KR102426802B1 - 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 - Google Patents
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102426802B1 KR102426802B1 KR1020190172588A KR20190172588A KR102426802B1 KR 102426802 B1 KR102426802 B1 KR 102426802B1 KR 1020190172588 A KR1020190172588 A KR 1020190172588A KR 20190172588 A KR20190172588 A KR 20190172588A KR 102426802 B1 KR102426802 B1 KR 102426802B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- fusion protein
- vegf
- cancer
- present
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title abstract description 55
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title abstract description 55
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 title description 32
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 title description 17
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 45
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 20
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 15
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 15
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 14
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 13
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 13
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 6
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 201000011199 bladder lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 abstract description 42
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 abstract description 28
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 abstract description 28
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 28
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 abstract description 14
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 8
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 5
- 108010082093 Placenta Growth Factor Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 92
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 88
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 35
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 34
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 33
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 32
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 27
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 19
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 13
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 description 13
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 11
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 9
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 9
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 8
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 6
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000007808 Cell invasion assay Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 4
- APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 4-[5-[3-(carboxymethoxy)phenyl]-3-(4,5-dimethyl-1,3-thiazol-2-yl)tetrazol-3-ium-2-yl]benzenesulfonate Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=C(OCC(O)=O)C=CC=2)=NN1C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100372760 Homo sapiens FLT1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000894590 Homo sapiens Uncharacterized protein C20orf85 Proteins 0.000 description 3
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 3
- LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 102100021442 Uncharacterized protein C20orf85 Human genes 0.000 description 3
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 3
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 2
- WWSJZGAPAVMETJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-ethoxypyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)OCC WWSJZGAPAVMETJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IETUUAHKCHOQHP-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(O)=O IETUUAHKCHOQHP-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- FFEUXEAKYRCACT-PEDHHIEDSA-N Arg-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(O)=O FFEUXEAKYRCACT-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 2
- NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N Arg-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- IARGXWMWRFOQPG-GCJQMDKQSA-N Asn-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IARGXWMWRFOQPG-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IBLAOXSULLECQZ-IUKAMOBKSA-N Asn-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O IBLAOXSULLECQZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 2
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N Cys-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- UXXIVIQGOODKQC-NUMRIWBASA-N Gln-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O UXXIVIQGOODKQC-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N Glu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N 0.000 description 2
- OGCIHJPYKVSMTE-YUMQZZPRSA-N Gly-Arg-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGCIHJPYKVSMTE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- NYEYYMLUABXDMC-NHCYSSNCSA-N Ile-Gly-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N NYEYYMLUABXDMC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- HUWYGQOISIJNMK-SIGLWIIPSA-N Ile-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N HUWYGQOISIJNMK-SIGLWIIPSA-N 0.000 description 2
- PFPUFNLHBXKPHY-HTFCKZLJSA-N Ile-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PFPUFNLHBXKPHY-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N Leu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 2
- FGZVGOAAROXFAB-IXOXFDKPSA-N Leu-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O FGZVGOAAROXFAB-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 2
- BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ATNKHRAIZCMCCN-BZSNNMDCSA-N Lys-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ATNKHRAIZCMCCN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- PNHRPOWKRRJATF-IHRRRGAJSA-N Met-Tyr-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PNHRPOWKRRJATF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- YUPRIZTWANWWHK-DZKIICNBSA-N Phe-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N YUPRIZTWANWWHK-DZKIICNBSA-N 0.000 description 2
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CLJLVCYFABNTHP-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLJLVCYFABNTHP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 2
- 101100331535 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DIB1 gene Proteins 0.000 description 2
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N Thr-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- GMXIJHCBTZDAPD-QPHKQPEJSA-N Thr-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GMXIJHCBTZDAPD-QPHKQPEJSA-N 0.000 description 2
- VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N Thr-Ser-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 2
- LTLBNCDNXQCOLB-UBHSHLNASA-N Trp-Asp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 LTLBNCDNXQCOLB-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N Tyr-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- JZWZACGUZVCQPS-RNJOBUHISA-N Val-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N JZWZACGUZVCQPS-RNJOBUHISA-N 0.000 description 2
- LCHZBEUVGAVMKS-RHYQMDGZSA-N Val-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(O)=O LCHZBEUVGAVMKS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 2
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 2
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 2
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 2
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 229940051306 eylea Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 2
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 102000055590 human KDR Human genes 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(azetidin-3-yloxy)-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(CN1C=C(C(OC2CNC2)=N1)C1=CN=C(NC2CC3=C(C2)C=CC=C3)N=C1)N1CCC2=C(C1)N=NN2 VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NOC(=N1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AETVBWZVKDOWHH-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-(1-ethylazetidin-3-yl)oxypyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)OC1CN(C1)CC AETVBWZVKDOWHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKOKHHBZFDFMJW-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-(2-morpholin-4-ylethoxy)pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)OCCN1CCOCC1 IKOKHHBZFDFMJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNPMDUDIDCXVCH-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-(3-piperazin-1-ylpropyl)pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(CN1C=C(C(CCCN2CCNCC2)=N1)C1=CN=C(NC2CC3=C(C2)C=CC=C3)N=C1)N1CCC2=C(C1)N=NN2 VNPMDUDIDCXVCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPZOCVVDSHQFST-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-ethylpyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)CC LPZOCVVDSHQFST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVTQDSGGHBWVTR-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-phenylmethoxypyrazol-1-yl]-1-morpholin-4-ylethanone Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)OC1=NN(C=C1C=1C=NC(=NC=1)NC1CC2=CC=CC=C2C1)CC(=O)N1CCOCC1 HVTQDSGGHBWVTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYELSNVLZVIGTI-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-5-ethylpyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1CC)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 FYELSNVLZVIGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGGVALXERJRIRO-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-2-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-1H-pyrazol-5-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)O MGGVALXERJRIRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N Ala-Glu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N Ala-Leu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N Ala-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)NCC(O)=O SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQLDNOCHHRISMS-NAKRPEOUSA-N Ala-Pro-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WQLDNOCHHRISMS-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N Ala-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- ZUVMUOOHJYNJPP-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZUVMUOOHJYNJPP-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- WONGRTVAMHFGBE-WDSKDSINSA-N Asn-Gly-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WONGRTVAMHFGBE-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000030808 Clear cell renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001362614 Crassa Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100497384 Drosophila melanogaster CASK gene Proteins 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- DHNWZLGBTPUTQQ-QEJZJMRPSA-N Gln-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N DHNWZLGBTPUTQQ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- XKBASPWPBXNVLQ-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XKBASPWPBXNVLQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WPJDPEOQUIXXOY-AVGNSLFASA-N Gln-Tyr-Asn Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O WPJDPEOQUIXXOY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N Gln-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N Glu-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N His-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- CSTDQOOBZBAJKE-BWAGICSOSA-N His-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O CSTDQOOBZBAJKE-BWAGICSOSA-N 0.000 description 1
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101000851030 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- VGSPNSSCMOHRRR-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N VGSPNSSCMOHRRR-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108700036276 KH902 fusion Proteins 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BTNXKBVLWJBTNR-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BTNXKBVLWJBTNR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CTJUSALVKAWFFU-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CTJUSALVKAWFFU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010059282 Metastases to central nervous system Diseases 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- JOXIIFVCSATTDH-IHPCNDPISA-N Phe-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N JOXIIFVCSATTDH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- AXIOGMQCDYVTNY-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 AXIOGMQCDYVTNY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- ZVRJWDUPIDMHDN-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ZVRJWDUPIDMHDN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Cys Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SJRQWEDYTKYHHL-SLFFLAALSA-N Phe-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=CC=C3)N)C(=O)O SJRQWEDYTKYHHL-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N Pro-Gln-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZLXKLMHAMDENIO-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLXKLMHAMDENIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 101100020526 Pycnoporus cinnabarinus LCC3-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 206010039020 Rhabdomyolysis Diseases 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000720795 Schizosaccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N Ser-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N Ser-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- RCOUFINCYASMDN-GUBZILKMSA-N Ser-Val-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O RCOUFINCYASMDN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241001147693 Staphylococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 101100074140 Trametes versicolor LCC4 gene Proteins 0.000 description 1
- UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N Trp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- KSFXWENSJABBFI-ZKWXMUAHSA-N Val-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KSFXWENSJABBFI-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N Val-Ser-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BZDGLJPROOOUOZ-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BZDGLJPROOOUOZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- -1 and Proteins 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 206010073251 clear cell renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229950005748 conbercept Drugs 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 208000001309 degenerative myopia Diseases 0.000 description 1
- 230000004340 degenerative myopia Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000008571 general function Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 101150075807 lcc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035168 lymphangiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 108091008602 mbVEGFR Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000013152 negative regulation of cell migration Effects 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020615 rectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108091008601 sVEGFR Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 108010052774 valyl-lysyl-glycyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 암 치료 또는 안질환 치료의 수단으로써 혈관내피성장인자 및 태반성장인자에 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 융합단백질을 포함하는 약학조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질 (KP-VR2)은 (a) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2; (b) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2; 및 (c) 인간 IgG의 Fc 부위를 포함하는 폴리펩티드로서, VEGF 및 PlGF에 대해 높은 결합친화도를 갖는다. 또한, 본 발명의 재조합 융합단백질은 혈관내피세포의 이동 및 침윤억제효과가 우수하며, 다양한 암종 및 섬유아세포에 대해 현저히 우수한 증식억제효과를 갖는다. 따라서, 혈관신생에 의해 유발되는 암질환 및 안과질환의 치료제로써 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 신생혈관형성 관련 질환의 예방, 치료 및/또는 억제를 위한 약물의 제조에 이용될 수 있는, 혈관내피성장인자 수용체 재조합 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 면역글로불린유사 도메인의 Fc 부위에 VEGFR 세포외 도메인이 융합된 다가의 이중표적항체이다.
혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF)는 신호전달단백질의 일종이며, 순환계형성 (vasculogenesis) 및 혈관신생 (angiogenesis)에 중요한 역할을 한다. VEGF는 혈액순환이 부적절할 경우 조직에 산소를 저장 및 공급하는 시스템의 일부로서 기능하는데, VEGF의 일반적인 기능은 배아발달, 부상 또는 운동 후의 근육, 경색된 혈관을 우회하는 혈관의 형성 등의 과정에서 새로운 혈관을 생성하는 것이다. 그러나 증가된 양의 VEGF는 비정상적인 혈관신생을 야기할 수 있다. 특히 혈관신생 또는 신생혈관형성은 종양발생에도 관련되어, 원발성 또는 전이성 종양의 발생에 수반되고, 혈관신생에 의해 원발성 암의 암세포가 혈관 내로 유입되면 암전이가 일어난다. 혈관신생은 천식, 호흡곤란, 자궁내막증; 죽상동맥경화증 및 조직부종과 같은 급성 및 만성 염증; 간염 및 카포시 육종과 같은 감염원의 질환; 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염 및 갑상선염과 같은 자가면역질환; 및 당뇨병성망막증, 맥락막혈관신생증 (choroidal neovasularization, CNV), 노인성황반변성 (age-related macular degeneration, AMD) 및 혈관섬유종과 같은 질환 (Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249-257; Kuwano M, et al.2001. Intern Med 40: 565-572)을 유발하는 것으로 알려져 있다.
혈관신생에서 중요한 역할을 하는 VEGF는 주로 혈관내피를 구성하는 세포에 영향을 미친다. 시험관 내 (in vitro) 결과에 따르면, VEGF는 혈관내피세포의 분열 및 유주를 자극하고 미세혈관 투과성을 높인다. VEGF는 포유류에서 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 PLGF (PlGF, PGF, placenta growth factor)의 5종류로 분류된다. VEGF-A는 혈관신생, 혈관내피세포의 유주, 분열, 혈관내강 형성, 대식세포 및 과립세포 (granulocyte)의 주화성, 혈관확장 등을 촉진하고, VEGF-B는 배아의 혈관신생, 특히 심근조직의 형성을 촉진한다. VEGF-C는 림프관형성 (Lymphangiogenesis)을 촉진하며, VEGF-D는 폐 세기관지를 둘러싼 림프관의 발달에 필요하다. PlGF는 순환계형성 (Vasculogenesis), 허혈 (ischemia), 염증, 상처회복, 암에서의 혈관신생에 중요한 역할을 한다.
VEGF 수용체 (VEGF receptor, VEGFR)는 상기 VEGF를 리간드로 하는 수용체로서, VEGFR1 (flt-1), VEGFR2 (Kdr/flk-1) 및 VEGFR3 (flt-4) 등 3개 아형이 있고, 이들은 유전자의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 세포막 수용체 (membrane-bound VEGFR, mbVEGFR) 또는 수용성 수용체 (soluble VEGFR, sVEGFR) 형태로 존재한다. VEGF 수용체는 혈관내피세포에 일반적으로 존재하지만 신경세포, 카포시육종 (Kaposi's sarcoma) 및 조혈모세포 등에서 발현된다. VEGF가 VEGF 수용체에 결합되면 수용체 타이로신 (tyrosine) 잔기의 인산화와 함께 수용체 이중화 (dimerization) 작용으로 신호가 전달된다.
VEGF는 이의 수용체인 VEGFR1 및 VEGFR2에 대해 높은 친화도로 결합하고, 주로 VEGFR2을 통해 신호를 전달하여, 혈관내피세포의 증식과 이동 등 혈관신생과 관련된 기작을 유도한다. 따라서, VEGF 및 VEGFR2은 VEGF에 의해 유도되는 혈관신생 기작을 억제하기 위한 표적이 되어왔다 (Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579, 2008; Youssoufian et al., Clin. Cancer Res., 13:5544s, 2007). 종래 개발된 융합단백질 계열의 anti-VEGF로서 이중표적항체 (bi-specific antibody) 또는 다중표적항체 (multi-specific antibody)는, i) VEGFR1 도메인2, VEGFR2 도메인3, 도메인4 및 IgG1 Fc로 구성된 콘베르셉트 (Conbercept), ii) VEGFR1 도메인2, VEGFR2 도메인3 및 IgG1 Fc로 구성된 VEGF-Trap (Aflibercept), 및 iii) VEGFR1 도메인2, 도메인3 및 IgG1 Fc로 구성된 VEGF-Grab 등이 있다.
본 발명자들은 혈관신생 억제를 통한 항암치료용 및 안과질환치료용 다중표적항체 개발을 위해 부단히 노력한 결과, 놀랍게도 VEGF-A, VEGF-B 및 PLGF에 높은 민감도와 특이도로 결합하고, in vitro 및 in vivo 에서 신생혈관형성 관련 질환에 대해 뛰어난 억제효과를 지닌, 면역글로불린-유사 도메인의 융합단백질을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579, 2008; Youssoufian et al., Clin. Cancer Res., 13:5544s, 2007
이와 같이, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는, 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하고, 혈관신생과 관련된 질환으로서 암질환 및 안질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는, 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하고, 혈관신생과 관련된 질환으로서 암질환 및 안질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 4가 다중표적항체로서 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 제공한다. 본 발명의 융합단백질은 면역글로불린-유사 도메인의 재조합 융합단백질로서, (a) 2개의 중쇄가 이황화결합 (disulfied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인 및 (b) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되며, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합된다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 융합단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 발현벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성한다. 상기 재조합 발현벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp .), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속 (Staphylococcus sp .)과 같은 원핵세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속 (Aspergillus sp .)과 같은 진균, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속 (Schizosaccharomyces sp .) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장세포7 (COS7:monkey kidney cells) 세포, NSO세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터난소 (CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터신장 (BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하다.
본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 방법을 포함하며, 숙주세포에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, 엘렉트로포레이션 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 융합단백질을 발현시키기 위해 다양한 재조합 발현벡터/숙주세포 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현조절서열이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세균숙주에 사용할 수 있는 발현벡터는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다 (phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모세포에 유용한 발현벡터는 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충세포에 유용한 벡터는 pVL941이다. 본 발명에서 재조합 발현벡터는 플라스미드, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), 또는 재조합바이러스일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (a) 상기 숙주세포를 융합폴리펩티드 생산이 가능한 조건 하에서 성장시키는 단계; 및 (b) 생산된 융합폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 숙주세포는 상기 융합 폴리펩티드를 암호화 하는 염기서열이 발현조절서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 포함한다. 상기 융합폴리펩티드는 상기 (a) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2 (immunoglobulin-like domain 2); (b) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2; 및 (c) 인간 IgG의 Fc 영역 폴리펩티드를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를, 원핵 또는 진핵 발현시스템에서 발현시켜 생산될 수 있다. 상기 생산된 융합폴리펩티드는 생물학적으로 안정적인 단백질을 형성하는 일반적인 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 투석 (dialysis), 이온교환 크로마토그래피 (ion-exchange chromatography), 친화크로마토그래피 (affinity chromatography), HPLC (high pressure liquid chromatography), PAGE (polyacrylamide gel electrophoesis) 등의 정제방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 제조방법에 의하여 제조된 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 제공한다. 본 발명의 실시예 2 내지 4에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 타겟 리간드인 VEGF-A 및 PlGF에 대해, 선행기술인 애플리버셉트 (Afliberceptⓡ) 및 베바시주맙 (Bevacizumabⓡ)과 비교하여 현저히 우수한 결합력을 갖는다. 또한, 실시예 5에 따르면, 본 발명의 재조합 융합단백질 (KP-VR2)은, 이를 VEGF 관련 질환의 치료가 필요한 피험자에게 투여할 경우, 체내 VEGF와 매우 높은 민감도와 특이도로 결합하여 anti-VEGF 기능을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예 6에 따르면, 본 발명의 융합단백질 (KP-VR2)은 선행기술인 애플리버셉트와 유사한 약동학적 (pharmacokinetic) 특성을 가지므로 기존에 상용화된 anti-VEGF를 대체하거나 이와 병용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 종양치료용 약학적 조성물 및 안구 내 혈관신생과 관련된 안질환치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 실시예 7에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 혈관내피세포 (HUVEC) 및 혈관내피유래 세포주 (EA-hy923)의 이동 및 침윤을, 보다 적은 농도에서 보다 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 세포이동과 침윤은 혈관내피세포의 혈관형성에 중요한 과정이므로, 이로부터 본 발명의 융합단백질이 암 및 혈관신생관련 안질환을 포함하는 질환에서 혈관신생 억제제로서 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예 8 내지 10은, 본 발명의 융합단백질 (KP-VR2)이 in vitro 및 in vivo 에서 다양한 인간유래 암종과 섬유아세포 및 이들의 누드마우스로의 이종이식편의 성장을 억제하는 효과가 매우 우수함을 제시한다.
일 실시예에서, 본 발명의 융합단백질을 사용하여 치료할 수 있는 종양의 예로서 유피낭종 (epidermoid tumors), 머리 및 목에서와 같은 편평종양 (squamous tumors), 결장직장종양, 전립선, 유방, 폐 (소세포 및 비-소세포 종양 포함), 췌장, 갑상선, 난소 및 간, 카포시 육종, 중추신경계 이상증식 (신경아세포종, 모세혈관 혈관세포아종, 수막종 및 뇌 전이), 흑색종, 신장 암종, 위장관 종양, 횡문근육종, 신경교아세포종 및 평활근육종 등이 제시된다. 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 “안구 내 혈관신생과 관련된 안질환”은 노인성 황반변성, 삼출성 노인성 황반변성, 맥락막혈관신생, 맥락막혈관병증, 병적 근시, 당뇨성 망막병증, 당뇨성 황반부종, 망막혈관폐쇄, 미숙아망막병증 또는 신생혈관성 녹내장일 수 있다. 또한, 상기 맥락막혈관신생은 근시성 맥락막혈관신생, 외상성 맥락막혈관신생, 포도막염에 의한 맥락막혈관신생, 안 히스토플라즈마증, 또는 특발성 맥락막혈관신생일 수 있다.
이와 관련된 본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 혈관내피성장인자와 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 융합단백질로서, (a) 2개의 중쇄가 이황화결합 (disulfied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인, 및 (b) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되며, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합된, Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물로서, 상기 Fc 융합단백질 대 VEGFR1 항원이 1:2 이상 결합하는 것인, 신생혈관생성 관련 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이러한 범주에 속하는 본 발명의 다른 일시예에서, 신생혈관형성 관련 암질환은 직결장암, 자궁암, 위암, 간암, 흑색종, 폐암, 신장암, 췌장암, 방광암, 림프종 (lymphoma) 및 뇌암을 포함할 수 있으며, 신생혈관형성 관련 안과질환은 포도막 흑생종, 습성 황반변성 (wet age-related macular degeneration, AMD), 당뇨황반부종 (diabetic macular edema), 망막정맥폐쇄 (retinal vein occlusion), 또는 당뇨망막병증 (diabetic retinopathy)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 약리학적 유효성분으로서 혈관내피성장인자 (VEGF)와 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 Fc 융합단백질 1 ~ 100 ㎎/㎖; (b) 용매로서 폴리소르베이트 0.01 ~ 1%(w/v); 및 (c) 완충제 (buffer)로서 인산나트륨 5 ~ 50 mM, 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM, 또는 인산나트륨 5 ~ 50 mM 및 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM를 포함하고, pH가 6.5 ~ 7.5인, 신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 Fc 융합 단백질은 (i) 2개의 중쇄가 이황화결합 (disulfied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인, 및 (ii) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되고, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합된 것인, 신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 액상 또는 동결건조된 약제학적 제형을 제공한다.
이와 관련된 일 실시예에서, 상기 약제학적 제형은 수크로오스, 소르비톨, 글리세롤, 트리할로오스 및 만니톨로 구성된 군으로부터 하나 이상의 안정화제 1 ~ 10%(w/v); 및 등장화제 (isotonic agent) 10 ~ 150 mM를 더 포함할 수 있다. 이 범주에 속하는 다른 일 실시예에서, 바람직하게는, 상기 Fc 융합단백질 25 ㎎/㎖, 상기 폴리소르베이트 0.03 %(w/v), 상기 인산나트륨 10 mM, 상기 시트르산나트륨 10 mM 및 상기 수크로오스는 5%(w/v)를 포함할 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다. 또한, 이 범주에 속하는 또 다른 일 실시예에서, 바람직하게는, 상기 Fc 융합단백질 25 ㎎/㎖, 및 상기 폴리소르베이트 0.03 %(w/v)이 포함되고, 상기 등장제는 염화나트륨으로 40 mM 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 범주에 속하는 또 다른 일 실시예에서, 바람직하게는, 상기 Fc 융합단백질 20 ~ 100 ㎎/㎖, 상기 폴리소르베이트 0.03 %(w/v), 상기 인산나트륨 5 mM, 상기 시트르산나트륨 5 mM 및 상기 수크로오스 5%(w/v) 이고, 및 상기 등장제는 염화나트륨으로 40 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 범주에 속하는 또 다른 일 실시예에서, 상기 Fc 융합단백질은 가장 바람직하게는 15 ㎎/㎖ , 25 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖, 60 ㎎/㎖, 80 ㎎/㎖ 및 100 ㎎/㎖로 구성된 군으로부터 선택된 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 약학 조성물 또는 약제학적 제형을 포함하는 시린지가 제공되며, 상기 시린지는 정맥투여 (intravenous, iv), 피하투여 (subcutaneous, sc) 또는 복강 내 투여 (intraperitoneal, ip) 투여를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 치료하고자 하는 질환에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 분리하여 또는 병행하여 투여할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 유효성분과 상관없는 약학적으로 허용되는 부형제, 완충용액, 안정화제 또는 약학적 담체 또는 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비 독성이며 유효성분의 효능을 방해하지 않으며, 이들의 정밀한 성질은 경구, 점막, 또는 비경구(예를 들어, 정맥 내 주입)인 투여 경로에 따른다. 본 발명의 융합단백질은 투여량 0.001 ~ 5 ㎎/one eye 또는 1 ~ 10 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다.
본 발명의 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질은 4가 항체인 면역글로불린-사 도메인의 융합단백질로서, 인간 IgG1 Fc 부위의 각 중쇄에 한쌍의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 융합된 구조를 가지며, VEGF 및 PlGF에 대한 결합친화성이 강하고, 혈관내피세포의 이동 및 침윤억제효과가 우수하며, 다양한 암종 및 섬유아세포에 대하여도 증식억제효과가 뛰어나다. 따라서, 본 발명의 융합단백질은 혈관내피성장인자의 과다발현에 의해 유발되는 암질환 및 혈관신생과 관련된 안질환의 치료제로서 개발 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 융합단백질 컨스트럭트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2a, 2b 및 도 3은 애플리버셉트의 구조 및 본 발명의 KP-VR2 (VEGFR 융합 단백질)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 융합단백질 KP-VR2를 정제하고 SDS-PAGE 후 웨스턴 블럿을 수행하여 분자의 크기 확인 것이다.
도 5는 본 발명의 융합단백질, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 VEGF-A에 대한 결합친화력을 ELISA 시험으로 비교한 것이다.
도 6은 본 발명의 융합단백질, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 PlGF에 대한 결합친화력을 ELISA 시험으로 비교한 것이다.
도 7은 본 발명의 융합단백질 KP-VR2의 리간드 (VEGFA165, VEGFA121 또는 PlGF)에 대한 최대 결합력을 비교한 것이다.
도 8은 본 발명의 융합단백질과 애플리버셉트의 VEGF-A165에 대한 최대 결합력을 SPR 시험으로 확인한 것이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 융합단백질의 투여경로에 따른 약동력학적 특성을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 융합단백질이 제대유래 혈관내피세포 (HUVEC)의 이동 및 침윤을 억제하는 수준을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 융합단백질이 혈관내피세포주 (EA-hy926)의 이동 및 침윤을 억제하는 정도를 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 융합단백질이 9종의 암종에 대해 세포분열을 억제하는 능력을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 13 및 도 14는 anti-VEGF 내성 암종 및 섬유아세포에 대한 본 발명의 융합단백질의 세포분열 억제능력을 애플리버셉트와 비교하여 나타낸 것이다.
도 15 내지 도 17은 본 발명의 융합단백질 및 애플리버셉트의 누드마우스에 이종이식한 종양 (HT-29, LOVO, 및 SKUT1B)의 성장억제효과를 비교한 것이다.
도 18은 본 발명의 KP-VR2에 대한 재조합발현벡터를 나타낸다.
도 19는 본 발명에서 제조한 KP-VR3에 대한 재조합발현벡터를 나타낸다.
도 20은 ASPC-1 (ATCCⓡ CRL-1682) 또는 MIA PaCa2세포 (ATCCⓡ CRL-1420) 등의 췌장암종들에서 종양 성장억제력을 비교한 결과이다.
도 21은 MKN 45 (KCLB No.80103), NCI-N87(ATCCⓡ CRL-25822™), MKN 28(KCLB No.80101), 또는 SNU 16 (KCLB No. 00016) 위암들에서 종양 성장 저해효과를 확인한 결과이다.
도 22는 HepG2 (ATCCⓡ HB-8065™), SNU423(ATCCⓡ CRL-2238, A549 (ATCCⓡ CCL-185™) 또는 B16F10(ATCCⓡ CRL-6475™) 성장의 저해효과를 확인한 결과이다.
도 23은 Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™) 또는 EL-4 (ATCCⓡ TIB-39) 암종들에 대한 세포분열 억제능력을 확인 한 결과이다.
도 24는 토끼의 안구에 레이저 (laser)를 조사하여 맥락막신생혈관 (choroidal neovascularization, CNV)를 유발하고, 시험물질을 투여한 후 시험물질의 효력을 평가한 결과이다.
도 25는 본 발명의 약제학적 제형을 냉장, 상온 및 40℃ 조건 하에서 보관하는 동안 생성된 불순물을 SE-HPLC로 확인한 결과이다.
도 26은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 냉장 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 27은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 상온 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 28은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 가혹조건에서 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 29는 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 냉장보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 30은 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 상온에서 보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 31은 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 가혹조건하에서 보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 2a, 2b 및 도 3은 애플리버셉트의 구조 및 본 발명의 KP-VR2 (VEGFR 융합 단백질)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 융합단백질 KP-VR2를 정제하고 SDS-PAGE 후 웨스턴 블럿을 수행하여 분자의 크기 확인 것이다.
도 5는 본 발명의 융합단백질, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 VEGF-A에 대한 결합친화력을 ELISA 시험으로 비교한 것이다.
도 6은 본 발명의 융합단백질, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 PlGF에 대한 결합친화력을 ELISA 시험으로 비교한 것이다.
도 7은 본 발명의 융합단백질 KP-VR2의 리간드 (VEGFA165, VEGFA121 또는 PlGF)에 대한 최대 결합력을 비교한 것이다.
도 8은 본 발명의 융합단백질과 애플리버셉트의 VEGF-A165에 대한 최대 결합력을 SPR 시험으로 확인한 것이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 융합단백질의 투여경로에 따른 약동력학적 특성을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 융합단백질이 제대유래 혈관내피세포 (HUVEC)의 이동 및 침윤을 억제하는 수준을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 융합단백질이 혈관내피세포주 (EA-hy926)의 이동 및 침윤을 억제하는 정도를 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 융합단백질이 9종의 암종에 대해 세포분열을 억제하는 능력을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 13 및 도 14는 anti-VEGF 내성 암종 및 섬유아세포에 대한 본 발명의 융합단백질의 세포분열 억제능력을 애플리버셉트와 비교하여 나타낸 것이다.
도 15 내지 도 17은 본 발명의 융합단백질 및 애플리버셉트의 누드마우스에 이종이식한 종양 (HT-29, LOVO, 및 SKUT1B)의 성장억제효과를 비교한 것이다.
도 18은 본 발명의 KP-VR2에 대한 재조합발현벡터를 나타낸다.
도 19는 본 발명에서 제조한 KP-VR3에 대한 재조합발현벡터를 나타낸다.
도 20은 ASPC-1 (ATCCⓡ CRL-1682) 또는 MIA PaCa2세포 (ATCCⓡ CRL-1420) 등의 췌장암종들에서 종양 성장억제력을 비교한 결과이다.
도 21은 MKN 45 (KCLB No.80103), NCI-N87(ATCCⓡ CRL-25822™), MKN 28(KCLB No.80101), 또는 SNU 16 (KCLB No. 00016) 위암들에서 종양 성장 저해효과를 확인한 결과이다.
도 22는 HepG2 (ATCCⓡ HB-8065™), SNU423(ATCCⓡ CRL-2238, A549 (ATCCⓡ CCL-185™) 또는 B16F10(ATCCⓡ CRL-6475™) 성장의 저해효과를 확인한 결과이다.
도 23은 Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™) 또는 EL-4 (ATCCⓡ TIB-39) 암종들에 대한 세포분열 억제능력을 확인 한 결과이다.
도 24는 토끼의 안구에 레이저 (laser)를 조사하여 맥락막신생혈관 (choroidal neovascularization, CNV)를 유발하고, 시험물질을 투여한 후 시험물질의 효력을 평가한 결과이다.
도 25는 본 발명의 약제학적 제형을 냉장, 상온 및 40℃ 조건 하에서 보관하는 동안 생성된 불순물을 SE-HPLC로 확인한 결과이다.
도 26은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 냉장 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 27은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 상온 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 28은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 가혹조건에서 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 29는 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 냉장보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 30은 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 상온에서 보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 31은 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 가혹조건하에서 보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위한 것일 뿐, 이들 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1:
VEGFR
융합 단백질
KP
-VR2의 생산
인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR2 도메인3 (KP-VR1); 인간 IgG1의 Fc 도메인 (서열번호: 2)에 융합된 인간 VEGFR1 도메인2 (KP-VR2) (서열번호: 1); 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR2 도메인 3 (서열번호: 3) 및 VEGFR1 도메인2 (KP-VR3); 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR1 도메인 2 및 VEGFR2 도메인 3 (KP-VR4, Aflibercept)를 각각 pCHO 1.0 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. KP-VR1 내지 KP-VR4 컨스트럭트로 CHO-S세포 (Invitrogen) 를 트랜스펙션하고 (리포펙타민 형질전환방법, Invitrogen사 제공), 트렌스펙션된 세포를 메토트렉세이트 (methotrexate)와 퓨로마이신(Puromycin)로 선별하였다. KP-VR2와 KP-VR4 (VEGF-Trap; Aflibercept; 상품명 Eylea)를 단백질 A-세파로스 친화 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 정제된 단백질을 HPLC 분석으로 정량하고, SDS-PAGE 후 웨스턴블럿 (western blot)을 수행하였다. 각각의 컨스트럭트를 도 1에 나타내었다. 웨스턴블럿의 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR1 도메인2 (KP-VR2)는 125 kDa 정도의 밴드사이즈를 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예
2: 본 발명의
KP
-VR2,
애플리버셉트
(
aflibercept
) 및
베바시주맙
(
bevacizumab
)의
VEGF
-
A에 대한 결합 친화력
측정
VEGF-A 리간드에 대한 KP-VR2, KP-VR4(애플리버셉트) 또는 베바시주맙의 결합 친화도를 비교하였다. “BEVACIZUMAB Summary Validation Report” (February 28, 2014)의 지시에 따라 효소면역법 (ELISA)을 사용하였다. 먼저 96웰 플레이트(Nunc사)를 50 ng/㎖ VEGFA165(I) (R&D systems)로 코팅하고, KP-VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) 또는 아바스틴(베바시주맙)을 단계적으로 증가된 양 (0.0122 ~ 1,000 ng/㎖)으로 가하였다. 플레이트를 세척한 후, 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 (peroxidase conj㎍ated) 항-인간 Fc 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine) (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기 (spectrophotometer, Biorad)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
또한, KP-VR2 또는 KP-VR4 (애플리버셉트)의 VEGF-A에 대한 결합량을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2 또는 KP-VR4 애플리버셉트로 코팅하고, VEGF165(II) (R&D systems) 을 단계적으로 증가된 양 (0.03125 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시켰고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig항체와 함께 반응시켰다.
다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예
3: 본 발명의
KP
-VR2,
애플리버셉트
또는
베바시주맙의
PlGF에
대한 중화작용 비교
PlGF (placental growth factor)에 대한 본 발명의 KP-VR2, KP-VR4(애플리버셉트) 또는 베바시주맙의 결합 친화도를 알아보기 위하여 효소면역법을 사용하였다. 먼저 96 웰 플레이트 (Nunc)를 50 ng/㎖ PlGF(I)로 코팅하고, KP-VR2 (0.0122 ~ 1,000 ng/㎖), 애플리버셉트 (0.390625 ~ 16,000 ng/㎖) 또는 베바시주맙 (0.0122 ~ 1,000 ng/㎖)을 단계적으로 증가된 양 (0.0122 ng/㎖ ~ 1 uM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후 퍼옥시다아제 컨쥬게이션 된 항-인간 Fc 항체와 함께 반응시켰다. 이후 3,3’, 5,5’- 테트라베틸벤지딘 (TMB) 용액(Roche)을 첨가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, KP-VR2 또는 KP-VR4의 PlGF에 대한 결합량을 비교하기 위하여, 96웰 플레이트 (Nunc)를 400 ng/㎖ KP-VR2 또는 KP-VR4로 코팅하고, PlGF을 단계적으로 증가된 양 (0.8 12,500 ng/㎖)으로 첨가하였다. 비오티닐화된-PlGF 항체와 1시간 반응시키고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션 (peroxidase conj㎍ated) 된 항-염소 Ig항체 (R&D systems)와 함께 반응시켰다. 이후 3,3’, 5,5’-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, PlGF에 대한 KP-VR2 및 애플리버셉트의 결합 친화도를 비교하기 위하여, 96웰 플레이트를 50 ng/㎖ PlGF로 코팅하고, KP-VR2 또는 애플리버셉트와는 단계적으로 증가된 용량의 PlGF (2 ~ 31,250 ng/㎖)를 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-인간 Fc 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3,3’, 5,5’-테트라벤지딘 (TMB) 용액을 가하고, ELISA 리더기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 PlGF 대한 역가가 KP-VR4 (애플리버셉트)와 비교하여 약 42배까지 증가하였고, KP-VR2의 PlGF와의 최대 결합량은 KP-VR4 (애플리버셉트)와 비교하여 약 200% 증가하였다 (도 6). 이는 KP-VR2이 현저히 높은 PlGF에 대한 결합력을 가지는 것을 제시한다. 한편, 본 발명의 KP-VR2는 KP-VR4 (애플리버셉트)와 유사한 수준의 PlGF에 대한 결합력을 보였다.
실시예
4: 본 발명의
KP
-VR2의 리간드 (
VEGFA165
또는
PlGF
)에 대한 최대 결합값 비교
본 발명의 KP-VR2, KP-VR(애플리버셉트) 또는 베바시주맙의 VEGFA165 또는 PlGF에 대한 최대 결합값을 ELISA 시험을 통해 확인하고 그 결과를 하기 표 1 (KP-VR2, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 VEGF 및 PlGF에 대한 결합 친화성 비교)에 나타내었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 애플리버셉트 보다 VEGFA에 대한 결합능력이 약 100% 높았고, PlGF에 대한 결합능력이 약 76% 높은 것으로 확인되었다.
| 리간드 결합력 | |||
| 리간드 | Bmax (OD) | 비고 | |
| KP-VR2 | VEGF-A165 | 1.30±0.003 | 106% 증가 |
| 애플리버셉트 | VEGF-A165 | 0.63±0.008 | |
| 베바시주맙 | VEGF-A165 | 0.55±0.051 | |
| KP-VR2 | PLGF | 1.60±0.03 | 75.8% 증가 |
| 애플리버셉트 | PLGF | 0.91±0.03 | |
또한, 리간드 (ligands)와 약물의 결합력을 비교하기 위하여 Octet (Pall ForteBio) 시험을 수행했다. 먼저, 2 ㎍/㎖ 애플리버셉트와 8 ㎍/㎖ KP-VR2을 200 ㎕씩 플레이트에 분주하고, 애널라이트 (analyte)로서 VEGF-A (R&D systems)를 20 nM부터 0.315 (20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 및 0.3125) nM, PLGF (R&D systems)를 80 nM부터 2.5 nM (80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25) 까지 1/2씩 희석하고 200 ㎕씩 분주하여 준비하였다. 애플리버셉트를 2 ㎍/㎖, KP-VR2를 8 ㎍/㎖ 농도로 플레이트에 붙인 후 VEGF-A를 애널라이트로 하여 결합력을 측정하였다. 도 7의 A는 VEGF-A를 20 nM부터 1/2씩 희석하여 러닝하였다. Curve fit model은 1:1 바인딩 모델을 적용하였으나 KP-VR2 경우 에피토프가 2곳임을 가정하여 2:1 heterogeneous binding model (KP-VR2)을 적용하였다. 애플리버셉트의 KD값은 2.69 x 10- 12으로 측정되었다. 2:1 heterogeneous binding model에서 KP-VR2와 VEGF-A와의 결합에서 측정된 KD값에서 dissociation값에 의해 측정범위를 넘어선 KD값 (<1.00x10-12)과 4.75 x 10-12 수준의 KD값이 산출되었다 (표 2 및 표 3). 표 2는 VEGF-A에 대한 kinetic, 표 3은 PLGA에 대한 kinetc을 나타낸 것이다.
| Fitting model (Octet) | VEGF : Receptor | KD(M) | Kon(1/ms) | Kdis(1/s) |
| 1:1 | Aflibercept | 2.69x10-12 | 6.01x105 | 1.64x10-6 |
| 2:1 | KP-VR2 | <1.00x10-12 | 3.35x104 | <1.00x10-7 |
| 4.75x10-12 | 6.44x104 | 3.30x10-7 |
| Fitting model | PLGF : Receptor | KD(M) | Kon(1/ms) | Kdis(1/s) |
| 1:1 | Aflibercept | 2.65x10-10 | 2.96x105 | 7.86x10-5 |
| 2:1 | KP-VR2 | 7.49x10-10 | 2.16x105 | 1.62x10-4 |
| 4.85x10-8 | 1.41x105 | 6.85x10-3 |
실시예
5:
융합단백질
KP
-VR2와
애플리버셉트의
VEGF
-A165에 대한 최대 결합력 비교
리간드들 (ligands)과 약물들과의 최대 결합력을 비교하기 위하여 Octet (Pall ForteBio) 시험을 수행했다. 동일 농도 (8 μg/ml)의 애플리버셉트와 KP-VR2을 200 μl씩 센서 (ForteBio)에 분주하고, analyte로서 VEGF-A (R&D systems)를 40 nM부터 1.25 (40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25) nM까지 ½씩 희석하여 200 μl씩 분주하여 준비하였다. 애플리버셉트의 VEGF-A165의 최대 결합값은 ~ 0.2687 nm이고 KP-VR2의 VEGF-A165의 최대 결합값은 ~ 0.5332 nm 이었다. 그 결과를 도 8 및 표 4 (KP-VR2 및 KP-VR4의 VEGF에 대한 결합친화도)에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 VEGFA165 최대결합값은 ~0.5332 nm로 애플이버셉트의 최대 결합값 ~ 0.2687 nm 대비 ~ 98.4% 증가하였다 (표 4). 따라서, 본 발명의 KP-VR2이 KP-VR4 (애플리버셉트)와 비교하여 현저히 높은 수준의 VEGF-A 결합력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
| Kinetic binding parameters | |||
| 리간드 | Rmax(nm) | 비고 | |
| KP-VR2 | VEGF | ~ 0.5332 | 98.4% 증가 |
| 애플리버셉트 | VEGF | ~ 0.2687 | |
또한, 본 발명의 KP-VR2 및 KP-VR4 (애플리버셉트)의 VEGFA165, 또는 PlGF에 대한 최대 결합값을 ELISA 시험을 통해 확인하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 표 5는 KP-VR2, 애플리버셉트 또는 베바시주맙의 VEGF 및 PlGF에 대한 결합값 비교시험으로 표 5에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 애플리버셉트 또는 베바시주맙 보다 VEGFA에 대한 최대 결합량이 2배 높았고, PLGF 경우 애플리버셉트 보다 2배 더 많이 결합됨이 확인되었다. 애플리버셉트 또는 베바시주맙은 리간드에 1:1 결합하는 것으로 알려졌으며, KP-VR2는 1:2 리간드 결합할 수 있음이 확인되었다.
| Molecule | Stoichiometry of VEGF-A | Stoichiometry of PLGF |
| Bevacizumab | 1:1 | - |
| Aflibercept | 1:1 | 1:1 |
| KP-VR2 | 1:2 | 1:2 |
| Difference in anti-VEGF agents: higher avidity | ||
실시예
6. 본 발명의
KP
-VR2의
랫트에서의
약동력학
(
pharmacokinetic
) 특성
VR-2와 KP-VR4 (애플리버셉트)의 약동력학 (PK)을 확인하기 위하여, KP-VR2와 KP-VR4 (애플리버셉트)를 사용하여 랫트에서 IV (intravenous, 정맥 내) 투여와 SC (subcutaneous, 피하) 투여 2개 그룹으로 나누어 1 ㎎/㎏의 용량을 투여한 후 ELISA 시험을 수행하였다. 먼저 IV 투여 그룹은 각각 180 ~ 200 g으로 계량된 암컷 SD (Sprague-Dawley) 랫트 (오리엔트바이오, 6주령)에 KP-VR2 및 KP-VR4 (애플리버셉트)을 각각 꼬리정맥에 주사한 직후 (0H), 5분, 15분, 45분, 3시간, 5시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 168 시간 별로 랫트의 경정맥에서 혈액을 채취하여 투여된 물질의 변화량을 확인하였다 (VEGF-TRAP: A VEGF BIOCKER WITH POTENT ANTI TUMOR EFFECTS. PNAS. 2002, 99(17):139311398). 다음, SC 투여 군은 180 ~ 200 g으로 계량된 암컷 SD (오리엔트바이오, 6주령, Sprague-Dawley) 랫트에 시험물질 (KP-VR2, 애플리버셉트)을 랫트의 목 뒤쪽에 피하주사를 한 직후 (0H), 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 48시간, 96시간, 168시간, 240시간, 및 336 시간 별로 랫트의 경정맥에서 혈액을 채취하여 시험물질의 변화량을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 KP-VR4 (애플리버셉트)와 유사한 생체 내 반감기를 가지며 유사한 약동학적 특성을 나차냈다.
실시예
7: 혈관내피세포에서
KP
-VR2에 의한 세포이동 및 침윤억제 분석
실시예 7-1. HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells)에서 KP -VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) 또는 베바시주맙 처리 후 VEGF-A로부터 유도된 세포침윤 억제력 측정
혈관내피세포의 KP-VR2에 의한 세포이동 및 침윤억제 정도를 측정하기 위하여 트랜스웰 (transwell) 시스템에서 화학주성 운동 분석법 (chemotactic motility assay)으로 세포이동을 측정하였다. 먼저 트랜스웰 시스템에서 성장감소인자인 마트리젤 (Matrigel, Millipore)을 코팅한 후, 침윤분석법 (invasion assay)으로 세포침윤을 측정하였다. 세포이동의 정량분석과, 세포침윤의 측정은 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로 트랜스웰의 아랫면을 10 ㎕의 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 24시간 건조하였다. 세포침윤 어세이 (invasion assay)를 수행하기 위해, Corning사의 QCM 24-웰 세포 세포침윤 어세이 키트 (QCM 24-well cell invasion assay kit)을 사용하였다. 세포침윤 어세이 배지 (invasion medium) (endothelial cell basal medium, EBM, 0.1% FBS)로 탈착된 세포들을 수거한 후, 세포수를 5 x 104/300 μl 세포침윤 배지로 조절하여, 각각의 인서트 (insert)에 세포들을 분주하였다. 6웰은 KP-VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) (Eylea, 상표명), 또는 베바시주맙 (Avastin, 상표명) 0 ~ 200 nM 처리하였다. 6웰의 VEGF (350 ng/㎖)를 처리하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 인서트에 남은 세포와 배지를 제거하고, 인서트를 새로운 웰로 옮겼다. 세포분리용액 225 ㎕에 인서트를 올리고 37℃ 배양기에서 30분 동안 배양했다. 남은 세포를 완전히 떼어내기 위해 인서트를 흔들고, 세포분리용액과 세포가 섞인 용액에 75 ㎕ 용해완충액 (lysis buffer)/ 염색용액 (dye solution)을 가한 후 상온에서 15분 방치했다. 200 μl의 용액을 96웰로 옮기고 595 nm 형광으로 읽었다. 결과를 도 10a, 도 10b, 및 표 6 (혈관내피세포에서 KP-VR2에 의한 세포 이동 및 침윤 억제 분석)에 나타내었다.
| 혈관내피세포 이동 억제도 | |||
| VEGF 억제제 | 리간드 | IC50 (nM) | 비고 |
| KP-VR2 | VEGF-A165 | 11.00±1.40 | |
| 애플리버셉트 | VEGF-A165 | 20.08±3.95 | |
| 베바시주맙 | VEGF-A165 | 21.28±2.72 | |
도 10a 및 도 10b에 나타낸 것과 같이, VEGF는 HUVEC (Lonza)에서 세포이동 및 침윤작용을 유도하고, KP-VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) 또는 베바시주)은 이러한 세포이동 및 침윤을 억제하였으며, 본 발명의 KP-VR2는 같은 농도 (13 nM)에서 KP-VR4 (애플리버셉트) 및 베바시주맙 보다 세포이동 및 침윤 억제효과가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2의 IC50는 약 11 nM로서, KP-VR4 (애플리버셉트) 및 베바시주맙의 IC50이 각각 20 nM과 21 nM인 것과 비교하여 현저히 우수한 침윤억제 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예
7-2.
EA
-
hy926
세포주에서
KP
-VR2,
KP
-VR4 (
애플리버셉트
) 또는
KP
-VR3 (
베바시주맙
) 처리 후
VEGF
-A로부터 유도된 세포침윤 억제력 측정
먼저 EA-hy926 세포주 (ATCCⓡ CRL-2922™)를 0.1 % FBS가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma)가 있는 96웰 플레이트에 3.5 x 105 cell/㎖로 접종한 다음, KP-VR2 (1,500 ㎍/㎖), KP-VR4 (애플리버셉트) (3,000 ㎍/㎖), 및 베바시주맙 (3,000 ㎍/㎖)을 각각 처리하여 24시간 동안 반응시키고, 융합단백질을 처리하지 않은 배지를 음성대조군으로 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었다. 도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2은 KP-VR4 (애플리버셉트) 및 베바시주맙과 비교하여 VEGF에 의해 유도된 EA-hy926 세포의 성장을 보다 더 적은 농도에서도 매우 효과적으로 억제하였다.
실시예
8:
KP
-VR2와
KP
-VR4의
암종에
대한 세포분열 억제능력 비교
본 발명의 KP-VR2의 암종에 대한 세포분열 억제능력을 확인하기 위하여 9가지 암종에 대하여 MTS 세포증식 어세이 (MTS cell proliferation colorimetric assay)를 수행하였다. 표 7은 본 실시예에서 이용한 9종의 암종에 대한 것이다.
| 종류 | 바이오마커 | 기원 | 구입처 |
| HT29 | VEGF positive | Human colorectal adenocarcinoma | ATCCⓡ HTB-38™ |
| LoVo | VEGF positive | Human colorectal adenocarcinoma | ATCCⓡ CCL-229™ |
| PLGF positive | |||
| AGS | PLGF positive | Human gastric adenocarcinoma | ATCCⓡ CRL-1739™ |
| VEGF positive | |||
| SKUT1b | VEGF positive | Human uterine sarcoma | ATCCⓡ HTB-115™ |
| VEGFR1 positive | |||
| Caki-1 | VEGF positive | Renal Clear Cell carcinoma | ATCCⓡ HTB-46™ |
| VEGFR1 positive | |||
| Hy-926 | VEGF positive | Human Endothelial | ATCCⓡ CRL-2922™ |
| VEGFR1 positive | |||
| HCT 116 | VEGF positive | Human colorectal carcinoma | ATCCⓡ CCL-247™ |
| PANC 02.03 | VEGF positive | Human Pancreas Adenocarcinoma | ATCCⓡ CRL-2553™ |
| SW480 | VEGF positive | Human colorectal adenocarcinoma | ATCCⓡ CCL-228™ |
| PLGF positive | |||
| PC-3 | VEGF positive | Human prostate adenocarcinoma | ATCCⓡ CRL-1435™ |
| PLGF positive |
먼저 37℃, 5% CO2 조건 하에서 상기 9종류의 암종들 HT-29 (ATCCⓡ HTB-38™), LOVO (ATCCⓡ CCL-229™), HCT116 (ATCCⓡ CCL-247™), SKUT1b (ATCCⓡ HTB-115™), Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), AGS (ATCCⓡ CRL-1739™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), SW480 (ATCCⓡ CCL-228™), 및 PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™)를 포화상태 (full confluency)에 도달하게 하였다. 다음 이들 암종 세포들을 수거하여 웰당 3 x 103 cells/well로 분주하고 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 (Sigma) 배지에서 24시간 배양하였다. 다음, 배지를 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, KP-VR2 또는 KP-VR4 (애플리버셉트)를 2, 4 또는 6 nM의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 마지막으로 MTS 시약 (Qiagen)을 가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 12a, 12b 및 표 8에 나타내었다. 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 시험에 사용된 모든 암종에 대해 KP-VR4 (애플리버셉트) 보다 현저히 우수한 세포분열 억제효과를 나타내었다.
| 종류 | 접근 시험법 | in vitro efficacy KP-VR4 | in vitro efficacy KP-VR2 |
| EA-hy926 | in vitro efficacy | ~ 17% 증식 억제 | ~ 33% 증식 억제 |
| HT29 | in vitro efficacy | - | ~ 44% 증식 억제 |
| LoVo | in vitro efficacy | ~ 35% 증식 억제 | ~ 65% 증식 억제 |
| HCT116 | in vitro efficacy | - | ~ 44% 증식 억제 |
| SKUT1b | in vitro efficacy | - | ~ 26% 증식 억제 |
| CaKi-1 | in vitro efficacy | - | ~ 67% 증식 억제 |
| PANC0203 | in vitro efficacy | - | ~ 37% 증식 억제 |
| SW480 | in vitro efficacy | - | ~ 38% 증식 억제 |
| AGS | in vitro efficacy | - | ~ 34% 증식 억제 |
| PC-3 | in vitro efficacy | - | ~ 20% 증식 억제 |
또한, 표 8 (세포증식 억제 효과)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 VEGF와 PlGF를 타겟으로 하는 9종의 암종에 대해 세포증식을 억제하는 활성이 우수하였다.
실시예
9: anti-
VEGF
내성
암종
및 섬유아세포에 대한
KP
-VR2와
애플리버셉트의
세포분열 억제능력 비교
본 발명의 KP-VR2의 암종에 대한 세포분열 억제능력을 확인하기 위해 anti-VEGFA, 또는 anti-VEGFR에 대하여 내성을 지닌 암종 및 섬유아세포에 MTS 세포증식어세이를 수행하였다. 표 9은 본 실시예에서 사용한 4가지 암종 및 2가지 섬유아세포를 나타낸다.
| 종류 | Biomarker | Origin | 접근시험법 (1단계) |
접근시험법 (2단계) |
구입처 |
| CT26 | A model resistant to anti-VEGFR | Mouse Colon carcinoma | in vitro efficacy | Xenograft 시험 | ATCCⓡ CRL-2638™ |
| B16-F10 | A model resistant to FOLFIRY(p38) | Mouse Skin melanoma | in vitro efficacy | Xenograft 시험 | ATCCⓡ CRL-6475™ |
| EL4 | Anti-VEGF-A refractory | Mouse lymphoma | in vitro efficacy | Xenograft 시험 | ATCCⓡ TIB-39™ |
| LCC1 | Anti-VEGF-A refractory | Mouse lung carcinoma | in vitro efficacy | Xenograft 시험 | ATCCⓡ CRL-1642™ |
| NIH3T3 | fibroblast | Mouse embryo fibroblast | in vitro efficacy | KCLB NO21658 | |
| Hs27 | fibroblast | Human skin fibroblast | in vitro efficacy | ATCCⓡ CRL-1634™ |
먼저 37℃, 5% CO2 조건 하에서 상기 4종류의 암종들 (EL-4(ATCCⓡ TIB-39™), LLC1(ATCCⓡ TIB-39™), B16F10 (ATCCⓡ CRL-6475™), CT-26 (ATCCⓡ CRL-2638™) 및 섬유아세포 NIH3T3 (한국세포주은행(KCLB) No 21658)및 Hs27 (ATCCⓡ CRL-1634™)를 포화상태 (full confluency)에 도달하게 하였다. 다음, 상기 암종 및 섬유아세포들을 수거하여 웰당 3 x 103 cells/well 로 분주하고 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 (Sigma) 배지에서 24시간 배양하였다. 다음, 배지를 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, KP-VR2 또는 KP-VR4 (애플리버셉트)를 2, 4, 또는 6 nM의 농도로 처리하고 72시간 배양하였다. MTS 시약 (Qiagen)을 가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 13, 도 14 및 표 10 (암종 및 섬유아세포)에 나타내었다.
| 종류 | 접근 시험법 | KP-VR4 | KP-VR2 |
| CT26 | In vitro efficacy | - | ~56% 증식 억제 |
| B16-F10 | In vitro efficacy | - | ~30% 증식 억제 |
| EL4 | In vitro efficacy | ~49% 증식 억제 | ~67% 증식 억제 |
| LLC1 | In vitro efficacy | ~12% 증식 억제 | ~70% 증식 억제 |
| NIH3T3 | In vitro efficacy | ~41% 증식 억제 | ~52% 증식 억제 |
| Hs27 | In vitro efficacy | ~15% 증식 억제 | ~25% 증식 억제 |
도 13, 도 14 및 표 10에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2는 KP-VR4 (애플리버셉트)에 비해 암세포 증식억제능력이 현저히 우수할 뿐만아니라 (실시예 8), anti-VEGF/VEGFR 내성 암종들 (EL-4, LLC1, B16F10, 및 CT-26)과 섬유아세포 (Hs27 및 NIH3T3)에 대해서도 뛰어난 증식억제 능력을 보였다.
실시예
10:
KP
-VR2와
애플리버셉트의
누드마우스에서의 종양성장억제 비교
KP-VR2의 종양성장억제 효과에 대한 in vivo 시험을 위하여, BALB/c 누드 마우스에서 여러 가지 종양의 이종이식모델을 사용하였다.
실시예
10-1. HT-29
in
vivo
이종이식편
(
xenograft
)
먼저 HT-29세포 (ATCCⓡ HTB-38™) 5 x 106 cells/0.2 ㎖를 누드 마우스 (오리엔트 바이오, 암컷 4주령)의 등에 피하주사하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (1 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏)와 KP-VR4 (애플리버셉트) (2 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하고, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양의 부피를 측정하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 HT-29 직결장암종의 성장을 2 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 약 40% 증가된 저해효과를 보였다 (P<0.05). 1 ㎎/㎏ KP-VR2가 3 ㎎/㎏ 애플리버셉트 (KP-VR4)와 유사한 효과를 제시하였다.
실시예
10-2.
LOVO
in
vivo
이종이식편
HT-29세포 대신 LOVO (ATCCⓡ CCL-229™)를 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 10-1와 동일하게 수행하였다. LOVO 5 x 106 cells/0.2 ㎖ 를 누드마우스 (샘타코, 암컷 4주령)의 등에 피하주사 하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (1 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (KP-VR4) (1 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였고, 최종 42일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 16a 및 16b에 나타내었다. 도 16a 및 16b에 제시된 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2가 LOVO 직장암종의 성장을 1 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 50 ~ 60% 증가된 저해 효과를 보였다 (P<0.05). 본 발명의 KP-VR2의 종양성장억제 효과는 투여초기부터 관찰되었으며, 그 차이가 점차 커지는 추세를 보였다. 또한, 본 발명의 KP-VR2는 동량의 애플리버셉트에 비하여 약 50% 정도의 종양중량감소 효과를 나타내었다.
실시예
10-3.
SKUT1B
in
vivo
이종이식편
본 발명의 KP-VR2의 항암활성을 추가로 확인하기 위하여, HT-29세포 대신 VEGFR1 양성 세포주인 SKUT1B (ATCCⓡ HTB-115™) 자궁암종을 누드마우스에 주입하였다. 먼저 SKUT1B 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스 의 등에 피하주사 하고 1일 경과후에 KP-VR2 (2 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (KP-VR4) (2 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회씩 32일이 될 때까지 투여하였으며, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS를 동일시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양부피를 측정하고, 최종 32일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 17a 및 17b에 나타내었다. 도 17a 및 17b에 제시된 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2는 SKUT1B 자궁암종의 성장을 2 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 60 ~ 70% 현저히 증가된 저해효과를 보였다 (P<0.05). 또한, 본 발명의 KP-VR2는 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 약 60%의 종양무게 감소효과를 나타냈다. 동일한 조건으로 반복시험을 수행하여 37일차까지의 결과를 재확인 하였다. 도 17C에서, SKUT1B 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사 하고 1주일 경과 후에 종양 크기가 200 ㎣이 되었을 때, KP-VR2 (4 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (4 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회씩 투여하였으며, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS를 동일시간 및 주기로 투여하였다. 본 발명의 KP-VR2는 SKUT1B 자궁암종의 성장을 동량의 애플리버셉트와 비교하여 현저히 증가된 저해효과를 보였다 (P<0.05). 그 유사한 시험결과들이 도 17d 17e에 나타내었다. 도 17d 및 도 17e에 제시된 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2가 SKUT1B 자궁암종의 성장을 2 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 70 ~ 80% 증가된 현저히 우수한 저해 효과를 보였다 (P<0.05). 또한, 본 발명의 KP-VR2는 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 약 70% 종양무게감소 효과를 나타냈다.
실시예
10-4:
ASPC
-1 (
ATCC
ⓡ
CRL
-1682) 또는 MIA
PaCa2세포 (ATCC
ⓡ
CRL
-1420)
등의 췌장암종들에서
종양 성장억제력 비교시험
ASPC-1 (ATCCⓡ CRL-1682) 및 MIA PaCa2세포 (ATCCⓡ CRL-1420) 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드 마우스 (샘타코, 암컷 4주령)의 등에 피하주사하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자란 것을 확인한 다음, KP-VR2 (5 ㎎/㎏) 또는 베바시주맙주 (5 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하고, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline, Gibco)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양의 부피를 측정하고, 그 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 췌장암종들의 성장을 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙주와 비교하여 두드러진 종양 성장 저해효과를 보였다 (P<0.001).
실시예
10-5:
MKN
45 (
KCLB
No.80103), NCI-N87(
ATCC
ⓡ
CRL
-25822™),
MKN
28(KCLB No.80101), 또는
SNU
16 (
KCLB
No. 00016) 위암들에서 성장 저해효과
확인
시험
MKN 45, NCI-N87, MKN 28 또는 SNU16 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사 하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (5 ㎎/㎏)와 베바시주맙 (5 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였고, 최종일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21B에서, NCI-N87 암종은 VEGF에 내성을 보이는 암종으로 보다 베바시주맙의 한계를 극복함을 보여준다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 MKN 45, NCI-N87, MKN28 또는 SNU16 위암종들의 성장을 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙와 비교하여 우수한 암 성장의 저해효과를 보였다.
실시예 10-6: HepG2 ( ATCC ⓡ HB -8065 ™ ), SNU423 ( ATCC ⓡ CRL -2238™), A549 (ATCCⓡ CCL-185 ™ ) 또는 B16F10 ( ATCC ⓡ CRL -6475™) 성장의 저해효과 관찰
HepG2 (ATCCⓡ HB-8065), SNU423(ATCCⓡ CRL-2238) 및 A549 (ATCCⓡ CCL-185) 5 x 106 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사 하고 종양이 100 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (5 ㎎/㎏)와 베바시주맙 (5 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 22a, 도 22b 및 도 22c에 나타내었다. 도 22A에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 HepG2 간암의 성장을 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙 대비 주요하게 암 성장의 저해효과를 보였다. 도 22B에서도 본 발명의 KP-VR2가 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙과 대비하여 SNU423 간암의 성장을 저해한 것을 확인하였다. 또한, 도 22C에서도 본 발명의 KP-VR2가 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙과 대비하여 A547 폐암의 성장을 저해한 것을 확인하였다. 도 22D에서, B16F10 (ATCC® CRL-6475) 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사하고, 1일 후에 KP-VR2 (2 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (2 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였고, 최종일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 22d에 나타내었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 간암, 폐암 또는 흑색종에 대한 항암효과를 나타냈다.
실시예
10-7:
Caki
-1 (
ATCC
ⓡ
HTB
-46™),
Panc0203
(
ATCC
ⓡ
CRL
-2553™), PC-3 (
ATCC
ⓡ
CRL
-1435™) 또는 EL-4 (
ATCC
ⓡ
TIB
-39)
암종들에
대한 세포분열 억제능력 관찰
도 23은 누드마우스에 접종시 종양이 형성되지 않은 암종들에서 KP-VR2의 암종들에 대한 세포분열 억제능력을 확인하기 위해서 MTS 세포증식 어세이 (MTS cell proliferation colorimetric assay)를 수행한 결과이다. 먼저 37℃, 5% CO2 조건 하에서 상기 4종류의 암종들 Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™) 또는 EL-4 (ATCC® TIB-39)를 포화상태 (full confluency)에 도달하게 하였다. 다음 이들 암종 세포들을 수거하여 웰당 3 x 103 cells/well로 분주하고 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 (Sigma) 배지에서 24시간 배양하였다. 다음, 배지를 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, KP-VR2 또는 애플리버셉트를 6 μM의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 마지막으로 MTS 시약 (Qiagen)을 가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 시험에 사용된 모든 암종에 대해 애플리버셉트 및 베바시주맙주 대비 현저히 우수한 세포분열 억제효과를 나타내었다.
실시예
10-8: 토끼의 안구에 레이저 (laser)를 조사하여
맥락막신생혈관
(choroidal
neovascularization
,
CNV
)를 유발하고, 시험물질을 투여한 후 시험물질의 효력을 평가
동물의 우측 안구에 산동제 (미드리아실 1 % 점안액)를 점안한 후, Zoletil 50 (VIRBAC, France) 및 xylazine (Rompunⓡ, Bayer AG, Germany)을 이용하여 마취를 실시한 뒤, 안구에 laser (Elite, Lumenis, USA)를 532 nm, power 150 mW, duration 0.1 sec의 조건으로 조사하며, optic nerve를 중심으로 약 6 시 방향에 6 개의 spot을 만들었다. 동물이 마취된 상태에서 시험물질 50 ㎕를 해당 동물의 우측 안구에 31 ga㎍e 주사바늘이 장착된 주사기를 이용하여 초자체내 투여하였다. Day 0, 3, 7, 10 및 14에 동물의 우측 안구에 산동제 (미드리아실 1 % 점안액)를 점안한 후, Zoletil 50 (VIRBAC, France) 및 xylazine (Rompunⓡ, Bayer AG, Germany)을 이용하여 마취를 실시한 뒤, 2% fluorescein sodium salt solution 약 1 ㎖을 정맥을 통해 주입한 뒤, 안저카메라 (TRC-50IX, TOPCON, Japan)를 이용하여 약 2분 이내에 촬영하였다. 망막 CNV 확인 및 약효 평가는 망막 형광 안저 사진을 이용하여 수행하였다. 이미지 분석은 ImageJ software (NIH, Bethesda, MD)를 이용하여, 조사부위의 형광 강도를 분석하였다 (도 24A). 망막 형광 강도 분석 결과, 레이저 조사 후 7일째 (Day 7)에 측정한 양성대조물질 투여군 (G2) 및 시험물질 고용량 투여군 (G4)의 망막 형광 강도 수준은 유발대조군 (G1)에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며 (p<0.05), laser 조사 후 10 및 14 일째 (Day 10 및 14)에 측정한 G2 및 모든 시험물질 투여군 (G3-G4)의 망막 형광 강도 수준은 G1 대비 유의하게 낮았다 (p<0.01 또는 p<0.05). 도 24B는 약물투여 14일 후에 초자액에 남아있는 약물의 잔존량을 비교한 것으로서, 투여용량에 비례하여 약물이 남아있었다.
실시예
11: 제형 최적 조건 평가
실시예
11-1: 냉장, 상온 및 40℃ 보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건
평
가
본 실시예에서는 선행기술문헌 국제공개공보 WO2017188570에 개시된 내용에 따라 다음 제형의 제제를 제조하였다: a) KP-VR2의 아미노산 서열 포함하는 1 ~ 100 ㎎/㎖ 신규신생혈관생성 억제제; b) 폴리소르베이트 0.01 ~ 1%(w/v) 용매; c) 10 ~ 100 mM 염화 나트륨 등장제; 및 d) 5 ~ 50 mM 인산나트륨 완충제 또는 5 ~ 50 mM citric 나트륨 완충제를 포함하고, 1 ~ 10%(w/v)의 안정화제로서 수크로오스가 선택적으로 추가로 포함되는 제제. 상기 혈관내피 성장인자 (VEGF) 길항제 제형에 대해 냉장, 상온 및 40℃의 보관조건에 따른 제제 안정성을 비교하였다. 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적 pH를 확인하기 위하여 pH 5.0 ~ 7.5의 시료를 제조하였다. 표 11에 제형 및 저장조건을 나타낸다.
| pH | Storage compositions | 저장 조건 | 분석 시험법 | |
| 제형 | 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 | - 20~100 ㎎/㎖ KP-VR2 - 5 mM sodiumphosphate - 5 mM sodium citrate - 40 mM sodium chloride - 0.03% polysorbate 20 - 5% sucrose |
4℃ 25℃ 40℃ |
- SE-HPLC - SDS-PAGE - ELISA |
구체적으로, 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화 나트륨, 5 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 소듐 나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5로 하여 냉장, 상온 및 40℃에서 7일간 보관하여 시간이 경과함에 따라 생성된 불순물을 SE-HPLC (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피) 분석을 수행하였다. SE-HPLC 분석에서, TSK gel G3000swxl column (일본TOSOH사)을 사용하여 고분자량 불순물인 응집물 (aggregation)들과 저분자량 불순물인 단편 (fragment)들을 합하여 계산하였다. 그 결과를 표 12 내지 표 14에 나타냈다. 표 12 (SE-HPLC, 4℃)의 보관조건에서는 D/A(%), dimer 및 응집들의 전체 %는 pH 조건 별로 큰 차이는 보이지 않았다. 그 중 pH 6.5, pH 7.0 및 pH 7.5 냉장 보관조건에서 aggregation함량이 낮았다. 표 13 (SE-HPLC, RT)의 상온 보관조건에서는 낮은 pH 완충액 보관조건에서 aggregation 함량이 특히 높았고, 상대적으로 pH 6.5, 7.0, 및 pH 7.5 상온 보관조건에서 aggregation 함량이 낮았다. 표 14 (SE-HPLC, 40℃)의 가혹 보관조건에서는 대다수의 시료의 aggregation 함량이 높았다. 그러나 그 중 6.5, 7.0 및 7.5 완충액 보관조건에서 aggregation 함량이 낮았다.
| 냉장 | pH5.0 | pH5.5 | pH6.0 | pH6.5 | pH7.0 | pH7.5 | ||||||||||||
| DAY | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 |
| Monomer (%) |
97.12 | 96.75 | 96.2 | 96.6 | 97.25 | 96.84 | 97.47 | 97.33 | 97.63 | 96.78 | 97.91 | 97.44 | 98.1 | 97.99 | 97.61 | 98.3 | 98.21 | 98.02 |
| D/A fragment (%) | 2.88 | 3.25 | 3.8 | 3.4 | 2.75 | 3.16 | 2.53 | 2.67 | 2.37 | 3.22 | 2.09 | 2.56 | 1.9 | 2.01 | 2.39 | 1.7 | 1.79 | 1.98 |
| 상온 | pH5.0 | pH5.5 | pH6.0 | pH6.5 | pH7.0 | pH7.5 | ||||||||||||
| DAY | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 |
| Monomer (%) |
97.12 | 59.79 | 32.69 | 96.6 | 91.73 | 63.99 | 97.47 | 95.43 | 92.71 | 96.78 | 96.81 | 96.19 | 98.1 | 96.9 | 96.57 | 98.3 | 97.3 | 97.1 |
| D/A fragment (%) | 2.88 | 40.21 | 67.31 | 3.4 | 8.27 | 36.01 | 2.53 | 4.57 | 7.29 | 3.22 | 3.19 | 3.81 | 1.9 | 3.1 | 3.43 | 1.7 | 2.7 | 2.9 |
| 가혹 | pH5.0 | pH5.5 | pH6.0 | pH6.5 | pH7.0 | pH7.5 | ||||||||||||
| DAY | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 | 0 | 3 | 7 |
| Monomer (%) |
97.12 | 11.41 | 9.19 | 96.6 | 6.78 | 3.87 | 97.47 | 7.17 | 2.56 | 96.78 | 38.45 | 25.75 | 98.1 | 45.36 | 37.71 | 98.3 | 46.51 | 38.82 |
| D/A fragment (%) | 2.88 | 88.59 | 90.81 | 3.4 | 93.22 | 96.13 | 2.53 | 92.83 | 97.44 | 3.22 | 61.55 | 74.25 | 1.9 | 54.64 | 62.29 | 1.7 | 53.49 | 61.18 |
SE-HPLC 분석에서, TSK-gel G3000swxl (7.8 × 300 mm) 칼럼 (일본 TOSOH사)을 사용하여 0.02M 인산 나트륨 (pH 7.0), 0.4M NaCl 완충액을 0.5 ㎖/분의 속도로 흘려주고, 흡광도 280 nm에서 혈관내피성장인자 융합 단백질의 피크를 확인하였다. 도 25A의 보관조건에서, D/A(%), 이량체 (dimer) 및 응집들의 전체 %는 pH조건별로 큰 차이는 보이지 않았다. 이 중 pH 6.5, pH 7.0 및 pH 7.5 냉장 보관조건에서 응집체 함량이 낮았다. 도 25B에서, 상온 보관조건에서는 낮은 pH 완충액 보관조건에서 응집체 함량이 특히 높았고, 상대적으로 pH 6.5, 7.0, 및 pH 7.5 상온 보관조건에서 응집체함량이 낮았다. 도 25C에서, 가혹 보관조건 (40℃)에서는 대다수의 시료의 응집체 함량이 높았다. 그러나 그 중 6.5, 7.0 및 7.5 완충액 보관조건에서 응집체 함량이 낮았다.
실시예
11-2: 냉장, 상온 및 40℃ 보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 여러 제제들은 7일간 냉장보관하여 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 1 ㎎/㎖로 희석된 분석시료 20.0 ㎕에 5 x 샘플 완충액 5.0 ㎕를 첨가한 후 100℃에서 5분간 반응한 시료를 분석에 사용하였다. 최종 분석시료는 웰당 10 ㎕로 로딩하였다. 마커는 (HiMark Pre-stained Protein Standard, Invitrogen) 단백질 마커를 사용하였으며, 웰당 5 ㎕로 로딩하였다. Novex Tris-Acetate 3 ~ 8% 젤에 150 V로 1시간 전기영동하였다. 투마시블루 (coomassie blue, Merck)로 염색하였으며, 선명한 밴드가 나올 때까지 탈색하였다. SDS-PAGE분석결과, 냉장보관에서는 도 26 및 표 12 내지 14과 비교한 결과 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 억제되었다.
실시예
11-3: 상온보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 이들 제조한 제제들을 7일간 상온에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 상기 실시예와 동일하게 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 27A 및 도 27B에서 비교한 결과, 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 그러나 특정 완충 pH 6.5, 7.0 및 7.5 제제들은 상온보관 1주일 경과 후에도 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 시간이 경과에 따라 크게 증가하지 않았다.
실시예
11-4: 가혹보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 이들 제제들을 7일간 가혹조건 (40℃) 하에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, 대조군 도 28A 및 28B에 나타낸 것과 같이, 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 시간 경과에 따라 증가하였다. 그러나 특정 완충 pH 6.5, 7.0 및 7.5 제제들은 40℃ 하에서 보관한지 1주일 경과 후에도 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 상대적으로 적게 관찰되었다.
실시예
11-5: 냉장보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5로 제조하였다. 이들 제조한 제제들을 7일간 냉장 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체의 ELISA 분석을 수행하였다. 완충액 pH 5.0, 5.5, 6, 6.5, 7.0 및 7.5 제제들의 VEGF-A에 대한 친화력 (avidity)을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2로 코팅하고, VEGF165 (R&D systems)을 단계적으로 증가된 양 (0.0156 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시켰고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 29A 및 29B에 나타내었다. 도 29a 및 29b에 나타낸 것과 같이, 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 냉장보관조건에서 억제되었다.
실시예
11-6: 상온보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 이들 제조한 제제들을 7일간 상온에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석하였다. 완충액 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5 제제들의 VEGF-A에 대한 친화력을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2로 코팅하고, VEGF165 (R&D systems)을 단계적으로 증가된 양 (0.0156 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시키고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 30의 A 및 B에 나타내었다. 상온에서 7일 동안 보관한 결과, 완충액 pH 6.5, 7.0 및 7.5 조건에서 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 억제되었다.
실시예
11-7: 가혹보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5로 제조하였다. 이들 제조된 제제들을 7일간 가혹조건 (40℃) 하에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체 및 변형체를 ELISA 분석하였다. 완충액 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5 제제들의 VEGF-A에 대한 친화력을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2로 코팅하고, VEGF165 (R&D systems)을 단계적으로 증가된 양 (0.0156 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시켰고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 31의 A 및 B에 나타내었다. 가혹 조건에서 7일 동안 보관한 결과, 완충액 pH 6.5, 7.0 및 7.5조건에서 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 억제되었으며, 특히 완충액 pH 7.0 조건에서 가장 불순물 함량이 적은 것으로 확인되었다.
<110> KOREA PRIME PHARM CO. LTD.
<120> A pharmaceutical composition comprising VEGFR fusion protein for
preventing and treating angiogenesis related disease
<130> KPR19P-0001-KR
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEGFR1 Domain 2
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile
100
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG1 Fc reagion
<400> 2
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 3
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VEGFR2 Domain 3
<400> 3
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile
100
Claims (3)
- (a) 약리학적 유효성분으로서 혈관내피성장인자 (VEGF)와 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 Fc 융합단백질 1 ~ 100 ㎎/㎖; (b) 용매로서 폴리소르베이트 0.01 ~ 1%(w/v); 및 (c) 완충제로서 인산나트륨 5 ~ 50 mM, 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM, 또는 인산나트륨 5 ~ 50 mM 및 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM를 포함하고 pH가 6.5 ~ 7.5인, 약학 조성물로서,
상기 Fc 융합 단백질은 (i) 2개의 중쇄가 이황화결합 (dis㎕fied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인, 및 (ii) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되고, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합되며,
상기 Fc 융합단백질 대 VEGFR1 항원이 1 : 2 이상 결합하는 것인,
신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - 제1항에 있어서, 신생혈관생성 관련 질환이 암질환으로서 직결장암, 자궁암, 위암, 간암, 흑색종, 폐암, 신장암, 췌장암, 방광암, 림프종 또는 뇌암인 것인,
신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서, 신생혈관생성 관련 질환이 안질환으로서, 포도막 흑생종, 습성 황반변성 (wet age-related macular degeneration, AMD), 당뇨황반부종 (diabetic macular edema), 망막정맥폐쇄 (retinal vein occlusion), 또는 당뇨망막병증 (diabetic retinopathy)인 것인,
신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190172588A KR102426802B1 (ko) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190172588A KR102426802B1 (ko) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210080732A KR20210080732A (ko) | 2021-07-01 |
| KR102426802B1 true KR102426802B1 (ko) | 2022-07-28 |
Family
ID=76859963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190172588A Active KR102426802B1 (ko) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102426802B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117304307A (zh) * | 2022-06-27 | 2023-12-29 | 上海鼎新基因科技有限公司 | 一种治疗新生血管相关眼底疾病的aav药物 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008535798A (ja) | 2005-03-11 | 2008-09-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆの阻害による貧血の処置 |
| US20080242587A1 (en) | 2007-02-27 | 2008-10-02 | Hak-Zoo Kim | Fusion proteins binding to vegf and angiopoietin |
| CN100471872C (zh) | 2005-11-04 | 2009-03-25 | 余波 | 包含vegf受体片段的优化融合蛋白质及其医疗应用 |
| US20130149744A1 (en) | 1999-06-08 | 2013-06-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for Producing a Fusion Protein Capable of Binding VEGF |
| KR101685532B1 (ko) * | 2016-04-26 | 2016-12-13 | 한국프라임제약주식회사 | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질 |
| US20170145116A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-05-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Tetravalent multispecific antibodies |
| US20190177428A1 (en) | 2006-08-30 | 2019-06-13 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8927232B2 (en) * | 2008-12-11 | 2015-01-06 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology (Kaist) | Fusion protein capable of binding VEGF-A and TNF-alpha |
| KR20180023015A (ko) * | 2011-01-13 | 2018-03-06 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도 |
| KR102337471B1 (ko) * | 2019-12-23 | 2021-12-09 | 한국프라임제약주식회사 | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 약제학적 제형 |
-
2019
- 2019-12-23 KR KR1020190172588A patent/KR102426802B1/ko active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130149744A1 (en) | 1999-06-08 | 2013-06-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for Producing a Fusion Protein Capable of Binding VEGF |
| JP2008535798A (ja) | 2005-03-11 | 2008-09-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆの阻害による貧血の処置 |
| CN100471872C (zh) | 2005-11-04 | 2009-03-25 | 余波 | 包含vegf受体片段的优化融合蛋白质及其医疗应用 |
| US20190177428A1 (en) | 2006-08-30 | 2019-06-13 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
| US20080242587A1 (en) | 2007-02-27 | 2008-10-02 | Hak-Zoo Kim | Fusion proteins binding to vegf and angiopoietin |
| US20170145116A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-05-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Tetravalent multispecific antibodies |
| KR101685532B1 (ko) * | 2016-04-26 | 2016-12-13 | 한국프라임제약주식회사 | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210080732A (ko) | 2021-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101685532B1 (ko) | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질 | |
| US12152057B2 (en) | Fusion proteins for inhibiting angiogenesis | |
| EP3268386B1 (en) | Fusion protein comprising a ligand binding domain of vegf and pdgf. | |
| JP7348249B2 (ja) | Ｖｅｇｆ－ｇｒａｂタンパク質と薬物の結合体及びその用途 | |
| KR102128966B1 (ko) | 종양 투과성 펩타이드와 항-신생혈관생성 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 혈관신생관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 | |
| KR102426802B1 (ko) | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 | |
| KR102337471B1 (ko) | 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 약제학적 제형 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20191223 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20210602 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20220425 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20220725 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20220725 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration |