KR102393079B1

KR102393079B1 - 가축 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102393079B1
Application number: KR1020200025053A
Authority: KR
Inventors: 이창훈; 민용기
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: KR20210109886A

Abstract

본 발명은 가축 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 기관세포, 폐동맥 혈관세포에서 LPA에 의하여 유도되는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고, ZO-1 단백질 손실과 혈관신생을 완화하는 LPA 길항제로서, (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol을 포함하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물을 제공한다.

Description

가축 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating respiratory disease of domestic animals}

본 발명은 동물 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

동물에 있어서 호흡기 질환 (respiratory disease)은 흔한 질병이다. 특히 젖소, 육우, 돼지, 닭 등의 가축 및 개, 고양이로 대표되는 애완동물에 있어서, 빈번히 발생하며, 이의 치료를 위하여 비용 또한 많이 소모된다 (Snowder, G.D. 등; 2006).

가축 호흡기 질환은 미생물 감염 뿐만 아니라, 높은 사육밀도로 인한 스트레스 등과 같은 다양한 환경 요인에 의해 발생한다. 특히 밀폐된 사육공간에 있는 암모니아 가스, 이산화탄소 및 먼지 등에 의해서 가축 호흡기 질환이 쉽게 유발되며, 이러한 환경적 스트레스는 미생물 감염의 기회 또한 높이게 된다.

돼지 호흡기 복합감염증(PRDC, porcine respiratory disease complex)은 육돈 및 비육돈에 발생하며, 발육부진, 사료효율 저하, 무기력, 식욕부진, 발열, 기침, 호흡장애를 특징으로 한다. 돼지 호흡기 복합감염증은 돼지 호흡기 생식기 증후군 바이러스(PRRSV), 액티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacilus pleurpneumoniae) 등과 같은 바이러스, 세균 등의 혼합감염에 의해 발생하며, 사육 환경이 불량하거나 밀집 사육 상태에서 흔히 발병되어, 폐사를 비롯한 발육지연과 사료효율의 저하를 가져와 양돈업에 많은 경제적 손실을 준다.

소 호흡기 질환(bovine respiratory disease, BRD)은 소 헤르페스 바이러스 제1형(BHV-1), 감염성 소 비기관염 바이러스(infectious bovine rhinotracheitis virus; IBR) 등에 의해 유발되며, 전 세계적으로 육우사육과 낙농분야에 커다란 영향을 미치고 있다.

BRD 호흡기 질환의 호흡기계의 증상은 염증, 종창, 출혈, 호흡기관 점막의 괴사를 특징으로 하고 고열, 식욕감퇴, 침울, 콧물, 호흡곤란, 코와 입의 염증을 동반할 수 있으며, 감염 바이러스의 종류에 따라 유산을 일으킬 수 있다 (Ellis 등, 1996).

이러한 가축 호흡기 질환은 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, LPA)과 같은 면역계와 관련된 내인성 인자가 중요한 역할을 한다. LPA는 많은 질병에서 염증을 일으키는 강력한 내인성 인자로, 널리 분포된 G단백질 결합수용체를 통해 강력한 마이토겐(mitogen)으로 작용하는 인지질 유도체이다. LPA는 리소포스파티딜콜린(lysophospatidylcholene)으로부터 콜린기를 제거하는 리소포스파타제 D인 오토탁신(autotaxin), 또는 포스파티딘산(phosphatidic acid)의 합성에 의하여 생성된다 (Zhao, Y. 등, 2013; Knowlden, S. 등, 2014; Noguchi, K. 등, 2009; Chen, J. 등, 2008). 중요한 점은 LPA가 LPA와 같은 내인성 인자에 의한 호흡기 질환 뿐만아니라, 먼지, 공기오염 및 미생물에 의한 특발성 폐 섬유증 치료의 표적이 되는 등, 가축의 많은 호흡기 질환에서 중요한 역할을 한다는 것이다 (Zhao, Y 등, 2013).

LPA는 막 인지질 대사의 중간 생성물로, 다양한 염증성 사이토카인의 생성과 관련 있으며(Kempf K. 등, 2006), TNF-α의 mRNA 발현을 유도하고 TNF-α의 합성 및 방출을 촉진한다 (Meilleur MA 등, 2007; Duoduo Zhang 등, 2016). 또한 LPA는 마우스의 피부에서 인터루킨-6의 생성을 증가시키는 것이 보고되었다 (Flavia V. Castelino 등, 2016).

한편, 병원성 혈관 신생은 호흡기 질환을 포함하는 염증질환에 중요하며(Rivera Lopez 등, 2008; Gustin, C. 등, 2008), LPA는 여러 질병에서 병원성 혈관 신생의 강력한 자극인자로 작용하고 있다 (Kano, K. 등, 2008; Lin, C.I. 등, 2008).

본 발명의 발명자들은 세포기반 고효율 스크리닝방법(cell-based high-throughput screening, HTS)을 이용하여 LPA 신호전달의 길항제를 확인하는 과정에서 소의 기관세포에서 LPA에 의해 유도된 염증성 사이토카인 생산을 완화시키는 효과를 갖는 LPA 신호전달 길항제를 확인하고 본 발명을 완성하였다. 또한 본 발명에서 확인한 LPA 신호전달 길항제는 소의 기관 세포에서 세포 접합물질의 손실을 완화하는 것을 확인하였다.

한국등록특허 제1875246호는 LPA1 길항제로 1-{4'-[3-메틸-4-((R)-1-페닐-에톡시카르보닐아미노)-이속사졸-5-일]-비페닐-4-일}-시클로프로판카르복실산 (화합물 1) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 개시하고 있으나, 본 발명에서 확인한 LPA 신호전달의 길항제와 차이가 있다.

한국공개특허 제20190020049호는 선택적 LPA 수용체 억제제로 카르바모일옥시메틸 트리아졸 시클로헥실 산을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1628706호는 리소포스파티드산 수용체의 폴리시클릭 길항제를 개시하고 있으나, 이 역시 본 발명에서 확인한 LPA 신호전달의 길항제와 차이가 있으며, 동물 호흡기 질환에서 LPA 길항제로서의 본 발명과는 차이가 있다.

한국등록특허 제1875246호, 폴리시클릭 LPA₁ 길항제 및 그의 용도, 2018.06.29. 등록. 한국공개특허 제20190020049호, LPA 길항제로서의 카르바모일옥시메틸 트리아졸 시클로헥실 산, 2019.02.27. 공개. 한국등록특허 제1628706호, 리소포스파티드산 수용체의 폴리시클릭 길항제, 2016.06.02. 등록.

Snowder, G.D.; Van Vleck, L.D.; Cundiff, L.V.; Bennett, G.L. Bovine respiratory disease in feedlot cattle: Environmental, genetic, and economic factors. J. Anim. Sci. 2006, 84: 1999-2008 Ellis et al. (1996) JAVMA 208:393-400; Ellsworth et al.(1994) In: Proceedings, 74th Conference of Research Workers in Animal Disease:34 Zhao, Y.; Natarajan, V. Lysophosphatidic acid (LPA) and its receptors: Role in airway inflammation and remodeling. Biochim. Biophys. Acta 2013, 1831: 86-92. Knowlden, S.; Georas, S.N. The autotaxin-LPA axis emerges as a novel regulator of lymphocyte homing and inflammation. J. Immunol. 2014, 192, 851-857. Noguchi, K.; Herr, D.; Mutoh, T.; Chun, J. Lysophosphatidic acid (LPA) and its receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 2009, 9: 15-23. Chen, J.; Chen Y.; Zhu W.; Han Y.; Han B.; Xu R.; Deng L.; Cai Y.; Cong X.; Yang Y.; Hu S.; Chen X. Specific LPA receptor subtype mediation of LPA-induced hypertrophy of cardiac myocytes and involvement of Akt and NFkappaB signal pathways. J. Cell. Biochem. 2008, 103: 1718-1731. Rivera, Lopez, C.M.; Tucker, A.L.; Lynch, K.R. Lysophosphatidic acid (LPA) and angiogenesis. Angiogenesis, 2008, 11: 301-310. Gustin, C.; Van Steenbrugge, M.; Raes, M. LPA modulates monocyte migration directly and via LPA-stimulated endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008, 295, C905-914. Kano, K.; Arima, N.; Ohgami, M.; Aoki, J. LPA and its analogs-attractive tools for elucidation of LPA, biology and drug development. Curr. Med. Chem. 2008, 15: 2122-2131. Lin, C.I.; Chen, C.N.; Huang, M.T.; Lee, S.J.; Lin, C.H.; Chang, C.C.; Lee, H. Lysophosphatidic acid upregulates vascular endothelial growth factor-C and tube formation in human endothelial cells through LPA(1/3), COX-2, and NF-kappaB activation- and EGFR transactivation-dependent mechanisms. Cell, Signal. 2008, 20: 1804-1814. Kempf K, Haltern G, Futh R, Herder C, Muller-Scholze S, Gulker H and Martin S: Increased TNF-alpha and decreased TGF-beta expression in peripheral blood leukocytes after acute myocardial infarction. Horm Metab Res. 2006, 38: 346-351. Meilleur MA, Akpovi CD, Pelletier RM and Vitale ML: Tumor necrosis factor-alpha-induced anterior pituitary folliculostellate TtT/GF cell uncoupling is mediated by connexin 43 dephosphorylation. Endocrinology. 2007, 148: 5913-5924. Duoduo Zhang, Yan Zhang, Chunyan Zhao, Wenjie Zhang, Guoguang Shao, Hong Zhang: Effect of lysophosphatidic acid on the immune inflammatory response and the connexin 43 protein in myocardial infarction, Experimental and Therapeutic Medicine, 2006, 11(5): 1617-1624. Flavia V. Castelino, Gretchen Bain, Veronica A. Pace, B.S., Katharine E. Black, Leaya George, Clemens K. Probst, Lance Goulet, Robert Lafyatis, Andrew M. Tager, An Autotaxin-LPA-IL-6 Amplification Loop Drives Scleroderma Fibrosis, Arthritis Rheumatol., 2016, 68(12): 2964-2974. Ingvild J Brusevold1, Ingun H Tveteraas, Monica Aasrum, John Ødegard, Dagny L Sandnes, Thoralf Christoffersen, Role of LPAR3, PKC and EGFR in LPA-induced cell migration in oral squamous carcinoma cells, r 2014, 14:432

본 발명의 목적은 가축 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 가축 호흡기 내의 염증성 사이토카인의 증가를 완화시키는 가축 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 가축 호흡기 염증 질환 개선용 동물 사료를 제공하는 데 있다.

본 발명은 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol(이하 KA-1002로 기재)을 포함하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물을 제공한다.

상기 KA-1002는 LPA(Lysophosphatidic Acid)의 길항제로 작용하는 것일 수 있으며, 상기 KA-1002의 LPA 길항작용은 LPAR1(LPA Receptor1)을 매개로 하는 것일 수 있다.

상기 KA-1002는 LPA에 의하여 유도되는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것일 수 있으며, 상기 LPA에 의하여 유도되는 염증성 사이토카인은 TNFα(tumor necrosis factor-α), IL-1β(Interleukin-1β) 및 IL-6(Interleukin 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있다.

상기 KA-1002는 LPA 길항작용은 LPA에 의하여 유도되는 혈관신생을 억제함으로써 가축 호흡기 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한 상기 KA-1002의 LPA 길항작용은 LPA에 의하여 유도되는 ZO-1 단백질 발현 억제를 완화시키는 것일 수 있다.

상기 LPA에 의하여 유도되는 ZO-1 단백질 발현 억제는 세포-세포 간 타이트 정션을 감소시키는 것일 수 있다.

상기 가축은 소, 돼지, 닭, 개, 고양이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 KA-1002 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물을 제공한다.

상기 KA-1002는 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 가용화된 데커시놀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 치료받을 가축의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 소, 돼지, 닭, 개, 고양이 등의 가축에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 KA-1002는 리핀스키의 5의 법칙 (Lipinski's rule of five)에 기초한 ADME 파라미터((흡수(absorption), 분포(distribution), 대사(metabolism), 배설(excretion))를 모두 충족하는 것을 확인함으로써, 약동학적으로 안전성이 확립되어, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 KA-1002 ((2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol)을 포함하는 가축 호흡기 염증 질환 개선용 동물 사료를 제공한다.

상기 가축 호흡기 염증 질환 개선용 동물 사료는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명은 가축 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 소의 기관세포인 EBTr(NBL-4;ATCC®CC-44^TM)에서 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol (이하 KA-1002)이 LPA에 의한 세포파괴 및 염증을 완화하는 LPA 신호전달 길항제로 작용하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 새로운 를 LPA 신호전달 길항제를 이용한 가축 호흡기 질병의 예방 또는 치료제에 대한 개발을 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol (KA-1002)의 분자구조식이다.
도 2는 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. (A)는 소의 폐동맥 혈관 내피세포에서 LPA로 유도된 TNFα, (B)는 IL-1β, (C)는 IL-6의 발현량에 KA-1002이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. (D)는 소의 폐동맥 혈관 내피세포에서 상대적인 LPAR1 및 LPAR2의 전사 수준을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 Swiss ADME 분석에 의한 생리화학적 특징을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 소 혈관내피세포주(Calf pulmonary artery endothelium, CPAE cell)에서 LPA에 의하여 유도된 혈관신생에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 CPAE 세포에서 무처리세포, LPA에 의하여 유도된 신생혈관 및 LPA에 의하여 유도된 혈관신생이 KA-1002에 의하여 억제된 것을 나타낸 사진이며, (B)는 Imaris software (Oxford Instruments)를 이용하여 tube network의 양을 계산한 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 소의 기관세포(EBTr cell)에서 LPA에 의하여 유도된 ZO-1 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 무처리 EBTr 세포, LPA를 처리한 것, 및 LPA + KA-1002를 처리한 EBTr 세포를 나타낸 사진이다 (ZO-1 (빨간색), F-actin (초록색) 및 핵 (파란색)). (B)는 상기 EBTr 세포당 ZO-1의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이고, (C)는 상기 EBTr 세포당 F-actin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 EBTr 세포에서 LPA 처리 후, 세포부착 여부를 나타낸 것이다. (A)는 무처리, LPA 처리 및 LPA에 5 μM, 20 μM로 각각 KA-1002가 처리된 EBTr 세포의 현미경 사진이다. (B)는 각 실험군의 부착된 EBTr 세포의 상대적인 양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 EBTr 세포에서 LPA에 의하여 유도된 (A) TNFα 및 (B) IL-1β 의 상대적인 전사량을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 세포 기반 고효율 스크리닝방법을 통한 LPA 신호 길항제 선별 >

유력한 LPA 신호 길항제를 선별하기 위하여, 한국 화학 연구원의 라이브러리의 2000 종의 화합물을 세포 기반 고효율 스크리닝 방법(HTS)으로 선별하였다. LPA 길항제로 잘 알려진 Ki-16427과 구조적 유사성을 기초로 선별된 2000 종의 화합물이 소 혈관세포주인 CPAE 세포에서 LPA에 의하여 유도된 염증성 사이토카인인 TNFα 생성 억제여부를 확인하여 유력한 LPA 신호 길항제 후보 물질을 선별하였다.

ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 소의 혈관 세포주인 CPAE (ATCC® CCL-209™) 세포를 구입하여 사용하였다. CPAE 세포는 소의 폐동맥 내피세포로, 10% 소태아혈청, 1% 페니실린, 스트렙토마이신이 보충된 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지에서 95% 공기와 5% 이산화탄소 조건에서 37℃ 로 배양되었다. TNFα 의 발현 분석을 위해서 CPAE 세포를 상기 화합물을 각 농도별 (5-20 μM) 존재 하에서 LPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 100 μM이 되도록 처리하였다. 이후, 처리된 각 CPAE 세포의 전체 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출한 다음, 이중 각 20 ng 씩을 실시간 역전사효소 PCR(RT-PCR)에 사용하였다. RT-PCR은 ThermoscriptTM RT-PCR cDNA SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 이후, Brilliant II CYBR® Green qPCR Master Mix를 이용하여 PCR (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)을 수행하였다.

실험 결과, 5 μM 농도에서 LPA에 의하여 유도된 TNFα 의 발현이 70% 이상 억제되는 물질 14종을 선별하였다. 그 중, KA-1002의 억제효과가 가장 현저하였으며, 이의 분자구조가 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purine-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol)인 것을 확인하였다. 도 1은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol (KA-1002)의 분자구조식이다.

< 실시예 2. KA-1002의 폐동맥 내피세포에서 LPA 유발 염증성 사이토카인 생성에 미치는 효과 확인>

KA-1002가 LPA에 의하여 염증 유도된 CPAE 세포에서 생성되는 다른 염증성 사이토카인 및 케모카인에 미치는 효과를 확인하였다.

CPAE 세포는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였고, 역시 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전체 RNA를 분리한 후, cDNA를 제작하였다.

하기 표 1과 같이 프라이머와 프로브 세트를 Bioneer 사 (Daejeon, Korea)로부터 구입하였으며, 결과는 베타-액틴 양을 이용하여 정규화하였다. 실시간 qPCR은 Agilent Technologies AriaMx real-time system (Agilent Technologies Inc.)을 이용하여 2회 반복 검체로 실시하였으며, 각 검체의 세포들에 대하여 2^-△△CT값에 기초한 상대적인 발현은 가장 높은 발현값에 대한 백분율로 표현하여 도 2에 나타내었다.

Gene Name	5'-Primer Sequence	3'-Primer Sequence
Bovine TNFα	TCTCTCTCACATACCCTGCCA	CCACATCCCGGATCATGCTT
Bovine IL-6	CCAGCCACAAACACTGACCT	CCCCAGCTACTTCATCCGAA
Bovine IL-1β	AACGTCCTCCGACGAGTTTC	CCAGCACCAGGGATTTTTGC
Bovine LPAR1	AACACAGGGCCCAATACTCG	CAATTGCAATGGCCAGGAGG
Bovine LPAR2	CCACGAGTCTGTTCGCTACA	GTGGCATTTGCTGTACCCTG
Bovine β-actin	TCGGTTGGATCGAGCATTCC	GTGGCTTTTGGGAAGGCAAA

도 2는 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 도 2(A) 내지 도 2(C)에서 보는 바와 같이, KA-1002는 CPAE 세포에서 소의 폐동맥 혈관 내피세포에서 LPA에 의해 유도된 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 발현을 유의하게 억제하였다. 본 발명에 따른 KA-1002가 종래 LPA 길항제로 알려진 Ki-16425보다 낮은 농도에서 TNFα의 발현 억제효과가 더 좋았으며, IL-1β 및 IL-6의 경우, 본 발명의 KA-1002가 Ki-16425보다 5 및 20 μM에서 각각 발현 억제효과가 더 뛰어난 것을 확인하였다.

< 실시예 3. KA-1002의 LPA 수용체 확인>

본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 길항 기전을 알아보기 위하여 KA-1002 처리 시, LPA 수용체(LPAR)의 발현정도를 조사하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로, CPAE 세포에서 KA-1002 처리 시 LPAR1 및 LPAR2의 전사 수준을 조사하여 도 2(D)에 나타내었다.

도 2(D)에서 보는 바와 같이, KA-1002 처리 시 LPAR1의 전사 수준이 LPAR2보다 높게 나타났다. 이러한 결과는 Ki-16425의 LPA 길항제 효과와 유사한 결과로, 이는 본 발명의 KA-1002가 LPAR1를 매개로 하여 LPA 길항제로 작용하는 것으로 알려진 Ki-16425와 동일한 메커니즘으로 LPA의 길항제로 작용하는 것으로 해석될 수 있다.

< 실시예 4. KA-1002의 Swiss ADME 분석>

본 발명의 LPA 길항제로서 KA-1002의 약동학적 특성을 알아보기 위하여 Swiss ADME 분석을 실시하였다. Swiss Institute of Bioinformatics에서 제공하는 Swiss ADME 프로그램으로 KA-1002의 약동학적 특성, 약물유사성을 분석한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, KA-1002는 리핀스키의 5의 법칙 (Lipinski's rule of five)에 기초한 ADME 파라미터((흡수(absorption), 분포(distribution), 대사(metabolism), 배설(excretion))를 모두 충족하는 것을 확인하였다.

< 실시예 5. KA-1002의 LPA 유도 염증성 혈관 신생의 완화 효과 확인>

LPA가 염증 부위에서 염증을 증폭시키기 위하여 혈관 신생을 유발한다는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명의 LPA 길항제로서 KA-1002가 소의 혈관 세포에서 염증을 억제하기 때문에, 본 발명자들은 KA-1002가 LPA에 의하여 매개되는 혈관 신생 증가를 억제할 것이라고 추측하고, KA-1002의 LPA 유도 염증성 혈관 신생의 완화 효과를 확인하였다.

실험예 2와 동일한 방법으로 CPAE 세포를 무처리, LPA(100 μM) 및 LPA(100 μM) + KA-1002(20 μM) 으로 처리한 다음 혈관의 신생여부를 광학현미경으로 확인하고 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, CPAE 세포는 LPA(100 μM) 에 의하여 신생혈관이 증가한 것을 확인하였으며, KA-1002(20 μM)을 첨가한 실험군에서는 LPA에 의하여 유도된 혈관의 신생이 억제된 것을 확인하였다.

< 실시예 6. KA-1002의 소 기관세포에서 LPA 에 의하여 유도된 ZO -1 에 미치는 효과 확인>

LPA는 소의 기관세포(EBTr 세포에서 Zonula occludens-1(이하 ZO-1) 단백질의 발현을 강하게 감소시키는 것으로 알려져 있다. ZO-1 단백질은 세포-세포 접합에서 신호전달에 관여하며, 세포 간 접합의 세포질 표면에서 다단백질 복합체의 조립을 위한 구조적 기초를 제공하는 스캐폴딩 단백질이다. 건강한 세포의 경우 ZO-1 단백질의 발현이 높으며, 기관 세포에서 LPA에 의하여 이러한 세포 접합 물질이 손실되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명의 LPA 길항제로서의 KA-1002가 LPA에 의하여 유도된 ZO-1 단백질의 감소를 억제하는지 확인하였다.

ZO-1 발현 분석을 위해, EBTr 세포를 20 μM KA-1002의 존재 또는 부재하에 100 μM LPA (Sigma-Aldrich)로 18 시간 동안 처리하였으며, 3회 반복 검체로 실험하였다. 먼저 EBTr 세포를 8-웰 μ-슬라이드(Ibidi, Planegg, Germany)에 접종하고, 20 μM KA-1002의 존재 또는 부재하에 100 μM LPA로 처리하고 37 ℃ and 5% CO₂ 조건으로 24시간 배양하였다. 이후 파라포름알데하이드로 20분간 고정시킨 후, 슬라이드를 0.01% Triton X-100이 포함된 PBS로 수세, 투과시킨 후, 1 % 소혈청 알부민으로 실온에서 1시간동안 블로킹시켰다. 이후, 플로로포어가 접합된 1차 항체를 4℃에서 처리하고, 다음 날 1% 소혈청 알부민으로 10분간 3회 수세한 후, PBS에 1000배 희석한 DAPI로 염색하였다. ZO-1 또는 F-actin에 대한 1차 항체(Thermo 0Fisher Scientific)는 1:200으로 희석하여 세포간 구조와 타이트 정션(tight junction)을 기초로 한 ZO-1 또는 actin 필라멘트의 시각화를 위하여 사용하였다. 형광 신호는 VIS 및 NIR 레이저가 장착된 LSM 880 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화 하였으며, 모든 캡처 된 이미지는 LSM 880 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 이미지 최적화(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 위한 Airyscan 모드를 사용하여 촬영되었고, 이를 도 5에 나타내었다.

도 5는 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 소의 기관세포(EBTr cell)에서 LPA에 의하여 유도된 ZO-1 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 무처리 EBTr 세포, LPA를 처리한 것, 및 LPA + KA-1002를 처리한 EBTr 세포를 나타낸 사진이다 (ZO-1 (빨간색), F-actin (초록색) 및 핵 (파란색)). (B)는 상기 EBTr 세포당 ZO-1의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이고, (C)는 상기 EBTr 세포당 F-actin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 5(A)에서 보는 바와 같이, EBTr 세포에서 LPA에 의하여 ZO-1 단백질이 손실되었으며, 상기 ZO-1 단백질이 손실은 KA-1002에 의하여 완화된 것을 확인하였다. F-actin 발현은 LPA 또는 KA-1002에 의하여 유의하게 변화하지 않았다. 각 세포의 이미지의 같은 부분에서 ZO-1 및 F-actin의 상대적 발현양을 측정하여 본 결과, 무처리된 EBTr 세포에서 ZO-1 단백질은 세포질 전체 및 세포 가장자리에 위치해 있으며, 특히 세포의 경계지역에 ZO-1 발현이 높은 것을 확인하였다. 그러나, LPA를 처리한 EBTr 세포의 경우, ZO-1 단백질은 세포 가장자리 지역 대부분에서 손실되었다. 또한 LPA를 처리한 EBTr 세포에 KA-1002를 더 처리한 경우, 세포 가장자리에 ZO-1 단백질의 배치가 회복된 것을 알 수 있었다.

세포 가장자리 지역에 위치된 ZO-1 단백질은 세포간 타이트 정션 및 세포 부착능에 중요한 역할을 하기 때문에, LPA 처리는 세포와 세포간 타이트 정션의 손실을 유발하는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 7. KA-1002의 소 기관세포에서 LPA에 의하여 유도된 부착능력 손실에 미치는 효과 확인>

상기 실시예 6의 결과로부터 KA-1002가 LPA에 의하여 유도된 세포와 매트리스의 부착력 손실에도 효과를 미치는지 확인하였다. 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 EBTr 세포를 처리한 후, EBTr 세포가 배양 플레이트에 부착하는 정도를 관찰하여 도면 6에 나타내었다.

도 6은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 EBTr 세포에서 LPA 처리 후, 세포부착 여부를 나타낸 것이다. (A)는 무처리, LPA 처리 및 LPA에 5 μM, 20 μM로 각각 KA-1002가 처리된 EBTr 세포의 현미경 사진이다. (B)는 각 실험군의 부착된 EBTr 세포의 상대적인 양을 그래프로 나타낸 것이다. (C)는 무처리, LPA 처리 및 LPA에 20 μM로 KA-1002가 처리된 EBTr 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 6(A) 및 6(B)에서 보는 바와 같이 LPA가 처리된 EBTr 세포는 LPA가 처리되지 않은 세포에 비하여 배양 플레이트에 대한 부착력이 현저히 낮았으며, LPA 처리된 세포는 부착세포에 대한 미부착세포의 비율이 크게 나타났다. 그러나 KA-1002를 처리한 경우, LPA 처리된 EBTr 세포의 배양 플레이트에 대한 부착력이 KA-1002 농도 의존적으로 회복되는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 LPA가 세포의 구조적 파괴 또는 조직 손상을 일으킬 수 있는 세포-세포간 타이트 정션 및 세포-매트릭스 부착을 감소시키는 것으로 해석할 수 있으며, 본 발명의 KA-1002가 이를 완화시킬 수 있음을 시사한다.

< 실시예 8. KA-1002의 소 기관세포에서 LPA에 의하여 유도된 염증성 사이토카인 생성에 미치는 효과 확인>

소의 기관세포에서 LPA 매개 염증성 사이토카인 생성을 특성화하기 위하여, 무처리, LPA 처리 및 LPA와 KA-1002를 각각 처리한 EBTr 세포의 TNFα 및 IL-1β를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하여 도 7에 나타내었다.

도 7은 본 발명에 따른 LPA 길항제인 KA-1002의 EBTr 세포에서 LPA에 의하여 유도된 (A) TNFα 및 (B) IL-1β 의 상대적인 전사량을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 7에서 보는 바와 같이, TNFα와 IL-1β는 LPA 처리에 의해 유의하게 증가하였으나, KA-1002에 의하여 LPA 처리로 유도된 TNFα와 IL-1β의 증가가 억제되었다. 상기 실시예 2의 CPAE 세포 실험에서 유사한 결과를 고려하면, LPA는 소의 기관지 및 내피 세포에서 염증을 유발하며, KA-1002는 LPA의 길항제로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.

Claims

(2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol 을 포함하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물에 있어서,
상기 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol은 LPA(Lysophosphatidic Acid) 수용체의 길항제로 작용하며,
상기 가축 호흡기 염증 질환은 소의 폐렴 또는 기관지염인 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol의 LPA 길항작용은 LPAR1(LPA Receptor1)을 매개로 하는 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol은 LPA에 의하여 유도되는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 LPA에 의하여 유도되는 염증성 사이토카인은 TNFα(tumor necrosis factor-α), IL-1β(Interleukin-1β) 및 IL-6(Interleukin 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol은 LPA에 의하여 유도되는 혈관신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol은 LPA에 의하여 유도되는 ZO-1 단백질 발현 억제를 완화하는 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 LPA에 의하여 유도되는 ZO-1 단백질 발현 억제는 세포-세포 간 타이트 정션을 감소시키는 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환의 예방 또는 치료 조성물.
삭제
(2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol을 포함하는 가축 호흡기 염증 질환 개선용 동물 사료에 있어서,
상기 (2R,3R,4S,5R)-2-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol은 LPA(Lysophosphatidic Acid) 수용체의 길항제로 작용하며,
상기 가축 호흡기 염증 질환은 소의 폐렴 또는 기관지염인 것을 특징으로 하는 가축 호흡기 염증 질환 개선용 동물 사료.