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KR102433259B1 - 지방조직 유래 세포외기질을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

지방조직 유래 세포외기질을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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KR102433259B1
KR102433259B1 KR1020190168838A KR20190168838A KR102433259B1 KR 102433259 B1 KR102433259 B1 KR 102433259B1 KR 1020190168838 A KR1020190168838 A KR 1020190168838A KR 20190168838 A KR20190168838 A KR 20190168838A KR 102433259 B1 KR102433259 B1 KR 102433259B1
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Abstract

본 발명은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 의료용 조성물은 체내 이식 후에도 조성물이 잘 응집된 상태로 존재하고, 일정기간 동안 부피를 유지할 수 있다.

Description

지방조직 유래 세포외기질을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조방법{Medical compositions including adipose tissue-derived extracellular matrix and method of making the same}
본 발명은 지방조직 유래 세포외기질을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 동종 및 이종 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
재생의학은 인간의 세포와 조직, 장기를 대체하거나 재생시키는 것을 목적으로 한다. 조직 손상 및 기능 상실을 초래하는 외상성 트라우마, 사회의 고도화에 따른 새로운 질환의 출현 등은 재생의학 분야의 더욱 빠른 발전을 위한 필연적 동기를 부여하고 있다.
재생의학 분야에 이용되는 의료용 물질은 적용하고자 하는 조직 및 장기의 종류, 질환 또는 외상의 종류, 및 환자의 병력 등에 따라 신중하게 선택되어야 한다. 통상적으로, 연구용으로서 가장 빈번하게 선택되는 물질로는 이종 유래 추출 콜라겐 및 젤라틴, 미생물 유래 히알루론산, 키토산, 식물성 셀룰로스 계열 고분자, 식물성 알지네이트 등이 있다. 이외에, 사람의 사체로부터 얻어낼 수 있는 동종 유래 물질들도 재생의학 분야에서 안전하게 사용 가능한 유효한 생체재료로 주목 받고 있다.
생체재료 중, 특히 지방조직은 생체재료로서의 안전성, 유효성뿐만 아니라 경제적/산업적 관심도 국내외적으로 높아지고 있다. 지방조직은 지방세포, 전지방세포, 섬유아세포, 혈관 내피 세포 및 다양한 면역 세포로 이루어진 느슨한 결합 조직의 하나이다. 지방조직은 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 글루코스아미노클루칸 등과 같은 세포외기질을 함유한다. 세포외기질은 생체 내 조직에서 세포의 지지 및 증식을 도울 뿐만 아니라, 세포와 결합하여 조직의 조성물을 유지함으로써 생체의 손상부위 회복에 도움을 줄 수 있다.
일례로, 인체 지방조직 유래 세포외기질 제품인 Renuva®(MTF Biologics)는 족부궤양과 같은 결손 부위에 적용되어 조직수복에 효과를 가진다고 보고되고 있다. 또 다른 예로, 인체 지방조직 유래 세포외기질 제품인 Allofill®(Biologica Technologies)는 주름개선에 효과를 가진다고 보고되고 있다. 그러나, 상기 Renuva®나 Allofill®과 같은 의료용 제품들은 미세입자화된 인체지방조직 유래 세포외기질 분말이 멸균생리식염수에 수화된 단순한 성상으로 제공되기 때문에, 사용 후 체내에서 부피를 유지하기 어려운 단점을 가진다.
1. 대한민국 등록특허 10-0771058 2. 대한민국 등록특허 10-1628821
1. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering, Acta Biomaterialia 2013, 8921-31 2. Biocompatibility of injectable hydrogel from decellularized human adipose tissue in vitro and in vivo, Journal of Biomedical Materials Research Part B, 2018, 1684-1694 3. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells, Biomaterials, 2010, 4715-24 4. Preclinical Optimization of a Shelf-Ready, Injectable, Human-Derived, Decellularized Allograft Adipose Matrix, Tissue Engineering Part A 2019, Vol. 25, No. 3-4
이에, 본 발명자들은 체내 이식 후에도 조성물이 잘 응집된 상태로 존재하고, 일정기간 동안 부피를 유지할 수 있는 의료용 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱 상세하게는 동종 또는 이종 지방조직 유래 세포외기질 분말 및 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자를 사용함으로써, 체내 이식 후 자가지방의 생성을 촉진하고, 자가조직화를 유도할 수 있으며, 또한, 점탄성 특성이 향상되어 체내 부피 유지력이 우수한 의료용 조성물 및 그 제조 방법 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 의료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 혼합하는 단계를 포함하는 의료용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 의료용 조성물은 체내 이식 후에도 조성물이 잘 응집된 상태로 존재하고, 일정기간 동안 부피를 유지할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 동종 또는 이종 지방조직 유래 세포외기질 분말 및 생체적합성 고분자 또는 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자를 사용함으로써, 체내 이식 후 자가지방의 생성을 촉진하고, 자가조직화를 유도할 수 있으며, 또한, 점탄성 특성이 향상되어 체내 부피 유지력이 우수하다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 의료용 조성물의 제조에서, 감마 멸균 시 세포외기질 분말 및 생체적합성 고분자의 가교물의 혼합 비율에 따른 물성을 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일례에 따른 의료용 조성물의 점성계수, 탄성계수 및 복소점도를 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일례에 따른 의료용 조성물 주입 6주 후, 누드마우스에서 적출한 조성물을 나타낸 사진 및 상기 조성물의 부피를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일례에 따른 의료용 조성물 주입 6주 후, 누드마우스에서 적출한 조성물을 조직학적으로 분석하기 위해, H&E(haematoxylin and eosin) 염색을 수행한 사진 및 세포 유입을 정량한 그래프이다,
도 5는 본 발명의 일례에 따른 의료용 조성물 주입 6주 후, 누드마우스에서 적출한 조성물 내 지방 생성을 분석하기 위해, Oil Red O 염색을 수행한 사진 및 정량한 그래프이다.
본 발명은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 의료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 지방조직 유래 세포외기질 분말 및 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 의료용 조성물을 제조하여, 상기 의료용 조성물이 방사선 멸균 시에도 그 제형을 유지할 수 있으며, 우수한 점탄성 특성을 가짐을 확인하였다. 또한, 상기 의료용 조성물에 대해 인 비보(in vivo) 실험을 진행하여 HA-CMC 담체를 사용할 경우보다 채내 부피유지 능력, 자기조직화 능력 및 자가지방 생성 능력이 우수함을 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 의료용 조성물을 보다 보다 상세하기 설명한다.
본 발명의 의료용 조성물은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함한다.
본 발명에서 지방조직 유래 세포외기질 분말(이하, 세포외기질 분말이라 한다.)은 의료용 소재로 사용되어, 체내 이식 후 자가지방 생성을 촉진하고 자가조직화를 유도할 수 있다.
일 구체예에서, 세포외기질(extracellular matrix, ECM)은 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체를 의미한다. 상기 세포외기질은 세포의 유형 또는 세포의 분화 정도에 따라 그 성분이 달라질 수 있으며, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성단백질과 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 등의 복합단백질, 그리고 파이브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 당단백질로 구성될 수 있다.
일 구체예에서, 지방조직은 동종 또는 이종 유래 지방조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류뿐만 아니라 어류 등을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 지방조직 유래 세포외기질 분말의 평균 입경은 100 내지 800 μm 일 수 있다. 상기 입경 범위에서 생체 주입용으로 적합하며, 주사기로 주입이 가능하다.
일 구체예에서, 지방조직 유래 세포외기질 분말의 함량은 조성물 전체 중량 대비 1 내지 30 중량부, 5 내지 15 중량부 또는 3 내지 8 중량부일 수 있다. 상기 범위에서 주사기로 주입이 가능하다.
본 발명에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 의료용 조성물의 점탄성 특성을 향상시킬 수 있으며, 체내 부피 유지력을 향상시킬 수 있다. 이때 생체적합성 고분자의 가교물은 화학적으로 가교된 한 가지 이상의 생체적합성 고분자를 의미한다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 분자량은 10 kDa 내지 2 MDa 일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자로 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 가교물은 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자의 가교물일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자는 가교제에 의해 가교되며, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 함량은 조성물 전체 중량 대비 0.1 내지 20 중량부, 1 내지 15 중량부, 1 내지 11 중량부 또는 9 내지 11 중량부일 수 있다. 상기 범위에서 생체적합성 고분자의 물성을 향상시킬 수 있으며, 또한, 체내 부피 유지력을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 의료용 조성물의 점성계수는 3,000 내지 20,000 Pa일 수 있고, 탄성계수는 1,000 내지 10,000 Pa일 수 있으며, 복소점도는 1,000 내지 10,000 Pa·s일 수 있다. 상기 점성계수, 탄성계수, 및 복소점도는 회전형 레오미터 분석기(진동 수: 0.1~10 Hz, 온도: 25℃, 변형율: 1%)에 의해 측정된 결과값을 의미한다.
점탄성(viscoelasticity)은 물체에 힘을 가했을 때 액체로서의 성질과 고체로서의 성질이 동시에 나타나는 현상을 의미한다. 본 발명에서는 조성물이 가해지는 힘에 대하여 저항하는 힘과 소실되는 힘을 측정하여 점성계수, 탄성계수 및 복소점도를 측정할 수 있다.
점성계수(손실탄성계수, viscous modulus, G'')란 상실된 에너지의 척도로서 물질의 점성성분을 의미한다. 본 발명에서 상기 의료용 조성물의 점성계수는 5,000 내지 10,000 Pa 또는 6,000 내지 8,000 Pa일 수 있다. 탄성계수(저장탄성계수, elastic modulus, G')란 탄성체가 탄성한계 내에서 가지는 응력과 변형의 비를 의미한다. 상기 탄성계수가 클수록 조성물이 단단하고 변형에 대하여 저항하는 능력이 높아진다. 본 발명에서 상기 의료용 조성물의 탄성계수는 1,000 내지 5,000 Pa Ehsms 1,000 내지 3000 pa일 수 있다. 복소점도는(complex viscosity)는 진동 측정법에서 계산되는 진동수 의존적 점도로서, 상기 수치는 G'', G' 및 측정하는 진동수 값이 반영된 수치이다. 본 발명에서 상기 의료용 조성물의 복소점도는 1,000 내지 3,000 Pa·s 또는 1,500 내지 2,500 Pa·s일 수 있다.
또한, 의료용 조성물의 압출력, 즉, 주입 압력은 110 N 이하일 수 있다. 본 발명에서 압출력은 만능재료시험기를 사용하여 측정한 값으로서, 구체적으로, 내용물이 담긴 주사기(20 G)에 캐뉼러를 체결하고, 시험속도인 12 mm/min으로 주사기를 눌러 주사기 안의 내용물이 캐뉼러 외부로 배출될 때의 최대하중값(N)을 나타낸다.
상기 압출력은 환자에게 편안한 주사 속도에서의 압출력을 의미한다. "환자에게 편안한"은 피부에 주사시 환자에게 상해나 과도한 통증을 야기하지 않는 주사 속도를 정의하는 데 사용된다. 본 발명에서 사용되는 "편안함"은 환자의 편안함뿐만 아니라 의사 또는 의료전문가가 조성물을 주사하는 데 있어서의 편안함 또는 능력을 포함한다. 일반적으로, 낮은 압출력을 가지는 것이 조성물의 주입시 압통이 없으며 컨트롤이 용이하다. 본 발명에서 상기 의료용 조성물의 압출력은 100 N 이하, 70 N 이하, 60 N 이하, 40 N 이하, 35 N 이하, 또는 30 N 이하일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 의료용 조성물은 주사기로의 주입 등을 통해 생체 내로 주입 또는 삽입될 수 있다. 이러한 의료용 조성물은 일반적인 의료용 재료로서 사용될 수 있으며, 조직 수복제, 필러, 유착방지제, 성형보조물, 관절염 치료제, 창상 피복제, 지혈제, 또는 지방이상증 치료제로 사용될 수 있다. 이때, 지방이상증은 지방 조직이 소실되는 증상을 가지며, 본 발명의 의료용 조성물에 의해 자가지방의 생성을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 의료용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 의료용 조성물의 제조 방법은 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 지방조직 유래 세포외기질 분말은 시중에서 시판 중인 제품을 사용할 수 있으며, 또는 실험실 등에서 제조하여 사용할 수 있다.
상기 지방조직 유래 세포외기질 분말은 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계;
상기 세포가 제거된 지방조직을 동결건조하는 동결건조 단계; 및
상기 동결건조된 동결건조물을 분말화하는 분말화 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명은 탈지방화 단계를 수행하기 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 상기 세척 단계에서는 지방조직을 멸균 증류수로 세척할 수 있다. 상기 단계를 통해 지방조직 내의 불순물을 제거할 수 있다.
본 발명에서 탈지방화 단계는 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 단계이다.
일 구체예에서, 탈지방화(delipidation)는 조직으로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 지질 성분의 제거는 물리적 처리 또는 화학적 처리에 의해 수행될 수 있으며, 상기 물리적 처리 및 화학적 처리를 함께 수행할 수 있다. 함께 수행 시, 수행 순서는 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 물리적 처리의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 분쇄를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분쇄는 당업계에 공지된 분쇄 수단, 예를 들어, 믹서기, 호모게나이져, 냉동 분쇄기, 초음파 분쇄기, 핸드블랜더, 플런저 밀 등을 사용하여 수행할 수 있다.
상기 분쇄의 수행시, 분쇄물, 즉 분쇄된 지방조직의 입경은 0.01 내지 1 mm 일 수 있다.
일 구체예에서, 화학적 처리의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 상기 알코올로 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 40:60 내지 60:40일 수 있다.
상기 탈지질 용액의 처리 시간은 4 내지 30 시간, 또는 10 내지 20 시간일 수 있다.
일 구체예에서, 탈지방화 단계는 물리적 처리 및 화학적 처리를 순차적으로 적용하여 수행할 수 있다. 물리적 처리에 의해 지방조직에서 지질 성분을 1차 탈락시킬 수 있으며, 상기 물리적 처리에 의해 탈락되지 않은 지질 성분은 화학적 처리에 의해 제거될 수 있다.
본 발명에서 탈세포화 단계는 상기 탈지방화 단계에 의해 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 단계이다.
일 구체예에서, 탈세포화(decellularization)는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 탈세포화는 염기성 용액을 사용하여 수행할 수 있으며, 상기 염기성 용액으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 염기성 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 탈세포화시 염기성 용액을 사용하여 세포 독성이 없다는 장점을 가진다.
일 구체예에서, 염기성 용액의 농도는 0.01 내지 1 N, 0.06 내지 0.45 N, 0.06 내지 0.2 N, 또는 0.08 내지 1.02 N일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 60 내지 48 분, 70 내지 200 분, 또는 90 내지 150 분 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
본 발명에서는 탈세포화 단계를 수행한 후, 동결건조 단계를 수행하기 전에 원심분리 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 원심분리 단계를 통해 탈지방화 단계 및 탈세포화 단계에서의 불순물을 제거할 수 있으며, 높은 순도의 세포외기질 물질(침전물)을 수득할 수 있다.
일 구체예에서, 원심분리는 4,000 내지 10,000 rpm, 또는 8,000 rpm에서 5 내지 30 분, 5 내지 20 분, 또는 10분 동안 수행할 수 있다.
또한, 원심분리 전 및/또는 후, 세척 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 세척시 멸균 증류수를 사용할 수 있다.
본 발명에서 동결건조 단계는 전술한 단계, 즉, 탈세포화 단계 또는 원심분리 단계 후의 수득물을 동결건조하는 단계이다. 상기 동결건조는 조직이 동결된 상태에서 이를 급속 냉각후 진공으로 수분을 흡수하는 방법으로, 상기 동결건조를 수행하여 세포외기질 물질 내 수분을 조절할 수 있으며, 분말화를 용이하게 수행할 수 있도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서 분말화 단계는 동결건조된 동결건조물, 즉, 세포외기질을 분말화하는 단계이다.
상기 분말화된 세포외기질 분말의 입경은 100 내지 800 μm 일 수 있다.
또한, 본 발명의 지방조직 유래 세포외기질 분말은 지방조직을 세척하는 세척 단계;
상기 세척된 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계;
상기 탈세포화된 지방조직을 원심분리하는 원심분리 단계;
상기 원심분리 후의 침전물을 동결건조하는 동결건조 단계; 및
상기 동결건조된 동결건조물을 분말화하는 분말화 단계;를 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 시중에서 시판 중인 제품을 사용할 수 있다. 또한, 상기 가교물은 생체적합성 고분자를 이용하여 실험실 등에서 제조하여 사용할 수 있다.
상기 생체적합성 고분자의 가교물은 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 가교 단계; 및
상기 가교된 가교물을 동결건조하는 동결건조 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 가교 단계는 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 단계이다. 상기 단계에서 생체적합성 고분자 및 가교제는 전술한 종류를 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자들은 아미드 결합(amide bond)을 통해 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 가교제의 함량은 생체적합성 고분자 대비 0.5 내지 10 중량부일 수 있다.
본 발명에서 동결건조 단계는 상기 단계에서 가교된 생체적합성 고분자를 동결건조하는 단계이다.
일 구체예에서, 동결건조는 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 물리적 혼합에 의해 혼합될 수 있다.
일 구체예에서, 혼합물 내에서 지방조직 유래 세포의기질 분말의 함량은 1 내지 30 중량부, 5 내지 15 중량부 또는 3 내지 8 중량부일 수 있다.
또한, 혼합물 내에서 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 0.1 내지 20 중량부, 1 내지 15 중량부, 1 내지 11 중량부 또는 9 내지 11 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 혼합물은 동결건조된 생체적합성 고분자의 가교물을 용매에 용해시킨 후, 세포외기질 분말과 혼합하여 제조할 수 있다. 이때 용매로는 생리식염수를 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 혼합물을 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 멸균 단계를 통해 의료용 조성물 내의 면역성을 제거할 수 있으며, 세균 등을 효과적으로 파괴할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 멸균 단계는 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지30 kGy일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 의료용 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 의료용 조성물은 체내 이식 후 자가지방 생성을 촉진 및 자가조직화를 유도할 수 있고, 또한, 점탄성 특성이 향상되어 체내 부피 유지력이 우수한 효과를 가진다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 의료용 조성물은 주사기로의 주입 등을 통해 생체 내로 주입 또는 삽입될 수 있으며, 조직 수복제, 필러, 유착방지제, 성형보조물, 관절염 치료제, 창상 피복제, 지혈제, 또는 지방이상증 치료제로 사용될 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 인체 지방조직 유래 세포외기질 입자 및 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자가 물리적으로 혼합된 의료용 조성물
(1) 인체 지방조직 유래 세포외기질의 제조
인체 지방조직을 분쇄기로 분쇄하여 지방을 탈락시켰다. 탈락하지 않은 지방을 제거하기 위해 40% 내지 60% 아이소프로필 알코올과 40% 내지 60% 헥산을 이용하여 16시간 동안 탈지방화 과정을 거쳤다. 지방이 제거된 조직에 0.1N 수산화나트륨(NaOH)을 처리하여 세포를 제거하였다.
지방 및 세포 제거가 완료된 세포외기질을 세척하기 위해 8,000 rpm에서 10분 간 원심분리하여 상등액을 제거하였으며, 세척 과정을 5 내지 10회 반복하였다. 인체 지방조직 유래 세포외기질의 수분 함유량이 10% 이하, 바람직하게는 1% 내지 8%가 되도록 지지체를 동결건조하였다.
상기 동결건조가 완료된 인체지방조직 유래 세포외기질을 마이크로 분쇄기를 이용하여 미세입자화 하였다.
(2) 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자 제조
히알루론산(HA)과 카복시메틸셀룰로스(CMC)를 1,4-butanediol diglycidyl ether(BDDE)와 혼합하여 HA-CMC 담체를 제조하였다.
구체적으로, 0.1 내지 1 N의 수산화나트륨 수용액 100 ml 당 1 내지 10 ml의 BDDE를 첨가하여 반응용매를 준비하였다. 상기 반응용매에, 1 내지 10 g의 CMC 및 1 내지 20 g의 HA를 첨가한 후 균질하게 혼합하여 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액을 50℃에서 3 시간 동안 가온 반응을 진행하여 가교를 수행하였다.
가교가 완료된 반응물을 투석막에 넣고 5 L의 인산완충용액(Phosphate-buffered saline)으로 상온에서 투석하였다. 2 시간 후, 5 L의 50% EtOH로 교체하고 상온에서 1 시간 투석하였다. 이후 멸균 증류수로 상온에서 72 시간 동안 투석한 후, 반응물을 동결건조하여 최종적으로 HA-CMC 담체를 수득하였다.
(3) 의료용 조성물 제조
(1)에서 제조한 인체 지방조직 유래 세포외기질(5 중량% 내지 15 중량%) 및 (2)에서 제조한 HA-CMC 담체(1 중량% 내지 10 중량%)를 멸균 생리식염수와 혼합하였다.
혼합된 최종산물을 25 kGy 감마선으로 멸균하여 의료용 조성물을 제조하였다.
실험예 1. 의료용 조성물의 방사선 멸균 시 제형 유지능력 검증
(1) 방법
실시예 1에서 제조된 의료용 조성물의 제형 유지 능력을 검증하였다.
하기 표 1의 함량(나머지: 멸균 생리식염수)으로 시료를 준비한 후, 25 kGy 감마선으로 멸균을 시행하였다. 감마 멸균 시 각 성분들의 함량 비율에 따른 물성을 확인하였다.
Figure 112019130412724-pat00001
한편, 각 시료에 대하여 압출력을 측정하였다. 상기 압출력은 만능재료시험기를 사용하여 내용물이 담긴 주사기에 캐뉼러를 체결하고, 시험속도 12mm/min으로 주사기를 눌러 주사기 안의 내용물이 캐뉼러 외부로 배출될 때의 최대하중값(N)을 측정하였다.
(2) 결과
감마 멸균 시 시료의 각 성분 함량 비율에 따른 물성 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 시료의 압출력 측정 결과를 표 2에 나타내었다.
시료번호 인체지방조직 유래 세포외기질 함량(%) 담체함량(%) 압출력(주입 압력, N)
17G 20G
1 5 2 26N 28N
2 10 2 23N 20N
3 15 2 32N 37N
4 5 4 26N 20N
5 10 4 19N 30N
6 15 4 35N 41N
7 5 6 22N 27N
8 10 6 23N 30N
9 15 6 36N 65N
10 5 8 28N 27N
11 10 8 23N 41N
12 15 8 38N 72N
13 5 10 19N 28N
14 10 10 23N 68N
15 15 10 48N 100N
도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 인체 지방조직 유래 세포외기질(ECM) 5 중량% 및 HA-CMC 담체 10 중량%를 포함하는 의료용 조성물이 가장 우수한 물성을 가지며, 20G에서 40 N 이하의 압출력을 가져 주사기를 통한 생체 내 주입이 용이한 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 의료용 조성물의 점탄성 특성 분석
(1) 방법
실험예 1에서 최적 혼합비율로 선택된 인체 지방조직 유래 세포외기질(ECM) 5 중량% 및 HA-CMC 담체 10 중량%를 포함하는 의료용 조성물(시료 13)을 실험군(의료용 조성물)으로, 세포외기질을 포함하지 않고 HA-CMC 10 중량%를 포함하는 조성물을 대조군(HA-CMC)하여, 점탄성 특성을 비교하였다.
구체적으로, 회전형 레오미터 분석기를 진동 수: 0.1~10 Hz, 온도: 25℃, 변형율: 1%로 하여, 탄성계수, 점성계수 및 복소점도를 측정하였다.
(2) 결과
탄성계수, 점성계수 및 복소점도의 측정 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 의료용 조성물이 대조군인 HA-CMC 보다 탄성계수 및 점성계수에서 약 7 배 이상 높은 값을 나타내었고, 복소점도에서도 6 배 이상 높은 값을 나타내었다.
실험예 3. 인체 지방조직 유래 의료용 조성물의 in vivo 성능 검증
(1) 방법
의료용 조성물의 성능을 검증하기 위해 동물 실험을 진행하였다.
실시예 1의 (1)에서 제조된 세포외기질 분말(세포외기질) 및 실시예 1의 (2)에서 제조된 HA-CMC 담체(HA-CMC)를 각각 대조군으로 하고, 실험예 1에서 최적 혼합비율로 선택된 인체 지방조직 유래 세포외기질(ECM) 분말 5 중량% 및 HA-CMC 담체 10 중량%를 포함하는 의료용 조성물(시료 13)을 실험군으로 하였다.
BALB/c 누드마우스의 배부 피하에 대조군 및 실험군의 조성물을 각각 0.2cc 이식하고, 이식 6주 후 실험 동물들을 희생하여 결과를 분석하였다.
(2) 결과
(A) 체내 부피유지 능력 검증
대조군 및 실험군의 조성물 주입 6주 후, 누드마우스에서 적출한 시료들을 촬영하고, 디지털 캘리퍼스를 통해 부피를 측정하였다.
도 3은 누드마우스에서 적출한 조성물을 나타낸 사진 및 부피(Residual vol.)를 나타낸 그래프이다.
상기 도 3에 나타난 바와 같이, 실험군인 의료용 조성물은 대조군인 HA-CMC 및 세포외기질 대비 체내 부피유지력이 우수한 것을 확인할 수 있다.
그래프를 통해서도 6주 후에 의료용 조성물이 세포외기질보다 4 배 이상 부피가 유지되는 것을 확인할 수 있다.
(B) 자가조직화 검증
(A)에서 적출한 시료들에 대해 조직 염색으로 자가조직화 여부를 확인하였다. H&E(haematoxylin and eosin) 염색을 수행하여 조직분석을 진행했고, 세포 유입을 정량화 하였다.
도 4는 누드마우스에서 적출한 조성물을 조직학적 분석하기 위해 H&E(haematoxylin and eosin) 염색을 수행한 사진 및 세포 유입을 정량화한 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 조직 염색 결과 대조군인 HA-CMC 및 세포외기질 대비 실험군인 의료용 조성물 내로 세포가 유입되고, 혈관이 형성 되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 그래프를 통해, 6주 후 의료용 조성물이 HA-CMC 보다 8 배 이상 세포 유입이 증가한 것을 확인할 수 있다.
(C) 자가지방 생성효과 검증
(A)에서 적출한 시료들에 대해 지방생성을 검증하였다.
적출된 시료들 내 지방 생성을 분석하기 위해 Oil Red O 염색을 진행하였고, 지방생성을 정량화 하였다.
도 5는 누드마우스에서 적출한 조성물 내 지방 생성을 분석하기 위해 Oil Red O 염색을 수행한 사진 및 정량화한 그래프이다.
상기 도 5에 나타난 바와 같이, Oil Red O로 염색한 결과 실험군인 의료용 조성물 내 지방 생성이 대조군인 HA-CMC 및 세포외기질 보다 더 많이 유도됨을 확인할 수 있다.
또한, 그래프를 통해, 6주 후 의료용 조성물이 세포외기질 보다 8% 이상 지방 생성이 증가된 것을 확인할 수 있다.

Claims (17)

  1. 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하며,
    상기 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 조성물 전체 중량 대비 0.1 내지 20 중량%이고,
    상기 생체적합성 고분자의 가교물은 히알루론산과 카복시메틸셀룰로스의 가교물인 의료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    지방조직 유래 세포외기질 분말의 평균 입경은 100 내지 800 μm 인 의료용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    지방조직 유래 세포외기질 분말의 함량은 조성물 전체 중량 대비 1 내지 30 중량%인 의료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    생체적합성 고분자의 가교물은 가교제에 의해 가교되어 제조되며,
    상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 것인 의료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    의료용 조성물의 점성계수는 3,000 내지 20,000 Pa이고,
    탄성계수는 1,000 내지 10,000 Pa이며,
    복소점도는 1,000 내지 10,000 Pa·s 이고,
    압출력은 110 N 이하인 것인 의료용 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    의료용 조성물은 조직 수복제, 필러, 유착방지제, 성형보조물, 관절염 치료제, 창상 피복제, 지혈제, 또는 지방이상증 치료제로 사용되는 것인 의료용 조성물.
  9. 지방조직 유래 세포외기질 분말; 및 생체적합성 고분자의 가교물을 혼합하는 단계를 포함하며,
    상기 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 조성물 전체 중량 대비 0.1 내지 20 중량%이고,
    상기 생체적합성 고분자의 가교물은 히알루론산과 카복시메틸셀룰로스의 가교물인 의료용 조성물의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    지방조직 유래 세포외기질 분말은 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
    상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계;
    상기 세포가 제거된 지방조직을 동결건조하는 동결건조 단계; 및
    상기 동결건조된 동결건조물을 분말화하는 분말화 단계;를 통해 제조되는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    지질 성분의 제거는 물리적 처리 및/또는 화학적 처리에 의해 수행되며,
    물리적 처리는 분쇄이고,
    화학적 처리는 탈지질 용액을 사용하여 수행되는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 포함하는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    탈세포화는 염기성 용액을 사용하여 수행되며,
    상기 염기성 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    탈세포화 단계를 수행한 후, 원심분리하는 단계를 추가로 수행하는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  15. 제 9 항에 있어서,
    생체적합성 고분자의 가교물은 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 가교 단계; 및
    상기 가교된 가교물을 동결건조하는 동결건조 단계를 통해 제조되는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    가교제의 함량은 생체적합성 고분자 대비 0.5 내지 10 중량%인 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
  17. 제 9 항에 있어서,
    혼합된 혼합물을 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것인 의료용 조성물의 제조 방법.
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