KR102495246B1

KR102495246B1 - 체지방 감소 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 bcc-lh-04 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102495246B1
Application number: KR1020220095780A
Authority: KR
Inventors: 김석진; 신금주; 이종서; 이동완; 정의천; 임혜지; 이나래; 권태준
Original assignee: (주)헥토헬스케어
Priority date: 2022-08-02
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2023-02-14
Anticipated expiration: 2042-08-02
Also published as: WO2024029670A1

Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 속 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 체지방 감소 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 신규 락토바실러스 헬베티쿠스 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 체지방 감소 활성을 갖는 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.

Description

체지방 감소 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 및 이를 포함하는 조성물 {Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 having body fat-reducing activity and compositions comprising the same}

비만은 에너지 섭취와 소비가 균형을 이루지 못하여 과잉의 에너지가 지방으로 축적되어 체지방이 비정상적으로 많아지고, 다양한 대사 이상이 유발되는 상태를 의미하며, 과도하게 축적된 체지방으로 인한 비만은 당뇨병, 심혈관계 질환과 특정 암의 발병위험을 증가시키는 주요 원인이다.

이러한 비만을 야기시키는 주요 원인으로서는 과도한 칼로리의 섭취로 인한 지방의 축적이며, 이 과정에서 다양한 기전을 통해 지방세포가 증가하게 된다. 먼저 체 내 섭취 된 지방은 리파아제(lipase)라는 효소에 의해 분해 되어 흡수 되고, 또한 과 섭취 된 탄수화물은 당으로 분해되어 혈당을 높이거나 지방세포로의 분화를 촉진 시켜 지방세포 생성을 유도한다. 이러한 과정에서 지방이 축적되면 비만이 발생하게 된다.

체지방 감소 기전으로는 크게 두 가지로 나눌 수 있으며, lipase 등 효소의 작용을 억제하여 지방 소화흡수를 억제하는 방법과 지방세포의 합성을 직접적으로 억제하는 체지방 합성 억제 기전이 있다. 따라서 생체 내 지방을 생성하는 세포에 대한 연구로 지방전구세포인 3T3L-1이 in vitro 상에서 연구되고 있다(Applied Biological Chemistry volume 63, Article number: 9 (2020)).

비만으로부터 야기되는 다양한 합병증이 증가하면서 국내뿐만 아니라 전 세계 적으로 위에서 언급한 비만 발생의 과정을 억제하는 치료제에 대한 연구가 증가하고 있으나, 그 효과가 미미하며 부작용이 큰 실정이다. 대부분 식욕을 억제하는 약물들이 다수 존재하며 이는 간 손상, 호르몬의 변화 등을 나타내며 약제 복용 중단 시 체중의 재 증가 발생하는 경우가 많기 때문에 장기간 복용하는 경우도 발생한다. 투여 기간이 길어지고 투여 증례가 많아지는 만큼 문제가 발생할 확률도 높아지므로 발생 빈도가 적은 부작용이라도 심각한 부작용들은 간과할 수 없기때문에, 이러한 약물을 대체할 수 있는 무해한 자연 친화성이 높은 소재의 개발이 요구되고 있다.

체지방 감소 효과 소재의 후보군들 중 프로바이오틱스가 다수 연구 되고 있으며, 프로바이오틱스는 고지방 음식을 섭취하는 쥐들의 체중 증가를 예방하는데 도움을 주며 지방의 감소 및 비만관련 생화학적 지표를 유의하게 감소시킨다는 연구결과가 보고되었다. 따라서 지방 흡수의 억제 및 세포의 분화 억제에 효능을 갖는 안전하고 효과적인 프로바이오틱스 균주에 대한 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 신규 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주 또는 이의 배양물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 체지방 감소 효과 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 체지방 감소 효과 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 상기 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04인 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물은 지방산 (fatty acid) 농도 감소와 리파아제(Lipase) 효소 억제 활성을 통해 지방 세포 분화 및 세포 내 지방 축적을 억제하여, 우수한 체지방 감소 효과를 갖는다.

또한, 소장세포 또는 소화관에서 지방 분화 억제 효과로 인해, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.

더욱이, 체중 증가량의 감소 및 체지방량의 감소로 시킴으로써, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.

도 1은 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 균주의 지방산 (fatty acid) 흡수능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04 균주의 sucrose agar에서 EPS 생성능을 확인한 mucoid colony 사진이다.
도 5는 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 리파아제(Lipase) 억제 활성 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 신규 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04의 전지방분화세포인 3T3-L1에서 지방세포 분화억제능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 9주간 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04을 마우스에 경구투여 후 체중 증가율 감소를 나타낸 그래프이다.
도 8은 9주간 Lactobacillus helveticus BCC-LH-04을 마우스에 경구투여 및 부검 후 피하지방 및 복부지방(장간막지방 및 부고환지방) 감소를 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서 다음의 신규 균주 또는 이의 배양물을 제공한다 : 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물.

본 발명에 따른 균주는 각각 한국생명공학연구원에 2021. 12. 06.로 수탁하였다. 수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스 균주는 BCC-LH-04 로 기재되어 있다.

수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함한다.

[서열번호 1]

상기 BCC-LH-04 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 용혈성 및 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 BCC-LH-04 균주는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다:

지방산(FA) 농도 감소;

세포외다당류(EPS) 생성;

리파아제(lipase) 효소 억제 활성; 및

지방전구세포 분화 억제 활성.

구체적으로, 상기 BCC-LH-04 균주는 지방산 농도 감소, 세포외다당류 생성, 리파아제 효소 억제 활성 또는 지방전구세포의 분화 활성 억제에 의해 체지방 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. "치료 또는 개선"은 비만 또는 비만 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 비만 관련 질환은 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 개체에 투여되는 경우 체중 증가율 감소 또는 피하지방 및 복부지방(부고환지방, 신장주위지방)을 감소시킬 수 있다.

상기 조성물은 소장세포 또는 소화관에서 지방 성분 흡수 억제, 탄수화물 흡수 저해 및/또는 지방 분화 억제 효과를 가질 수 있다. 상기 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 오염물질에 의해 유발되는 질환의 치료제 또는 피부 노화 개선을 위한 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

건강기능식품은 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하고, 건강기능식품은 비만의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 낙농제품, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.

이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.

의약외품은 비만의 예방 또는 개선 목적으로 사용되는 제제로, 인간 또는 동물의 구조 또는 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 제제 이외의 제제를 의한다.

의약외품으로 사용하는 경우 상기 BCC-LH-04 균주 또는 이의 배양물을 사용하거나, 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 분리

프로바이오틱스 신규 균주를 선발하기 위해 원유(raw milk)을 시료로 사용하였다. 시료 1 mL을 멸균 식염수에 10배 연속 희석한 후 희석액 0.1 mL를 MRS 고체배지에 도말하여 혐기조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 MRS 액체배지에 37℃, 18시간 동안 순수 배양하였다.

실시예 2. 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 당 이용성

선별된 균주의 당 이용성을 분석하기 위해 API 50 CH kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 확인하였다. MRS 고체배지에서 배양된 균주의 콜로니를 2 MacFarland의 탁도로 조절하여 현탁액을 제조하였다. 탁도를 맞춘 API 50 CHL medium을 API 50CH 스트립 튜브에 120 μL씩 분주하고 큐플에 미네랄 오일(mineral oil)을 2 방울씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 및 48 시간 동안 배양하여 당 이용 패턴을 확인하였다. 동정 결과는 API web 프로그램(https://apiweb.biomerieux.com)을 사용하여 확인하였다.

동정 결과, 표 1에 표시된 바와 같이 락토바실러스 엑시도필루스 3 63.2%를 나타내었다.

표 1.

실시예 3. 균주의 동정: 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석

균주의 동정을 위해 Solgent(Daejeon, Korea)에 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 의뢰하였다. 균주의 순수 배양액 1 mL에서 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 주형으로 16S rRNA 영역을 27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) primer로 PCR을 수행하여 DNA sequencing (Solgent)을 진행하였다. 염기서열 분석 결과를 토대로 NCBI의 BLAST 상의 Genebank 데이터베이스에 등록된 다른 표준균주와 상동성을 비교하였다.

염기서열 분석 결과 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지며(도 1), 본 발명자들은 위 유산균을 BCC-LH-04로 명하였고, 이 유산균은 Lactobacillus helveticus NBRC 15019^T 와 99.7%의 상동성을 나타내었다. Mega 7 program을 이용하여 상동성을 분석하고 계통도를 얻었다(도 2). 이에 본 발명자는 상기 균주를 신규한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주로 동정하였고, Lactobacillus helveticus BCC-LH-04으로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 12월 06일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 14810BP). 또한, 상기 균주 염기서열은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) GenBank 에 등록하여 accession No. OL988623(BCC-LH-04)을 받았다.

실시예 4. 신규 미생물의 생리 활성 및 안전성 확인

1) 내산성 및 내담즙성 측정

인공 위액에서의 내산성 실험 및 인공담즙에서의 내담즙 실험은 개별적으로 처리 되었다. 인공위액은 HCL로 pH를 2.5로 조절한 MRS 액체배지에 펩신을 250 unit/mL가 되도록 첨가한 다음 멸균하여 제조하였다.

구체적으로 실험은 위에서 분리하여 선별한 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 내산성 및 내담즙성을 시험하기 위하여 MRS 액체배지에 접종하여 2회 이상 계대배양을 통해 활성을 확인하였다. 배양은 37℃의 혐기적인 조건에서 24시간 동안 진행되었으며 3600 rpm에서 15분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 회수 후 멸균 식염수 (0.85% NaCl)로 2회 세척한 후 상등액을 제거 한 뒤, pH가 2.5로 조절된 인공위액을 상등액과 동량으로 첨가한 뒤 혼합하여 균체가 인공위액에 잘 섞이도록 하였다. 혼합 후 37℃의 혐기적인 조건에서 배양하면서 0시간 및 2시간 후에 생존 균수를 측정하였다.

내산성 실험과 동일하게 배양 후 수거된 균체에 상등액과 동량의 0.3% oxgall이 첨가된 인공담즙액을 혼합하여 균체가 인공담즙액에 잘 섞이도록 하였다. 혼합 후 37℃ 혐기적인 조건에서 5시간동안 배양한 뒤 생존 균수를 측정하였다.

총균수는 배양액에서 1 mL을 취하여 10진 희석법을 통해 MRS 평판배지에 도말한 다음 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니의 수를 계수하여 생존 생균 수를 측정하였다.

내산성 및 내담즙성 확인 결과(표 2) 무처리 군에 비하여 각각 47.1% 및 20.8%의 높은 생존율을 보여서 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주는 우수한 내산성 및 내담즙성을 동시에 갖는 것으로 확인되었다.

표 2.

2) 용혈성 테스트(hemolysis test)

용혈성 테스트는 유산균이 인체 내에서 용혈성 독성이 없음을 확인하기 위한 것으로, 적혈구의 파괴 또는 분해되는 현상인 용혈성 여부를 검사하였다. Baumgartner 등의 방법에 의해서, 시험 균주를 Columbia blood agar에서 성장시키고 혐기성 조건 하에서 37℃에서 48시간 동안 배양 하였다. 균체 주위에 투명 환의 생성여부로 용혈성을 판단하였다. 본 발명의 균주의 용혈성 여부를 검사한 결과, 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04균주는 α-hemolysis(적혈구 헤모글로빈의 methemoglobin을 감소시켜서 녹색 colony을 형성함)로 혈액에 대해서 용혈성이 없이 인체에 무해한 것으로 확인되었다.

3) 항생제 내성 시험

원유(raw milk)에서 분리된 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 에 대한 항생제 내성 여부를 확인하기 위해 E-TEST을 이용한 MIC를 확인하였다. 자세히, 시험 균주는 MRS broth에 배양한 후 0.5~1.0 McFarland (1.5~3X10⁸ CFU/mL) 농도로 희석 후 준비하였다. 균주 적정 한천배지(1.8%) 멸균 후, 실온에서 고형화하고 멸균된 면봉을 균주가 담긴 액체배지에 적신 후 꺼내서 한천배지에 lawn이 형성되도록 streaking을 한다. 접종한 균주가 한천배지에 잘 스며들도록 혐기조건에서 10~20분간 상온 방치 한다. 시험하고자 하는 항생제 strip을 한천배지 위에 적절한 거리를 유지하여 위치 시키고 37°C에서 48시간 혐기배양 하였다. 결과 판독은 균이 자라지 않는 strip 부위의 가장 밑 부분을 MIC로 확정하였다. 확인한 항생제는 암피실린(AM), 클린다마이신(CM), 클로람페니콜(CL), 에리트로마이신(EM), 스트렙토마이신(SM), 테트라사이클린(TC), 반코마이신(VA), 카나마이신(KM) 및 젠타마이신(GM)과 같은 9가지 이며, EFSA(European Food Safety Authority) 기준 cut-off 기준과 비교하여 수치가 미달일 경우 내성이 없음을 판정 하였다.

선발된 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04 균주의 항생제 내성 양상을 조사한 결과, 표 3 에서 나타낸 바와 같이 테스트된 9가지(AM, CM, CL, EM, SM, TC, VA, KM) 모든 항생제에 대해 EFSA 기준으로 내성이 없음을 보였고, 다른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주들과 유사한 결과를 나타내어서 인체에 적용 가능함을 확인하였다.

표 3.

실시예 5. 선발유산균의 사균 및 동결건조 분말 제조

선발 유산균의 in vitro 실험 수행을 위해, 유산균을 MRS 배지에 18 시간 배양한 뒤, 3600 rpm에서 15분 이상 원심분리하여 균체를 획득하여 상등액 제거 후 배양액 동량의 1xPBS로 1회 세척하였다. 세척한 균체에 배양 시 배지 용량의 1/10에 해당하는1xPBS를 첨가하여 농축한 뒤, 121°C에서 15분간 고압 멸균기를 이용하여 간접 멸균하였다.

멸균된 유산균 사균체는 -80°C의 초저온냉동고에서 24시간 냉동을 거친 뒤, 동결건조기로 48시간 동안 동결건조 하였다. 동결건조 된 분말은 수거하여 냉장 보관하며 실험 시 사용하였다.

실시예 6. 균주에 의한 지방산(FA) 흡수능 in vitro 평가 및 Exopolysaccharide 생성능 확인

시료내에 존재하는 지방산이 CoA 유도체로 전환되고, 산화되면서 probe에 발색을 유도하는 중간물질(H₂O₂)를 생성하는 원리를 이용하여 흡광도(OD 570nm)로 쉽게 측정할 수 있다.

배지 내 지방산을 감소시키는 균주가 체내에 흡수 되었을 때, 소장 내용액(gut fluid content) 에 녹아 있는 지방산(fatty acid, FA) 농도를 감소시켜서 체내로 흡수되는 지방산의 양을 줄여서 지방 생성을 저해할 수 있는 원리를 바탕으로 BCC-LH-04 균주의 지방산 흡수능을 확인 하였다.

장 환경으로부터 분리 보존된 균주들을 MRS agar 혹은 MRS(+0.05% cysteine) agar에 접종한 후 anaerobic chamber(WHITLEY A35 Workstation, Labconsult)에서 37°C 혐기배양 하였다. 48시간 배양한 후 single colony를 1mL MRS 혹은 MRS(+0.05% cysteine) broth에 접종(E-tube 사용)하여 37°C 에서 18~20h 동안 혐기배양 하였다. 0.5%(w/v) Brij58 및 0.25mM sodium palmitate이 들어있는 MRS broth 900μL 가 담긴 E-tube에 상기 배양된 균주 배양액 100μL 접종하여 37°C 에서 24h 동안 혐기배양 하였다. 배양액은 원심분리(13,000 rpm, 1 min, 4°C) 후 상등액을 회수하여 상등액 10μL에 남아있는 잔여 지방산(FA)농도를 측정하였다. 상등액의 지방산 양은 EnzyChrom™ Free Fatty Acid Assay Kit (Bio-Assay Systems, USA)를 이용하여 570nm의 흡광도를 측정하고 계산하였다. 표준물질의 정량곡선으로 균주 배양액 안의 지방산 양을 계산하고 접종하지 않은 대조군(negative control, NC) 대비하여 균주의 지방산 농도 감소능을 계산하고, 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, BCC-LH-04 균주는 접종되지 않은 대조구에 대비하여 유의하게 높은 56.1% 지방산 흡수능을 보였다. 이는 함께 시험된 같은 종의 다른 균주중에서 가장 우수하였고 상용화된 체지방 감소 기능성 균주인 Lactobacillus 복합물 (LCP)의 52.9% 지방산 흡수능 보다도 높은 결과를 나타내었다.

Exopolysaccharide(EPS)는 미생물이 대사 시 분비하여 축적되는 다당류로, 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로서 존재하는 1차 또는 2차 대사 산물이다. 유산균이 생성하는 EPS는 발효유제품에서 천연 안정제로 효능이 입증되었고, 최근에는 다양한 생리적인 기능성 소재로 연구되어왔다. 대표적으로 면역 관련 기능성이 보고 되었고 이 외에도 체지방 감소 및 콜레스테롤 저하 등의 효능도 보고되고있다. 유산균이 당을 섭취하여 EPS를 생성하면 체내에 잘 흡수 되지 않는 다당류로 변환되어 배출됨으로 기존 당과 경쟁적으로 작용될 수 있으며, 이는 칼로리 흡수를 저하시키는 긍정적인 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서 지방산이 우수한 균주들의 EPS 생성능 검증을 통해 추가적인 체지방 감소 관련 기능성을 확인하였다. EPS 생성능 확인을 위해 sucrose agar 1% trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% dipotassium phosphate, 0.5% diammonium citrate, 5% sucrose, 15% agar, pH 7.0)에 선발 균주들을 스트리킹 도말하여 37°C, 혐기 조건에서 48시간 배양한 뒤 콜로니의 점성 여부를 확인하였으며, 또한 sucrose broth에 배양하여 crude EPS 생성량을 확인 하였다. 도 4와 같이 BCC-LH-04 균주는 점성을 띠는 mucoid colony를 생성하였고, crude EPS는 0.95±0.09 g/L 정도 생산하였다.

실시예 7. 리파아제(Lipase) 효소 억제 활성

췌장 리파아제는 트리글리세라이드를 2-모노아실글리세롤(2- 과 지방산으로 분해하는 지방분해효소로, 섭취된 지방을 50% 내지 70% 정도 분해하는 효소이다. 리파아제 활성이 증가하게 되면 체내 섭취되는 지방을 더욱 흡수하여 체내 지방세포의 축적을 증가시킨다. 이러한 췌장 리파아제의 활성을 억제하면 음식물로부터 흡수된 지방의 분해가 감소하게 되며, 체내 지방 흡수가 감소하게 되어 결과적으로 칼로리 섭취량을 감소시켜 몸무게를 줄여주는 다이어트 효과가 있다.

리파아제 억제능은 Lipid(tryclyceride)에 리파아제를 처리한 혼합물에 선발 균주 일정 시간 반응 후 최종적으로 분해되어 나오는 지방산(FA, fatty acid) 농도를 측정하여, 균주 처리 시 리파아제 활성을 얼마나 억제하는지를 평가하였다.

구체적인 시험방법은 다음과 같다. Triolein(80mg), Lecithin(10mg) 및 Taurocholic acid(5mg)을 9 mL의 TES buffer(0.1M TES, 0.1M NaCl, pH7.0, Biosaesang, South Korea)에 첨가하여 lipid solution을 제조하고 10unit/mL로 희석된 Pancreatic Lipase(500unit/mg) 용액을 준비한다. 100μL의 열처리 사균체 용액과 lipid solution 100uL 및 50uL의 Lipase 용액(10unit)을 혼합하여 37℃의 heat-block에 30분간 반응시킨다. 반응 후 분해된 지방산(FA)의 측정은 FFA Assay kit을 이용하여 측정하였다. 선발된 4균주들의 리파아제 억제 활성은 균주가 처리되지 않은 혼합물(대조군)에서 유리된 지방산(FA)의 양과 비교하였다(도 5).

BCC-LH-04 균주가 34.3%로 우수한 리파아제 활성 억제능을 보였으며, LF-01균주는 리파아제 활성 억제능을 보이지 않았다. 체지방 감소 효능을 지닌 유산균으로 알려진 LG균주의 억제능과 비교하였을 때, 유의하게 더 높은 수치인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 지방전구세포 분화 억제 활성

1) 3T3-L1 지방세포 분화 유도

미국표준균주은행(ATCC, American Type Culture Collection)에서 구입한 생쥐 유래 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)인 3T3-L1 cell을 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum, Gibco, USA)이 포함된 DMEM(ATCC, USA)배지를 이용하여 5% CO₂ incubator, 37°C 조건에서 배양하였다.

3T3-L1 mouse embryonic fibroblast를 지방 세포로 분화시키는 과정은 다음과 같다. 3T3-L1 세포가 100% confluence를 나타내는 시점(day 0)으로부터 2일 후(day 2)에 120% confluence의 세포를 사용한다. 배양된 3T3-L1 세포의 기존 배지를 제거한 후, 10% FBS, 1% P/S, 1μg/mL insulin(Sigma, USA), 0.5mM 3-isobutyl-1-methlxanthine(IBMX, Sigma, USA) 및 1μM dexamethasone(Sigma, USA)이 포함된 DMEM(분화 배지, MDI)로 배양한다. 분화 배지 처리 2일 후 (day 4)에 10% FBS와 1μg/mL insulin이 포함된 DMEM(인슐린 배지)로 교환하여 배양하였다. 이로부터 2일 후 (day 6)에 10% FBS만 포함된 기존 DMEM 배지(안정화 배지)로 교환하여 배양하였다. 안정화 배지 교체 4일 후(day 10) 3T3-L1 세포의 90% 이상이 지방세포로 분화되어 지방구를 형성하면 완전히 분화되었다고 본다.

2) 3T3-L1 지방세포 내 지방축적 억제능 평가

배양한 3T3-L1 지방세포에 분화 배지를 첨가하는 시점(day 0)에 각각의 시험 균주 열처리/동결건조 분말을 1 mg/mL(0.1%)로 함께 첨가하였다. 분화 배지 처리 2일 뒤 균주 및 분화 배지를 제거 한 후, 위에서 설명 한 분화 유도 방법으로 인슐린 배지 및 안정화 배지 교체의 과정을 거쳐 총 10일간 분화 시킨다.

분화 완료 후 지방구가 생성된 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte) 배양액을 1xPBS로 2번 세척하여 배양액을 제거하고, 10% 포르말린(Biosesang, South Korea)으로 30분 동안 첨가하여 세포를 고정시켰다. 포르말린 제거 후, 60% isopropanol을 처리하여 5분간 세포를 추가 고정한다. Isopropanol을 제거 한 뒤, 0.5% Oil-Red O(Sigma, USA)와 DW가 3:2 비율로 희석된 염색 시약을 고정된 세포에 처리하여 20분 동안 염색시켰다. 염색 시약을 제거한 뒤, 1xPBS 로 2회 세척하여 염색된 지방구를 현미경으로 관찰하였다.

분화도의 측정은 Isopropanol 100%(Duksan, South Korea)를 염색된 세포에 처리하여 염색 시약을 유리시킨 뒤, Microplate reader를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과(도 6) 지방세포 분화 정도를 나타낸 도면이다. 도 6에 나 타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 BCC-LH-04 사균체를 처리한 군이 72.4%로 높은 지방세포 분화 억제능을 보였으며, 상용화 된 체지 기능성 균주인 Lactobacillus 복합물(LCP) 보다도 더 우수한 억제능을 보였다.

실시예 9. 실험동물에서의 체지방 감소 효과 실험

마우스에서의 체지방 감소 효과를 확인하기 위하여, 5주령 C57BL/6J(Charles River Japan) 마우스를 1주간 순치 후, 3그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 제1군은 보통식이(ND)를 투여한 군, 제2군은 고지방식이 (HFD, 60 Kcal% fat diet, D12492)를 투여한 군, 제3군은 고지방식이(HFD)와 함께 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04(10⁹ CFU/mouse)을 투여한 군으로, 주 5회 경구투여 하였다. 매주 2회 체중(body weight)과 식이 섭취량(food intake)을 확인하고 9주 투여 후에 부검하여 지방 조직의 무게 및 크기를 측정하였다.

1) 마우스 체중 증가율의 감소

0주차 체중을 100%로 하여 시간에 다른 체중 증가율을 측정하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 제3군(HFD+BCC-LH-04)은 제2군(HFD)과 비교하여, 1주 후부터 0 주차 체중을 100%로 하여 시간에 따른 체중 증가율을 측정하여 도 6에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 제3군(HFD+BCC-LH-04)은 제2군(HFD)과 비교하여, 1주 후부터 체중 증가율에 차이를 나타내었다. 9주차에서 제3군의 체중 증가율이 165.94%이고, 제2군의 증가율은 176.51%로, 제3군은 제2군보다 체중 증가율이 10.6% 감소하였다. 하기 표 4에서 보는 바와 같이, 제3군의 9주간 체중 증가량은 15.35이고, 제2군의 9주간 체중 증가량은 17.98로, 약 15%의 차이를 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 고지방식이를 한 제2군과 고지방식이를 하면서 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04을 동시 투여한 제3군을 비교한 결과, 1주 후부터 체증 증가율에 차이를 나타내기 시작하면서 시간이 갈수록 체중 증가율이 차이가 현저히 커지는 것을 알 수 있다.

표 4.

2) 피하지방, 장간막지방 및 부고환지방의 감소

9주간 투여 및 부검 후에 피하지방, 장간막지방 및 부고환지방의 양을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.

표 5.

상기 표 5 및 도 8에서 보는 바와 같이, 제3군의 체지방은 제2군의 체지방의 양과 비교하여 피하지방은 37.2%, 장간막지방은 30.0%, 부고환지방은 20.6% 감소한 것을 확인하였다. 따라서, 락토바실러스 헬베티쿠스 BCC-LH-04이 마우스 체지방 감소 개선에 있어 현저한 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC 14810BP(BCC-LH-04)

수탁일자 : 2021. 12. 06.

Claims

수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주를 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 서열을 포함하는 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 용혈성 및 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
지방산(FA) 농도 감소;
세포외다당류(EPS) 생성;
리파아제(lipase) 효소 억제 활성; 및
지방전구세포 분화 억제 활성.
제4항에 있어서, 지방산 농도 감소, 세포외다당류 생성, 리파아제 효소 억제 활성 또는 지방전구세포의 분화 활성 억제에 의해 체지방 감소 효과를 나타내는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 개체에 투여되는 경우 체중 증가율 감소, 또는 피하지방 및 복부지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 서열을 포함하는 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 용혈성 및 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물:
지방산(FA) 농도 감소;
세포외다당류(EPS) 생성;
리파아제(lipase) 효소 억제 활성; 및
지방전구세포 분화 억제 활성.
제7항에 있어서, 지방산 농도 감소, 세포외다당류 생성, 리파아제 효소 억제 활성 또는 지방전구세포의 분화 활성 억제에 의해 체지방 감소 효과를 나타내는 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 개체에 투여되는 경우 체중 증가율 감소, 또는 피하지방 및 복부지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
수탁번호 KCTC 14810BP의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) BCC-LH-04 균주를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
제13항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 서열을 포함하는 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 의약외품 조성물.
제13항에 있어서, 상기 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 용혈성 및 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 하는 의약외품 조성물.
제13항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 의약외품 조성물:
지방산(FA) 농도 감소;
세포외다당류(EPS) 생성;
리파아제(lipase) 효소 억제 활성; 및
지방전구세포 분화 억제 활성.
제13항에 있어서, 지방산 농도 감소, 세포외다당류 생성, 리파아제 효소 억제 활성 또는 지방전구세포의 분화 활성 억제에 의해 체지방 감소 효과를 나타내는 의약외품 조성물.
제13항에 있어서, 개체에 투여되는 경우 체중 증가율 감소, 또는 피하지방 및 복부지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 의약외품 조성물.