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KR102460408B1 - 줄기세포 시트를 제조하는 방법 - Google Patents

줄기세포 시트를 제조하는 방법 Download PDF

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KR102460408B1
KR102460408B1 KR1020200091755A KR20200091755A KR102460408B1 KR 102460408 B1 KR102460408 B1 KR 102460408B1 KR 1020200091755 A KR1020200091755 A KR 1020200091755A KR 20200091755 A KR20200091755 A KR 20200091755A KR 102460408 B1 KR102460408 B1 KR 102460408B1
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Abstract

본 발명은 줄기세포 시트를 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 상세하게 본 발명은 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

줄기세포 시트를 제조하는 방법{Method for manufacturing stem cell sheet}
본 발명은 줄기세포 시트를 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 줄기세포를 배양 및 프라이밍하고, 이를 시트 형태로 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
조직공학(tissue engineering)은 손상된 조직 치료 및 재생을 목적으로 하는 연구 분야이다. 일반적으로, 손상된 조직을 치료 또는 재생하기 위해 체외에서 배양된 다양한 종류의 세포 조직을 체내에 이식 및 주입하게 되는데, 최근 여러 치료목적으로 사용될 수 있는 다능성(multipotent) 전구 세포인 ‘중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)’의 효능이 두각을 나타내고 있다.
이러한 효능은 이식된 줄기세포가 체외에서 배양될 때, 상기 줄기세포의 내부에 저장되는 측분비인자(paracrine factor)에 의한 것인데, 그 양과 종류는 세포 배양 환경에 따라 조절된다. 예를 들어, 이를 위해 등록특허 제2097191호에서는 중간엽 줄기세포를 활성화할 수 있는 조성물을 개시하고 있다.
하지만, 현재 체외에서 배양된 줄기세포가 치료목적으로 이식될 때, 내부에 저장된 측분비인자의 지속기간이 낮아, 치료 효능을 발휘하는 데 그 한계가 있다. 이를 위해, 최근 줄기세포 내 측분비인자의 지속기간을 증가시키기 위하여 체외에서 줄기세포를 다른 세포와 공배양하는 방법들이 연구되고 있다. 다만, 이는 궁극적으로 체내 이식될 수 있는 다능성 줄기세포의 숫자(loading dosage)를 현저히 줄어들게 하여 치료 효과를 감소시킬 수 있게 되는 문제점이 생긴다.
따라서, 치료를 위해 체내로 이식되는 줄기세포의 치료 효과를 증가시키기 위한 줄기세포의 배양 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 원하는 측분비인자의 종류 및 양을 상기 줄기세포 내에 프라이밍시킬 수 있고, 상기 줄기세포를 시트 형태로 제조 가능하게 하는 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 줄기세포 시트를 제조하는 방법에 의해 원하는 측분비인자의 종류 및 양을 상기 줄기세포 내에 프라이밍시킬 수 있으며, 나아가, 온도 변화를 통해 줄기세포를 시트 형태로 제조할 수 있다.
도 1(a)은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 다공성 멤브레인을 SEM으로 관찰한 이미지를 나타내며 도 1(b)는 상기 다공성 멤브레인에 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 세포 배양층이 형성된 것을 SEM으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포 배양층 표면 거칠기의 변화를 온도 및 시간에 따라 나타낸 것이다.
도 3(a)는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 줄기세포 시트를 제조하는 방법에 의해 프라이밍되는 줄기세포를 역주기형광현미경(phase-contrast inverted fluorescence microscope)의 X100배율로 촬영한 이미지를 나타내며, 도 3(b)는 프라이밍이 완료되어 수확된 줄기세포 시트를 나타낸다.
도 4(a)는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 줄기세포 시트를 제조하는 방법에 사용되는 공배양 세포의 종류에 따라, 프라이밍된 줄기세포를 역주기형광현미경의 X40배율로 촬영한 이미지를 나타내며, 도 4(b)는 사용되는 공배양 세포의 종류에 따라, 최종적으로 수확된 줄기세포 시트 내에 저장되는 측분비인자의 양 및 종류를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 온도 변화에 따라 세포의 탈부착이 가능한 세포 배양용 멤브레인을 이용하여 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 다공성 멤브레인은 복수개의 고분자 나노섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 형성되거나, 고분자 합성 수지가 성형됨으로써 형성될 수 있다. 상기 다공성 멤브레인이 복수개의 고분자 나노섬유로 형성되는 경우 고분자 나노섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극을 포함할 수 있다. 이때, 상기 공극은 수십nm 내지 수㎛의 직경을 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 멤브레인은 상기 공극으로 인해, 세포들은 투과시키기 않으면서 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 멤브레인은 평균 직경 100nm 내지 20㎛의 직경의 기공 사이즈, 바람직하게는 평균 직경 100nm 내지 5㎛의 기공 사이즈를 가지는 공극을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 고분자 나노섬유 또는 고분자 합성 수지는 열가소성수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함하는 재료로 형성될 수 있으며, 예를 들어 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(polystyrene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 일면이 아닌 양면에 세포 배양층이 형성되어 있어, 일면에는 줄기세포를, 다른 면에는 공배양 세포를 접종시켜 배양시킬 수 있다.
나아가, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 상기 다공성 멤브레인 상에 온도에 따라 표면구조 변화를 갖는 조성물을 코팅 또는 도포하여, 온도에 따라 표면 구조가 변하는 세포 배양층을 포함할 수 있다.
상기 세포 배양층으로 인해, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 온도에 따라 표면 구조가 변하여, 배양되는 세포의 탈부착이 용이하게 될 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되도록, 상기 온도 범위에서 세포 배양층의 표면을 변화시켜 세포의 부착 및 탈착을 용이하게 한다.
상기 세포 배양층은 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체, 가교제, 중합 개시제 및 잔부의 물을 포함하는 코팅 조성물을 이용하여 중합된 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함할 수 있으며, 이때, 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만일 수 있다. 바람직하게는 1중량부 초과 내지 3중량% 미만을 포함할 수 있다. 상기 가교제의 함량이 1중량부 미만인 경우에는 세포 배양층에 세포가 잘 부착되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 5중량부를 이상인 경우에는 LCST(하한 임계 용액 온도, lower critical solution temperature) 미만의 온도에서 세포 배양층으로부터 배양된 세포의 탈착이 지연되는 문제가 생길 수 있다.
상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체를 폴리이소프로필아크릴아마이드로 중합시키는 역할을 하는 것으로, 폴리이소프로필아크릴아마이드 제조에 사용되는 통상의 방법, 즉 단일중합(homopolymerization), 공중합(copolymerization) 및 3원공중합(terpolymerization), 가교중합(crosslinkedpolymerization) 등에 사용될 수 있는 가교제라면 제한 없이 사용 가능하며, 바람직하게는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide;MBAAm) 및 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine, TEMED) 또는 이들의 혼합이 가교제로서 사용될 수 있다.
한편, 상기 중합개시제는 예를 들어 광개시제일 수 있으며, 이때 광개시제는 코팅 수용액에서 단량체가 UV에 의해 가교결합을 수행할 수 있도록 도와주며, 이때, 상기 광개시제는 UV를 통해 가교결합을 개시할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1프로파논을 사용할 수 있다
나아가, 상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서 표면 거칠기가 4 내지 37nm이고, 바람직하게는 20 내지 32nm일 수 있고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서 표면 거칠기가 4㎛ 이상인 온도에 따른 표면 조도 변화 특성을 가질 수 있다. 이 때 상기 표면 거칠기는 300kHz의 진동수를 사용하는 PPPNCHR 캔틸레버 또는 25kHz의 진동수를 사용하는 BL-AC40TS 캔틸레버를 이용한 비접촉 방식의 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 줄기세포는 그 종류에 제한되지 않으며, 예를 들어, IPS(induced pluripotent stem) 세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포　및 췌장 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 IPS(induced pluripotent stem) 세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포　및 중간엽 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 공배양 세포는 예를 들어 근세포(muscle cell), 섬유아세포(fibroblasts), 내피세포(endothelial cells), 및 표피 세포(epidermal cells)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
바람직하게는 공배양 세포는 대동맥평활근세포(aortic smooth muscle cell), 인간 섬유아세포(human dermal fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 및 인간 표피 세포(human epidermal cells)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 배양을 위해, 상기 세포 배양용 멤브레인을 세포 배양액이 채워진 챔버에 배치하고 세포를 배양할 수 있다. 상기 세포 배양액은 세포 배양에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있으며, 당업계에서 사용되는 배양액이라면 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 줄기세포를 접종하는 단계 및 공배양 세포를 접종하는 단계는 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 세포 배양용 멤브레인의 탈부착 효과에 따라, 세포의 부착이 용이하게 될 수 있도록 온도를 조절하는 것이 바람직하다.
이 때, 상기 줄기세포를 접종하는 단계에서 줄기세포는 1X104 cells/cm2 내지 1X105 cells/cm2의 양으로 접종되며, 상기 줄기세포의 접종량이 1X104 cells/cm2 미만인 경우나, 1X105 cells/cm2을 초과하는 경우에는 세포의 부착/증식에 문제를 일으킬 수 있다.
접종되는 줄기세포 및 공배양 세포의 수의 비는 3:1 내지 1:3일 수 있다. 상기 세포 수의 비가 3:1미만인 경우에는 줄기세포 내의 측부비인자의 함량이 현저 히 줄어들수 있으며, 1:3을 초과하는 경우에 역시 동일 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 공배양 세포를 접종할 때, 32℃이하의 온도가 되면, 중력에 의해 상기 세포 배양용 멤브레인의 하면(즉, 줄기세포가 접종된 면의 반대면)에 상기 공배양 세포가 제대로 부착되지 않아, 공배양 효율이 현저히 감소할 수 있다.
나아가, 본 발명은 배양하는 줄기세포에 측분비인자의 종류 및 양을 원하는 대로 조절하기 위해, 줄기세포를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프라이밍(Priming)은 줄기세포의 치료 효능을 증진시키기 위하여 반응성(활성)이 향상되도록 하는 현상을 의미하며, 본 발명의 줄기세포는 공배양 세포에 의해 프라이밍이 유도될 수 있다. 구체적으로 본 발명은 상기 공배양 세포를 접종한 후, 5 내지 10일 동안 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 줄기세포를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로 줄기세포를 프라이밍하는 방법은 줄기세포와 프라이밍을 유도하는 조성물 또는 세포와 혼합하여 줄기세포의 프라이밍을 유도하나, 이 경우 줄기세포만을 선택적으로 추출하는데 어려움이 있다. 이로 인해, 종래의 줄기세포 프라이밍 유도를 위하여 제작된 혼합물이 체내환경에 적용될 시, 면역원성(immunogenicity) 또는 종양원성(tumorigenicity)과 같은 문제가 유발될 수 있다.
반면, 본 발명의 줄기세포 시트를 제조하는 방법은 공배양 세포와 분리되어 세포를 배양하면서, 동시에 다공성 멤브레인의 공극으로 인해 공배양 세포로부터 줄기세포의 프라이밍을 충분히 유도할 수 있기 때문에, 종래 줄기세포를 프라이밍하는 방법과는 달리, 줄기세포만을 표적으로 프라이밍을 유도할 수 있다.
나아가, 본 발명은 줄기세포를 프라이밍한 후, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만의 온도에서 상기 줄기세포를 탈착할 수 있기 때문에, 프라이밍이 유도된 줄기세포의 탈착 역시 용이하게 수행될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 세포 배양용 멤브레인의 제조.
N-이소프로필아크릴아마이드 단량체와 증류수를 1:1 질량비로 혼합하고, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체가 증류수에 충분히 녹을 수 있도록 5분 동안 교반하였다. 시간이 지남에 따라서, 낮은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액과 높은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액은 안정적으로 나뉘게 되었고, 최종적으로 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액이 안정적으로 분리되었을 때, 파이펫을 이용하여 각각의 용액을 바이알에 옮겨 N-이소프로필아크릴아마이드:물의 질량비가 87:13인 높은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액 5ml을 수득하였다.
그 다음, 자외선 조사처리를 할 때 자외선에 반응하게 만들기 위한 가교제인 N,N’-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm) 0.05g (N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 1중량부) 와 광개시제인 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 0.005g (N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 0.01중량부)를 수득한 각각의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액에 첨가하여 코팅 수용액을 제조하였다.
나아가, 콜라겐으로 이루어지며 평균 공극이 5㎛인 다공성 멤브레인(도 1(a))을 제조하고, 이를 상기 코팅 수용액을 이용하여 전체적으로 코팅한 후 UV 광원을 10분간 조사하여 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층이 코팅된 세포 배양용 멤브레인(도 1(b))을 제조하였다.
2. 표면 거칠기의 변화 측정
표면 거칠기의 변화를 측정하기 위해 제조된 세포 배양용 멤브레인의 표면에서, 온도 및 시간에 따른 표면 거칠기 변화를 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 보이는 바와 같이, LCST를 초과하는 온도인 37℃에서는 상기 세포 배양용 멤브레인 표면의 거칠기 변화가 거의 없는 반면, LCST 미만의 온도인 20℃에서는 상기 세포 배양용 멤브레인의 표면의 거칠기 변화가 급격하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 37℃에서는 세포의 부착이 용이하며, 20℃에서는 세포의 탈착이 용이함을 확인할 수 있었다.
3. 줄기세포 시트의 제조
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 상기 제조된 세포 배양용 멤브레인에 접종하고, 그 후 7일간 배양하였다. 이 때, 배양액은 중간엽 줄기세포를 배양하는 데 사용되는 배양액을 사용하였으며, 배양 및 프라이밍은 37℃의 온도에서 수행하고, 그 후 20℃의 환경에서 상기 줄기세포를 ‘시트’의 형태로 수확하였다.
그 결과 도 3(a)에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인에 접종된 줄기세포는 시간이 지남에 따라 배양이 정상적으로 진행되는 것을 확인할 수 있었으며, 도3(b)에서 보이는 바와 같이, 수확된 줄기세포는 시트의 형태임을 확인할 수 있었다.
4. 공배양 세포의 종류에 따른 줄기세포 시트의 제조.
상기 제조된 세포 배양용 멤브레인에 줄기세포를 다른 종류의 세포와 공배양시켰다.
구체적으로는 37℃에서 상기 세포 배양용 멤브레인의 일면에 중간엽 줄기세포를 접종하였으며, 반대면에는 무처리, HUVEC, ASMC 및 hDF를 각각 접종하였다. 그 후 7일간 배양하여 상기 중간엽 줄기세포를 각각 프라이밍하였으며, 20℃에서 상기 줄기세포를 시트 형태로 탈착한 후, 탈착된 줄기세포 시트를 주사전자현미경으로 관찰하였으며, 상기 줄기세포 내에 저장된 측분비인자의 종류, 함량 및 지속시간을 측정하였다.
구체적으로 탈착된 줄기세포 시트의 관찰을 위하여 제작된 줄기세포 시트를 칼세인 아세톡시메틸(calcein-AM, green)과 에티듐 호모다이머(ethidium homodimer-1, red)를 사용하여 염색시킨 후, 이를 역주기형광현미경(X40/100배율)으로 관찰하였다. 또한, 측분비인자 (VEGF, Angiopoietin-1)의 함량 및 지속시간 측정을 위하여는 해당인자 검증을 위한 엘라이자 키트(Elisa kit, R&D systems)를 사용하였다.
그 결과, 도 4(a)에 보이는 바와 같이, 공배양되는 세포의 종류에 따라 줄기세포의 형태가 바뀌는 것을 확인할 수 있었으며, 도4(b)에 보이는 바와 같이, 줄기세포와 공배양되는 세포의 종류에 따라, 줄기세포 내에 저장되는 측분비인자의 종류에 따른 함량과 지속시간이 달라짐을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (12)

  1. 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계;
    상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계;
    상기 공배양 세포를 접종하는 단계에 후속적으로, 5 내지 10일 동안 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 줄기세포를 프라이밍하는 단계; 및
    상기 줄기세포를 프라이밍한 후, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만의 온도에서 상기 줄기세포를 탈착하는 단계를 포함하고,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포((mesenchymal stem cell))이고,
    상기 공배양 세포는 HUVEC(인간 제정맥 내피세포), ASMC(대동맥평활근세포), 및 hDF(인간 섬유아세포)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양층은 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체, 가교제, 중합 개시제 및 잔부의 물을 포함하는 코팅 조성물을 이용하여 중합된 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서 표면 거칠기가 4 내지 37nm이고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서 표면 거칠기가 4㎛ 이상인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 가교제는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide;MBAAm), 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine,TEMED) 또는 이들의 혼합인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 공극은 평균 직경 100nm 내지 20㎛의 기공 사이즈를 갖는 것인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포를 접종하는 단계 및 공배양 세포를 접종하는 단계는 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 수행되는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포를 접종하는 단계에서 줄기세포는 1X104 cells/cm2 내지 1X105 cells/cm2의 양으로 접종되며,
    상기 공배양 세포를 접종하는 단계에서 공배양 세포는 1X104 cells/cm2 내지 1X105 cells/cm2의 양으로 접종되는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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