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KR102424496B1 - 신장 질환 및 치주 질환의 검출 및 진단을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

신장 질환 및 치주 질환의 검출 및 진단을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR102424496B1
KR102424496B1 KR1020217031929A KR20217031929A KR102424496B1 KR 102424496 B1 KR102424496 B1 KR 102424496B1 KR 1020217031929 A KR1020217031929 A KR 1020217031929A KR 20217031929 A KR20217031929 A KR 20217031929A KR 102424496 B1 KR102424496 B1 KR 102424496B1
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KR
South Korea
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polypeptide
cystatin
seq
sample
antibody
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KR1020217031929A
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KR20210127763A (ko
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마하락스미 에라밀리
지오시 퍼레이스
존 조셉 퀸
머시 브이.에스.엔 에라밀리
Original Assignee
아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 포유 동물에서 신장 질환 및 치주 질환을 검출하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

신장 질환 및 치주 질환의 검출 및 진단을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION AND DIAGNOSIS OF RENAL DISEASE AND PERIODONTAL DISEASE}
우선권
본 출원은 2016년 3월 2일자로 출원된, 미국 특허 출원 번호 제62/302,299호의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 원용된다.
서열 목록
본 문서는 EFS-Web을 통해 전자 형식으로 제출되는, 전자 서열 목록 텍스트 파일을 참조로 본원에 원용된다. 텍스트 파일명은 "16-179-WO_ST25.final.txt"이며, 7.10KB이며 2017년 3월 2일에 작성되었다.
신장 질환은 물 소비 증가, 잦은 배뇨, 식욕 감퇴, 체중 감소 및 근육 위축과 관련이 있다. 일반적으로, 신장 질환의 임상 증상이 진행하는 시점에는, 복구할 수 없는 신장 손상이 생긴 것이다. 조기 검출로 보다 조기 치료가 가능하게 되고 따라서 병의 진행이 늦어지게 된다. 현재의 치료법은 투석과 인 및 단백질이 적은 식이 요법을 포함한다. 조기 검출은 수명 및 삶의 질을 개선하는 데 중요하다.
포유 동물에서, 신장 질환 진행은 5 가지 수준으로 구분된다. 포유 동물, 예를 들어, 개과(canine)에서 신장 질환을 검출하는 현재의 방법은, 신장 초음파, 생검, 또는 요 단백/크레아티닌 수준 측정을 포함한다. 생검은 침습적이며 크레아티닌 측정은 심각한 조직 손상이 발생한 후인, 신부전 3기까지는 정확하지 않다. 보다 초기 단계에서 신장 질환을 검출해서 병의 진행이 중단될 수 있도록 하는 방법이 당 기술분야에 필요하다.
본 발명은 치주 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, 상부 요로 감염과 하부 요로 감염을 구별하는 방법 및 급성 신장 손상과 하부 요로 감염을 구별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 실시예는 시료 내의 시스타틴 B(Cystatin B) ("Cys B") 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체의 복합체의 형성에 적합한 상태 하에 시료를 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체의 복합체가 검출된다.
또 다른 실시예는 대상 내의 신장 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정된다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교되고, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교된 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준이 신장 질환을 표시하는 것이다.
또 다른 실시예는 대상 내의 질환 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 분석 결과를 제공하는 테스트를 요청하는 단계를 포함한다. 질환 상태에 대해 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 시료가 상승된 양의 시스타틴 B 폴리펩티드를 함유하면 감소된 신장 기능에 대한 치료제가 대상에게 투여된다. 질환 상태는 만성 신장 질환 환자에서의 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상, 급성 신장 손상, 활성 신장 손상, 진행성 만성 신장 질환, 치주 질환, 상부 요로 감염, 신장 질환, 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
또 다른 실시예는 대상 내의 치주 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정된다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교되고, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 대상 내의 치주 질환의 표시이다.
또 다른 실시예는 상부 요로 감염과 하부 요로 감염을 구별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정된다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교되고, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교된 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준이 대상 내의 상부 요로 감염을 표시하는 것이다.
또 다른 실시예는 급성 신장 손상과 하부 요로 감염을 구별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하고, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정되는, 단계; 그리고 (b) 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교하고, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교된 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준이 대상 내의 급성 신장 손상을 표시하는 것인, 단계를 포함한다.
일 실시예에서 신장 질환은 만성 신장 질환, 급성 신장 손상 또는 세균 감염에 의해 유발될 수 있다. 일 실시예에서, 신장 질환, 만성 신장 질환 또는 급성 신장 손상은 암에 의해 유발되지 않는다. 세균 감염은 아나플라즈마 종(Anaplasma sp.), 에를리히아 종(Ehrlichia sp.), 렙토스피라 종(Leptospira sp.), 에스케리치아 종(Escherichia sp.) 또는 보렐리아 종(Borrelia sp.)에 의해 유발될 수 있다. 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적인 1개 이상의 항체의 복합체를 검출하여 결정될 수 있다.
일 실시예에서 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적인 1개 이상의 항체의 복합체는, 검출 전에 표시제(indicator agent)와 접촉될 수 있다. 1개 이상의 항체는 서열번호 5, 6, 7, 11, 또는 13로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 실시예에서 대상은 비-인간 동물일 수 있고 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 치태, 열구액(crevicular fluid), 치은 생검 또는 혀 면봉(tongue swab)일 수 있다.
일 실시예에서, 시스타틴 B 폴리펩티드 또는 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 면역 검정, 경쟁적 면역 검정, 샌드위치 면역 검정, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사면역 검정 (RIA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역 검정 또는 웨스턴 블랏 검정에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 실시예는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 단리된 항체는 동결건조될 수 있고; 표지에 접합될 수 있고; 고체 지지체에 고정될 수 있고; 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 폴리펩티드에 특이적으로 결합될 수 있고; 또는 고체 지지체에 고정되고 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 폴리펩티드에 특이적으로 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 항체는 고체 지지체에 고정될 수 있고 1개 이상의 표지에 접합될 수 있다.
또 다른 실시예는 신장 질환, 만성 신장 질환 환자에서의 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상, 활성 신장 손상, 진행성 만성 신장 질환, 급성 신장 손상, 상부 요로 감염, 또는 치주 질환을 진단하는 키트를 제공한다. 키트는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체; 및 대상 시료에 존재하는 시스타틴 B 폴리펩티드에 대한 1개 이상의 항체의 결합을 촉진하는 1개 이상의 시약을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드는 동결건조될 수 있고; 표지에 접합될 수 있고; 고체 지지체에 고정될 수 있고; 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체에 특이적으로 결합될 수 있다.
또 다른 실시예는 인간, 개과 또는 고양이과 대상과 같은, 포유 동물에서 신장 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 시료 (예, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 세포, 조직) 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계; 그리고 (b) 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교하고, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준에 비교된 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준이 신장 질환을 표시하는 것인, 단계를 포함한다. 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 포유 동물에서의 신장 질환은, 예를 들어, 만성 신장 질환 환자에서의 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상 , 만성 신장 질환, 진행성 만성 신장 질환, 급성 신장 손상, 활성 신장 손상, 상부 요로 감염, 또는 신장의 세균 감염일 수 있다. 일 실시예에서, 신장 질환은 암이나 신장 암이 아니다.
일 실시예는 (i) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 (또는 포함하는) 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 단리된 항체 및 (ii) 상기 1개 이상의 단리된 항체에 특이적으로 결합되는 1개 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역복합체를 제공한다. 1개 이상의 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 이들의 조합일 수 있다. 면역복합체는 항원 (예컨대 폴리펩티드)과 항체 사이에 형성된 복합체이다. 면역복합체는 고체 지지체에 고정될 수 있다.
특정 실시예들은 소정의 바람직한 실시예들 및 청구항들에 대한 다음과 같은 더욱 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명을 통하여 치주 질환의 진단을 할 수 있다.
도 1은 근위 세뇨관 상피 세포에서의 정상 세뇨관 상피, 세포 파괴 및 세포 사멸을 보여준다.
도 2는 시스타틴 C 단백질의 존재 시에 시스타틴 B의 웨스턴 블랏 분석을 보여준다.
도 3은 본래의 개과 시스타틴 B (MDCK 용해물)를 사용하여 Cys B ELISA 검정으로 얻은 표준 곡선을 보여준다.
도 4는 개과 젠타마이신 모델의 혈청과 소변에 대한 Cys B ELISA 분석을 보여준다.
도 5는 염증성 또는 허혈성으로 유발된 활성 신장 손상으로 클리닉에 출현한 개로부터의 소변의 CysB ELISA 분석을 보여준다.
도 6 패널 a와 b는 개과 고양이과 기준 범위를 보여준다.
도 7 패널 a와 b는 건강한 개와 CKD 환자에 비해 AKI로 진단된 환자에서 뇨 및 혈청 시스타틴 B 수치가 유의하게 증가한 것을 보여준다.
도 8은 건강한 환자 및 하부 요로 감염 환자의 시스타틴 B 수치를 보여준다.
도 9는 개과 AKI 시료, 인간 CKD 시료 및 개과 음성 대조군 시료 내의 Cys B 폴리펩티드의 검출을 보여준다.
도 10은 건강한 개과 동물의 혈청 내 CysB 값을 보여준다.
이들 및 다른 목적 및 특징은 도면과 함께 취해진 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다.
본 발명은 이하에서 보다 구체적으로 설명되며, 본원에 설명된 예들은, 당 기술분야의 숙련자들에게 다양한 변형 및 변경이 명백할 것이므로, 단지 예시적인 것으로 의도된다. 본원의 설명 및 하기의 청구항들 전체적으로 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"의 의미는 문맥이 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 수치와 관련하여 "약"이라는 용어는 값이 5% 위아래로 변하는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 100의 값의 경우, 95 내지 105 (또는 95와 105 사이의 임의의 값)를 의미한다.
명세서에 사용된 용어들은 일반적으로 본원에 설명된 조성물 및 방법의 맥락 이내에서, 그리고 각각의 용어가 사용되는 특정 맥락에서 당 기술분야에서의 통상적인 의미를 갖는다. 일부 용어들은 조성물 및 방법의 설명에 관하여 실무자에게 추가 지침을 제공하기 위해 보다 구체적으로 정의되었다.
본원에 설명된 조성물 및 방법은 예를 들어, 신장 질환, 만성 신장 질환 환자에서의 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상, 진행성 만성 신장 질환, 급성 신장 손상, 활성 신장 손상, 상부 요로 감염, 및 치주 질환을 포함한, 몇몇 질환 및 상태의 진행을 예후, 진단 및 모니터하는 데 사용될 수 있다. 신장 질환은 (1) 건강한 대상과 비교할 때 신장 기능 감소; 또는 (2) 신장의 물리적 손상; 또는 (3) 둘 다를 초래하는 임의의 질환 상태를 포함한다. 일 실시예에서 신장 질환은 암을 포함하지 않거나 신장 암을 포함하지 않는다. 신장 암을 포함한 암 마커는 만성 신장 질환 환자에서의 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상, 만성 신장 질환, 진행성 만성 신장 질환, 활성 신장 손상, 급성 신장 손상, 상부 요로 감염, 또는 치주 질환 마커와 상이할 수 있다. 일 실시예에서 만성 신장 질환 환자에서의 급성 신장 손상, 진행성 만성 신장 질환, 활성 신장 손상, 급성 신장 손상, 상부 요로 감염, 또는 치주 질환은 암을 포함하지 않거나 신장 암을 포함하지 않는다.
만성 신장 질환 (CKD)은 시간 경과에 따른 신장 기능의 점진적인 손실을 특징으로 하는 상태이다. CKD는 만성 신장 질환으로도 알려져 있다. CDK에는 신장 암, 신세포 암종, 방광 암 또는 다른 암은 포함되지 않는다. CKD가 악화됨에 따라, 노폐물이 높은 수준으로 혈액에 쌓일 수 있고 고혈압, 빈혈, 약한 뼈, 영양 건강 결핍 및 신경 손상이 생길 수 있다. CKD는 심장 및 혈관 질환의 위험을 증가시키고 결국 신부전으로 이어질 수 있다. CKD는 당뇨병, 고혈압 및 기타 장애로 인해 야기될 수 있다. 조기 검출 및 치료는 종종 질병이 악화되는 것을 막아줄 수 있다.
국제 신장 이사회(International Renal Interest Society)에서 확립한 개과의 CKD 병기를 표 1에 나타내었다.
혈청
크레아티닌
농도		 I 기
비-질소혈
CKD		 II 기
경증 신장
질소혈증		 III 기
중등도 신장
질소혈증		 IV 기
중증 신장
질소혈증
mg/dL <1.4 1.4-2.0 2.1-5.0 >5.0
Μmol/L <125 125-179 180-439 >440
국제 신장 이사회에서 확립한 고양이과의 CKD 병기를 표 2에 나타내었다.
혈청
크레아티닌
농도		 I 기
비-질소혈
CKD		 II 기
경증 신장
질소혈증		 III 기
중등도 신장
질소혈증		 IV 기
중증 신장
질소혈증
mg/dL <1.6 1.6-2.8 2.9-5.0 >5.0
Μmol/L <140 140-250 251-440 >440
본원에 설명된 방법들은 1, 2, 3 또는 4기 CKD에 있는 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상을 검출할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 방법들은 크레아티닌 검정이 1, 2, 3 또는 4기 CKD에 있는 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상을 검출할 수 있기 전에 1, 2, 3 또는 4기 CKD에 있는 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상을 검출할 수 있다. 인간의 신장 질환은 사구체 여과율 (glomerular filtration rate, GFR)에 따라 병기가 할당된다. 인간의 연령, 인종, 성별 및 그들의 혈청 크레아티닌을 사용하는 식을 사용하여 GFR을 계산한다. 아래는 CKD와 GFR의 5개 병기를 각 병기에 대해 보여준다.
· 1 기 정상이거나 높은 GFR (GFR> 90 mL/분)
· 2 기 경증 CKD (GFR = 60-89 mL/분)
· 3A 기 중등도 CKD (GFR = 45-59 mL/분)
· 3B 기 중등도 CKD (GFR = 30-44 mL/분)
· 4 기 중증 CKD (GFR = 15-29 mL/분)
· 5 기 말기 CKD (GFR <15 mL/분)
본원에 설명된 방법들은 1, 2, 3A, 3B, 4 또는 5기 CKD에 있는 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상을 검출할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 방법들은 크레아티닌 검정 또는 GFR 값이 1, 2, 3A, 3B, 4 또는 5기 CKD에 있는 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상을 검출할 수 있기 전에 1, 2, 3A, 3B, 4 또는 5기 CKD에 있는 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상을 검출할 수 있다.
만성 신장 질환 또는 신장 질환은 사구체 또는 세뇨관 질환일 수 있다.
급성 신장 손상 (AKI)은 신장 여과 기능의 갑작스러운 또는 급격한 감소로 정의된다. AKI는 만성 신장 질환(CKD), 투석이 필요한 신부전 (말기 신장 질환), 심장 질환 또는 사망으로 이어질 수 있다. 경증 AKI 또는 AKI의 완전한 회복조차도 몇가지 단기간 및 장기간의 건강상의 문제가 있을 수 있다. AKI는 임의의 원인으로 인한 신장 혈류 감소 (예, 저혈압, 탈수), 신장에 유해한 물질에 대한 노출, 신장에서 항-염증 프로세스, 전신 질환, 압궤 손상, 항생제, 패혈증 또는 요로 폐쇄로부터의 신장 조직에 대한 손상에 의해 초래할 수 있다. AKI는 대사성 산증, 높은 칼륨 수치, 요독증, 체액 균형 변화 및 다른 장기 시스템에 영향을 줄 수 있다. 일 실시예에서 AKI는 암을 포함하지 않거나 신장암을 포함하지 않는다. 국제 신장 이사회에서 확립한 고양이과 및 개과의 AKI 등급을 표 3에 나타냈다.
AKI
등급		 혈액 크레아티닌 임상 설명
등급
I		 <1.6 mg/dl
(<140μmol/l)		 비 질소혈 AKI:
AKI 문서화됨 (AKI의 역사적, 임상적, 실험적 또는 영상학적 증거, 임상적 핍뇨/무뇨(oliguria/anuria), 용량 반응성; 및/또는
48 시간 이내 혈액 크레아티닌 내 진행성 비 질소혈 증가 ≥ 0.3 mg/dl (≥26.4μmol/l); 및/또는
핍뇨 <1ml/kg/hr) 또는 6 시간 동안 무뇨 측정됨.
등급 II 1.7-2.5 mg/dl
(141-220μmol/l)


 경증 AKI:
AKI 및 정적 또는 진행성 질소혈증 문서화됨
혈액 크레아티닌 내 진행성 질소혈 증가;
48 시간 이내 ≥0.3 mg/dl (≥26.4 μmol/l ) 또는, 용량 반응성;
핍뇨 <1ml/kg/hr) 또는 6 시간 동안 무뇨 측정됨
등급 III 2.6-5.0 mg/dl
(221-439 μmol/l)


 중등도 내지 중증 AKI:
AKI 및 질소혈증 및 기능성 신부전의 중증도 증가 문서화됨
등급 IV 5.1-10.0 mg/dl
(440-880 μmol/l)
등급
V		 >10 mg/dl
(>880 μmol/l)
일 실시예에서 본원에 설명된 방법들은 등급 1, 2, 3, 4 또는 5 등급 AKI를 검출할 수 있다. 일 실시예에서, 본원에 설명된 방법들은 크레아티닌 검정이 1, 2, 3, 4 또는 5 등급 AKI를 검출할 수 있기 전에 1, 2, 3, 4 또는 5 등급 AKI를 검출할 수 있다.
AKI는 다음과 같이 인간에서 병기가 할당될 수 있다:
Figure 112021113921813-pat00001
일 실시예에서 방법들은 인간에서의 1, 2 또는 3 기 AKI를 검출할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 방법들은 크레아티닌 검정이 인간에서의 1, 2 또는 3 기 AKI를 검출할 수 있기 전에 인간에서의 1, 2 또는 3 기 AKI를 검출할 수 있다.
일 실시예에서, 신장 질환, CKD 또는 AKI는 세균 감염에 의해 유발된다. 일 실시예에서 세균 감염은 아나플라즈마 종(Anaplasma sp.), 에를리히아 종(Ehrlichia sp.), 렙토스피라 종(Leptospira sp.), 에스케리치아 종(Escherichia sp.) 또는 보렐리아 종(Borrelia sp.)에 의해 유발된다.
활성 신장 손상은 진행중 또는 진행성 신장 손상, 신장 장애 또는 신장 병리로 정의된다. 활성 신장 손상은 신장에 누적된 손상을 일으킨다.
폴리펩티드
시스타틴 A & B는 시스타틴 상과 중 1과의 구성원이며 크기가 약 11 kDa인 상대적으로 작은 단백질이다. 인간에서, 이러한 단백질은 단량체이며 크기가 약 11 kDa이다. 그들은 글리코실화되지 않으며 다른 시스타틴 상과에서 볼 수 있는 이황화물 가교가 없다. 그들은 또한 신호 서열이 없어서 일반적으로 세포에 갇힌 세포내 단백질이다. Ochieng & Chaudhuri, J Health Care Poor Underserved 2010, 21(1 Suppl):51 참조. 일부 시스타틴 B는 세포외 액에 존재하며 인간의 소변에서 정제되었다. Abrahamson 외, J Biol Chem 1986, 261:11282-11289 참조. 시스타틴 B는 리소좀 시스테인 프로테나아제, 카텝신 계열, 특히 카텝신 B, H 및 L의 멤버들을 억제하는 것으로 나타났다. Green 외, Biochem J 1984 218:939; D'Amico 외, J Transl Med 2014, 12:350; Jarvinen & Rinne, Biochim Biophys Acta 1982, 708:210-217 참조.
시스타틴 B 폴리펩티드는 예 1에 상세히 설명되어 있으며 다음을 포함하고 있다:
QVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTPYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF (서열번호 1)
MMCGAPSASQPATADTQAIAD (서열번호 2)
MMCGAPSASQPATADTQAIADQVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTXYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF (서열번호 3) (여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있거나 또는 여기서 X는 P 또는 N일 수 있다).
QTNKAKHDELAYF (서열번호 4) 시스타틴 B C 말단 “펩티드 9”
CGAPSASQPATADTQAIA (서열번호 5) 시스타틴 B N-말단 “펩티드 3-20”
CGAPSASQ (서열번호 6) 시스타틴 B N-말단 “펩티드 3-10”
CAIADQVKA (서열번호 7) 시스타틴 B N-말단 “펩티드 18-25”
FQSLPHENKPLALSS (서열번호 8) 시스타틴 B “펩티드 2”
SQVVAGTPYFIKVQVDDD (서열번호 9) 시스타틴 B “펩티드 1”
KHDELAYF (서열번호 10)
MMCGAPSASQPATADTQAIADQVKAQLEE (서열번호 11)
AIADQVKA (서열번호 12)
SQVVAGTNYFIKVQVDDD (서열번호 13)
일 실시예는 서열번호 1-27를 포함하는 정제된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제공한다. 서열번호 1-27의 폴리펩티드 단편은 약 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 미만 (또는 약 10 내지 약 95의 임의의 범위) 인접 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 실시예에서, 폴리펩티드 단편은 서열번호 1-27의 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 초과 인접 아미노산으로 이루어진다. 일 실시예에서, 폴리펩티드 또는 그의 단편은 자연적으로 발생하지 않는다.
폴리펩티드 서열번호 1-2, 4-13 및 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및 27이 전장 Cys B 폴리펩티드 보다 작다는 사실은 중요한데 작은 폴리펩티드일수록 전장 폴리펩티드 검정보다 특이성 및/또는 민감성이 더 클 수 있기 때문이다. 이렇게 더 작은 폴리펩티드는 제조 비용이 더 저렴할 수 있으며, 전장 폴리펩티드보다 더 높은 순도로 수득될 수도 있다. 또한, 더 작은 단편들과 시료에 존재하는 더 작은 단편들의 수준은 질병 상태를 표시할 수 있다. 단편화된 폴리펩티드의 증가된 수준 (즉, 전장보다 작음)은 질병의 마커가 될 수 있다.
폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 공유적으로 연결된 3개 이상의 아미노산의 중합체이다. 폴리펩티드는 번역 후 변형될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 세포 물질, 다른 유형의 폴리펩티드, 화학 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용되는 화학물질 또는 이들의 조합을 실질적으로 함유하지 않는 폴리펩티드 조제물이다. 실질적으로 세포 물질, 배양 배지, 화학 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용되는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는 폴리펩티드 조제물은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 이상 보다 적은 다른 폴리펩티드, 배양 배지, 화학적 전구체 및/또는 합성에 사용되는 다른 화학물질을 갖는다. 따라서, 정제된 폴리펩티드는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이상 순수하다.
"폴리펩티드"라는 용어는 한 종류의 폴리펩티드 (폴리펩티드 세트) 중 하나 이상을 지칭할 수 있다. 또한 "폴리펩티드"는 둘 이상의 상이한 종류의 폴리펩티드의 혼합물 (즉, 전장 단백질, 절단된(truncated) 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드의 혼합물)을 지칭할 수 있다. 또한 "폴리펩티드들" 또는 "폴리펩티드"라는 용어는 각각 "1개 이상의 폴리펩티드"를 의미할 수도 있다.
폴리펩티드 변이체는 서열번호 1-27에 제시된 폴리펩티드 또는 그의 단편으로부터 대략, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 잔기 만큼 상이하다 (예, 아미노산 첨가, 치환 또는 결실). 이 비교가 정렬을 필요로 하는 경우, 서열은 최대 상동성을 위해 정렬된다. 변이 부위는 폴리펩티드 내 어디에서나 발생할 수 있다.
변이체 폴리펩티드는 일반적으로 본원에 설명된 폴리펩티드 서열 중 1개를 변형시키고, 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 그것이 생물학적 동등물인지 여부를 결정함으로써 확인될 수 있다. 변이체는 그것이 면역조직화학 검정, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역검정, 방사면역 검정 (RIA), 면역효소 검정 또는 웨스턴 블랏 검정과 같은 검정에서 본원에 설명된 폴리펩티드와 실질적으로 동일하게 반응하는 경우, 예를 들어, 원래 폴리펩티드의 활성의 90-110%를 가지는 경우, 생물학적으로 동등하다. 일 실시예에서, 검정은 경쟁 검정이며, 여기서 생물학적으로 동등한 폴리펩티드는 본원에 설명된 폴리펩티드의 대응하는 반응성 항원 또는 항체에 대한 결합을 약 80, 95, 99 또는 100% 만큼 감소시킬 수 있다. 대응하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 변이체 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
변이체 폴리펩티드는 서열번호 1-27에 나타낸 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%, 또는 약 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다. 예를 들어, 서열번호 1-27의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1-27과 적어도 약 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 90%, 87%, 84% 또는 81% 동일할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 1개 이상의 보존적 아미노산 변이 또는 다른 사소한 변형을 가지며 생물학적 활성을 보유하며, 즉 서열번호 1-27에 생물학적으로 기능적인 동등물이다. 생물학적으로 활성인 동등물은 대응하는 폴리펩티드와 비교할 때 실질적으로 동등한 기능을 갖는다.
아미노산 서열에 돌연변이를 도입하는 방법은 당해 분야 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); Maniatis 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조. 돌연변이는 또한 "QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene)과 같은 시판 중인 키트를 사용하여 도입할 수 있다. 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산을 대체함으로써 기능적으로 활성인 변이체 폴리펩티드의 생성은 당해 분야 숙련자에 의해 달성될 수 있다.
변이체 폴리펩티드는 1개 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것으로서, 펩티드 화학 분야의 당해 분야 숙련자라면 폴리펩티드의 2차 구조 및 수치요법 성질이 실질적으로 변하지 않을 것으로 기대할 것이다. 일반적으로, 하기 아미노산 군은 보존적 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
본원에서 사용된, 2개의 아미노산 서열 (또는 2개의 핵산 서열)의 % 동일성은 Karlin 및 Altschul, PNAS USA 90:5873-5877, 1993에서와 같이 변형된, Karlin 및 Altschul (PNAS USA 87:2264-2268, 1990)의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul 외 (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행된다. 비교 목적을 위해 갭 정렬을 얻기 위해, GappedBLAST를 Altschul 외 (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)에 설명한 바와 같이 이용한다. BLAST 및 GappedBLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램의 기본 매개변수들 (예, XBLAST 및 NBLAST)을 사용해서 본원에 설명된 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득한다.
동일성 또는 동일하다는 것은 아미노산 서열 유사성을 의미하며, 당해 분야에서 인정한 의미를 갖는다. 동일성을 갖는 서열은 동일하거나 유사한 아미노산을 공유한다. 서열 동일성은 서열이 정렬되고 필요에 따라 서열 동일성을 최대화하기 위해 갭을 적절하게 도입한 후에 결정된, 항체의 원래 아미노산 서열과 동일한 아미노산의 백분율이다. 따라서, 참조 서열과 85% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 후보 서열은 참조 서열과 후보 서열의 정렬 후에, 후보 서열 내의 아미노산의 85%가 참조 서열 내의 대응 아미노산과 동일하며, 그리고/또는 보존적 아미노산 변화를 구성하는 것을 요구한다.
폴리펩티드 또는 항체는 폴리펩티드 또는 항체가 자연적으로 보통 결합하지 않는 아미노산 서열에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 또는 항체는 아미노산 이외의 화합물 또는 분자에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 항체는 표지자 시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 정지 이동 서열, 막횡단 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 단백질 정제 리간드는 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 1개 이상의 C 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 스페이서는 자연적으로 폴리펩티드 또는 항체와 보통 결합하지 않는 아미노산 서열이다. 아미노산 스페이서는 약 1, 5, 10, 20, 100 또는 1,000 아미노산을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 단백질의 이동을 번역과 동시에 또는 번역 후에 지시하는 신호 (또는 리더) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드 (예, poly-His)의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 향상시키기 위한 링커 또는 다른 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역 또는 소 혈청 알부민에 접합될 수 있다.
폴리펩티드는 자연적으로 폴리펩티드가 보통 결합하지 않은 아미노산 서열, 즉 이종 아미노산 서열에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 이종 아미노산 서열은 상이한 유기체, 합성 서열, 또는 폴리펩티드의 카르복시 또는 아미노 말단에 통상 위치하지 않는 서열로부터 유래될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 지시자 시약과 같은, 아미노산 이외의 화합물 또는 분자에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 폴리펩티드는 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 정지 이동 서열, 막횡단 도메인, 단백질 정제 리간드 또는 이들의 조합물에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 면역 반응(예, IL-2와 같은 사이토카인)을 강화시키는 부분 (폴리펩티드 또는 다른 화합물일 수 있는 작용기), 정제를 용이하게 하는 부분 (예, 6-히스티딘 태그, trpE, 글루타티온, 말토오스 결합 단백질과 같은 친화력 태그), 또는 폴리펩티드 안정성을 촉진하는 부분 (예, 폴리에틸렌 글리콜; 아세틸, 프로필, 숙시닐, 벤질, 벤질옥시카르보닐 또는 t-부틸옥시 카르보닐 같은 아미노 말단 보호기; 아미드, 메틸아미드 및 에틸아미드 같은 카르복시 말단 보호기)에 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 단백질 정제 리간드는 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 또는 양쪽 말단 모두에서 1개 이상의 C 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 스페이서는 자연적으로 폴리펩티드와 결합되지 않는 아미노산 서열이다. 아미노산 스페이서는 약 1, 5, 10, 20, 100 또는 1,000 아미노산을 포함할 수 있다.
원하는 경우, 폴리펩티드는 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 신호 서열, TMR 정지 이동 서열, 막횡단 도메인 같은 다른 아미노산 서열, 뿐만 아니라 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그, 및 포도상구균 단백질 A, 또는 이들의 조합물을 또한 함유할 수 있는 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질은 서로 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 상이한 아미노산 서열이다. 융합 단백질 구조체는 고정된 서열로 개별 폴리펩티드 단편들을 함께 연결시킴으로써 유기 화합물 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 융합 단백질 구조체는 또한 적절한 서열로 아미노산 잔기들을 암호화하는 특정된 재조합 DNA 서열을 갖는 도입된 발현 벡터를 운반하는, 시험관 내 배양된 유전자 변형 숙주 세포 (예컨대, E. coli)에 의해 발현될 수 있다. 이종 폴리펩티드는 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 1개 이상의 폴리펩티드가 융합 단백질에 존재할 수 있다. 폴리펩티드의 단편은 융합 단백질에 존재할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 서열번호 1-27, 그의 단편 또는 이들의 조합물 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 다량체 형태일 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 서열번호 1-27 또는 이들의 조합물 중 2개 이상의 사본을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 폴리펩티드는 인간, 토끼, 마우스, 개과, 고양이과, 다른 포유류, 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 폴리펩티드는 화학적으로 합성되거나 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 종래의 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
일 실시예에서, 폴리펩티드는 고체상 또는 기질에 공유 또는 비공유 고정된다.
폴리펩티드는 재조합으로 생산될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 벡터에 도입될 수 있으며, 이는 당해 분야에 주지된 기술을 사용하여 적합한 발현 숙주 시스템에서 발현될 수 있다. 다양한 박테리아, 효모, 식물, 포유동물 및 곤충 발현 시스템이 당해 분야에서 이용 가능하며, 이러한 발현 시스템을 사용할 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 무-세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 폴리펩티드는 동결 건조(lyophilized), 건조(desiccated) 또는 건조(dried), 예를 들어 동결-건조(freeze-dried)될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
일 실시예는 본원에 개시된 1개 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전체 게놈보다 적은 양을 함유하며, 단일 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 RNA 또는 DNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단백질, 지질 및 다른 폴리뉴클레오티드와 같은, 다른 성분없이 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정제된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1-27에 나타낸 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 링커, 신호 서열, TMR 정지 이동 서열, 막횡단 도메인 또는 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그 및 포도상구균 단백질 A을 코딩하는 서열과 같은, 다른 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단리될 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 결합되는 5' 및 3' 측부 게놈 서열 중 1개 또는 둘 모두와 바로 인접하지 않는 자연 발생 폴리뉴클레오티드다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 게놈에서 재조합 DNA 분자의 바로 측부에 자연적으로 발견되는 핵산 서열이 제거되거나 부재한다면, 예를 들어, 임의의 길이의 재조합 DNA 분자일 수 있다. 또한, 단리된 폴리뉴클레오티드는 비-자연 발생 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드다. 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이지만, 유전자 암호의 축퇴로 인해, 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과 핵산 서열이 상이하다. 생물학적으로 기능적인 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 상보성 DNA (cDNA) 분자, 종 동종체 및 변이체 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함할 수 있거나 또는 자연에서 발생하지 않는 변경된 서열을 코딩할 수 있다 원하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 복제 원점, 프로모터, 인핸서, 또는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 다른 조절 요소를 비롯한, 발현 조절 요소를 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 예를 들어, pBR322, pUC 또는 ColE1과 같은 플라스미드, 또는 아데노바이러스 2 형 벡터 또는 5 형 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 선택적으로, Sindbis 바이러스, 시미안 바이러스 40, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 및 사이토메갈로바이러스, 및 레트로바이러스 벡터, 예컨대 쥐 육종 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, Moloney 쥐 백혈병 바이러스, Rous 육종 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 벡터가 사용될 수 있다. MC 및 MC1 같은 미니염색체(minichromosome), 박테리오파지, 파지미드, 효모 인공 염색체, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 코스미드 (파지 람다 cos 부위가 삽입된 플라스미드) 및 레플리콘(replicon) (세포에서 스스로의 조절 하에 복제 가능한 유전 요소)가 사용될 수도 있다.
발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 제조하고 이를 숙주 세포에서 발현시키기 위한 방법들이 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,366,246호 참조. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그것이 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 지시하는, 하나 이상의 발현 조절 요소에 인접하거나 근접하게 위치될 때 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 생물학적 시료와 같은 시험 시료 내의 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해, 예를 들어 프로브 또는 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브는 통상적으로 예를 들어, 하이브리드화를 통해 서열 특이적 방식으로, 표적 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 프라이머는 효소 조작을 지원할 수 있고 효소 조작이 일어나도록 표적 핵산과 하이브리드화할 수 있는 프로브의 서브세트이다. 프라이머는 효소 조작을 간섭하지 않는 당해 분야에서 이용 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합으로부터 제조될 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 이상의 인접 뉴클레오티드일 수 있다.
항체
항체는 본원에 설명된 시스타틴 B 폴리펩티드, 본원에 설명된 변이체 시스타틴 B 폴리펩티드, 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 포함한다. 항체는 다수 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 "항체"는 항원 결합을 위해 무손상(intact) 항체와 경쟁하는 무손상 항체 또는 그의 항원-결합 부분 또는 단편을 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 1개 이상의 시스타틴 B 폴리펩티드, 예를 들어, 서열번호 1-27에 특이적으로 결합하는 임의의 유형의 항체 분자 또는 특이적 결합 분자를 포함한다. 항체는 자연 발생, 비-자연 발생, 합성 또는 유전적으로 조작될 수 있다. 본원에서 사용된, 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등의 용어는, 항체 또는 그의 단편은 복합체를 형성하기 위해 시스타틴 B 폴리펩티드 (예, 서열번호 1-27)에 특이적으로 결합하는 임의의 자연 발생하거나, 효소적으로 수득 가능하거나, 합성적이거나 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드, 당단백질 또는 면역글로불린을 포함한다.
항체 또는 그의 단편은 본원에 설명된 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 항체는 적절한 실험 동물에서 생체 내에서 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 시험관 내에서 만들 수 있다. 항체를 제조하고 특성화하기 위한 수단은 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn 외 Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright 외 Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992) 참고. 예를 들어, 다중클론 항체는 본원에 설명된 폴리펩티드를 인간 또는 다른 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 염소, 돼지, 개, 소, 양, 당나귀 또는 말과 같은 동물에게 투여함으로써 생산될 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수집하고 예를 들어, 암모늄 설페이트로 침전시킨 후 친화도 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의해 혈장으로부터 항체를 정제한다. 다중클론 항체를 생산하고 가공하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다.
항체는 IgG (IgG1, IgG2, IgG2a, Ig2b, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1 및 IgA2), IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 아이소타입일 수 있다.
항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 단일클론 항체는 실질적으로 균질한 항체의 군으로부터 수득된 항체이다. 실질적으로 균질한 항체의 군은 소량의 돌연변이체 또는 변이체를 함유할 수 있다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며 단일 항원 부위와 상호작용한다. 각각의 단일클론 항체는 통상적으로 단일 에피토프를 표적으로 하는 반면, 다중클론 항체 집단은 통상적으로 다양한 에피토프 군을 표적으로 하는 다양한 항체를 함유한다. 단일클론 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (Kohler과 Miistein, Nature 256:495, 1975), 재조합 방법 (미국 특허 제4,816,567호), 및 파지 항체 라이브러리로부터의 단리 (Clackson 외, Nature 352:624-628, 1991; Marks 외, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991)을 비롯한, 다수의 방법에 의해 생산될 수 있다.
키메라 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 특정 종 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 부분을 가지며, 사슬의 나머지 부분은 다른 종, 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스로부터 유래된다. 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi 외, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies 외, J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호 참고.
키메라 항체는 예를 들어, CDR-이식 (EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니아링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489-498 (1991); Studnicka 외, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska 외, PNAS 96:969-973 (1994)), 및 체인 셔플링(chain shuffling) (미국 특허 제5,565,332호)을 비롯한 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
일 실시예에서, 키메라 항체는 서로 다른 종들의 가변 및 불변 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어 항체는 한 포유동물의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과, 다른 동물 (예컨대 마우스, 토끼, 개과, 고양이과 또는 인간) 유래의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체는 수여자 항체 내로 도입된 CDR에나, 프레임워크 서열에도 포함되지 않은 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산을 도입하여 항원을 인식하고 항원에 결합하는 항체의 능력을 보다 정확하게 최적화할 수 있다. 예를 들어, 필요하다면, 항체 가변 영역의 프레임워크 영역 내의 아미노산은 재구성 항체(reshaped antibody)의 CDR이 적절한 항원-결합 부위를 형성하도록 치환될 수 있다. Sato 외, Cancer Res. (1993) 53:851-856 참고.
항체의 항원-결합 부위 또는 단편의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: Fab 단편; Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편; Fd 단편; Fv 단편; 단일-사슬 Fv (scFv) 분자; sdAb 단편 (나노바디); Fab-유사 항체 (파파인 소화에 의해 수득되는 Fab 단편과 동등한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 함유하는 항원-결합 단편); F(ab')2-유사 항체 (펩신 소화에 의해 수득되는 F(ab')2 단편과 동등한 2개의 항원-결합 도메인을 함유하는 항원-결합 단편), 항체 단편으로부터 제조된 다중특이적 항체, 디아바디(diabody), 이중특이적 항체, 다기능성 항체, 인간화 항체, 개과화 항체, 인간 항체, 개과 항체, 고양이과 항체, 쥐 항체, 토끼 항체, 합성 항체, CDR-이식 항체, 및 항체의 과가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어지는 최소 인식 단위 (예, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)), 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드. 다른 조작된 분자들, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예, 1가 나노바디, 2가 나노바디), 단일 사슬 (Fv)2 (sc(Fv)2); 2가 (sc(Fv)2); 4가 ([sc(Fv)2]2) scFV 항체, 및 작은 조절 면역 약물(small modular immunopharmaceutical, SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인도, 본원에 사용된 바와 같이, "항원-결합 단편 또는 부분"으로 간주된다.
"특이적으로 결합한다", "특이적으로 결합" 또는 "에 특이적인"은 제1 항원, 예를 들어, 서열번호 1-27의 폴리펩티드가, 본원에 설명된 항체를 다른 비-특이적 분자보다 큰 친화력으로 인식하고 결합한다는 것을 의미한다. "특이적으로 결합한다", "특이적으로 결합" 또는 "에 특이적인"는 또한 제1 항체, 예를 들어, 서열번호 1-27에 대응하여 키워진 항체를 의미하며, 서열번호 1-27을 다른 비-특이적 분자보다 큰 친화력으로 인식하고 결합한다. 비-특이적 분자는 제1 항원과 공통 에피토프를 공유하지 않는 항원이다. 특이적 결합은 예를 들어, 당해 분야에 공지된 방법론을 사용하여 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사면역 검정 (RIA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역검정, 또는 웨스턴 블랏 검정을 사용하여 시험할 수 있다.
일 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 27에 제시된 폴리펩티드 위의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일 실시예에서, 에피토프는 AYF, LAYF (서열번호 20), ELAYF (서열번호 21), DELAYF (서열번호 22), HDELAYF (서열번호 23), KHDELAYF (서열번호 10), AKHDELAYF (서열번호 24), KAKHDELAYF (서열번호 25), NKAKHDELAYF (서열번호 26), TNKAKHDELAYF (서열번호 27) 또는 QTNKAKHDELAYF (서열번호 4)이다.
일 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1-27 또는 그의 단편에 대해 제2 항체 또는 참조 항체와 결합에 대해 경쟁한다. 모든 경쟁적 결합 검정을 사용하여 동일한 항원에 대한 두 항체 간의 경쟁을 측정할 수 있다. 예를 들어 샌드위치 ELISA 검정이 이 목적으로 사용될 수 있다. 교차-반응성에 대해 검정하는 수단은 당해 분야 숙련자에게 주지되어 있다 (예를 들어, Dowbenko 외 (1988) J. Virol. 62: 4703-4711 참조).
경쟁적 결합을 평가하기 위해 사용된 임의의 검정법을 사용하는 제1 항체의 존재 시에, 항원에 대한 제2 항체의 결합이 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 90% 또는 그 이상 감소하는 경우, 제1 항체는 제2 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 간주된다.
경쟁적 결합은 고체 지지체에 부착된 서열번호 1-27로 나타낸 1개 이상의 단리된 폴리펩티드를 제공하고 폴리펩티드에 결합하거나 폴리펩티드에 대한 결합을 위해 본원에 설명된 항체와 경쟁하는 항체의 능력을 검정함으로써 확인될 수 있다.
항체는 (a) 서열번호 1-27 또는 그의 항원 결합 단편에 결합하기 위한 참조 항체와의 결합을 위해 경쟁하고; (b) 참조 항체와 동일한 서열번호 1-27 또는 그의 항원 결합 단편의 에피토프에 결합하고;참조 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 서열번호 1-27 또는 그의 항원 결합 단편에 결합하고; 그리고/또는 (d) 참조 항체와 실질적으로 동일한 오프 율(off rate)로 서열번호 1-27 또는 그의 단편에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 참조 항체는 107 l/몰 이상의 결합 친화도 Ka 로 서열번호 1-27의 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편의 자신의 폴리펩티드 파트너에 대한 친화도는 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 배율에서 산출된다. Chen, Y. 외, 1999, J. Mol. Biol. 293: 865-881 참조. 친화도 상수를 측정하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 특정 실시예에서, 참조 항체는 특정 Kon 율/결합 율 또는 Koff 율로서 서열번호 1-27의 폴리펩티드에 대한 결합 친화도를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일 실시예에서, 항체는 6 x 105 M-1s-1 이상의 Kon으로 특이적으로 결합하거나; 항체는 5 x 10-6 s-1 이상의 Koff 율로 특이적으로 결합하거나; 또는 항체는 500pM, 400pM, 300pM, 200 pM, 100pM, 50pM, 40pM, 30 pM, 20 pM 이상의 결합 친화도로 특이적으로 결합한다.
서열번호 1-27에 특이적으로 결합하는 항체는 동물의 혈청, 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 치태, 열구액, 치은 생검, 혀 면봉 또는 소변 시료와 같은, 시료에 존재하는 시스타틴 B 폴리펩티드 및 그의 단편의 존재를 검출하는데 특히 유용하다. 면역검정법은 1개의 항체 또는 여러 개의 항체를 사용할 수 있다. 면역검정법은 예를 들어, 1개의 에피토프에 특이적인 단일클론 항체, 1개의 폴리펩티드의 에피토프에 특이적인 단일클론 항체들의 조합, 상이한 폴리펩티드의 에피토프에 특이적인 단일클론 항체, 동일한 항원에 특이적인 다중클론 항체, 상이한 항원에 특이적인 다중클론 항체, 또는 단일클론 항체와 다중클론 항체의 조합을 사용할 수 있다. 면역검정 프로토콜은 예를 들어, 경쟁, 직접 반응, 또는 예를 들어, 표지된 항체를 사용하는 샌드위치 형태의 검정에 기반할 수 있다. 항체는 예를 들어, 형광, 화학발광, 방사성, 효소, 콜로이드성 금속, 방사성 동위원소 및 생물발광 표지를 포함하여, 당해 분야에 공지된 임의의 유형의 표지로 표지될 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 지지체에 결합되어 특정 질환 및 상태에서 시료에 존재하는 폴리펩티드의 존재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 지지체는 예를 들어, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 개질된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마그네타이트를 포함한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동결 건조(lyophilized), 건조(desiccated) 또는 건조(dried), 예를 들어 동결-건조(freeze-dried)될 수 있다.
항체는 면역친화도 컬럼에 의해 폴리펩티드를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어, 흡착에 의해서나 또는 공유 결합에 의해서 고체 지지체에 부착되어서 항체가 그들의 면역선택성 활성을 보유할 수 있게 된다. 선택적으로, 항체의 항원 결합 부위가 접근 가능하도록 스페이서 그룹이 포함될 수 있다. 이어서 고정화된 항체는 타액, 치태, 열구액, 치은 생검, 혀 면봉, 혈청, 혈액 및 소변을 포함하지만 이에 한정되지 않는 생물학적 시료로부터의, 서열번호 1-27 또는 그의 단편을 특이적으로 결합시키는 데 사용될 수 있다.
항체는 또한 다양한 세포 이벤트 또는 생리학적 조건 동안 본원에 설명된 폴리펩티드의 존재 및 분포를 분석하기 위한 면역조직화(immunolocalization) 연구에 사용될 수 있다. 항체는 또한 수동 면역화에 관여하는 분자를 동정하고 비-단백질 항원의 생합성에 관여하는 분자를 동정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 분자의 동정은 백신 개발에 유용할 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체 및 단일 사슬 항체를 비롯한 항체를 사용하여 특정 질환 또는 상태의 개선 과정을 모니터링할 수 있다. 동물의 시험 시료에서 서열번호 1-27 또는 그의 단편의 양의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 장애를 완화시키는 데 목적을 둔 특정 치료 요법이 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. 항체는 예를 들어, RIA, ELISA 또는 웨스턴 블랏 검정과 같은 직접 결합 검정법을 사용하여 검출 및/또는 정량화될 수 있다.
검출 방법
일 실시예는 시스타틴 B 폴리펩티드 및 서열번호 1-27에 특이적인 1개 이상의 항체의 복합체 형성에 적합한 조건 하에, 시료를 서열번호 1-27에 특이적인 1개 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 시스타틴 B 폴리펩티드 및 서열번호 1-27에 특이적인 1개 이상의 항체의 복합체가 검출된다.
일 실시예에서, 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 시료 내의 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드의 양을 검출할 수 있다. 폴리펩티드의 상대적인 수준은 여러 질환 또는 상태를 진단하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 검출하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법이 본원에 설명된 방법들에 사용될 수 있다.
본원에 설명된 항체와 함께 사용되는 검정 방법은 직접 및 간접 표지 기술, 면역친화도 컬럼, 면역자성 비드, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사면역 검정 (RIA), 응집 검정 비혼탁 검정, 정량 비혼탁 검정, 뿐만 아니라 일차 항체를 검출하는 표지된 이차 항체를 포함한다.
항체는 예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류기와 같은 시판중인 기기를 사용하여 검출에 적합한 여기 및 방출 파장을 갖는 형광 라벨로, 검출 가능하게 표지될 수 있다. 형광 표지의 예로는 피코에리트린 (PE), 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민 (RH), 텍사스 레드 (TX), Cy3, 훽스트(Hoechst) 33258 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 포함한다. 이러한 표지는 표준 기술 (Maino 외, 1995, Cytometry 20: 127-133)을 사용하여 항체에 접합될 수 있다.
본원에 설명된 방법은 서열번호 1-27 또는 그의 단편을 검출하는데 사용될 수 있으며, 여기서 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열번호 1-27에 특이적으로 결합한다. 생물학적 시료는 개, 고양이 또는 인간과 같은 포유동물로부터의 혈청, 혈액, 세포, 혈장, 타액, 치태, 열구액, 치은 생검, 혀 면봉, 또는 소변을 포함할 수 있다. 시험 시료는 미처리, 침전, 분별, 분리, 희석, 농축 또는 정제될 수 있다.
본원에서 사용된, "환자" 또는 "대상"은 고양이과, 소, 돼지, 말 또는 개과를 포함하는 인간 또는 비-인간 동물을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "시료", "시험 시료", "환자 시료" 또는 "대상 시료"는 대상으로부터 수득된 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 치태, 열구액, 치은 생검, 혀 면봉, 또는 소변 시료를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
검정법에는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 블랏, IFA, 방사면역 검정 (RIA), 혈구응집 (HA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역검정, 형광 편광 면역검정 (FPIA), 미세역가 플레이트 검정 (미세역가 플레이트의 1개 이상의 웰에서 수행된 임의의 분석)을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 경쟁, 직접 반응 또는 샌드위치 형 검정법에 기초하는 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 한 가지 검정법은 가역 유동 크로마토그래피 결합 검정, 예를 들어 SNAP® 검정을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,726,010호 참조.
검정법은 고체 상 또는 기질을 사용할 수 있거나 또는 면역침전 또는 고체 상을 이용하지 않는 임의의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 고체 상 또는 기질이 사용되는 경우, 1개 이상의 폴리펩티드 또는 항체는 고체 지지체 또는 기질 예컨대 미세역가 웰, 자성 비드, 비-자성 비드, 컬럼, 매트릭스, 멤브레인, 합성 또는 천연 섬유로 이루어지는 섬유질 매트 (예, 유리 또는 셀룰로오스계 물질 또는 열가소성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에스테르), 입자상 물질로 이루어지는 소결된 구조 (예, 유리 또는 다양한 열가소성 중합체), 또는 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리술폰 등으로 이루어지는 캐스팅 멤브레인 필름 (일반적으로 본질적으로 합성)에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 일 실시예에서, 기질은 일반적으로 다공성 폴리에틸렌, 예를 들어 Chromex Corporation (앨버커키, 뉴멕시코)의 10-15 마이크론 다공성 폴리에틸렌으로 알려져 있는, 폴리에틸렌의 소결된, 미세 입자이다. 이들 기질 물질은 모두 필름, 시트 또는 플레이트와 같은 적합한 형상으로 사용될 수 있거나, 종이, 유리, 플라스틱 필름 또는 직물과 같은 적절한 불활성 담체 상에 코팅되거나 결합되거나 적층될 수도 있다. 고체 상에 항체를 고정시키는 적합한 방법은 이온성, 소수성, 공유 상호작용 등을 포함한다.
일 실시예에서, 방법은 시험 시료를 폴리펩티드/항체 복합체, 즉 면역복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에서 서열번호 1-27에 특이적으로 결합하는 하나 또는 다수의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 즉, 항체는 시료에 위치한 서열번호 1-27의 하나 또는 다수의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 당해 분야 숙련자는 항체/폴리펩티드 복합체 결합을 검출하는 데 사용되는 검정법 및 조건에 친숙하다. 시료 내의 폴리펩티드와 항체 사이의 복합체의 형성이 검출된다. 항체/폴리펩티드 복합체의 형성은 폴리펩티드가 환자 시료에 존재한다는 표시이다.
일 실시예에서, 폴리펩티드/항체 복합체는 항체에 결합된, 효소 접합체와 같은 지시자 시약이 검출 가능한 반응을 촉매하는 경우에 검출된다. 선택적으로, 신호 발생 화합물을 포함하는 지시자 시약은 폴리펩티드/항체/지시자 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 폴리펩티드/항체 복합체에 적용될 수 있다. 폴리펩티드/항체/지시자 복합체가 검출된다. 선택적으로, 폴리펩티드 또는 항체는 폴리펩티드/항체 복합체의 형성에 앞서 지시자 시약으로 표지될 수 있다. 상기 방법은 선택적으로 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 양성 대조군은 1개 이상의 폴리펩티드를 함유할 수 있으며, 이는 Cys B에 특이적인 항체에 특이적으로 결합하고 양성 결과를 제공할 것이다. 음성 대조군은 Cys B에 특이적인 항체와 특이적으로 결합하거나 교차 반응하는 임의의 Cys B 폴리펩티드 또는 임의의 폴리펩티드 또는 다른 성분을 함유하지 않는다.
일 실시예에서, 1개 이상의 항체는 고체 상 또는 기질에 공유 또는 비공유 고정된다. 잠재적으로 Cys B 폴리펩티드를 포함하는 시료가 기질에 첨가된다. Cys B에 특이적인 1개 이상의 항체가 기질에 첨가된다. 항체는 고체 상에 사용되는 동일한 항체일 수 있거나 또는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래될 수 있으며 효소 접합체와 같은 지시자 시약에 연결될 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단(chromophore) 또는 효소 기질이 첨가되고 색상이 생길 수 있다. 색 반응은 중단되고 색상은 예를 들어, 분광 광도계를 사용하여 정량화될 수 있다.
다른 실시예에서, 1개 이상의 항체가 고체 상 또는 기질에 고정화된다. 잠재적으로 Cys B 폴리펩티드를 함유하는 시험 시료가 기질에 첨가된다. Cys B 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제2 항-종(anti-species) 항체가 첨가된다. 이들 제2 항-종 항체는 고체 상에 고정화된 항체와 다른 종으로부터 유래된다. 제2 항-종 항체에 특이적으로 결합하고, 고체 상에 고정화된 항체에 특이적으로 결합하지 않는 제3 항-종 항체가 첨가된다. 제3 항-종 항체는 효소 접합체와 같은 지시자 시약을 포함할 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고 색상이 생길 수 있다. 색 반응은 중단되고 색상은 예를 들어, 분광 광도계를 사용하여 정량화될 수 있다.
일 실시예에서, 1개 이상의 포획 항체는 본원에 설명된 폴리펩티드의 1개 이상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 포획 항체 또는 항체들은 예를 들어 고체 지지체에 서열번호 1-27의 하나 또는 다수의 폴리펩티드를 고정시키는 데 사용될 수 있다. 1개 이상의 검출 항체는 폴리펩티드의 동일한 1개 이상의 에피토프 또는 상이한 1개 이상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 검출 항체는 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 고정화를 검출하거나 가시화하는 데 사용될 수 있다. 이 실시예는 포획 및 검출 기능 모두에 대해 단지 1개의 항체를 사용하는 검정법보다 더 특이적이고 더 민감하기 때문에 유리하다.
한 유형의 검정 포맷에서, 1개 이상의 항체가 고체 상 또는 기질 상에 코팅될 수 있다. 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 함유하는 것으로 의심되는 시험 시료는, 시험 시료 폴리펩티드에 대한 고체 상의 항체 혹은 폴리펩티드에 특이적인 항체에 접합된 지시자 시약 화합물의 항원/항체 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 상기 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 접합된 신호 발생 화합물을 포함하는 지시자 시약과 함께 인큐베이팅된다. 항-폴리펩티드 항체에 접합된 지시자 시약의 고체 상에 대한 결합은 정량적으로 측정될 수 있다. 대조군 시료 또는 대조군 표준으로부터 생성된 신호와 비교하여 신호의 측정 가능한 변경은 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편의 존재를 나타낸다. 이러한 유형의 검정은 시험 시료 내의 폴리펩티드의 양을 정량할 수 있다.
다른 유형의 검정 포맷에서, 1개 이상의 항체가 지지체 또는 기질 상에 코팅된다. 항체를 지시자 시약에 접합시키고 시험 시료에 첨가한다. 이 혼합물은 지지체 또는 기질에 도포된다. Cys B 폴리펩티드가 시험 시료에 존재하는 경우, 지시자 시약에 접합된 1개 이상의 항체 및 지지체 상에 고정된 1개 이상의 항체에 결합할 것이다. 그런 다음 폴리펩티드/항체/지시자 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 시료 내의 폴리펩티드의 양을 정량할 수 있다.
다른 유형의 검정 포맷에서, 1개 이상의 항체가 지지체 또는 기질 상에 코팅된다. 시험 시료를 지지체 또는 기질에 적용하고 인큐베이팅한다. 시료로부터 결합되지 않은 성분은 세척 용액으로 고체 지지체를 세척함으로써 씻어 낸다. 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편이 시험 시료에 존재한다면, 이들은 고체 상에 코팅된 항체에 결합할 것이다 이 폴리펩티드/항체 복합체는 지시자 시약에 접합된 제2 항-종 특이적 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 폴리펩티드/항체/항-종 항체 지시자 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 시료 내의 폴리펩티드의 양을 정량할 수 있다.
폴리펩티드/항체 복합체 또는 폴리펩티드/항체/지시자 복합체의 형성은 예를 들어, 방사선 측정법, 비색 분석법, 형광 측정법, 크기-분리법 또는 침전 방법으로 검출할 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 신호 발생 화합물을 포함하는 지시자 시약에 커플링된 이차 항체의 첨가에 의한다. 폴리펩티드/항체 복합체와 연관된 신호 발생 화합물 (표지)을 포함하는 지시자 시약은 상술한 방법을 사용하여 검출될 수 있으며, 발색제, 촉매, 예컨대 효소 접합체 형광 화합물, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 화학발광 화합물, 예컨대 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄 및 루미놀, 방사성 원소, 직접적인 시각적 표지 뿐만 아니라, 보조 인자, 억제제, 자성 입자 등을 포함한다. 효소 접합체의 예는 알칼라인 포스파타아제, 서양고추냉이 과산화효소, 베타-갈락토시다아제 등을 포함한다. 특정 표지의 선택은 중요하지 않지만, 단독으로 또는 1개 이상의 추가 물질과 함께 연합하여 신호를 생성할 수 있을 것이다.
본원에서 사용되는 "양을 결정한다"라는 문구는 시료 내의 1개 이상의 폴리펩티드의 수준을 측정 또는 확인하는 것을 의미한다. 이는 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사면역 검정 (RIA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역검정, 또는 웨스턴 블랏 검정, 또는 면역조직화학 법을 포함하는, 항체를 사용하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 검출에 대해 당해 분야에 주지된 방법론에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 서열번호 1-27의 폴리펩티드는 질량 분광법 또는 당해 분야 숙련자에게 공지된 유사한 방법에 의해 결정될 수 있다. 시료에 존재하는 폴리펩티드의 양을 결정하는 것은 시험관 내 분석 및 실험 조작에 의해 달성된다.
진단 방법
일 실시예는 대상에서 신장 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1-27에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정된다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교되며, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 신장 질환의 표시이다.
다른 방법은 CKD 환자의 AKI 또는 AKI를 진단할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 방법은 암 또는 신장 암에 의해 유발된 신장 기능의 저하 또는 신장에 대한 물리적 손상을 진단할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 세균 감염에 의해 유발된 신장 질환, 신장 기능의 저하 또는 신장에 대한 물리적 손상을 진단할 수 있다. 세균 감염은 예를 들어, 아나플라즈마 종(Anaplasma sp.), 에를리히아 종(Ehrlichia sp.), 렙토스피라 종(Leptospira sp.), 에스케리치아 종(Escherichia sp.) 또는 보렐리아 종(Borrelia sp.)에 의해 유발될 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 세균 감염에 의해 유발된 신장 질환, 신장 기능 저하 또는 신장에 대한 물리적 손상을 진단 또는 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정된다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교되며, 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 세균 감염에 의해 유발된 신장 질환, 신장 기능 저하 또는 신장에 대한 물리적 손상의 표시이다.
본원에 개시된 바와 같이, 폴리펩티드는 질환이 없는 대상으로부터의 대조군 시료와 비교할 때 질환이 있는 대상 시료에서 더 많은 양 또는 수준으로 발견된다. 대상 시료에서 본원에 설명된 폴리펩티드의 상대적인 수준은 질환의 진행 및 질환의 중증도를 나타낼 수 있다. 즉, 일부 경우에, 시스틴틴 B 폴리펩티드의 양 또는 수준이 클수록 더 심각한 질병 상태를 의미한다.
시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 대조군 시료 또는 대조군 표준보다 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% 또는 그 이상인 수준이다. 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 대조군 시료 또는 대조군 표준보다 약 10 내지 500% 또는 그 이상; 약 20 내지 500% 또는 그 이상; 약 30 내지 500% 또는 그 이상; 약 40 내지 500% 또는 그 이상; 약 50 내지 500% 또는 그 이상; 약 60 내지 500% 또는 그 이상; 약 100 내지 500% 또는 그 이상인 수준이다.
시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 또한 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 통계적으로 유의하게 증가된 양인 수준일 수 있다.
시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 또한 약 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000 또는 그 이상의 ng/ml일 수 있다. 시스타틴 B 폴리펩티드의 대조군 수준 또는 대조군 표준은 약 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 20, 10 또는 그 이하의 ng/ml일 수 있다.
시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 임의의 유형의 신장 질환 또는 상태, 세균 감염 또는 치주 질환을 갖지 않는 정상 대조군 대상을 사용하여 결정되는 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교될 수 있다.
일부 실시예에서, 시험 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 수준은 1개 이상의 정상 대조군 대상으로부터의 대조군 시료 내의 시스타틴 B의 수준과 비교된다. 통상적으로, 대조군 시료에서 측정된 대조군 수준은 시험 시료에서 측정된 시스타틴 B 폴리펩티드 수준과 비교된다. 대안적으로, 시험 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 수준을 이전에 결정되었거나 또는 미리 정의된 대조군 수준 ("대조군 표준")과 비교한다. 예를 들어, 시스타틴 B 폴리펩티드의 대조군 표준은 다수의 정상 또는 건강한 대조군 대상으로부터의 대조군 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 수준을 포함하는 데이터와 같은, 데이터로부터 계산될 수 있다. 정상 또는 건강한 대조군 대상과 시험 대상은 동일한 종의 것일 수 있다.
특정 실시예는 포유동물, 특히 개, 고양이 및 인간에서 특정 질환 또는 상태를 확인하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 특정 실시예는 환자에 대한 진단 및 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 대상 시료 내의 CysB 폴리펩티드를 동정하는 것은, 신장 질환의 독립적인 예측자 또는 만성 신장 질환 단계에서 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상의 식별자일 수 있다 (예를 들어, 1-4 기). 상기 방법은 유리하게 만성 신장 질환에서의 급성 신장 손상 또는 활성 신장 손상의 진단 및 확인을 허용하며, 환자 연령 또는 체질량에 의해 영향을 받지 않거나 혼동되지 않는다. 따라서, 추가의 실시예는 폴리펩티드를 사용하여 결정된 상기 신장 환자 예후를 사용하여 적절한 신장 요법을 선택하는 것에 관한 것이다.
대상 시료 내의 Cys B 폴리펩티드를 동정하는 것은 AKI 등급 (예를 들어, 1-5 등급)의 독립적인 예측자가 될 수 있다. 본원에 설명된 방법 및 조성물은 유리하게는 3 등급 이전의 AKI 단계의 진단 및 확인을 허용하며 환자 연령 또는 체질량에 의해 영향을 받지 않거나 혼동되지 않는다.
항체는 예를 들어, 신장 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 인간, 고양이 또는 개와 같은 동물로부터 시험 시료를 얻음으로써 신장 질환을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 시험 시료는 항체-항원 복합체 (즉, 면역복합체)의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 항체와 접촉된다. 당해 분야 숙련자는 항원/항체 복합체의 형성을 가능하게 하고 적절한 조건을 알고 있다. 항체-항원 복합체의 존재 또는 양은 당해 분야에 공지된 방법론에 의해 결정될 수 있다.
실시예들은 환자 시료 내의 특정 폴리펩티드의 수준을 확인함으로써 환자 건강을 예측하고, 질환 진행을 모니터링하고, 및/또는 치료 효능을 평가/모니터링하는 방법을 추가로 포함한다. 일 측면에서, 상기 방법은 질환 진행 또는 치료 효능을 평가하기 위해 여러 시점에서 수행될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 진단시에, 그리고 치료 후 특정 시점에서 수행될 수 있으며, 여기서 특정 치료법은 질환 진행의 감소 또는 완화를 초래해야 한다.
본원에 설명된 방법은 또한 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드의 양(amount) 또는 정량(quantity)을 나타낼 수 있다. 특정 실시예에서, 특정 폴리펩티드의 양 또는 정량은 질환 병기 (즉, 1-4 기), 질환 진행의 지표 및/또는 예후 표시자를 제공한다. 효소 접합체와 같은 많은 지시자 시약으로 인해, 존재하는 폴리펩티드의 양은 생성된 신호에 비례한다. 시험 시료의 종류에 따라, 적당한 완충액 시약으로 희석하거나, 농축하거나, 어떠한 조작 없이도 고체 상과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 이전에 희석된 혈청 또는 혈장 시료, 또는 소변과 같은 농축 표본을 사용하여, 존재하는 폴리펩티드의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있다.
본원에 설명된 폴리펩티드 및 검정은 신장 질환의 존재를 검출하기 위해 다른 폴리펩티드 또는 검정법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 및 검정은 크레아티닌 또는 일반적인 단백질 수준의 검출 또는 측정에 적합한 시약과 조합될 수 있다.
일 실시예는 상부 요로 감염을 하부 요로 감염과 구별하는 방법을 또한 제공한다. 상부 요로 감염은 신장의 감염이다 (신우 신염). 하부 요로 감염은 방광 감염이다 (방광염). 이러한 상태들은 구별하기가 어려울 수 있다. 치료법이 다를 수 있기 때문에 의료 제공자가 상부 요로 감염과 하부 요로 감염의 차이를 알리는 것이 좋다. 당해 분야에서 요구되는 방법은 이들 감염을 구별하기 위해 필요하다.
상기 방법은 서열번호 1-27에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 상기 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 것을 포함한다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하며, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 대상에서의 상부 요로 감염의 표시이다.
일 실시예는 급성 신장 손상을 하부 요로 감염과 구별하는 방법을 제공한다. 이러한 상태들은 구별하기가 어려울 수 있다. 치료법이 다를 수 있기 때문에 의료 제공자가 급성 신장 손상과 하부 요로 감염의 차이를 알리는 것이 좋다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1-27로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정된다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하며, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 대상에서의 급성 신장 손상의 표시이다.
일 실시예는 대상 내의 치주염을 진단하는 방법을 제공한다. 치주 질환에는 치은염 (잇몸의 염증)과 치주염이 포함된다. 치주염은 치조골의 부착 손실과 파괴를 초래하는 치주 조직의 질환이다. 치주 질환의 임상 진단은 질환을 표시하는 치주 조직의 다양한 징후와 증상을 인식함으로써 이루어진다. 징후와 증상의 출현은 대개 질환이 시작된 지 오랜 시간 후이고 지지 뼈와 조직에 상당한 손상이 발생한 후이다. 또한, 치주 질환은 종종 수의과 환자에서 전신 마취없이 적절히 평가되거나 치료될 수 없다. 치주 질환의 조기 발견 방법은 당해 분야에 필요하다. 상기 방법은 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 1-27에 특이적인 1개 이상의 항체를 사용하여 결정한다. 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교되고, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 대상 내의 치주 질환의 표시이다.
치료 방법 .
특정 실시예는 대상에서 질환 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 번호 1-13에 특이적인 1개 이상의 항체를 사용하여 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하기 위한 분석 결과를 제공하는 시험을 요구하는 단계를 포함한다. 시료가 질환 상태에 대해 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교할 때 증가된 양의 시스타틴 B 폴리펩티드를 함유하는 경우, 질환 상태에 대해 대상에게 치료가 투여된다.
질병 상태에는 AKI, 치주 질환, 상부 요로 감염 및 신장 질환이 포함된다. 일 실시예에서, 질환 상태는 암 또는 신장 암이 아니다.
CKD, AKI 및 신장 질환에 대한 치료에는 예를 들어, 폐쇄성 네프론/요관결석 수술, 신장 종양용 화학요법, 식이 관리, 장내 인산염 결합제, 항단백뇨 치료제 (예, 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACEI), 오메가-3 지방산), 항고혈압제 (예, ACEI, 칼슘 채널 길항제 (CCA)), 탈수 교정용 수액 요법, 산독증 관리, 이뇨제 투여, 투석, 전해질 이상 교정, 항구토제 및 제산제, 재조합 에리트로포이에틴을 포함한다. 상부 요로 감염은 항생제로 치료할 수 있다. 치주 질환은 철저한 세척, 스케일링 및 치근 활택, 잇몸 이식 수술, 레이저 치료, 재생 절차 (치주낭 내 멤브레인 (필터), 골 이식 또는 조직-자극 단백질 사용), 치과 임플란트, 치주낭 감소 절차 (잇몸 조직을 폴딩시키고 조직을 다시 제 자리에 고정하기 전에 질병-유발 박테리아를 제거함)로 치료할 수 있다.
대안적인 실시예에서, 본원에 설명된 방법은 질환 진행의 완화를 위한 조성물 또는 치료 요법 (조성물 또는 식이 여부)의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 설명된 방법은 서열번호 1-27을 포함하는 폴리펩티드의 환자 수준에 대한 조성물 또는 치료 요법 활성을 평가하는 데 사용될 수 있다.
키트
일 실시예는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시예에서, 키트는 서열번호 1-27을 포함하는 하나 또는 다수의 폴리펩티드에 특이적인 하나 또는 복수의 항체를 포함한다. 임의로 키트의 특정 실시예에 포함되는 것은 사용 지침, 그리고 예를 들어 샌드위치 검정에 유용한 이차 항체일 수 있다. 이 항체를 표지하기 위한 시약 뿐만 아니라 구별 가능하게 표지된 항체도 키트에 존재할 수 있다.
추가의 실시예에서, 키트는 각각 서열번호 1-27을 포함하는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 또는 복수의 항체를 포함한다. 특정 실시예에서, 항체는 고체 지지체 또는 기질 상에 제공되는데, 칩, 마이크로어레이, 비드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
키트 (예, 제조 물품)는 환자 시료에서 본원에 설명된 폴리펩티드, 또는 그의 단백질 단편을 검출하기 위한 것일 수 있다. 키트는 1개 이상의 항체 및 본원에 설명된 전장 단백질 또는 단백질 단편에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 조성물을 포함한다. 키트 또는 제조 물품은 또한 시료 내의 폴리펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합을 결정하기 위한 1개 이상의 항체 또는 항체 단편 및 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 1개 이상의 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 디바이스 및 예를 들어, 포유동물에서 신장 질환의 확인을 위한 1개 이상의 폴리펩티드 또는 항체의 사용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트의 1개 이상의 폴리펩티드 또는 항체가 신장 기능장애의 확인을 위해 사용될 수 있음을 나타내는 표지를 포함하는 포장재를 포함할 수 있다. 당해 분야 숙련자에게 공지된 버퍼, 컨트롤 등과 같은 다른 구성 요소가 이러한 테스트 키트에 포함될 수 있다. 본원에 설명된 폴리펩티드, 항체, 검정 및 키트는 예를 들어, 환자의 신장 질환의 개별적인 경우들의 진단에 유용하다.
이 키트는 신장 질환, 특히 개과, 고양이과 및 인간 신장 질환의 치료를 진단, 예측 또는 모니터링하는 데에 유용하다.
여기에 예시적으로 설명된 실시예들은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들이 없는 경우에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 경우에서, "~를 포함하는", "필수적으로 ~로 이루어지는" 및 "~로 이루어지는" 같은 임의의 용어들은 통상의 의미를 보유하면서 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되는 것이며 제한을 위한 것이 아니며, 용어 및 표현의 사용에 있어 도시되고 설명된 특징들 및 그 부분들의 임의의 등가물을 배제하는 의도는 없지만, 청구된 실시예들의 범위 내에서 다양한 변경이 가능하다는 것을 인식해야 한다. 그러므로, 비록 본 명세서가 실시예들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념들에 대한 선택적인 특징들, 수정 및 변형이 당해 분야 숙련자에 의해 취해질 수 있으며, 그러한 수정 및 변형은 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 이들 실시예의 범위 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해해야 한다.
상술한 특징들을 포함하는 방법의 실시예는 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도되고 있다.
예
다음의 예들은 본 발명의 특정 실시예들, 및 그의 다양한 용도를 예시한다. 그것들은 설명의 목적으로만 제시된 것이며, 제한하는 것으로 받아들여서는 안된다.
예 1: 개과 Cys B의 단백질 서열
이전에는 개과 CysB가 서열번호 1에 나타낸 바와 같이 77 aa의 단백질 서열을 갖는 것으로 여겨졌다.
QVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTPYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF (서열번호 1)
그러나, 이러한 믿음은 정확하지 않다. MDCK 세포주를 성장시켜 합류되게 하고 부착 세포를 수집하고 세제를 함유하는 생리학적 완충액으로 용해시켰다. 용해 후, 세포를 10000 rpm으로 30 분 동안 회전시켜 세포 찌꺼기를 펠릿화하였다. 상층액은 소변 특이적 개과 시스타틴 B 소스로 사용하였다. 상층액을 사용하여 개과의 Cys B의 누락된 21 aa N-말단을 트립신 소화 및 LC-MS 동정을 사용하여 서열분석하였다.
MMCGAPSASQPATADTQAIAD (서열번호 2)
따라서, 개과 Cys B (FL-Cys B)의 완전한 아미노산 서열을 다음과 같이 결정했다:
MMCGAPSASQPATADTQAIADQVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTNYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF (서열번호 3)
예 2: 개과 시스타틴 B에 대한 항체
A. 재조합 단백질에 대응하여 키운 항체
면역원으로서 서열번호 1 및 서열번호 3의 재조합 단백질을 사용하여 토끼에서의 표준 방법론에 따라 다중클론 항체를 생성하였다. 따라서, 키워진 각각의 항체는 ELISA 검정에서 각각의 재조합 면역원에 특이적으로 결합했다.
면역원으로서 서열번호 3을 갖는 재조합 단백질을 사용하고, CPG를 보강제로 사용하여 마우스에서의 표준 방법론에 따라 단일클론 항체를 키웠다. 생성된 7개의 단일클론 항체는 ELISA 검정에서 각각의 재조합 면역원에 특이적으로 결합했다. HRP-염소 항-마우스 IgG H&L 사슬 이차 항체를 사용하여 단일클론 결합을 검출하였다. 플레이트에 결합된 시험된 모든 클론을 5 ug/ml의 재조합 FL 시스타틴 B (서열번호 3)로 코팅하였다. 표 4는 3개의 클론에 대한 예시적인 결합 데이터를 보여준다.
rFL-Cys B에 대한 단일클론 항체의 스크리닝. 3개의 클론으로부터의 대표적인 연속 희석 데이터
Cys B 단일클론 @ 10 ug/ml
FL-Cys B (ug/ml) 9A3 5E1 3H4
10 2.79 2.77 2.74
1 2.38 2.32 2.36
0.5 1.94 1.87 1.79
0.25 1.54 1.46 1.43
0.125 1.12 1.04 0.97
0.0625 0.69 0.62 0.64
0.03125 0.44 0.42 0.43
0 0.11 0.11 0.13
B: 합성 펩티드에 대응하여 키운 항체
개과 시스타틴 B로부터 유래된 하기 펩티드들을 KLH에 접합시켰다. 상기 접합체를 토끼의 항체 생성을 위한 면역원으로 사용하였다.
시스타틴 B C 말단 “펩티드 9” QTNKAKHDELAYF (서열번호 4)
시스타틴 B N-말단 “펩티드 3-20” CGAPSASQPATADTQAIA (서열번호 5)
시스타틴 B N-말단 “펩티드 3-10” CGAPSASQ (서열번호 6)
시스타틴 B N-말단 “펩티드 18-25” CAIADQVKA (서열번호 7)
시스타틴 B “펩티드 2” FQSLPHENKPLALSS (서열번호 8)
시스타틴 B “펩티드 1” SQVVAGTPYFIKVQVDDD (서열번호 9)
또한 면역원으로서 펩티드 서열번호 2 (N-말단) 및 서열번호 5 (펩티드 3-20)를 사용하고, 프로인트 보강제를 사용하여 마우스에서의 표준 방법론에 따라 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 생성시켰다. 따라서, 키워진 각각의 항체는 ELISA 검정에서 각각의 재조합 면역원에 특이적으로 결합했다.
따라서, 키워진 각각의 항체는 각각의 펩티드 면역원에 특이적으로 결합했다. 예를 들어, 아래 표 5는 각각의 면역원에 대한 펩티드 1, 2 및 9에 대한 토끼 항-펩티드 다중클론 항체의 전형적인 결합 곡선을 보여준다. 3가지 다중클론 항체 전부 그들의 표적에 높은 친화도로 결합하였으며 시스타틴 B ELISA에서 샌드위치를 형성하는데 사용될 수있다.
각각의 면역원에 대한 토끼 항-시스타틴 B 펩티드의 결합
Ab
역가		 펩티드
1		 펩티드
2		 펩티드
9
10 2.55 4.00 4.00
1 1.00 3.79 4.00
0.5 0.31 2.15 3.95
0.25 0.08 0.50 2.41
0.125 0.05 0.11 0.57
0.0625 0.04 0.06 0.12
0 0.04 0.04 0.05
또한, 항-펩티드 9 항체 및 항-펩티드 1 항체는 ELISA 검정에서 재조합 FL-Cys B (서열번호 3) 및 자극된 MDCK 세포의 용해물 내의 본래의 세포내 단백질에 특이적으로 결합했다. 항-펩티드 9 항체는 경쟁적 ELISA 검정에서 펩티드 KHDELAYF (서열번호 10)에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.
서열번호 11, 12 및 13은 표준 방법론에 따라 토끼를 면역화하는 데 사용되었다. 각 항체는 ELISA 검정에서 각각의 면역원에 특이적으로 결합했다.
예 3: 개과 시스타틴 B의 검출을 위한 면역검정
시스타틴 B ELISA를 다음과 같이 진행시켰다.
고체 상 및 포획 항체:
96 웰 4BX 미세역가 플레이트를 밤새 4℃에서 10 ug/ml 친화도 정제된 토끼 항-펩티드 9로 코팅시킨다. 플레이트를 0.05% TWEEN® (폴리소르베이트) 20를 함유하는 1X PBS, pH 7.4로 3회 세척한다. 그런 다음 플레이트를 1% BSA를 함유하는 1xPBS, pH 7.4로 2시간 동안 차단시킨다. 세척 후, 상기와 같이, 플레이트를 진공 하에 37℃에서 4시간 동안 건조시킨다. 그 후 플레이트를 4℃에서 건조 보관한다.
검출 항체의 준비:
전장 재조합 시스타틴 B (rFL-Cys B) (서열번호 3)로 면역화된 마우스로부터 7개의 단일클론 항체를 생성하였다. 1개의 클론 (3H4)을 단백질 G로 정제된, rFL Cys B에 대한 결합 성능에 기초하여 선택하고, 1.0mg의 정제 항체를 SMCC 방법을 사용하여 서양고추냉이 과산화효소 (HRP)로 표지하고 탈염시켜 과량의 HRP를 제거하였다. 표지된 항체를 적정하고 0.25-2.0 ug/ml를 ELISA 검정에 사용하였다.
시스타틴 B 샌드위치 ELISA 프로토콜: 혈청 및 소변
시스타틴 B는 세포내 단백질이며 일반적으로 큰 농도로 자유롭게 순환하지 않는다. 이것은 스트레스를 받은 개과의 신장 세포로부터 수집한 상등액에서 단백질이 발견되지 않았다는 사실에 의해 추가 확인되었다. 그러나 시스타틴 B는 파열된 개과의 신장 세포로부터 정제되었다. 따라서 혈청이나 소변에서 검출되는 시스타틴 B는 세포 파열과 사멸로부터 비롯된다. 활성 신장 손상에서, 근위 세뇨관에서의 상피 세포의 아폽토시스와 괴사가 혈청과 소변 시스타틴 B 증가를 초래하기 쉽다 (도 1).
시스타틴 B는 반려 동물에서 신장 질환과 관련이 없다. 단일클론 항체를 상기 설명된 바와 같이 재조합 시스타틴 B에 대해 키우고 시스타틴 C 단백질의 존재 하에 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 그의 특이성을 확인하였다 (도 2). 이들 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA도 진행시켰다.
샌드위치 ELISA의 경우, 표준은 rFL-Cys B 또는 MDCK 세포 펠렛으로부터의 세제 용해물이었다. 두 표준 준비물 모두 LCMS 방법으로 정량하였다. 소변 시료를 적어도 0.1%Sarkosyl을 함유하는, 완충액 A (0.1M PO4:, pH 7.4)로 적어도 1:10으로 희석시켰다. 혈청 시료를 완충액 A에서 적어도 1:100으로 희석시키고 상기와 같이 100 ul를 웰에 두 번씩 첨가하였다. 100 ul를 다중클론 항체 포획 웰에 두 번씩 첨가하고 실온에서 흔들면서, 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 그 후 플레이트를 PETCHEK® 세척액 (IDEXX Laboratories, Inc., 미국 메인주)으로 6회 세척하고 100 ul의 HRP 단일클론 검출 항체 0.25-2 ug/ml를 첨가하였다. 검출 항체를 30분간 인큐베이팅하고 나서, 6회 세척하고, 100 ul의 기질 TMB를 웰에 첨가하였다. 색상은 5분 동안 전개하고, 이어서 100 ul의 정지 용액 (1N HCL)을 첨가하였다. 플레이트를 VMAX® 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 미지의 물질을 정량화하기 위해 4PL 파라미터 핏을 시그마(Sigma) 플롯에 사용했다.
표준 곡선은 본래의 개과 시스타틴 B (MDCK 용해물)를 사용하여, 상술한 Cys B ELISA 검정으로 얻어졌다 (도 3).
환자 시료 내의 개과 시스타틴 B 검출
시스타틴 B 수준은 상술한 시스타틴 B ELISA 검정을 사용하여, 개 소변에서 결정되었으며 표 6에 나타나 있다.
신장 질환이 있는 개과에서의 시스타틴 B 수준.
시료 상태 시스타틴 B (ng/ml)
1 건강함 356
2 건강함 382
3 건강함 292
4 AKI 6022
5 AKI 7920
6 AKI 9559
7 CKD 453
8 CKD 1595
9 CKD 3372
표 6에서 알 수 있듯이 건강한 개는 급성 (활성) 신장 손상 (AKI) 및 만성 신장 질환 (CKD)과 비교했을 때 소변에서 시스타틴 B의 수준이 낮았다. AKI 시료는 CKD 시료보다 높은 시스타틴 B 수준을 나타냈다.
시스타틴 B는 개과의 젠타마이신 모델로부터 혈청과 소변에서 ELISA를 사용하여 측정되었으며 (도 4) 염증성 또는 허혈성 유도 활성 신장 손상으로 클리닉에 출현한 개 소변으로 측정했다 (도 5). 모델 시스템에서 개들은 혈청 크레아티닌이 1.5mg/dL에 도달할 때까지 8시간마다 10mg/kg 젠타마이신을 투여받았다. 이 개에서 그 지점은 8일째에 도달했으며; 반면 혈청 시스타틴 B는 1일에 기준선 위로 증가했다. 이러한 예비 결과는 시스타틴 B가 활성 신장 손상에 대한 크레아티닌보다 초기 마커임을 시사한다. 환자 시료에서 더 건강한 환자와 활성 신장 손상으로 진단된 환자 간에 명확한 분리가 있다.
예 4: 구강 면봉에 의한 시스타틴 B 검출
면봉을 사용하여 치과 검사를 받는 개과의 잇몸을 샘플링했다. 개는 심각한 치아 부식 뿐만 아니라 치은염, 잇몸 질환을 가진 것으로 나타났다. 면봉을 플라스틱 시험관에 넣고 사용할 때까지 4℃에서 보관했다. 면봉을 30분 동안 실온으로 평형시킨 다음, 세제를 함유하는 시스타틴 B 검정 완충액 0.5ml에 30분 동안 두었다. 면봉을 제거하고 상술한 바와 같이 시스타틴 B 검정에 사용하였다. 시료가 없는 대조군 면봉을 사용하여 백그라운드 신호를 판별했다. 대조군 면봉은 0.04의 평균 OD를 갖는 검출 한계 (LOD) 아래이었지만, 광범위한 치과 절차를 받고 있는 개과에서 면봉의 OD는 1.04이었다. 그 결과 신호 대 잡음 S/N 비는 26이 된다. 아래 표 7을 참조한다:
Figure 112021113921813-pat00002
치주 질환을 가진 2마리의 개 치아를 면봉으로 닦고 시스타틴 B ELISA 완충액에서 시스타틴 B를 추출하여 시스타틴 B 검정에서 시료로 사용했다. 1000 ng/ml 재조합 전장 개과 시스타틴 B 단백질을 첨가한 표준 물질을 양성 대조군으로 전개시켰다. 재조합 전장 시스타틴 B 단백질 양성 대조군의 경우 신호 (O.D. @ 450 nM)는 0.322, 개과 1의 경우 1.8485, 개과 2의 경우 1.444였다. 치주 질환을 가진 2마리의 개과의 경우의 값들은 1000 ng/ml rCanine FL-Cys B 표준보다 5배 넘게 많았다. 따라서, Cys B는 개과와 같은 포유동물에서 치주 질환의 마커이다.
예 5: 변형된 ELISA
96 웰 4BX 미세역가 플레이트를 밤새 4℃에서 5 ug/ml 친화도 정제된 토끼 항-펩티드 9로 코팅시켰다. 플레이트를 0.05% TWEEN® (폴리소르베이트) 20를 함유하는 1X PBS, pH 7.4로 3회 세척한다. 그런 다음 플레이트를 1% BSA를 함유하는 1xPBS, pH 7.4로 2시간 동안 차단시킨다. 세척 후, 상기와 같이, 플레이트를 진공 하에 37℃에서 4시간 동안 건조시킨다. 그 후 플레이트를 4℃에서 건조 보관한다.
샌드위치 ELISA의 경우, 표준은 rFL-Cys B 또는 MDCK 세포 펠렛으로부터의 세제 용해물이었다. 두 표준 준비물 모두 LCMS 방법으로 정량하였다. 소변 시료를 완충액 A (적어도 1.0 % N-도데카노일-N-메틸글리신 나트륨 염 (Sarkosyl, Sigma)을 함유하는, 0.1M 인산염, pH 7.2)로 1:20으로 희석시켰다. 혈청 시료를 완충액 A에서 적어도 1:50으로 희석시키고 상기와 같이 100 ul를 웰에 두 번씩 첨가하였다. 100 ul를 다중클론 항체 포획 웰에 두 번씩 첨가하고 실온에서 흔들면서, 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 그 후 플레이트를 PETCHEK® 세척액 (IDEXX Laboratories, Inc., 미국 메인주 웨스트브룩)으로 6회 세척하고 100 ul의 HRP-표지 단일클론 검출 항체 0.25-2 ug/ml를 첨가하였다. 검출 항체를 30분간 흔들면서 인큐베이팅하고 나서, 6회 세척하고, 100 ul의 기질 TMB를 웰에 첨가하였다. 색상은 5분 동안 전개되었으며, 이어서 100 ul의 정지 용액 (1N HCL)을 첨가하였다. 플레이트를 VMAX® 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 미지의 물질을 정량화하기 위해 4PL 파라미터 핏을 시그마(Sigma) 플롯에 사용했다.
예 6: 인간 Cys-B의 검출
이 예는 항-개과 Cys B 항체를 사용하여 인간 CysB를 검출하기 위한 ELISA의 구성을 설명한다. 재조합 인간 시스타틴 B (rH FL Cys B) 단백질 (서열번호 14)은 미국의 Genscript로부터 얻었다.
>sp|P04080|CYTB_HUMAN Cystatin-B OS=Homo sapiens GN=CSTB PE=1 SV=2
MMCGAPSATQPATAETQHIADQVRSQLEEKENKKFPVFKAVSFKSQVVAGTNYFIKVHVG
DEDFVHLRVFQSLPHENKPLTLSNYQTNKAKHDELTYF [서열번호 14]
rH FL Cys B 단백질과 개과 시스타틴 B에 대해 키운 항체와의 교차 반응성을 샌드위치 ELISA로 평가하였다. 간단히 말해서, 재조합 전장 개과 시스타틴 B 서열 (rC FL 시스타틴 B)에 대해 키운 마우스 단일클론 항체를 포획 시약으로 사용하고 ELISA에서 다수의 재조합 FL Cys B 항원을 결합시키는 능력을 스크리닝하였다. 스크리닝된 검출 시약은 토끼 다중클론 N-말단 항-개과 시스타틴 B 항체와 서양고추냉이 과산화효소 항-종 IgG (H&L)이었다. ELISA에서 용량 의존 곡선을 제공하는 일련의 쌍을 이룬 시약이 발견되었다. 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 개과 C-말단 "펩티드 9" (QTNKAKHDELAYF (서열번호 4))에 대해 마우스에 생성된 3가지 단일클론 항체 (IF10, 2B5, 9A10)가 샌드위치 ELISA를 형성하기 위해 항-개과 N-말단 시스타틴 B 다중클론 항체 327 (CAIADQVKA (서열번호 7)에 대해 토끼에서 키워짐), 328 (CGAPSASQPATADTQAIA (서열번호 5)에 대해 토끼에서 키워짐) 또는 329 (CGAPSASQ (서열번호 6)에 대해 토끼에서 키워짐)와 쌍을 이루었다. 또한, 이들 쌍은 래트 및 마우스 rFI 시스타틴 B 단백질에 결합했다.
Figure 112021113921813-pat00003
N-말단 토끼 다중클론 항체 327을 고체 상 포획 물질로 사용하여, 개과 시스타틴 B C-말단 "펩티드 9" QTNKAKHDELAYF (서열번호 4)에 대해 생성된 단일클론 마우스 항체를 rH FL 시스타틴 B와의 결합에 대해 분석하였다. 표 9 참조. 하기 표 10에 나타낸 바와 같이, 하나의 C-말단 단일클론 항체 (9A10)는 샌드위치를 형성하였지만, 다른 C-말단 단일클론 항체 (2B5)는 그렇지 않았다. 이 단일클론 항체들의 특이성은 매핑되었고 9A10 단일클론은 인간과 개과 모두의 시스타틴 B의 상동성 서열을 인식했다. 고체 상-결합 다중클론 항체 327과 짝을 이룬 rFL 개과 시스타틴 B에 대해 키운 3H4 단일클론 항체는 인간과 개과 rFL 시스타틴 B 모두에 대해 결합을 나타냈다 (표 11).
시스타틴 B C-말단 서열
개과 QTNKAKHDELAYF 서열번호 4
인간 QTNKAKHDELTYF 서열번호 15
시스타틴 B 토끼 다중클론 및 마우스 단일클론 항체의 에피토프 맵핑.


펩티드 서열		 항-펩티드 항체
다중클론 단일클론
항-Pep 9 2B5 9A10
QTNKAKHDELAYF
서열번호 4		 3.4 2.5 2.8
QTNKAKHDELAY
서열번호 16		 3.4 0.2 2.8
QTNKAKHDELA
서열번호 17		 3.1 0.2 2.4
QTNKAKHDEL
서열번호 18		 2.3 0.1 0.1
QTNKAKHDE
서열번호 19		 2.3 0.2 0.1
에피토프에 필수적인 잔기 YF AYF
rFL-시스타틴 B
포획 접합체 인간 개과
327 3H4 0.911 2.102
9A10 0.829 1.584
2B5 0.065 0.065
327 0.077 1.211
개과 Cys B에 특이적인 항체를 인간 Cys B를 검출하는데 사용할 수 있다. 특히, AYF, LAYF (서열번호 20), ELAYF (서열번호 21), DELAYF (서열번호 22) HDELAYF (서열번호 23), KHDELAYF (서열번호 10), AKHDELAYF (서열번호 24), KAKHDELAYF (서열번호 25), NKAKHDELAYF (서열번호 26), TNKAKHDELAYF (서열번호 27) 및 QTNKAKHDELAYF (서열번호 4) 또는 그의 일부를 인간 및 개과 Cys B를 검출하는데 사용할 수 있다. 예 7: 개과 및 고양이과 소변에서 기준 범위의 결정
개과 및 고양이과에서 얻은 소변 시료를 지역 수의과 병원에서 2년에 걸쳐서 수집했다. 소변을 분취하고 사용 시까지 동결시켰다. 해동시킨 소변 시료를 예 3에 설명된 ELISA 검정을 사용하여 시스타틴 B에 대해 측정하였다. 수의과 시험 당시 신장 장애, 예컨대 CKD를 제시하는 혈청 크레아티닌 또는 SDMA 수준, 요로 결석, 또는 요로 감염의 역사 또는 출현의 징후가 없는 건강한 동물로부터 기준 범위를 정립시켰다. 따라서, 총 280 마리의 건강한 개과 및 42 마리의 건강한 고양이과를 사용하였고 각각의 종에 대해 평균 + 3 표준 편차 (Std Dev)를 사용하여 257 ng/ml의 기준 범위를 결정했다. 도 6 참조. 따라서, 정상적인 건강한 범위는 약 0 ng/ml에서 약 257 ng/ml (예, 약 0, 5, 10, 20, 50, 75, 100에서 약 200, 210, 225, 250, 또는 257 ng/ml)이다. 257 ng/ml 넘는 값 (예, 약 257, 260, 270, 280, 290, 300 ng/ml 이상)은 신장 질환을 나타낸다.
예 8: 개과 AKI 개체군 중의 시스타틴 B
임상으로 확인된 AKI가 있는 개 및 건강한 개에서 얻은 25 개의 매칭된 소변 및 혈청 시료를 시스타틴 B ELISA (예 5)에서 전개시켰다. AKI 환자의 병인에는 예를 들어 신독성 약물, 뱀에 물린 자국, 일사병, 에틸렌 글리콜 노출 및 전염병이 포함되었다. 도 7a-b 및 표 12-13에 나타낸 바와 같이, 건강한 개 및 CKD 환자와 비교하여 AKI로 진단된 환자에서 소변 및 혈청 시스타틴 B 수준이 유의하게 증가하였다.
Figure 112021113921813-pat00004
Figure 112021113921813-pat00005
예 9: 감염성 질환에서의 시스타틴 B
동물의 비뇨기계의 대부분의 감염성 질환은 호기성 세균 감염이다. 일반적인 유기체로는 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus), 장구균(Enterococcus) 및 연쇄상구균(Streptococcus)이 있다. 감염을 일으키는 덜 흔한 유기체로는 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas)가 있다. 미코플라즈마(Mycoplasma)는 요로 감염의 드문 원인이며 보통 박테리아와의 동시감염으로 발견된다. 렙토스피라증(Leptospirosis)은 신장과 다른 많은 기관을 감염시키는 섬유성 렙토스피라(Leptospira) 세균에 의해 야기된 전세계적인 동물매개 질환이다. 리케챠병(Rickettsial) (rickettsioses) 및 관련 질환 (아나플라즈마증(anaplasmosis), 에를리히아증(ehrlichiosis), Q 열, 쓰쓰가무시병(scrub typhus)은 그람 음성균, 절대 세포내 구간균(coccobacilli) 군에 의해 유발된다. 진드기 질환인, 바베시아(Babesia)는 또한 신장 질환과 관련이 있어 왔다.
ELISA, PCR 및 현미경 응집 테스트 (MAT) 역가 > 1:800 (IDEXX Laboratories, inc.)에 의해 렙토스피라 종(Leptospira sp.)에 대해 양성으로 확인된 20 마리의 개과 환자의 혈청 시료를 시스타틴 B ELISA에서 수행하였다. 확인된 건강한 개과 혈청 시료들도 혈청 내 평균 시스타틴 B 수준을 결정하기 위해 실행되었다. 아래 표 14에서 알 수 있듯이, 9 개의 렙토스피라증 양성 시료 (45%)는 건강한 개과 (149.1 ng/ml)의 혈청의 상대 컷오프 (평균 +3SD) 값보다 높았다 (도 10). 이 데이터는 시험된 렙토스피라증 환자의 45%가 신장 손상을 가졌음을 나타낸다. 따라서, 시스타틴 B의 혈청 수치가 상승하면 렙토스피라에 감염된 환자의 신장 손상이 있음을 나타낸다.
렙토스피라 종(Leptospira sp.)에 대한 시스타틴 B ELISA 결과. 양성 시료
시료 ID 시스타틴 B (ng/ml)
1304 99
2648 375
4282 241
4318 171
4558 411
4567 82
4628 133
4650 145
4873 767
4972 276
5242 65
5369 54
5529 292
5614 75
5646 65
5651 81
5659 203
5663 167
5664 111
5679 59
5694 141
예 10: 요로 감염에서의 시스타틴 B
각각 임상으로 확인된 요로 감염 (UTI)을 갖는 개 10 마리 및 건강한 코호트 10 마리의 소변 시료를 시스타틴 B 검정에서 진행시켰다. UTI는 양성 배양 및 임상 검사로 확인하였다. UTI의 간섭은 이전에 알려진 AKI 마커의 특이성에 중요한 문제이다. 도 8은 시스타틴 B 수치가 건강한 환자와 하부 요로 감염 환자 간에 유의한 차이가 없음을 보여주었다. 따라서, 시스타틴 B 마커를 AKI와 UTI를 구별하는 데 사용할 수 있다.
예 11: 고양이과 신장 질환에서의 시스타틴 B
신장 질환으로 진단된 4 마리의 고양이과의 소변 시료와 3 마리의 건강한 대조군을 지역 수의과 클리닉에서 얻어 시스타틴 B 검정에서 진행시켰다. 신장 질환을 가진 4 마리 고양이 각각에게서 소변 시스타틴 B 농도는 기준 간격인 257 ng/ml를 초과했다. 3 마리의 건강한 대조군 각각에게서 소변 시스타틴 B 농도는 기준 간격 이내였다. 표 15 참조. 시스타틴 B는 고양이의 신장 질환에 대한 마커이다.
소변 시스타틴 B
ng/mL 		혈청 크레아티닌
mg/dL 		SDMA (ug/dL), 또는
표시된 다른 시험 		진단
3062 3.0 (03/02/2016)
2.9 (04/01/2016)
2.6 (08/27/2016)		 N/D (3/2/2016)
16 (4/1/2016)
26 (8/27/2016)		 신장 질환
1513 2.0 (02/13/2013)
2.4 (03/20/2014)
3.1 (10/06/2015)		 뇨 단백질 30 mg/dL; 뇨 250 적혈구/uL 신장 질환
903 1.3 (7/17/2015)
3.6 (11/16/2015)
2.4 (11/23/2015)
2.0 (12/10/2015)
3.8 (02/01/2016)		 N/D 신장 질환
329 2.0 (02/13/2013)
2.4 (03/20/2014)
3.1 (10/06/2015)		 뇨 단백질 30 mg/dL; 뇨 250 적혈구/uL 신장 질환
73 N/D N/D 건강함
50 N/D N/D 건강함
48 N/D N/D 건강함
N/D = 측정 안됨 예 12: 양에서의 항-시스타틴 B 항체
2 마리의 양을 사용하여 서열번호 4에 대한 양 다중클론 항체를 생성시켰다. 펩티드를 KLH에 접합시키고 프로인트 완전 보강제로 유화시켰다. 표준 200 일 프로토콜을 사용했다. 양 혈청에서의 항체 반응을 토끼 혈청의 반응과 비교하였다. 양들이 면역화 프로토콜의 초기 단계에 있었음에도 불구하고 양들에서 비슷한 역가가 나타났다. 양에서 키운 항체를 Cys B 폴리펩티드의 검출에 사용할 수있다.
희석 토끼 양
100 2.832 2.804
1000 2.753 2.986
10000 1.56 0.797
100000 0.296 0.076
1000000 0.04 0.017
10000000 0.008 0.001
예 13: CKD 환자에서의 인간 소변 시스타틴 B 검출:소변은 4 기 CKD로 진단받은 사람의 환자에서 수집했다. 소변을 연속 희석시키고 시스타틴 B 뇨 ELISA에서 전개시켰다. 2 개의 항-시스타틴 B 단일클론 항체 (3H4 (예 2 및 3 참조) 및 9A10 (예 6 참조))를 비교하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 인간의 소변 시료는 개과 AKI 시료보다 높은 수준의 시스타틴 B를 생성하고, 개과의 음성 대조군보다 높은 수준을 나타냈다. 또한, 상이한 항-시스타틴 B 단일클론들은 아마도 결합을 위한 에피토프의 이용가능성으로 인해 상이한 반응을 나타냈다. 따라서, CKD를 포함한 신장 질환은 시스타틴 B에 특이적인 항체를 사용하여 인간에서 진단할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Yerramilli, Mahalakshmi Farace, Giosi Quinn, John J Yerramilli, Murthy V.S.N. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION AND DIAGNOSIS OF RENAL DISEASE AND PERIODONTAL DISEASE <130> 16-179-WO <150> 62/302,299 <151> 2016-03-02 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 1 Gln Val Lys Ala Gln Leu Glu Glu Arg Glu Asn Lys Lys Tyr Thr Thr 1 5 10 15 Phe Lys Ala Val Thr Phe Arg Ser Gln Val Val Ala Gly Thr Pro Tyr 20 25 30 Phe Ile Lys Val Gln Val Asp Asp Asp Glu Phe Val His Leu Arg Val 35 40 45 Phe Gln Ser Leu Pro His Glu Asn Lys Pro Leu Ala Leu Ser Ser Tyr 50 55 60 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 65 70 75 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Met Met Cys Gly Ala Pro Ser Ala Ser Gln Pro Ala Thr Ala Asp Thr 1 5 10 15 Gln Ala Ile Ala Asp 20 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> The X stands for any amino acid <400> 3 Met Met Cys Gly Ala Pro Ser Ala Ser Gln Pro Ala Thr Ala Asp Thr 1 5 10 15 Gln Ala Ile Ala Asp Gln Val Lys Ala Gln Leu Glu Glu Arg Glu Asn 20 25 30 Lys Lys Tyr Thr Thr Phe Lys Ala Val Thr Phe Arg Ser Gln Val Val 35 40 45 Ala Gly Thr Xaa Tyr Phe Ile Lys Val Gln Val Asp Asp Asp Glu Phe 50 55 60 Val His Leu Arg Val Phe Gln Ser Leu Pro His Glu Asn Lys Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Ser Ser Tyr Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala 85 90 95 Tyr Phe <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 4 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 5 Cys Gly Ala Pro Ser Ala Ser Gln Pro Ala Thr Ala Asp Thr Gln Ala 1 5 10 15 Ile Ala <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 6 Cys Gly Ala Pro Ser Ala Ser Gln 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 7 Cys Ala Ile Ala Asp Gln Val Lys Ala 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 8 Phe Gln Ser Leu Pro His Glu Asn Lys Pro Leu Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 9 Ser Gln Val Val Ala Gly Thr Pro Tyr Phe Ile Lys Val Gln Val Asp 1 5 10 15 Asp Asp <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 10 Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 11 Met Met Cys Gly Ala Pro Ser Ala Ser Gln Pro Ala Thr Ala Asp Thr 1 5 10 15 Gln Ala Ile Ala Asp Gln Val Lys Ala Gln Leu Glu Glu 20 25 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 12 Ala Ile Ala Asp Gln Val Lys Ala 1 5 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 13 Ser Gln Val Val Ala Gly Thr Asn Tyr Phe Ile Lys Val Gln Val Asp 1 5 10 15 Asp Asp <210> 14 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Met Cys Gly Ala Pro Ser Ala Thr Gln Pro Ala Thr Ala Glu Thr 1 5 10 15 Gln His Ile Ala Asp Gln Val Arg Ser Gln Leu Glu Glu Lys Glu Asn 20 25 30 Lys Lys Phe Pro Val Phe Lys Ala Val Ser Phe Lys Ser Gln Val Val 35 40 45 Ala Gly Thr Asn Tyr Phe Ile Lys Val His Val Gly Asp Glu Asp Phe 50 55 60 Val His Leu Arg Val Phe Gln Ser Leu Pro His Glu Asn Lys Pro Leu 65 70 75 80 Thr Leu Ser Asn Tyr Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Tyr Phe <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Thr Tyr Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 16 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 17 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 18 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 19 Gln Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu 1 5 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 20 Leu Ala Tyr Phe 1 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 21 Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 22 Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 23 His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 24 Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 25 Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 26 Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 27 Thr Asn Lys Ala Lys His Asp Glu Leu Ala Tyr Phe 1 5 10

Claims (25)

  1. (a) 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하고, 여기서 상기 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정되는, 단계; 그리고
    (b) 상기 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하고, 여기서 상기 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 상기 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 상기 대상 내의 치주 질환의 표시하는 것인, 단계에 의해 대상 내의 치주 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 상부 요로 감염과 하부 요로 감염을 구별하는 방법으로,
    (a) 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하고, 여기서 상기 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정되는, 단계; 그리고
    (b) 상기 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하고, 여기서 상기 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 상기 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 상기 대상 내의 상부 요로 감염의 표시인, 단계를 포함하는, 방법.
  3. 급성 신장 손상과 하부 요로 감염을 구별하는 방법으로,
    (a) 대상의 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 결정하고, 여기서 상기 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체를 사용하여 결정되는, 단계; 그리고
    (b) 상기 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하고, 여기서 상기 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 상기 시료 내의 시스타틴 B 폴리펩티드의 상승된 수준은 상기 대상 내의 급성 신장 손상의 표시인, 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 상부 요로 감염은 아나플라즈마 종(Anaplasma sp.), 에를리히아 종(Ehrlichia sp.), 렙토스피라 종(Leptospira sp.), 에스케리치아 종(Escherichia sp.) 또는 보렐리아 종(Borrelia sp.)에 의해 유발되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체의 복합체를 검출하여 결정되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 고체 지지체에 고정되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 1개 이상의 표지에 접합되는, 방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12의 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적인 1개 이상의 항체의 복합체를 표시제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 1개 이상의 항체는 서열번호 5, 6, 7 또는 11로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 대상은 비-인간 동물인, 방법.
  11. 제 2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 타액, 치태, 열구액, 치은 생검 또는 혀 면봉인, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 시스타틴 B 폴리펩티드 또는 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 면역 검정, 경쟁적 면역 검정, 샌드위치 면역 검정, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역 검정, 방사면역 검정 (RIA) 또는 웨스턴 블랏 검정에 의해 결정되거나 검출되는, 방법.
  14. 제2항에 있어서,
    상기 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체의 복합체를 검출하여 결정되는, 방법.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 시스타틴 B 폴리펩티드, 및 서열번호 2, 3, 5, 6, 7, 11 또는 12로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 항체의 복합체를 검출하여 결정되는, 방법.
  16. 제2항에 있어서,
    상기 항체는 고체 지지체에 고정되는, 방법.
  17. 제3항에 있어서,
    상기 항체는 고체 지지체에 고정되는, 방법.
  18. 제2항에 있어서,
    상기 항체는 1개 이상의 표지에 접합되는, 방법.
  19. 제3항에 있어서,
    상기 항체는 1개 이상의 표지에 접합되는, 방법.
  20. 제2항에 있어서,
    상기 1개 이상의 항체는 서열번호 5, 6, 7, 또는 11로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  21. 제3항에 있어서,
    상기 1개 이상의 항체는 서열번호 5, 6, 7, 또는 11로 이루어지는 1개 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  22. 제2항에 있어서,
    상기 대상은 비-인간 동물인, 방법.
  23. 제3항에 있어서,
    상기 대상은 비-인간 동물인, 방법.
  24. 제2항에 있어서,
    상기 시스타틴 B 폴리펩티드 또는 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 면역 검정, 경쟁적 면역 검정, 샌드위치 면역 검정, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역 검정, 방사면역 검정 (RIA) 또는 웨스턴 블랏 검정에 의해 결정되거나 검출되는, 방법.
  25. 제3항에 있어서,
    상기 시스타틴 B 폴리펩티드 또는 시스타틴 B 폴리펩티드의 양은 면역 검정, 경쟁적 면역 검정, 샌드위치 면역 검정, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 혼탁 면역 검정, 입자 강화 혼탁 면역 검정, 방사면역 검정 (RIA) 또는 웨스턴 블랏 검정에 의해 결정되거나 검출되는, 방법.

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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108700600B (zh) * 2016-03-02 2022-06-03 艾德克斯实验室公司 用于检测和诊断肾病和牙周病的方法和组合物
WO2019032746A1 (en) 2017-08-08 2019-02-14 Fresenius Medical Care Holdings, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING AND ESTIMATING THE PROGRESSION OF CHRONIC RENAL DISEASE
JP7207585B2 (ja) * 2017-09-01 2023-01-18 株式会社三洋物産 遊技機
CN110938130B (zh) * 2019-11-08 2021-07-09 上海交通大学 一种生物活性多肽rvfqplphenkpltl及其制备方法和应用
KR20230009394A (ko) 2020-04-17 2023-01-17 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드 형광 소광 면역검정
US11175293B1 (en) 2021-01-04 2021-11-16 University Of Utah Research Foundation Rapid assay for detection of SARS-CoV-2 antibodies
JP2021079146A (ja) * 2021-02-22 2021-05-27 株式会社三洋物産 遊技機
JP7315071B2 (ja) * 2021-03-03 2023-07-26 株式会社三洋物産 遊技機
AU2023213987A1 (en) * 2022-01-26 2024-09-05 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions for differentiating progressive chronic kidney disease from stable chronic kidney disease

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011153469A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Markers for renal disease

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5726010A (en) 1991-07-31 1998-03-10 Idexx Laboratories, Inc. Reversible flow chromatographic binding assay
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US20070015146A1 (en) 2001-05-22 2007-01-18 Gene Logic, Inc. Molecular nephrotoxicology modeling
NL1020962C2 (nl) 2002-06-28 2003-12-30 Tno Therapie en prognose/monitoring bij sepsis en septische shock.
CA2533803A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation
US20070087448A1 (en) 2004-02-16 2007-04-19 Nelsestuen Gary L Biological profiles and methods of use
DE602006018578D1 (de) 2005-01-28 2011-01-13 Childrens Medical Center Diagnose- und prognoseverfahren von blasenkrebs.
EP1846576A4 (en) * 2005-02-01 2009-01-07 Us Gov Health & Human Serv BIOMARKERS OF TISSUE STATUS
US8383357B2 (en) 2005-03-16 2013-02-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors
JP2009502112A (ja) 2005-07-28 2009-01-29 オンコセラピー・サイエンス株式会社 腎細胞癌を診断および処置するための方法
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
CN101120904B (zh) 2006-11-13 2011-06-29 李复生 癌症疾病治疗器
WO2008141285A2 (en) 2007-05-11 2008-11-20 The Institutes For Pharmaceutical Discovery, Llc Methods for early diagnosis of kidney disease
US20090075266A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Predictive Biosciences Corporation Multiple analyte diagnostic readout
JP2012504650A (ja) * 2008-10-02 2012-02-23 セルタクシス，インコーポレイテッド 免疫細胞の負の走化性の調節方法
US20110287964A1 (en) * 2008-11-17 2011-11-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans
CN102713632B (zh) 2009-12-23 2015-10-07 希尔氏宠物营养品公司 用于诊断和治疗犬肾脏病症的组合物和方法
KR101222437B1 (ko) * 2010-03-17 2013-01-15 경북대학교 산학협력단 바이오마커
CN101937000A (zh) * 2010-08-05 2011-01-05 北京倍爱康生物技术有限公司 一种人胱抑素c的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法
CN108700600B (zh) * 2016-03-02 2022-06-03 艾德克斯实验室公司 用于检测和诊断肾病和牙周病的方法和组合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011153469A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Markers for renal disease

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clin Cancer Res., 2008, Vol. 14, pp 1080-1089.
Journal of Periodontal Research, 2015, Vol. 50, pp 637-649.
Parasitol Res., 2015, Vol. 114, pp 3941-3957.

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