KR102501488B1 - 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 kra17-833t6 균주, 이의 배양물 및 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물 - Google Patents
스트렙토마이세스 속 돌연변이주 kra17-833t6 균주, 이의 배양물 및 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 흰가루병 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주, 이의 배양물 및 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 흰가루병 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주, 이의 배양물, 및 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물에 관한 것이다.
흰가루병은 전 세계적으로 11,800여종의 식물에서 발생하는 것으로 보고되고 있으며, 국내에서는 400여종의 식물에 발생하는 것으로 알려졌다. 그 중에서 보리, 밀 등의 곡물류와 오이, 딸기, 토마토 등의 채소류, 사과, 포도, 배 등의 과수류, 그리고 장미, 거베라 등의 화훼류에서 흰가루병의 피해가 크다. 특히 국내에서 시설재배의 딸기, 오이, 가지, 및 장미 등 거의 모든 작물에서 흰가루병의 피해가 큰데 그 원인은 일조량 부족, 환기불량, 밀식재배, 질소비료 과용 등 국내시설재배 특성상 흰가루병 발병을 극복하기 어려운 재배환경 때문이다.
흰가루병 방제용으로 사용하는 약제는 Piperazine, Pyrimidine, Imidazole, Triazole 등의 스테롤 생합성 저해제와 Benzimidazole계 및 Strobilurin계의 화합물 등이 사용되고 있다. 스테롤 생합성 저해제는 피페라진계의 Triforine, 피리미딘계의 Nuarimol, Fenarimol, 트리아졸계의 Triadimefon, Flusilazole 등이 있다.
흰가루병 방제를 위해서 다양한 방법이 시도되기는 했으나, 현실적으로는 상기와 같은 유기합성 살균제에 의존하고 있으며 국내에서 흰가루병 방제에 사용된 금액은 전체 살균제의 약 10%에 달하고 있다. 하지만 계속되는 살균제 사용으로 약제 저항성균이 유발되는 등 약효저하에 대한 보고가 계속되고 있으며 농약의 오ㆍ남용에 의한 농산물 잔류문제가 제기되면서 환경 친화적인 새로운 흰가루병 방제제 개발의 필요성이 대두되고 있다.
생물농약으로서 흰가루병을 방제하고자 하는 노력은 천연물, 미생물 등을 이용한 방법들이 제시되었으며 특히 세균인 바실러스속 균들을 활용한 미생물 농약들이 개발되었으나, 효과가 우수하고 가격이 저렴하며 안전한 흰가루병 방제용 미생물 농약은 아직까지 정착되어 있지 않은 실정이다.
이와 같은 점들을 고려하여, 본 발명자들은 흰가루병 방제 활성이 높은 스트렙토마이세스 속 균주를 선별하고, 돌연변이 유발을 통해 방제 활성 및 수율을 향상시키며, 이 균주 또는 이의 배양액을 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물의 해충방제 효과를 확인하고, 이 균주가 우수한 흰가루병 방제 활성을 나타내는 배양 조건을 확립하였다.
본 발명의 목적은, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주, 이의 배양물, 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물 및 이의 제조방법, 및 이를 이용한 흰가루병 방제 방법을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1구현예로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP)를 제공한다.
상기 균주는 흰가루병(powdery mildew)에 대한 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 흰가루병은 곡물류로서 보리 또는 밀; 채소류로서 오이, 딸기, 가지, 호박, 고추, 상추, 파프리카 또는 토마토; 과수류로서 참외, 수박, 사과, 포도 또는 배; 화훼류로서 장미 또는 거베라로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 발병한 것 일 수 있다.
본 발명은 제2구현예로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP)의 배양물을 제공한다.
본 발명은 제3구현예로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 흰가루병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA833-T6 균주 또는 이의 배양여액의 1 내지 100배 희석액을 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명은 제4구현예로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP)를 배양하는 흰가루병 방제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 균주의 배양 배지의 탄소원:질소원 중량비가 1:3 내지 6:3 일 수 있다.
상기 균주의 배양 배지의 탄소원은 글루코스이고, 질소원은 콩가루 일 수 있다.
상기 균주를 교반속도 160 내지 200rpm에서 배양하는 것 일 수 있다.
상기 균주를 25 내지 29 ℃에서 배양하는 것 일 수 있다.
상기 균주를 5일 내지 9일 동안 배양하는 것 일 수 있다.
본 발명은 제5구현예로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 흰가루병 방제용 조성물을 식물의 전부 또는 일부, 식물의 종자, 식물의 서식지 또는 흰가루병 균의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는 흰가루병 방제 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 흰가루병 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주, 이의 배양물 및 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물 및 이의 제조방법을 이용하여 흰가루병의 예방 및/또는 치료를 효과적으로 수행하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 흰가루병 방제 활성이 우수한 균주를 스크리닝하기 위해 선발된 방선균의 흰가루병 방제 활성을 비교한 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주의 배양조건 M3 배지, 27℃, 7일 배양, 150rpm에 따른 흰가루병 방제 효과를 나타낸 것이고, 도 2b는 KRA17-833 균주의 배양조건 A 배지, 27℃, 7일 배양, 170rpm에 따른 흰가루병 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주 배양여액의 처리 시기에 따른 흰가루병 발병률을 비교한 그래프이고, 도 3b는 KRA17-833 균주 배양여액의 처리 시기에 따른 방제가(예방 효과)를 비교한 그래프이며, 도 3c는 KRA17-833 균주 배양여액의 처리 시기에 따른 흰가루병 예방 효과를 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 KRA17-833 균주 배양여액의 희석율에 따른 흰가루병 발병률 및 방제가(치료 효과)를 비교한 그래프이고, 도 4b는 KRA17-833 균주 균주 배양여액의 희석율에 따른 흰가루병 치료 효과를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주에 의해 생산된 흰가루병 방제 활성물질의 분리 및 정제 방법을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주의 16S rRNA의 유전자 염기서열 분석에 근거한 계통수를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주에 의해 생산되는 유효 활성물질의 정량분석 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주 개량을 위한 UV 돌연변이 방법을 나타낸 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주의 돌연변이체 T3(833-T3), T6(833-T6), T7(833-T7), 야생형 및 미처리 대조군에 대하여, 배양여액 100배 희석액의 흰가루병 발병율 및 방제가를 비교한 그래프이고, 도 9b는 상기 돌연변이체 T6와 미처리 대조군(CK)의 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(T6)와 야생형(wild type) 배양액의 HPLC 분석을 통한 활성물질 수율을 비교한 것이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이주 KRA17-833T6 균주를 탄소원:질소원 비율이 1:3, 2:3, 3:3, 4:2, 4:3 인 배지에서 배양한 배양액[순서대로 GS13, GS23. GS33, GS42, GS43], M3 배지에서 배양한 야생형 균주의 배양액[M3 배지 - 야생형] 및 미처리 대조군에 대하여 흰가루병 발병율 및 방제가를 비교한 그래프이고, 도 11b는 상기 탄소원:질소원 비율이 4:2인 배양액[GS42] 및 미처리 대조군[CK]의 처리 결과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 배양 시 교반속도 150rpm을 사용한 경우 배양여액의 흰가루병 방제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 12b는 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 배양 시 교반속도 170rpm을 사용한 경우 배양여액의 흰가루병 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주의 배양조건 M3 배지, 27℃, 7일 배양, 150rpm에 따른 흰가루병 방제 효과를 나타낸 것이고, 도 2b는 KRA17-833 균주의 배양조건 A 배지, 27℃, 7일 배양, 170rpm에 따른 흰가루병 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주 배양여액의 처리 시기에 따른 흰가루병 발병률을 비교한 그래프이고, 도 3b는 KRA17-833 균주 배양여액의 처리 시기에 따른 방제가(예방 효과)를 비교한 그래프이며, 도 3c는 KRA17-833 균주 배양여액의 처리 시기에 따른 흰가루병 예방 효과를 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 KRA17-833 균주 배양여액의 희석율에 따른 흰가루병 발병률 및 방제가(치료 효과)를 비교한 그래프이고, 도 4b는 KRA17-833 균주 균주 배양여액의 희석율에 따른 흰가루병 치료 효과를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주에 의해 생산된 흰가루병 방제 활성물질의 분리 및 정제 방법을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주의 16S rRNA의 유전자 염기서열 분석에 근거한 계통수를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주에 의해 생산되는 유효 활성물질의 정량분석 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주 개량을 위한 UV 돌연변이 방법을 나타낸 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRA17-833 균주의 돌연변이체 T3(833-T3), T6(833-T6), T7(833-T7), 야생형 및 미처리 대조군에 대하여, 배양여액 100배 희석액의 흰가루병 발병율 및 방제가를 비교한 그래프이고, 도 9b는 상기 돌연변이체 T6와 미처리 대조군(CK)의 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(T6)와 야생형(wild type) 배양액의 HPLC 분석을 통한 활성물질 수율을 비교한 것이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이주 KRA17-833T6 균주를 탄소원:질소원 비율이 1:3, 2:3, 3:3, 4:2, 4:3 인 배지에서 배양한 배양액[순서대로 GS13, GS23. GS33, GS42, GS43], M3 배지에서 배양한 야생형 균주의 배양액[M3 배지 - 야생형] 및 미처리 대조군에 대하여 흰가루병 발병율 및 방제가를 비교한 그래프이고, 도 11b는 상기 탄소원:질소원 비율이 4:2인 배양액[GS42] 및 미처리 대조군[CK]의 처리 결과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 배양 시 교반속도 150rpm을 사용한 경우 배양여액의 흰가루병 방제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 12b는 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 배양 시 교반속도 170rpm을 사용한 경우 배양여액의 흰가루병 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명에서 "배양물"이란 미생물을 배지에서 배양한 결과 수득되는 결과물을 의미한다.
본 발명에서 "배양 여액"이란 배지에서 미생물을 배양한 후 균체를 여과하여 제거한 뒤 남은 액체를 의미한다.
본 발명에서 "흰가루병 방제용 조성물"이란 식물에 발병하는 흰가루병의 예방, 경감 또는 치료를 목적으로 사용하는 조성물을 의미한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP) 또는 이의 배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP) 및/또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 흰가루병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 배양물에는 배양액 또는 배양여액이 포함된다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 또는 이의 배양물은 흰가루병(powdery mildew)에 대한 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 흰가루병은 식물조직 위의 흰색에서 회색의 점무늬나 큰무늬 가루 모양으로 자라는 곰팡이가 잎의 표면에 가장 흔하게 나타나는 것으로, 감염부위에는 하얀 균총이 표면에 부분적으로 나타나거나 잎 전면에 밀가루를 뿌려 놓은 것 같은 증상을 보이며, 잎의 아래쪽, 어린 싹과 줄기, 눈, 꽃과 어린 열매에도 발생한다.
상기 흰가루병이 발병하는 식물로는 곡물류, 채소류, 과수류, 화훼류 등이 있으나 한정되지 않으며, 그 예로는 곡물류로 보리 또는 밀 등; 채소류로 오이, 딸기, 가지, 호박, 고추, 상추, 파프리카 또는 토마토 등; 과수류로 참외, 수박, 사과, 포도 또는 배 등; 화훼류로서 장미 또는 거베라 등이 있다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주는 토양 샘플에서 흰가루병 방제 활성이 높은 스트렙토마이세스 속 KRA17-833 균주를 선발한 후 두 차례에 걸친 돌연변이 유발을 통해 흰가루병 방제 활성 및 수율이 현저히 증대된 변이 균주이다(이하, '방제 활성' 또는 '방제 효과'란 다른 기재가 없는 한 흰가루병 방제 활성 또는 효과를 의미한다).
본 발명의 일 실시예에서, 오이 흰가루병에 대해 배양액 10배, 20배 희석액 처리 시 가장 우수한 방제 활성을 나타내는 스트렙토마이세스 속 KRA17-833 균주를 선별하였다.
도 1을 참조하면, 오이 흰가루병에 대해 배양액 3배 희석액 처리에서 100% 방제 활성을 나타내는 14개 균주을 선발하고, 이들의 배양액 10배, 20배 희석액을 오이 흰가루병에 처리 시 KRA17-833 균주(도 1에서 833으로 표시됨)가 가장 높은 방제 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KRA17-833 균주의 배양조건에 따른 방제 효과, 배양액 처리 시기에 따른 예방 효과, 배양액의 희석 농도에 따른 치료 효과를 확인하였다. 도 2a-도 2b, 도 3a-도 3b, 도 4a-4b를 참조하면 배지 또는 배양 조건에 따라, 처리 시기에 따라, 희석 농도에 따라 방제 효과에 차이가 발생할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KRA17-833 균주 배양액에 포함된 활성물질을 확인하기 위하여 도 5와 같이 KRA17-833 균주 배양여액을 추출, 분리 및 정제하였다. 분리한 활성물질(833-M)을 분석한 결과, 분자량 [M+H] 423.2103의 화학식 C17H26N8O5의 신규 화학구조를 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KRA17-833 균주의 분류학적 구분을 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열을 다른 스트렙토마이세스 균주의 염기서열과 비교하였다. 도 6은 KRA17-833 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것으로, KRA17-833 균주는 스트렙토마이세스 요코스카넨시스(Streptomyces yokosukanensis)와 99.9% 유사성을 나타내었다.
본 발명의 흰가루병 방제용 조성물은 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 또는 이의 배양여액의 1 내지 100배 희석액을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 활성물질의 정량분석 조건 확립 및 균주 개량을 위한 UV 돌연변이 유발 조건을 확립하고, 2차례 UV 돌연변이 유발을 통해 개량 균주를 선발하였다. 야생형 보다 방제활성이 향상된 변이체 T3, T6, T7 모두 배양액 50배 희석액 처리 시 95% 이상의 방제 활성을 나타내었다. 또한, 도 9a-도 9b에 나타난 것과 같이, 야생형 보다 방제활성이 향상된 변이체 T3, T6, T7 중 배양액 100배 희석액에서 가장 우수한 방제 활성을 나타내는 KRA17-833T6를 선발하였다. 도 10을 참조하면, 변이 균주 KRA17-833T6는 활성물질 833-M 및 다른 활성물질의 함량이 야생형에 비하여 2배 이상 증가하여 수율이 향상된 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 변이 균주 KRA17-833T6는 야생형 균주 KRA17-833 보다 방제활성 및 활성물질 수율이 모두 향상된 것으로 나타났다.
본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6(수탁번호: KCTC15066BP) 균주를 배양하는 흰가루병 방제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 흰가루병 방제용 조성물의 제조를 위한 배지에서, 탄소원:질소원 중량비가 1:3 내지 6:3 (1~6:3) 인 것이 바람직하고, 2:3 내지 6:3(2~6:3) 인 것이 더욱 바람직하며, 이 중에서도 6:3(4:2) 인 경우 가장 바람직하다. 또한, 상기 탄소원은 글루코스 일 수 있고, 질소원은 콩가루 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, KRA17-833T6 균주의 배양조건을 확립하기 위하여, 탄소원 및 질소원에 따른 배양 상태 및 활성을 조사하였다. 표 2를 참조하면, 탄소원을 글루코스로 고정할 때 질소원으로는 콩가루(soybean flour)인 경우 방제 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 도 11a-도 11b를 참조하면, 탄소원과 질소원의 비율에 따른 방제 활성을 조사한 결과 1:3, 2:3, 3:3, 4:2, 4:3 비율의 경우 각각 83.3%, 94.5%, 93.9%, 96.6% 및 92.1%로 매우 우수한 효과를 나타내었다.
본 발명의 흰가루병 방제용 조성물의 제조를 위한 배양에서, 교반속도는 160 내지 200rpm 인 것이 바람직하고, 160 내지 180rpm인 것이 더욱 바람직하며, 170rpm인 것이 가장 바람직하다. 또한, 온도 25 내지 29 ℃에서, 5일 내지 9일 동안 배양되는 것이 바람직하다. 상기 배양 조건의 범위를 벗어나는 경우, KRA833-T6 균주 배양액의 방제 활성이 저하될 수 있다. 도 12a-도 12b에 따르면, KRA833-T6 균주를 탄소원:질소원 4:2 배지, 27℃, 7일간의 조건에서 배양할 때, 교반속도를 150rpm에서 170rpm으로 증가시키는 경우 방제 효과가 증가한 것을 확인하였다. 특히 150rpm에서 배양한 경우 50배 희석액에서 70% 방제 활성을 보였으나, 170rpm으로 배양한 경우 100배 희석액에서도 95%의 방제 활성을 나타내어, KRA17-833T6 균주는 교반속도 증가함에 따라 활성물질 생산성이 향상됨을 확인하였다. 다만, 교반속도가 200rpm을 초과하여 거품 발생이 심한 문제가 발생하는 경우 미량원소, 거품 방지제 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 전술한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6(수탁번호: KCTC15066BP) 균주 및/또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 흰가루병 방제용 조성물을 식물의 전부 또는 일부, 식물의 종자, 식물의 서식지 또는 흰가루병 균의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는 흰가루병 방제 방법을 제공한다.
상기 식물로는 흰가루병이 발병하는 식물이라면 한정되지 않으며, 그 예로는 곡물류로서 보리 또는 밀 등; 채소류로서 오이, 딸기, 가지, 호박, 고추, 상추, 파프리카 또는 토마토 등; 과수류로서 참외, 수박, 사과, 포도 또는 배 등; 화훼류로서 장미 또는 거베라 등이 있다.
상기 접촉은 식물의 줄기와 잎에 직접 살포하는 경엽처리이거나 토양에 적용하는 토양처리일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1: 토양 방선균 라이브러리 구축 및 선발
충북 단양군, 무주 덕유산, 제주도 일대 산림 및 국공립공원 토양을 채취한 후 방선균 선택 배지를 이용하여 분리하였다. 계대 배양을 통해 순수 분리한 750종의 방선균은 25% 글리세롤(-70℃)에 균 현탁액을 만들어 보관하고 각 방선균을 액체 배지(M3)에 배양한 후 배양여액을 이용하여 생물활성을 위한 라이브러리를 구축하였다.
이와 같이 분리된 방선균 배양여액 500여개를 3배 희석 살포한 결과 14개 균 배양액에서 100%의 오이 흰가루병 방제 활성을 보인 14개 균주를 선발하였고, 이들 14개 균주 배양액을 10배, 20배 희석하여 살포한 결과, 10배 희석액 살포 시 선발된 모든 균에서 90% 이상의 방제 효과가 확인되었으며 20배 희석 시에도 6개 균 배양액에서 80% 이상의 활성을 나타내었다(도 1). 상기 14개 균주 중 10배 희석 및 20배 희석에서 모두 거의 100%의 방제 활성을 나타내는 균주 KRA17-833을 선발하였다.
실시예 2: 선발된 균주 KRA17-833의 오이 흰가루병 방제 효과
(1) 균주 KRA17-833의 배양조건에 따른 흰가루병 방제 효과를 확인하였다.
M3 배지, 27℃, 150rpm 조건에서 배양된 배양여액을 온실조건에서 처리 시, 10배, 20배 희석액에서 100%의 오이 흰가루병 완전 방제 효과를 보였으며 50배 희석액에서 75%의 방제 효과를 나타내었다(도 2a).
기본 배지인 M3 배지에 탄소원의 변화를 준 A 배지[glucose 2%(w/v), soluble starch 1%(w/v), soybean flour 2%(w/v)]를 이용하고 교반속도를 150rpm에서 170rpm으로 증가시켜 배양된 배양여액 온실 조건에서 처리 시, 50배 희석액에서 95% 이상의 방제 효과를 보였고, 100배 희석액에서도 80%의 방제 효과를 나타내었다(도 2b).
(2) 균주 KRA17-833의 배양여액 처리 시기에 따른 흰가루병 예방 효과를 확인하였다. 비닐하우스 포장에서 오이 흰가루병 방제 활성평가는 처리 시기를 9월, 10월, 11월로 조건을 달리하여 실시하였고, 배양여액을 각 농도로 희석하여 7일 간격으로 3회 경엽 살포하고 최종 살포 7일 후 달관조사를 통해 발병 정도를 조사하였다.
고온 건조한 조건인 9월 처리 시, 하우스 포장에서의 병 발생율은 평균 90%로 배양여액 100배, 50배, 20배, 10배로 희석하여 살포 처리한 결과 병 방제가는 각각 77.4%, 95.6%, 95.9%, 100%로 탁월한 예방효과를 보였다(도 3a-도 3c).
일교차가 큰 10월 말 처리 시, 흰가루병 방제가는 희석배수에 따라 89.2%, 94.8%, 98.2%, 99%로 거의 완전 예방수준의 효과가 확인되었다(도 3a-도 3c).
(3) 균주 KRA17-833의 배양여액 희석 농도에 따른 흰가루병 치료 효과를 확인하였다. 흰가루병이 50% 정도 발병한 오이 잎에 배양여액을 20배, 50배 희석하여 7일 간격으로 3회 경엽 살포하였다. 그 결과 50배 희석액 처리 시 73.2%의 치료 효과가 확인되었고, 20배 희석액 처리 시 89.3% 이상의 매우 우수한 효과를 나타내었다(도 4a, 도 4b).
실시예 3: 균주 KRA17-833이 생산하는 유효 활성물질의 정제 및 화학구조 규명
도 5에 나타낸 바와 같이, 균 배양여액을 HP20 레진에 흡착시킨 후 물(100%)~메탄올(100%) 순으로 용출하여 각 분획별 흰가루 방제 활성을 검정하였다. 활성을 보이는 30% 메탄올 분획을 MPLC(0~100% MeOH), 세파덱스 LH20(aq. 30% MeOH), C18 sep-pak 카트리지(0~10% MeOH)를 실시하여 분리 정제한 후 최종적으로 분취용 HPLC[D.W (pH 3.17), 6ml/min, 210,254nm, Rt14min]를 통해 활성물질을 순수 분리 정제하였다.
분리한 유효 활성물질은 ESI-TOF MS 스펙트럼을 통해 분자량을 확인하였다. 그 결과, 활성물질은 분자량 [M+H] 423.2103의 화학식 C17H26N8O5인 것으로 규명되었다(이하, 이 활성물질을 833-M 이라 함).
실시예 4: 균주 KRA17-833의 분류 동정
균주 KRA17-833는 ㈜마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA 유전자의 서열 분석을 하였고, 확보된 염기서열을 GenBank database의 염기서열과 비교하였다. 염기서열 비교 결과로 얻은 후보군 중에서 가장 유사도가 높은 후보군 10종을 clustal w를 이용하여 정렬하고 neighbour-joining method (PHYDIT program version 3.0)를 통해 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. KRA17-833 균주는 16S rRNA 유전자 상동성 분석 결과 스트렙토마이세스 요코스카넨시스(Streptomyces yokosukanensis)와 99.9%의 유사성을 보이는 것으로 확인되었다(도 6).
실시예 5: 균주 KRA17-833의 돌연변이를 통한 방제활성 및 수율 증가
(1) 활성물질 833-M의 정량분석조건 확립
KRA17-833 균주가 생산하는 흰가루병 방제 활성물질은 수용성으로 0.02% TFA를 첨가한 DW을 이용하여 분석조건을 확립하였다. 활성물질 833-M은 머무름 시간(retention time) 4.16분으로 UV max 209, 274로 정량분석 결과 배양여액 원액에 약 5 ppm 농도로 존재하는 것이 확인되었다. 따라서 정량분석 조건을 바탕으로 돌연변이 유발을 통한 변이 균주들의 활성물질 증가 및 배양조건 확립 시 물질의 수율 증가 여부 확인에 사용하였다.
(2) UV 돌연변이 유발 조건 확립
균주 KRA17-833 포자 현탁액(105 콜로니/ml) 100㎕를 멸균 증류수를 이용하여 희석(10-2)한 후 방선균 배양용 한천배지에 도말하고 암 조건에서 일정 시간 동안 UV(254nm)를 조사한 후 콜로니 형성률 1%의 조건을 탐색하기 위하여 시간별로 콜로니 개수를 조사하였다(도 8). KRA17-833 균주의 경우 17cm 높이에서 90초간 UV 조사 시 형성된 콜로니 수는 평균 9개로 미처리 대조군와 비교 시 1.2%의 콜로니 형성을 보임으로써(표 1), 이후 UV를 이용한 돌연변이 유발에 이와 동일한 조건을 사용하였다.
(3) 선발 돌연변이 균주의 배양 및 활성 검정균주 개량을 통해 선발된 각 콜로니들을 액체배양용 배지(M3)에 각각 접종하여 27℃, 150 rpm으로 7일간 진탕 배양한 후 배양여액을 사용하여 활성평가 및 HPLC 정량분석을 실시하였다. 각 배양액의 흰가루병 방제 활성평가는 잎 면적의 30~40% 정도의 흰가루병 발병율을 보이는 오이 유묘에 배양여액을 50배 희석하여 분무 살포하고 7일 후 달관조사를 통해 활성을 평가하였으며, 그 결과 흰가루병 방제활성이 우수한 변이체는 HPLC를 사용하여 활성물질의 수율을 정량분석한 후 가장 활성이 우수한 변이체를 최종 선발하였다.
UV 조사에 의한 균주 개량을 통해 선발된 506개의 변이체 배양액의 활성을 평가한 결과 20개 변이체에서 70% 이상의 방제활성을 보였으며 5개의 변이체에서 90% 이상의 병 방제 활성을 나타내었다. 활성이 우수한 선발 변이체는 재배양하여 활성 평가를 통해 재현성을 확인하였으며 이 중 3개의 변이체에서 야생형 보다 흰가루병 방제활성이 증가한 것으로 확인되었다.
수율이 증가한 변이체는 회복(recovery) 방지를 통해 안정적으로 활성물질을 생산하는 것을 확인한 후 글리세롤(30%) 저장 용액(stock solution)을 사용하여 보관 균주를 만들어 -70℃로 보관하면서 이후 실험에 접종원으로 사용하였다.
배양여액 처리 전 발병율은 65%, 65%, 62% 이었으나, 변이체 T3, T6, T7의 배양여액 50배 희석액 2차 처리 후 발병율은 각각 3%, 0%, 3%로 흰가루 병반 면적이 현저히 줄어든 것이 확인되었으며 대조구 대비 95% 이상의 병 방제 활성을 나타내었다. 또한 재현성 확인을 위해 재배양한 후 배양여액 100배 희석액을 1회 살포 처리한 후 병 발생면적을 조사(처리구별 오이 유묘에 2회 반복 후 평균)한 결과 야생형의 발병율 25%와 미처리 대조군 발병율 75%에 비해 변이체 T3, T6, T7의 발병율은 각각 6.3%, 2.5%, 4.5%로 높은 흰가루병 방제 활성을 확인하였다(도 9a, 도 9b).
방제 활성이 가장 우수한 변이체 T6을 선발하였다. 변이체 T6 배양액을 HPLC를 이용해 정량분석한 결과 활성물질 833-M의 수율이 야생형보다 약 2배 증가한 것이 확인되었고 833-M 이외에 활성을 보이는 다른 물질의 함량도 2배 이상 증가한 것으로 확인되었다(도 10).
실시예 6: 배양조건 확립
(1) 탄소원, 질소원 선발
대량배양 시 생산단가 절감을 위한 배지 선발을 위해 일반적으로 가격이 저렴하고 구입이 용이한 글루코스를 탄소원으로 고정한 후 다양한 질소원을 사용하여 배양한 배양 상태 및 활성을 조사하였다. 균 배양 시 기본배지로 글루코스(1%), CaCO3(0.3%), FeSO4(0.02%)[100㎖/500㎖ 삼각플라스크]에 질소원을 각각 1%(v/v) 첨가하여 27℃, 160rpm, 7일간 배양하고 원심분리하여 균체를 제거한 후 사용하였고, 활성평가는 흰가루병이 잎 면적의 30~40% 정도 발병율을 보이는 오이 유묘에 상기 균체를 제거한 배양여액을 50배 희석하여 7일 간격으로 2회 분무 살포하고 최종처리 7일 후 달관조사를 통해 활성을 평가하였다(발병도 0: 0%, 1: 10~30%, 2: 30~50%, 3: 50~70%, 4: 70% 이상).
표 1은 질소원 종류에 따른 오이 흰가루병 방제 활성을 나타낸 것으로, 이를 참조하면 Bacto soytone, Soybean flour, Yeast ext.를 첨가한 경우 60% 이상의 오이 흰가루병 방제 활성을 보였으며, 특히 콩가루[Soybean flour(1%)] 첨가 시 95%의 높은 방제활성을 보여 질소원으로 최종 선발하였다.
* 기본배지: Glucose(1%), CaCO3(0.3%), FeSO4(0.02%)
* 배양여액 50배 희석, 7일 간격 2회 살포 처리 7일 후 활성평가
(2) 탄소원 및 질소원(C:N) 비율 조사
선발된 탄소원 글루코스와 질소원 콩가루의 배지 내 비율(이하, C/N 비율 또는 C:N 비율)을 달리하여 각 조성비별 배지에 균을 접종하고 27℃, 150rpm, 7일간 배양한 후 배양여액 50배 희석액을 2회 살포 처리한 후 병 방제 활성을 조사하였다. 그 결과 변이체 T6 균주는 C:N 비율 1:3, 2:3, 3:3, 4:2, 4:3 비율로 배양한 경우 흰가루병 방제 활성은 각각 83.3%, 94.5%, 93.9%, 96.6% 및 92.1%로 매우 우수한 병 방제 활성을 나타내었다(도 11a, 도 11b).
선발 C/N 비율의 경우 완전 배지인 M3에서 배양한 야생형 균주 배양액의 흰가루병 방제가 66.7% 보다 30% 이상 병 방제 활성이 증가하였다(도 11a). 또한 탄소원의 농도가 높을수록 세포 형태가 뚜렷하고 배양액 농도가 옅은 반면, 질소원인 콩가루(soybean flour) 농도가 높을수록 검갈색의 농도가 짙고 세포 용해(cell lysis)가 일어난 배양액을 생산하는 경향을 보였다. 따라서 변이체 T6 균주의 대량배양을 위한 선택배지로 C/N 4:2 배지를 선발하였다.
(3) 교반속도
선발된 탄소원과 질소원(4:2)을 기본배지로 하고 교반속도를 달리하여 배양한 결과, 교반속도를 150rpm에서 170rpm으로 증가시킨 경우 활성물질의 생산성이 향상된 것이 확인되었다. 교반속도 150rpm으로 배양한 경우 50배 희석액에서 70%의 활성을 보인 반면 170rpm으로 배양한 경우 100배 희석 시에도 95%의 흰가루병 방제효과를 보였다(도 12a, 도 12b).
본 발명에 따른 KRA17-833 균주 및 변이체인 KRA17-833T6 균주는 교반속도 증가에 따라 활성물질 생산성이 향상되는 경향을 보였으나 200rpm 초과의 교반속도로 배양 시 거품 발생이 심한 문제가 있는 경우 미량원소 및 거품 방지제(anti-form)을 사용할 수 있다.
지금까지 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주, 이의 배양물, 이를 포함한 흰가루병 방제용 조성물과 이의 제조방법, 이를 이용한 흰가루병 방제 방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP).
- 제1항에 있어서,
흰가루병(powdery mildew)에 대한 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주.
- 제2항에 있어서,
상기 흰가루병은 곡물류로서 보리 또는 밀; 채소류로서 오이, 딸기, 가지, 호박, 고추, 상추, 파프리카 또는 토마토; 과수류로서 참외, 수박, 사과, 포도 또는 배; 화훼류로서 장미 또는 거베라로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 발병한 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주.
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP)의 배양액.
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는,
흰가루병 방제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA17-833T6 균주 또는 이의 배양여액의 1 내지 100배 희석액을 포함하는 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물.
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP)를 배양하는 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 균주의 배양 배지의 탄소원:질소원 중량비가
1:3 내지 6:3 인 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 균주의 배양 배지의 탄소원은 글루코스이고, 질소원은 콩가루 인 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 균주를 교반속도 160 내지 200rpm에서 배양하는 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 균주를 25 내지 29 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 균주를 5일 내지 9일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제용 조성물의 제조방법.
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA17-833T6 균주(수탁번호: KCTC15066BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 흰가루병 방제용 조성물을 식물의 전부 또는 일부, 식물의 종자, 식물의 서식지 또는 흰가루병 균의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
흰가루병 방제 방법.
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