KR102462782B1 - Redox-responsive nitric monoxide donating compounds and delivery systems - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 일산화질소를 방출할 수 있는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물에 관한 것이다.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug capable of selectively releasing nitrogen monoxide under reducing conditions in vivo.
The reductive nitric oxide donor compound of the present invention can be usefully used for preventing or treating cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease, or infectious disease.
Description
본 발명은 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 일산화질소를 방출할 수 있는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물에 관한 것이다.The present invention relates to a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug capable of selectively releasing nitrogen monoxide under reducing conditions in vivo.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.The reductive nitric oxide donor compound or prodrug of the present invention can be usefully used for preventing or treating cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease, or infectious disease.
일산화질소는 생체 내 효소 및 대사작용에 의해서 합성되는 반응성 기체물질로써 세포분열, 세포사멸, 세포분화, 신경전달, 면역작용, 심혈관계 항상성 유지 등 생리학적 역할에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. Nitric oxide is a reactive gas substance synthesized by in vivo enzymes and metabolism, and plays an important role in physiological roles such as cell division, apoptosis, cell differentiation, neurotransmission, immunity, and maintenance of cardiovascular homeostasis.
1998년 일산화질소의 심혈관계 항상성 유지 기작을 밝힌 공로로 세명의 과학자가 노벨 생리의학상을 받은 이후로, 일산화질소의 생의학적인 응용 가능성을 향상시키고자 오랜 기간 일산화질소 공여체 및 전달체가 개발되어 왔다.Since three scientists were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine for discovering the mechanism of nitric oxide maintaining homeostasis in the cardiovascular system in 1998, nitric oxide donors and carriers have been developed for a long time to improve the biomedical applications of nitric oxide.
특히, 최근 5년간 일산화질소의 항암 작용에 대한 관심이 폭발적으로 증가하여 일산화질소 전달체의 개발 및 항암, 항박테리아제로의 적용을 포함한 다양한 질병분야로의 응용 가능성이 주목받고 있다. In particular, interest in the anticancer action of nitric oxide has exploded in the past 5 years, and the potential for application to various disease fields including the development of a nitric oxide transporter and its application as an anticancer and antibacterial agent is attracting attention.
하지만 일산화질소는 가스 형태로 존재하므로 효과적인 전달에 많은 제약이 있으며, 대다수의 기술들이 생체적용이 힘든 자외선 반응성에 의하여 방출되는 일산화질소 공여체 또는 자발적인 분해에 의해 방출되는 일산화질소 공여체를 이용하기에, 실질적인 임상 적용 및 상용화에 한계를 보여주고 있다. 또한, 상기 한계를 가진 공여체라도 질병 부위로 효과적 전달하기 위해서는 복잡한 합성법을 이용해야 하므로 기술의 상용화에 한계가 있다.However, since nitrogen monoxide exists in a gaseous form, there are many limitations in effective delivery, and most technologies use a nitrogen monoxide donor released by UV reactivity, which is difficult to bioapply, or a nitrogen monoxide donor released by spontaneous decomposition. It shows limitations in clinical application and commercialization. In addition, there is a limit to the commercialization of the technology because a complex synthesis method must be used to effectively deliver even a donor having the above limitations to a diseased site.
따라서, 일산화질소의 생의학적인 응용을 위해서는, 생체 내 특이적 환경에 선택적으로 반응하여 일산화질소를 방출하는 공여체 및 전달체의 개발이 필요한 실정이다.Therefore, for the biomedical application of nitric oxide, it is necessary to develop a donor and a carrier that selectively reacts to a specific environment in vivo to release nitric oxide.
본 발명자들은 자가-희생 링커를 이용한 환원반응성 일산화질소 방출 화합물이 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 분해되어 일산화질소를 방출할 수 있고, 약물, 전달체 또는 약물을 함유하는 전달체에 간편히 부착될 수 있으며, 상기 화합물이 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다는 점을 입증하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The present inventors have found that a reductive nitrogen monoxide-releasing compound using a self-immolative linker can be selectively decomposed under reducing conditions in vivo to release nitrogen monoxide, and can be easily attached to a drug, a carrier or a carrier containing the drug, It has been demonstrated that the compound has a preventive or therapeutic effect on cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease, or infectious disease, and thus the present invention has been completed.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
여기서,here,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 피리딘-2-일이다.R 2 is straight or branched C1-C10 alkyl; or substituted or unsubstituted pyridin-2-yl.
본 발명은 상기 화학식 1에서 R1은 C2 알킬렌이며, R2는 피리딘-2-일인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug, wherein in
본 발명은 상기 환원반응성이 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커의 자가-희생적 단편화에 의한 것인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug, wherein the reductive reactivity is due to self-immolative fragmentation of a self-immolative linker induced by a redox reaction.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 4로 표시되는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug, which is represented by the following Chemical Formula 4, wherein a drug, a carrier, or a drug-containing carrier is conjugated.
[화학식 4][Formula 4]
여기서,here,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
상기 R3는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체이다.R 3 is a drug, a carrier, or a carrier containing the drug.
본 발명은 상기 약물이 단백질 약물, 화학적 약물 및 핵산으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reductive nitric oxide donor compound or prodrug conjugated to a drug, a carrier, or a carrier containing the drug, wherein the drug is at least one selected from the group consisting of protein drugs, chemical drugs, and nucleic acids.
본 발명은 상기 전달체가 고분자, 유기 나노구조체, 무기 나노구조체, 유기 마이크로 구조체, 무기 마이크로구조체, 하이드로젤, 스캐폴드 및 코팅물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides that the carrier is at least one selected from the group consisting of polymers, organic nanostructures, inorganic nanostructures, organic microstructures, inorganic microstructures, hydrogels, scaffolds and coating materials, drug, carrier or drug-containing carrier Provided is a reductive nitric oxide donor compound or prodrug conjugated to
본 발명은 상기 전달체가 알부민인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug conjugated to a drug, a carrier or a drug-containing carrier, wherein the carrier is albumin.
본 발명은 상기 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 직경이 10-20 nm인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug conjugated to a drug, a carrier or a carrier containing the drug, wherein the albumin-conjugated reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug has a diameter of 10-20 nm. .
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug as an active ingredient.
본 발명은 상기 암이 전이성 암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the cancer is metastatic cancer.
본 발명은 상기 약학적 조성물이 비경구 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the pharmaceutical composition is administered parenterally.
본 발명은 상기 약학적 조성물이 정맥, 피하, 복강 또는 종양 내 주사를 통해 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the pharmaceutical composition is administered through intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or intratumoral injection.
본 발명은 상기 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases, intractable neurological diseases or infectious diseases, comprising the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug as an active ingredient.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물을 싸이올기를 함유하고 있는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 반응시키는 단계를 포함하는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a drug, a carrier, or a drug-containing carrier is conjugated reduction comprising the step of reacting the compound of
[화학식 1][Formula 1]
여기서,here,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 피리딘-2-일이다.R 2 is straight or branched C1-C10 alkyl; or substituted or unsubstituted pyridin-2-yl.
본 발명은 상기 R1가 C2 알킬렌이며, R2는 피리딘-2-일인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for preparing a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug in which R 1 is C2 alkylene and R 2 is pyridin-2-yl, wherein a drug, a carrier, or a drug-containing carrier is conjugated.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or treating cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease or infectious disease by administering the reductive nitric oxide donor compound or prodrug of the present invention to mammals including humans. do.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 용도를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a use of the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention in the manufacture of a medicament.
이하 이를 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기의 구체적인 서술에 의해 본 발명 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Hereinafter, this will be described in detail. All combinations of the various elements disclosed herein are within the scope of the present invention. In addition, it cannot be considered that the scope of the present invention is limited by the following specific description.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.The present invention provides a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
여기서,here,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 피리딘-2-일이다.R 2 is straight or branched C1-C10 alkyl; or substituted or unsubstituted pyridin-2-yl.
본 발명에서 “Cx-Cy”여기서 x, y는 1 이상의 정수)는 탄소 개수를 의미한다. 예를 들면, C1-C10 알킬렌은 1 이상 10 이하의 탄소수를 가지는 알킬렌을 의미하며, C1-C10 알킬은 1 이상 10 이하의 탄소수를 가지는 알킬을 의미한다.In the present invention, "Cx-Cy" where x and y are integers greater than or equal to 1) means the number of carbons. For example, C1-C10 alkylene means alkylene having 1 or more and 10 or less carbon atoms, and C1-C10 alkyl means alkyl having 1 or more and 10 or less carbon atoms.
본 발명에서 “알킬”은 직쇄 또는 분지쇄 포화탄화수소기를 의미하는 것으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-디케닐 등을 포함한다.In the present invention, “alkyl” refers to a straight-chain or branched saturated hydrocarbon group, and includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, n- hexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-dikenyl, and the like.
본 발명에서 “알킬렌”은 상기 정의된 알킬로부터 유도된 2가의 작용기를 의미한다.In the present invention, “alkylene” refers to a divalent functional group derived from alkyl as defined above.
본 발명에서 “전구약물(prodrug)”는 불활성 화합물이 투여 후 생체 내에서 활성형인 목적하는 화합물로 변화하는 약물을 의미한다.In the present invention, “prodrug” refers to a drug in which an inactive compound is converted into an active target compound in vivo after administration.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소를 포함할 수 있으며, 이에 따라 라세미체, 라세믹 혼합물, 단일의 에난티오머, 부분 입체 이성질체 혼합물 또는 각각의 부분 입체이성체로서 존재할 수 있다. The compound represented by Formula 1 of the present invention may contain one or more asymmetric carbons, and thus may exist as a racemate, a racemic mixture, a single enantiomer, a mixture of diastereomers, or each diastereomer. .
상기 이성질체는 종래 이성질체를 분리하기 위한 기술, 예를 들면, 관 크로마토그래피 또는 HPLC 등에 의해 분리가 가능할 수 있다. 또한, 화합물 각각의 입체 이성질체는 공지된 광학적으로 순수한 출발 물질 및/또는 시약을 이용하여 입체 특이적으로 합성할 수 있다.The isomers may be separated by conventional techniques for separating isomers, for example, column chromatography or HPLC. In addition, stereoisomers of each compound can be stereospecifically synthesized using known optically pure starting materials and/or reagents.
본 발명에서 “입체 이성질체”는 부분 입체 이성질체(diastereomer) 및 광학 이성질체(enantiomer)를 포함하는 것으로, 광학 이성질체는 거울상 이성질체뿐만 아니라 거울상 이성질체의 혼합물 및 라세미체를 포함한다.In the present invention, "stereoisomer" includes diastereomers and optical isomers (enantiomers), and optical isomers include enantiomers as well as mixtures of enantiomers and racemates.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 및 전구약물은 하기 화학식 2로 표시되는, R1은 C2 알킬렌이며, R2는 피리딘-2-일인 화합물 또는 전구약물일 수 있다.The reductive nitrogen monoxide donor compound and prodrug represented by
[화학식 2][Formula 2]
본 발명에서 “환원반응성”은 생체 내 특정 환원 조건 하에서 유발된 산화환원반응(redox)에 의해 화합물이 단편화(fragmentation)되어 일산화질소를 방출하는 화합물을 방출할 수 있는 특성을 의미한다.In the present invention, “reduction reactivity” refers to a property capable of releasing a compound emitting nitrogen monoxide by fragmentation of a compound by redox induced under specific reducing conditions in vivo.
본 발명의 화합물은 강력한 환원 조건 하에서 쉽게 절단될 수 있는 이황화결합을 포함하고 있다. 환원 조건 하에서 절단된 이황화결합으로 인해 유리된 싸이올기(-thiol, -SH)는 분자 내 친핵성 공격이 가능하며, 자가-희생 링커(self-immolative linker)는 분자 내 순환을 거쳐 5원 고리의 형성을 통해 카바메이트(carbamate)를 절단하여 일산화질소 공여자(NO donor)를 방출할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 화합물은 자가-희생 링커 및 일산화질소 공여자를 포함하는 화합물로도 정의될 수도 있을 것이다.The compounds of the present invention contain disulfide bonds that can be easily cleaved under strong reducing conditions. The free thiol group (-thiol, -SH) due to the cleaved disulfide bond under reducing conditions is capable of intramolecular nucleophilic attack, and the self-immolative linker undergoes intramolecular circulation to form a 5-membered ring Formation can cleave the carbamate to release the nitric oxide donor (NO donor). Accordingly, a compound of the present invention may also be defined as a compound comprising a self-immolative linker and a nitric oxide donor.
본 발명에서 환원반응성은 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커의 자가-희생적 단편화에 의한 것일 수 있다.In the present invention, the reduction reactivity may be due to the self-immolative fragmentation of the self-immolative linker induced by the redox reaction.
본 발명에서 “자가-희생 링커(self-immolative linker)”는 특정 환원 조건 하에서 한번의 화학 반응이 연쇄반응을 통해 자가-희생적 단편화 과정(self-immolative fragmentation process)을 거쳐 자발적으로 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있는 링커 부분을 의미한다.In the present invention, the "self-immolative linker" is a nitric oxide donor by spontaneously decomposing through a self-immolative fragmentation process through a chain reaction in one chemical reaction under specific reducing conditions. It means a linker moiety capable of releasing
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화합물에서 자가-희생 링커는 하기 화학식 3으로 표시되는 부분을 의미하는 것일 수 있다.According to embodiments of the present invention, the self-immolative linker in the compound of the present invention may refer to a moiety represented by the following formula (3).
[화학식 3][Formula 3]
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이다.R 1 is straight-chain or branched C1-C10 alkylene.
본 발명에서 “
후술하는 실험예에 따르면, 본 발명의 자가-희생 링커는 환원 조건 하에서 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있음을 구체적으로 입증하였으며, 나아가 세포 내 환경에서만 특이적으로 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있다는 점을 확인하였다. 본 발명의 화합물이 자가-희생 링커의 분해에 의해 일산화질소 공여자를 방출하는 메커니즘은 도 1a에 나타내었다.According to the experimental examples described below, it has been specifically demonstrated that the self-immolative linker of the present invention can be degraded under reducing conditions to release a nitric oxide donor, and furthermore, it can be specifically degraded only in the intracellular environment to release a nitric oxide donor. It was confirmed that it is possible. The mechanism by which a compound of the present invention releases a nitric oxide donor by cleavage of a self-immolative linker is shown in Figure 1a.
본 발명에서 “일산화질소 공여자(NO donor)”는 일산화질소를 방출할 수 있는 화합물을 의미하며, 본 발명의 실시예들에 따르면, 하기 화학식의 SIN-1으로 지칭되는 3-몰포리노시드노니민(3-morpholinosydnonimine)일 수 있다.In the present invention, "nitrogen monoxide donor (NO donor)" means a compound capable of releasing nitrogen monoxide, and according to embodiments of the present invention, 3-morpholinoside nonimine referred to as SIN-1 of the following formula (3-morpholinosydnonimine).
[SIN-1][SIN-1]
본 발명에서 “SISIN-1”은 상기 SIN-1 및 자가-희생 링커를 포함하는 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 전구약물을 의미하거나, 또는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물에서 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체 외에 상기 SIN-1 및 자가-희생 링커가 결합된 부분을 의미하는 것일 수 있다.In the present invention, “SISIN-1” refers to a compound of
예를 들어, 본 명세서에서 SISIN-1이 단독으로 표기된 경우는 화학식 1 또는 2로 나타낸 화합물 또는 전구약물을 의미할 수 있다. 또한, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 “(약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체)-SISIN-1”로 표기될 수 있으며, 구체적으로 알부민 및 SISIN-1이 반응하여 제조된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 AL-SISIN-1로 표시될 수 있다.For example, in the present specification, when SISIN-1 is expressed alone, it may mean a compound or prodrug represented by
본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 약물, 전달체 또는 약물을 함유하는 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다.The compound or prodrug represented by
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 약물과 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합된 것일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합된 것일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 화합물을 함유하고 있는 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합된 것일 수 있다.According to embodiments of the present invention, the compound or prodrug represented by
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 4로 표시되는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug, which is represented by the following formula (4), wherein a drug, a carrier, or a drug-containing carrier is conjugated.
[화학식 4][Formula 4]
여기서,here,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
상기 R3은 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체이다.R 3 is a drug, a carrier, or a carrier containing the drug.
본 발명에서 “약물”은 치료효과가 밝혀진, 목적하는 치료 효과를 위해 대상체에 투여되는 치료제 물질을 의미한다. 상기 약물은 예를 들어, 화학약물, 유전자 치료제, 광열(Photothermal) 치료제 및 광역학(Photodynamic) 치료제, 항생제, 항바이러스제 또는 면역치료제일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 종래 개발되어 있는 약물이라면 치료하고자 하는 목적에 따라 어느 것이든 사용할 수 있다.In the present invention, "drug" refers to a therapeutic agent administered to a subject for a desired therapeutic effect, whose therapeutic effect has been found. The drug may be, for example, a chemical drug, a gene therapy agent, a photothermal agent and a photodynamic agent, an antibiotic, an antiviral agent, or an immunotherapeutic agent, but is not limited thereto. Any can be used depending on the purpose.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 약물은 단백질 약물, 화학적 약물 및 핵산으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류를 포함한다.According to embodiments of the present invention, the drug may be any one selected from the group consisting of protein drugs, chemical drugs, and nucleic acids, but is not limited thereto. The subject also includes a human or non-human mammal.
본 발명에서 “전달체”는 치료를 위한 약물 등을 목표로 하는 타겟으로 전달함에 있어서 생체 내 안정성 및/또는 안전성을 증가시키거나, 타겟 특이성을 향상시킬 수 있는 물질을 의미한다. 상기 전달체는, 예를 들면, 고분자, 유기 나노구조체, 무기 나노구조체, 유기 마이크로 구조체, 무기 마이크로구조체, 하이드로젤, 스캐폴드 및 코팅물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term “delivery vehicle” refers to a substance capable of increasing in vivo stability and/or safety or improving target specificity in delivering a drug for treatment or the like to a target target. The carrier may be, for example, one or more selected from the group consisting of polymers, organic nanostructures, inorganic nanostructures, organic microstructures, inorganic microstructures, hydrogels, scaffolds, and coating materials, but is not limited thereto.
본 발명에서 전달체는 추가적으로 약물을 함유한 것을 의미할 수 있다.In the present invention, the carrier may mean additionally containing a drug.
본 발명에서 전달체는 이의 유사체를 포함할 수 있다.In the present invention, the carrier may include an analog thereof.
본 발명에서 “유사체”는 특정 유기 무기 또는 고분자 화합물 등을 모체로 하여 작용기 도입, 산화, 환원, 치환 등의 모체의 구조 또는 성질을 크게 변화시키지 않는 범위에 포함되는 화합물을 의미한다.In the present invention, "analog" refers to a compound included in a range that does not significantly change the structure or properties of the parent such as introduction, oxidation, reduction, substitution, etc. of a functional group using a specific organic inorganic or high molecular compound as a parent.
본 발명의 실시예들에 따르면, 전달체는 알부민, 실리카 나노입자(silica nanoparticle, SiNP) 또는 4-arm PEG(4-arm polyethylene glycol)일 수 있다.According to embodiments of the present invention, the carrier may be albumin, silica nanoparticles (SiNP) or 4-arm PEG (4-arm polyethylene glycol).
후술하는 실험예에 따르면, 본 발명의 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 생체 내 환원 조건에서 특이적으로 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있음을 구체적으로 확인하였으며, 림프절로의 특이적 배수 및 축적을 통해 전이성 암에 대한 예방 또는 치료 효과를 가진다는 점을 확인하였다.According to the experimental examples described below, the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug conjugated with the drug, carrier, or drug-containing carrier of the present invention is specifically decomposed under reducing conditions in vivo to release the nitrogen monoxide donor. was specifically confirmed, and it was confirmed that it had a preventive or therapeutic effect on metastatic cancer through specific drainage and accumulation into lymph nodes.
본 발명에서 “알부민”은 간 세포에서 일차적으로 합성되는. 포유류의 혈장에서 가장 풍부한 단백질로서, 혈액 삼투압의 유지, 다양한 기질의 수송 등에 있어서 중요한 역할을 하는 다기능성 혈장 단백질을 의미한다. 알부민은 I, II 및 III의 3개의 도메인을 가지며, 각각의 도메인은 서브도메인 A 및 B로 구성되어 있다. 알부민은 3주의 혈장 반감기를 가지며, 상기 알부민의 긴 반감기는 FcRn(Neonatal Fc receptor)에 의한 알부민의 세포 내 분해와 연관되어 있으며, 알부민의 도메인 I 및 III가 FcRn에 대한 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.In the present invention, "albumin" is synthesized primarily in liver cells. As the most abundant protein in mammalian plasma, it refers to a multifunctional plasma protein that plays an important role in maintaining blood osmotic pressure and transporting various substrates. Albumin has three domains, I, II and III, and each domain is composed of subdomains A and B. Albumin has a plasma half-life of 3 weeks, and the long half-life of albumin is associated with intracellular degradation of albumin by FcRn (Neonatal Fc receptor), and domains I and III of albumin play an important role in binding to FcRn. has been reported
본 발명에서 “알부민 유사체”는 모(parent) 알부민 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 유래된 것으로, 목적하는 특성을 제공하고 있는 부분을 포함하고 있어 모 알부민 단백질 또는 폴리펩타이드와 동일한 또는 유사한 특성을 나타내는 것을 의미한다.In the present invention, "albumin analogue" is derived from a parent albumin protein or polypeptide, and includes a portion that provides the desired properties, so that it exhibits the same or similar properties as the parent albumin protein or polypeptide. .
본 발명에서 알부민 또는 이의 유사체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 면역원성을 회피하기 위해 인간 혈청에서 유래된 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)일 수 있다.In the present invention, albumin or an analog thereof may be derived from any species, and may be human serum albumin (HSA) derived from human serum to avoid immunogenicity.
본 발명에서 전달체로서 알부민 또는 이의 유사체를 사용하는 경우, 기존 개발되어 있는 약물을 물리적으로 함유할 수 있고, 대량 생산 및 생체적합성 측면에서 질병 치료용 약물로 높은 상용화 가능하다.When albumin or an analog thereof is used as a carrier in the present invention, it can physically contain a drug that has been previously developed, and can be highly commercialized as a drug for treating diseases in terms of mass production and biocompatibility.
본 발명에서 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 크기는 치료하고자 하는 질환 또는 전달하고자 하는 조직기관에 따라 적절히 조절할 수 있다. 예를 들어, 특정 암조직으로의 전달을 위해서는 직경을 50-200 nm으로 조절할 수 있으며, 림프절로 전달을 위해서는 직경을 10-100 nm로 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the size of the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug conjugated with the carrier can be appropriately adjusted according to the disease to be treated or the tissue organ to be delivered. For example, the diameter may be adjusted to 50-200 nm for delivery to a specific cancer tissue, and the diameter may be adjusted to 10-100 nm for delivery to a lymph node, but is not limited thereto.
본 발명의 실시예들에 따르면, 전달체로서 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 직경이 10-100 nm일 수 있으며, 바람직하게는 10-20 nm 일 수 있다. 본 발명에서 화합물의 크기가 상기 범위 미만인 경우, 혈관으로 배수되어 목적하는 수준의 림프절로의 특이적 배수를 달성할 수 없을 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 피하 축적으로 인해 목적하는 수준의 림프절로의 특이적 배수를 달성할 수 없을 수 있다.According to embodiments of the present invention, the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound conjugated with albumin as a carrier may have a diameter of 10-100 nm, preferably 10-20 nm. If the size of the compound in the present invention is less than the above range, it may not be able to drain into blood vessels and achieve specific drainage to the desired level of lymph nodes, and if it exceeds the above range, the desired level of lymph nodes due to subcutaneous accumulation It may not be possible to achieve specific drainage into the furnace.
후술하는 실험예에 따르면, 직경이 10-20 nm인, 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물이 크기 의존적으로 림프절로의 배수 및 축적된다는 것을 확인하였다.According to the experimental example to be described later, it was confirmed that the albumin-conjugated reductive nitric oxide donor compound having a diameter of 10-20 nm was drained and accumulated in the lymph nodes in a size-dependent manner.
본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다. The compound represented by
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 약물과 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 약물을 함유한 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다.According to embodiments of the present invention, the compound represented by
상기 화학식 4에서 R3가 약물 또는 약물을 함유한 전달체인 경우, 상기 화합물과 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 약물 또는 약물을 포함하는 전달체의 약물은 본 발명의 화합물에 포함되어 있는 약물과 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 약물일 수 있다.In
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 바람직하게는 전이성 암일 수 있다.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention as an active ingredient. The cancer may preferably be a metastatic cancer.
본 발명의 실시예들에 따르면, 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물, 또는 약물을 함유한 전달체에 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물이 암, 바람직하게는 전이성 암을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다.According to embodiments of the present invention, a reductive nitric oxide donor compound or prodrug conjugated with albumin, or a reductive nitric oxide donor compound or prodrug conjugated to a drug-containing carrier, treats cancer, preferably metastatic cancer. It can be used to prevent or treat.
본 발명에서 “전이성 암”은 암의 성질을 구분하는 용어로, 최초로 종양이 발생한 부위에서 혈관 또는 림프관을 통해 다른 분위로 전이하여 생긴 암종을 의미한다. 암의 근본적인 치료는 원발성 암의 치료와 함께 전이 부위에서의 암의 제어가 중요하다. 전이성 암은 예를 들어, 대장암, 전립선암, 부인과암, 위암, 다발성골수종, 간장암, 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 담관암, 담낭암, 신경아세포종 및 호지킨 림프종 등을 들 수 있다. 또한 특히, 전립선암, 폐암, 대장암 및 부인과암의 일종인 유방암은 골 및 간 등에 전이를 초래하기 쉬운 암으로 알려져 있다. 본 발명에서 전이성 암은 상기 예들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전이하는 성질을 가진 암이라면 모두 포함할 수 있다.In the present invention, “metastatic cancer” is a term that distinguishes the nature of cancer, and refers to a carcinoma that has metastasized to another site through blood vessels or lymphatic vessels from the site where the tumor first occurred. In the fundamental treatment of cancer, it is important to control the cancer at the metastasis site along with the treatment of the primary cancer. Metastatic cancer includes, for example, colorectal cancer, prostate cancer, gynecological cancer, stomach cancer, multiple myeloma, liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, kidney cancer, bile duct cancer, gallbladder cancer, neuroblastoma, and Hodgkin's lymphoma. Also, in particular, breast cancer, which is a type of prostate cancer, lung cancer, colorectal cancer, and gynecological cancer, is known as a cancer that tends to metastasize to bones and liver. In the present invention, metastatic cancer may include the above examples, but is not limited thereto, and any cancer having metastatic properties may be included.
본 발명에서 암의 치료는 예를 들면 치료 전 대비 종양의 성장을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 40% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상 억제하는 것일 수 있다.The treatment of cancer in the present invention may be, for example, inhibiting tumor growth by about 10% or more, about 20% or more, about 40% or more, about 60% or more, or about 80% or more compared to before treatment.
후술하는 실험예에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 종양 세포에 특이적인 세포독성 효과를 나타내었으며, 그 결과 종양 전이를 억제하여 마우스 생존율이 현저하게 연장되었음을 확인하여 본 발명의 화합물이 우수한 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 입증하였다.According to the experimental examples described below, the reductive nitric oxide donor compound of the present invention exhibited a specific cytotoxic effect on tumor cells, and as a result, it was confirmed that the mouse survival rate was significantly prolonged by inhibiting tumor metastasis, so that the compound of the present invention It has been demonstrated that excellent cancer prevention or treatment effects can be exhibited.
또한, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition comprising the reductive nitric oxide donor compound or prodrug of the present invention as an active ingredient can be used for preventing or treating autoimmune diseases, intractable neurological diseases or infectious diseases.
상기 자가면역질환은 예를 들어, 다발성 경화증, 루푸스, 류마티스관절염, 크론병, 1형 당뇨병 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The autoimmune disease may be, for example, multiple sclerosis, lupus, rheumatoid arthritis, Crohn's disease,
상기 난치성신경질환은 원인이 불명하고 치료법이 확립되지 않은 신경 질환의 총칭으로, 예를 들어, 파킨슨병, 루게릭병, 근육병, 소뇌실조증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The intractable neurological disease is a generic term for neurological diseases for which a cause is unknown and a treatment has not been established, and may include, for example, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, myopathy, cerebellar ataxia, and the like, but is not limited thereto.
상기 감염성질환은 예를 들어, B형 간염, C형 간염, 사람유두종바이러스(Human papillomavirus; HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 감염 질환, 인플루엔자 감염 질환, 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 감염 질환, 코로나 바이러스(예를 들어, COVID-19) 감염 질환 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The infectious disease is, for example, hepatitis B, hepatitis C, human papillomavirus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory infection disease, influenza infection disease, human immunodeficiency virus ( Human immunodeficiency virus, HIV) infectious disease, coronavirus (eg, COVID-19) infectious disease, and the like, but are not limited thereto.
본 발명에서 "치료"는 본 발명 조성물의 투여로 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미하며, "예방"은 본 발명 조성물의 투여로 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, "treatment" means any action in which symptoms are improved or cured by administration of the composition of the present invention, and "prevention" means any action of suppressing or delaying symptoms by administration of the composition of the present invention.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있으며, 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있고, 치료하고자 하는 각각의 질환 또는 포함되는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may include an appropriate carrier conventionally used in the preparation of the pharmaceutical composition. The pharmaceutically acceptable carrier may be used in a mixture of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, etc., and if necessary, other conventional agents such as antioxidants, buffers, bacteriostats, etc. Additives may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to form injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets, and these formulations are formulated in the art. It can be prepared by the conventional method used in or by the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (latest edition), Mack Publishing Company, Easton PA, and can be formulated into various formulations according to each disease to be treated or components included. have.
본 발명의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효량의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물이 대상체에 투여되도록 제형화될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated so that a therapeutically effective amount of a reductive nitric oxide donor compound or prodrug is administered to a subject.
본 발명에서 사용되는 “치료학적으로 유효량”은 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 화합물의 양을 나타내며, 치료 유효량 및 예방 유효량을 모두 포함한다."Therapeutically effective amount" as used in the present invention refers to the amount of the compound of the present invention effective for preventing or treating cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease or infectious disease, and includes both a therapeutically effective amount and a prophylactically effective amount.
본 발명에서 "치료 유효량"은 약물 또는 치료제가 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 나타낼 수 있는 약물의 임의의 양을 의미한다. In the present invention, "therapeutically effective amount" refers to a decrease in the severity of disease symptoms, an increase in the frequency and duration of disease symptom-free periods, or damage caused by disease suffering, when the drug or therapeutic agent is used alone or in combination with other therapeutic agents. or any amount of a drug that can show prevention of a disorder.
본 발명에서 "예방 유효량"은 질환 발생 위험이 있는 개체 또는 질환 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 개체에서 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양을 의미한다. 유효량의 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소 등에 따라 결정될 수 있다.In the present invention, "prophylactically effective amount" means any amount of a drug that inhibits the occurrence or recurrence of a disease in an individual at risk of developing a disease or in an individual at risk of suffering from disease recurrence. The level of the effective amount depends on the subject type and severity, age, sex, drug activity, drug sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. can be determined accordingly.
본 발명에 따른 약학조성물에 포함되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 함량은 치료하고자 하는 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라 적절히 조절 가능하다. 예를 들어, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 70 중량%, 1 내지 60 중량%, 또는 1 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.The content of the reductive nitric oxide donor compound or prodrug contained in the pharmaceutical composition according to the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease to be treated, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, and the like. For example, it may be included in an amount of 0.0001 to 99.9% by weight, 0.1 to 90% by weight, 1 to 80% by weight, 1 to 70% by weight, 1 to 60% by weight, or 1 to 50% by weight based on the total weight of the composition. .
본 발명에서 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 조성물을 개체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. As used herein, "administration" refers to the physical introduction of a composition to a subject using any of a variety of methods and delivery systems known to those of ordinary skill in the art.
본 발명의 약학적 조성물을 위한 투여 경로는 모든 투여 경로를 포함한다. 바람직하게는, 비경구 투여일 수 있으며, 예를 들어 정맥, 피하, 복강, 종양 내 주사 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함하며, 바람직하게는 주사에 의한 투여 경로일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The route of administration for the pharmaceutical composition of the present invention includes all routes of administration. Preferably, it may be parenteral administration, including, for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intratumoral injection, or other parenteral administration routes, preferably by injection, but is not limited thereto.
본 발명의 조성물을 위한 투여 횟수는 예를 들어 1회, 복수 회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.The number of administrations for the composition of the present invention may be, for example, one, multiple, and/or one or more extended periods of time.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 개체의 질환 발병 정도에 따라 본 발명의 조성물 또한, 그 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 특히 환자가 갖는 질환의 발병 정도 등에 따라 증감될 수 있다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, specifically, the composition of the present invention according to the degree of disease onset of the individual, and the dosage may vary depending on the route of administration, the degree of the disease, the sex , body weight, age, in particular, the degree of onset of a disease of the patient may be increased or decreased according to the.
또한, 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. In addition, the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents. When administered in combination with another therapeutic agent, the composition of the present invention and the other therapeutic agent may be administered sequentially or simultaneously.
본 발명에서 병용 투여되는 다른 치료제는 종래 치료효과를 나타내는 치료제라면 제한없이 병용 투여될 수 있다. 암의 퇴행을 촉진하거나 또는 추가로 종양 성장을 방지하는 화합물, 단백질 등의 약물일 수 있으며, 방사선 치료 등 약물 요법 이외의 기타 항암 요법을 모두 포함한다. 또한, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 치료하기 위한 약물일 수 있다. The other therapeutic agents to be administered in combination in the present invention may be administered in combination without limitation as long as they are therapeutic agents showing conventional therapeutic effects. It may be a drug such as a compound or protein that promotes cancer regression or further prevents tumor growth, and includes all other anti-cancer therapies other than drug therapy, such as radiation therapy. In addition, it may be a drug for treating an autoimmune disease, an intractable neurological disease, or an infectious disease.
본 발명의 화합물은 상기 치료제들과 병용투여 되어 종래 치료제의 치료 효과를 현저히 증가시키는 역할을 할 수 있다.The compound of the present invention may serve to significantly increase the therapeutic effect of conventional therapeutic agents when administered in combination with the above therapeutic agents.
상기 병용 투여되는 치료제는 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.For the therapeutic agent to be administered in combination, the route of administration, administration timing, and dosage may be determined according to the type of disease, the disease state of the patient, the purpose of treatment or prevention, and other drugs or physiologically active substances used in combination.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물을 싸이올기를 함유하고 있는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 반응시키는 단계를 포함하는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a drug, a carrier, or a drug-containing carrier is conjugated reduction comprising the step of reacting the compound of
[화학식 1][Formula 1]
여기서,here,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 피리딘-2-일이다.R 2 is straight or branched C1-C10 alkyl; or substituted or unsubstituted pyridin-2-yl.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는, R1은 C2 알킬렌이며, R2는 피리딘-2-일인 화합물일 수 있다.The reductive nitrogen monoxide donor compound represented by
[화학식 2][Formula 2]
본 발명의 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법에는 당업자에게 자명한 수준으로 변형된 제조방법도 이에 포함된다.The method for preparing the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug conjugated to the drug, carrier, or drug-containing carrier of the present invention includes a method modified to a level apparent to those skilled in the art.
본 발명의 화학식 1 또는 2의 화합물은 산화환원-반응에 의한 일산화산소 방출능을 상실하지 않으면서도 유기 또는 무기 물질과 높은 수율로 접합이 가능하다.The compound of
본 발명의 실시예들에 따르면, 2-피리딜 디설파이드(2-pyridyl disulfide) 모이어티는 SISIN-1에 도입되어 싸이올 교환 반응을 통해 다양한 싸이올기를 가진 물질과의 접합할 수 있는 우수한 이탈기 역할을 할 수 있다. According to embodiments of the present invention, a 2-pyridyl disulfide moiety is introduced into SISIN-1 and an excellent leaving group capable of conjugation with a material having various thiol groups through a thiol exchange reaction can play a role
후술하는 실험예에 따르면, 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 전구약물은 일산화질소 공여자의 방출할 수 있는 화합물 구조에 영향을 주지 않으면서도, 싸이올(tiol)기를 가진 물질과 간단하고 손쉬운 방법을 통해 온화한 조건(under mild conditions)에서도 고효율로 쉽게 접합할 수 있음을 확인하였다.According to the experimental examples to be described later, the compound or prodrug of
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or treating cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease or infectious disease by administering the reductive nitric oxide donor compound or prodrug of the present invention to mammals including humans. do.
본 발명의 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 화합물 또는 전구약물을 투여함으로써, 징후의 발현 전에 질병 그 자체를 다룰 뿐만 아니라, 이의 징후를 저해하거나 피하는 것을 포함한다.The method of the present invention for preventing or treating cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease, or infectious disease, by administering the compound or prodrug of the present invention, not only treats the disease itself before the onset of symptoms, but also inhibits or treats the symptoms including avoiding.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 용도를 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a use of the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention in the manufacture of a medicament.
의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물은 허용가능한 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.The compound of the present invention for the manufacture of a medicament may be admixed with acceptable adjuvants, diluents, carriers, etc., and may be prepared as a complex formulation together with other active agents to have a synergistic action of the active ingredients.
본 발명의 화합물, 약학적 조성물, 치료방법 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 이상 동일하게 적용되며, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 반복기재를 생략하였다.Matters mentioned in the compounds, pharmaceutical compositions, treatment methods and uses of the present invention are equally applied unless they contradict each other, and repeated descriptions are omitted to avoid excessive complexity of the specification.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 일산화질소를 방출하므로 질병 부위에 선택적인 약리 작용을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 전구약물이 치료 표적 외에 다른 기관에 작용하여 의도하지 않은 유해효과가 나타나는 것을 방지할 수 있다.Since the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention selectively releases nitrogen monoxide under reducing conditions in vivo, it can exhibit selective pharmacological action on diseased sites. In addition, it is possible to prevent the compound or prodrug of the present invention from acting on organs other than the therapeutic target, resulting in unintended adverse effects.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있으며, 연구용 시료로도 생산 및 판매가 가능하다.The reductive nitric oxide donor compound or prodrug of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, autoimmune disease, intractable neurological disease, or infectious disease, and can be produced and sold as a research sample.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 환원반응성에 의한 일산화질소 공여능을 잃지 않으면서도 약물, 전달체 또는 약물을 함유하고 있는 전달체에 손쉽게 높은 수율로 접합이 가능하며, 이로 인해 종래의 치료 약물 및 SISIN-1의 약리 효과를 높일 수 있어 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.The reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by
또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 일산화질소 공여자로서 SIN-1을 포함하고 있는 종래의 일산화질소 공여체와 달리 자발적으로 분해되지 않으므로 보관 및 운반이 용이하다.In addition, the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by
도 1은 산화환원으로 유발된 자가-희생에 의한 환원반응성 일산화질소 공여 화합물(prodrug) 및 전달 시스템에 관한 것이다.
구체적으로 도 1a는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물(SISIN-1) 및 응용(전달체와의 접합)에 대한 개략도 및 산화환원으로 유발된 자가-희생에 의한 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 단편화되는 메커니즘을 나타낸 것이다.
도 1b는 전이성 암 치료를 위한 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 림프 전달 및 치료 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1 합성의 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 단편화에 대한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 단편화에 대한 질량 스펙트럼(ESI+)을 나타낸 것이다. 171.08 및 275.08 m/z의 주요 피크는 각 물질의 전체 분자를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 NO 방출능을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 6a는 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 NO 방출에 대한 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6b는 Griess 분석에 의해 NO 방출을 정량화한 것이다.
도 7은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 AL-SISIN-1의 제조방법 및 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 7a는 AL-SISIN-1의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 7b는 AL-SISIN-1의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7c는 동적광산란광도계(DLS)에 의해 결정된 평균 유체 역학적 크기 및 표면전하를 나타낸 것이다. 수득된 AL-SISIN-1은 크기가 10.6±0.5 nm로 균일하게 분포되어 있음을 확인할 수 있다.
도 7d는 알부민, 유리 SISIN-1 및 AL-SISIN-1의 UV/Vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸다. 빨간색 화살표는 SISIN-1(310nm)의 특성 흡광도를 나타낸다.
도 7e 및 7f는 각각 사중극-비행시간차 질량분석법(ESI-Q-TOF MS) 의해 획득된 고분해능 질량스팩트럼(ESI+) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-TOF MS)에 의한 질량스펙트럼을 나타낸 것으로 AL-SISIN-1의 접합 효율을 정량적으로 나타낸 것이다. 본 질량분석법들을 통해 AL-SISIN-1이 알부민에 비해 273 g/mol 만큼 질량이 증가함을 확인하고, 알부민 1개당 1개의 SISIN-1이 접합됨을 확인하였다(접합된 SISIN-1의 이론적 값, 272.3 g/mol).
도 7g는 GSH 처리 후 AL-SISIN-1의 UV/Vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7h는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 AL-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SiNP-SISIN-1의 제조방법 및 특성을 나타낸 것으로, 무기 전달체와의 응용 가능성을 보여준다.
구체적으로 도 8a는 SiNP-SISIN-1의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 8b는 SiNP-SISIN-1의 대표적인 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 8c는 SiNP-SISIN-1의 에너지분산형 X선 분광법(EDS)을 통한 성분 분석을 나타낸 이미지이다. 파란색, 분홍색, 빨간색 및 녹색은 각각 실리콘, 황, 산소 및 질소를 나타낸다.
도 8d는 KBr 펠릿에서 SiNP-SH 및 SiNP-SISIN-1의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8e는 열중량분석(Thermogravimetric analysis, TGA) 곡선을 나타낸 것이다. SISIN-1은 전체의 3.2 질량%를 차지한다.
도 8f는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 SiNP-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 4-arm PEG-SISIN-1의 특성을 나타낸 것으로, 유기 및 고분자 기반 전달체와의 응용 가능성을 보여준다.
구체적으로 도 9a는 4-arm PEG-SISIN-1의 합성 경로를 나타낸 것이다.
도 9b는 4-arm PEG-SISIN-1의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 4-arm PEG-SISIN-1의 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 10a는 4-arm PEG-SH 및 4-arm PEG-SISIN-1의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10b는 4-arm PEG-SH 및 4-arm PEG-SISIN-1의 GPC 프로파일을 나타낸다. 상대 분자량은 용리액 시스템으로 THF를 사용하는 폴리스티렌 스탠다드(polystyrene standards)와 비교하여 결정하였다.
도 10c는 KBr 펠릿에서 SiNP-SH 및 SiNP-SISIN-1의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10d는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 4-arm PEG-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 11은 SISIN-1-OH의 제조방법 및 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로, 도 11a는 SISIN-1-OH의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 11b는 SISIN-1-OH의 1H NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 12는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 SISIN-1-OH의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 13은 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 통해 확인한 화합물의 크기에 따른 림프 배수(lymphatic-drainage) 및 NO 공여능을 DAF-2 DA을 사용한 배수 림프절의 ex vivo 이미지를 나타낸 것이다.
도 14는 AL-SISIN-1의 림프 배수, 생체 분포 및 NO 공여능을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 14a는 크기에 따른 본 발명의 화합물의 림프 배수 및 축적의 개략도를 나타낸 것이다.
도 14b는 AF647가 표지된 AL-SISIN-1(AF647-AL-SISIN-1)에 대한 시간 경과에 따른 림프 축적 및 생체 분포의 생체 내 이미징 시스템(IVIS) 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 14c는 AF647-AL-SISIN-1의 시료 처리 4시간 및 24시간 후 림프절, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 및 장을 포함한 적출된 주요 기관의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도면에 표시된 원은 배수 림프절을 나타낸다.
도 14c는 Nitrite/Nitrate Assay Kit를 이용한 혈청 내 NOx 수준의 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 14e는 마우스 발 조직에 샘플을 피하투여 후, 림프절로의 배수를 나타낸 것이다.
도 15는 AF647-AL-SISIN-1의 시간 경과에 따른 림프에의 축적 및 생체 분포를 나타낸 생체 내 형광 이미지이다.
도 16은 용혈 분석(hemolysis assay)를 이용하여 본 발명의 화합물의 혈액 적합성을 확인한 것이다.
도 17a는 샘플처리 후 8주령 BALB/c 암컷 마우스로부터 적출된 비장 사진을 나타낸 것이다.
도 17b는 비장/체중 비율을 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 18은 8주령 BALB/c 암컷 마우스에 AL-SISIN-1 투여 3일 후 주요 기관 조직의 절편을 수집 후 유의한 형태학적 변화 여부를 확인한 것이다.
도 19a는 알부민, SISIN-1-OH 및 AL-SISIN-1 처리 후 B16-F10 전이성 암 세포주의 공 초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 세포 내 NO 및 핵은 각각 DAF-2 DA(녹색) 및 DAPI(파란색)로 염색되었으며, 스케일 바는 100 μm이다.
도 19b는 B16-F10에서 유리 SIN-1, SISIN-1-OH, 알부민 및 AL-SISIN-1의 용량 의존적 항암 효과를 나타낸 것이다.
도 19c는 MTS 분석에 의한 AL-SISIN-1 처리 48 시간 후 다양한 배양 세포에서의 상대 세포 생존율(%)을 나타낸 것이다.
도 20은 전이성 암 모델에서 항-전이 효과 확인한 것을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 20a는 전체 실험의 타임라인을 나타낸 것이다.
도 20b는 샘플 처리 후 생존율(morbidity-free survival) 확인한 것이다.
도 20c는 샘플 처리 후 마우스로부터 적출된 종양 배수 림프절(TDLN)의 사진을 나타낸 것이다.
도 20d는 림프절 비대의 정량화 결과(TDLN/체중)를 나타낸 것이다.
도 20e는 H&E 염색을 사용한 조직학적 분석을 통해 본 발명의 화합물이 전이성 암에 대해 항-전이성을 갖는다는 점을 확인한 것이다.
도 20f는 본 발명의 화합물을 처리한 전이성 암 모델에서의 TDLN과 암 모델이 아닌 일반 마우스에서 적출한 림프절을 비교한 것이다.
도 20g는 H&E 염색을 사용한 조직학적 분석을 통해 폐조직으로의 전이를 평가한 것을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 화합물이 림프절로의 전이를 억제할 수 있는지 여부를 확인한 이미지이다. 빨간색 화살표는 확대된 종양 배수 림프절을 나타낸다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 relates to a redox-induced self-sacrificing, reductive nitric oxide donor prodrug and delivery system.
Specifically, Figure 1a is a schematic diagram of a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug (SISIN-1) and application (conjugation with a carrier) of the present invention and a redox-induced self-sacrifice reductive nitrogen monoxide donor compound or a mechanism by which the prodrug is fragmented.
1B is a schematic diagram of the lymphatic delivery and treatment process of the reductive nitric oxide donor compound or prodrug of the present invention for the treatment of metastatic cancer.
Figure 2 shows the synthesis route of the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug SISIN-1 of the present invention.
Figure 3 shows 1 H NMR spectrum of the compound obtained in each step of the synthesis of the reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug SISIN-1 of the present invention.
4 shows a 1 H NMR spectrum for self-immolative fragmentation induced by redox reaction of SISIN-1, a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention.
5 shows the mass spectrum (ESI+) of the self-immolative fragmentation induced by the redox reaction of SISIN-1, which is a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention. The main peaks at 171.08 and 275.08 m/z represent the total molecule of each substance.
6 shows the NO release ability induced by the redox reaction of the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug SISIN-1 of the present invention.
Specifically, Figure 6a shows the UV-Vis spectrum for NO emission induced by the redox reaction of SISIN-1.
Figure 6b quantification of NO release by Griess analysis.
7 shows the preparation method and characteristics of AL-SISIN-1, which is a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention.
Specifically, FIG. 7a shows a method for preparing AL-SISIN-1.
7b shows a TEM image of AL-SISIN-1.
Figure 7c shows the average hydrodynamic size and surface charge determined by dynamic light scattering spectroscopy (DLS). It can be confirmed that the obtained AL-SISIN-1 is uniformly distributed with a size of 10.6±0.5 nm.
7D shows UV/Vis absorbance spectra of albumin, free SISIN-1 and AL-SISIN-1. The red arrow indicates the characteristic absorbance of SISIN-1 (310 nm).
7e and 7f show high-resolution mass spectra (ESI+) obtained by quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (ESI-Q-TOF MS) and mass spectra by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF MS), respectively. This is a quantitative representation of the conjugation efficiency of AL-SISIN-1. Through these mass spectrometry methods, it was confirmed that the mass of AL-SISIN-1 increased by 273 g/mol compared to albumin, and it was confirmed that one SISIN-1 was conjugated per albumin (theoretical value of conjugated SISIN-1, 272.3 g/mol).
Figure 7g shows the UV/Vis absorbance spectrum of AL-SISIN-1 after GSH treatment.
7h shows the cumulative NO release profile of AL-SISIN-1 under various physiological conditions analyzed by Griess assay.
8 shows the preparation method and characteristics of SiNP-SISIN-1, which is a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention, and shows the possibility of application with an inorganic carrier.
Specifically, FIG. 8a shows a manufacturing method of SiNP-SISIN-1.
8B shows a representative TEM image of SiNP-SISIN-1.
8c is an image showing the component analysis of SiNP-SISIN-1 through energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS). Blue, pink, red and green represent silicon, sulfur, oxygen and nitrogen, respectively.
Figure 8d shows the FT-IR spectra of SiNP-SH and SiNP-SISIN-1 in KBr pellets.
Figure 8e shows a thermogravimetric analysis (TGA) curve. SISIN-1 occupies 3.2 mass % of the total.
Figure 8f shows the cumulative NO release profile of SiNP-SISIN-1 under various physiological conditions analyzed by Griess assay.
9 shows the properties of 4-arm PEG-SISIN-1, which is a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention, and shows the possibility of application with organic and polymer-based carriers.
Specifically, Figure 9a shows the synthetic route of 4-arm PEG-SISIN-1.
Figure 9b shows the 1 H NMR spectrum of 4-arm PEG-SISIN-1.
10 shows the properties of 4-arm PEG-SISIN-1, which is a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug of the present invention.
Specifically, Figure 10a shows the MALDI-TOF mass spectrum of 4-arm PEG-SH and 4-arm PEG-SISIN-1.
10B shows the GPC profiles of 4-arm PEG-SH and 4-arm PEG-SISIN-1. Relative molecular weight was determined by comparison with polystyrene standards using THF as the eluent system.
Figure 10c shows the FT-IR spectra of SiNP-SH and SiNP-SISIN-1 in KBr pellets.
Figure 10d shows the cumulative NO release profile of 4-arm PEG-SISIN-1 in various physiological conditions analyzed by Griess assay.
11 shows the preparation method and characteristics of SISIN-1-OH.
Specifically, FIG. 11a shows a method for preparing SISIN-1-OH.
11b shows 1 H NMR data of SISIN-1-OH.
12 shows the cumulative NO release profile of SISIN-1-OH under various physiological conditions analyzed by Griess assay.
13 shows ex vivo images of draining lymph nodes using DAF-2 DA for lymphatic-drainage and NO donating ability according to the size of the compound identified through the in vivo imaging system (IVIS).
14 shows lymphatic drainage, biodistribution and NO donating ability of AL-SISIN-1.
Specifically, Figure 14a shows a schematic diagram of lymphatic drainage and accumulation of compounds of the present invention as a function of size.
14B shows in vivo imaging system (IVIS) fluorescence images of lymphatic accumulation and biodistribution over time for AF647-labeled AL-SISIN-1 (AF647-AL-SISIN-1).
14C shows fluorescence images of major organs, including lymph nodes, heart, lungs, liver, spleen, kidneys and intestines, after 4 and 24 hours of sample treatment with AF647-AL-SISIN-1. Circles indicated in the figure indicate draining lymph nodes.
Figure 14c shows the quantification of the NOx level in serum using the Nitrite / Nitrate Assay Kit.
14E shows drainage into lymph nodes after subcutaneous administration of a sample to mouse paw tissue.
15 is an in vivo fluorescence image showing the accumulation and biodistribution of AF647-AL-SISIN-1 in lymph over time.
16 shows the blood compatibility of the compounds of the present invention using a hemolysis assay.
17A shows a photograph of a spleen extracted from an 8-week-old BALB/c female mouse after sample treatment.
Figure 17b shows the quantification of the spleen/weight ratio.
FIG. 18 shows whether or not significant morphological changes were confirmed after collecting sections of
19A shows confocal microscopy images of the B16-F10 metastatic cancer cell line after treatment with albumin, SISIN-1-OH and AL-SISIN-1. Intracellular NO and nuclei were stained with DAF-2 DA (green) and DAPI (blue), respectively, and the scale bar is 100 μm.
Figure 19b shows the dose-dependent anticancer effect of free SIN-1, SISIN-1-OH, albumin and AL-SISIN-1 in B16-F10.
Figure 19c shows the relative cell viability (%) in various cultured cells after 48 hours of AL-SISIN-1 treatment by MTS analysis.
20 shows the confirmation of the anti-metastatic effect in the metastatic cancer model.
Specifically, FIG. 20A shows the timeline of the entire experiment.
Figure 20b is a confirmation of the survival rate (morbidity-free survival) after sample treatment.
20C shows photographs of tumor draining lymph nodes (TDLNs) excised from mice after sample treatment.
20D shows the results of quantification of lymph node enlargement (TDLN/body weight).
20E is a histological analysis using H&E staining to confirm that the compound of the present invention has anti-metastatic properties for metastatic cancer.
20f is a comparison between TDLN in a metastatic cancer model treated with the compound of the present invention and lymph nodes extracted from a normal mouse that is not a cancer model.
20g shows the evaluation of metastasis to lung tissue through histological analysis using H&E staining.
21 is an image confirming whether the compound of the present invention can inhibit metastasis to lymph nodes. Red arrows indicate enlarged tumor draining lymph nodes.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of Examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by these examples. In addition, it should be understood that terms not specifically defined in this specification have meanings commonly used in the technical field to which the present invention pertains.
본 명세서에 기재되어 있는 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었으며, 각 조건은 3회 이상 분석하였다. 통계학적 분석은 Prism 소프트웨어 패키지로 수행되었으며, 결과는 평균±표준편차(SD) 또는 평균±평균 표준오차(SEM)로 표시되었다. 단방향 또는 양방향 ANOVA 테스트는 표시되지 않는 한 다중 비교에 대한 통계적 차이를 얻기 위해 사용되었다. 표적샘플은 #으로 표시되고 대조군과 비교되었으며, 두 집단의 차이 분석을 위해 Student's t-test를 사용하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; n.s. 유의미한 차이가 나타나지 않음).All experiments described herein were repeated at least 3 times, and each condition was analyzed at least 3 times. Statistical analysis was performed with the Prism software package, and the results were expressed as mean ± standard deviation (SD) or mean ± mean standard error (SEM). One-way or two-way ANOVA tests were used to obtain statistical differences for multiple comparisons unless indicated. The target sample was marked with # and compared with the control group, and Student's t-test was used to analyze the difference between the two groups (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; n.s. There was no significant difference. not).
실시예Example 1. One. SISINSISIN -1의 합성Synthesis of -1
(1) (One) SISINSISIN -1의 합성Synthesis of -1
SISIN-1의 합성의 각 단계는 하기와 같으며, 화합물의 합성경로는 도 2에 나타내었다. 또한, 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 스펙트럼은 도 3에 나타내었다.Each step of the synthesis of SISIN-1 is as follows, and the synthesis route of the compound is shown in FIG. 2 . In addition, 1 H NMR spectrum of the compound obtained in each step is shown in FIG. 3 .
단계 1: 화합물 1의 합성Step 1: Synthesis of
2,2'-디싸이오디피리딘(2,2'dithiodipyridine)(4000 mg, 18.16 mmol)을 50 mL 메탄올에 용해시킨 용액에 210 μL의 빙초산을 첨가하고 교반하였다. 그 다음 교반된 용액에 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(848.9 μL, 12.10 mmol)을 적가하고, 실온에서 밤새도록 격렬히 교반하였다.To a solution of 2,2'-dithiodipyridine (4000 mg, 18.16 mmol) dissolved in 50 mL methanol, 210 μL of glacial acetic acid was added and stirred. Then, 2-mercaptoethanol (848.9 μL, 12.10 mmol) was added dropwise to the stirred solution, and stirred vigorously at room temperature overnight.
이후, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)로 반응이 완료된 것을 확인하고, 과량의 유기용매를 감압 하에 증발시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피(용리액은 에틸 아세테이트(EA):헥산(hexane)=80:20)를 통해 정제하여, 담황색 오일의 화합물 1을 수득하였다(1772 mg, 수율: 78.2%).After that, after confirming that the reaction is complete by thin layer chromatography (TLC), the excess organic solvent is evaporated under reduced pressure, and silica gel chromatography (eluent is ethyl acetate (EA): hexane = 80: 20) to give
[화합물 1][Compound 1]
1H NMR(500 MHz, CDCl3, 25℃, δ8.51(ddd, J = 5.0, 1.7, 0.9 Hz, 1H), 7.58(ddd, J = 8.0, 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.40(dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.16(ddd, J = 7.4, 5.0, 1.0 Hz, 1H), 5.71(t, J = 7.1 Hz, 1H), 3.81(td, J = 7.0, 5.2 Hz, 2H), 3.00 - 2.91(m, 2H). 1 H NMR (500 MHz, CDCl3, 25°C, δ8.51 (ddd, J = 5.0, 1.7, 0.9 Hz, 1H), 7.58 (ddd, J = 8.0, 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.40 (dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.16 (ddd, J = 7.4, 5.0, 1.0 Hz, 1H), 5.71 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 3.81 (td, J = 7.0, 5.2 Hz, 2H) ), 3.00 - 2.91 (m, 2H).
단계 2: 화합물 2의 합성Step 2: Synthesis of
상기 단계 1에서 수득한 화합물 1(1.50 g, 8.00 mmol) 및 DMAP(4-dimethylaminopyridine)(1.96 g, 16.0 mmol)을 50 mL의 무수 디클로로메탄(dichloromethane, DCM)에 용해시킨 냉각된(ice bath) 용액에 4-니트로페닐 클로로포메이트(4-nitrophenyl chloroformate)(3.23 g, 16.0 mmol)를 첨가하였다. 그리고 질소 분위기 하에서 밤새도록 반응을 수행하여 서서히 실온에 도달하도록 하였다.Compound 1 (1.50 g, 8.00 mmol) and DMAP (4-dimethylaminopyridine) (1.96 g, 16.0 mmol) obtained in
이후, 박층 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인하고, 과량의 유기용매를 감압 하에 증발시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피(용리액은 DCM)를 통해 정제하여, 담황색 액체의 화합물 2를 수득하였다(2507 mg, 수율: 88.8%).After confirming that the reaction was completed by thin layer chromatography, the excess organic solvent was evaporated under reduced pressure, and then purified through silica gel chromatography (eluent was DCM) to obtain
[화합물 2][Compound 2]
1H NMR(500 MHz, CDCl3, 25℃, δ8.51 - 8.48(m, 1H), 8.31 - 8.26(m, 1H), 7.70 - 7.62(m, 1H), 7.41 - 7.36(m, 1H), 7.12(ddd, J = 6.7, 4.8, 1.8 Hz, 1H), 4.57(t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.16(t, J = 6.4 Hz, 1H). 1 H NMR (500 MHz, CDCl3, 25°C, δ8.51 - 8.48 (m, 1H), 8.31 - 8.26 (m, 1H), 7.70 - 7.62 (m, 1H), 7.41 - 7.36 (m, 1H), 7.12 (ddd, J = 6.7, 4.8, 1.8 Hz, 1H), 4.57 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.16 (t, J = 6.4 Hz, 1H).
단계 3: SISIN-1의 합성 및 특성 확인Step 3: Synthesis and characterization of SISIN-1
3-몰포리노시드노니민 하이드로클로라이드(3-morpholinosydnonimine hydrochloride, SIN-1)(300 mg, 1.45 mmol) 및 중탄산 나트륨(150 mg, 1.78 mmol)을 2.5 mL의 수성 시스템에서 혼합하였다. 그리고 화합물 2(394 mg, 1.12 mmol)를 5 mL 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 용액에 상기 제조된 혼합물을 첨가한 후, 실온에서 4 시간 동안 격렬하게 교반 하였다.3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1) (300 mg, 1.45 mmol) and sodium bicarbonate (150 mg, 1.78 mmol) were mixed in a 2.5 mL aqueous system. Then, the prepared mixture was added to a solution of compound 2 (394 mg, 1.12 mmol) in 5 mL tetrahydrofuran (THF), followed by vigorous stirring at room temperature for 4 hours.
이후, 박층 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인하고, THF를 증발시키고 남은 수성상(aqueous phase)을 DCM으로 추출, 건조, 여과 및 회전 증발시켰다. Then, it was confirmed that the reaction was completed by thin layer chromatography, THF was evaporated, and the remaining aqueous phase was extracted with DCM, dried, filtered and rotary evaporated.
이후, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(정지상: neutral aluminum oxide, 용리액 시스템: 1% methanol in DCM)를 통해 정제하여 아이보리 점착성(sticky) 액체 SISIN-1를 수득하였다(377 mg, 수율: 88.1%).Then, the residue was purified by column chromatography (stationary phase: neutral aluminum oxide, eluent system: 1% methanol in DCM) to give ivory sticky liquid SISIN-1 (377 mg, yield: 88.1%).
[SISIN-1][SISIN-1]
1H NMR(600 MHz, CDCl3, 25℃, δ8.47(d, J = 4.6 Hz, 1H), 7.77(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.74(s, 1H), 7.67(dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.09(dd, J = 7.3, 4.9 Hz, 1H), 4.39(t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.02 - 3.96(m, 4H), 3.59 - 3.52(m, 4H), 3.12(t, J = 6.6 Hz, 2H). 1 H NMR (600 MHz, CDCl3, 25°C, δ8.47 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.67 (dd, J) = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 7.3, 4.9 Hz, 1H), 4.39 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.02 - 3.96 (m, 4H), 3.59 - 3.52 (m, 4H), 3.12 (t, J = 6.6 Hz, 2H).
(2) (2) SISINSISIN -1의 산화환원에 의해 유발된 단편화 확인Confirmation of fragmentation induced by redox of -1
상기 제조된 SISIN-1의 환원 조건 하에서 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커에 의한 단편화는 1H NMR 및 질량분석(ESI+)를 통해 확인하였다.Fragmentation by the self-immolative linker induced by the redox reaction under reducing conditions of the prepared SISIN-1 was confirmed by 1 H NMR and mass spectrometry (ESI+).
구체적으로 2 당량의 dithiothreitol(DTT, 환원제)을 CDCl3에서 SISIN-1로 처리하고 실온에서 밤새 배양한 후, 1H NMR을 통해 SISIN-1의 자가-희생 링커에 의한 단편화 확인하였으며, 1H NMR 스펙트럼은 도 4에 나타내었다.Specifically, 2 equivalents of dithiothreitol (DTT, reducing agent) was treated with SISIN-1 in CDCl 3 and incubated overnight at room temperature. Fragmentation of SISIN-1 by a self-immolative linker was confirmed through 1 H NMR, and 1 H NMR The spectrum is shown in FIG. 4 .
또한, 5 당량의 dithiothreitol(DTT, 환원제)를 아세토니트릴에서 SISIN-1에 처리하고 배양한 후 반응을 모니터링하였으며, 질량분석(ESI+) 스펙트럼은 도 5에 나타내었다.In addition, 5 equivalents of dithiothreitol (DTT, reducing agent) was treated with SISIN-1 in acetonitrile and the reaction was monitored after incubation, and the mass spectrometry (ESI+) spectrum is shown in FIG. 5 .
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 SISIN-1는 환원 조건 하에서 자가-희생 링커의 자발적인 분자 내 반응을 통해 단편화가 가능하며 이를 통해 일산화질소 공여자를 방출할 수 있다는 점을 확인하였다.As can be seen from the above results, it was confirmed that the SISIN-1 of the present invention can be fragmented through a spontaneous intramolecular reaction of a self-immolative linker under reducing conditions, thereby releasing the nitric oxide donor.
(3) NO (3) NO 방출능Emissivity 확인 Confirm
SISIN-1의 환원 조건 하에서 산화환원에 의해 유발된 NO 방출능은 UV-Vis 분광분석법을 통해 확인하였다. The ability to release NO induced by redox under reducing conditions of SISIN-1 was confirmed by UV-Vis spectroscopy.
구체적으로 2 mM GSH를 SISIN-1에 처리하고 37℃에서 2시간 동안 5% DMSO를 포함한 증류수에서 2mM GSH와 함께 배양하였다. 이후 UV-Vis 분광광도계를 통해 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 6a에 나타내었다.Specifically, 2 mM GSH was treated with SISIN-1 and incubated with 2 mM GSH in distilled water containing 5% DMSO at 37° C. for 2 hours. Thereafter, absorbance was measured using a UV-Vis spectrophotometer, and the results are shown in FIG. 6A .
또한, NO 방출량은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 SISIN-1(50 μM) 접종하고, 밤새도록 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 6b에 나타내었다.In addition, the amount of NO released was quantitatively determined by the Griess method. Inoculate SISIN-1 (50 µM) in DMEM (50 µM, 1.5 mL) under various physiological conditions (50 g/L serum, extracellular (20 µM, GSH) and intracellular (2 mM, GSH)) at 37 °C. , after overnight incubation, transferred to 96-well plates and stored at -70°C. The cumulative amount of NO in each solution was quantified by comparing the absorbance at 548 nm with a standard curve indicated by NaNO 2 , and the cumulative NO release profile of SISIN-1 is shown in FIG. 6b .
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서 SISIN-1 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 혈액과 피부를 포함한 전신 조직의 세포 외 환경에서 유리 싸이올 함유 생체 분자의 잠재적인 간섭을 고려할 때, SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다.As can be seen from the above results, SISIN-1 was degraded under reducing conditions, and much higher amounts of NO were released under intracellular (2 mM, GSH) conditions. In addition, in serum (50 g/L) or extracellular (20 μM, GSH) conditions, NO emission was negligible. This indicates that SISIN-1 may have adequate stability after administration, considering the potential interference of free thiol-containing biomolecules in the extracellular environment of systemic tissues including blood and skin, and specifically It has been confirmed that it is possible to emit
실시예 2. AL-SISIN-1의 합성 및 특성 확인Example 2. Synthesis and Characterization of AL-SISIN-1
(1) AL-SISIN-1의 합성(1) Synthesis of AL-SISIN-1
AL-SISIN-1의 제조과정은 하기와 같으며, 본 발명의 SISIN-1을 이용한 AL-SISIN-1의 제조방법, 상기 제조된 AL-SISIN-1의 TEM 이미지, 동적광산란광도계(DLS)에 의해 결정된 평균 유체 역학적 크기 및 표면전하, UV/Vis 흡광도 스펙트럼, 사중극-비행시간차 질량분석법(ESI-Q-TOF MS)에 의해 획득된 고분해능 질량스팩트럼(ESI+) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-TOF MS)에 의한 결과는 도 7에 나타내었다.The manufacturing process of AL-SISIN-1 is as follows, and the manufacturing method of AL-SISIN-1 using SISIN-1 of the present invention, the TEM image of the prepared AL-SISIN-1, and dynamic light scattering spectrophotometer (DLS) mean hydrodynamic size and surface charge determined by the UV/Vis absorbance spectra, high-resolution mass spectra (ESI+) acquired by quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (ESI-Q-TOF MS) and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry The results by (MALDI-TOF MS) are shown in FIG. 7 .
투석 전 알부민(648 mg, 9.76 μmol)을 15 mL 포스페이트 완충액(0.1 M, pH 7.5)에 용해시킨 용액에 실시예 1에서 제조된 SISIN-1(4.86 mg, 12.7 μmol)을 용해시키고, 실온에서 밤새도록 격렬하게 교반하였다.Before dialysis, SISIN-1 (4.86 mg, 12.7 μmol) prepared in Example 1 was dissolved in a solution of albumin (648 mg, 9.76 μmol) in 15 mL phosphate buffer (0.1 M, pH 7.5), and overnight at room temperature. It was stirred vigorously.
이후, UV-Vis 분광분석법을 통해 흡광도를 측정하여 반응완료를 확인하고, 반응 혼합물을 30 kDa 분자량 차단 Amicon®ultra centrifugal filter로 옮기고 4,000 rpm, 25℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 그리고 상층액을 증류수로 3회 세척, 수집 및 동결건조하여 AL-SISIN-1(510 mg, 수율: 78.2%)을 수득하였다.Thereafter, the absorbance was measured through UV-Vis spectroscopy to confirm the completion of the reaction, and the reaction mixture was transferred to a 30 kDa molecular weight blocking Amicon ® ultra centrifugal filter and centrifuged at 4,000 rpm, 25° C. for 20 minutes. And the supernatant was washed three times with distilled water, collected and freeze-dried to obtain AL-SISIN-1 (510 mg, yield: 78.2%).
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인(2) Confirmation of fragmentation and NO release ability by self-immolative linker
AL-SISIN-1의 환원 조건 하에서 산화환원 반응에 의해 유발된 NO 방출능은 UV-Vis 분광분석법을 통해 확인하였다.The ability to release NO induced by redox reaction under reducing conditions of AL-SISIN-1 was confirmed by UV-Vis spectroscopy.
구체적으로 AL-SISIN-1을 37℃에서 2시간 동안 GSH와 함께 배양 후 UV/Vis 흡광도 스펙트럼을 조사하였으며, 결과는 도 7g에 나타내었다.Specifically, UV/Vis absorbance spectrum was investigated after incubating AL-SISIN-1 with GSH at 37°C for 2 hours, and the results are shown in FIG. 7g.
상기 도 7g에서 확인할 수 있는 바와 같이, 310 nm의 특정적인 피크가 감소되는 것을 확인하여 산화환원 반응으로 유발된 자가-희생 링커의 단편화에 의한 일산화질소 공여자의 방출을 확인하였다.As can be seen in FIG. 7G, it was confirmed that the specific peak at 310 nm was reduced, thereby confirming the release of the nitric oxide donor by fragmentation of the self-immolative linker induced by the redox reaction.
또한, NO 방출량은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 AL-SISIN-1(50 μM) 접종하고 기-정해진 시간 경과 후 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, AL-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 7h에 나타내었다.In addition, the amount of NO released was quantitatively determined by the Griess method. AL-SISIN-1 (50 µM) in DMEM (50 µM, 1.5 mL) under various physiological conditions (50 g/L serum, extracellular (20 µM, GSH) and intracellular (2 mM, GSH)) at 37 °C. After inoculation and a pre-determined time elapsed, they were transferred to a 96-well plate and stored at -70°C. The cumulative amount of NO in each solution was quantified by comparing the absorbance at 548 nm with a standard curve indicated by NaNO 2 , and the cumulative NO release profile of AL-SISIN-1 is shown in FIG. 7h .
상기 도 7h에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서 AL-SISIN-1이 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 혈액과 피부를 포함한 전신 조직의 세포 외 환경에서 유리 싸이올 함유 생체 분자의 잠재적인 간섭을 고려할 때, AL-SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다.As can be seen in FIG. 7h, AL-SISIN-1 was degraded under reducing conditions, and a much larger amount of NO was released under intracellular (2 mM, GSH) conditions. In addition, in serum (50 g/L) or extracellular (20 μM, GSH) conditions, NO emission was negligible. This indicates that AL-SISIN-1 can have adequate stability after administration, considering the potential interference of free thiol-containing biomolecules in the extracellular environment of systemic tissues including blood and skin. It was confirmed that NO can be emitted.
실시예 3. SiNP-SISIN-1의 합성 및 특성 확인Example 3. Synthesis and Characterization of SiNP-SISIN-1
(1) SiNP-SISIN-1의 합성(1) Synthesis of SiNP-SISIN-1
SiNP-SISIN-1는 싸이올화된 실리카 나노입자(Thiolated silica nanoparticle, SiNP-SH)를 사용하여 하기와 같이 원스텝(one-step)으로 제조하였으며, 제조방법, TEM 이미지, EDS 매핑 이미지, FT-IR 스펙트럼 및 TGA(Thermogravimetric analysis) 분석 결과는 도 8에 나타내었다.SiNP-SISIN-1 was prepared in one-step as follows using thiolated silica nanoparticles (SiNP-SH), manufacturing method, TEM image, EDS mapping image, FT-IR Spectral and thermogravimetric analysis (TGA) analysis results are shown in FIG. 8 .
마지막으로 SiNP-SH 1 mg/mL 및 SISIN-1 0.1 mg/mL를 0.2%(v/v) 빙초산과 함께 메탄올에서 혼합하였다. 어두운 조건에서 24 시간 동안 용액을 교반한 후 증류수로 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 SISIN-1이 접합된 실리카 나노입자(SiNP-SISIN-1) 수득하였다.Finally, 1 mg/mL of SiNP-SH and 0.1 mg/mL of SISIN-1 were mixed with 0.2% (v/v) glacial acetic acid in methanol. After stirring the solution under dark conditions for 24 hours, it was centrifuged with distilled water at 4,000 rpm for 10 minutes to obtain SISIN-1 conjugated silica nanoparticles (SiNP-SISIN-1).
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인(2) Confirmation of fragmentation and NO release ability by self-immolative linker
SiNP-SISIN-1의 NO 방출능의 확인은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 SiNP-SISIN-1(2.5 mg/mL) 접종하고 하룻밤동안 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. The confirmation of the NO release ability of SiNP-SISIN-1 was quantitatively determined by Griess analysis. SiNP-SISIN-1 (2.5 mg/L) in DMEM (50 µM, 1.5 mL) under various physiological conditions (50 g/L serum, extracellular (20 µM, GSH) and intracellular (2 mM, GSH)) at 37 °C. mL) and incubated overnight, transferred to a 96-well plate and stored at -70°C.
각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, SiNP-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 8f에 나타내었다.The cumulative amount of NO in each solution was quantified by comparing the absorbance at 548 nm with a standard curve indicated by NaNO 2 , and the cumulative NO release profile of SiNP-SISIN-1 is shown in FIG. 8f .
상기 도 8f에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서의 SiNP-SISIN-1는 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 SiNP-SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다. 결론적으로, 도 8는 SISIN-1이 사이올기를 함유한 무기 기반 약물전달체에 손쉽게 개질화 될 수 있음을 보여준다.As can be seen in FIG. 8f , SiNP-SISIN-1 was degraded under reducing conditions, and a much larger amount of NO was released under intracellular (2 mM, GSH) conditions. In addition, in serum (50 g/L) or extracellular (20 μM, GSH) conditions, NO emission was negligible. This indicates that SiNP-SISIN-1 can have adequate stability after administration, confirming that it can specifically release NO in cells. In conclusion, Figure 8 shows that SISIN-1 can be easily modified into an inorganic-based drug delivery system containing a thiol group.
실시예 4. 4-arm PEG-SISIN-1의 합성 및 특성 확인Example 4. Synthesis and characterization of 4-arm PEG-SISIN-1
(1) 4-arm PEG-SISIN-1의 합성(1) Synthesis of 4-arm PEG-SISIN-1
4-arm PEG-SISIN-1의 제조과정 및 합성된 화합물의 1H NMR 스펙트럼은 도 9에 나타내었으며, MALDI-TOF 질량스펙트럼, GPC 프로파일, FT-IR 스펙트럼은 도 10에 나타내었다. 1 H NMR spectrum of the preparation process of 4-arm PEG-SISIN-1 and the synthesized compound is shown in FIG. 9, and MALDI-TOF mass spectrum, GPC profile, and FT-IR spectrum are shown in FIG. 10.
SISIN-1이 접합된 4-arm PEG(4-arm PEG-SISIN-1)의 제조는 수성 조건에서 수행되었다. 구체적으로, 0.1 mL DMSO에 녹인 SISIN-1(23.0 mg, 0.06 mmol)을 5 mL 증류수에 녹인 4-arm PEG-SH(100 mg, 0.01 mmol)에 첨가하였다. 용액에 5.0 μL 빙초산을 첨가한 후, 상온에서 밤새 격렬하게 교반하면서 반응시켰다. 이후 수득된 용액을 정제를 위해 분자 컷오프(cutoff)가 2 kDa인 투석막으로 옮겼다. 4-arm PEG-SISIN-1은 증류수에 대해 연속 2일 투석하였으며, 동결건조 되었다.Preparation of 4-arm PEG conjugated with SISIN-1 (4-arm PEG-SISIN-1) was performed in aqueous conditions. Specifically, SISIN-1 (23.0 mg, 0.06 mmol) dissolved in 0.1 mL DMSO was added to 4-arm PEG-SH (100 mg, 0.01 mmol) dissolved in 5 mL distilled water. After adding 5.0 μL of glacial acetic acid to the solution, the reaction was conducted overnight at room temperature with vigorous stirring. Then, the obtained solution was transferred to a dialysis membrane having a molecular cutoff of 2 kDa for purification. 4-arm PEG-SISIN-1 was dialyzed against distilled water for 2 consecutive days and lyophilized.
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인(2) Confirmation of fragmentation and NO release ability by self-immolative linker
4-arm PEG-SISIN-1의 NO 방출능의 확인은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 4-arm PEG-SISIN-1(50 μM)을 접종하고 하룻밤동안 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, 4-arm PEG-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 10d에 나타내었다.Confirmation of NO release ability of 4-arm PEG-SISIN-1 was quantitatively determined by Griess assay. 4-arm PEG-SISIN-1 (50 µM, 1.5 mL) in DMEM (50 µM, 1.5 mL) in various physiological conditions (50 g/L serum, extracellular (20 µM, GSH) and intracellular (2 mM, GSH)) at 37 °C. 50 μM) and incubated overnight, transferred to 96-well plates and stored at -70°C. The cumulative amount of NO in each solution was quantified by comparing the absorbance at 548 nm with a standard curve indicated by NaNO 2 , and the cumulative NO release profile of 4-arm PEG-SISIN-1 is shown in FIG. 10D .
상기 도 10d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서의 4-arm PEG-SISIN-1는 분해되었으며, 세포 내 (2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 4-arm PEG-SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다. 결론적으로, 도 9 및 도 10은 SISIN-1이 싸이올기를 함유한 유기 및 고분자 기반 약물전달체에 손쉽게 개질화 될 수 있음을 보여준다.As can be seen in FIG. 10D , 4-arm PEG-SISIN-1 was degraded under reducing conditions, and a much larger amount of NO was released under intracellular (2 mM, GSH) conditions. In addition, in serum (50 g/L) or extracellular (20 μM, GSH) conditions, NO emission was negligible. This indicates that 4-arm PEG-SISIN-1 can have adequate stability after administration, and confirms that it can specifically release NO in cells. In conclusion, Figures 9 and 10 show that SISIN-1 can be easily modified into organic and polymer-based drug delivery systems containing thiol groups.
실시예 5. SISIN-1-OH의 합성 및 특성 확인Example 5. Synthesis and characterization of SISIN-1-OH
SISIN-1-OH는 하기 방법을 통해 제조하였으며, SISIN-1-OH의 제조방법 및 1H NMR 데이터는 도 11에 나타내었다.SISIN-1-OH was prepared by the following method, and the preparation method and 1 H NMR data of SISIN-1-OH are shown in FIG. 11 .
질소 대기 하에 SISIN-1(30 mg, 78 μmol)을 5 mL 메탄올에 용해시킨 용액에 1.4 μL의 빙초산을 첨가 후 교반하였다. 교반된 용액에 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(8.5 μL, 1.2 μmol)을 적가하고, 실온에서 밤새도록 격렬하게 교반하였다.1.4 μL of glacial acetic acid was added to a solution of SISIN-1 (30 mg, 78 μmol) dissolved in 5 mL methanol under a nitrogen atmosphere, followed by stirring. To the stirred solution, 2-mercaptoethanol (8.5 μL, 1.2 μmol) was added dropwise, and stirred vigorously at room temperature overnight.
이후, 박층 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인하고, 과량의 유기용매를 감압 하에 증발시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피(용리액: 1% methanol in DCM)를 통해 정제하여, 노란색 끈적한 액체 상태의 SISIN-1-OH를 수득하였다(26.9mg, 수율: 98.3%).Then, after confirming that the reaction was completed by thin layer chromatography, the excess organic solvent was evaporated under reduced pressure, and purified by silica gel chromatography (eluent: 1% methanol in DCM), and SISIN-1- as a yellow sticky liquid OH was obtained (26.9 mg, yield: 98.3%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25℃, δ 7.72 (s, 1H), 4.37 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.99 - 3.95 (m, 1H), 3.02 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.95 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 2.89 (t, J = 5.7 Hz, 1H). 1 H NMR (500 MHz, CDCl3, 25°C, δ 7.72 (s, 1H), 4.37 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.99 - 3.95 (m, 1H), 3.02 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.95 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 2.89 (t, J = 5.7 Hz, 1H).
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인(2) Confirmation of fragmentation and NO release ability by self-immolative linker
SISIN-1-OH의 NO 방출능의 확인은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 SISIN-1-OH(50 μM)을 접종하고 하룻밤 동안 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, SISIN-1-OH의 누적 NO 방출 프로파일은 도 11에 나타내었다.Confirmation of NO release ability of SISIN-1-OH was quantitatively determined by Griess assay. SISIN-1-OH (50 µM) in DMEM (50 µM, 1.5 mL) under various physiological conditions (50 g/L serum, extracellular (20 µM, GSH) and intracellular (2 mM, GSH)) at 37 °C After inoculation and incubation overnight, they were transferred to 96-well plates and stored at -70°C. The cumulative amount of NO in each solution was quantified by comparing the absorbance at 548 nm with a standard curve indicated by NaNO 2 , and the cumulative NO release profile of SISIN-1-OH is shown in FIG. 11 .
상기 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서의 SISIN-1-OH는 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 SISIN-1-OH은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다.As can be seen in FIG. 11, SISIN-1-OH under reducing conditions was decomposed, and much larger amounts of NO were released under intracellular (2 mM, GSH) conditions. In addition, in serum (50 g/L) or extracellular (20 μM, GSH) conditions, NO emission was negligible. This indicates that SISIN-1-OH can have adequate stability after administration, confirming that it can specifically release NO in cells.
실험예 1. 크기에 따른 림프 배수 확인Experimental Example 1. Confirmation of lymph drainage according to size
본 발명 화합물의 크기-의존적 림프 배수(lymphatic-drainage) 및 NO 공여능은 생체 내 이미징 시스템(in vivo imaging system, IVIS)을 통해 확인하였다.The size-dependent lymphatic-drainage and NO donating ability of the compound of the present invention was confirmed through an in vivo imaging system (IVIS).
구체적으로, 실시예에서 제조된 AL-SISIN-1 및 SISIN-1-OH을 피하 주사(2 mM, 10 μL)하고, 2시간 후, 8주령 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스를 희생시켰다. 그리고 배수 림프절(draining lymph nodes)을 적출하여 수집 후 NO가 전달된 양을 평가하였다. 이미징을 위해 DAF-2DA(diaminofluorescein-2 diacetate) 5 μM 및 1% 염화 수은(II)의 1:1 용액 5 μL를 주입하였다. 이후 림프절은 FITC 채널을 사용하여 즉시 이미지화 하였으며, 결과는 도 13에 나타내었다.Specifically, AL-SISIN-1 and SISIN-1-OH prepared in Example were injected subcutaneously (2 mM, 10 μL), and 2 hours later, 8-week-old female BALB/c-nu/nu mice were sacrificed. Then, the amount of NO delivered after collection was evaluated by extracting draining lymph nodes. For imaging, 5 µL of a 1:1 solution of 5 µM of diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and 1% mercury(II) chloride was injected. Thereafter, the lymph nodes were immediately imaged using the FITC channel, and the results are shown in FIG. 13 .
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1은 일산화질소에 비례하여 형광물질이 생성되었으며, 특히, SISIN-1-OH 처리한 대조군 대비 AL-SISIN-1를 처리한 경우에 배수 림프절에서 더 강한 형광 신호를 관찰하여 크기-의존적인 림프절 배수를 확인하였다.As can be seen in FIG. 13 , AL-SISIN-1 produced a fluorescent substance in proportion to nitric oxide. In particular, when AL-SISIN-1 was treated compared to SISIN-1-OH-treated control, in the draining lymph node. A stronger fluorescence signal was observed to confirm size-dependent lymph node drainage.
실험예 2. 크기에 따른 따른 림프 배수, 생체 분포 및 NO 공여능 확인Experimental Example 2. Confirmation of lymphatic drainage, biodistribution and NO donating ability according to size
(1) 시간 경과에 따른 림프 배수 및 생체 분포 확인(1) Confirmation of lymphatic drainage and biodistribution over time
본 발명 화합물의 크기에 따른 시간-의존적 림프 배수 및 축적은 AF647가 표지 AL-SISIN-1(AF647-AL-SISIN-1)를 사용하여 생체 내 이미징 시스템(in vivo imaging system, IVIS)을 통해 확인하였다.The time-dependent lymphatic drainage and accumulation according to the size of the compound of the present invention was confirmed through an in vivo imaging system (IVIS) using the AF647-labeled AL-SISIN-1 (AF647-AL-SISIN-1). did.
구체적으로, AL-SISIN-1의 시간 의존적 림프 유도 배수 및 축적을 추적하기 위한 AF647-AL-SISIN-1은 SISIN-1(0.08 mg, 0.20 μmol) 및 BSA-AF(BSA, Alexa FluorTM 647 접합체)(10 mg, 0.15 μmol)를 2 mL 인산염 완충 용액(0.1 M, pH 7.5)에서 실온에서 하룻밤 동안 반응시켜 제조하였으며, 이후 Amicon® ultra centrifugal filter로 여과 및 동결건조하였다.Specifically, AF647-AL-SISIN-1 for tracking the time-dependent lymphoid induction fold and accumulation of AL-SISIN-1 was SISIN-1 (0.08 mg, 0.20 μmol) and BSA-AF (BSA, Alexa Fluor ™ 647 conjugate). ) (10 mg, 0.15 μmol) was prepared by reacting in 2 mL of phosphate buffer solution (0.1 M, pH 7.5) at room temperature overnight, followed by filtration and lyophilization with Amicon ® ultra centrifugal filter.
상기 여과 및 동결건조된 AF647-AL-SISIN-1(2 mM, 10 μL)을 8주령 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스의 발 조직에 피하 주사하였으며, AL-SISIN-1의 시간-의존적 림프 배수 및 축적은 IVIS(excitation/emission peak at 640/710 nm)에 의해 시각화되었으며, 결과는 도 14b, 14c 및 도 15에 나타내었다.The filtered and lyophilized AF647-AL-SISIN-1 (2 mM, 10 μL) was injected subcutaneously into the paw tissue of 8-week-old female BALB/c-nu/nu mice, and time-dependent lymphoid of AL-SISIN-1 The fold and accumulation were visualized by IVIS (excitation/emission peak at 640/710 nm), and the results are shown in FIGS. 14b, 14c and 15 .
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 피하 투여된 AF647-AL-SISIN-1은 2분 이내에 림프로 배수되고 축적되기 시작했으며, 24시간 이상 지속되는 것을 확인하였다.As can be seen from the above results, subcutaneously administered AF647-AL-SISIN-1 began to drain and accumulate in the lymph within 2 minutes, and it was confirmed that it continued for more than 24 hours.
(2) 시간 경과에 따른 림프-유도성 NO 공여능의 확인(2) Identification of lymph-induced NO donor ability over time
시간경과에 따른 림프-유도성 NO 공여를 특성화하기 위해 실시예에서 제조된 AL-SISIN-1 및 SISIN-1-OH(각각 2 mM, 30 μL)를 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 발 조직에 피하 주사하였다. 미리 정해진 기간(2 시간, 6 시간 및 18 시간) 후, 샘플 처리된 마우스를 희생하여 혈청 및 장기 조직액을 수집하였다. 응고된 혈액 표본(clotted blood specimen)을 Amicon® ultra centrifugal filter에서 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 준비하였다. 기관 조직액은 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 200 μL의 차가운 DPBS에서 기관 조직 균질물(organ tissue homogenate)을 원심 분리하여 준비하였다. 이후, 제조업체의 프로토콜에 따라 Nitrite/Nitrate Assay Kit를 사용하여 혈청 및 배액 림프절 모두에서 NOx 수준을 정량화하였으며, 결과는 도 14d 및 14e에 나타내었다.To characterize lymph-induced NO donation over time, AL-SISIN-1 and SISIN-1-OH (2 mM, 30 μL, respectively) prepared in the Examples were added to the paw tissues of 8-week-old female BALB/c mice. were injected subcutaneously. After a predetermined period (2 hours, 6 hours and 18 hours), sample treated mice were sacrificed to collect serum and organ tissue fluid. The clotted blood specimen was centrifuged in an Amicon ® ultra centrifugal filter at 4° C. and 13,000 rpm for 10 minutes to prepare serum. Organ tissue fluid was prepared by centrifuging an organ tissue homogenate in 200 µL of cold DPBS at 4°C and 13,000 rpm for 10 minutes. Thereafter, NOx levels were quantified in both serum and draining lymph nodes using the Nitrite/Nitrate Assay Kit according to the manufacturer's protocol, and the results are shown in FIGS. 14D and 14E.
상기 도 14d 및 도 14e에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1은 대조군인 SISIN-1-OH 대비 많은 양의 NO를 림프절에 공여할 수 있음을 확인하였으며, AL-SISIN-1의 림프-유도성 NO 공여능을 확인하였다.As can be seen in FIGS. 14d and 14e, it was confirmed that AL-SISIN-1 can donate a large amount of NO to the lymph nodes compared to the control SISIN-1-OH, and AL-SISIN-1 lymph- Inducible NO donating ability was confirmed.
실험예Experimental example 3. 혈액 적합성 확인 3. Check blood compatibility
본 발명의 화합물의 혈액 적합성을 확인하기 위해 적혈구에서 방출된 헤모글로빈을 측정하여 용혈 분석(hemolysis assay)를 수행하였다. In order to confirm the blood compatibility of the compound of the present invention, hemolysis assay was performed by measuring hemoglobin released from red blood cells.
구체적으로 헤파린 튜브에 준비된 신선한 마우스 혈액을 원심 분리(4℃, 15분, 2,000 rpm)한 후, 생성된 상청액을 폐기하였다. 그리고 DPBS에서 혈액 세포를 10배 희석한 후, 각 샘플을 처리하여 최종 농도가 1 mM이되도록 처리하였다. 그 다음 혈액 세포를 37℃에서 3 시간 동안 배양하고, 생성된 현탁액을 원심분리하였다(4℃15분, 2,000 rpm). 헤모글로빈 방출을 정량화하기 위해 상층액의 흡광도를 541 nm에서 측정하였다. DPBS 및 1x 용해 완충액은 각각 음성 대조군(0% 용혈) 및 양성 대조군(100% 용혈)으로 사용하였다.Specifically, fresh mouse blood prepared in a heparin tube was centrifuged (4° C., 15 minutes, 2,000 rpm), and the resulting supernatant was discarded. And after diluting the blood cells 10-fold in DPBS, each sample was treated to have a final concentration of 1 mM. The blood cells were then incubated at 37° C. for 3 hours, and the resulting suspension was centrifuged (4° C. 15 min, 2,000 rpm). To quantify hemoglobin release, the absorbance of the supernatant was measured at 541 nm. DPBS and 1x lysis buffer were used as negative control (0% hemolysis) and positive control (100% hemolysis), respectively.
결과는 도 16에 나타내었으며, 상기 도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 용혈 분석 결과 혈청에서 헤모글로빈 방출이 무시할 수 있는 정도로 나타나 본 발명의 화합물이 우수한 혈액 적합성을 보유하고 있음을 확인하였다.The results are shown in FIG. 16, and as can be seen in FIG. 16, hemoglobin release from serum was negligible as a result of hemolysis analysis, confirming that the compound of the present invention has excellent blood compatibility.
실험예 4. 안전성 확인Experimental Example 4. Confirmation of safety
본 발명의 화합물의 전신독성 확인은 8주령 BALB/c 암컷 마우스 샘플처리 후 3일 후 비장을 적출 후 관찰하여 확인하였으며, 결과는 도 17에 나타내었다.Systemic toxicity of the compound of the present invention was confirmed by observing and removing the
상기 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 샘플 처리 3일 후에 염증 관련된 비장의 비대가 관찰되지 않아 본 발명의 화합물이 안전성을 가진다는 점을 확인하였다.As can be seen in FIG. 17 , no inflammation-related spleen hypertrophy was observed after 3 days of sample treatment, confirming that the compound of the present invention has safety.
또한, 8주령 BALB/c 암컷 마우스에 AL-SISIN-1 투여 3일 후 주요 기관 조직의 절편을 수집 후 유의한 형태학적 변화 여부를 확인하였으며, 결과는 도 18에 나타내었다. 상기 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1 투여 후 심장, 폐, 신장, 간, 비장 및 배액 림프절을 포함한 주요 기관 조직에서 유의미한 변화가 관찰되지 않아 본 발명의 조성물은 안전성이 우수함을 확인하였다.In addition, it was confirmed whether there was a significant morphological change after collecting sections of
실험예 5. 종양세포 내에서 NO 방출능 확인Experimental Example 5. Confirmation of NO-releasing ability in tumor cells
종양 세포 특이적인 세포독성을 평가하기 위해 전이성 암 세포주인 B16-F10에서 본 발명의 화합물의 NO 방출 및 축적에 대해 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 사용하여 B16-F10 세포 내 NO 수준을 DAF-2 DA의 형광 신호 평가하여 확인하였다.To evaluate tumor cell-specific cytotoxicity, the NO levels in B16-F10 cells were measured using confocal microscopy for NO release and accumulation of compounds of the present invention in B16-F10, a metastatic cancer cell line, using DAF-2. It was confirmed by evaluation of the fluorescence signal of DA.
구체적으로, 세포를 1x105 cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 놓인 커버 글라스에 접종(seed)하고 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 37℃에서 DMEM 배지 하에 배양하였다. 밤새 배양한 후, 오래된 배지를 5 μM의 DAF-2 DA를 포함하는 신선한 배지로 교체하고, 다시 40분 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 DPBS로 세척하고 각 샘플(50 μM에 해당하는 SISIN-1 농도)을 신선한 배지로 처리하였다. 샘플과 함께 3시간 동안 배양한 후, 세포를 DPBS로 세척하고, 실온의 어두운 조건에서 10% 중성 완충 포르말린(NBF)으로 처리하였다. 30분 후, 커버 글래스를 DAPI가 있는 안티페이드 장착 매체(antifade mounting medium)에 장착하고 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였으며, 결과는 도 19a에 나타내었다.Specifically, cells were seeded on a cover glass placed in a 6-well plate at a density of 1x10 5 cells/well and DMEM medium at 37°C with 10% FBS, 100 U/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin. cultured under After overnight incubation, the old medium was replaced with fresh medium containing 5 μM of DAF-2 DA, and incubated again for 40 minutes. Thereafter, the cells were washed with DPBS and each sample (SISIN-1 concentration corresponding to 50 μM) was treated with fresh medium. After incubation with the samples for 3 hours, cells were washed with DPBS and treated with 10% neutral buffered formalin (NBF) in the dark at room temperature. After 30 minutes, the cover glass was mounted on an antifade mounting medium with DAPI and observed by confocal microscopy, and the results are shown in FIG. 19A .
도 19a에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1 또는 SISIN-1-OH로 처리한 후 B16-10 세포에서 높은 형광 강도가 관찰되었는데, 이는 본 발명의 화합물이 B16-F10 세포에 유입되어 세포 내 GSH 반응 행동에 따라 NO를 방출함으로 인해 세포 내 NO 농도가 크게 증가하였음을 나타낸다.As can be seen in FIG. 19a , high fluorescence intensity was observed in B16-10 cells after treatment with AL-SISIN-1 or SISIN-1-OH. This indicates that the intracellular NO concentration was significantly increased due to the release of NO according to the GSH response behavior.
실험예 6. 암세포에 대한 세포독성 효과 확인Experimental Example 6. Confirmation of cytotoxic effect on cancer cells
(1) 암세포에 대한 용량-의존적 세포독성 확인(1) Identification of dose-dependent cytotoxicity against cancer cells
용량-의존성 세포독성은 SIN-1, SISIN-1-OH, 알부민 및 AL-SISIN-1을 포함한 샘플을 처리한 후, MTT 분석을 사용하여 평가하였다.Dose-dependent cytotoxicity was assessed using the MTT assay after treatment of samples containing SIN-1, SISIN-1-OH, albumin and AL-SISIN-1.
구체적으로 B16-F10 세포를 96-웰 플레이트에 5x103 cells/well의 초기 밀도로 접종하고, 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 37℃ DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 오래된 배지를 신선한 배지의 샘플로 교체하고 세포를 다시 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 세척하고 0.5 mg/mL의 MTT 용액이 포함된 배지로 4시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 배지를 200 μL DMSO로 교체하고 570 nm에서 해당 흡광도를 측정하여 상대적 세포 생존력을 조사하였으며, 결과는 도 19b에 나타내었다.Specifically, B16-F10 cells were inoculated into a 96-well plate at an initial density of 5x10 3 cells/well, and cultured in DMEM medium at 37° C. together with 10% FBS, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin. After incubation for 24 hours, the old medium was replaced with a sample of fresh medium and the cells were incubated for another 48 hours. Thereafter, the cells were washed and incubated for 4 hours in a medium containing 0.5 mg/mL of MTT solution. Finally, the relative cell viability was investigated by replacing the medium with 200 μL DMSO and measuring the corresponding absorbance at 570 nm, and the results are shown in FIG. 19B .
상기 도 19b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 화합물의 처리 용량이 높아질수록 높은 세포독성 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, 유리 SIN-1의 경우, 세포질 선택적 SISIN-1-OH 및 AL-SISIN-1에 비해 현저히 낮은 세포독성을 나타냈는데, 이는 SIN-1의 비특이적 방출 후 NO가 무해한 이온으로 빠르게 분해되는 것으로 여겨진다. 이는 선택적인 세포 내 NO 방출이 세포독성에 중요한 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.As can be seen in FIG. 19b , it can be confirmed that the higher the treatment dose of the compound, the higher the cytotoxic effect. In addition, in the case of free SIN-1, it exhibited significantly lower cytotoxicity compared to cytoplasmic selective SISIN-1-OH and AL-SISIN-1, which is believed to be rapidly decomposed of NO into harmless ions after non-specific release of SIN-1 . This indicates that selective intracellular NO release can have a significant effect on cytotoxicity.
(2) 암세포 특이적 세포독성 확인(2) Confirmation of cancer cell-specific cytotoxicity
본 발명 화합물의 암세포 특이적 세포독성은 배양된 B16-F10 세포주, 림프구 및 비장 세포의 세포 생존력(cellular viability)을 MTS 세포 증식 분석(MTS cell proliferation assay)을 사용하여 확인하였다.The cancer cell-specific cytotoxicity of the compounds of the present invention was confirmed by using the MTS cell proliferation assay for the cellular viability of cultured B16-F10 cell lines, lymphocytes and spleen cells.
구체적으로 림프구 및 비장 세포는 8주령 암컷 BALB/c 마우스로부터 세포 스트레이너(cell strainer)(Falcon, New Jersey, USA)를 사용하여 분리하였다. 분리된 세포를 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고 1 mL ACK 용해 완충액(on ice)에 재현탁하였다. 2분 동안 인큐베이션 후, 9 mL의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 세포를 다시 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 분리된 세포를 96-웰 플레이트에 5x103 cells/well의 초기밀도로 접종(seed)하고, 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지 하에서 37℃에서 배양하였다. 이후 AL-SISIN-1(50 μM)을 처리한 후, 세포를 48시간 동안 배양하고 제조업체의 프로토콜에 따라 MTS 세포 증식 분석(cell proliferation assay)으로 세포 생존력(cellular viability)을 평가하였으며, 결과는 도 19c에 나타내었다.Specifically, lymphocytes and spleen cells were isolated from 8-week-old female BALB/c mice using a cell strainer (Falcon, New Jersey, USA). The isolated cells were centrifuged at 4°C and 300 g for 5 minutes and resuspended in 1 mL ACK lysis buffer (on ice). After incubation for 2 minutes, 9 mL of RPMI 1640 medium was added and the cells were again centrifuged at 4°C, 300 g for 5 minutes. The isolated cells were seeded in a 96-well plate at an initial density of 5x10 3 cells/well, and 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin containing RPMI 1640 medium at 37 ° C. cultured in After treatment with AL-SISIN-1 (50 µM), cells were cultured for 48 h and evaluated for cellular viability by MTS cell proliferation assay according to the manufacturer's protocol. 19c.
상기 도 19c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 처리 후 암세포인 B16-F10 세포주는 약 50%의 세포생존율을 나타낸 반면, 림프구 및 비장 세포를 포함한 정상세포에서는 약 80% 이상의 세포생존율을 나타내어 본 발명의 화합물이 암세포에 특이적으로 세포독성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.As can be seen in FIG. 19c, after treatment with the compound of the present invention, the cancer cell line B16-F10 cell line showed about 50% cell viability, whereas normal cells including lymphocytes and spleen cells showed a cell viability of about 80% or more. It was confirmed that the compound of the present invention can exhibit specific cytotoxicity to cancer cells.
실험예 7. 전이성 암 모델에서 항-전이 효과 확인Experimental Example 7. Confirmation of anti-metastatic effect in metastatic cancer model
본 발명의 화합물의 항전이 효과는 전이성 암 모델 마우스에서 평가하였다.The anti-metastatic effect of the compounds of the present invention was evaluated in metastatic cancer model mice.
구체적으로, B16-F10 전이성 암 세포주를 8주령 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스(3×106 cell/mouse)의 오른쪽 앞발에 접종하였다. 접종 5일 후 마우스를 무작위로 3 개 그룹(그룹 당 7마리)으로 나누고, 3개 그룹의 마우스에 각각 식염수, SISIN-1-OH 및 AL-SISIN-1(각각 2 mM, 10 μL)을 2회(5일 및 7일) 피하 주사하였다. 각 그룹의 생존율(morbidity-free survival)을 모니터링하고 30일에는 모든 마우스를 희생시켰다(도 20a).Specifically, the B16-F10 metastatic cancer cell line was inoculated into the right forelimb of an 8-week-old female BALB/c-nu/nu mouse (3×10 6 cell/mouse). Five days after inoculation, mice were randomly divided into 3 groups (7 mice per group), and 3 groups of mice were each dosed with 2 saline, SISIN-1-OH and AL-SISIN-1 (2 mM, 10 μL each). Subcutaneous injections were made twice (
(1) 생존율(morbidity-free survival) 확인(1) Confirmation of morbidity-free survival
생존율 확인을 위해 수 림프절(tumor-draining lymph node) 부피가 2500 mm3에 도달하면 생쥐를 생명 윤리적으로 허용된 한계에 따라 마우스를 희생시켰으며, 이에 따른 결과는 도 20b에 나타내었다.To check the survival rate, when the volume of the tumor-draining lymph node reached 2500 mm 3 , the mice were sacrificed according to the bioethically accepted limits, and the results are shown in FIG. 20b .
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 피하 주사한 종양 접종 마우스의 생존 시간이 연장되었음을 확인하여, 본 발명의 화합물이 전이성 종양 확산 억제 효과를 가진다는 점을 확인하였다.As can be seen from the above results, it was confirmed that the survival time of tumor-inoculated mice subcutaneously injected with AL-SISIN-1 was prolonged, confirming that the compound of the present invention had an effect of inhibiting metastatic tumor proliferation.
(2) 림프 전이에 의한 림프절 비대 억제 평가 1(2) Evaluation of inhibition of lymph node enlargement by
본 발명의 화합물이 림프절로의 전이를 억제할 수 있는지 여부를 마지막 샘플 주입 14일 후의 마우스의 종양 배수 림프절의 확대 여부를 확인하여 평가하였으며, 결과는 도 21에 나타내었다.Whether the compound of the present invention can inhibit metastasis to lymph nodes was evaluated by checking whether the tumor draining lymph nodes of mice expanded 14 days after the last sample injection, and the results are shown in FIG. 21 .
도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 투여한 마우스에서는 유의미한 림프절 비대를 나타내지 않아, 본 발명의 화합물이 림프절로의 전이를 효과적으로 억제할 수 있다는 점을 확인하였다.As can be seen in FIG. 21 , mice administered with AL-SISIN-1 did not show significant lymph node enlargement, confirming that the compound of the present invention could effectively inhibit metastasis to lymph nodes.
(3) 림프 전이에 의한 림프절 비대 억제 평가 2(3) Evaluation of inhibition of lymph node enlargement by
림프 전이에 의한 림프절 비대 억제를 평가하기 위해 종양 보유 마우스가 사망 한 시점에서 해당 마우스의 종양-배수 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN)을 절제 후 관찰하였으며, TDLN의 사진은 도 20c에 나타내었고, 림프절 비대의 정량화 결과(TDLN/체중)는 도 20d에 나타내었다.In order to evaluate the inhibition of lymph node enlargement by lymph metastasis, the tumor-draining lymph node (TDLN) of the tumor-bearing mouse was excised at the time of death at the time of death, and the picture of the TDLN is shown in Figure 20c. , The results of quantification of lymph node enlargement (TDLN/body weight) are shown in FIG. 20D .
상기 도 20c 및 20d에서 확인할 수 있는 바와 같이, TDLN의 부피는 SISIN-1-OH를 접종한 마우스에서는 큰 변화가 없었으나, AL-SISIN-1를 접종한 마우스에서는 유의미한 퇴행을 나타내었다. 이는 본 발명의 화합물이 전이성 암에서 항-전이성 효과를 가진다는 점을 나타낸다.As can be seen in FIGS. 20c and 20d, the volume of TDLN did not change significantly in mice inoculated with SISIN-1-OH, but significant regression was observed in mice inoculated with AL-SISIN-1. This indicates that the compound of the present invention has an anti-metastatic effect in metastatic cancer.
(4) 조직학적 분석(4) histological analysis
AL-SISIN-1의 항전이 효과를 확인하기 위해 조직학적 분석을 통해 TDLN에서 림프 전이의 존재 및 폐조직으로의 전이를 평가하였다.To confirm the anti-metastatic effect of AL-SISIN-1, the presence of lymphatic metastasis in TDLN and metastasis to lung tissue were evaluated through histological analysis.
구체적으로, 주요 기관을 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하였으며, Nikon Eclipse 80i (Tokyo, Japan)를 조직학적 분석 이미지에 사용하였다.Specifically, major organs were stained with hematoxylin and eosin (H&E), and a Nikon Eclipse 80i (Tokyo, Japan) was used for histological analysis.
1) 림프 전이의 평가1) Assessment of lymphatic metastasis
도 20e에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 투여한 군에서는 림프절에 침윤된 전이성 종양 세포(도면 내 빨간색 부분)가 식염수 및 SISIN-1-OH을 투여한 군 대비 매우 적음을 확인하여 본 발명의 화합물이 전이성 암에 대해 항-전이성을 갖는다는 점을 확인하였다.As can be seen in Figure 20e, in the group administered with AL-SISIN-1, the number of metastatic tumor cells (red part in the figure) infiltrating the lymph nodes was very small compared to the group administered with saline and SISIN-1-OH. It was confirmed that the compound of the present invention has anti-metastatic properties against metastatic cancer.
또한, 도 20f에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 투여한 군은 비-종양 마우스의 림프절과 비교하여 보존된 TDLN 부피를 갖는 것으로 확인하였다.In addition, as can be seen in FIG. 20f , it was confirmed that the group administered with AL-SISIN-1 had a conserved TDLN volume compared to the lymph nodes of non-tumor mice.
2) 폐 조직의 종양결절의 평가2) Evaluation of tumor nodules in lung tissue
TDLN의 전이성 종양은 일반적으로 치명적인 폐 전이로 알려진 폐 조직으로 퍼져 암 환자의 빠른 사망을 초래한다. 따라서, 폐 조직의 종양 결절은 H&E 염색 후 조직학적 분석으로 평가하였으며, 결과는 도 20g 및 도 20h에 나타내었다.Metastatic tumors of TDLN usually spread to lung tissue, known as fatal lung metastasis, resulting in rapid death in cancer patients. Therefore, tumor nodules in lung tissue were evaluated by histological analysis after H&E staining, and the results are shown in FIGS. 20G and 20H.
상기 도 20g 및 도 20h에 나타낸 바와 같이, AL-SISIN-1에 의한 림프 전이 억제 결과, AL-SISIN-1을 투여한 군에서는 체중 변화없이 폐 종양 결절 형성이 발견되지 않아 본 발명의 화합물이 항-전이성을 갖는다는 점을 확인하였다.As shown in FIGS. 20G and 20H, as a result of inhibiting lymph metastasis by AL-SISIN-1, lung tumor nodule formation was not found in the group administered with AL-SISIN-1 without a change in body weight, so the compound of the present invention was an anti-inflammatory. - It was confirmed that it has metastatic properties.
Claims (15)
[화학식 1]
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬 또는, 피리딘-2-일이다.A reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by the following formula (1):
[Formula 1]
here,
R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
R 2 is linear or branched C1-C10 alkyl or pyridin-2-yl.
상기 R1은 C2 알킬렌이며,
R2는 피리딘-2-일인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.According to claim 1,
Wherein R 1 is C2 alkylene,
R 2 is pyridin-2-yl, a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug.
상기 환원반응성은 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커의 자가-희생적 단편화에 의한 것인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.According to claim 1,
The reduction reactivity is due to the self-immolative fragmentation of the self-immolative linker caused by the redox reaction, the reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug.
[화학식 4]
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
상기 R3은 전달체이다.A reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by the following formula (4):
[Formula 4]
here,
R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
The R 3 is a carrier.
상기 전달체는 고분자, 유기 나노구조체, 무기 나노구조체, 유기 마이크로 구조체, 무기 마이크로구조체, 하이드로젤, 스캐폴드 및 코팅물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.5. The method of claim 4,
The carrier is at least one selected from the group consisting of polymers, organic nanostructures, inorganic nanostructures, organic microstructures, inorganic microstructures, hydrogels, scaffolds and coating materials, a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug.
상기 전달체는 알부민인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.5. The method of claim 4,
The carrier is albumin, a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug.
상기 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 직경이 10-20 nm인 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.8. The method of claim 7,
The albumin-conjugated reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug is a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug conjugated with a drug, carrier, or drug-containing carrier having a diameter of 10-20 nm.
상기 암은 전이성 암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.10. The method of claim 9,
The cancer is metastatic cancer, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
상기 약학적 조성물은 비경구 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.10. The method of claim 9,
The pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which is administered parenterally.
상기 약학적 조성물은 정맥, 피하, 복강 또는 종양 내 주사를 통해 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.12. The method of claim 11,
The pharmaceutical composition is administered via intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or intratumoral injection, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
[화학식 1]
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬 또는, 피리딘-2-일이다,
[화학식 4]
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
상기 R3는 전달체이다.A method for preparing a reduction-reactive nitrogen monoxide donor compound or prodrug represented by the following formula (4), comprising reacting the compound of formula (1) with a carrier containing a thiol group:
[Formula 1]
here,
R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
R 2 is straight or branched C1-C10 alkyl or pyridin-2-yl,
[Formula 4]
here,
R 1 is straight or branched C1-C10 alkylene,
The R 3 is a carrier.
상기 R1은 C2 알킬렌이며,
R2는 피리딘-2-일인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법.15. The method of claim 14,
Wherein R 1 is C2 alkylene,
R 2 is pyridin-2-yl, a method for preparing a reductive nitrogen monoxide donor compound or prodrug.
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