC5AC, TRPV1, TRPA1) mRNA 발현을 유의성 있게 증가를 나타내는 것을 도 8B, 도 8C 및 도 8D의 결과에서 확인하였다(p<0.01).
또한 양성대조군 (Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군은 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 농도 의존적으로 기침 관련 유전자 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도8B, 도8C, 도 8D).
또한 도 8의 결과와 같이, 비교예 1의 PG (100 ㎎/㎏)와 비교예 2의 PF (100 ㎎/㎏) 를 각각 경구 투여한 시험군 보다도 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)에서, 기침 관련 유전자 발현이 더 감소하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
시험예 2-4: PG+PF 복합 추출물에 대한, 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 염증성 사이토카인 유전자 발현 (qRT-PCR) 분석
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직에서 염증성 사이토카인 유전자 발현을 qRT-PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)을 이용하여, 도 9와 같이 측정 분석하였다. 도 9A는 TNF-a, 도 9B는 TARC, 도 9C는 COX-2, 도 9 D는 NOS-II 도 9 E는 MIP-2, 도 9 F는 CXCL-1 mRNA 발현을 확인한 것이다.
정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군 (PM10D_CTL)이 2배 이상 염증 사이토카인 유전자 발현을 유의성 있게 증가를 나타내는 것을 확인하였다.
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)에서 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 염증성 사이토카인의, TNF-a, TARC, COX-2, NOS-II, MIP-2 및 CXCL-1의 유전자 발현이 유의성 있게 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏)를 경구 투여한 시험군에서는 도 9D의NOS-II와 도 9F의 CXCL-1 유전자 발현 결과와 같이, 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소되는 것이 확인되었다.
또한 비교예 1의 PG(100 ㎎/㎏)를 경구 투여한 시험군에서는 도 9C의 COX-2 유전자 발현 결과와 같이, 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다.
시험예 2-5: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 미세먼지에 의한 알레르기 천식 신호전달체인 IRAK1과 CD11b 단백질 발현 (Immune histology fluorescent, IHF) 분석
미세먼지에 의한 천식 예방 개선에 대한 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)의 효과를 확인하기 위하여, 알레르기 천식 신호전달체인 IRAK1과 CD11b 단백질을 발현을 면역형광법을 사용하여 확인하였다.
도 10A는 면역형광법 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 10B는 IRAK1단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이고, 도 10C는 CD11b 단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이다.
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직에서 신호전달 IRAK1 단백질 발현을 면역형광조직염색(IHF, Immune histology fluorescent)으로 측정 분석한 결과 도 10과 같이, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)에서 현저하게 알레르기 천식 신호전달체인 IRAK1 단백질 발현이 증가를 나타내는 것을 확인하였다. 양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)은 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다(도 10A, 도10B).
또한 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏, p<0.001)와 비교예 1의 PG(100 ㎎/㎏, p<0.05)를 각각 경구 투여한 시험군에서는 IRAK1 단백질 발현이 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다.
또한 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)에서 현저하게 CD11b 단백질 발현이 증가를 나타내는 것을 확인하였다. 양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏ p<0.05, 100 ㎎/㎏)은 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 감소되는 것을 도 10A와 도 10C와 같이 확인하였다.
또한 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏, p<0.001)와 비교예1의 PG(100 ㎎/㎏, p<0.05)를 각각 경구 투여한 시험군에서는, CD11b 단백질 발현이 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 감소되었으나 유의성은 없음을 확인하였다.
시험예 2-6: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 미세먼지에 의한 폐질환 병인 관련 매개물질인, TNF-α와 MCP-1 단백질 발현 (IHF) 분석
미세먼지에 의한 폐질환과 관련하여 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에 대한 효과를 확인하기 위해 미세먼지에 의한 폐 질환 병인 관련 매개물질인 TNF-α와 MCP-1 단백질 발현 분석을 미세먼지의 노출에 대한 동물모델의 폐 조직을 사용하여 확인하였다.
도 11A는 TNF-α 단백질 발현에 대한 면역형광법 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 11B는 TNF-α 단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이다. 또한 도 11C는 MCP-1단백질 발현에 대한 면역형광법 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 11D는 MCP-1 단백질에 대한 이미지 분석 결과를 그래프화하여 나타낸 것이다.
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직에서, 미세먼지에 의한 폐질환 병인 관련 매개물질인, TNF-α와 MCP-1 단백질 발현을 면역형광조직염색 (IHF, Immune histology fluorescent)으로 측정 분석한 결과, 도 11과 같이, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)에서 현저하게 TNF-α 단백질 발현이 증가를 나타내는 것을 확인하였다.
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏ p<0.01, 100 ㎎/㎏ p<0.05)에서 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다(도 11A, 도11B).
또한 비교예 1의 PF(100 ㎎/㎏, p<0.01)와 비교예 2의 PG (100 ㎎/㎏)는 TNF-α 단백질 발현이 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였고, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)에서 현저하게 MCP-1 단백질 발현이 증가를 나타내는 것을 확인하였다.
양성대조군(Dexamethasone, 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏ p<0.01, 100 ㎎/㎏)에서 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 감소되는 것을 도 11C와 도11D에서와 같이 확인하였다.
또한, 비교예2의 PF(100 ㎎/㎏)와 비교예 1의PG(100 ㎎/㎏)를 경구 투여한 각 시험군에서는, MCP-1 단백질 발현이 대조군 (PM10D_CTL)에 비하여 감소되었으나 유의성은 없음을 확인하였다(도 11D).
시험예 2-7: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 동물모델의 폐 조직(Lung tissue)의 염증활성 세포를 FACS로 분석
호흡기 염증성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환 기관지 천식, 기관지 확장증, 폐기종, 등의 미세먼지에 의한 호흡기 질환은 미세먼지 등의 자극에 의한, type 1 helper T(Th1) 세포와 type 2 helper T(Th2) 세포의 불균형으로 인하여 유발되며, Th1 세포에서 인터페론-γ(INF- γ) 분비되어, 대식세포, cytotoxic T-세포 등을 자극한다. Th2 세포에서는 인터루킨(interleukin, IL)-4, -5, -9, -13 등이 분비되며 이들은 미세먼지에 의한 알레르기성 기도 염증을 유발시킨다.
이와 관련하여, CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포와 같은 염증 활성세포는 상기 미세먼지 등에 의한 알레르기성 기도 염증을 유발과 관련된 T 세포에 관련된 염증활성 세포이다. 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)의 미세먼지에 의한 기도 염증에 대한 효과를 확인하기 위해상기 염증 활성세포를 분석하였다.
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직 (Lung)에서 염증활성 세포를 FACS를 이용하여 확인 하였다. 결과는 하기 표 2와 같다.

폐에서의 세포 표현형 (cell phenotypes) 		미세먼지의 유도에 의한 기도염증 동물 모델 평가
(PM10D-induced airway inflammation murine model(Absolute No.)

Balb/c_
Normal
PM10D_
CTL
PM10D_
Dexa
3mg/kg
PM10D_PF
100 mg/kg
PM10D_PG
100 mg/kg
PM10D_
PG+PF
100mg/kg
PM10D_
PG+PF
200mg/kg

CD4+
(x105cells)
12.11
±1.23
21.23
±0.2###
15.58
±2.29**
20.08
±6.45
20.03
±0.69
15.50
±0.52***
13.27
±1.51***

CD8+
(x105cells)
4.81
±0.09
14.60
±0.41###
8.03
±1.52
12.02
±3.55
9.96
±1.46
8.01
±0.18***
5.98
±0.40***

CD4+/CD69+
(x105cells)
0.41
±0.12
5.16
±0.79###
1.11
±0.29**
3.29
±0.24
2.34
±0.11**
1.00
±0.34***
0.75
±0.09***

CD62L+/CD44+
(x105cells)
6.51
±1.53
17.39
±0.08###
8.24
±1.64**
9.08
±2.66
9.05
±0.07
5.48
±0.40***
3.76
±0.95***

Gr-1+/CD11b+
(x105cells)
6.15
±1.53
29.53
±21.97
7.02
±0.69
3.78
±0.70
7.73±
1.51
3.24
±0.32***
2.99
±0.35***
상기 표2에서와 같이, 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직(Lung)에서 염증활성 세포를 확인한 결과 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포 비율이, 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏)에서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 비교예 1의 PG 를 경구 투여한 시험군과, 비교예 2의 PF 경구 투여한 시험군보다 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군에서 상기 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포 비율이 더 감소하는 것을 확인되었다. 이와 같이 비교예 1의 PG 및 비교예 2의 PF 보다 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에서 미세 먼지 등에 의한 기도 염증에 대한 약리 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
시험예 2-8: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 폐세척액 (BALF)에 포함된 염증활성세포를 유세포분석기(FACS)로 분석
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐세척액 (BALF)에 포함된 염증활성 세포를 FACS를 이용하여 확인 하였다. 결과는 하기 표 3와 같다.

폐세척액에서의 세포 표현형 (Cell phenotypes)
미세먼지의 유도에 의한 기도염증 동물 모델 평가
(PM10D-induced airway inflammation murine model(Absolute No.)
Balb/c_
Normal
PM10D_
CTL
PM10D_
Dexa
3mg/kg
PM10D_PF
100 mg/kg
PM10D_PG
100 mg/kg
PM10D_
PG+PF
100mg/kg
PM10D_
PG+PF
200mg/kg
CD4+
(x104 cells)
0.91±
0.11
26.54
±3.39###
6.82±
0.03
16.78±
6.62
17.74±
0.02
11.11±
1.16***
9.76±
1.64***
CD8+
(x104 cells)
0.36±
0.13
21.02±
4.01###
4.04±
0.87
15.53±
1.14
16.94±
1.23
12.49±
1.03***
10.66±
2.24***
CD4+/CD69+
(x104 cells)
0.67±
0.38
9.63±
0.02
3.35
±0.8
4.74±
0.54
4.52±
0.65**
2.81±
0.29***
2.22±
0.69***
CD62L+/CD44+
(x104 cells)
0.33±
0.03
49.52±
4.43
28.8
±3.80
29.58±
3.39**
28.48±
0.90**
20.17±
0.28***
18.72±
2.36***

CD11b+/CGr-1+
(x104 cells)
1.77±
0.32
74.40±
5.15#
43.09
±2.74
27.55±
7.2**
29.11±
5.18**
16.51±
1.63***
10.78±
5.22***
상기 표 3에서와 같이, 미세먼지(PM10+DEP) 동물모델실험 종료 폐세척액(BALF)에서 염증활성 세포를 확인한 결과 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포의 감소효과가 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)에서 농도의존적으로 나타나는 것을 확인하였다. 또한 비교예 1의 PG 를 경구 투여한 시험군과 비교예 2의 PF를 각각 경구 투여한 시험군보다 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군에서 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포 비율이 더 감소하는 것을 확인되었다. 이와 같이, 비교예 1의 PG 및 비교예 2의 PF를 경구 투여한 시험군 보다 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 경구 투여한 시험군에서 미세먼지에 의한 기도 염증의 약리 효과가 우수한 것을 재확인하였다.
시험예 2-9: PG+PF 복합 추출물에 대한미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 염색분석(staining assay) 방법을 통한 폐 조직(Lung tissue) 분석
본 발명의 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)에 대한 미세먼지에 의한 질환에 대한 예방, 치료 및 개선 효과를 조직학적으로 분석하기 위하여, 미세먼지의 노출에 대한 동물모델의 폐조직을 헤마톡실린&에오신 염색(H&E staining), 마손삼색염색(M-T staining) 및 파스 염색(PAS staining) 분석을 하였다.
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델 실험 종료 후 폐 조직 (Lung)을 헤마톡실린&에오신 염색(H&E, Hematoxylin and Eosin Staining)한 결과, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군 (PM10D_CTL)에서 기관지(brochia) 주변에 미세먼지(PM10+DEP)의 침착이 뚜렷하게 증가하는 것으로 나타내었고, 기도의 두께가 증가 했으며, 기도(airway) 주변에 염증면역세포의 침윤과 과립구세포(neutrophils, eosinophils), 그리고 활성화된 대식세포들로 인하여 염증이 심화되어 폐포 세포 파괴를 진행되어 있는 것을 확인하였다.
폐포 세포 파괴 정도는 콜라겐 침착(collagen deposition)으로 관찰하기 위하여 마손삼색염색(Masson Trichrome, M-T staining) 염색으로 확인한 결과, 정상군 (Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(PM10D_CTL)에서 기관지(brochia) 주변구조(structure) 부분의 미세기관(tracheal)과 폐포(alveolar) 그리고 세포부분의 염증(inflammatory)과 혈액(blood) 세포의 침윤정도를 관찰 할 수 있었다.
기관지염 등의 점액질 분비 확인을 위하여 PAS staining을 한 결과, 대조군 (PM10D_CTL)에서는 기관지(airway) 주변에 점액질을 분비하는 기도 배상 세포(goblet cell)가 많이 분포하는 것을 확인 하였다.
헤마톡실린&에오신 염색 (H&E staining), 마손삼색염색(MT staining) 및 파스염색(PAS staining)의 결과에서, 양성대조군(Dexa. 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)를 200 ㎎/㎏농도로 경구 투여 처리한 시험군에서 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 기관지(brochia) 주변에 미세먼지(PM10+DEP)의 침착이 뚜렷하게 감소하였고, 기도의 두께가 정상군에 가깝게 감소를 나타내어 기관지(airway) 주변에 염증면역세포의 침윤과 과립구세포(neutrophils, eosinophils), 그리고 활성화된 대식세포들이 크게 감소를 나타내었다.
또한 세포 부분의 염증과 혈액 세포의 침윤정도도 정상군에 가깝게 억제되는 것을 확인하였다.
또한 비교예 1의 PG (100 ㎎/㎏)와 비교예 2의 PF(100 ㎎/㎏)를 각각 경구 투여한 시험군 보다 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군에서 기도(airway) 주변에 염증면역세포의 침윤과 과립구세포(neutrophils, eosinophils), 그리고 활성화된 대식세포들로 인하여 염증이 더욱 감소하는 효과를 확인하였다(도 12).
시험예 2-10: PG+PF 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 staining assay 방법을 통한 기관지(trachea tissue) 검사 분석
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 기관지 조직 (trachea tissue)을 알리산 블루 염색(AB-PAS staining) 염색한 결과, 정상군 (Balb/c_Nr)에 비하여 대조군 (PM10D_CTL)에서 기관지(brochia) 주변에 미세먼지 (PM10+DEP)에 의한 염증이 증가되어 있고, 호흡기 상피세포 내의 점액 (musin) 함유량이 뚜렷하게 증가를 도 13과 같이 확인하였다.
양성대조군(Dexa. 3 ㎎/㎏)과 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군(200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)은 대조군(PM10D_CTL)에 비하여 기관지(brochia) 주변에 염증 정도가 감소되어 있는 것을 확인하였다.
또한 비교예 1의 PG (100 ㎎/㎏)와 비교예 2 의 PF (100 ㎎/㎏)를, 각각 경구 투여한 시험군 보다도 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 200 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군에서, 호흡기 상피세포 내의 점액(musin) 함유량이 정상군에 더 가깝게 억제되는 것을 확인하였다(도13).
시험예 3: PG+ (PF+PFY) 복합 추출물에 대한 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 호흡기 보호개선 동물모델효능 평가 (In vivo assay )
실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7)에 대한 미세먼지의 노출에 대한 호흡기 보호개선의 효과를 비임상학적 평가인, 동물모델 평가를 이용하여 확인하였다.
7주령의 Balb/c 마우스에 표준 미세먼지(PM10)과 DEP(디젤연소분진)을 적용하여, 호흡기 손상 동물 모델을 구축 및 제작하여 미세먼지의 노출에 대한 호흡기 보호개선 동물모델효능평가에 사용하였다. 상기 구축한 동물 모델을 미세먼지(PM10+DEP) 의 노출에 대한 동물모델로 명명하였다.
호흡기 손상 미세먼지(PM10)에 각각 디젤연구소분진(Diesel exhaust particles, DEP)를 섞은 4 mg/ml 미세먼지 혼합물(PM10D)을 수산화알루미늄(aluminium hydroxide, Alum)에 희석시켜 기도 및 폐 주입방법(Intra-Nasal-Tracheal (INT) injection)을 이용하여 3일 간격으로 3회 (약물투여 3일 후, 6일 후, 9일 후) intra-nasal tracheal injection, 기도를 통해 폐로 직접 주입하는 동물모델을 제작하고, 최종 미세먼지(PM10D+DEP) 주입 3일 후 분석하였다.
또한 시험군으로 비교예 1의 PG, 비교예 2의 PF, 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)및 실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7) 모두 100 ㎎/㎏로 동일한 농도로 시험군을 준비하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (3㎎/㎏)을 11일간 매일 오전11시에 경구투여 하여, 미세먼지의 노출에 대한 호흡기 보호개선 효과를 동물모델을 통하여 확인하였다. 결과는 미세먼지(PM10+DEP) 동물모델실험 종료 후 폐 조직(Lung)과, 폐세척액 (BALF)에서 염증활성 세포를 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다.
시험예 3-1: PG+ (PF+PFY) 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 동물모델 폐 조직(Lung tissue)의 염증세포를 유세포분석기(FASC)로 분석
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직 (Lung)에서 염증활성 세포를 FACS를 이용하여 확인 하였다. 결과는 하기 표 4와 같다.


폐에서의 세포 표현형 (cell phenotypes) 		미세먼지의 유도에 의한 기도염증 동물 모델 평가
(PM10D-induced airway inflammation murine model(Absolute No.))
Balb/c_
Normal		 PM10D_
CTL		 PM10D_
Dexa
3mg/kg		 PM10D_PF
100 mg/kg		 PM10D_PG
100 mg/kg		 PM10D_
PG+PF
100mg/kg		 PM10D_
PG+(PF+PFY)
100mg/kg
CD4+
(x105cells)		 12.82
±0.23		 26.94
±1.74###		 18.03
±2.21**		 19.09
±2.21		 19.04
±0.12		 12.20
±0.41***		 7.41
±1.11***
CD8+
(x105cells)		 4.35
±0.09		 15.78
±0.55###		 11.22
±1.51		 12.94
±1.43		 11.65
±1.47		 7.07
±0.19***		 4.25
±0.21***
CD4+/CD69+
(x105cells)		 0.39
±0.15		 6.16
±0.72###		 2.22
±0.29**		 4.11
±0.25		 3.99
±0.21**		 1.87
±0.49***		 0.65
±0.05***
CD62L+/CD44+
(x105cells)		 1.47
±0.39		 18.86
±0.08###		 9.25
±0.16**		 10.01
±2.44		 10.54
±0.09		 3.42
±0.03***		 2.89
±0.51***
Gr-1+/CD11b+
(x105cells)		 6.85
±1.55		 31.23
±17.97		 11.13
±0.15		 5.59
±0.2		 8.71
±1.25		 3.01
±0.22***		 1.89
±0.45***
상기 표4에서와 같이, 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐 조직 (Lung)에서 염증활성 세포를 확인한 결과, CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포에서 실시예 10의 PG+ (PF+PFY) 복합 추출물을100 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군에서 세포 비율이 다른 시험군 보다 더 감소하는 것을 확인하였다. 더욱 구체적으로는, 비교예 1의 PG 를 투여한 시험군과, 비교예 2의 PF를 경구 투여한 시험군보다 실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7)을 경구 투여한 시험군에서 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포가 더 감소하는 것을 확인되었다. 또한, 상기 실시예 3 의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군 보다, CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포의 염증활성 세포의 감소효과가 실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7)을 경구 투여한 시험군에서 약 2배 정도 더 관찰되었다.
시험예 3-2: PG+ (PF+PFY) 복합 추출물에 대한 미세먼지의 노출에 대한 동물모델 효능 평가에서 동물모델의 폐세척액(BALF)에 포함된 염증활성 세포를 유세포분석기(FASC)로 분석
미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐세척액(BALF)에서 염증활성 세포를 유세포분석기(FACS)을 이용하여 확인 하였다. 결과는 하기 표 5와 같다.

폐세척액에서의 세포 표현형 (Cell phenotypes)		 미세먼지의 유도에 의한 기도염증 동물 모델 평가
(PM10D-induced airway inflammation murine model(Absolute No.))
Balb/c_
Normal		 PM10D_
CTL		 PM10D_
Dexa
3mg/kg		 PM10D_PF
100 mg/kg		 PM10D_PG
100 mg/kg		 PM10D
_PG+PF
100mg/kg		 PM10D_
PG+PF+PFY
100mg/kg
CD4+
(x104 cells)		 0.81±
0.19		 40.47
±3.49###		 8.84±
0.01		 20.45±
0.03		 21.44±
0.09		 8.02±
2.69***		 3.66±
1.11***
CD8+
(x104 cells)		 0.39±
0.08		 38.99±
0.21###		 7.45±
0.81		 21.25±
1.11		 22.11±
1.04		 8.88±
1.31***		 2.21±
0.11***
CD4+/CD69+
(x104 cells)		 0.72±
0.69		 10.11±
0.14###		 3.51
±0.43		 4.75±
0.64		 4.88±
0.25**		 2.21±
0.38***		 1.11±
0.39***
CD62L+/CD44+
(x104 cells)		 0.37±
0.1		 47.09±
5.13###		 23.58
±2.80		 24.59±
0.18**		 22.21±
0.04**		 12.02±
0.33***		 6.32±
4.36***
CD11b+/CGr-1+
(x104 cells)		 1.45±
0.31		 81.74±
6.59###		 47.03
±2.21		 25.21±
8.2**		 26.22±
4.45**		 14.59±
2.29***		 4.21±
6.58***
상기 표 5에서와 같이, 미세먼지(PM10+DEP)의 노출에 대한 동물모델실험 종료 후 폐세척액(BALF)에서, 염증활성 세포를 확인한 결과, CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포에서 실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7)을 100 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 시험군에서 농도 의존적으로 감소하는 하는 것을 확인하였다. 또한 비교예 1의 PG 를 경구 투여한 시험군과, 비교예 2의 PF를 경구 투여한 시험군보다, 실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7)을 경구 투여한 시험군에서 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포비율이 더 감소하는 것을 확인되었다. 또한 실시예 3의 CHJ3(PG : PF=3 : 7)을 경구 투여한 시험군보다 CD4+ T 세포(CD4+), CD8+ T 세포(CD8+), CD4+/CD69+ 세포, CD62L+/CD44+세포 및 Gr-1+/CD11b+ 세포의 염증활성 세포 감소효과가 실시예 10의 복합 추출물(PG : PF+PFY=3 : 7)을 경구 투여한 시험군에서 약 2배 이상 현저하게 나타나는 것을 확인하였다. 시험예 3의 결과를 확인한 결과, 깨순 추출물과 깻잎 추출물의 혼합됨으로써, 인삼 추출물과 병용시 작용효과가 현저한 것으로 나타났다.

Claims (10)

  1. 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
    상기 복합 추출물은 인삼 추출물 20 내지 30 중량% 및 깻잎 추출물 80 내지 70중량%의 혼합물이고,
    상기 인삼 추출물은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 혼합물을 포함하는, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 혼합물은 인삼 추출물 총 중량에 대하여, 1 내지 3 중량%로 포함하는 것인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 깻잎 추출물은 로즈마리산을 포함하는 것인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 로즈마리산은 상기 깻잎 추출물 총 중량 중 1 내지 10 중량% 포함하는 것인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 복합 추출물은
    1) 인삼 및 깻잎을 주정으로 추출하여 인삼 추출액과 깻잎 추출액을 각각 제조하는 단계;
    2) 인삼 추출액과 깻잎 추출액을 각각 진공 농축하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계 후 각각 건조시키는 단계;를 포함하여 수득된 것인 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 깻잎 추출물은 깨순 추출물을 더 포함하는, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 미세먼지에 의한 호흡기 질환은 호흡기 염증성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive PulmonaryDisease; COPD), 부비강염, 알레르기성 비염, 하기도 감염증, 급만성기관지염, 폐렴, 기관지 천식, 기관지 확장증, 폐기종, 폐결핵 후유증, 급성 호흡 궁박증후군, 기침, 중이염, 인후염, 편도염, 후두염 및 폐섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인, 미세먼지에 의한 호흡기 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 개선용 건강 기능식품에 있어서,
    상기 복합 추출물은 인삼 추출물 20 내지 30 중량% 및 깻잎 추출물 80 내지 70중량%의 혼합물이고,
    상기 인삼 추출물은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 혼합물을 포함하는, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 개선용 건강 기능식품.
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