KR102408378B1 - 다중 바이오마커 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산 전처리 과정을 통해 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 이용한 다중 바이오마커 검출을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 전처리 방법에 따르면, 필요한 유전자 바이오마커의 변이 부분만을 선별적으로 얻을 수 있어 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 구조체와의 비특이적인 결합을 최소화할 수 있어 검출 기능을 향상시킬 수 있으며, 낮은 농도의 바이오마커도 효과적으로 진단할 수 있고, 나아가 액체 생검으로부터 질병을 조기진단하고 약물의 효과 등을 용이하게 확인할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 다중 바이오마커 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 핵산 전처리 과정을 통해 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 이용한 다중 바이오마커 검출을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
특정한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 기술이다. 특정한 핵산 또는 단백질을 검출하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떤 유전적, 생물학적 표지가 사람의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다. 이러한 핵산과 단백질을 검출하는 방법을 이용하면 시료에 존재하는 병원체 유전자의 변형, 또는 특정 유전자의 발현 등을 발견할 수 있다. 이와 같은 분자 진단은 DNA 또는 RNA 등 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염질환, 암진단, 유전질환 및 맞춤 진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91. 1998). 그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확인하기 위해서 전기 영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기 영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤 (Agarose gel)을 만들고 DNA를 EtBr 등으로 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있어왔다. 또한, 최근에 사용되고 있는 real-time PCR 방법은 형광을 사용하기 때문에 전기 영동이 불필요하나, 고가의 사용 기기와 고가의 형광시약을 사용해야 한다 (Higuchi, R., et. al., Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nature Biotechnology 11, 1026 - 1030, 1993)는 문제점이 있다. 최근에 현장 진단 개념의 PCR 제품인 Cepheid사의 GeneXprt system과 시약이 개발되어 판매되고 있으나, 장비와 시약이 매우 고가이므로 일반적인 검사에서 사용하는 데는 어려움이 있다 (Helb, D., et. al., Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237, 2010). 다른 방법으로, PCR 후에 젤 전기 영동 대신에 멤브레인을 사용하여 확인하는 핵산 측면 흐름 어세이 (Nucleic Acid Lateral Flow Assay)가 있다 (Aveyard, J., et. al., One step visual detection of PCR products with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device. Chem. Commun., 41, 4251-4253, 2007). 그러나, 젤 전기 영동 기술에 비해 복잡하여 실험실에서 제조하여 사용하기는 불가능하며, 멤브레인에 부착된 프로브의 시퀀스는 PCR 증폭 산물에 따라서 특이적으로 결합할 수 있도록 사용하여야 하는 기술의 한계 때문에 범용으로 사용하는 데는 한계점이 있다. 특히, 이와 같은 PCR 기반의 염기서열분석법은 특정 오류에 극히 취약하고 데이터 해석과정에서 문제가 생겨 자주 심각한 오진이 있어, 혈액 속 특정 핵산 바이오마커를 이와 상보적인 서열을 만났을 때 변화를 형광, 전위차, 색변화 등으로 표현하고자 하는 연구들이 진행되고 있으나, 하지만 이 연구들의 경우는 대부분 한 번에 하나의 바이오마커를 검출해 내기 때문에 다중의 바이오마커들이 관여하는 대부분의 질병들을 효과적으로 진단하는데 어려움이 있다.
대중적인 암 진단 기법으로는 분자 생물학적 진단, 초음파 진단, X-Ray, MRI, CT, PET, 뼈 스캔 등 다양한 방법이 존재한다. 대부분의 암 진단 기법은 최종적으로 육안을 통해 판단하므로 방사선 필름 또는 조직 판독 과정에 큰 오류가 생길 수 있다. 즉, 암의 크기에 따라 발견되지 못하거나 단순한 염증 등을 암으로 오인하여 진단할 수 있다. MRI나 PET 등의 몇몇 방법들은 긴 측정시간이 있어야 하는데 이때 환자의 움직임과 긴장이 진단의 정확성에 영향을 미친다는 단점이 존재한다. 또한, 환자에 대한 방사선 피폭의 위험성은 피해갈 수 없는 문제이다. 따라서 더욱 확실한 암 진단을 위하여 생체검사(biopsy)를 통해 종양 조직을 직접 채취해 검사를 진행하기도 하나, 이 경우에는 일부분의 암으로 의심되는 조직만을 검사하게 되므로 전체적인 암의 양상 및 유형을 파악할 수 없다. 종양을 채취하기 위해 바늘이나 수술 요법이 사용되는 것 또한 환자에게 큰 거부감을 줄 수 있고 환자의 상태에 따라 조직 생체검사 자체가 불가능한 경우도 존재한다. 전반적으로 암을 확진하기 위해 사용되는 기존의 방법들은 비싼 비용과 환자에게 불편을 주어 주기적으로 자주 검사하기에 적합한 방법이 아닌 실정이다. 현재는 액체 생체검사를 통해 환자의 혈액, 대소변, 침 등의 체액을 통해 그 안에 있는 바이오마커를 검출하여 암을 진단하고자 하는 시도들이 점차 이루어지고 있다. 이미 암 환자의 혈액 속에는 특정한 염기서열들이 환자가 아닌 자에 비교해 굉장히 많이 존재한다는 것이 다양한 연구들을 통해 밝혀지고 있으며 이는 바이오 빅데이터의 형태로 모든 자료가 저장되고 있다. 현재 연구되고 있는 유전자 바이오마커들은 miRNA와 같은 짧은 비특이적 코딩 RNA (Small non-coding RNA: sncRNA)들이 주목받고 있다. 최근 들어 RNA, DNA 들이 서로 작용하면서 세포의 분열, 성장, 사멸, 그리고 종양 진행에 큰 영향을 주는 것으로 알려졌다. 또한, sncRNA의 프로파일링이 유전자의 유전적 변이와의 상관관계에 관한 연구들도 진행되고 있으나, 서열분석에서 주목되는 다양한 짧은 서열들에 따른 각각의 프로브를 디자인해야 하는 문제점이 있어왔다. 따라서 짧은 서열과 긴 서열을 동시에 진단하는 방법의 개발은 매우 필수적이다. 그러나, 길이가 긴 mRNA는 자체적으로 특정 이차구조를 생성할 수 있고 이는 프로브와의 결합을 방해하기 때문에, 길이가 다른 샘플을 한 프로브로 잡아내는 것에는 큰 한계가 있다. 그런데, mRNA와 같은 5000 bp의 표적이라고 할지라도 그 안에서 실질적으로 마커 역할을 하는 부분은 작은 부분에 불과하다. 유전적인 변이는 크게 삽입(Insertion), 삭제(Deletion), 점돌연변이(Point mutation) 및 전좌(translocation)이 있으며 작게는 1개의 뉴클레오타이드의 변이만을 나타낸다. 따라서 긴 대상(표적)의 핵심 유전자 염기서열 부분을 선별하는 방법을 이용하면 삼각기둥형의 나노형광구조체만으로도 더 다양한 바이오마커를 더욱 효율적으로 검출할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 일반적으로 생체 내에서 긴 유전자 마커들을 짧은 서열화로 전환하는 새로운 방법을 개발하고자 하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 바이오마커 검출 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 바이오마커 검출 키트를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 핵산을 전처리하여 바이오마커 내의 표적 핵산을 선별하는 단계; 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계; 및 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커 검출 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 제한효소 인지 서열을 포함하며, 바이오마커 내의 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머; 제한효소; 스트렙타비딘으로 코팅된 자성입자; 형광핵산나노구조체; 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 바이오마커 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 전처리 방법에 따르면, 필요한 유전자 바이오마커의 변이 부분만을 선별적으로 얻을 수 있어 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 구조체와의 비특이적인 결합을 최소화할 수 있어 검출 기능을 향상시킬 수 있으며, 낮은 농도의 바이오마커도 효과적으로 진단할 수 있고, 나아가 액체 생검으로부터 질병을 조기진단하고 약물의 효과 등을 용이하게 확인할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바이오마커 검출 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
Step 1: 시료로부터 핵산을 분리하는 단계
Step 2 및 3: 핵산을 전처리하여 표적 핵산을 선별하는 단계
Step 4: 형광핵산 나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계 및 표적 핵산을 검출하는 단계
도 2는 표적 서열과 결합된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 전개도 모형을 나타낸 도이다:
c1, c2 및 c3: 표적 서열.
도 3은 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 제조 과정 중 열처리 과정에서의 NaCl 농도 조건별 Cy5/Cy3 형광값을 나타낸 도이다.
도 4는 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 제조 과정 중 열처리 과정에서의 NaCl 농도 조건별 정규화된 Cy5 및 Cy3 형광값을 나타낸 도이다.
도 5는 표적 서열과 결합된 사면체형 형광핵산나노구조체의 전개도 모형을 나타낸 도이다.
도 6은 표적 서열의 농도에 따른 정규화된 형광값을 나타내는 도이다.
도 7은 도 6에서 측정된 형광값의 추세선 식과 이 때 얻어지는 검출 한계값을 나타낸 표이다.
도 8은 표적 서열의 농도에 따라 Cy5/Cy3 형광값의 비율을 확인한 그래프이다:
LW: L858R 야생형(wild type);
LM: L858R 돌연변이형;
TW: T790M 야생형;
TM: T790M 돌연변이형;
DW: Del Ex19 야생형; 및
DM: Del Ex19 돌연변이형.
도 9는 야생형과 돌연변이의 비율에 따른 정규화된 형광값과 Cy5/Cy3 형광값의 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 도 11에서 측정한 Cy5/Cy3 형광값을 이용하여 200nM 표적에서 식별 가능한 최소한의 돌연변이 비율을 계산한 것을 나타낸 도이다.
도 11은 표적 서열 (Del Ex19)의 길이에 따라 제조된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체에서의 Cy5/Cy3 형광 비율을 나타낸 도이다. 도 11a에서 녹색은 야생형 Del Ex19, 적색은 Del Ex19 돌연변이를 표적으로 하는 경우의 Cy5/Cy3 비율을 나타낸다. 도 11b는 다음의 식을 사용하여 계산한 시스템 효율(η (%))을 나타낸 것이다.
도 12는 단일가닥(a) 또는 이중가닥(b) 표적핵산의 길이에 따라 제조된 삼각 기둥형 형광핵산나노구조체에서의 Cy5/Cy3 형광 비율을 나타낸 도이다.
도 13은 표적 서열 (Del Ex19)의 길이에 따라 제조된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 4 종의 폐암세포주에서 추출한 RNA 시료에 대한 Del Ex19 표적 검출능을 나타낸 도이다:
P: PCR만 수행;
P+R: PCR 및 제한효소 반응 수행; 및
P+R+F: PCR, 제한효소 반응 및 자성입자 활용한 필터링 과정 수행.
도 14는 표적 서열 (L858R)의 길이에 따라 제조된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 4 종의 폐암세포주에서 추출한 RNA 시료에 대한 L858R 표적 검출능을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 서열 관계를 나타낸 모식도이다.
도 16은 본 발명의 사면체형 형광핵산나노구조체의 서열 관계를 나타낸 모식도이다.
Step 1: 시료로부터 핵산을 분리하는 단계
Step 2 및 3: 핵산을 전처리하여 표적 핵산을 선별하는 단계
Step 4: 형광핵산 나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계 및 표적 핵산을 검출하는 단계
도 2는 표적 서열과 결합된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 전개도 모형을 나타낸 도이다:
c1, c2 및 c3: 표적 서열.
도 3은 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 제조 과정 중 열처리 과정에서의 NaCl 농도 조건별 Cy5/Cy3 형광값을 나타낸 도이다.
도 4는 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 제조 과정 중 열처리 과정에서의 NaCl 농도 조건별 정규화된 Cy5 및 Cy3 형광값을 나타낸 도이다.
도 5는 표적 서열과 결합된 사면체형 형광핵산나노구조체의 전개도 모형을 나타낸 도이다.
도 6은 표적 서열의 농도에 따른 정규화된 형광값을 나타내는 도이다.
도 7은 도 6에서 측정된 형광값의 추세선 식과 이 때 얻어지는 검출 한계값을 나타낸 표이다.
도 8은 표적 서열의 농도에 따라 Cy5/Cy3 형광값의 비율을 확인한 그래프이다:
LW: L858R 야생형(wild type);
LM: L858R 돌연변이형;
TW: T790M 야생형;
TM: T790M 돌연변이형;
DW: Del Ex19 야생형; 및
DM: Del Ex19 돌연변이형.
도 9는 야생형과 돌연변이의 비율에 따른 정규화된 형광값과 Cy5/Cy3 형광값의 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 도 11에서 측정한 Cy5/Cy3 형광값을 이용하여 200nM 표적에서 식별 가능한 최소한의 돌연변이 비율을 계산한 것을 나타낸 도이다.
도 11은 표적 서열 (Del Ex19)의 길이에 따라 제조된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체에서의 Cy5/Cy3 형광 비율을 나타낸 도이다. 도 11a에서 녹색은 야생형 Del Ex19, 적색은 Del Ex19 돌연변이를 표적으로 하는 경우의 Cy5/Cy3 비율을 나타낸다. 도 11b는 다음의 식을 사용하여 계산한 시스템 효율(η (%))을 나타낸 것이다.
도 12는 단일가닥(a) 또는 이중가닥(b) 표적핵산의 길이에 따라 제조된 삼각 기둥형 형광핵산나노구조체에서의 Cy5/Cy3 형광 비율을 나타낸 도이다.
도 13은 표적 서열 (Del Ex19)의 길이에 따라 제조된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 4 종의 폐암세포주에서 추출한 RNA 시료에 대한 Del Ex19 표적 검출능을 나타낸 도이다:
P: PCR만 수행;
P+R: PCR 및 제한효소 반응 수행; 및
P+R+F: PCR, 제한효소 반응 및 자성입자 활용한 필터링 과정 수행.
도 14는 표적 서열 (L858R)의 길이에 따라 제조된 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 4 종의 폐암세포주에서 추출한 RNA 시료에 대한 L858R 표적 검출능을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 서열 관계를 나타낸 모식도이다.
도 16은 본 발명의 사면체형 형광핵산나노구조체의 서열 관계를 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 바이오마커에서 핵산 변이체가 발생하는 위치를 포함하는 표적 핵산 영역을 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머로 분리한 핵산을 증폭하는 단계; 및 증폭된 결과물에 제한효소를 처리하고, 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 코팅된 자성입자를 처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 획득하는 단계를 포함하는, 바이오마커 전처리 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 긴 길이의 바이오마커 핵산 서열을 핵산 변이체가 발생하는 위치를 포함하는 짧은 길이의 표적 핵산으로 변환시켜 선별할 수 있다.
일 구현예에서, 변환된 짧은 길이의 표적 핵산은 75bp 미만의 길이인 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 내지 50bp의 길이일 수 있다.
일 구현예에서, 변환된 짧은 길이의 표적 핵산이 단일가닥인 경우, 바람직하게는 43bp 이하의 길이일 수 있으며, 보다 바람직하게는 16-43bp의 길이인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 변환된 짧은 길이의 표적핵산이 이중가닥인 경우, 바람직하게는 28bp이하의 길이일 수 있으며, 보다 바람직하게는 16-28bp 인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 프라이머는 제한효소 인지 서열(restriction enzyme site)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제한효소를 처리하여 표적 부분과 표적이 아닌 부분으로 자를 수 있으며, 표적 부분은 20~30bp가 되도록 자를 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 핵산을 전처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 선별하는 단계; 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계; 및 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커 검출 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 핵산의 전처리는 바이오마커에서 핵산 변이체가 발생하는 위치를 포함하는 표적 핵산 영역을 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머로 분리한 핵산을 증폭하는 단계; 및 증폭된 결과물에 제한효소를 처리하고, 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 코팅된 자성입자를 처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 획득하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머는 제한효소 인지 서열(restriction enzyme site)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 검출 방법은 하나 이상의 바이오마커를 다중 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형광핵산나노구조체는 삼각기둥형 또는 사면체형일 수 있다.
일 구현예에서, 삼각기둥형 형광핵산나노구조체는 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 핵산 서열 A3a 및 핵산 서열 A3b로 이루어진 제 1 핵산 U1; 제 1 형광물질, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1; 제 2 형광물질, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4 및 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및 제 3 형광물질, 핵산 서열 A3a 및 A3b와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6 및 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열을 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 사면체형 형광핵산나노구조체는 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1; 제 1 형광물질, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1; 제 2 형광물질, 핵산 서열 B4, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및 제 3 형광물질, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6를 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 표적 서열로서 이용한 바이오마커 Del Ex19, T790M 및 L858R는 모두 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 유전자에 발생하는 유전자 변이 마커이다. 구체적으로, Del Ex19는 EGFR 유전자의 Exon 19번에 생기는 삭제 변이이고, T790M은 Exon 20번에 발생하는 점 돌연변이이며, L858R은 Exon 21번에서 나타나는 점 돌연변이이다. 상기 마커들은 약물인 EGFR TKI(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor)에 민감한 돌연변이로 알려져 있으며, EGFR TKI 관련 약물 처방의 기준점으로 활용되고 있다.
일 구현예에서, 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체는 본 발명의 전처리를 통해 선별한 표적 핵산, 제 1 핵산 U1, 제 2 핵산 S1, 제 3 핵산 S2 및 제 4 핵산 S3을 혼합한 뒤 열처리하여 형광핵산나노구조체를 제조한 뒤 그래핀 옥사이드에 부착함으로써 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 형광나노핵산구조체는 삼각기둥형 형광나노핵산구조체의 경우, 표적 핵산(서열), 즉 c1, c2 및 c3가 없을 때는, 구조체에서 S1, S2 및 S3의 표적에 상보적인 부분 (c1*, c2* 및 c3*)과 그래핀 옥사이드에 결합되는 삼각기둥의 삼각 바닥면 한 면을 제외하고 모두 이중결합을 형성하고 있는 접합부에 의해 입체 구조를 형성하고 있으며; 표적 핵산 c1, c2 및 c3을 포함하여 형광나노핵산구조체가 제조되거나 이와 반응하여 형광나노핵산구조체가 형성되면, 표적 핵산 c1, c2 및 c3이 S1, S2 및 S3의 c1*, c2* 및 c3* 중 각각에 상보적인 서열에 결합함으로써 그래핀 옥사이드에 부착될 삼각기둥의 삼각면 한 면을 제외하고 모두 이중결합을 형성한다. 또한, 사면체 형광나노핵산구조체의 경우 표적 핵산(서열), 즉 c1, c2 및 c3가 없을 때는, 구조체에서 S1, S2 및 S3의 표적에 상보적인 부분 (c1*, c2* 및 c3*)과 그래핀 옥사이드에 부착될 poly A 꼬리 부분 (B3, B5 및 B6)을 제외하고 모두 이중결합을 형성하여 입체 구조를 형성하고 있고 (접합부); 표적 핵산 c1, c2 및 c3을 포함하여 형광나노핵산구조체가 제조되거나 이와 반응하여 형광나노핵산구조체가 형성되면, 표적 핵산 c1, c2 및 c3이 S1, S2 및 S3 중 각각에 상보적인 단일가닥 서열 부분에 결합하므로 그래핀 옥사이드에 부착될 poly A 꼬리 부분을 제외하고 모두 이중결합을 형성한다.
일 구현예에서, 표적 핵산 검출은 형광공명에너지전이 현상으로 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 핵산은 DNA 및/또는 RNA일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "형광나노핵산구조체"는 표적 핵산에 상보적인 서열의 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브, 상기 프로브들로 이루어진 구조체 또는 표적 핵산과 결합된 상기 프로브들을 포함한다.
본 발명에서 용어, "형광핵산나노구조체/그래핀 옥사이드 복합체" 또는 "그래핀 형광핵산나노구조체"는 상기 형광핵산나노구조체가 그래핀 옥사이드 상에 부착된 구조체 또는 복합체를 말한다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으나, 본 발명에서는 단일가닥 핵산을 의미하며, 제 1 핵산 U1, 제 2 핵산 S1, 제 3 핵산 S2 및 제 4 핵산 S3일 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 소변, 타액, 혈장 또는 체액을 포함하며, 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있으며, 액체 생검인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 표적 핵산에 상보적인 핵산을 포함하는 단일가닥 프로브를 하나 이상 포함할 수 있으며, 표적 핵산에 상보적인 핵산을 포함하는 단일가닥 프로브가 3개 이상이면, 각 단일가닥 프로브의 표적 핵산에 상보적인 핵산 부위를 제외한 일부 서열과 상보적인 서열들로 이루어진 단일가닥 프로브를 추가로 포함함으로써 입체 구조를 이룰 수 있다. 또한, 각각 서로 상이한 표적 핵산에 상보적인 핵산 및 서로 상이한 형광물질을 포함하는 한 종류 이상의 단일가닥 프로브를 포함함으로써 서로 상이한 표적 핵산의 다중 검출이 가능하고, 입체 구조를 이룸으로써 검출 결과가 안정적으로 유지되며, 여러 표적 핵산들을 각각 정량할 수 있는 장점이 있다.
일 구현예에서, 표적에 따라, 각각의 프로브의 표적 핵산 상보적 부위 서열이 변경될 수 있으므로, 특정 질병에 특이적인 핵산들을 표적으로 선정하여 이의 진단 등에 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 표적 서열로 폐암에 특이적인 바이오마커로서 알려진 돌연변이 Del Ex19, L858R 및 T790M를 포함하도록 전처리하여 짧은 길이의 핵산으로 만든 후 각각 c1으로 이용하고, 돌연변이가 없는 동일한 길이의 핵산을 c3로 이용하였으며, GAPDH를 c2로 이용하였으므로, 이를 이용하여 폐암의 진단 및 항암제의 사용 효과 등을 모니터링할 수 있다.
본 발명의 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 전처리를 통해 선별한 표적 핵산과 서로 상이한 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브인 제 2 핵산 S1, 제 3 핵산 S2 및 제 4 핵산 S3, 및 단일가닥 프로브인 제 1 핵산 U1은 특정 열처리 과정을 통해 형광나노핵산구조체로 조립될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단일가닥 프로브들에 포함된 형광물질들은 서로 다른 파장대의 형광물질일 수 있다.
일 구현예에서, 형광물질은 플루오레신(fluorescein, FAM), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine, Cy), 보디피(BODIPY), 아세톡시메틸 에스터(Acetoxymethyl ester) 및 쿠마린(coumarin)으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 핵산 단일가닥 부착이 가능한 공지의 형광체라면 모두 사용 가능하다.
일 구현예에서, 상기 열처리는 형광나노핵산구조체의 구조에 따라 상이할 수 있으며, 사면체의 경우, 95℃, 2분; 60℃에서 1분에 1℃씩 냉각; 20℃ 5분 및 4℃로 열처리할 수 있고, 삼각기둥의 경우, 95℃ 5분; 85℃ 5분; 1분에 0.5℃씩 낮춰 20℃에서 5분 및 4℃로 열처리할 수 있다.
일 구현예에서, 그래핀 옥사이드(Graphene Oxide: GO)는 형광제한화학물질(Universal Quencher: UQ)로서 형광공명에너지 전이에 의한 형광을 선택적으로 차단할 수 있으며, 표적 핵산과 본 발명의 단일가닥 프로브가 결합하여 이중결합을 형성하면 프로브 (또는 형광나노핵산구조체)가 그래핀 옥사이드로부터 거리가 멀어져 형광물질의 발광이 검출될 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서는 그래핀 옥사이드는 이중가닥 염기서열보다 단일가닥 염기서열과 더 쉽게 부착되는 고유한 특성과 형광공명에너지전이에 따라 그래핀 옥사이드와 형광나노핵산구조체의 형광물질의 거리가 가까워지면 형광이 차단되며, 거리가 멀어지면 다시 형광이 검출될 수 있는 특성을 이용하여, 형광 물질이 포함된 프로브들에 다중의 표적 염기서열들이 프로브들의 각각에 상보적인 서열과 결합해 이중결합을 형성하면 그래핀 옥사이드로부터 거리가 멀어지게 되어 형광을 발광함으로써, 다중 표적을 한 번에 인식하고 정량할 수 있도록 복합체를 디자인하였다.
일 구현예에서, 형광나노핵산구조체를 제조하는 단계 및 형광나노핵산구조체를 그래핀 옥사이드에 부착하는 단계의 염(NaCl)의 농도는 50 내지 300mM일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 핵산을 전처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 선별하는 단계; 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계; 및 선별한 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 반응시켜 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커 검출 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 핵산의 전처리는 바이오마커에서 핵산 변이체가 발생하는 위치를 포함하는 표적 핵산 영역을 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머로 분리한 핵산을 증폭하는 단계; 및 증폭된 결과물에 제한효소를 처리하고, 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 코팅된 자성입자를 처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 획득하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머는 제한효소 인지 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체의 형광핵산나노구조체가 반응하면 이중결합이 형성되어 그래핀 옥사이드로부터 거리가 멀어져 형광물질의 발광이 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형광핵산나노구조체는 삼각기둥형 또는 사면체형일 수 있다.
일 구현예에서, 삼각기둥형 형광핵산나노구조체는 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1; 제 1 형광물질, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2 및 핵산 서열 B2를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1; 제 2 형광물질, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4 및 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및 제 3 형광물질, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6 및 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열을 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 사면체형 형광핵산나노구조체는 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1; 제 1 형광물질, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1; 제 2 형광물질, 핵산 서열 B4, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및 제 3 형광물질, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6를 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 제한효소 인지 서열을 포함하며, 바이오마커 내의 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머; 제한효소; 스트렙타비딘으로 코팅된 자성입자; 형광핵산나노구조체; 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 바이오마커 검출 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA를 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료 전처리
긴 서열의 바이오마커를 입체 구조의 형광나노핵산구조체에서 검출할 수 있는 짧은 길이의 유전자 바이오마커로 만드는 전처리를 수행하였다. 구체적으로, 폐암에 특이적인 바이오마커로서 알려진 돌연변이 Del Ex19, L858R 및 T790M를 예시로 이용하였고, 각 변이에 특이적인 프라이머를 설계할 때, 정방향 프라이머(forward primer)는 표적과 인접한 부분을 증폭하도록 설계하였고. 역방향 프라이머(reverse primer)의 경우엔 5´에 비오틴(biotin)이 부착된 서열을 설계한 뒤 (표 2) PCR을 수행하였다. 증폭 후 남은 프라이머들과 증폭 효소(polymerase) 등을 제거하기 위해 PCR clean up kit를 이용하였다. 정제된 증폭 산물을 각 변이 (바이오마커)에 해당하는 제한효소와 반응시켜 표적(target) 부분과 폐기(waste) 부분으로 절단하였다 (표 1). 이 후, 스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 자성 비드(magnetic beads)와 15분 내지 4시간 동안 반응시켰으며, 자석을 이용해 자성 비드를 침전시켜 선별된 표적들이 포함된 상층액 부분을 수득하였다. 이를 통해, 긴 길이의 바이오마커를 이의 표적 부분을 포함하는 짧은 길이의 유전자 바이오마커로 변환시켰다.
| 변이 | Primer | 5' modification | sequence(From 5'to 3') | 서열 번호 |
| Del Ex19 | Forward | - | AT CCC AGA AGG TGA GAA AGA TAA AAT TC | 1 |
| Del Ex19 | Reverse | biotin | GGC ACA CGT GGG GGT TGT | 2 |
| L858R | Forward | - | AAG ATC ACA GAT TTT GGG C | 3 |
| L858R | Reverse | biotin | GAT TCC AAT GCC ATC CAC TT | 4 |
| T790M | Forward | - | CTC CAC CGT GCA GCT CAT CA | 5 |
| T790M | Reverse | biotin | CCA AGC GAC GGT CCT CCA AG | 6 |
실시예 2. 그래핀 옥사이드의 합성
1 g의 그래파이트와 50 g의 염화나트륨(NaCl)을 막자사발을 이용해 10분 내지 15분 간 갈아준 후, 염화나트륨을 제거하기 위해 간 그래파이트와 염화나트륨을 물에 넣어 6시간 이상 교반하였다. 뷰흐너 깔때기를 이용해 그래파이트를 걸러내고 80℃의 오븐에서 건조하였다. 건조한 그래파이트에 23 ml의 98% 황산을 넣어 12시간 동안 교반하였다. 이 후 3g의 과망간산칼륨을 넣고 35℃에서 30분간 교반한 뒤, 온도를 70℃로 올려주고 45분간 교반하였다. 그 후 46 ml의 물을 첨가한 뒤 98℃에서 30 분간 교반하고, 140 ml의 물과 10 ml의 30% 과산화수소를 첨가해준 후 1시간 동안 교반하였다. 모든 반응 종료 후 50 ml 튜브에 30 ml를 담고, 20 분간 11000 rpm에서 원심분리하여 한번은 5% 염산에서 3번은 물을 이용하여 세척하였다. 세척한 시료를 20%의 세기로 5분간 tip sonication 하고, 1시간 동안 bath sonication하였다. 그 후 사이즈를 선별하기 위하여 5000 g에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득한 상층액을 11000 rpm에서 60 분간 원심분리한 후 하층 부분을 수득하고, 이를 20 ml 증류수에 분산시켜 그래핀 옥사이드를 재분산하였다.
실시예 3. 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체 제조 및 염 농도에 따른 검출능 확인
3-1. 삼각기둥 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체 제조
상기 실시예 1의 시료 전처리에서 염농도 조건에 따라 상기 실시예 3의 삼각기둥형 형광핵산나노구조체의 핵산 검출능에 영향이 있는지 확인하기 위하여, 자성 비드 반응을 1M 염농도 조건에서 수행한 뒤, 200 mM 내지 1000 mM의 염농도에서 삼각기둥형 형광핵산나노구조체를 제작하여, L858R, T790M 및 Del Ex19을 전처리하여 수득한 표적 핵산에 대한 검출능을 확인하였다. 여기서, L858R, T790M 및 Del Ex19을 전처리하여 수득한 표적 핵산과 같은 길이의 dsDNA를 대조군으로 사용하였다. 구체적으로, 총 4개의 단일가닥으로 구성되고, 삼각기둥의 윗면과 구조체 조립 연결 부분들이 이중가닥으로 구성되어 있으며, 옆면과 그래핀 옥사이드에 연결될 다른 바닥 부분은 단일가닥으로 이루어진 프리즘형(삼각기둥형) 형광나노핵산구조체 (도 2)를 이용하여 L858R, T790M 및 Del Ex19을 검출하기 위해, 상기 실시예 1에서 전처리한 L858R, T790M 및 Del Ex19의 돌연변이 표적 부위에 대한 삼각기둥형 형광나노핵산구조체의 총 4가닥의 단일가닥을 제작하였다. 즉, 이중가닥을 이룰 구조체의 윗면 (삼각기둥의 바닥 중 한 부분)의 서열 U1; 및 표적 서열 c1 (돌연변이를 포함하는 L858R, T790M 또는 Del Ex19를 전처리한 표적 서열), c2 (GAPDH) 및 c3 (야생형 L858R, T790M 또는 Del Ex19를 전처리한 서열)에 상보적인 서열을 포함하는 S1', S2' 및 S3'로 이루어지는 서열들 (표 3)을 전처리된 L858R, T790M 및 Del Ex19에 대해 각각 제작하고 260 nm 파장대에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량한 모든 서열의 몰 비율이 1:1이 되도록 같은 몰수(10 pmol)만큼 넣고, 상기 실시예 1에서 전처리한 시료들을 각각 넣어주었다. 1 batch 당 30 ul가 되도록 볼륨을 맞춰준 후, 중합효소 연쇄반응(PCR) 장비에 넣고, 95℃로 온도를 높이고 5분간 유지하고, 85℃로 온도를 낮춘 뒤 5분간 유지한 후, 1분에 0.5℃씩 온도를 20℃까지 낮춰 5분간 유지하고, 4℃로 온도를 낮추는 열처리를 200 mM 내지 1000 mM의 염농도에서 수행하였다. 제조한 삼각기둥형 형광핵산나노구조체 20 pmol을 실시예 1에서 제조한 그래핀 옥사이드 3μg과 섞고 물과 염(NaCl)을 첨가하여 총 부피가 50 μl가 되도록 하였다. 이 때, 염 농도가 200 mM인 그래핀 옥사이드 용액이 사용되었다. 그 후 30분 동안 25℃에서 반응시켜 그래핀-사면체 형광나노핵산구조체를 제조하였다. 제조된 형광나노핵산구조체의 옆면은 단일가닥으로 이루어진 표적에 상보적인 부분을 포함하고, 삼각기둥의 두 면의 바닥 중 단일가닥으로 이루어진 아랫면이 그래핀 옥사이드 위에 부착된 구조를 이룬다. 제조된 삼각기둥 형광나노핵산구조체를 형광 장비 (plate reader)에 넣고, 각각 FAM, Cy3 및 Cy5에 해당하는 excitation/emission 485nm/525nm, 540nm/570nm 및 640nm/670nm 파장에서 측정하였다. 측정한 Cy5/Cy3 형광 비율을 통해 표적 바이오마커의 돌연변이형/야생형의 비율을 측정하였으며, 형광값을 음성 대조군 (표적이 없는 순수한 삼각기둥형 핵산구조체) 및 양성 대조군 (표적이 100% 첨가된 상태의 삼각기둥형 핵산구조체)을 이용해 정규화하였다.
| (a) L858R 변이 검출을 위한 삼각기둥형 핵산 구조체 | |||||
| 이름 | 5'-sequence-3' | 형광체 | 길이 | 서열 번호 | |
| U1 | TAT GAA GTT CGT CCA TAG ACT GAG CTT AGT ACG TAC AAC CGT GAA CAG GCC AAC ACA GAC ACG GTA AGT ATC CTG TAC ATG CGA | None | 84bp | 7 | |
| S1 | ACG GTT GTA CGT ACT AAG CTC AGT CTA TCC CGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA CCG GAA CCA AGA CAG CCA CAC GGC GAC AAC AGA AGG TA | 5'-FAM | 92bp | 8 | |
| S2 | TAC TTA CCG TGT CTG TGT TGG CCT GTT CCA TCA TAT TTG GCA GGT TTT TCT ACC TTC CGC CGG AAC GCC GGA ACA AGA AGA ACA AGT AGC CG | 5'-Cy3 | 92bp | 9 | |
| S3 | GGA CGA ACT TCA TAT CGC ATG TAC AGG ACC AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTC GGC TAC CGG ACC AGC ACC AAG GCG AGA ACA AGA ACG GTG TC | 5'-Cy5 | 92bp | 10 | |
| C1 (L858R mutation) |
AAG ATC ACA GAT TTT GGG CGG G | None | 22bp | 11 | |
| C2 (GAPDH) |
GAA AAA CCT GCC AAA TAT GAT G | None | 22bp | 12 | |
| C3 (L858R wild type) |
AAG ATC ACA GAT TTT GGG CTG G | None | 22bp | 13 | |
| (b) T790M 변이 검출을 위한 삼각기둥형 핵산 구조체 | |||||
| U1 | TAT GAA GTT CGT CCA TAG ACT GAG CTT AGT ACG TAC AAC CGT GAA CAG GCC AAC ACA GAC ACG GTA AGT ATC CTG TAC ATG CGA | None | 84bp | 14 | |
| S1 | ACG GTT GTA CGT ACT AAG CTC AGT CTA TCA TGA TGA GCT GCA CGG TGG AGG ACA CCG GAA CCA AGA CAG CCA CAC GGC GAC AAC AGA AGG TA | 5'-FAM | 92bp | 15 | |
| S2 | TAC TTA CCG TGT CTG TGT TGG CCT GTT CCA TCA TAT TTG GCA GGT TTT TCT ACC TTC CGC CGG AAC GCC GGA ACA AGA AGA ACA AGT AGC CG | 5'-Cy3 | 92bp | 16 | |
| S3 | GGA CGA ACT TCA TAT CGC ATG TAC AGG ACG TGA TGA GCT GCA CGG TGG AGC GGC TAC CGG ACC AGC ACC AAG GCG AGA ACA AGA ACG GTG TC | 5'-Cy5 | 92bp | 17 | |
| C1 (T790M mutation) |
CTC CAC CGT GCA GCT CAT CAT G | None | 22bp | 18 | |
| C2 (GAPDH) |
GAA AAA CCT GCC AAA TAT GAT G | None | 22bp | 19 | |
| C3 (T790M wild type) |
CTC CAC CGT GCA GCT CAY CAC G | None | 22bp | 20 | |
| (c) Del Ex19 변이 검출을 위한 삼각기둥형 핵산 구조체 | |||||
| U1 | TAT GAA GTT CGT CCA TAG ACT GAG CTT AGT ACG TAC AAC CGT GAA CAG GCC AAC ACA GAC ACG GTA AGT ATC CTG TAC ATG CGA | None | 84bp | 21 | |
| S1 | ACG GTT GTA CGT ACT AAG CTC AGT CTA TTT TCG GAG ATG TCT TGA TAG CGG ACA CCG GAA CCA AGA CAG CCA CAC GGC GAC AAC AGA AGG TA | 5'-FAM | 92bp | 22 | |
| S2 | TAC TTA CCG TGT CTG TGT TGG CCT GTT CCA TCA TAT TTG GCA GGT TTT TCT ACC TTC CGC CGG AAC GCC GGA ACA AGA AGA ACA AGT AGC CG | 5'-Cy3 | 92bp | 23 | |
| S3 | GGA CGA ACT TCA TAT CGC ATG TAC AGG AAT GTT GCT TCT CTT AAT TCC TTC GGC TAC CGG ACC AGC ACC AAG GCG AGA ACA AGA ACG GTG TC | 5'-Cy5 | 92bp | 24 | |
| C1 (Del Ex19 mutation) |
AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA T | None | 22bp | 25 | |
| C2 (GAPDH) |
GAA AAA CCT GCC AAA TAT GAT G | None | 22bp | 26 | |
| C3 (Del Ex19 wildtype) |
CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA A | None | 22bp | 27 | |
그 결과, 200 mM 내지 1000 mM의 염 농도가 형광값 분석에 미치는 영향이 없었는 것으로 나타났다 (도 3 및 4). 모든 전처리 과정이 마무리된 샘플들은 1000 mM 염 농도를 가지므로, 전처리된 샘플을 많이 사용하고자 할수록 삼각기둥형 형광핵산나노구조체와 전처리가 완료된 샘플을 반응시킬 때 용액의 염 농도가 높아진다. 1000 mM 농도보다 낮은 용액에서 반응시키는 경우 처리할 수 있는 샘플의 양이 제한되고, 샘플을 많이 사용할수록 큰 형광 값을 얻을 수 있어 유리하므로, 1000 mM 농도에서 샘플과 형광핵산나노구조체를 합성하는 것을 가장 최적의 조건으로 수립하였다.
3-2. 사면체 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체 제조
상기 실시예 3-1에서와 같이 L858R, T790M 및 Del Ex19을 전처리하여 수득한 표적 핵산에 특이적이나, 구조적으로는 사면체의 바닥면이 이중가닥을 이루고, 옆면과 그래핀 옥사이드에 연결될 부분은 단일가닥으로 이루어진 사면체형 형광나노핵산구조체 (도 5)를 합성하고, 중합효소 연쇄반응(PCR) 장비에서, 95℃로 온도를 높이고 2분간 유지하고, 60℃로 온도를 낮춘 뒤 1분에 1℃씩 온도를 20℃까지 낮추고, 5분간 20℃를 유지한 후, 4℃로 온도를 낮추는 열처리를 수행하여 제작한 뒤 그래핀 옥사이드에 부착하였다. 사면체 형광핵산나노구조체는 총 4가닥의 단일가닥은 이중가닥을 이룰 구조체의 윗면 (사면체의 바닥 부분)의 서열 U1 (S1, S2 및 S3 각각에 상보적인 서열들로 이루어짐); 및 각각의 표적 서열 c1, c2 및 c3에 상보적인 서열을 포함하는 S1, S2 및 S3로 이루어지며, 제작된 사면체 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체는 사면체의 바닥이 위로 올라간 구조에서 옆면의 표적에 상보적인 단일가닥 부분과, S1 가닥의 아데닌 서열 (poly A)이 길게 빠져나와 그래핀 옥사이드에 부착된 형태를 이룬다.
실시예 4. 표적 농도에 따른 검출 확인
4-1. 검출 한계 측정
상기 실시예서 최적화된 염농도인 1000 mM에서 3가지 표적 바이오마커인 Del Ex19, L858R 및 T790M의 검출 한계값을 측정하였다. 이를 위해 표적 농도를 5 내지 200 nM로 조절하여 농도별 형광 세기를 측정하였으며, 검출한계는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)사에서 출시한 가이드라인 EP17에 의하여 계산되었다. 또한, 이때의 Cy5/Cy3 형광값을 확인하고 정규화하였다. 아울러, 표적 농도에 따른 Cy5/Cy3 형광값의 비율을 분석하였다.
그 결과, 야생형의 경우 Cy3형광값이 표적 서열의 농도가 높아짐에 따라 선형적으로 증가하였으나, 돌연변이형의 경우 Cy5형광값이 표적 서열의 농도가 높아짐에 따라 선형적으로 증가하였다 (도 6). 또한, 도 6에서 측정된 형광값의 추세선 식과 이때 얻어지는 검출 한계값을 나타낸 결과, 추세선은 0.95이상의 R2을 보이므로 선형성을 나타내는 것을 알 수 있었다 (도 7). 아울러, 표적 농도에 따른 Cy5/Cy3 형광값의 비율을 확인한 결과, 10 nM이상의 농도 수준부터 야생형과 돌연변이형의 차이에 대한 통계적 유의성이 0.05이하로 떨어져, Cy5/Cy3 형광값의 차이를 통해 돌연변이의 존재 여부를 측정할 수 있다는 것을 알 수 있었다 (도 8).
4-2. 돌연변이 선별능 확인
표적 서열의 돌연변형/야생형 비율에 따른 형광값의 변화를 확인하기 위하여, 구체적으로, 전처리한 전체 표적의 농도는 200 nM로 고정하고 돌연변이를 가진 표적의 비율을 0 내지 100%까지 변화시키면서 Cy3 형광값 및 Cy5형광값을 정규화하였다. 또한, 측정한 Cy5/Cy3 형광값을 이용하여 200 nM의 표적에서 식별 가능한 최소한의 돌연변이 비율을 계산하였다.
그 결과, 돌연변이의 비율이 높아질수록 정규화한 Cy3 형광값은 감소하였으며, 정규화된 Cy5 형광값은 증가하는 경향을 나타냈다 (도 9). 또한, Cy5/Cy3 형광값은 돌연변이 비율이 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였으며, 이는 선형적으로 관찰되었다. 또한, 200 nM의 표적에서 식별 가능한 최소한의 돌연변이 비율은 최소 0.25%의 mutant 만을 선별적으로 구분 가능한 것으로 나타났다 (도 10).
실시예 5. 표적 길이에 따른 검출능 확인
상기 실시예 3-1에서 제작한 삼각기둥형 형광핵산나노구조체를 이용하여, Del Ex19 변이를 포함하는 표적 서열의 길이를 22 내지 150 nt (bp)로 조절함에 따른 Cy5/Cy3 형광 비율을 관찰하였다.
본 발명의 삼각기둥형 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체는 야생형을 첨가했을 때에는 낮은 Cy5/Cy3 형광값을 보이고, 돌연변이형을 첨가했을 때에는 반대로 높은 Cy5/Cy3 형광값을 보이도록 디자인되어 있으나, 표적 서열의 길이가 길어질수록(75nt에 가까워질수록) 야생형을 넣었을 때 Cy5/Cy3 형광 비율이 높아졌으며, 돌연변이형을 넣은 경우 에는 Cy5/Cy3 값이 낮아지는 현상이 발생하였다 (도 11). 특히, 75 내지 100 nt(bp) 이상의 길이를 갖는 경우에는 야생형과 돌연변이 모두에서, 급격한 감소가 관찰되었다. 이는 길이가 길어질수록 표적 부위를 제외한 미반응 부분들이 표적 서열과 삼각기둥형 형광핵산나노구조체와의 반응을 저해하는 것으로 유추된다.
또한, 3nt 단위의 16 내지 43 nt(bp)의 길이를 갖는 단일가닥 또는 이중가닥의 Del Ex19 돌연변이 표적을 대상으로 Cy5/Cy3 형광비를 확인하여, 표적의 길이를 보다 최적화하였다(표 4). 도 12에 도시된 바와 같이, 단일가닥 DNA(ssDNA)는 16-43 nt(bp) 범위에서 구별가능한 Cy5/Cy3 형광비를 나타내며, 이중가닥 DNA(dsDNA)는 16-28nt (bp) 범위에서, 구별가능한 Cy5/Cy3 형광비를 나타냈다. DNA의 경우, dsDNA는 상보서열과 프로브가 경쟁적으로 결합하므로, 검출효율이 단일가닥에 비해 낮다.
| 표적 | 길이 | 구분 | 5'-sequence-3' | 서열 번호 |
| Del Ex19 Mutant | 16bp | Target | TAT CAA GAC ATC TCC G | 28 |
| Complementary | CGG AGA TGT CTT GAT A | 29 | ||
| 19bp | Target | CTA TCA AGA CAT CTC CG AA | 30 | |
| Complementary | TTC GGA GAT GTC TTG ATA G | 31 | ||
| 22bp | Target | CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA A | 32 | |
| Complementary | TTT CGG AGA TGT CTT GAT AGC G | 33 | ||
| 25bp | Target | GTC GCT ATC AAG ACA TCT CCG AAA G | 34 | |
| Complementary | CTT TCG GAG ATG TCT TGA TAG CGA C | 35 | ||
| 28bp | Target | CGT CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA AGC C | 36 | |
| Complementary | GGC TTT CGG AGA TGT CTT GAT AGC GAC G | 37 | ||
| 31bp | Target | CCC GTC GCT ATC AAG ACA TCT CCG AAA GCC A | 38 | |
| Complementary | TGG CTT TCG GAG ATG TCT TGA TAG CGA CGG G | 39 | ||
| 34bp | Target | TCC CGT CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA AGC CAA C |
40 | |
| Complementary | GTT GGC TTT CGG AGA TGT CTT GAT AGC GAC GGG A | 41 | ||
| 37bp | Target | ATT CCC GTC GCT ATC AAG ACA TCT CCG AAA GCC AAC A | 42 | |
| Complementary | TGT TGG CTT TCG GAG ATG TCT TGA TAG CGA CGG GAA T | 43 | ||
| 40bp | Target | AAT TCC CGT CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA AGC CAA CAA G | 44 | |
| Complementary | CTT GTT GGC TTT CGG AGA TGT CTT GAT AGC GAC GGG AAT T | 45 | ||
| 43bp | Target | AAA ATT CCC GTC GCT ATC AAG ACA TCT CCG AAA GCC AAC AAG G | 46 | |
| Complementary | CCT TGT TGG CTT TCG GAG ATG TCT TGA TAG CGA CGG GAA TTT T | 47 | ||
| Del Ex19 Mutant |
50bp | Target | GTT AAA ATT CCC GTC GCT ATC AAG ACA TCT CCG AAA GCC AAC AAG GAA AT | 48 |
| 75bp | Target | GAA GGT GAG AAA GTT AAA ATT CCC GTC GCT ATC AAG ACA TCT CCG AAA GCC AAC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC | 49 | |
| 100bp | Target | ACT CTG GAT CCC AGA AGG TGA GAA AGT TAA AAT TCC CGT CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA AGC CAA CAA GGA AAT CCT CGA TGA AGC CTA CGT GAT GGC C | 50 | |
| 125bp | Target | GGT GTA TAA GGG ACT CTG GAT CCC AGA AGG TGA GAA AGT TAA AAT TCC CGT CGC TAT CAA GAC ATC TCC GAA AGC CAA CAA GGA AAT CCT CGA TGA AGC CTA CGT GAT GGC CAG CGT GGA CAA CC | 51 | |
| 150bp | Target | GTG CGT TCG GCA CGG TGT ATA AGG GAC TCT GGA TCC CAG AAG GTG AGA AAG TTA AAA TTC CCG TCG CTA TCA AGA CAT CTC CGA AAG CCA ACA AGG AAA TCC TCG ATG AAG CCT ACG TGA TGG CCA GCG TGG ACA ACC CCC ACG TGT GCC | 52 | |
| Del Ex19 야생형(WT) |
22bp | Target | AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA T | 53 |
| 50bp | Target | TTC CCG TCG CTA TCA AGG AAT TAA GAG AAG CAA CAT CTC CGA AAG CCA AC | 54 | |
| 75bp | Target | AGA AAG TTA AAA TTC CCG TCG CTA TCA AGG AAT TAA GAG AAG CAA CAT CTC CGA AAG CCA ACA AGG AAA TCC TCG | 55 | |
| 100bp | Target | ATC CCA GAA GGT GAG AAA GTT AAA ATT CCC GTC GCT ATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCC AAC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC TAC G | 56 | |
| 125bp | Target | AAG GGA CTC TGG ATC CCA GAA GGT GAG AAA GTT AAA ATT CCC GTC GCT ATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCC AAC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC TAC GTG ATG GCC AGC GT | 57 | |
| 150bp | Target | T GTA TAA GGG ACT CTG GAT CCC AGA AGG TGA GAA AGT TAA AAT TCC CGT CGC TAT CAA GGA ATT AAG AGA AGC AAC ATC TCC GAA AGC CAA CAA GGA AAT CCT CGA TGA AGC CTA CGT GAT GGC CAG CGT GGA CAA CCC CCA CGT GTG CC | 58 |
* 이중가닥 표적은 target 및 complementary 모두 포함* mutant의 50bp 내지 150bp 및 WT의 22내지 150bp는 단일가닥 표적
실시예 6. 폐암세포주에서의 변이 검출 확인
본 발명의 표 3의 Del Ex19 및 L858R 변이 검출을 위한 삼각기둥형 형광핵산나노구조체를 이용하여 실시예 3-1에서 제작한 삼각기둥 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 이용하여 3 가지 폐암세포주 (A549, H1975 및 PC-9)와 L858R 돌연변이 형질전환(mutation transformed) 3T3 세포에서의 Del Ex19 변이 검출능을 확인하였다. 구체적으로, 상기 4 가지 세포주에서 RNA를 추출하고, 이를 역전사한 뒤 상기 실시예 1에서와 같이 시료 전처리를 진행하였다. 이 때 Del Ex19에 특화된 프라이머 (표 2)를 사용하였다. 그 후 최종적으로 얻어지는 전처리한 시료를 1 batch 당 600 ng씩 넣고 삼각기둥형 형광핵산나노구조체와 함께 합성하였다. 여기서, 대조군으로는 전처리하지 않은 RNA를 사용하였다. 또한, 상기 4 종의 세포주에서 추출한 RNA의 PCR, 제한효소 처리 (RE) 및 스트렙타비딘-비오틴 결합을 이용한 표적 서열 정제 과정을 12% 폴리아크릴아마이드를 이용한 전기영동으로 확인하였다.
그 결과, 전처리를 하지 않은 긴 시료를 그대로 사용한 경우에는 Cy5/Cy3 형광값이 전체적으로 높게 나와 (삼각기둥형의 형광핵산나노구조체의 변이 없음) 각 값의 차이가 통계적으로 유의하지 않았던 반면, 전처리를 통해 짧은 서열로 정제 및 선별된 시료를 이용한 경우에는 실제로 Del Ex19 변이를 가지는 PC-9세포에서 제일 큰 값의 Cy5/Cy3 형광값이 측정되었고, p 값이 0.01이하로 통계적 유의성을 나타냈다 (도 13 상단). 또한, 전처리를 통한 표적 서열 정제 과정을 확인한 결과, PCR, 및 제한효소 과정을 거친 시료에 비하여 표적 서열을 선별한 과정을 거친 시료가 높은 Cy5/Cy3형광을 나타냈으며, 이는 통계적 유의성이 있는 것으로 나타났다 (도 13 하단). 또한, L858R 변이의 경우, 전처리를 통한 표적 서열 정제 과정이후에 실제 H1975 세포 및 L858R 돌연변이 형질전환(mutation transformed) 3T3 세포에서 제일 큰 값의 Cy5/Cy3 형광값이 측정되었다. 또한 p 값은 0.01이하로 통계적 유의성을 나타냈다 (도 14).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Progeneer Inc.
<120> MULTIPLEXED DETECTION METHOD OF BIOMARKERS
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<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-Foward primer
<400> 1
atcccagaag gtgagaaaga taaaattc 28
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-Reverse primer(5'-biotin)
<400> 2
ggcacacgtg ggggttgt 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R-Forward primer
<400> 3
aagatcacag attttgggc 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R-Reverse primer(5'-biotin)
<400> 4
gattccaatg ccatccactt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M-Forward primer
<400> 5
ctccaccgtg cagctcatca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M-Reverse primer(5'-biotin)
<400> 6
ccaagcgacg gtcctccaag 20
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<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R-U1
<400> 7
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acggtaagta tcctgtacat gcga 84
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<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R-S1
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<212> DNA
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<223> L858R-S2
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<223> L858R-C2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R-C3
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<223> T790M-S1
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M-S3
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-U1
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<220>
<223> Del Ex19-S1
<400> 22
acggttgtac gtactaagct cagtctattt tcggagatgt cttgatagcg gacaccggaa 60
ccaagacagc cacacggcga caacagaagg ta 92
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<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-S2
<400> 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-S3
<400> 24
ggacgaactt catatcgcat gtacaggaat gttgcttctc ttaattcctt cggctaccgg 60
accagcacca aggcgagaac aagaacggtg tc 92
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-C1
<400> 25
aaggaattaa gagaagcaac at 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19-C2
<400> 26
gaaaaacctg ccaaatatga tg 22
<210> 27
<211> 22
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<223> Del Ex19 Mut-Target(16bp)
<400> 28
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<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(16bp)
<400> 29
cggagatgtc ttgata 16
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(19bp)
<400> 30
ctatcaagac atctccgaa 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(19bp)
<400> 31
ttcggagatg tcttgatag 19
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(22bp)
<400> 32
cgctatcaag acatctccga aa 22
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(22bp)
<400> 33
tttcggagat gtcttgatag cg 22
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(25bp)
<400> 34
gtcgctatca agacatctcc gaaag 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(25bp)
<400> 35
ctttcggaga tgtcttgata gcgac 25
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(28bp)
<400> 36
cgtcgctatc aagacatctc cgaaagcc 28
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(28bp)
<400> 37
ggctttcgga gatgtcttga tagcgacg 28
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(31bp)
<400> 38
cccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc a 31
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(31bp)
<400> 39
tggctttcgg agatgtcttg atagcgacgg g 31
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(34bp)
<400> 40
tcccgtcgct atcaagacat ctccgaaagc caac 34
<210> 41
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(34bp)
<400> 41
gttggctttc ggagatgtct tgatagcgac ggga 34
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(37bp)
<400> 42
attcccgtcg ctatcaagac atctccgaaa gccaaca 37
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(37bp)
<400> 43
tgttggcttt cggagatgtc ttgatagcga cgggaat 37
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(40bp)
<400> 44
aattcccgtc gctatcaaga catctccgaa agccaacaag 40
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(40bp)
<400> 45
cttgttggct ttcggagatg tcttgatagc gacgggaatt 40
<210> 46
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Target(43bp)
<400> 46
aaaattcccg tcgctatcaa gacatctccg aaagccaaca agg 43
<210> 47
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mut-Complementary(43bp)
<400> 47
ccttgttggc tttcggagat gtcttgatag cgacgggaat ttt 43
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mutant-Target(50bp)
<400> 48
gttaaaattc ccgtcgctat caagacatct ccgaaagcca acaaggaaat 50
<210> 49
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mutant-Target(75bp)
<400> 49
gaaggtgaga aagttaaaat tcccgtcgct atcaagacat ctccgaaagc caacaaggaa 60
atcctcgatg aagcc 75
<210> 50
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mutant-Target(100bp)
<400> 50
actctggatc ccagaaggtg agaaagttaa aattcccgtc gctatcaaga catctccgaa 60
agccaacaag gaaatcctcg atgaagccta cgtgatggcc 100
<210> 51
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mutant-Target(125bp)
<400> 51
ggtgtataag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa 60
gacatctccg aaagccaaca aggaaatcct cgatgaagcc tacgtgatgg ccagcgtgga 120
caacc 125
<210> 52
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 Mutant-Target(150bp)
<400> 52
gtgcgttcgg cacggtgtat aagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc 60
ccgtcgctat caagacatct ccgaaagcca acaaggaaat cctcgatgaa gcctacgtga 120
tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc 150
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 WT-Target(22bp)
<400> 53
aaggaattaa gagaagcaac at 22
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 WT-Target(50bp)
<400> 54
ttcccgtcgc tatcaaggaa ttaagagaag caacatctcc gaaagccaac 50
<210> 55
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 WT-Target(75bp)
<400> 55
agaaagttaa aattcccgtc gctatcaagg aattaagaga agcaacatct ccgaaagcca 60
acaaggaaat cctcg 75
<210> 56
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 WT-Target(100bp)
<400> 56
atcccagaag gtgagaaagt taaaattccc gtcgctatca aggaattaag agaagcaaca 60
tctccgaaag ccaacaagga aatcctcgat gaagcctacg 100
<210> 57
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 WT-Target(125bp)
<400> 57
aagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat caaggaatta 60
agagaagcaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgaagccta cgtgatggcc 120
agcgt 125
<210> 58
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del Ex19 WT-Target(150bp)
<400> 58
tgtataaggg actctggatc ccagaaggtg agaaagttaa aattcccgtc gctatcaagg 60
aattaagaga agcaacatct ccgaaagcca acaaggaaat cctcgatgaa gcctacgtga 120
tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc 150
Claims (19)
1) 시료로부터 분리된 핵산을 전처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 선별하는 단계;
2) 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 선별된 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 반응시켜 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커 검출 방법으로,
상기 형광핵산나노구조체는 삼각기둥형 또는 사면체 형이며,
상기 바이오마커는 변이를 포함하고,
상기 선별된 표적 핵산은 16 내지 43bp 길이의 단일가닥 또는 16 내지 28bp길이의 이중가닥 핵산인 것을 특징으로 하는 바이오마커의 검출 방법.
2) 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 선별된 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체를 반응시켜 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 바이오마커 검출 방법으로,
상기 형광핵산나노구조체는 삼각기둥형 또는 사면체 형이며,
상기 바이오마커는 변이를 포함하고,
상기 선별된 표적 핵산은 16 내지 43bp 길이의 단일가닥 또는 16 내지 28bp길이의 이중가닥 핵산인 것을 특징으로 하는 바이오마커의 검출 방법.
제 1항에 있어서, 핵산의 전처리는:
a) 바이오마커에서 핵산 변이체가 발생하는 위치를 포함하는 표적 핵산 영역을 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머로 분리한 핵산을 증폭하는 단계; 및
b) 증폭된 결과물에 제한효소를 처리하고, 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 코팅된 자성입자를 처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 획득하는 단계를 포함하며, 상기 프라이머는 제한효소 인지 서열(restriction enzyme site)을 포함하는, 바이오마커 검출 방법.
a) 바이오마커에서 핵산 변이체가 발생하는 위치를 포함하는 표적 핵산 영역을 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머로 분리한 핵산을 증폭하는 단계; 및
b) 증폭된 결과물에 제한효소를 처리하고, 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 코팅된 자성입자를 처리하여 바이오마커의 표적 핵산을 획득하는 단계를 포함하며, 상기 프라이머는 제한효소 인지 서열(restriction enzyme site)을 포함하는, 바이오마커 검출 방법.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커를 다중 검출하는, 바이오마커 검출 방법.
삭제
제1항에 있어서, 삼각기둥형 형광핵산나노구조체는 하기를 포함하는, 바이오마커 검출 방법:
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 핵산 서열 A3a 및 핵산 서열 A3b로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4 및 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 A3a 및 A3b와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6 및 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열을 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 핵산 서열 A3a 및 핵산 서열 A3b로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4 및 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 A3a 및 A3b와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6 및 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열을 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
제1항에 있어서, 사면체형 형광핵산나노구조체는 하기를 포함하는, 바이오마커 검출 방법:
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 B4, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6를 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 B4, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6를 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
제1항에 있어서, 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체는 선별한 표적 핵산, 제 1 핵산 U1, 제 2 핵산 S1, 제 3 핵산 S2 및 제 4 핵산 S3을 혼합한 뒤 열처리하여 형광핵산나노구조체를 제조한 뒤 그래핀 옥사이드에 부착하여 제조되는, 바이오마커 검출 방법.
제1항에 있어서, 표적 핵산 검출은 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer) 현상으로 형광을 검출하는, 바이오마커 검출 방법.
제1항에 있어서, 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA 및 RNA인, 바이오마커 검출 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 선별된 표적 핵산은 바이오마커의 변이가 발생하는 위치를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출 방법.
제1항에 있어서, 표적 핵산과 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체의 형광핵산나노구조체가 반응하면 이중결합이 형성되어 그래핀 옥사이드로부터 거리가 멀어져 형광물질의 발광이 검출되는, 바이오마커 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 변이는 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출 방법.
삭제
삭제
제한효소 인지 서열을 포함하며, 바이오마커 내의 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머 및 5' 말단에 비오틴이 결합된 역방향 프라이머;
제한효소;
스트렙타비딘으로 코팅된 자성입자;
형광핵산나노구조체; 및
그래핀 옥사이드를 포함하는 바이오마커 검출 키트로,
상기 형광핵산나노구조체는 삼각기둥 형 또는 사면체 형이며,
상기 바이오마커는 변이를 포함하고,
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 바이오마커를 증폭하고 상기 제한효소를 처리할 때, 16 내지 43bp 길이의 단일가닥 표적 핵산 또는 16 내지 28bp 길이의 이중가닥 표적 핵산이 제조되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출 키트.
제한효소;
스트렙타비딘으로 코팅된 자성입자;
형광핵산나노구조체; 및
그래핀 옥사이드를 포함하는 바이오마커 검출 키트로,
상기 형광핵산나노구조체는 삼각기둥 형 또는 사면체 형이며,
상기 바이오마커는 변이를 포함하고,
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 바이오마커를 증폭하고 상기 제한효소를 처리할 때, 16 내지 43bp 길이의 단일가닥 표적 핵산 또는 16 내지 28bp 길이의 이중가닥 표적 핵산이 제조되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출 키트.
삭제
제16항에 있어서, 삼각기둥형 형광핵산나노구조체는 하기를 포함하는, 바이오마커 검출 키트:
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 핵산 서열 A3a 및 핵산 서열 A3b로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4 및 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 A3a 및 A3b와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6 및 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열을 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 핵산 서열 A3a 및 핵산 서열 A3b로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4 및 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 A3a 및 A3b와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6 및 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열을 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
제16항에 있어서, 사면체형 형광핵산나노구조체는 하기를 포함하는, 바이오마커 검출 키트:
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 B4, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6를 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2 및 핵산 서열 A3로 이루어진 제 1 핵산 U1;
2) 제 1 형광물질, 핵산 서열 B1, 핵산 서열 A1과 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B2, 제 1 바이오마커의 표적 핵산 c1과 상보적인 핵산 서열 및 핵산 서열 B3를 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 S1;
3) 제 2 형광물질, 핵산 서열 B4, 핵산 서열 A2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B1과 상보적인 핵산 서열, 제 2 바이오마커의 표적 핵산 c2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B5를 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 S2; 및
4) 제 3 형광물질, 핵산 서열 B2와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 A3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B4와 상보적인 핵산 서열, 제 3 바이오마커의 표적 핵산 c3와 상보적인 핵산 서열, 핵산 서열 B6를 순차적으로 포함하는 제 4 핵산 S3.
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