[go: up one dir, main page]

KR102470985B1 - 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트 - Google Patents

브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트 Download PDF

Info

Publication number
KR102470985B1
KR102470985B1 KR1020200187436A KR20200187436A KR102470985B1 KR 102470985 B1 KR102470985 B1 KR 102470985B1 KR 1020200187436 A KR1020200187436 A KR 1020200187436A KR 20200187436 A KR20200187436 A KR 20200187436A KR 102470985 B1 KR102470985 B1 KR 102470985B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
brucella
gene
abortus
suis
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020200187436A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220095679A (ko
Inventor
이진주
허문
염은지
성소라
윤순식
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020200187436A priority Critical patent/KR102470985B1/ko
Publication of KR20220095679A publication Critical patent/KR20220095679A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102470985B1 publication Critical patent/KR102470985B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 속(genus), 종(species) 및 생물형(biovar)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라균의 동정 및 감염병 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트{Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella and primer set for detection}
본 발명은 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
브루셀라병은 브루셀라균(Brucella)에 의해 소, 돼지, 산양, 면양, 개 등 대부분의 동물에 감염되어 유산, 불임 등 주로 생식기 장애를 일으키는 전염병으로 전세계적으로 발생하면서 축산업에 막대한 경제적 손실을 초래한다. 이 질병은 사람에게도 감염되는 인수공통 전염병으로 주로 축주, 수의사, 도축장 종사자 등 가축과 관련된 직업 종사자들에게 많이 발생하는 직업병으로 알려져 있으며, 주기적인 발열, 두통, 식욕부진 등 감기와 같은 증상을 보이다가 만성으로 지속될수록 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 되며 1-3% 미만의 치사율을 보이고 있다. 현재 국내에서도 동물뿐만 아니라 사람에서도 브루셀라병이 발생하고 있으며 감염된 동물으로부터 사람으로 브루셀라균의 전파되는 것을 막기 위한 대책이 시급한 실정이다. 감염된 동물은 뚜렷한 증상없이 균을 장기간 보균하면서 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하면서 주변환경을 오염시킨다. 브루셀라병 치료를 위해서는 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 때문에 치료방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다.
브루셀라균(Brucella)은 숙주특이성, 배양성, 생물·생화학적, 혈청학적 성상 차이에 따라 B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B. ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats), B. pinnipedialis (common seal), B. ceti (common dolphin), B. microti (soil), B. inopinata (human) 등 10종과 함께 2014년 개코원숭이(baboon)에서 분리된 B. papionis와 2016년 빨간여우(redfox)에서 분리된 B. velpis가 새롭게 추가되어 현재까지 총 12종이 알려져 있다. 이들 중 사람에게 감염되어 병원성을 일으키는 균종은 B. melitensis, B. suis, B. abortus, B.canis이며, 국내에서는 B. abortus와 B. canis만 분리 보고되고 있다. 브루셀라균의 분류는 생물학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 집락의 형태, oxidase 및 urease에 대한 반응성, phages에 대한 용해능에 따라 종(species)을 구분하고 더 나아가 CO2 요구도, H2S 산생능, 색소(thionin, basic fuchsin)에서의 배양성, 특이혈청과의 응집 여부에 따라 생물형(biovar)을 구분하고 있어 최종 야외에서 분리된 브루셀라균에 대하여 생물형까지 동정하기 위해서는 많은 시간이 소요되며 각 시험결과를 판독하기 위해서는 숙련된 전문가가 필요하며 살아 있는 균을 다루기 때문에 매우 위험하다. 최근 이와 같은 한계점을 극복하기 위해 유전자를 이용한 분자생물학적 기법으로 균을 보다 쉽게 감별 및 동정하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라균은 유전학적 상동성(DNA homology)이 매우 높기 때문에 이들을 감별하는 연구가 90년대 중반부터 계속되었으며, 그 결과 AMOS PCR법, Bruce-ladder PCR법, differential multiplex PCR법 등이 개발되어 많은 브루셀라균을 감별동정할 수 있었다. 특히, 2012년에 개발된 differential multiplex PCR법은 10종의 브루셀라균에 대하여 단일튜브 내 동시에 감별할 수 있는 유전자 진단법이다. 그러나 이들은 균종 감별은 가능하지만 생물·생화학적 특성분석은 할 수 없기 때문에 이러한 특성 분석도 동시에 할 수 있는 진단법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 브루셀라균 유전체를 분석하여 속(genus), 종(species) 및 생물형(biovar)을 감별하기 위한 특이 단일염기다형성을 확인하고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라균 감별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라균 감별용 키트 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1 내지 40의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라균 감별용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 감별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라균 감별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라균 감별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 브루셀라균 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라균 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 브루셀라균 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라균 감별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 40의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라균 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라균 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라균 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 속(genus), 종(species) 및 생물형(biovar)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라균의 동정 및 감염병 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 브루셀라균의 감별 부위 서열 및 다른 유사세균과의 sequence identity를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 omp25 유전자에서 B. canis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 BCAN_B0021 유전자에서 B. canis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 entE 유전자에서 B. suis bv. 1~4, B. ceti 및 B. pinnipedialis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 DM38_RS01620 유전자에서 B. suis bv. 5에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 aroA 유전자에서 B. ovis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 glk 유전자에서 B. ovis 및 B. melitensis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 clpX 유전자에서 B. abortus S19에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 BAb-S19 유전자에서 B. abortus S19에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 BAB1 유전자에서 B. abortus RB51 및 B. neotomae에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 rpsL 유전자에서 B. melitensis Rev1, B. abortus bv1, 2 및 4에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 glk2 유전자에서 B. abortus bv.1, 2, 4 및 B. suis bv.2에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 rplV 유전자에서 B. abortus bv.7에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 pyrH 유전자에서 B. suis bv.1에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 ssrA 유전자에서 B. suis bv.2 및 B. melitensis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 rpoB 유전자에서 B. suis bv.3에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 ABC transporter 유전자에서 B. suis bv.3, 4 및 B. canis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 DM38_RS00005 유전자에서 B. suis bv.5 및 B. microti에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 fbaA 유전자에서 B. abortus에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 gap 유전자에서 B. melitensis에 대한 특이 SNP를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 21는 본 발명에 따른 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용하여, 브루셀라 표준균주 및 백신균주를 감별한 결과를 나타낸 도이다.
도 22은 본 발명에 따른 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용하여 브루셀라 분리 균주를 감별한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 본 발명에 따른 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라균 감별용 조성물을 제공한다.
상기 브루셀라균 감별용 조성물은 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이다:
브루셀라균 1번 염색체(accession No. NC_007618, NC_010103, NC_022905, NC_003317, NC_013119, NC_009505, NC_015857, NC_004310)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체(accession No. NC_007624, NC_010104, NC_022906, NC_003318, NC_013118, NC_009504, NC_015858, NC_004311)의 360501번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 687211번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 17391번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 320931번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 12938번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 78863번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 78790번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 18902번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 30610번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 1036311번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 1036332번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 265232번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1099314번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 63304번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 958730번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 783223번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 265717번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 983736번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1139687번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1139688번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 633668번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1354542번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1214190번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 488222번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 28351번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 28315번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라균 2번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드.
본 발명에 있어서, 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.
본 발명에 있어서, 다형성(polymorphism)은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에 있어서, 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 마커(marker)는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 브루셀라균은 Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella neotomae, Brucella microti, Brucella ceti 및 Brucella pinnipedialis로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 감별은 유전학적·생물학적 성질의 차이를 이용하여 특정한 세균을 가려내는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 감별은 속(genus), 종(species) 또는 생물형(biovar)을 감별하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 생물형(biovar)은 한 생물종에 속한 개체들의 다양한 생물학적 특징을 기준으로 구분한 단위로, 종(Species) 이하의 수준에서 개체들을 구분하는데 유용하게 활용된다. 생물형은 생화학적 또는 생리학적 특성을 기준으로 구분된다. 동일한 생물형에 속하는 개체들은 일반적으로 같은 종으로 구분되나, 서로 다른 종에 속하는 개체들도 생물형을 구분하는 기준에 따라 같은 생물형에 속하는 경우도 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 브루셀라균 감별용 조성물을 이용하여 도 21과 같이 감별할 수 있다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커는 브루셀라균의 속(genus), 종(species) 및 생물형(biovar)을 감별할 수 있는바, 브루셀라균의 동정 및 감염병 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라균 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라균 감별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라균 감별용 키트는 단일염기다형성 마커를 검출하여 브루셀라균의 종, 속 및 생물형을 감별할 수 있다. 상기 키트에는 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 프로브 등을 포함할 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA) 키트인 것이 바람직하나, 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 분석법이라면 제한없이 적용 가능하다.
본 발명에 있어서, 다좌위 염기 분석은 필수 유전자들의 서열을 연결한 후 연결된 염기서열을 바탕으로 계통학적 분석을 수행하는 방법으로, 분석하고자 하는 종의 분절유전자(segmentation gene)의 염기서열 증폭으로 계통분석을 수행하므로 종에 대한 보다 광범위한 정보를 제공한다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라균 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라균 감별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어서, 마이크로어레이는 유전자 칩(gene chip)이라고도 불리며, 유전자, DNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 일정한 패턴으로 고정시킨 작은 고형물을 의미한다.
본 발명의 브루셀라균 감별용 마이크로어레이는 상기 브루셀라균 조성물, 즉, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는바, 브루셀라균의 감별 및 감염병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 40의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라균 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라균 감별용 키트를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 브루셀리균 감별용 키트는 PCR을 수행하기 위한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 필수 요소는 단일염기다형성 마커에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라균 감별 방법을 제공한다.
상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다:
브루셀라균 1번 염색체(accession No. NC_007618, NC_010103, NC_022905, NC_003317, NC_013119, NC_009505, NC_015857, NC_004310)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체(accession No. NC_007624, NC_010104, NC_022906, NC_003318, NC_013118, NC_009504, NC_015858, NC_004311)의 360501번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 687211번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 17391번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 320931번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 12938번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 78863번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 78790번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 18902번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 30610번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 1036311번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 1036332번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 265232번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1099314번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 63304번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 958730번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 783223번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 265717번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 983736번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1139687번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1139688번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 633668번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1354542번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 1번 염색체의 1214190번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 488222번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 28351번째 뉴클레오티드;
브루셀라균 2번 염색체의 28315번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라균 2번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드.
본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계는 서열번호 1 내지 40의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라균 감별용 프라이머 세트를 이용하여, (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 (c) 단계는 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 브루셀라균 속(genus) 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
브루셀라균 53주의 전장 유전자 정보(3.4M nt/균주)를 NCBI 등을 이용해 수집하였다. 수집된 브루셀라균의 전장 유전자 정보는 표 1에 나타내었다.
No Strain Size(Mb) Replicons Comment
1 B. abortus bv.2 86/8/59 3.28613 Ch1: NZ_CP007765.1/CP007765.1;
Ch2: NZ_CP007764.1/CP007764.1		 Reference
2 B. abortus bv.5 B3196 3.28175 Ch1: NZ_CP007707.1/CP007707.1;
Ch2: NZ_CP007708.1/CP007708.1		 Reference
3 B. abortus bv.6 870 3.28115 Ch1: NZ_CP007709.1/CP007709.1;
Ch2: NZ_CP007710.1/CP007710.1		 Reference
4 B. abortus bv.9 C68 3.27995 Ch1: NZ_CP007705.1/CP007705.1;
Ch2: NZ_CP007706.1/CP007706.1		 Reference
5 B. abortus S19 3.28394 Ch1: NC_010742.1/CP000887.1;
Ch2: NC_010740.1/CP000888.1		 Vaccine
6 B. abortus RB51 - Ch1: NZ_AQIE01000001;
Ch2: NZ_AQIE01000002		 Vaccine
7 B. abortus bv.1 9-941 3.28645 ChI: NC_006932.1/AE017223.1;
ChII: NC_006933.1/AE017224.1		 Isolate
8 B. abortus 2308 3.27831 ChI: NC_007618.1/AM040264.1;
ChII: NC_007624.1/AM040265.1		 Isolate
9 B. abortus A13334 3.28603 Ch1: NC_016795.1/CP003176.1;
Ch2: NC_016777.1/CP003177.1		 Isolate
10 B. abortus NCTC 10505 3.28529 Ch1: NZ_CP007700.1/CP007700.1;
Ch2: NZ_CP007701.1/CP007701.1		 Reference
11 B. abortus 63/75 3.28031 Ch1: NZ_CP007663.1/CP007663.1;
Ch2: NZ_CP007662.1/CP007662.1		 Reference
12 B. abortus BDW 3.2895 Ch1: NZ_CP007681.1/CP007681.1;
Ch2: NZ_CP007680.1/CP007680.1		 Isolate
13 B. abortus BER 3.28852 Ch1: NZ_CP007682.1/CP007682.1;
Ch2: NZ_CP007683.1/CP007683.1		 Isolate
14 B. abortus BFY 3.28816 Ch1: NZ_CP007738.1/CP007738.1;
Ch2: NZ_CP007737.1/CP007737.1		 Isolate
15 B. abortus BAB8416 3.27311 Ch1: NZ_CP008774.1/CP008774.1;
Ch2: NZ_CP008775.1/CP008775.1		 Isolate
16 B. abortus 104M 3.28543 Ch1: NZ_CP009625.1/CP009625.1;
Ch2: NZ_CP009626.1/CP009626.1		 Isolate
17 B. abortus ZW053 3.44426 Ch1: NZ_CP009098.1/CP009098.1;
Ch2: NZ_CP009099.1/CP009099.1		 Isolate
18 B. canis ATCC 23365 3.31277 ChI: NC_010103.1/CP000872.1;
ChII: NC_010104.1/CP000873.1		 Reference
19 B. canis RM6/66 3.31275 Ch1: NZ_CP007758.1/CP007758.1;
Ch2: NZ_CP007759.1/CP007759.1		 Reference
20 B. canis HSK A52141 3.27751 Ch1: NC_016778.1/CP003174.1;
Ch2: NC_016796.1/CP003175.1		 Isolate
21 B. canis Oliveri 3.31866 ChI: NZ_HG803175.1/HG803175.1;
ChII: NZ_HG803176.1/HG803176.1		 Isolate
22 B. melitensis bv.1 16M 3.29493 ChI: NC_003317.1/AE008917.1;
ChII: NC_003318.1/AE008918.1		 Reference
23 B. melitensis bv.2 63/9 3.31296 Ch1: NZ_CP007789.1/CP007789.1;
Ch2: NZ_CP007788.1/CP007788.1		 Reference
24 B. melitensis bv.3 Ether 3.31073 Ch1: NZ_CP007760.1/CP007760.1;
Ch2: NZ_CP007761.1/CP007761.1		 Reference
25 B. melitensis ATCC23457 3.31122 ChI: NC_012441.1/CP001488.1;
ChII: NC_012442.1/CP001489.1		 Reference
26 B. melitensis M28 3.31175 Ch1: NC_017244.1/CP002459.1;
Ch2: NC_017245.1/CP002460.1		 Isolate
27 B. melitensis M5-90 3.31223 ChI: NC_017246.1/CP001851.1;
ChII: NC_017247.1/CP001852.1		 Reference
28 B. melitensis NI 3.29447 ChI: NC_017248.1/CP002931.1;
ChII: NC_017283.1/CP002932.1		 Reference
29 B. melitensis 20236 3.31188 Ch1: NZ_CP008750.1/CP008750.1;
Ch2: NZ_CP008751.1/CP008751.1		 Reference
30 B. melitensis Rev1 - Ch1: NZ_EQ999561;
Ch2: NZ_EQ999555		 Vaccine
31 B. suis bv.1 1330 3.31517 ChI: NC_004310.3/AE014291.4;
ChII: NC_004311.2/AE014292.2		 Reference
32 B. suis bv.2 ATCC23445 3.32461 ChI: NC_010169.1/CP000911.1;
ChII: NC_010167.1/CP000912.1		 Reference
33 B. suis bv.3 686 3.29726 Ch1: NZ_CP007719.1/CP007719.1;
Ch2: NZ_CP007718.1/CP007718.1		 Reference
34 B. suis bv.4 40 - Ch1: GG703793;
Ch2: GG703794		 Reference
35 B. suis bv.5 513 - Ch1: DS999724;
Ch2: DS999712		 Reference
36 B. suis bv. 1 S2 3.31528 ChI: NZ_CP006961.1/CP006961.1;
ChII: NZ_CP006962.1/CP006962.1		 Vaccine
37 B. suis bv. 2 PT09143 3.32477 ChI: NZ_CP007691.1/CP007691.1;
ChII: NZ_CP007692.1/CP007692.1		 Isolate
38 B. suis bv. 2 PT09172 3.32504 ChI: NZ_CP007693.1/CP007693.1;
ChII: NZ_CP007694.1/CP007694.1		 Isolate
39 B. suis bv. 2 Bs364CITA 3.32897 ChI: NZ_CP007697.1/CP007697.1;
ChII: NZ_CP007698.1/CP007698.1		 Isolate
40 B. suis bv. 2 Bs396CITA 3.32846 ChI: NZ_CP007720.1/CP007720.1;
ChII: NZ_CP007721.1/CP007721.1		 Isolate
41 B. suis bv. 2 Bs143CITA 3.32454 ChI: NZ_CP007695.1/CP007695.1;
ChII: NZ_CP007696.1/CP007696.1		 Isolate
42 B. suis 513UK 3.3197 Ch1: NZ_CP007717.1/CP007717.1;
Ch2: NZ_CP007716.1/CP007716.1		 Reference
43 B. suis VBI22 3.31609 ChI: NC_016797.1/CP003128.1;
ChII: NC_016775.1/CP003129.1		 Isolate
44 B. suis BSP 3.31386 Ch1: NZ_CP008757.1/CP008757.1;
Ch2: NZ_CP008756.1/CP008756.1		 Isolate
45 B. suis ZW046 3.49328 Ch1: NZ_CP009096.1/CP009096.1;
Ch2: NZ_CP009097.1/CP009097.1		 Isolate
46 B. suis ZW043 3.44086 Ch1: NZ_CP009094.1/CP009094.1;
Ch2: NZ_CP009095.1/CP009095.1		 Isolate
47 B. suis Human/AR/US/1981 3.31509 ChI: NZ_CP010850.1/CP010850.1;
ChII: NZ_CP010851.1/CP010851.1		 Isolate
48 B. ovis ATCC 25840 3.27559 ChI: NC_009505.1/CP000708.1;
ChII: NC_009504.1/CP000709.1		 Reference
49 B. neotomae 5K33 3.32962 Ch1: EQ999582;
Ch2: EQ999575		 Reference
50 B. microti CCM4915 3.33737 Ch1: NC_013119.1/CP001578.1;
Ch2: NC_013118.1/CP001579.1		 Reference
51 B. ceti TE10759-12 - Ch1: NC_022905;
Ch2: NC_022906		 Isolate
52 B. pinnipedialis B2/94 3.39927 Ch1: NC_015857.1/CP002078.1;
Ch2: NC_015858.1/CP002079.1		 Reference
53 B. pinnipedialis 6/566 3.33103 Ch1: NZ_CP007743.1/CP007743.1;
Ch2: NZ_CP007742.1/CP007742.1		 Isolate
in silico 분석을 통해, 표 1의 브루셀라균 53종의 16S rRNA, 23S rRNA, IS711, BCSP31 등의 유전자를 분석하였다. 구체적으로, 상기 분석은 특이 SNP가 포함된 유전자 부위를 중심으로 annealing temperature 54℃로, 증폭산물의 크기는 180 bp±60 범위로 프라이머를 합성하였으며, 특이 SNP가 포함된 감별부위에 대하여 수집된 표준균주와 분리균주들의 전장 유전자 정보와 이 부위를 직접 assemble sequencing한 염기서열 정보와의 일치 여부를 재차 확인하여 선발된 부위의 신뢰도를 확보하였다.
총 990 bp의 BCSP31 sequence을 NCBI blast을 통해 분석한 결과 다른 세균과 감별할 수 있는 부위를 확인하고, 이를 중심으로 primer를 제작(225-448 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(224 bp)하였다. sequencing을 통해 특이 감별부위의 염기서열을 확인하였고, 다른 유사세균과의 sequence identity를 분석하였다. 특이 감별 부위의 서열 및 다른 유사세균과의 sequence identity를 분석한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 다른 유사 세균과의 sequence identity는 79% 이하이며 증폭을 위한 프라이머에도 상호 매칭되지도 않아 브루셀라균에 특이 유전자 부위임을 확인하였다. 특히, 121번째 및 124번째 염기서열에 동시에 매칭되는 세균이 없어 브루셀라균 속(genus) 특이 부위임을 확인하였다.
실시예 2. B. canis 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
B. canis에 대한 특이 SNP는 chromosome1에 있는 omp25 유전자(642 bp) 및 chromosome2에 있는 BCAN_B0021(810 bp)에서 선발하였다. B. canis omp25 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(208-322 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(115 bp)하였다. 또한 sequencing 및 alignment을 통해 B. canis 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, B. canis에 대한 SNP가 omp25 유전자의 49번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. canis omp25 유전자의 49번째 염기는 아데닌(A)이었으나, B. canis를 제외한 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
B. canis BCAN_B0021 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(52-275 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(224 bp)하였다. 또한 sequencing 및 alignment을 통해 B. canis의 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, B. canis에 대한 SNP가 BCAN_B0021 유전자의 37번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. canis BCAN_B0021 유전자의 37번째 염기는 티민(T)이었으나, B. canis를 제외한 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
실시예 3. B. suis, B. ceti 및 B. pinnipedialis 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
B. suis는 5개의 biovar(bv.)가 존재하지만 하나의 특정 유전자에서 5개 모두를 검출할 수 있는 SNP는 선발할 수 없었다. 이에, chromosome2에 있는 entE 유전자(1620 bp)에서 B. suis bv. 1~4에 대한 SNP를 선발하였고, DM38_RS01620 부위(525 bp)에서 B. suis bv. 5에 대한 SNP를 선발하였다. 또한 B. ceti 및 B. pinnipedialis에 대한 SNP 또한 상기 chormosome 2에 있는 entE 유전자에서 함께 선발하였다.
3-1. B. suis bv. 1~4에 대한 SNP 선발
entE 유전자에서 B. suis bv. 1~4에 대한 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(627-841 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(215 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv. 1~4 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, B. suis bv. 1~4에 대한 SNP가 entE 유전자의 61번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv. 1~4 entE 유전자의 61번째 염기는 아데닌(A)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다. 또한 브루셀라균 중 B. canis 균주는 entE 유전자의 61번째 염기가 아데닌(A)임이 확인되었다.
3-2. B. ceti 및 B. pinnipedialis 에 대한 SNP 선발
상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 chromosome2에 있는 entE 유전자(1620 bp)에서 B. ceti 및 B. pinnipedialis에 대한 SNP를 선발하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, B. ceti 및 B. pinnipedialis에 대한 SNP가 entE 유전자의 113번째 및 186번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. ceti 및 B. pinnipedialis의 entE 유전자의 113번째 염기는 구아닌(G)이었으나, B. ceti 및 B. pinnipedialis을 제외한 다른 브루셀라균은 아데닌(A)임을 확인하였다. 또한 B. ceti 및 B. pinnipedialis의 entE 유전자의 186번째 염기는 아데닌(A)이었으나, B. ceti 및 B. pinnipedialis을 제외한 다른 브루셀라균은 구아닌(G)임을 확인하였다.
3-3. B. suis bv. 5에 대한 SNP 선발
DM38_RS01620 유전자에서 B. suis bv. 5에 대한 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(130-346 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(217 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv. 5 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, B. suis bv. 5에 대한 SNP가 DM38_RS01620 유전자의 166번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv. 5 DM38_RS01620 유전자의 166번째 염기는 아데닌(A)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
실시예 4. B. ovis 및 B. melitensis 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
4-1. B. ovis 에 대한 SNP 선발
B. ovis에 대한 특이 SNP는 chromosome1에 있는 1353 bp의 aroA 유전자와 chromosome2에 있는 1032bp의 glk 유전자에서 선발하였다.
먼저, B. ovis aroA 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(1102-1301 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(200 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 aroA 유전자에서 B. ovis 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, B. ovis에 대한 SNP가 aroA 유전자의 123번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. ovis aroA 유전자의 123번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
또한, B. ovis glk 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(774-998 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(225 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 glk 유전자에서 B. ovis 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, B. ovis에 대한 SNP가 glk 유전자의 26번째 및 47번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. ovis glk 유전자의 26번째 및 47번째 염기는 아데닌(A)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
4-2. B. melitensis 에 대한 SNP 선발
B. melitensis glk 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(774-998 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(225 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 glk 유전자에서 B. melitensis 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, B. melitensis에 대한 SNP가 glk 유전자의 119번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. melitensis glk 유전자의 119번째 염기는 아데닌(A)임을 확인하였다.
실시예 5. B. abortus S19 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
브루셀라 백신균주 중 하나인 B. abortus S19에 대한 특이 SNP는 chromosome1에 있는 clpX 유전자(1275 bp) 및 BAb-S19 유전자(894 bp)에서 선발하였다.
먼저, B. abortus S19 clpX 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(322-529 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(208 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 clpX 유전자에서 B. abortus S19 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, B. abortus S19에 대한 SNP가 clpX 유전자의 130번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. abortus S19 clpX 유전자의 166번째 염기는 시토신(C)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
BAb-S19 유전자에서 B. abortus S19 특이 SNP가 있는 부위를 조사하였다. 구체적으로, 상기 B. abortus S19 특이 SNP가 있는 부위 중심으로 primer를 제작(247-386 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(140 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 BAb-S19 유전자에서 B. abortus S19 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, B. abortus S19에 대한 SNP가 BAb-S19 유전자의 44번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. abortus S19 BAb-S19 유전자의 44번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
실시예 6. B. abortus RB51 및 B. neotomae 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
브루셀라 백신균주 중 하나인 B. abortus RB51에 대한 특이 SNP는 chromosome1에 있는 BAB1 유전자(711 bp)에서 선발하였다. 구체적으로, B. abortus RB51 BAB1 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(346-555 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(210 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. abortus RB51 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, B. abortus RB51에 대한 SNP가 BAB1 유전자의 143번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. abortus RB51 BAB1 유전자의 143번째 염기는 시토신(C)이었으나, 다른 브루셀라균은 아데닌(A)인 것을 확인하였다.
한편, BAB1 유전자의 39번째 염기는 B. neotomae와 다른 생물형을 감별할 수 있는 SNP임을 확인하였다. 구체적으로, B. neotomae BAB1 유전자의 39번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 아데닌(A)인 것을 확인하였다.
실시예 7. B. melitensis Rev1; 및 B. abortus bv.1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51; 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
브루셀라 백신균주 중 하나인 B. melitensis Rev1에 대한 특이 SNP는 chromosome1에 있는 rpsL 유전자(385 bp)에서 선발하였다. 구체적으로, B. melitensis Rev1 rpsL 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(155-385 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(231 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. melitensis Rev1 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, B. melitensis Rev1에 대한 SNP가 rpsL 유전자의 118번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. melitensis Rev1 rpsL 유전자의 118번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)임을 확인하였다.
한편, rpsL 유전자의 176번째 염기는 B. abortus bv1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51과 다른 생물형을 감별할 수 있는 SNP임을 확인하였다. 구체적으로, B. abortus bv1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51의 rpsL 유전자의 176번째 염기는 아데닌(A)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
실시예 8. B. abortus bv.1, 2, 4, 7, B. abortus S19 및 B. abortus RB51; 및 B. suis bv.2; 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
8-1. B. abortus bv.1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51에 대한 SNP 선발
B. abortus bv.1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51과 기타 biovar로 감별되는 생화학적 반응 결과로는 thionin 색소 분해능의 유무가 있으며 이들의 감별 유전자 타입도 확인하였다. 구체적으로, B. abortus bv.1, 2, 4 glk2 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(317-568 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(252 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 glk2 유전자에서 B. abortus bv.1, 2, 4 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, B. abortus bv.1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51에 대한 SNP가 glk2 유전자의 150번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. abortus bv.1, 2, 4, B. abortus S19 및 B. abortus RB51의 glk2 유전자의 150번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)임을 확인하였다.
한편, 상기 sequencing 및 alignment 결과, glk2 유전자의 91번째 염기는 B. suis bv.2에 대한 특이성이 있는 것을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv.2 glk2 유전자의 91번째 염기는 구아닌(G)이었으나, 다른 브루셀라균은 아데닌(A)임을 확인하였다.
8-2. B. abortus bv.7에 대한 SNP 선발
rplV 유전자에서 B. abortus bv.7에 대한 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(390 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. abortus bv.7 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, B. abortus bv.7에 대한 SNP가 rplV 유전자의 48번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. abortus bv.7 rplV 유전자는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
실시예 9. B. suis bv.1~5 및 B. melitensis, B. canis, B. microti 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
B. suis biovar에 대한 특이 SNP 선발은 pyrH gene(bv.1), ssrA gene(bv.2), rpoB gene(bv.3), ABC transporter gene(bv.3, 4)와 DM38_RS00005(bv.5) 부위를 이용하였다.
9-1. B. suis bv.1에 대한 SNP 선발
브루셀라균 chromosome1에 있는 972 bp의 pyrH 유전자에서 B. suis bv.1 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(761-965 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(205 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv.1 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, B. suis bv.1에 대한 SNP가 pyrH 유전자의 56 및 57 번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv.1 pyrH 유전자의 56 및 57번째 염기는 구아닌-티민(GT)이었으나, 다른 브루셀라균은 아데닌-구아닌(AG)인 것을 확인하였다.
9-2. B. suis bv.2에 대한 SNP 선발
B. suis bv.2는 chromosome1에 있는 ssrA 유전자(438 bp)에서 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(1-260 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(260 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv.2 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, B. suis bv.2에 대한 SNP가 ssrA 유전자의 224번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv.2 ssrA 유전자의 224번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
한편, ssrA 유전자의 192번째 염기서열은 B. melitensis에만 특이적인 SNP임을 확인하였다. 구체적으로, B. melitensis ssrA 유전자의 192번째 염기는 아데닌(A)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
9-3. B. suis bv.3에 대한 SNP 선발
B. suis bv.3는 chromosome1에 있는 rpoB 유전자(4134 bp)에서 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(172-333 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(162 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv.3 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, B. suis bv.3에 대한 SNP가 rpoB 유전자의 94번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv.3 rpoB 유전자의 94번째 염기는 아데닌(A)이었으나, 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
9-4. B. suis bv.3 및 4에 대한 SNP 선발
B. suis bv.3 및 4를 모두 감별할 수 있는 특이 SNP는 chromosome2에 있는 ABC transporter 유전자(1646 bp)의 SNP 부위를 중심으로 primer를 제작(127-326 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(200 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv.3 및 4 동시 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, B. suis bv.3 및 4에 대한 SNP가 ABC transporter 유전자의 100번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv.3 및 4의 ABC transporter 유전자의 100번째 염기는 아데닌(A)이었으나 다른 브루셀라균은 구아닌(G)인 것을 확인하였다.
한편, B. suis bv. 3, 4 이외에 B. canis도 ABC transporter의 100번째 염기도 아데닌임을 확인한바, 해당 SNP를 이용하여 B. canis 또한 감별해낼 수 있음을 확인하였다.
9-5. B. suis bv.5 및 B. microti 에 대한 SNP 선발
B. suis bv.5는 chromosome2에 있는 DM38_RS00005 유전자(2190 bp)에서 B. suis bv.5 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(332-560 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(229 bp)하였다. sequencing 및 alignment을 통해 B. suis bv.5 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, B. suis bv.5에 대한 SNP가 DM38_RS00005 유전자의 31번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. suis bv.5 DM38_RS00005 유전자의 31번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
한편, DM38_RS00005 유전자의 25번째 염기서열은 B. microti에만 특이적인 SNP임 확인하였다. 구체적으로, B. microti DM38_RS00005 유전자의 25번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
실시예 10. B. abortus 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
B. abortus에 대한 특이 SNP는 chromosome2에 있는 fbaA 유전자(1065 bp)에서 선발하였다. B. abortus fbaA 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(170-364 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(195 bp)하였다. 또한 sequencing 및 alignment을 통해 B. abortus 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, B. abotus에 대한 SNP가 fbaA 유전자의 39번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. abotus fbaA 유전자의 39번째 염기는 구아닌(G)이었으나, 다른 브루셀라균은 아데닌(A)인 것을 확인하였다.
실시예 11. B. melitensis 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
B. melitensis에 대한 특이 SNP는 chromosome1에 있는 gap 유전자(1008 bp)에서 선발하였다. B. melitensis gap 유전자의 특이 SNP가 있는 부위를 중심으로 primer를 제작(442-589 nt)하여 표준(백신)균주를 대상으로 증폭(148 bp)하였다. 또한 sequencing 및 alignment을 통해 B. melitensis 감별용 특이 SNP를 분석하였고, 그 결과는 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, B. melitensis에 대한 SNP가 gap 유전자의 84번째 염기임을 확인하였다. 구체적으로, B. melitensis gap 유전자의 84번째 염기는 티민(T)이었으나, 다른 브루셀라균은 시토신(C)인 것을 확인하였다.
전술한 실시예 1 내지 11에서 확인한 브루셀라균 감별용 특이 SNP 및 이를 검출하기 위한 프라이머 정보는 표 2에 정리하였다.
Gene Primer sequence
(5` → 3`)		 서열번호 Size
(bp)		 타겟 부위를 기준으로 한 SNP의 위치 브루셀라균의 whole genome을 기준으로 한 SNP의 위치 Comments
BCSP31 F TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA 1 224 121
124		 Ch. 1, 817476
Ch. 1, 817479		 Genus Brucella
R CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG 2
fbaA F CCA ATG ACA TCA TGC TCC 3 195 39 Ch. 2, 360501 B. abortus
R CGT TAT AGT CCC AGT CGG 4
omp25 F AAG CCT GAC GAT TGG AA 5 115 49 Ch. 1, 687211 B. canis
R CGT CCT TGG ACT TCT TGG 6
BCAN_B0021 F GGA AAT CAT CGA GCG CAA 7 224 37 Ch. 2, 17391 B. canis
R ATT TTC TCG TCC TGT TCG GC 8
gap F ATC TCC AAC GCT TCG TGT A 9 148 84 Ch. 1, 320931 B. melitensis
R AGA GAT CCT TGT GCA TGG T 10
entE F CCA CCA TGT TTA CGC CAT GA 11 215 61 Ch. 2, 12938 B. suis bv. 1-4
R TGA TTA TGA TTA CAG CGT GC 12 113
186		 Ch. 2, 78863
Ch. 2, 78790		 B. ceti,
B. pinnipedialis
DM38
_RS01620		 F GAA GAT CTG GTG CAG GAA 13 217 166 Ch. 2, 18902 B. suis bv. 5
R TAC GAT CCA CAT CCA TGC 14
aroA F AAT GGT GTC GAT TGT ACC 15 200 123 Ch. 1, 30610 B. ovis
R ATG AAT TCC GGG AAA GAG 16
glk F CCT TGC GCT CAT TTT CAT 17 225 26
47		 Ch. 2, 1036311
Ch. 2, 1036332		 B. ovis
R GAA ACT TCA AAG CGC GAG 18 119 Ch. 2, 265232 B. melitensis
clpX F GAT ATC GAA CTG GCG AAG 19 208 130 Ch. 1, 1099314 B. abortus S19
R CGC GCT CCA CAT TAT AAT C 20
BAb-S19 F GCA CAG ATC GGC GAA CTG 21 140 44 Ch. 1, 63304 B. abortus S19
R GTG GTA AGC TCG ATA TGA AT 22
BAb-RB51 F GCC TAC AAG AAT TAC GAA CA 23 210 39 Ch. 1, 958730 B. neotomae
R CCG CCC TTT TGA TAC CAT ATA 24 143 Ch. 1, 641898 B. abortus RB51
rpsL F TTG CCA AGG TTC GTC TGA 25 231 118 Ch. 1, 783223 B. melitensis Rev1
R TCC CCG GAA AAT CTT ACT TC 26 176 Ch. 1, 1219989 B. abortus bv. 1,2,4
glk-2 F TGA CCG TCC TCA ATG ATT T 27 252 91 Ch. 2, 265717 B. suis bv. 2
R GTT CGA TAT GCG GGA AAA T 28 150 Ch. 2, 983736 B. abortus bv. 1,2,4
pyrH F CCG ATC CAA AGA AAG ACC 29 205 56
57		 Ch. 1, 1139687
Ch. 1, 1139688		 B. suis bv. 1
R TCA GAA ACA ATC GTG CAA C 30
ssrA F GAA GCT GTC AAT GGA AAA TG 31 260 192 Ch. 1, 633668 B. melitensis
R CGA TCT TTA CAC CCT TGT C 32 224 Ch. 1, 1354542 B. suis bv. 2
rpoB F GTT TTC AAG TCT GTT TTC CC 33 162 94 Ch. 1, 1214190 B. suis bv. 3
R GAA CAC GAT AAG ACG CAG 34
ABC transporter F TCC GGA TGG TTC ATC AC 35 200 100 Ch. 2, 488222 B. canis
B. suis bv. 3,4
R CAG CTA CGG AAG AGT TT 36
DM38_RS00005 F CGG CTT TCG ATC AGG ATA 37 229 25 Ch. 2, 28351 B. microti
R CCG AAA TAG GTG TAG ACG 38 31 Ch. 2, 28315 B. suis bv. 5
rplV F ATG GGC AAG GCC AAG GCT 39 390 48 Ch. 2, 1212540 B. abortus bv. 7
R TTA TGC GGC CTT CCC TTT 40
20 genes 20 pairs 31 SNPs ■ MLSA(14 genes)
상기 표 2에 기재된 균주별 염색체의 accession No.는 표 3에 나타내었다.
균주 1번 염색체의
accession No.		 2번 염색체의
accession No.
B. abortus 2308 NC_007618 NC_007624
B. canis ATCC 23365 NC_010103 NC_010104
B. ceti TE10759-12 NC_022905 NC_022906
B. melitensis 16M NC_003317 NC_003318
B. microti CCM 4915 NC_013119 NC_013118
B. ovis NCTC 10512 NC_009505 NC_009504
B. pinnipedialis B2/94 NC_015857 NC_015858
B. suis 1330 NC_004310 NC_004311
실시예 12. 표 2의 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용한 브루셀라균 분석법
상기 표 2의 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 활용하여, 브루셀라 표준균주 10종 22 생물형 및 백신균주 3종을 감별할 수 있는지 확인하였으며, 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 선발된 13종의 유전자(gene)에 위치한 브루셀라균 특이 SNP 22개를 이용할 경우 브루셀라균의 속(genus), 종(species) 및 생물형(biovars)을 모두 감별할 수 있음을 확인하였다.
표준균주 분석을 토대로, 표 2의 유전자 중 13종(BCSP31, fbaA, omp25, ssrA, entE, glk2, BAb-RB51, clpx-S9, rpsL, pyrH, rpoB, ABC transporter, RS00005) 유전자의 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 활용하여, 분리균주 14종을 대상으로 종을 감별하였으며, 그 결과를 classical biotyping 결과와 비교하였다. 비교 결과는 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 13종 유전자의 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용한 감별 결과는 classical biotyping 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
실시예 13. 표 2의 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA)
브루셀라균 14개 유전자(BCSP31, fbaA, omp25, ssrA, entE, glk2, BAb-RB51, clpx-S9, rpsL, pyrH, rpoB, ABC transporter, RS00005, rplV)의 브루셀라균 감별용 특이 SNP를 이용하여, 다좌위 염기 분석을 수행하였으며, 그 결과는 도 23에 나타내었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 브루셀라균이 속, 종 및 생물형에 따라 그룹이 나누어짐을 확인하였다. 특히 B. abortus는 생물형에 따라 세 그룹, 즉, (i) 생물형 1, 2, 4; (ii) 생물형 5, 5, 6, 9; 및 (iii) 생물형 7;로 나뉘는 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 브루셀라균의 sequencing 및 alignment를 통해 속(genus), 종(species) 및 생물형(biovar)을 감별하기 위한 특이 SNP를 확인하였고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다. 본 발명에 따른 브루셀라균 감별용 특이 SNP 및 프라이머 세트는 브루셀라균의 속, 종 및 생물형을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라균의 동정 및 진단에 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella and primer set for detection <130> 113 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_forward primer <400> 1 tggctcggtt gccaatatca a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_reverse primer <400> 2 cgcgcttgcc tttcaggtct g 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_forward primer <400> 3 ccaatgacat catgctcc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_reverse primer <400> 4 cgttatagtc ccagtcgg 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omp25_forward primer <400> 5 aagcctgacg attggaa 17 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omp25_reverse primer <400> 6 cgtccttgga cttcttgg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAN_B0021_forward primer <400> 7 ggaaatcatc gagcgcaa 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAN_B0021_reverse primer <400> 8 attttctcgt cctgttcggc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gap_forward primer <400> 9 atctccaacg cttcgtgta 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gap_reverse primer <400> 10 agagatcctt gtgcatggt 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> entE_forward primer <400> 11 ccaccatgtt tacgccatga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> entE_reverse primer <400> 12 tgattatgat tacagcgtgc 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DM38_RS01620_forward primer <400> 13 gaagatctgg tgcaggaa 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DM38_RS01620_reverse primer <400> 14 tacgatccac atccatgc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroA_forward primer <400> 15 aatggtgtcg attgtacc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroA_reverse primer <400> 16 atgaattccg ggaaagag 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glk_forward primer <400> 17 ccttgcgctc attttcat 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glk_reverse primer <400> 18 gaaacttcaa agcgcgag 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpX_forward primer <400> 19 gatatcgaac tggcgaag 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpX_reverse primer <400> 20 cgcgctccac attataatc 19 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAb-S19_forward primer <400> 21 gcacagatcg gcgaactg 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAb-S19_reverse primer <400> 22 gtggtaagct cgatatgaat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAb-RB51_forward primer <400> 23 gcctacaaga attacgaaca 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAb-RB51_reverse primer <400> 24 ccgccctttt gataccatat a 21 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_forward primer <400> 25 ttgccaaggt tcgtctga 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_reverse primer <400> 26 tccccggaaa atcttacttc 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glk-2_forward primer <400> 27 tgaccgtcct caatgattt 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glk-2 _reverse primer <400> 28 gttcgatatg cgggaaaat 19 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pyrH_forward primer <400> 29 ccgatccaaa gaaagacc 18 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pyrH_reverse primer <400> 30 tcagaaacaa tcgtgcaac 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssrA_forward primer <400> 31 gaagctgtca atggaaaatg 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssrA_reverse primer <400> 32 cgatctttac acccttgtc 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB_forward primer <400> 33 gttttcaagt ctgttttccc 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB_reverse primer <400> 34 gaacacgata agacgcag 18 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABC transporter _forward primer <400> 35 tccggatggt tcatcac 17 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABC transporter _reverse primer <400> 36 cagctacgga agagttt 17 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DM38_RS00005_forward primer <400> 37 cggctttcga tcaggata 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DM38_RS00005_reverse primer <400> 38 ccgaaatagg tgtagacg 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rplV_forward primer <400> 39 atgggcaagg ccaaggct 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rplV_reverse primer <400> 40 ttatgcggcc ttcccttt 18

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 40의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella neotomae, Brucella microti, Brucella ceti 및 Brucella pinnipedialis로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 브루셀라균 감별용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 감별은 속(genus), 종(species) 또는 생물형(biovar)을 감별하는 것인, 브루셀라균 감별용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항의 조성물을 포함하는 Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella neotomae, Brucella microti, Brucella ceti 및 Brucella pinnipedialis로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 브루셀라균 감별용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인, 브루셀라균 감별용 키트.
  10. (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 제1항의 브루셀라균 감별용 조성물을 이용하여, 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella neotomae, Brucella microti, Brucella ceti 및 Brucella pinnipedialis로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 브루셀라균 감별 방법.
  11. 삭제
KR1020200187436A 2020-12-30 2020-12-30 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트 Active KR102470985B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200187436A KR102470985B1 (ko) 2020-12-30 2020-12-30 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200187436A KR102470985B1 (ko) 2020-12-30 2020-12-30 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220095679A KR20220095679A (ko) 2022-07-07
KR102470985B1 true KR102470985B1 (ko) 2022-11-29

Family

ID=82398489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200187436A Active KR102470985B1 (ko) 2020-12-30 2020-12-30 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102470985B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117051131B (zh) * 2023-10-11 2024-01-30 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 与绵羊抗布鲁氏菌病性状相关的snp分子标记及其检测引物和应用
CN117947188B (zh) * 2023-12-28 2024-07-16 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 与布鲁氏菌链霉素耐药性相关的snp分子标记、引物、探针试剂盒及应用
CN118064612B (zh) * 2024-02-20 2025-02-18 沈阳农业大学 一对布鲁氏菌23S rRNA基因的引物及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701980A (zh) 2017-02-04 2017-05-24 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心snp标记及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101288035B1 (ko) * 2011-05-26 2013-07-22 대한민국 브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트
KR20170019925A (ko) * 2015-08-13 2017-02-22 대한민국(국군의무사령부 사령관) 브루셀라균 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701980A (zh) 2017-02-04 2017-05-24 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心snp标记及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
차세대염기서열분석법을 이용한 브루셀라균 신속 감별동정 및 분자유전학적 특성분석, 세균질병과 브루셀라병 OIE 표준실험실, 농림축산검역본부, 연구과제 최종보고, 2016*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220095679A (ko) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Widmer Genetic heterogeneity and PCR detection of Cryptosporidium parvum
CN1896284B (zh) 一种鉴别等位基因类型的方法
KR102470985B1 (ko) 브루셀라균 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트
KR101954392B1 (ko) 어위니아 아밀로보라 검출용 분자 마커 및 이의 용도
Ahmed et al. Molecular basis for identification of species/isolates of gastrointestinal nematode parasites
CN104508142A (zh) 离子激流基因组测序
JP2007209281A (ja) 種特異的プライマーを用いる動物種検出方法および種検出プライマー
US20230227913A1 (en) Methods, treatment, and compositions for characterizing thyroid nodule
KR101288035B1 (ko) 브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트
CN113604589B (zh) 同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂代谢基因分型的试剂盒
JP2020115793A (ja) 肺炎桿菌及び近縁菌種の遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット
WO2012087135A1 (en) Genetic markers specific for clostridium difficile ribotypes 027 (nap01/b1; rt 027) and 078 (nap7/8; rt 078) and their use
US20060210998A1 (en) Determination of antibiotic resistance in staphylococcus aureus
KR20220152470A (ko) 마 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102470994B1 (ko) 브루셀라 캐니스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트
CN112708658B (zh) 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用
KR102470988B1 (ko) 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트
KR102331200B1 (ko) 감 품종식별을 위한 kasp 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102053753B1 (ko) 탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도
KR101731619B1 (ko) 부녀 관계 확인용 마커 조성물 및 그의 용도
JP6945200B2 (ja) Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット
KR102411940B1 (ko) 살모넬라 종 판별용 프로브 조성물 및 이를 포함하는 살모넬라 종 판별용 키트
US20040121366A1 (en) High resolution typing system for pathogenic Mycobacterium tuberculosum
KR20170048882A (ko) 배추의 대량 유전자형 분석용 단일염기다형성 탐침 및 용도
KR101854898B1 (ko) 토종견 및 외래견 구별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20201230

PA0201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20220517

Patent event code: PE09021S01D

PG1501 Laying open of application
E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20221028

PR0702 Registration of establishment of national patent

Patent event code: PR07021E01D

Comment text: Registration of Establishment of National Patent

Patent event date: 20221122

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20221122

End annual number: 20

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration