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KR102505472B1 - 핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 또는 선별 방법 - Google Patents

핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 또는 선별 방법 Download PDF

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KR102505472B1
KR102505472B1 KR1020220112126A KR20220112126A KR102505472B1 KR 102505472 B1 KR102505472 B1 KR 102505472B1 KR 1020220112126 A KR1020220112126 A KR 1020220112126A KR 20220112126 A KR20220112126 A KR 20220112126A KR 102505472 B1 KR102505472 B1 KR 102505472B1
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KR
South Korea
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nucleic acid
nucleic acids
capturing
biological sample
composition
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KR1020220112126A
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Inventor
강지현
신희종
김민이
Original Assignee
주식회사 제놀루션
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Abstract

본 발명은 핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 또는 선별 방법{Magnetic particles for capturing nucleic acids and Method for capturing or selecting nucleic acids using the same}
본 발명은 핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 또는 선별 방법에 관한 것이다.
자성 입자는 핵산 추출, 핵산 포획, 핵산 정제, 질병 진단, 약물 전달 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다. 자성 입자를 이용한 핵산 정제를 통해 질병 진단에 사용하기 위해서는 시료 내 혼재되어 있는 다양한 크기의 핵산들 중 목적하는 크기의 핵산만을 선별하여 포획하는 것이 중요하다. 특히, 차세대 염기서열 분석 (Next Generation Sequencing; NGS)에서 DNA의 크기는 원하는 시퀀싱 결과를 생성하는데 직접적인 영향을 미치기 때문에 예측 가능하고 일관된 크기의 핵산을 선별하는 것이 중요하다.
그러나 자성 입자 표면에 흡착될 수 있는 핵산의 양이 한정적이기 때문에 약 150 bp 내지 800 bp 크기의 핵산 단편을 선별하는 것에 한정되어 있으며, genomic DNA, bacterial DNA 등과 같이 크기가 큰 핵산의 정제 (cleanup)에 사용하기 어렵다. 또한, NGS 적용에 국한되어 sample 양이 50 μL 이하로 사용되고 있어 대량의 샘플에서 많은 핵산을 얻기 어려운 문제가 있다.
본 발명의 일 예는 아민 화합물이 도입되어 표면이 개질된 핵산 포획용 자성입자를 제공하여, 생물학적 시료에서 핵산을 높은 회수율로 포획할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자를 포함하는 핵산 포획용 조성물을 제공하여, 상기 조성물 및 샘플의 부피비 조절을 통해 특정 크기의 핵산을 선별할 수 있는, 핵산 포획 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 예는 아민 화합물이 도입되어 표면이 개질된, 세포유리 (cell-free) 핵산 포획용 자성 입자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자 및 용매를 포함하는, 핵산 포획용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물을 생물학적 시료에 첨가하여 핵산을 포획하는 단계; 및 상기 포획된 핵산을 방출하는 단계를 포함하는, 핵산 포획 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물을 생물학적 시료에 첨가하여 핵산을 포획하는 단계; 상기 포획된 핵산을 방출하는 단계; 및 상기 포획된 핵산의 염기서열을 해독하는 단계를 포함하는, 핵산 포획 및 해독 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 아민 화합물이 도입되어 표면이 개질된, 세포유리 (cell-free) 핵산 포획용 자성 입자에 관한 것이다.
상기 아민 화합물은 말단에 아민기 (NH2)를 가지는 화합물이며, 자성 입자의 표면에 도입되어 자성 입자의 결합력을 강화할 수 있다. 상기 아민 화합물은 예를 들어 폴리아미도아민 (poly(amidoamine), PAMAM) 일 수 있다. 상기 아민 화합물은 덴드리머(dendrimer) 일 수 있다. 일 예로, 상기 아민 화합물은 폴리아미도아민 덴드리머(poly(amidoamine) dendrimer)인 것일 수 있다. 일 예로, 상기 폴리아미도아민 덴드리머는 10세대 이하, 9세대이하, 8세대 이하, 7세대 이하, 6세대 이하, 5세대 이하, 4세대 이하, 3세대 이하, 2세대 이하, 또는 1세대 일 수 있다.
상기 아민 화합물은 실리카 (silica) 화합물을 매개하여 상기 자성 입자에 도입된 것일 수 있다. 일 예로, 상기 아민 화합물은 이산화규소 (SiO2)를 매개하여 상기 자성 입자에 도입된 것일 수 있다.
상기 아민 화합물의 분자량은 300 내지 20,000, 300 내지 18,000, 300 내지 15,000, 300 내지 10,000, 300 내지 8,000, 300 내지 6,000, 300 내지 5,000, 300 내지 4,000, 300 내지 3,000, 300 내지 2,500, 300 내지 2,000, 300 내지 1,500, 300 내지 1,000, 500 내지 20,000, 500 내지 18,000, 500 내지 15,000, 500 내지 10,000, 500 내지 8,000, 500 내지 6,000, 500 내지 5,000, 500 내지 4,000, 500 내지 3,000, 500 내지 2,500, 500 내지 2,000, 500 내지 1,500, 500 내지 1,000, 700 내지 20,000, 700 내지 18,000, 700 내지 15,000, 700 내지 10,000, 700 내지 8,000, 700 내지 6,000, 700 내지 5,000, 700 내지 4,000, 700 내지 3,000, 700 내지 2,500, 700 내지 2,000, 700 내지 1,500, 700 내지 1,000, 900 내지 20,000, 900 내지 18,000, 900 내지 15,000, 900 내지 10,000, 900 내지 8,000, 900 내지 6,000, 900 내지 5,000, 900 내지 4,000, 900 내지 3,000, 900 내지 2,500, 900 내지 2,000, 900 내지 1,500, 또는 900 내지 1,000 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 자성입자는 하기 (1) 내지 (4) 중 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다:
(1) 입경이 700 내지 1,200 nm, 700 내지 1,100 nm, 700 내지 1,000 nm, 800 내지 1,200 nm, 800 내지 1,100 nm, 800 내지 1,000 nm, 900 내지 1,200 nm, 900 내지 1,100 nm, 또는 900 내지 1,000 nm;
(2) 포화자기도가 30 emu/g 이상, 35 emu/g 이상, 또는 40 emu/g 이상 (이때, 하한값은 예를 들어 100 emu/g 이하, 90 emu/g 이하, 80 emu/g 이하, 70 emu/g 이하, 60 emu/g 이하, 또는 50 emu/g 이하일 수 있다);
(3) 표면 전위가 20 mV 이상, 25 mV 이상, 30 mV 이상, 또는 35 mV 이상 (이때, 하한값은 예를 들어 100 mV 이하, 90 mV 이하, 80 mV 이하, 70 mV 이하, 60 mV 이하, 50 mV 이하, 또는 45 mV 이하일 수 있다); 및
(4) 핵산 결합률이 14% 이상, 15% 이상, 18% 이상, 또는 20% 이상 (이때, 하한값은 예를 들어 100% 이하, 100% 미만, 95% 이하, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 또는 25% 이하일 수 있다).
본 발명의 일 예에 따른 자성 입자는 카르복실기로 기능화되지 않은 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자는 페닐보론산을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 자성 입자는 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS), 표적 염기서열 분석(targeted sequencing), 표적 딥 염기서열 분석(targeted deep sequencing), 패널 염기서열 분석(panel sequenceing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종에 사용되기 위한 핵산 포획용 자성입자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 자성입자는 용매에 포함되어 포함되어, 생물학적 시료의 부피보다 큰 부피로 상기 생물학적 시료에 첨가되는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물은, 생물학적 시료의 부피보다 큰 부피로 상기 생물학적 시료에 첨가되는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 조성물은 생물학적 시료 부피의 1 내지 2.5배 부피로 첨가되는 것일 수 있다. 본원 실시예에 의하면, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물을 생물학적 시료 부피의 1 내지 2.5배 부피로 첨가하여 핵산을 포획할 경우, 우수한 핵산 포획률을 나타냈다.
본 발명의 일 예에 따른 자성입자는 용매에 포함되어 생물학적 시료에 첨가되는 것일 수 있다. 이에, 본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자 및 용매를 포함하는, 핵산 포획용 조성물에 관한 것이다.
상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 세포, 조직, 객담, 뇨, 대변, 머리카락, 손톱 및 발톱으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 용매는 분자 군집제 (molecular crowding agent) 및 염석제 (salting agent)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 분자 군집제는 복수개의 분자가 같은 공간에 동시에 존재할 수 있도록 부피를 줄여주는 효과를 가지며, 핵산이 자성입자 (magnetic bead) 표면에 잘 흡착하도록 도와준다. 예를 들어, 상기 분자 군집제는 피콜 (ficoll), 덱스트란 (dextran), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 및폴리바이닐알코올 (PVA)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 다른 핵산 포획용 조성물의 상기 분자 군집제의 농도는 50%(w/v) 이하, 40%(w/v) 이하, 30%(w/v) 이하, 25%(w/v) 이하, 또는 20%(w/v) 이하일 수 있다.
상기 염석제는 자성 입자 (magnetic bead) 주변에 높은 전하밀도를 가진 채로 녹아있는 음이온이 전자 반발과 용질의 응집을 일으켜 비드와 핵산 결합이 용이하게 하는 효과를 가진다. 예를 들어, 상기 염석제는 염화나트륨 (NaCl) 및/또는 황산암모늄 ((NH4)2SO4)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 다른 핵산 포획용 조성물의 상기 염석제의 농도는 5M 이하, 4.5M 이하, 4M 이하, 3.5M 이하, 3M 이하, 2.5M 이하, 1 내지 5M, 1 내지 4.5M, 1 내지 4M, 1 내지 3.5M, 1 내지 3M, 1 내지 2.5M, 1.5 내지 5M, 1.5 내지 4.5M, 1.5 내지 4M, 1.5 내지 3.5M, 또는 1.5 내지 3M 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물은, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자를 5 내지 100 mg/ml, 5 내지 90 mg/ml, 5 내지 80 mg/ml, 5 내지 70 mg/ml, 5 내지 60 mg/ml, 5 내지 50 mg/ml, 5 내지 40 mg/ml, 5 내지 30 mg/ml, 5 내지 20 mg/ml, 5 내지 10 mg/ml, 10 내지 100 mg/ml, 10 내지 90 mg/ml, 10 내지 80 mg/ml, 10 내지 70 mg/ml, 10 내지 60 mg/ml, 10 내지 50 mg/ml, 10 내지 40 mg/ml, 10 내지 30 mg/ml, 10 내지 20 mg/ml, 15 내지 100 mg/ml, 15 내지 90 mg/ml, 15 내지 80 mg/ml, 15 내지 70 mg/ml, 15 내지 60 mg/ml, 15 내지 50 mg/ml, 15 내지 40 mg/ml, 15 내지 30 mg/ml, 15 내지 20 mg/ml, 20 내지 100 mg/ml, 20 내지 90 mg/ml, 20 내지 80 mg/ml, 20 내지 70 mg/ml, 20 내지 60 mg/ml, 20 내지 50 mg/ml, 20 내지 40 mg/ml, 20 내지 30 mg/ml, 25 내지 100 mg/ml, 25 내지 90 mg/ml, 25 내지 80 mg/ml, 25 내지 70 mg/ml, 25 내지 60 mg/ml, 25 내지 50 mg/ml, 25 내지 40 mg/ml, 25 내지 30 mg/ml, 30 내지 100 mg/ml, 30 내지 90 mg/ml, 30 내지 80 mg/ml, 30 내지 70 mg/ml, 30 내지 60 mg/ml, 30 내지 50 mg/ml, 30 내지 40 mg/ml, 35 내지 100 mg/ml, 35 내지 90 mg/ml, 35 내지 80 mg/ml, 35 내지 70 mg/ml, 35 내지 60 mg/ml, 35 내지 50 mg/ml, 35 내지 40 mg/ml, 40 내지 100 mg/ml, 40 내지 90 mg/ml, 40 내지 80 mg/ml, 40 내지 70 mg/ml, 40 내지 60 mg/ml, 40 내지 50 mg/ml, 45 내지 100 mg/ml, 45 내지 90 mg/ml, 45 내지 80 mg/ml, 45 내지 70 mg/ml, 45 내지 60 mg/ml, 45 내지 50 mg/ml, 50 내지 100 mg/ml, 50 내지 90 mg/ml, 50 내지 80 mg/ml, 50 내지 70 mg/ml, 50 내지 60 mg/ml, 55 내지 100 mg/ml, 55 내지 90 mg/ml, 55 내지 80 mg/ml, 55 내지 70 mg/ml, 55 내지 60 mg/ml, 60 내지 100 mg/ml, 60 내지 90 mg/ml, 60 내지 80 mg/ml, 60 내지 70 mg/ml, 65 내지 100 mg/ml, 65 내지 90 mg/ml, 65 내지 80 mg/ml, 65 내지 70 mg/ml, 70 내지 100 mg/ml, 70 내지 90 mg/ml, 70 내지 80 mg/ml, 75 내지 100 mg/ml, 75 내지 90 mg/ml, 75 내지 80 mg/ml, 80 내지 100 mg/ml, 80 내지 90 mg/ml, 85 내지 100 mg/ml, 85 내지 90 mg/ml, 90 내지 100 mg/ml, 또는 95 내지 100 mg/ml 농도로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 자성 입자 및 용매를 포함하는 핵산 포획용 조성물을 생물학적 시료에 첨가하여 핵산을 포획하는 단계; 및 상기 포획된 핵산을 방출하는 단계를 포함하는, 핵산 포획 방법에 관한 것이다. 상기 자성 입자, 상기 용매, 상기 핵산 포획용 조성물, 및 상기 생물학적 시료 등은 전술한 바와 같다.
표면이 아민 화합물로 개질된 자성입자는 핵산과 강하게 결합하며, 이에 핵산 포획시에는 중성에 가까운 pH로 조절하여 아민 화합물이 양성자와 결합하여 짝산 형태로 존재하며, 핵산 방출시에는 pH를 염기성으로 조절하여 고분자가 팽창하여 양성자가 아민에서 떨어져 나와 중성 전하를 가져, 결합된 핵산을 방출하는 것일 수 있다. 이에, 상기 포획하는 단계는 pH 7 내지 8에서 수행되는 것일 수 있다. 또는, 상기 방출하는 단계는 pH 10 내지 12에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 방출하는 단계는 pH 10 내지 12의 용출 버퍼 (elution buffer)를 첨가하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 핵산 포획 방법은, 상기 핵산을 포획한 자성입자를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 세척하는 단계는 세척액 또는 세척 버퍼 (wash buffer)을 사용하여 세척하는 것일 수 있다. 본원 실시예에 의하면, 상기 세척액의 pH에 따라 핵산의 회수율이 상이하게 나타났으며, 예를 들어 상기 세척액은 pH 4 이상, pH 5 이상, pH 5.5 이상, pH 4 내지 6, pH 4 내지 5.5, pH 4.5 내지 6, pH 4.5 내지 5.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 5 내지 5.5인 것일 수 있다. 또한, 본원 실시예에 의하면, 700bp 이상의 크기가 큰 핵산의 경우 상기 세척액의 pH에 의한 영향을 비교적 덜 받았으며, 이 때 상기 세척액은 pH 4 이상, pH 5 이상, pH 5.5 이상, pH 4 내지 12, pH 4 내지 11.5, pH 4 내지 11, pH 4 내지 10, pH 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6, pH 5 내지 12, pH 5 내지 11.5, pH 5 내지 11, pH 5 내지 10, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8, pH 5 내지 7, 또는 pH 5 내지 6인 것일 수 있다.
본원 실시예에 의하면, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 첨가 부피비에 따라 포획되는 핵산의 크기가 달라졌으며, 이에 상기 조성물의 첨가 부피를 조절하여, 생물학적 시료 내에서 특정 크기의 핵산을 선별적으로 포획할 수 있다. 상기 부피비 (volume ratio)는, 생물학적 시료의 부피 1을 기준으로 나타낸 핵산 포획용 조성물의 부피 비율을 의미하며, 예를 들어 생물학적 시료 부피의 2배 부피인 경우 2X와 같이 표기할 수 있다.
이에, 본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물 및 생물학적 시료의 부피비를 조절하여, 상기 생물학적 시료 내 포함된 특정 크기의 핵산을 선별적으로 포획하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료는 전술한 바와 같다.
이에, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법에서, 상기 포획하는 단계는, 제거 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계; 상기 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하기 위한, 상기 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계; 및 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여, 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “제거”는, 샘플에 포함된 여러 크기의 핵산들 중 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하는 것, 포획 대상 핵산 이외의 핵산을 포획 후 폐기하는 것, 또는 제거 대상 핵산을 포획 후 폐기하는 것을 의미하며, 예를 들어 샘플에 포함된 포획 대상 핵산 이외의 핵산, 또는 제거 대상 핵산 전체의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 90.5% 초과, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상 제거하는 것을 의미할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법 또는 핵산 정제 방법은, 샘플 내 작은 크기의 핵산을 제거하고, 큰 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제하는 것일 수 있다
일 예로, 큰 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제할 때, 상기 제거 대상 핵산의 크기는 600 bp 이하, 600 bp 미만, 500 bp 이하, 400 bp 이하, 300 bp 이하, 250 bp 이하, 200 bp 이하, 150 bp 이하, 또는 100 bp 이하일 수 있다.
일 예로, 큰 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제할 때, 상기 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하기 위한, 상기 조성물의 부피는, 상기 생물학적 시료 부피의 1배 미만, 0.9배 이하, 0.9배 미만, 0.8배 이하, 0.8배 미만, 0.7배 이하, 0.7배 미만, 0.6배 이하, 0.6배 미만, 0.5배 이하, 0.5배 미만, 0.4배 이하, 0.4배 미만, 0.3배 이하, 또는 0.3배 미만인 것일 수 있다.
예를 들어, 생물학적 시료의 부피 기준으로, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 부피가 0.8배 미만으로 첨가될 경우, 300bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 (300bp 초과 크기의 핵산을 선택적으로 포획)할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 시료의 부피 기준으로, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 부피가 0.2배 이상 내지 0.5배 미만으로 첨가될 경우, 600bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 (600bp 초과 크기의 핵산을 선택적으로 포획)할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 시료의 부피 기준으로, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 부피가 0.4배 초과 내지 0.6배 미만으로 첨가될 경우, 500bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 (500bp 초과 크기의 핵산을 선택적으로 포획)할 수 있다. 일 예로, 상기 조성물의 부피가 상기 생물학적 시료 부피의 0.5배로 첨가될 때, 3,000 bp 크기 핵산을 선택적으로 포획할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 시료의 부피 기준으로, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 부피가 0.5배 초과 내지 0.8배 미만으로 첨가될 경우, 300bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 (300bp 초과 크기의 핵산을 선택적으로 포획)할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자 및 이를 포함하는 조성물은, 생물학적 시료 내 포함된 핵산에서 특정 크기의 핵산을 정제하는, 핵산 정제용 자성입자 및 핵산 정제용 조성물인 것일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법 또는 핵산 정제 방법은, 샘플 내 큰 크기의 핵산을 제거하고, 작은 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 핵산 포획용 조성물을 사용한 핵산 포획을 2회 수행하여, 큰 크기의 핵산 단편을 생물학적 시료에서 제거하는 것일 수 있다. 구체적으로, 큰 크기의 핵산을 1차 포획 후 제거하고, 큰 크기의 핵산이 제거된 생물학적 시료에서, 큰 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획하는 것일 수 있다.
이에, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법에서, 상기 포획하는 단계는, 제거 대상 핵산 및 포획 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계; 상기 제거 대상 핵산 또는 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위한, 상기 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계; 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여, 제거 대상 핵산을 포획 후 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 포획하는 단계는, 상기 제거 대상 핵산을 제거 후, 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 제거 대상 핵산이 제거된 생물학적 시료에 첨가하여, 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 제거 대상 핵산은 생물학적 시료에서 포획하지 않을 크기 범위의 핵산이며, 상기 포획 대상 핵산은 생물학적 시료에서 포획을 수행할 크기 범위의 핵산을 의미한다.
일 예로, 작은 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제할 때, 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비는, 상기 생물학적 시료 부피의 1배 미만, 0.9배 이하, 0.8배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 0.5배 이하, 0.4배 이하, 0.5배 초과 내지 1배 미만, 0.5배 초과 내지 0.9배 이하, 0.5배 초과 내지 0.8배 이하, 0.5배 초과 내지 0.8배 미만, 0.4배 초과 내지 0.6배 미만, 0.4 내지 0.5배 미만, 0.3 내지 0.5배 미만, 또는 0.2 내지 0.5배 미만의 부피인 것일 수 있다.
일 예로, 작은 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제할 때, 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비는, 상기 생물학적 시료 부피의 0.4배 이상, 0.5배 이상, 0.6배 이상, 0.7배 이상, 0.8배 이상, 0.9배 이상, 0.95배 이상, 1배 이상, 1배 초과, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 0.4 내지 1.5배, 0.4 내지 1.4배, 0.4 내지 1.3배, 0.4 내지 1.2배, 0.5 내지 1.5배, 0.5 내지 1.4배, 0.5 내지 1.3배, 0.5 내지 1.2배, 0.6 내지 1.5배, 0.6 내지 1.4배, 0.6 내지 1.3배, 0.6 내지 1.2배, 0.7 내지 1.5배, 0.7 내지 1.4배, 0.7 내지 1.3배, 0.7 내지 1.2배, 0.8 내지 1.5배, 0.8 내지 1.4배, 0.8 내지 1.3배, 0.8 내지 1.2배, 0.9 내지 1.5배, 0.9 내지 1.4배, 0.9 내지 1.3배, 0.9 내지 1.2배, 0.95 내지 1.5배, 0.95 내지 1.4배, 0.95 내지 1.3배, 0.95 내지 1.2배, 1 내지 1.5배, 1 내지 1.4배, 1 내지 1.3배, 1 내지 1.2배, 1.1 내지 1.5배, 1.1 내지 1.4배, 1.1 내지 1.3배, 또는 1.1 내지 1.2배의 부피인 것일 수 있다.
일 예로, 작은 크기의 핵산을 선별적으로 포획 또는 정제할 때, 상기 제거 대상 핵산은 600 bp 초과, 600 bp 이상, 700 bp 이상, 800 bp 이상, 900 bp 이상, 1,000 bp 이상, 1,100 bp 이상, 1,200 bp 이상, 1,300 bp 이상, 1,400 bp 이상, 1,500 bp 이상, 1,700 bp 이상, 2,000 bp 이상, 2,500 bp 이상, 또는 3,000 bp 이상 크기의 핵산인 것일 수 있으며, 상기 포획 대상 핵산은 600 bp 이하, 600 bp 미만, 500 bp 이하, 400 bp 이하, 300 bp 이하, 250 bp 이하, 200 bp 이하, 150 bp 이하, 또는 100 bp 이하 bp 크기의 핵산인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 제거 대상 핵산 및 포획 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계; 상기 제거 대상 핵산 또는 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위한, 본 발명의 일 예에 따른 자성 입자 및 용매를 포함하는 핵산 포획용 조성물 및 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계; 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여 제거 대상 핵산을 포획 후 제거하는 단계; 및 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 제거 대상 핵산이 제거된 생물학적 시료에 첨가하여 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 포함된 핵산 선별 방법에 관한 것이다.
상기 제거 대상 핵산을 포획 후 제거하는 단계에서, 생물학적 시료에 대한 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 부피비를 낮게 (일 예로, 생물학적 시료 부피의 0.8배 미만) 조절하여, 큰 크기 (일 예로, 300 bp 초과, 500 bp 초과, 또는 600 bp 초과)의 핵산을 포획 및 제거하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물을 생물학적 시료 부피의 0.5배 초과 내지 0.8배 미만의 부피비로 첨가하여, 300bp 초과 크기의 핵산을 포획 및 제거하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물을 생물학적 시료 부피의 0.4배 초과 내지 0.6배 미만의 부피비로 첨가하여, 500bp 초과 크기의 핵산을 포획 및 제거하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물을 생물학적 시료 부피의 0.2배 내지 0.5배 미만의 부피비로 첨가하여, 600bp 초과 크기의 핵산을 포획 및 제거하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물을 생물학적 시료 부피의 0.8배 미만의 부피비로 첨가하여, 300bp 초과 크기의 핵산을 포획 및 제거하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물을 생물학적 시료 부피의 0.3 내지 0.5배 (일 예로 0.4배) 부피의 핵산 포획용 조성물을 첨가하여, 200bp 또는 300bp 크기의 핵산을 제거하는 것일 수 있다.
상기 포획 대상 핵산을 포획하는 단계에서, 생물학적 시료에 대한 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 부피비를 높게 (일 예로, 생물학적 시료 부피의 1배 초과, 1.1배 이상, 또는 1.2배 이상) 조절하여, 작은 크기 (일 예로, 600 bp 이하, 500 bp 이하, 또는 300 bp 이하)의 핵산을 포획하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.7배로 1차 첨가하여 제거 대상 핵산을 제거하고, 상기 조성물을 상기 제거 대상 핵산이 1차 제거된 생물학적 시료에 1.2배 부피비로 2차 첨가하여, 200 bp 크기의 핵산을 선택적으로 포획할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물 및 용매를 포함하는 핵산 포획용 조성물을 생물학적 시료에 첨가하여 핵산을 포획하는 단계; 상기 포획된 핵산을 방출하는 단계; 및 상기 포획된 핵산의 염기서열을 해독하는 단계를 포함하는, 핵산 포획 및 해독 방법에 관한 것이다.
상기 해독하는 단계는 차세대 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS), 표적 염기서열 분석(targeted sequencing), 표적 딥 염기서열 분석(targeted deep sequencing), 패널 염기서열 분석(panel sequenceing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 NGS 라이브러리 제작 과정에서 dNTP, salt, primer, dimer 등의 오염물질을 제거할 수 있고, DNA 수거 효율이 높으며, 특정 크기의 DNA를 선별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 예는 핵산 결합을 촉진할 수 있는 작용기로 표면을 개질하여 많은 양의 핵산을 포획할 수 있는 자성 입자를 사용하여, 1차적으로 샘플 내의 핵산 (whole DNA)을 적은 양의 입자를 사용하여 빠르게 포획하고, 2차적으로 자성 입자의 표면 전하 특성을 이용하고 자성 입자의 농도, 및/또는 결합 버퍼 (binding buffer)와 시료 (sample)의 부피 비율을 조절하여, 핵산을 크기 별로 선별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 표면 개질 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 표면이 개질된 자성입자의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 모양과 크기를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 포화자기도를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 표면 전위를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 핵산 친화도 (결합률)를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 첨가 농도에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 버퍼 부피에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 버퍼 부피에 따른 핵산 포획률을 핵산 크기별로 나타낸 도면이다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 분자 군집제 농도에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 염석제 농도에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법에서 사용한 세척액 (wash buffer)의 pH에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법에서 사용한 용출 버퍼 (elution buffer)의 pH에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 핵산 포획률을, 종래의 None 입자 및 APTES 입자와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의 핵산 포획률을, 종래의 Ampure XP 입자와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의, 샘플에 대한 부피비에 따른 핵산 포획률을 나타낸 도면이다.
도 16b는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물의, 샘플에 대한 부피비에 따른 핵산 포획률을, 종래의 none 입자 및 APTES 입자와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17a는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물을 사용한 2차 포획을 통해 특정 크기의 핵산을 포획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17b는 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획 방법으로 핵산을 포획한 결과를, 종래의 None 입자 또는 APTES 입자와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 자성입자의 표면 개질을 위한 고분자 ligand 선정
자성 입자 표면에 결합된 결합 영역은 자성 입자의 결합력을 강화할 수 있으며, 본 발명의 일 예는 자성 입자 표면을 산으로 개질하여 분산력을 높인 후 실리카를 도입하거나, 3차원적으로 구형에 가까운 구조를 가지는 고분자로 개질된 자성입자를 제조하였다. 또한, 음이온을 띠고 있는 핵산과 결합 및 분리가 용이하도록 pH 변화에 따라 팽창하는 양이온성 비드를 제조하였다.
구체적으로, 상기 고분자는 대표적인 양이온성 고분자로 1차아민 뿐만 아니라, 2차아민 및 3차아민으로 구성되어 양전하를 증대시키며, 고분자 매트리스의 팽창, 확산 등에 의한 핵산 방출을 위해 APTES 1차 노출, 메틸 아크릴레이트 (methyl acrylate) 및 에틸렌디아민 (EDA)의 부가반응을 통해 말단 작용기를 폴리아미도아민 (Poly(amidoamine); PAMAM)으로 표면을 개질하였다.
실시예 2. 자성입자의 표면 개질
평균크기 600nm를 가지는 Fe3O4 자성 입자에 아미노프로필 트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane; APTES)를 첨가하여 1차 아민을 노출시킨 후, 한쪽 말단에 아민기를 메틸 아크릴레이트 (methyl acrylate)와 상온에서 마이클 반응 (Michael reaction)을 수행하였다. 다음으로, 에틸렌디아민 (ethylenediamine; EDA)의 amidation과 부가 반응하여 최외곽의 표면 말단기에 1차 아민을 도입하였다. 자성입자의 표면 개질 과정을 도 1에 나타냈고, 표면이 개질된 자성입자의 모식도를 도 2에 나타냈다. 제조된 자성입자를 “PAMAM 자성입자”로 명명하여 실험에 사용하였다.
실시예 3. 표면이 개질된 자성입자 분석
(1) 입자 모양 분석
한국기초과학지원연구원 (KBSI)에 분석 의뢰하여 Transmission Electron Microscopy (TEM)을 통해 실시예 2에서 제조한 표면이 개질된 자성입자의 모양과 크기를 관찰하여 도 3에 나타냈다. PAMAM 자성입자의 지름은 954±51 nm로 측정되었다. 평균 크기 600nm인 Fe3O4에 비하여 입자 표면에 결합된 고분자 구조에 의해 자성 입자의 평균 크기가 증가된 것으로 분석되었다.
(2) 포화자기도 분석
한국기초과학지원연구원 (KBSI)에 분석 의뢰하여 Vibrating Sample Magnetometer (VSM)으로 실시예 2에서 제조한 표면이 개질된 자성입자의 포화자기도를 분석하여 도 4에 나타냈다. PAMAM 자성입자의 포화자기도는 40.6 emu/g으로 측정되었다.
(3) 제타전위 분석
제타전위 측정을 통하여 실시예 2에서 제조한 표면이 개질된 자성입자의 표면 전위 변화를 확인하여 도 5에 나타냈다. PAMAM 자성 입자의 표면 전위는 37.1 mV를 나타냈다. 자성입자 말단 작용기들이 1차 아민 혹은 dendrimer를 매개로 한 아민 작용기로 치환되어 표면 전위가 양전하성으로 변화된 것을 확인할 수 있었다.
(4) 핵산 친화도 분석
400 ng DNA (101 bp)에 실시예 2에서 제조한 PAMAM 자성입자를 1.6 mg 첨가하여 상온에서 10분간 결합시켰다 (n=3). 자성 입자의 결합률을 도 6에 나타냈다. 대조군으로 -OH 작용기를 가지는 TEOS로 코팅된 입자 (TEOS) 및 1차 아민을 가지는 Aminopropyltriethoxysilane로 표면이 코팅된 입자 (ATPES)를 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 말단 아민 작용기에 의하여 DNA 흡착이 증가되는 것을 관찰하였다. 표면에 아민 화합물이 도입되지 않은 자성입자 TEOS는 응집 현상이 심하여 실험에 적용하기 어려웠고, 매우 낮은 결합률을 나타냈다. 표면에 아민 화합물이 도입된 자성 입자는 높은 결합률을 보였으며, 특히 표면이 Aminopropyltriethoxysilane로 개질된 자성입자와 비교하여, 표면이 PAMAM로 개질된 자성 입자의 결합률이 더욱 높았다. 구체적으로, TEOS는 2.2%, APTES는 13.3%, PAMAM는 21.0% 결합률을 보였다.
실시예 4. 자성입자 첨가 농도에 따른 핵산 포획 (Bead/sample w/v ratio)
핵산 포획 및 특정 크기의 핵산을 선별하기 위한 자성입자 첨가 농도 조건을 알아보기 위해 1kb DNA ladder marker를 샘플로 사용하였다. 해당 샘플은 200~10,000bp 범위 내 10개의 이중 가닥 DNA 단편으로 구성되었으며, 1,000bp와 5,000bp 단편은 agarose gel 상에서 쉽게 확인할 수 있도록 조정하였다.
실시예 2에서 제조한 PAMAM 자성입자를 10 ug/ul, 20 ug/ul, 40 ug/ul, 또는 80 ug/ul 농도가 되도록, 20%(w/v) PEG 및 2.5M NaCl을 포함하는 SSB 버퍼 (Size Selection Buffer)에 첨가하여 핵산 포획용 조성물을 제조하였다.
상기 제조한 핵산 포획용 조성물 각 10ul를 상기 DNA ladder marker 샘플 10uL에 첨가하고, pH 7 내지 8에서 3분 간 결합하여 DNA 포획을 진행하였다. 분산 용액은 PEG를 사용하여 DNA가 비드의 표면에 잘 흡착하게 하였고, NaCl에 의한 염석 (salting out) 효과를 통해 비드와 핵산의 결합을 용이하게 하였다.
핵산을 흡착한 PAMAM 자성입자를 자석에 부착시켜 상층액을 폐기하고, 80% 에탄올로 자성 입자를 2회 세척 후 elution buffer (250mM NaOH; pH 10)를 첨가하여 상온에서 2분간 방출하였다. 자석으로 자성입자를 제거하고 상층액을 수거하여 정제된 DNA를 얻었다. 수거한 DNA를 초기 sample 세기를 1로 기준하여 평준화하였다.
자성입자 첨가 농도에 따른 DNA 수거율을 도 7에 나타내었다. 도 7에서 1X는 자성입자 농도 10 ug/ul의 핵산 포획용 조성물을 샘플 10ul에 첨가하여 핵산 포획을 수행한 결과이다. 자성입자 농도가 높을수록 핵산과 결합할 수 있는 입자가 많아져 수거율이 증가할 것으로 예상하였으나, 특정 자성입자 농도에서 핵산 포획률이 우수하였으며, 핵산 크기에 따라 포획률이 우수한 자성입자 농도가 다르게 나타났다. 도 7에 나타난 바와 같이, 1,000 bp 핵산의 경우 자성입자 첨가 농도 5 내지 10 g/L에서 핵산 수거율 80% 이상으로 높게 나타났다. 5,000 bp 핵산의 경우 자성입자 농도 40 g/L 이상 첨가할 경우 핵산 수거율이 감소하여, 5 내지 20 g/L의 농도에서 80% 이상의 포획률을 나타내 적절하였다.
실시예 5. 버퍼 부피에 따른 핵산 포획 (buffer/sample v/v ratio)
(1) 버퍼 부피에 따른 1,000 bp 및 5,000 bp 크기 핵산의 포획률 측정
실시예 2에서 제조한 PAMAM 자성입자를 10 mg/ml 농도로 포함하는 핵산 포획용 조성물을 1kb DNA ladder marker 샘플 10 μL에 다양한 부피로 첨가 후 상온 및 pH 7-8에서 5분간 결합시켜 핵산을 포획하였다. 핵산을 흡착한 PAMAM 자성입자를 자석에 부착시켜 상층액을 폐기하고, 80% 에탄올로 자성 입자를 2회 세척 후 elution buffer (250mM NaOH)를 첨가하여 pH 10-12 및 상온에서 2분간 방출하였다. 자석으로 자성입자를 제거하고 상층액을 수거하여 정제된 DNA를 얻었다. 수거한 DNA를 초기 sample 세기를 1로 기준하여 평준화하였다.
자성입자 버퍼 부피에 따른 DNA 수거율을 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 10ul 샘플에 자성입자를 포함하는 버퍼를 10ul 이상 첨가할 경우 높은 intensity를 나타냈으며, 샘플 부피 기준으로 버퍼 부피가 1 내지 2.5배에서 80% 이상의 우수한 핵산 포획율을 보였다.
(2) 버퍼 부피에 따른 다양한 크기의 핵산 포획률 측정
실시예 2에서 제조한 PAMAM 자성입자를 10 mg/ml 농도로 포함하는 핵산 포획용 조성물을 DNA ladder 10 μL sample 에 버퍼 부피를 다양하게 사용하여 상기 (1)과 동일한 방법으로 DNA 크기 별 포획량을 분석하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 모든 DNA 크기에서 상용화되어 있는 자성입자인 AMPure XP와 비교하였을 때 PAMAM 비드의 DNA 포획량이 약 5% 이상, 대부분의 경우 약 10% 이상, 최대 15% 이상 높았다. 특히, 10 μL sample 사용하였을 때, 자성입자를 포함하는 버퍼 12 μL 에서 가장 높은 효율을 보였으며, 도 8의 결과와 유사하게 sample 및 자성입자 버퍼의 부피비율 1:1 내지 1:2.5에서 핵산 포획률이 우수한 것으로 보였다. Ladder marker를 통하여 DNA 크기 별로 80% 이상 포획되는 것을 확인하였으며, clean up에 있어 자성입자 농도뿐만 아니라 샘플 및 자성입자 용액의 부피 비율이 중요하였으므로 이에 대한 실험을 통하여 적정 조건을 확립하였다.
실시예 7. SSB 조성에 따른 Cleanup 효율 비교
실시예 4에서 제조한 핵산 포획용 조성물 18μL을 DNA 샘플 (100bp DNA ladder marker) 10μL에 첨가 후 상온 및 pH 7 내지 8에서 5분간 결합시켜 포획을 진행하고, 자성입자를 자석에 부착시켜 상층액을 폐기하고, 80% 에탄올로 2회 세척 후 elution buffer (250mM NaOH)를 첨가하여 상온에서 2분간 방출하였다. 자석으로 자성입자를 제거하고 상층액을 수거하여 DNA를 수거하였다. 이 때, 핵산 포획용 조성물 내 분자 군집제 (PEG) 또는 염석제 (NaCl) 농도를 변화시켜 용액의 pH 및 DNA 수거율을 비교하였다. 수거한 DNA는 Agilent Genomic DNA ScreenTape System으로 정량하였으며, DNA 크기를 확인하였다. DNA 회수율 (Recovery %)은 수거한 DNA양을 초기 DNA양으로 나눈 값이다.
표 1에 나타난 바와 같이, 버퍼 내 PEG 또는 NaCl 농도에 따라 SSB 용액의 pH는 변화 없음을 확인하였다.
Reagent Final Concentration pH
PEG 50%(w/v) 7.71
PEG 40%(w/v) 7.87
PEG 30%(w/v) 7.93
PEG 20%(w/v) 8.00
PEG 10%(w/v) 8.01
PEG 5%(w/v) 8.03
NaCl 50%(w/v) 7.71
NaCl 40%(w/v) 7.87
NaCl 30%(w/v) 7.93
NaCl 20%(w/v) 8.00
NaCl 10%(w/v) 8.01
NaCl 5%(w/v) 8.03
도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이, PEG 양이 감소할수록 DNA 회수율 역시 감소하나, PEG 농도를 25% 초과하여 사용하면 용액의 점성 또한 증가하여 입자 운동이 더뎌 handling 하기 어려움이 발생하여, PEG 농도 25% 이하가 바람직하였다.
또한, 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, NaCl 농도 약 1.5 내지 3M에서 회수율이 우수하였다.
실시예 8. Wash Buffer pH에 따른 Cleanup 효율 비교
실시예 4에서 제조한 핵산 포획용 조성물 18μL을 DNA 샘플 (100bp DNA ladder marker) 10μL에 첨가 후 상온 및 pH 7 내지 8에서 5분간 결합시켜 DNA 포획을 진행하고, 자성입자를 분리하여 상층액을 폐기한 뒤 이물질 및 salt를 제거하기 위해 wash buffer 500uL를 첨가 후 vortex 하였다. 상층액이 투명해질 때까지 자성입자를 자석에 부착시키고, 상층액을 폐기하는 과정을 2회 반복하였다. Elution buffer (250mM NaOH)를 첨가하여 상온에서 2분간 incubation 후 자석을 이용하여 자성입자를 제거하고, 상층액을 수거하여 포획된 DNA를 얻었다. 이 때, 세척과정에 사용된 wash buffer 용액에 HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 조절하고, wash buffer의 pH에 따른 DNA 회수율을 측정하여 도 12a 및 도 12b에 나타냈다. 0μM은 pH 5.4로 측정되었다.
수거한 DNA는 Agilent Genomic DNA ScreenTape System으로 정량하였으며, DNA 크기를 확인하였다. DNA 회수율 (Recovery %)은 수거한 DNA양을 초기 DNA양으로 나눈 값이다. 도 12a에 나타난 바와 같이, wash buffer의 pH 약 4 내지 6 범위에서 회수율이 높게 나타났다. 또한, 도 12b에 나타난 바와 같이, wash buffer의 pH 약 4 내지 12 범위에서 큰 크기의 DNA 회수율이 높게 나타났다. 이후 실험에는 pH 5.2의 wash buffer를 사용하였다.
실시예 9. Elution Buffer pH에 따른 Cleanup 효율 비교
실시예 4에서 제조한 핵산 포획용 조성물 18μL을 샘플 (100bp DNA ladder marker) 10μL에 첨가 후 상온에서 5분간 결합시켜 DNA 포획을 진행하고, DNA를 포획한 자성 입자를 자석을 이용해서 분리하고 상층액을 폐기하였다. DNA를 포획한 자성입자에 wash buffer 500μL를 첨가하여 vortex 하고, 상층액이 투명해질 때까지 자석을 이용하여 자성입자를 분리하고, 상층액을 폐기하는 과정을 2회 반복하였다. Elution Buffer (250mM NaOH)를 첨가하여 상온에서 2분간 inbubation 후, 자석을 이용하여 자성입자를 제거하고 상층액을 수거하여 포획된 DNA를 얻었다. 이 때, 핵산 분리 과정에 사용된 elution buffer 용액에 HCl 또는 NaOH 농도를 다르게 첨가하여 pH를 조절하였으며, Elution buffer의 pH에 따른 핵산 회수율을 측정하여 도 13에 나타냈다. DNA 회수율 (Recovery %)은 수거한 DNA양을 초기 DNA양으로 나눈 값이다. 수거한 DNA는 Agilent Genomic DNA ScreenTape System으로 정량하였으며, DNA 크기를 확인하였다.
pH가 낮은 경우 DNA의 퓨린 염기가 손실되기 쉬워 포스포다이에스터 결합이 DNA의 염기쌍을 끊어질 수 있다. 따라서, 핵산은 산성 조건에서 불안정한 상태이므로, 염기성의 elution buffer를 사용하는 것이 바람직하다.
도 13에 나타난 바와 같이, elution buffer의 pH 10 이상 범위에서 핵산 회수율이 우수하였으며, 이후 실험에는 pH 10 이상의 Elution buffer를 사용하였다.
실시예 10. 비드에 따른 cleanup 효율 비교
상기 최적화된 용액들의 조성을 가지고, none 입자, APTES 입자, PAMAM 입자의 cleanup 실험을 진행하였다. 각기 다른 자성입자를 포함하는 핵산 포획용 조성물 18μL을 DNA 샘플 (100bp DNA ladder marker) 10μL에 첨가 후 상온 pH 7 내지 8에서 5분간 결합시켜 DNA 포획을 진행하고, 자성입자를 분리하여 상층액을 폐기한 뒤 이물질 및 salt를 제거하기 위해 wash buffer 500uL를 첨가 후 vortex 하였다. 상층액이 투명해질 때까지 자성입자를 자석에 부착시키고, 상층액을 폐기하는 과정을 2회 반복하였다. Elution buffer (250mM NaOH)를 첨가하여 상온에서 2분간 incubation 후 자석을 이용하여 자성입자를 제거하고, 상층액을 수거하여 포획된 DNA를 얻었다.
도 14에 나타난 바와 같이, None 입자, APTES 입자가 모든 크기 DNA를 수거 못하는 반면, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자의 회수율은 80% 이상이었다.
실시예 11. Ampure XP 입자와의 cleanup 비교
실시예 10과 동일한 방법으로 본 발명의 일 예에 따른 자성입자를 이용하여 DNA를 포획하고, Ampure XP 입자는 제조사에서 제공한 방법을 토대로 진행하여, 핵산 회수율을 도 15a 및 도 15b에 나타냈다. 도 15b에 나타난 바와 같이, 200-3000bp 모든 크기에서 Ampure XP는 평균 50% 회수율을 보여주었으며, 본 발명의 일 예에 따른 자성입자는 평균 85%로 1.7배 가량 높은 회수율을 나타냈다.
실시예 12. 작은 크기 핵산을 제외한 선별적 핵산 포획
DNA 샘플 (100bp DNA ladder marker) 50μL에 실시예 4에서 제조한 핵산 포획용 조성물을 다양한 부피비 (샘플 부피의 1.2배, 0.8배, 0.65배, 0.6배, 0.5배 또는 0.4배)로 첨가한 후, 실시예 10과 실질적으로 동일한 방법으로 핵산 포획을 진행하였다. 샘플 부피 기준의 핵산 포획용 조성물의 부피비에 따른 회수율을 도 16a에 나타냈다. 도 16a에 나타난 바와 같이, 샘플 부피에 대한 핵산 포획용 조성물의 부피비가 낮아질수록 작은 크기 핵산의 회수율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 샘플 부피에 대한 핵산 포획용 조성물의 부피비가 0.8배 미만일 때, 샘플 내에 포함된 핵산 중 작은 크기 핵산을 제외하여 포획하는 효율이 우수하였으며, 0.4X 비율에서는 600bp 이하, 0.5X 비율에서는 500bp 이하, 0.6X 비율에서는 300bp 이하 크기의 DNA를 제외하고 포획할 수 있었다. 0.8X 이상의 비율에서는 200-3000bp 크기의 모든 DNA를 포획할 수 있었다.
또한, 1.2X 비율에서는 200bp 크기 핵산의 회수율이 약 50%로 나타났으나, 0.4X 비율에서는 200bp 크기 핵산의 회수율이 약 0%로 나타나, 200bp 크기의 작은 핵산 제거율이 현저히 높았다. 또한, 0.6X 비율에서는 300bp 크기 핵산의 회수율은 약 15%로 나타났으나, 0.4X 비율에서는 300bp 크기 핵산의 회수율이 약 0%로 나타나, 300bp 크기의 작은 핵산 제거율이 현저히 높았다.
따라서, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물 및 샘플의 부피비를 조절하여, 작은 크기의 핵산을 포획하지 않고, 특정 크기의 핵산을 선별하는 것이 가능하다.
또한, 종래의 none 입자, APTES 입자, 및 본 발명의 일 예에 따른 자성입자를 사용하여, 핵산 포획용 조성물의 부피 비율에 따른 핵산 포획율을 비교하였다. 도 16b에 나타난 바와 같이, None 입자 및 APTES 입자는 핵산 포획을 하지 못하는 반면, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물은 부피 비율이 감소할수록 작은 크기 DNA를 제외하고 선택적인 핵산 포획이 가능하였다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 포획용 조성물 및 샘플의 부피 비율을 조절하여, 샘플 내 특정 크기의 핵산을 선택적으로 포획하는 것이 가능하다.
실시예 13. 큰 크기의 핵산을 제외한 선별적 핵산 포획
DNA 샘플 (100bp DNA ladder marker) 50μL에 0.7X 비율로 실시예 4에서 제조한 핵산 포획용 조성물 35μL를 첨가하여 상온에서 5분간 결합하여 큰 크기의 DNA를 흡착하였다. 큰 크기의 DNA를 흡착한 자성입자를 제거한 뒤 상층액을 채취하고, 상층액에 2차 부피비 (1.2배, 0.95배, 0.7배, 0.5배 또는 0.4배)에 따라 핵산 포획용 조성물을 첨가하여 DNA와 결합하였다. 자성입자를 자석에 부착시켜 상층액을 폐기하고, 에탄올을 이용하여 자성입자를 2회 세척하였다. Elution buffer를 첨가하여 상온에서 2분간 용출시켰다. 얻어진 DNA 회수율을 도 17a에 나타냈다.
도 17a에 나타난 바와 같이, 2차 포획 시에는 핵산 포획용 조성물의 부피 비율이 높아질수록 큰 크기 핵산의 회수율이 줄어들었다. 구체적으로, 1.2X 부피비에서는 3,000bp 크기 핵산의 회수율이 약 6% 였으나, 0.4X 부피비에서는 3,000bp 크기 핵산의 회수율이 1.5배 이상인 약 9.5%로 나타났다. 2차 포획시 핵산 포획용 조성물의 부피비가 높을수록 큰 크기 핵산을 보다 많이 제외하고 포획하였으며, 이는 1차 포획으로 인하여 샘플 내 핵산 농도 및 크기 분포가 상이해지고, 큰 크기의 핵산이 손상을 받아 상이한 경향성을 나타내는 것으로 보였다. 1차적으로 0.7X 비율로 큰 크기의 핵산을 제거하고, 2차 부피비율에 따라 큰 크기 DNA를 추가적으로 제거함으로 전반적인 회수율은 감소하였다.
또한, 종래의 none 입자 또는 APTES 입자를 사용하여 동일하게 실험한 결과를 도 17b에 나타냈다. 도 17b에 나타난 바와 같이, 종래의 None 입자 및 APTES 입자는 핵산 포획을 하지 못하는 반면, 본 발명의 일 예에 따른 핵산 선별방법은, 핵산 포획용 조성물의 2차 첨가 부피 비율이 증가할수록 큰 크기 DNA를 제거하고 선택적인 핵산 포획이 가능하였다.

Claims (29)

  1. 생물학적 시료 내에 포함된 핵산 중 제거 대상 핵산 및/또는 포획 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계;
    핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계; 및
    상기 생물학적 시료에서, (1) 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하거나, (2) 상기 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 포함하며,
    상기 부피비를 설정하는 단계는,
    (1) 상기 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하기 위한, 핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계, 또는
    (2) 상기 제거 대상 핵산 또는 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위한, 핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계를 포함하는 것이고,
    상기 핵산을 포획하는 단계는,
    (1) 상기 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하는 단계, 또는
    (2) 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여 제거 대상 핵산을 포획 후 제거하는 단계; 및
    상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 제거 대상 핵산이 제거된 생물학적 시료에 첨가하여, 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 포함하는 것이며,
    상기 핵산 포획용 조성물은, 아민 화합물이 도입되어 표면이 개질된 세포유리 (cell-free) 핵산 포획용 자성 입자 및 용매를 포함하는 것인,
    핵산 포획 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아민 화합물은 폴리아미도아민 (poly(amidoamine), PAMAM)인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아민 화합물은 폴리아미도아민 덴드리머 (poly(amidoamine) dendrimer)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아민 화합물은 실리카 (silica) 화합물을 매개하여 상기 자성 입자에 도입된 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 자성 입자는 카르복실기로 기능화되지 않은 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 자성 입자는 페닐보론산을 포함하지 않는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 자성 입자는 하기 (1) 내지 (4) 중 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인, 방법:
    (1) 입경이 700 내지 1200 nm,
    (2) 포화자기도가 30 emu/g 이상,
    (3) 표면 전위가 20 mV 이상, 및
    (4) 핵산 결합률이 14% 이상.
  8. 제1항에 있어서, 상기 포획 대상 핵산을 포획하는 단계에서, 상기 조성물은 생물학적 시료의 부피보다 큰 부피로 상기 생물학적 시료에 첨가되는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 자성 입자는 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS), 표적 염기서열 분석(targeted sequencing), 표적 딥 염기서열 분석(targeted deep sequencing), 패널 염기서열 분석(panel sequencing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종에 사용되기 위한 핵산 포획용인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    생물학적 시료 내에 포함된 핵산 중 제거 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계;
    핵산 포획용 조성물의 부피를 상기 생물학적 시료의 부피보다 작게 설정하는 단계; 및
    상기 생물학적 시료에 상기 핵산 포획용 조성물을 첨가하여, 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    생물학적 시료 내에 포함된 핵산 중 제거 대상 핵산 및 포획 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계;
    상기 제거 대상 핵산 또는 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위한, 핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계;
    상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여 제거 대상 핵산을 포획 후 제거하는 단계; 및
    상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 제거 대상 핵산이 제거된 생물학적 시료에 첨가하여, 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비는, 상기 핵산 포획용 조성물의 부피가 상기 생물학적 시료의 부피보다 작은 것이고,
    상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비는, 상기 핵산 포획용 조성물의 부피가 상기 생물학적 시료의 부피보다 큰 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 용매는 분자 군집제 (molecular crowding agent) 및 염석제 (salting agent)를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 분자 군집제의 농도는 25%(w/v) 이하, 및/또는 상기 염석제의 농도는 3M 이하인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 핵산 포획용 조성물 내 상기 자성입자의 농도는 5 내지 100 mg/ml인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 포획된 핵산을 방출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 포획하는 단계는 pH 7 내지 8에서 수행되는 것인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 방출하는 단계는 pH 10 내지 12의 용출 버퍼 (elution buffer)를 첨가하여 수행되는 것인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 핵산을 포획한 자성입자를 세척하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 세척하는 단계는 pH 4 이상의 세척액을 사용하여 세척하는 것인, 방법.
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하는 단계에서, 상기 생물학적 시료에 첨가되는 조성물의 부피는, 상기 생물학적 시료의 부피보다 작은 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하는 단계는,
    (1) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.8배 미만의 부피비로 첨가하여, 300bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획하는 것,
    (2) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.2배 이상 내지 0.5배 미만의 부피비로 첨가하여, 600bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획하는 것,
    (3) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.4배 초과 내지 0.6배 미만의 부피비로 첨가하여, 500bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획하는 것, 또는
    (4) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.5배 초과 내지 0.8배 미만의 부피비로 첨가하여, 300bp 이상 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 삭제
  24. 제1항에 있어서, 상기 포획 대상 핵산을 포획하는 단계에서, 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 상기 조성물의 부피는, 상기 생물학적 시료의 부피보다 작은 것이고,
    상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 상기 조성물의 부피는, 상기 생물학적 시료의 부피보다 큰 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제거하는 단계는,
    (1) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.8배 미만의 부피비로 첨가하여, 300bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 및 제거하는 것,
    (2) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.2배 이상 내지 0.5배 미만의 부피비로 첨가하여, 600bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 및 제거하는 것,
    (3) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.4배 초과 내지 0.6배 미만의 부피비로 첨가하여, 500bp 이하 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 및 제거하는 것, 또는
    (4) 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 0.5배 초과 내지 0.8배 미만의 부피비로 첨가하여, 300bp 이상 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획 및 제거하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 포획 대상 핵산을 포획하는 단계는, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료 부피의 1배 초과 내지 1.5배 이하의 부피비로 첨가하여, 3,000 bp 이상 크기의 핵산을 제외한 핵산을 선택적으로 포획하는 것인, 방법.
  27. 생물학적 시료 내에 포함된 핵산 중 제거 대상 핵산 및/또는 포획 대상 핵산의 크기를 설정하는 단계;
    상기 제거 대상 핵산 또는 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위한, 핵산 포획용 조성물 및 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계; 및
    상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여, (1) 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하거나, (2) 상기 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 포함하며,
    상기 부피비를 설정하는 단계는,
    (1) 상기 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하기 위한, 핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계, 또는
    (2) 상기 제거 대상 핵산 또는 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위한, 핵산 포획용 조성물 및 상기 생물학적 시료의 부피비를 설정하는 단계를 포함하는 것이고,
    상기 핵산을 포획하는 단계는,
    (1) 상기 제거 대상 핵산을 제외하고 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여 상기 제거 대상 핵산을 제외한 핵산을 포획하는 것, 또는
    (2) 상기 제거 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 생물학적 시료에 첨가하여 제거 대상 핵산을 포획 후 제거하는 단계; 및 상기 포획 대상 핵산을 포획하기 위해 설정된 부피비로, 상기 조성물을 상기 제거 대상 핵산이 제거된 생물학적 시료에 첨가하여 포획 대상 핵산을 포획하는 단계를 포함하는 것이며,
    상기 핵산 포획용 조성물은, 아민 화합물이 도입되어 표면이 개질된 세포유리 (cell-free) 핵산 포획용 자성 입자 및 용매를 포함하는 것인,
    생물학적 시료 내 포함된 핵산 선별 방법.
  28. 제1항 내지 제19항, 제21항 내지 제22항, 및 제24항 내지 26항 중 어느 한 항에 따른 핵산 포획 방법으로 핵산을 포획하는 단계; 및
    상기 포획된 핵산의 염기서열을 해독하는 단계를 포함하는,
    핵산 포획 및 해독 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 해독하는 단계는 차세대 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS), 표적 염기서열 분석(targeted sequencing), 표적 딥 염기서열 분석(targeted deep sequencing), 패널 염기서열 분석(panel sequencing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200007752A (ko) * 2018-07-13 2020-01-22 주식회사 제놀루션 마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법

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