KR102390931B1

KR102390931B1 - 보체 단백 분해 산물 C3a와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102390931B1
Application number: KR1020200014943A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 손유경; 손수민
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-02-07
Also published as: KR20210100945A; WO2021158092A3; WO2021158092A2

Abstract

본 발명은 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 인간의 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합함으로써 그의 활성을 저해할 수 있는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 폴리펩티드 생산방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하는 신규한 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a 수용체보다 높은 친화력으로 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하여 그의 활성을 억제함으로써 보체 단백 분해 산물 C3a와 연관된 다양한 질환의 예방 또는 치료용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있어 유용하다.

Description

보체 단백 분해 산물 C3a와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드 및 이의 용도{Novel polypeptide binding with human complement component 3a and usese thereof}

본 발명은 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 인간의 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합함으로써 그의 활성을 저해할 수 있는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 폴리펩티드 생산방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

항체 치료제는 화학제재에 비해 낮은 부작용과 높은 치료 효능 때문에 글로벌 제약기업과 생명공학 기업들이 개발에 집중 투자를 하여 현재 다수의 항체 치료제가 임상에 사용되고 있으며 많은 치료제 후보가 임상실험 중에 있다.

그러나 항체 치료제는 생산 비용이 비싸고 기존 특허 장벽을 벗어나기 힘들며 분자량이 커서 세포내 침투가 어렵고 기대만큼 실제 환자의 치료 효과가 높지 않은 문제점이 있기 때문에, 최근 항체 치료제를 대체하기 위한 인공항체의 개발이 활발하게 진행되고 있다. 이러한 인공항체 골격 단백질은 항체 치료제와 달리 암 조직 내로 침투되는 효율에 크게 향상되어 결과적으로 치료 효과를 향상 시킬 수 있다는 장점이 많은 연구를 통해 밝혀지고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존의 항체를 대체할 수 있는 비 항체 단백질 골격 (non-antibody protein scaffold)인 리피바디 (repebody)를 성공적으로 개발하였다. 리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고 대장균에서 대량생산 되며 동물 실험결과 면역원성이 거의 없음. 열 및 pH 안정성이 매우 우수하고 타겟에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며 타겟에 대한 특이성이 매우 탁월함을 입증한 바가 있다.

보체 단백 분해 산물 C3a는 선천성 면역계와 적응 면역계 사이의 중요한 매개체로 천식, 류마티스 관절염, 루프스와 같은 염증 반응 기반의 면역 관련 질환들의 유발인자로 알려져 있다. 특히, 혈액 중에 세균과 같은 침입자가 생체를 감염시키고 번식하면서 체내 과도한 염증 반응이 원인인 패혈증과 천식 치료제 개발의 표적 물질로 잘 알려져 있다. 패혈증은 전 세계적으로 중환자실 이환율 및 사망률의 주요한 원인으로 알려져 있고 미국의 경우 해마다 750,000명의 패혈증 환자가 발생하며 국내에서도 정확한 통계는 없지만 매우 높은 발병률을 나타내고 있다. 치사율 또한 40% 정도로 매우 높은 편이나, 2001년 FDA 승인을 받은 치료제가 2011년 시장에서 퇴출되면서 아직까지 효과적인 치료법이나 치료 물질은 매우 부족한 실정이다. 따라서 패혈증과 같이 과도한 염증 반응의 결과로 나타나는 질병의 치료제로써 보체 단백 분해 산물 C5a를 표적으로 하는 치료제 개발 연구가 꾸준히 진행되고 있지만, 비슷한 기능을 하는 C3a를 표적으로 하는 치료제 개발 연구는 상대적으로 많이 진행되지 못한 상태이다.

본 발명자들은 다양한 단백질에 대해 특이적으로 결합가능한 리피바디(Repebody)라는 폴리펩티드를 개발한 바 있으며 (대한민국 특허 제10-1356075호, 제10-1654890호, 제10-1587622호, 제10-1624702호, 제10-1624703호, 제10-1713944호, 제10-1751501호, 제10-1818152호 및 제10-1875809호), 상기 리피바디 골격을 이용하여 다양한 질환 관련 표적 단백질들에 대한 특이적인 결합 단백질 (Specific protein binder)을 성공적으로 제조하고, 세포 기반의 방법으로 생물학적인 저해효과가 있음을 검증하였고, 추가적인 연구를 활발히 진행하고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 상기 리피바디 골격을 이용하여 다양한 면역 질환과 관련이 깊은 것으로 알려진 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 단백질을 성공적으로 확보하기 위해 예의 노력한 결과, 리피바디의 구조적 특징인 모듈성과 전체구조분석을 통해 구축한 무작위한 돌연변이 라이브러리를 바탕으로 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 특이적인 결합력을 갖는 신규한 단백질을 선별하고, 반복 모듈 기반의 친화력 증대방식을 통해 결합력을 향상시키며, 결합력이 향상된 리피바디가 C3a의 활성을 억제할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody); 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물를 이용해 상기 리피바디를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리피바디에 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF)에 특이적으로 결합하는 리피바디가 융합된 이중 결합 리피바디(bispecific repebody)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리피바디 또는 이중 결합 리피바디를 함유하는 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 리피바디 또는 이중 결합 리피바디를 함유하는 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR (Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단과 VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합되어 있는 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드로, i) 88번 트레오닌이 메티오닌으로 치환; ii) 91번 이소류신이 류신으로 치환; iii) 93번 트레오닌이 메티오닌으로 치환; iv) 94번 글라이신이 프롤린으로 치환; v) 99번 세린이 이소류신으로 치환; vi) 116번 발린이 트립토판으로 치환; vii) 117번 글루탐산이 히스티딘으로 치환;으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 아미노산 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 포함되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 폴리펩타이드를 발현시키는 단계 및 상기 배양된 재조합 미생물 또는 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드와 혈관 내피세포성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 리피바디가 융합된 이중 결합 리피바디(bispecific repebody)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드 또는 이중 결합 리피바디를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 예방 또는 면역 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하는 신규한 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a 수용체보다 높은 친화력으로 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하여 그의 활성을 억제함으로써 보체 단백 분해 산물 C3a와 연관된 다양한 질환의 예방 또는 치료용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있어 유용하다.

도 1은 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 폴리펩타이드를 초기 선별하기 위해 첫 번째 라이브러리가 구축된 LRRV2 모듈과 LRRV3 모듈에 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 2은 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 파지 디스플레이의 바이오 패닝을 수행한 결과이다. BSA 대비 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 효소면역측정법 (ELISA)에 의한 결합 신호를 평균화 (Normalization)를 하였으며, 이때 8배 이상의 신호가 증가한 클론에 대해 특이적인 결합력을 갖는 리피바디 클론으로 정의하였다.
도 3는 상기 도 2에서 얻어진 클론인 H12에 대해 등온열량측정기 (Isothermal titration calorimetry; ITC)를 이용하여 해리상수를 측정한 결과로, 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 637 nM의 낮은 결합력을 가지고 있음을 확인하였다.
도 4는 결합력을 증대시키기 위해 일차적으로 선별된 클론인 H12을 바탕으로 두 번째 라이브러리가 구축된 LRRV4 모듈에 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 5는 두 번째 라이브러리를 이용하여 파지 디스플레이의 바이오 패닝을 수행한 결과이다. BSA 대비 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 효소면역측정법 (ELISA)에 의한 결합 신호를 평균화 (Normalization)를 하였으며, 이때 10배 이상의 신호가 증가한 클론에 대해 결합력이 증대된 리피바디 클론으로 정의하였다.
도 6은 상기 도 5에서 수득한 클론 중 가장 높은 결합력을 보이는 클론인 F6에 대해 등온열량측정기를 이용하여 해리상수를 측정한 결과로, 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 150 nM의 결합력을 가지고 있음을 확인하였다. 이는 결합력 증대 전의 H12 클론에 비해 약 4배 결합력이 증대된 것이다.
도 7은 결합력을 증대시키기 위해 이차적으로 선별된 클론인 F5를 바탕으로 세 번째 라이브러리가 구축된 LRR1 및 LRRV1 모듈에 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 8은 세 번째 라이브러리를 이용하여 파지 디스플레이의 바이오 패닝을 수행한 결과이다. BSA 대비 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 효소면역측정법 (ELISA)에 의한 결합 신호를 평균화 (Normalization)를 하였으며, 이때 12배 이상의 신호가 증가한 클론에 대해 결합력이 증대된 리피바디 클론으로 정의하였다.
도 9는 상기 도 8에서 수득한 클론 중 F6보다 결합력이 증대된 클론들에 대해 등온열량측정기를 이용하여 해리상수를 측정한 결과이다. 클론 E10이 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 약 0.6 nM로 가장 높은 결합력을 가지며, 이는 결합력 증대 전의 H12 클론에 비해 약 1,000배 결합력이 증대된 것이다.
도 10은 가장 높은 결합력을 지닌, 최종 선별된 E10을 대장균에서 발현 및 정제한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명에서 선별된 리피바디 E10이 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 특이적으로 결합하는지를 확인한 것으로, 이는 파지를 이용한 효소면역측정법 (ELISA)으로 측정하였다.
도 12는 본 발명에서 선별된 E10을 사람의 말초 혈액 단핵세포로부터 분리한 단핵구에 처리했을 때, 전 염증성 반응의 지표로 사용되는 인터루킨-6 (Interleukin-6)와 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-α)의 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에서 선별된 E10과 선행 특허의 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF)에 결합하는 리피바디를 융합하여 보체 단백 분해 산물 C3a과 혈관 내피세포 성장인자에 이중 결합 리피바디의 구조 개략도이다.
도 14는 본 발명에서 선별된 E10과 선행 특허의 보체 단백질 C5a에 결합하는 리피바디를 융합하여 보체 단백 분해 산물 C3a과 보체 단백질 C5a에 이중 결합 리피바디의 구조 개략도이다.
도 15는 본 발명에서 제조한 C3a-VEGF 이중 결합 리피바디의 이중 결합을 효소면역측정법 (ELISA)을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명에서 제조한 C3a-C5a 이중 결합 리피바디의 이중 결합을 효소면역측정법 (ELISA)을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 선별하고, 상기 폴리펩티드의 활성 억제 효과를 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 리피바디 개발을 위한 라이브러리에 포함된 폴리펩티드를 C3a의 파지미드를 이용한 바이오패닝을 통해 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 선별을 수행하고, 이들의 결합력을 개선하는 작업을 수행하였다. 그 결과 C3a에 특이적인 폴리펩티드를 제조하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 C3a에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 폴리펩티드를 개발하기 위하여, 인터날린 B (Internalin B) 단백질의 Ｎ-말단, 가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR) 의 LRR (Leucine-rich repeat) 단백질 부분이 융합된, 폴리펩티드의 반복 모듈을 무작위적으로 포함하는 라이브러리를 구축하였다(도 1). 상기 라이브러리에 포함된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되거나 또는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.

또한, 상기 라이브러리는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 파지미드의 형태가 될 수 있다. 본 발명의 용어 "파지미드"란, 대장균을 숙주로 하는 바이러스인 파지로 부터 유래된 원형의 폴리뉴클레오티드 분자를 의미하는데, 번식과 증식에 필요한 단백질 및 표면 단백질들의 서열이 포함되어 있다. 재조합 파지미드는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 파지미드는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있고, 주로 원하는 단백질을 파지의 표면 단백질과 융합하여 파지 표면에 표지하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 파지미드의 프로모터는 주로 유도성이며, 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 파지미드는 상기 라이브러리를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 및 분비하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열인 MalEss, DsbAss 또는 PelBss를 포함하고, 파지의 표면에 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위한 히스티딘-태그와 파지 표면으로의 발현을 위한 M13 파지의 표면 단백질의 일종인 gp3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명자의 선행 특허 (제10-2012-0019927호)에 기술된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 “보체 단백 분해 산물 C3a (complement component C3a)”는 보체 활성화 과정에서 보체 단백질 C3가 잘리면서 형성된 약 9 kDa의 작은 단백질 조각이다. 보체 단백 분해 산물 C3a 는 비만세포와 호염구 과립 파괴로 히스타민을 방출시켜 혈관 투과성을 증가시키며, 백혈구를 불러들여 식작용을 촉진시키는 등의 다양한 염증 반응에 관여한다. 특히 체내에 과도하고 존재하는 C3a는 면역 반응을 과도하게 일으켜 비정상적인 염증 반응을 유발하며, 이러한 현상은 천식, 류마티스 관절염, 패혈증 등과 같은 다양한 질환에서 발견되고 있다.

본 발명자들은 상기 파지미드를 포함하는 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력이 우수한 리피바디 형태의 신규한 폴리펩타이드(서열번호 3)를 선별하였다 (도 1, 도 2). 그러나, 선별된 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a의 수용체 (complement component 5a recpetor) 보다도 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력이 낮은 수준이어서(도 3), 상기 선별된 폴리펩타이드에 돌연변이를 가하여 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력이 향상된 변이 폴리펩타이드를 제작하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 선별된 서열번호 3을 대상으로 LRRV4 모듈에 위치한 아미노산 잔기 4개를 돌연변이 시킨 두 번째 라이브러리를 구축하고(도 4), 상기 두 번째 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력이 증대된 신규한 폴리펩타이드(서열번호 4)를 2차 선별하였다 (도 5). 선별된 각 클론에 대하여 등온열량적정기 (Isothermal titration calorimetry)를 이용하여 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력을 측정하였으며 (도 6), 이 중 서열번호 4의 폴리펩타이드가 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력이 가장 높은 클론임이 확인되었고, 그 결합력은 150 nM 인 것으로 확인하였다.

그러나, 선별된 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하는 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a 수용체보다 낮은 결합력을 가지기 때문에 생물학적 효능이 낮을 것으로 예상된다. 이에, 본 발명자들은 보체 단백 분해 산물 C3a와의 결합능이 더욱 개선됨과 동시에 생물학적 효능을 갖을 수 있는 리피바디를 확보하기 위하여, 서열번호 4를 기반으로 하여 LRR1과 LRRV1 모듈에 존재하는 총 6 개의 아미노산 잔기를 돌연변이 시킨 네 번째 라이브러리를 구축하였다(도 7).

상기 세 번째 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 결합력이 증대된 2개의 서로 다른 폴리펩타이드(서열번호 5, 서열번호 6)를 선별하였으며, 이 중 증대된 0.6 nM의 가장 높은 결합력을 지닌 리피바디 형태의 신규한 폴리펩타이드 (서열번호 5)를 최종적으로 선별하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR (Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단과 VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합되어 있는 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드로, i) 88번 트레오닌이 메티오닌으로 치환; ii) 91번 이소류신이 류신으로 치환; iii) 93번 트레오닌이 메티오닌으로 치환; iv) 94번 글라이신이 프롤린으로 치환; v) 99번 세린이 이소류신으로 치환; vi) 116번 발린이 트립토판으로 치환; vii) 117번 글루탐산이 히스티딘으로 치환;으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 아미노산 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR 패밀리 단백질의 N-말단은 인터날린 단백질의 N-말단인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 인터날린 단백질은 바람직하게는 인터날린 A, 인터날린 B, 인터날린 C, 인터날린 H 및 인터날린 J로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인터날린 B 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "인터날린 B 단백질"이란, 리스테리아 (Listeria) 균주에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 다른 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 다른 LRR 패밀리 단백질들과는 다른 유형의 N-말단 구조 때문에 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복 모듈의 접힘 (Folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 더욱 안정적인 구조를 포함하므로, 미생물에서 LRR 패밀리 단백질들의 안정적인 발현을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping motif) 및 인터날린 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단은 제한 없이 포함되나, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE"(서열번호 11) 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN" (서열번호 12)을 포함할 수 있다. 상기 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.

본 발명의 용어 "가변 림프구 수용체 (Variable Lymphocyte Receptor, VLR)"란, 먹장어와 칠성 장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 먹장어와 칠성 장어에서 면역 기능을 수행하는 단백질로서 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩타이드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하므로, 이를 기반으로 한 신규한 단백질 치료제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "LRR (Leucine rich repeat) 단백질"이란, 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 쓰레오닌을, x는 모든 종류의 20가지의 아미노산을 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖는 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것뿐 아니라, 컨센서스 디자인 (Consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "리피바디 (Repebody)"란, LRR 구조를 갖는 상기 인터날린의 N-말단과 상기 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리 폴리펩타이드이다. 리피바디 단백질은 구조상 오목한 지역 (Concave) 와 볼록한 지역 (Convex) 으로 나누어 질 수 있다. 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 리피바디 단백질은 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리화학적 성질을 향상 시킨 모든 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하여 그의 활성을 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pET-21a, pET-32a 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "재조합 미생물"이란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포는 특별히 제한되는 것이 아니나, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 대장균 BL21(DE3), OrigamiB(DE3)를 숙주 세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (ⅰ) 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 배양된 재조합 미생물 또는 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 리피바디가 융합된 이중 결합 리피바디(bispecific repebody)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 이중결합 리피바디는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드 또는 이중 결합 리피바디를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 질환 예방 또는 치료는 상기 폴리펩타이드가 보체 단백 분해 산물 C3a과 결합하여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어 "면역 질환"은 면역 체계에 이상이 생겨 발생하는 질환을 의미하는 것이다. 본 발명에서의 면역 질환은, 자가면역 질환이면 모두 해당되나, 바람직하게는 류마티스 관절염, 전신성홍반성낭창, 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 건선, 경파증, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 길랑바레 증후군, 백혈병, 그레이브스 병, 크론병, 실리악병, 베게너육아종증, 근육성 이영양증, 포도막염, 타키야수 동맥염, 측두 동맥염, 재발성 다발 연골염, 다발성 경화증, 척-스트라우스 증후군, 헤노흐-쇤라인 자반증, 굿파스처 증후군, 타입1 당뇨병, 아프타구내염, 천포창 및 췌양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여로 면역 질환이나 그로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 증상을 억제하거나 완화하는 것뿐만 아니라 질환의 증상을 반전시키는 암의 치료 또는 암의 진행을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 면역 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 면역 질환의 예방 또는 치료는 본 발명에서 확보한 폴리펩타이드가 보체 단백 분해 산물 C3a과 결합하여 이루어지는 것으로, 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하여 그의 활성을 유의하게 억제하여 면역 질환을 예방 또는 치료하는 것이다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 이중 결합 리피바디를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 치료 방법은 보체 단백 분해 산물 C3a의 과도한 활성으로 인하여 질병이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 단백질 구조 기반의 리피바디 라이브러리 구축

리피바디는 자연계에 존재하는 LRR 단백질들과 마찬가지로 보존된 루이신 서열을 갖는 반복 단위체 (Repeat unit)가 연속적으로 연결되어 전체 단백질 구조를 유지하는 모듈성과 전체 구조의 모양의 곡률로 인한 오목한 지역 (concave region)과 볼록한 지역 (convex region)으로 구별되는 구조적 특징을 갖는다. 상기 오목한 지역에는 항체의 상보결정지역 (complementarity determining region; CDR)처럼 초가변영역 (hypervariable region)이 위치하여, 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 또한, 볼록한 지역은 잘 보존되어 있는 서열을 바탕으로 LRR의 전체 구조를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 리피바디의 단백질 구조를 분석하여 하기와 같은 방식으로 무작위적인 라이브러리를 설계하였다.

구체적으로, 아민기말단 방향에 위치한 연속적인 두 개의 모듈 (LRRV2, LRRV3 module)의 오목한 지역에 위치하는 여섯 아미노산 잔기 91, 93, 94, 115, 117, 118번을 선택하여 무작위적인 돌연변이 라이브러리를 구축하였다(도 1).

그런 다음, 상기 선택한 아미노산을 NNK 동의코돈 (degenerate codon)으로 치환하도록, 라이브러리 구축을 위한 돌연변이 유발 프라이머 (mutagenic primer)를 합성하였다. 프라이머 서열은 아래와 같다.

서열번호 13 M1: CTG CCG AAT GGC GTC TTT GAT AAA CTG ACG AAC CTG AAA GAA CTG NNK CTG NNK NNK AAT CAA CTG CAG TCT CTG CCG GAC

서열번호 14 M2: CGT CAG TTT ATC AAA GAC GCC ATT CGG CAG GCT CTG CAG TTG GTT MNN MNN CAG MNN CAG ATA CGT CAG ATT GGT CAG TTC

이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄 반응 (overlap PCR)을 수행하며 라이브러리 DNA를 수득하고, 본 발명자의 선행 특허 (대한민국 등록특허 제1,356,075호)에 기술된 서열번호 2의 파지미드 pBEL118M에 삽입하여 최종적인 라이브러리 파지미드를 확보하였다.

상기 확보된 라이브러리를 전기천공법 (electroporation)으로 대장균 TG-1에 도입하여 형질전환체를 수득함으로써, 2.0x10⁸ 수준의 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.

실시예 2: 무작위적인 파지 라이브러리를 통한 C3a와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별

실시예 2-1: 리피바디 라이브러리의 패닝 과정을 통한 C3a와 결합하는 폴리펩타이드 선별

상기 선행특허에서 구축한 라이브러리를 사용하여 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 선별하여 정제하였다. 보체 단백 분해 산물 C3a와 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, 보체 단백 분해 산물 C3a를 면역튜브 (Immuno-tube)에 50 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4 ℃에서 12시간동안 코팅하였다. 상기 코팅된 면역튜브를 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA와 0.05 % Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBSA)으로 4 ℃에서 2시간동안 블로킹(Blocking) 하였다.

상기 정제된 파지를 10¹²cfu/ml의 농도로 상기 코팅된 면역튜브에 가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 총 2분간 5번씩 및 PBS로 2번 세척하였다. 마지막으로, 1 ml 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 13분간 반응시킴으로써, 보체 단백 분해 산물 C3a와 결합할 수 있는 리피바디 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다.

상기 용출액에 60 ㎕의 1.0 M Tris-HCl (pH 9.0)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 9 ml 대장균 XL1-Blue 용액 (OD 600 = 0.6)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝 (Bio-panning) 과정을 동일하게 4회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 각 패닝 과정을 통해 보체 단백 분해 산물 C3a와 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 보체 단백 분해 산물 C3a와 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가함을 의미하는 것으로 분석되었다.

실시예 2-2: 선별된 리피바디의 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 특이적인 결합여부 확인 및 서열 분석

실시예 2-1의 방법을 통하여 선별된 파지를 보체 단백 분해 산물 C3a와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 ELISA를 수행함으로써, BSA 대비 보체 단백 분해 산물 C3a의 흡광도(OD 450)가 8배 이상 높은 리피바디 후보들을 선별하고 (도 2), 이들 각각의 아미노산 서열을 확인한 후, 동일한 아미노산 서열을 갖는 클론을 제외 하였다. 그 결과, 상기 선별된 파지에서 총 4 종류의 리피바디 서열을 확인하였으며, 등온열량측정기를 이용하여 해리상수를 측정한 결과, 클론 H12는 약 637 nM의 결합력으로 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합함을 확인하였다 (도 3). H12는 91번 아미노산인 이소류신이 류신으로 치환되고, 93번 아미노산인 트레오닌이 메티오닌으로 치환되며, 94번 아미노산인 글리신이 프롤린으로 치환되고, 114번 아미노산인 발린은 발린이 유지되고, 116번 아미노산인 발린이 트립토판으로 치환되며, 117번 아미노산인 글루탐산이 히스티딘으로 치환되었음을 확인하였다 (서열번호 3). 추가적으로, 라이브러리를 구축하지 않은 88번의 트레오닌이 메티오닌으로, 99번의 세린이 이소류신이 치환되었음을 확인하였다.

상기 결과는 보체 단백 분해 산물 C3a와 결합하는데 중요한 역할을 수행하는 잔기가 존재함을 의미하는 것으로 분석되었다.

실시예 3: 모듈 기반 방법을 이용한 리피바디의 C3a에 대한 결합력 증대 수행

본 발명에서 기술된 모듈 기반 친화력 증대 방식은 선행특허(KR2012-0019927)에 따라 수행하였다. 해당 방법은 반복 모듈을 갖는 단백질에 대해 보편적으로 사용할 수 있는 기술로써, 본 특허에서 성공적으로 재현되어 높은 수준의 친화력을 갖는 단백질 설계를 가능하게 하였다.

실시예 3-1: 모듈을 이용한 추가적인 라이브러리 구축 및 결합력 증가 확인 및 다른 단백질에 대한 교차결합여부 확인

실시예 2-2의 결과에서 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 것이 확인된 클론인 H12의 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 해리상수는 637 nM이지만(도 2), 자연적으로 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a 수용체의 보체 단백 분해 산물 C3a에 대한 해리상수는 1 nM 수준이다. 따라서, 본 발명의 리피바디 후보로는 보체 단백 분해 산물 C3a의 활성을 충분히 억제할 수 없을 것으로 예상되었다.

이러한 문제점을 해결하고자, 추가적인 라이브러리 구축방법을 이용하여 결합력이 향상된 돌연변이체를 개발하고자 하였다.

구체적으로, 첫 번째 모듈 기반 친화력 증대를 위한 라이브러리는 LRRV4 모듈의 총 4개 아미노산 잔기를 돌연변이 시켜(도 4), 총 5번의 패닝과정을 거쳐서 결합력이 증대된 F6(서열번호 4)를 확보하였으며(도 5), 등온열량측정기를 이용하여 해리 상수를 측정한 결과, 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 150 nM의 결합력을 가지는 것을 확인하였다(도 6). F6는 137번 타이로신이 아르기닌으로 치환되고, 139번 아스파라긴이 라이신으로 치환되며, 141번 알라닌이 아스파라긴으로, 142번 히스티딘이 글리신으로 치환되었음을 확인하였다.

한편, 더욱 향상된 결합력을 나타내는 돌연변이체를 개발하기 위해서 F6를 기본 폴리펩타이드로 하여 LRRV1 및 LRR1 모듈의 총 여섯 개의 잔기를 돌연변이 시킨 후(도 7), 동일한 패닝과정을 거쳐, E10(서열번호 5)과 C9(서열번호 6)을 선별하였다. E10은 47번 이소류신이 타이로신으로 치환되고, 49번 아스파라긴이 트레오닌으로, 50번 아스파라긴이 세린으로 치환되었으며, 69번 알라닌, 71번과 72번 글리신은 그대로 유지되었다. 추가적으로, 139번 아스파라긴이 글루타민으로 치환되었으며, 142번 글리신이 아스파라긴으로 치환되었다. C9는 47번 이소류신이 류신으로 치환되고, 49번 아스파라긴이 류신으로 치환되었고, 50번 아스파라긴은 그대로 유지되었으며, 69번 알라닌과 71번 글리신은 발린으로 치환되고, 72번 글리신은 세린으로 치환되었다. 추가적으로, 139번 아스파라긴이 글루타민으로 치환되었으며, 142번 글리신이 아스파라긴으로 치환되었다. 등온열량측정기를 이용하여 해리 상수를 측정한 결과, E10이 보체 단백 분해 산물 C3a에 대해 0.6 nM의 가장 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였다(도 9). 이는 초기 선별된 H12와 비교 했을 때 결합력이 약 1,000배 향상된 결과이다.

이러한 결과를 통해 본 발명자는 자연적으로 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a의 수용체보다 높은 결합력을 갖는 리피바디를 성공적으로 확보하였으며, 이는 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적인 결합력을 갖는 폴리펩타이드임을 확인하였다.

실시예 4: 선별된 리피바디의 다른 단백질들에 대한 교차결합 여부 확인

자연적으로 존재하는 보체 단백 분해 산물 C3a는 보체 단백 분해 산물 C5a과 43.6 %의 높은 서열 유사성을 지니고 있다. 따라서, 선별한 E10 리피바디가 특이적으로 C3a에만 강한 결합력을 보이는지 확인하기 위해 보체 단백 분해 산물 C5a (RnD Systems, USA) 및 BSA와의 교차결합 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.

각각의 단백질을 96-웰 플레이트에 코팅 후 E10 리피바디를 디스플레이하고 있는 파지를 가하여 결합 정도를 효소결합 면역침강법 (ELISA)으로 확인한 결과, 선별한 E10 리피바디는 C3a에만 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (도 11).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은, 보체 단백 분해 산물 C3a에 높은 결합력을 갖는 리피바디를 성공적으로 확보하였으며, 이는 표적 단백질인 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적인 결합 능력을 갖는 폴리펩타이드임을 확인하였다.

실시예 5: 선별된 리피바디의 전 염증성 반응 억제 능력 확인

보체 단백 분해 산물 C3a는 염증 반응과 관련이 있고, 특히 인터루킨-6 (Interleukin-6)와 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-α)와 같은 사이토카인의 분비와 관련된 전 염증성 반응을 유도한다고 알려져 있다. 이에 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 선별된 리피바디가 전 염증성 반응을 억제할 수 있는지 그 활성을 확인하기 위하여 단핵구로부터의 인터루킨-6 (Interleukin-6)와 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-α)의 생성 및 분비 정도를 측정하는 실험을 수행하였다.

억제 여부를 확인하기 위하여 말초 혈액 단핵세포로부터 분리된 단핵구에 선별된 리피바디를 처리하여, 처리 전 후의 인터루킨-6 (Interleukin-6)와 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-α)의 생성 정도를 효소면역침강법 (ELISA)를 통해 분석한 결과, 리피바디가 처리됨에 따라 인터루킨-6 (Interleukin-6)와 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-α)의 생성 정도가 감소되는 것을 확인하였다(도 12).

실시예 6: 이중 결합 복합체로서의 결합 가능성 확인

실시예 6-1: 이중 결합 복합체 제조

대한민국 특허 제10-1713944-0000호에 기재된 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF)에 특이적으로 결합하는 리피바디를 본 발명에서 개발한 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 리피바디 E10와 GGGGS 링커 서열을 융합한 복합체를 포함한 pET21a 발현 벡터(Novagen, USA)를 제조하였다. 두 리피바디 사이에 링커를 2개 융합 시킨 것 (X2)과, 4개 융합시킨 것 (X4) 총 두 가지를 제조하였으며, 이를 대장균에서 발현시켜, C2-X2-E10과 C2-X4-E10 복합체 (서열번호 7; 서열번호 8)를 제조하였다 (도 13).

또한, 같은 전략으로 대한민국 특허 제10-1624702-0000호에 기재된 보체 단백질 C5a와 결합하는 리피바디를 본 발명에서 개발한 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 리피바디 E10과 GGGGS 링커 서열을 융합한 복합체를 포함한 pET21a 발현 벡터(Novagen, USA)를 제조하였다. 두 리피바디 사이에 링커를 2개 융합 시킨 것 (X2)과, 4개 융합시킨 것 (X4) 총 두 가지를 제조하였으며, 이를 대장균에서 발현시켜, E8-X2-E10과 E8-X4-E10 복합체 (서열번호 9; 서열번호 10)를 제조하였다 (도 14).

실시예 6-2: 이중 결합 복합체의 이중 결합 여부 분석

이중 결합 여부를 확인하기 위하여 상기 복합체를 보체 단백 분해 산물 C3a 및 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF)에 동시에 노출시켜 효소면역침강법 (ELISA)으로 이중 결합 여부를 확인한 결과, 복합체는 보체 단백 분해 산물 C3a 및 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 모두에 동시에 결합함을 확인하였다 (도 15).

이중 결합 여부를 확인하기 위하여 상기 복합체를 보체 단백 분해 산물 C3a 및 보체 단백질 C5a에 동시에 노출시켜 효소면역침강법 (ELISA)으로 이중 결합 여부를 확인한 결과, 복합체는 보체 단백 분해 산물 C3a 및 보체 단백질 C5a 모두에 동시에 결합함을 확인하였다 (도 16).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel polypeptide binding with human complement component 3a and usese thereof <130> P19-B341 <160> 14 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Repebody-Library <220> <221> misc_feature <222> (139)..(140) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (145)..(146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (148)..(149) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (205)..(206) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (211)..(212) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (214)..(215) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcnn kgcgnnknnk tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctgnnkctg nnknnkaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg 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Ser Val Thr Asp Ala Val 290 295 300 Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Tyr Ala Thr Ser Ser 305 310 315 320 Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn Val Arg Tyr 325 330 335 Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala Leu Lys Glu 340 345 350 Leu Thr Asn Leu Met Tyr Leu Leu Leu Met Pro Asn Gln Leu Gln Ile 355 360 365 Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu Val 370 375 380 Leu Trp His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys 385 390 395 400 Leu Thr Asn Leu Thr Arg Leu Gln Leu Asn Asn Asn Gln Leu Gln Ser 405 410 415 Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp 420 425 430 Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp Lys 435 440 445 Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser 450 455 460 Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp 465 470 475 480 Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu 485 490 495 Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val 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misc_feature <222> (50)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 cgtcagttta tcaaagacgc cattcggcag gctctgcagt tggttmnnmn ncagmnncag 60 atacgtcaga ttggtcagtt c 81

Claims

서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되고, 보체 단백 분해 산물 C3a에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드.
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제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 보체 단백 분해 산물 C3a에 결합하여 그의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
다음의 단계를 포함하는 보체 단백 분해 산물 C3a에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 제조방법:
(i) 제10항의 재조합 미생물을 배양하여 제1항의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
(ii) 상기 배양된 재조합 미생물 또는 배양물로부터 제1항의 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 표시되고, 보체 단백 분해 산물 C3a 및 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 이중 결합 리피바디(bispecific repebody).
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서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열로 표시되고, 보체 단백 분해 산물 C3a 및 보체 단백질 C5a에 특이적으로 결합하는 이중 결합 리피바디(bispecific repebody).
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