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KR102412078B1 - 다공성 이온 전하 결정체를 이용한 핵산 추출방법 - Google Patents

다공성 이온 전하 결정체를 이용한 핵산 추출방법 Download PDF

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KR102412078B1
KR102412078B1 KR1020210185773A KR20210185773A KR102412078B1 KR 102412078 B1 KR102412078 B1 KR 102412078B1 KR 1020210185773 A KR1020210185773 A KR 1020210185773A KR 20210185773 A KR20210185773 A KR 20210185773A KR 102412078 B1 KR102412078 B1 KR 102412078B1
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Abstract

본 발명은 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체 및 이를 이용한 핵산추출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 다공성 이온 전하 결정체는 음이온성 특성을 가짐으로써 음전하를 띄는 핵산을 전기적으로 분리시키고 양이온성 부산물을 결정체에 흡착시키며, 이와 동시에 용매인 물을 흡수할 수 있다. 즉, 다공성 이온 전하 결정체를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 담가두는 것만으로 핵산의 분리 및 농축이 자동으로 이루어지기 때문에 유해한 유기용매, 자석비드, 원심분리기와 같은 복잡한 장치를 사용하지 않고도 핵산을 간단하고 신속하게 분리하고 농축할 수 있는 핵산분리 방법을 제공한다.

Description

다공성 이온 전하 결정체를 이용한 핵산 추출방법 {A method for nucleic acid extraction process using porous ion charge particles}
본 발명은 다공성 이온 전하 결정체 및 이를 이용한 핵산 추출 방법에 관한 것이다.
현재 분자생물학 분야 기초연구, 질병을 진단, 치료, 또는 예방하기 위하여 세포, 박테리아, 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 기술이 핵산 증폭 반응 기술과 연계되어 널리 활용되고 있다. 또한, 이외에도 맞춤형 신약 개발, 법 의학, 환경 호르몬 검출 등 다양한 분야에서 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 기술이 요구되고 있는 실정이다.
종래 핵산 추출 기술의 일예로서는 세포를 포함하는 시료를 SDS나 프로테이나아제(proteinase) K로 처리하여 가용화한 후 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) 또는 페놀/클로로포름/아이소아밀알콜(phenol/chloroform/isoamylalcohol)을 사용하여 단백질을 변성, 분해하고 에탄올 침전으로 부산물을 제거하여 핵산을 정제하는 방법이 있었다. 그러나 페놀 추출법은 많은 처리 단계를 수행해야 하기 때문에 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 핵산 추출 효율이 연구자의 경험과 숙련도에 의해 크게 좌우되어 신뢰성이 크게 떨어지는 문제점이 있었다. 또한, 종래 핵산 추출방법의 경우, 세포 용해 단계에 필수적인 세포의 파쇄 과정에서 히스톤 단백질 등이 부산물로 남아 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 방해하는 억제제(inhibitor)로 작용한다는 문제가 있다.
최근에는 이러한 문제를 해소하기 위해 핵산과 특이적으로 결합하는 실리카나 유리섬유를 이용하는 키트가 사용되기도 한다. 상기 실리카나 유리섬유는 단백질, 세포 대사 물질들과 결합 비율이 낮으므로 상대적으로 높은 농도의 핵산을 얻을 수 있다. 이와 같은 방법은 페놀법과 비교했을 때 간편하다는 장점은 있지만, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 등의 효소 반응을 강하게 저해시키는 카오트로픽 시약이나 에탄올을 이용하기 때문에 이들 물질을 완전히 제거해야 하며, 이를 이유로 조작이 매우 번거롭고 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
최근 필터를 사용하여 핵산을 직접 정제하는 방법이 국제 공개특허 제2000/21973호에 개시되었는데, 이 방법은 시료를 필터에 통과시켜 세포를 필터에 흡착시킨 후 필터에 흡착된 세포를 용해시키고 필터로 여과시킨 후 필터에 흡착된 핵산을 세척 및 용출시키는 방법이다.
예를 들어, 대한민국 등록특허 10-0454869호에서는, 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출방법을 기재하고 있으며, 이와 같은 종래의 핵산 추출방법은, 1) 세포에 세포 용해 버퍼를 첨가하여 세포를 용해하는 단계; 2) 단계 1의 용해된 세포를 필터에 옮겨 핵산을 고정하는 단계; 3) 단계 2의 필터를 세척하는 단계; 및 4)필터로부터 핵산을 회수하는 단계로 구성되어 짧은 단계와 시간으로 재현성이 높게 핵산을 추출할 수 있는 장점이 있었다. 그러나 용해된 세포를 필터에 옮기거나 필터를 세척할 때 또는 필터에서 핵산을 회수할 때 각각 원심분리기의 사용이 필수적이어서 휴대성과 이동성이 떨어지고 현장에서의 핵산 추출과정을 복잡하게 하는 문제가 있다.
그밖에 자성 비드(Magnetic bead)를 이용한 핵산 추출방법, 주사기와 필터를 이용한 핵산 추출방법, Trizol을 이용한 핵산 추출방법 등도 있으나 자성 비드를 이용한 핵산 추출방법은 핵산을 튜브의 벽면에 고정하기 위해서 자석이 필요하고 용액을 제거하기 위해 펌프나 밸브(자동화기기) 또는 다수 개의 팁(tip)과 피펫(pipette)(수동)의 사용이 요구된다. 또한, 핵산 세척 및 용출 과정에서 핵산이 일부 유실되는 현상이 발생할 수 있다는 문제점이 있다. 주사기와 필터를 이용한 핵산 추출방법은 주사기를 이용하여 핵산이 옮기는 과정에서 일정 강도 이상의 힘을 줄 경우 필터가 파손되어 핵산의 추출을 어렵게 하는 문제가 있다. 또한, Trizol을 이용한 핵산 추출방법은 페놀이나 클로로포름 등 유해한 유기용매를 사용하는 문제가 있다.
이에 종래 핵산 추출방법의 문제점을 해소하고, 간편하고 효율적으로 고농도로 핵산을 분리해낼 수 있는 핵산 추출방법에 대한 개발이 요구되고 있다.
국제공개특허공보 WO2000/021973 한국등록특허공보 제10-045869호
본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 본 발명의 주된 목적은 피펫 및 팁의 사용을 최소로 하여 사용자 편리성이 개선되고 현장에서 신속하게 반응을 수행할 수 있는 핵산추출용 다공성 이온 전하 결정체 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 핵산의 전기적 특성을 이용할 수 있는 다공성 이온 전하 결정체를 이용함으로써 유해한 유기용매, 자성체, 또는 복잡한 기기나 장치를 사용하지 않아도 되어 휴대성과 이동성이 우수하고 현장에서의 사용이 편리한 핵산추출용 다공성 이온 전하 결정체 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 다공성 이온 전하 결정체를 이용하여 양이온성 부산물을 결정체에 흡착시키고 물을 흡수하여 순수한 핵산만을 분리하고 농축할 수 있는 핵산추출용 다공성 이온 전하 결정체 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.
이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명은 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체를 포함하는, 핵산 추출 튜브를 제공한다.
또한 본 발명은 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(Direct lysis buffer; DLB)과 핵산 추출 튜브에 투입하여 혼합하는 단계; 상기 혼합물에 다공성 이온 전하 결정체(Ion charge particle)를 투입하고 5분 내지 30분 동안 반응시키는 단계; 및 상기 반응을 완료한 이온 전하 결정체를 제거하고 핵산이 농축된 완충액을 얻는 단계를 포함하는, 핵산 추출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(Direct lysis buffer)과 핵산 추출 튜브에 투입하여 혼합하는 단계; 상기 혼합물에 다공성 이온 전하 결정체(Ion charge particle)를 투입하고 5분 내지 30분동안 반응시키는 단계; 상기 반응을 완료한 이온 전하 결정체를 제거하여 핵산이 농축된 완충액을 얻는 단계; 상기 핵산이 농축된 완충액에 PCR 혼합제를 투입하고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 과정에서 또는 완료된 시료를 인-시츄(in-situ)로 검출하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체 및 이를 이용 핵산 추출방법에 따르면, 다공성 이온 전하 결정체를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 담가두는 것만으로 핵산의 분리 및 농축이 자동으로 이루어지기 때문에 유해한 유기용매, 자석비드, 원심분리기와 같은 복잡한 장치를 사용하지 않고도 핵산을 간단하고 신속하게 분리하고 농축할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 미세한 양의 생물학적 시료로부터 전처리 과정 없이 바로 용해, 정제 및 농축이 진행되기 때문에 저농도의 바이오물질(병원체 등)을 함유하는 시료에 대해서도 효과적으로 적용될 수 있으며, 따라서, 향후 저농도로 분석이 제한되었던 다양한 기초연구, 시료 량이 극히 제한적인 진단검사, 임상 진단, 환경 모니터링, 약물 유전학 분석 등의 다양한 분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 이온 전하 결정체의 다공성 구조를 확대하여 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 핵산 추출방법의 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다. 용해 완충액에 의해 생물학적 시료가 용해되면서 핵산과 부산물이 분리되고 이온 전하 결정체가 양이온성 부산물을 부착시킴과 동시에 물을 흡수하면서 핵산이 농축된 완충액을 얻는 과정을 보여준다.
도 3은 Oropharyngeal sample(구인두암 샘플)에 본 발명의 핵산 추출방법(Test 2)과 용해 완충액(DLB)만을 사용한 추출방법(Test 1)을 각각 적용한 후, Target 유전자(GAPDH)의 Real-time PCR 증폭 효율을 비교한 결과를 도시한 것이다.
도 4는 Nasopharyngeal sample test(비인두암 샘플)에 본 발명의 핵산 추출방법(Test 2)과 용해 완충액(DLB)만을 사용한 추출방법(Test 1)을 각각 적용한 후, Target 유전자(GAPDH)의 Real-time PCR 증폭 효율을 비교한 결과를 도시한 것이다.
도 5는 Oropharyngeal sample(구인두암 샘플)에 아래 비교예 1의 양성이온 전하 결정체를 이용한 추출방법(Test 2)과 용해 완충액(DLB)만을 사용한 추출방법(Test 1)을 각각 적용한 후, Target 유전자(GAPDH)의 Real-time PCR 증폭 효율을 비교한 결과를 도시한 것이다.
도 6은 Nasopharyngeal sample test(비인두암 샘플)에 아래 비교예 2의 양성이온 전하 결정체를 이용한 추출방법(Test 2)과 용해 완충액(DLB)만을 사용한 추출방법(Test 1)을 각각 적용한 후, Target 유전자(GAPDH)의 Real-time PCR 증폭 효율을 비교한 결과를 도시한 것이다.
도 7은 다공성 이온 전하 결정체의 물 흡수 전과 후의 크기를 비교한 사진이다.
도 8은 이온 전하 결정체를 포함하는 캡슐의 외형을 나타내는 컨셉 이미지이다.
도 9는 다양한 형태의 고분자 흡수체를 사용하여 핵산을 분리 및 농축 한 후, 각 방법의 핵산 분리효능 PCR 검출 시험을 통해 확인한 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되는 실시예를 통해 설명될 것이며 명확해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
또한, 본 발명을 설명하기 위해 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과하고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 포괄하는 것을 아니므로, 본 출원시점에서 이들을 대체할 수 있는 균등한 변형 예들이 있을 수 있다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의될 수 있다.
“다공성 이온 전하 결정체”는 고체의 표면과 내부에 작은 구멍(기공)이 다수 형성되어 있으며, 전하를 띄고 있는 결정체를 의미한다.
"시료"는 검출하고자 하는 바이오물질를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.
“핵산”은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 다만, 보다 전형적으로는 DNA, RNA 등일 수 있다.
"용해 완충액(Direct lysis buffer; DLB)"은, 세포를 파괴할 때 사용되는 완충액으로, 용해물의 산도 및 삼투압을 조절하기 위한 염 또는/및 계면활성제를 포함하는 조성물이다. 예를 들면 25℃에서 약 5.8 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다.
"세포 용해 또는 용해(lysis)"는 세포 등의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 노출되는 현상을 의미하며, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전 단계에서 DNA 또는 RNA를 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.
"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체를 제공한다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 이온 전하 결정체는 음의 전하를 나타내는 작용기 또는 모이어티를 갖는 음이온성 결정체일 수 있으며, 음의 전하를 갖는 결정체라면 그 종류를 한정하지 않고 사용할 수 있다.
핵산은 구조상 음전하 특성을 갖기에 본 발명의 음이온성 전하 결정체와 전기적으로 반발하게 되어 이온 전하 결정체와 결합하지 못하는 반면, 양전하 특성을 갖는 용해 부산물은 이온 전하 결정체와 결합하게 된다.
또한, 본 발명의 다른 일 예에 따르면 상기 이온 전하 결정체는 초 다공질 구조를 가지며 용매, 특히 물(H2O)을 흡수 할 수 있다.
상기 초 다공질 구조는 일반적인 다공질 구조에 비해 수백 배의 넓은 표면적을 제공하여 매우 짧은 확산거리를 갖게 할 수 있다. 또한, 이온 전하 결정체 내부의 공극들이 서로 연결된 구조를 가질 수 있으며, 모세관 현상으로 인해 물이 매우 빠른 속도로 흡수되게 되고 본 발명의 다공성 이온 전하 결정체의 물 흡수 팽윤 속도는 일반적인 다공성 결정체에 비해 수백 배의 빠른 속도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, “다공성 이온 전하 결정체”의 성분은, 다공성이면서 음전하를 갖는 물질이라면 그 종류를 한정하지 않고 사용할 수 있으며, 합성 수지 또는 천연 수지일 수 있다.
본 발명의 “다공성 이온 전하 결정체”는 음이온성 고분자일 수 있으며, 구체적으로 고분자 사슬 중에 해리기(解離基)를 가져, 물과 접촉할 경우 해리하여 고분자이온이 형성되는 고분자전해질(polyelectrolyte) 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, “다공성 이온 전하 결정체”의 성분은 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리아크릴산나트륨(sodium polyacrylate), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 알지네이트(alginate), 에틸렌 말레익 앤하이드리드(ethylene maleic anhydride), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 히드록시 에틸 셀룰로오스(Hydroxy ethyl cellulose), 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스(Hydroxypropyl methyl cellulose), 셀룰로오스 아세테이트(Cellulose acetate), 카르복시 메틸 셀룰로오스(carboxy methyl cellulose), 폴리메타크릴산(Polymethacrylate, PMA) 등에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 폴리아크릴산나트륨(sodium polyacrylate) 일 수 있다. 물론 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 본 발명의 다공성 이온 결정체는 고분자전해질(Polyelectrolyte) 물질들이 서로 교차결합(Cross-link)하여 3차원 망상구조를 가지고 있다. 이러한 고분자 전해질에 의한 삼투압과 3차원 망상구조로 인해 용액의 흡수와 저장이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 다공성 이온 결정체는 아크릴산(Acrylic acid)으로 구성된 고분자일 수 있으며, 겔 중합법(Gel polymerization)에 따라 큰 덩어리로 만들어진 후 원하는 입도에 맞도록 잘려서 제조될 수 있다. 따라서 입자의 모양이 불규칙한 비정형이며 이후 가공을 통해 원하는 입자 형태 및 크기로 분류 및 제작될 수 있다. 또한, 접촉하는 전해질의 이온 특성에 따라 다공성 이온 결정체의 흡수력이 달라지며 음이온들(SO4 2-, OH- 등)이 공극수(pore water)에 용해되어 알칼리 환경이 조성되면 음이온성 고분자 물질이 만들어진다.
본 발명에 사용되는 아크릴산 기반 고분자의 경우, 음이온성 전해질 환경에서 카르복실기(-COO-)와 같은 음전하 그룹(Anionic functional group)으로 구성될 수 있다.
상기 다공성 이온 전하 결정체는 무정형, 구형, 타원형, 다각형 등 다양한 형태일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 다공성 이온 전하 결정체는 용매 흡수 전 약 0.05 내지 1.5cm 의 평균 직경을 가지는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 1.0cm, 0.2 내지 0.8 cm, 가장 바람직하게는 0.3 내지 0.5cm의 평균 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 상기 다공성 이온 전하 결정체는 용매 흡수 전과 비교해 흡수 후 부피가 1,000 내지 50,000% (10~500배)까지 증가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 20,000 내지 30,000% (200~300배) 까지 증가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예로서, 다공성 이온 전하 결정체의 포어 사이즈(직경)는, 예를 들면 약 0.1 내지 10 ㎚, 구체적으로 약 1 내지 5 ㎚, 보다 구체적으로 약 3 내지 5 ㎚ 범위일 수 있다. 포어 사이즈가 지나치게 큰 경우에는 물 흡수 능력이 떨어질 수 있고 작은 경우 부산물의 흡수 능력이 떨어질 수 있으며, 이를 고려하여 적절한 포어 사이즈의 다공성 이온 전하 결정체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체를 포함하는, 핵산 추출 튜브를 제공할 수 있다.
상기 핵산 추출 튜브는 핵산을 포함하는 시료 내의 핵산을 측정하기 위한 구조물로서, 시료를 수용할 수 있는 바디부, 일정한 바디부의 개구부를 개폐하는 캡 및 바디부와 캡의 연결부를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않고, 연결부를 포함하지 않으며, 연결부에 의하여 바디부 및 캡이 연결되지 않고 각각 존재하는 형태 또한 포함할 수 있다.
상기 핵산 추출 튜브를 구성하는 소재는, 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 플라스틱에 의한 습기 흡수가 문제가 되지 않을 경우, 바람직하게 구성되는 플라스틱류는 ABS, 아세탈(acetal), 아크릴섬유(acrylic), 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 알킬비닐 알코올(alkylvinylalcohol), 폴리아릴에테르에톤(polyaryletherketone), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone), 폴리에테르케톤(polyetherketone), 멜라민 포름알데히드(melamine formaldehyde), 페놀 포름알데히드(phenolic formaldehyde), 폴리아미드(polyamide, 예를 들면: 나일론6, 나일론 66, 나일론 12), 폴리아미드-이미드(polyamide-imide), 폴리디시클로펜타디엔(polydicyclopentadiene), 폴리에테르-이미드(polyether-imide), 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 폴리이미드(polyimide), 폴리페닐렌옥사이드(polyphenyleneoxide), 폴리프탈아미드(polyphthalamide), 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 폴리우레탄(polyurethan), 폴리설폰(polysulfone), 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 및 비닐 포말(vinyl formal)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 습기 흡수가 문제가 될 경우, 바람직하게 구성되는 플라스틱류는 폴리스틸렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리부틸렌(polybutylene), 에폭시(epoxy), 테플론(Teflon), PAN(peroxyacetylnitrate), PET(polyethylene terephthalate), PTFE(polytetrafluoroethylene), 클로로-플루오로에틸렌(chloro-fluoroethylene), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride), 액정 중합체(liquid crystal polymer), 폴리에스테르(polyester), LDPE(low-density polyethylene), HDPE(high density polyethylene), 폴리메틸펜틴(polymethylpentene), 폴리페닐렌 설파이드(polyphenylene sulfide), 폴리올페핀(polyolefin), PVC(polyvinyl chloride) 및 염소화 PVC를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 추출 튜브가 수용할 수 있는 시료의 용적은, 1 내지 50,000㎕의 범위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용자의 목적에 따라 다양한 크기로 형성되어 보다 다양한 범위를 가질 수 있다.
핵산 추출 튜브의 바디부는 다양한 형태로 형성될 수 있다. 사용자의 목적에 따라 하부의 모양이 원호형 및 사각형 등 다양한 형태로 형성될 수 있다.
따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브는 다양한 형태, 용적 및 모양을 갖는 바디부를 포함함으로써, 사용자의 목적에 따라 적합한 튜브를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(Direct lysis buffer)과 핵산 추출 튜브에 투입하여 혼합하는 단계;
상기 혼합물에 다공성 이온 전하 결정체(Ion charge particle)를 투입하고 5분 내지 30분 동안 반응시키는 단계; 및
상기 반응을 완료한 이온 전하 결정체를 제거하고 핵산이 농축된 완충액을 얻는 단계를 포함하는, 핵산 추출방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 다공성 이온 전하 결정체는 음이온성이며, 음이온성 이온 전하 결정체는 양이온성 부산물을 흡착할 수 있다. 또한 본 발명의 다공성 이온 전하 결정체는 용매, 특히 물을 흡수하는 것을 특징으로 한다.
상기 다공성 이온 전하 결정체로 사용가능한 물질과 결정체의 물리, 화학적 특성은 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 용해 완충액(Direct lysis buffer; DLB)은 세포막과 핵막을 제거하고 핵산을 용출시키는 완충용액이면 그 종류를 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있으며, 필요에 따라 사용하는 염의 종류와 계면활성제의 종류, 농도, pH 등을 조절할 수 있다.
상기 혼합물에 투입하는 다공성 이온 결정체 투입량은 시료의 종류와 양에 따라 적절히 조절 할 수 있다. 본 발명의 일 예에 따르면 10 내지 500 mg 을 투입 할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 400 mg, 50 내지 350 mg, 또는 100 내지 300mg을 투입 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 반응은 5분 내지 20분, 예를 들어 5분 내지 15분, 5분 내지 10분, 또는 10분 내지 15분 동안 수행될 수 있으며, 예를 들어 약 10분 내외로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 핵산 추출 반응은 상온에서 수행되는 것일 수 있으며, 추가적인 세척 단계가 없는 것을 특징으로 하는, 핵산 추출방법일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 추출방법에서 이온 전하 결정체를 제거하고 핵산이 농축된 완충액을 얻은 후, 완충액으로부터 핵산을 분리하는 단계를 추가로 포함 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(Direct lysis buffer)과 핵산 추출 튜브에 투입하여 혼합하는 단계;
상기 혼합물에 다공성 이온 전하 결정체(Ion charge particle)를 투입하고 5분 내지 30분 동안 반응시키는 단계;
상기 반응을 완료한 이온 전하 결정체를 제거하여 핵산이 농축된 완충액을 얻는 단계;
상기 핵산이 농축된 완충액에 PCR 혼합제를 투입하고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 과정에서 또는 완료된 시료를 인-시츄(in-situ)로 검출하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법을 제공할 수 있다.
실시예
제조예 1: 다공성 이온전하 결정체 제조
본 발명의 실시예에서는 음이온성 고분자체로 폴리아크릴산나트륨(sodium polyacrylate/ ㈜LG생활건강)을 사용하였으며, 비교예에서는 양이온성 고분자체로 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 (styrene-divinylbenzene copolymers / DOW Inc.) 을 사용하였다.
실시예 1: Oropharyngeal sample(Target: GAPDH) 핵산 검출 효과 검증
Oropharyngeal sample(구인두암 샘플)에 본 발명의 일 실시예에 따른 이온 전하 결정체를 이용한 핵산 추출방법(Test 2; 음성이온)을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(Test 2)와 동량의 동일한 샘플에 Direct Lysis Buffer만을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(대조군, Test 1)를 형광 증폭 곡선(fluoreascent amplification curves)으로 비교 도시하였으며, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3의 첫 번째 그래프를 보면 Test 1의 경우, 26 cycles 부터 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점(end point)의 RFU(relative fluorescence units)는 약 2000 범위 내의 수준을 갖는 것으로 나타났으며, Test 2(음성이온)의 경우, 23 cycles에 이르러 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU가 약 2200 범위 수준으로 나타났다. 두 번째 그래프를 보면 Test 1의 경우, 29 cycles 부터 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU는 약 1300 범위 내의 수준으로 나타났고, Test 2(음성이온)의 경우, 24 cycles 부터 형광발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU는 약 1900 수준으로 나타났다.
실시예 2: Nasopharyngeal sample (Target: GAPDH) 핵산 검출 효과 검증
Nasopharyngeal sample (비인두암 샘플)에 본 발명의 일 실시예에 따른 이온 전하 결정체를 이용한 핵산 추출방법(Test 2; 음성이온)을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(Test 2)와 동량의 동일한 샘플에 Direct Lysis Buffer만을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(대조군, Test 1)를 형광 증폭 곡선으로 비교 도시하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4의 첫 번째 그래프를 보면 Test 1의 경우, 39 cycles 부터 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU는 약 600 범위 내의 수준을 갖는 것으로 나타났다. 반면, Test 2(음성이온)의 경우, 27 cycles에 이르러 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU가 약 2300 범위 수준으로 나타났다. 두 번째 그래프를 보면 Test1의 경우, 형광 발현을 나타내지 않았으며, Test 2(음성이온)의 경우, 30 cycles에 이르러 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU가 약 2100 범위 수준으로 나타났다.
이상의 실시예 1, 2의 결과에 따라, 본 발명의 다공성 이온 전하 결정체를 이용한 핵산 추출방법이 DLB만을 사용한 핵산 추출방법보다 우수한 핵산 추출 및 검출 효과가 있음을 알 수 있었다.
비교예 1: 양성 이온 전하 결정체를 이용한 Oropharyngeal sample(Target: GAPDH) 핵산 검출 효과 비교
Oropharyngeal sample(구인두암 샘플)에 DLB 및 양이온 전하 결정체를 적용한 핵산 추출방법(Test 2; 양성이온)을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(Test 2)와 동량의 동일한 샘플에 Direct Lysis Buffer만을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(대조군, Test 1)를 형광 증폭 곡선(fluoreascent amplification curves)으로 비교 도시하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5의 첫 번째 그래프를 보면 Test 1의 경우, 27 cycles 부터 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점(end point)의 RFU(relative fluorescence units)는 약 2300 범위 내의 수준을 갖는 것으로 나타났으며, Test 2(양성이온)의 경우, 형광 발현을 나타내지 않았다. 두 번째 그래프를 보면 Test 1의 경우, 29 cycles 부터 형광 발현이 나타나기 시작하여 최종점의 RFU는 약 1300 범위 내의 수준으로 나타났고, Test 2(양성이온)의 경우, 형광 발현을 나타내지 않았다.
비교예 2: 양성 이온 전하 결정체를 이용한 Nasopharyngeal sample (Target: GAPDH) 핵산 검출 효과 비교
Nasopharyngeal sample (비인두암 샘플)에 DLB와 양이온 전하 결정체를 적용한 핵산 추출방법(Test 2; 음성이온)을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(Test 2)와 동량의 동일한 샘플에 Direct Lysis Buffer만을 적용한 후 RT-PCR을 수행한 결과(대조군, Test 1)를 형광 증폭 곡선으로 비교 도시하였으며, 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6의 첫 번째 그래프를 보면 Test 1과 Test 2(양성이온) 모두 형광 발현을 나타내지 않았다. 두 번째 그래프 역시 Test1과 Test 2(양성이온) 모두 형광 발현을 나타내지 않았다.
이상의 비교예 1, 2의 결과로부터 본 발명과 달리, 양이온성 다공성 이온 전하 결정체를 이용할 경우, 핵산이 전혀 추출되거나 검출되지 않음을 확인 할 수 있었다.
실험예 1. 다양한 형태의 고분자 흡수체를 이용한 핵산 분리 및 검출 시험
다양한 형태의 고분자 흡수체를 사용하여, 핵산 분리 및 검출 시험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타냈다.
구체적으로 본 발명의 핵산 추출방법에서 다공성 음이온 전하 결정체(5.음성비드, 제조예1의 음성 이온 다공성 결정체)를 대신하여 1. DLB만 사용 / 2. 양성 이온 결정체(스티렌-디비닐벤젠 공중합체) 사용 / 3. 음성(negative) 이온 결정체 사용(상기 2. 양성이온 결정체와 동일한 성분이나 후처리를 통해 음성 이온을 띄도록 제조한 결정체) / 4. 음성 섬유 필터를 각각 사용한 후, 각각의 분리방법을 통해 농축된 용액을 이용하여 PCR 검출시험을 수행하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, PCR결과 본 발명의 다공성 음이온 결정체(도 9의 5. 음성비드)를 사용 할 경우, 음성 섬유 필터를 사용할 때보다 핵산 분리 및 검출 효능이 현저히 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 양성이온 결정체여도 후처리를 통하여 음성 이온으로 만든 경우와 유사한 핵산 분리 및 검출 효능이 나타남을 확인 할 수 있었다.
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Claims (13)

  1. 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체로
    상기 다공성 이온 전하 결정체는 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리아크릴산나트륨(sodium polyacrylate)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 음이온 고분자전해질(polyelectrolyte)이며, 용매 흡수 전 약 0.1 내지 1cm의 평균 직경을 가지고 포어(pore) 사이즈가 1 내지 5nm인 것인, 다공성 이온 전하 결정체.
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  5. 상기 청구항 제1항의 핵산 분리용 다공성 이온 전하 결정체를 포함하는, 핵산 추출 튜브.
  6. 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(Direct lysis buffer)과 핵산 추출 튜브에 투입하여 혼합하는 단계;
    상기 혼합물에 상기 청구항 제1항의 다공성 이온 전하 결정체(Ion charge particle)를 투입하고 5분 내지 30분 동안 반응시키는 단계; 및
    상기 반응을 완료한 이온 전하 결정체를 제거하고 핵산이 농축된 완충액을 얻는 단계를 포함하는, 핵산 추출방법.
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  10. 제6항에 있어서, 상기 다공성 이온 전하 결정체는 양이온성 부산물을 흡착하고 용매를 흡수하는 것인, 핵산 추출방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 반응은 상온에서 수행하는 것인, 핵산 추출방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 반응은 추가적인 세척 단계가 없는 것을 특징으로 하는, 핵산 추출방법.
  13. 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(Direct lysis buffer)과 핵산 추출 튜브에 투입하여 혼합하는 단계;
    상기 혼합물에 상기 청구항 제1항의 다공성 이온 전하 결정체(Ion charge particle)를 투입하고 5분 내지 30분동안 반응시키는 단계;
    상기 반응을 완료한 이온 전하 결정체를 제거하여 핵산이 농축된 완충액을 얻는 단계;
    상기 핵산이 농축된 완충액에 PCR 혼합제를 투입하고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
    상기 PCR 과정에서 또는 완료된 시료를 인-시츄(in-situ)로 검출하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법.
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