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KR102385934B1 - 안구 질환을 치료하기 위한 abcb5(+) 줄기 세포 - Google Patents

안구 질환을 치료하기 위한 abcb5(+) 줄기 세포 Download PDF

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KR102385934B1
KR102385934B1 KR1020157025733A KR20157025733A KR102385934B1 KR 102385934 B1 KR102385934 B1 KR 102385934B1 KR 1020157025733 A KR1020157025733 A KR 1020157025733A KR 20157025733 A KR20157025733 A KR 20157025733A KR 102385934 B1 KR102385934 B1 KR 102385934B1
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마르쿠스 하. 프랑크
나타샤 와이. 프랭크
브루스 크샌더
파라스케비 에비 코로보우
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
더 셰펜스 아이 리써치 인스티튜트, 인크.
브이에이 보스톤 헬스케어 시스템
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Abstract

본 발명의 다양한 측면 및 실시양태는 안구 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법, 안구 줄기 세포를 단리하는 방법, 이식을 위한 안구 이식편을 선택 및/또는 생성하는 방법, 및 안구 세포 재생을 촉진하는 방법, 뿐만 아니라 단리된 안구 줄기 세포 표면 상에서의 ABCB5의 발현을 특징으로 하는 단리된 안구 줄기 세포를 함유하는 이식편 및 제제에 관한 것이다.

Description

안구 질환을 치료하기 위한 ABCB5(+) 줄기 세포 {ABCB5(+) STEM CELLS FOR TREATING OCULAR DISEASE}
관련 출원
본원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 2월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 61/766,424의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구
본 발명은 미국 국립 보건원 및 국립 암 연구소에 의해 부여된 5R01CA113796 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
윤부 줄기 세포는 마우스에서 느리게 순환하는, 표지-보유 세포로서 식별되어 있다. 윤부 줄기 세포는 인간에서 핵 전사 인자 ΔNp63α를 발현하고, 각막 상피 분화 마커, 예컨대 KRT12의 발현은 부족하다 [2,8] (도 1a). 윤부 줄기 세포는 일시적 증폭 세포를 생성하고, 이는 눈 발생 마스터 조절자 PAX6을 발현하고 [9], 각막 발생 및 재생 동안 윤부에서 벗어나 이동하여 KRT12(+) 중심 각막 상피를 생성한다 [10].
본 발명은, 일부 측면에서, 일반적으로 예를 들어 각막 질환 및/또는 망막 질환과 같은 안구 병태의 치료를 위한 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, 인간 줄기 세포)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은, 부분적으로, ABCB5가 눈의 줄기 세포에서 발현되고, 이러한 ABCB5(+) 줄기 세포는 정상 눈 발생에 필요하며, 안구 상처 (예를 들어, 안구 표면 상처)를 갖는 대상체에게 투여된 경우에 이들 세포는 세포를 재생시킬 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 예를 들어, 정상 각막 발생에 필요한 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포는 각막을 재생시킬 수 있다. 유사하게, 정상 망막 발생에 필요한 ABCB5(+) 망막 색소 상피 (RPE) 세포는 망막을 재생시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 측면에서, 본원은 안구 병태를 갖는 대상체에게 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포를 상기 대상체에서 안구 세포를 재생시키는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 안구 병태는 각막 질환이다. 일부 실시양태에서, 각막 질환은 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)으로 인한 실명이다. "윤부 줄기 세포 결핍"은 본원에서 중증 또는 전체, 편측 또는 부분적 LSCD를 지칭한다 [5]. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포는 각막 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 안구 병태는 망막 질환이다. 일부 실시양태에서, 망막 질환은 황반 변성이다. 일부 실시양태에서, 망막 질환은 망막염이다. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 망막 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) RPE 줄기 세포)는 각막 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 안구 병태는 안구 상처이다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 안구 이식편으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 안구 이식편은 1 내지 약 107개의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 107개 초과의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 안구 이식편으로서 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원은 안구 세포의 혼합 집단을 제공하는 단계, 및 혼합 집단으로부터 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 안구 세포의 혼합 집단으로부터 윤부 줄기 세포를 단리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원은 안구 이식편에서 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포의 개수를 식별하는 단계, ABCB5(+) 윤부 줄기 세포의 개수를 이식편의 총 세포 집단과 비교하는 단계, 및 비교에 기초하여, 이식을 위한 안구 이식편을 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 혼합 집단의 세포를 인간 ABCB5에 선택적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원은 기질을 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포로 시딩하여 안구 이식편을 생성하는 것을 포함하는, 대상체에의 이식을 위한 안구 이식편을 생성하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 기질은 피브린 겔, 양막, 아미노글리칸 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 인공 각막이다. 이러한 실시양태에서, 기질, 예를 들어, 인공 각막은 무세포성 콜라겐을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 본원은 대상체에의 이식을 위한 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된 안구 이식편을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원은 윤부 줄기 세포를 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포로서 식별하는 단계 및 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포를 안구 세포 재생의 촉진을 필요로 하는 대상체에게 안구 세포 재생을 촉진하는데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 안구 세포 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 측면에서, 본원은 세포 표면 상에서의 ABCB5의 발현을 특징으로 하는 윤부 줄기 세포의 단리된 제제를 제공한다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포는 안구 이식편으로서 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 1 내지 약 107개의 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포가 이식에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 단리된 ABCB5(+) 인간 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 동종 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 동계 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 ABCB5(+) 안구 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포는 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포는 단리된 ABCB5(+) 인간 윤부 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 피부 줄기 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포)가 아니다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 투여 단계 전에 생체외 확장된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본 발명의 일부 측면에서, 본원은 임의의 상기 이식편 또는 줄기 세포 제제를 수용하는 용기, 및 이식편 또는 제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 대한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
안구 병태를 치료하기 위한 본 발명의 이식편 또는 줄기 세포 제제의 용도가 또한 본 발명의 측면으로서 제공된다.
또한, 안구 병태를 치료하기 위한 본 발명의 줄기 세포 제제의 의약을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명은 그의 적용에서 하기 설명에 기재되거나 도면에 예시된 구성요소의 구축 및 배열의 세부 사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 각각의 상기 실시양태 및 측면은 임의의 다른 실시양태 또는 측면과 연결될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명을 위한 것으로, 제한사항으로 여겨져서는 안된다. 본원에서 "비롯한", "포함하는", 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는", 및 그의 변형의 사용은 그 다음에 나열되는 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라 추가의 항목을 포괄하는 것으로 의도된다.
첨부 도면은 일정한 비례로 도시된 것으로 의도되지 않는다. 명확화를 위해, 모든 구성요소가 모든 도면에 표시되어 있지 않을 수 있다. 하기 도면에서:
도 1a는 각막 구조 및 윤부 줄기 세포 니치의 개략도를 제시한다.
도 1b는 윤부에서 표지-보유 세포 집단의 존재를 식별시켜주는 BrdU-표지된 해리된 뮤린 각막 세포의 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다.
도 1c는 뮤린 윤부에서 ABCB5 및 BrdU의 공발현을 도시하는 면역형광 영상을 제시한다.
도 1d는 뮤린 윤부에서 ABCB5 및 BrdU의 공발현을 도시하는 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다. 막대 그래프 (우측)는 독립적 실험 (n=4)의 정량 분석을 예시한다.
도 1e는 기저 상피 층에서의 ABCB5 발현 (녹색)을 도시하는, 인간 각막으로부터의 접선 윤부 단면의 대표적인 면역조직화학적 분석을 제시한다.
도 1f는 ΔNp63α (녹색)와 ABCB5 (적색)의 공발현을 도시하는, 인간 각막으로부터의 접선 윤부 단면의 대표적인 면역조직화학적 분석을 제시한다.
도 1g는 ΔNp63α와 ABCB5의 공발현을 도시하는, 인간 윤부 상피 세포의 대표적인 세포측정 분석을 제시한다. 막대 그래프는 ABCB5(+) 및 ABCB5(-) 세포 상에서의 ΔNp63α 발현 (좌측 패널), 및 ΔNp63α(+) 및 ΔNp63α(-) 세포 상에서의 ABCB5 발현 (우측 패널)을 제시한다. 데이터는 평균 ± s.e.m., n=3 실험으로 도시된다.
도 1h는 ABCB5 및 KRT12 공발현의 이중 색상 유동 세포측정 분석을 제시한다.
도 1i는 수술 시점에 수행된 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)을 갖는 환자로부터의, 그리고 그의 각각의 공여자로부터의 윤부 생검에서 ABCB5 발현의 대표적인 면역조직화학적 분석을 제시한다. 막대 그래프는 건강한 공여자 및 LSCD를 갖는 환자에서의 ABCB5(+) 세포 (녹색)의 개수를 제시한다 (환자/공여자당 n=8 절편).
도 2a는 뮤린 Abcb5 유전자좌 및 단백질 위상의 개략도를 제시한다. 위상 구조는 TMHMM 막 위상 예측 알고리즘에 의해 결정되었고, TOPO2 소프트웨어를 사용하여 디스플레이하였다. Abcb5 녹아웃 (KO) (돌연변이체) 마우스에서 결실된 아미노산 잔기는 적색으로 하이라이팅된다.
도 2b는 Abcb5 KO 마우스의 생성에 사용된 전략의 개략적 요약도를 제시한다.
도 2c, 좌측 패널은 마우스 유전자형 결정에 사용된 게놈 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석의 전기영동 영상을 제시하며, 이는 113-염기 쌍 야생형 (WT) 대립유전자 및 322-염기 쌍 결실된 대립유전자를 입증한다. 도 2c, 우측 패널은 ABCB5 모노클로날 항체 (mAb) 3C2-1D12에 의한 뮤린 단백질 용해물의 웨스턴 블롯을 제시하며, 이는 Abcb5 KO 마우스에서 예측된 크기의 80 kD 단백질 밴드의 상실을 밝혀내었다.
도 2d는 슬릿 램프 검사 (좌측 패널), 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 (중앙 패널) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색 (우측 패널)을 사용한, 뮤린 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 각막의 표현형 특성화 영상을 제시한다. 아래 막대 그래프는 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 뮤린 중심 각막 및 윤부에서의 DAPI(+) 상피 세포의 개수를 도시한다. 제시된 데이터는 평균 ± s.e.m., n=4 실험을 나타낸다.
도 2e는 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스에서 PAX6, KRT12 및 KRT14의 LC-비오틴 확산 분석 및 면역형광 단백질 발현 분석을 제시한다. 막대 그래프는 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 마우스에서의 퍼센트 PAX6(+) 및 KRT12(+) 상피 세포를 도시한다. 제시된 데이터는 평균 ± s.e.m., n=6 실험을 나타낸다.
도 2f는 상피 변연절제 상처형성 48시간 후 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 각막의 H&E 및 DAPI 염색을 제시한다. 막대 그래프 (하부)는 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스에서 절편당 DAPI(+) 세포의 개수를 나타낸다. 제시된 데이터는 평균 ± s.e.m., n=4 실험을 나타낸다.
도 2g는 상피 변연절제 상처형성 48시간 후 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스의 윤부 및 중심 각막에서의 Ki67의 면역형광 분석을 제시한다. 막대 그래프 (하부)는 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 마우스의 윤부 및 각막에서의 Ki67(+)의 백분율을 나타낸다 (각각 평균± s.e.m., n=4 실험).
도 2h는 상피 변연절제 상처형성 48시간 후 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스의 윤부 및 중심 각막에서 TUNEL 염색의 면역형광 분석을 제시한다. 막대 그래프 (하부)는 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 마우스의 윤부 및 각막에서 TUNEL+ 상피 세포의 백분율을 나타낸다 (각각 평균± s.e.m., n=4 실험).
도 3a는 8-주 추적 후 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 윤부 상피 세포에서 BrdU 표지-보유 세포의 상실을 제시하는 유동 세포측정 분석을 제시한다.
도 3b는 1-주 추적 후 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 윤부 상피 세포에서 BrdU 표지-보유 세포의 상실을 제시하는 유동 세포측정 분석을 제시한다 (평균 ± s.e.m., n=6 실험).
도 3c는 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스 윤부 및 각막에서 Ki67 발현의 면역형광 분석을 제시한다. 우측의 막대 그래프는 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스에서 윤부 및 각막 내 Ki67(+) 세포의 백분율을 예시한다. 평균 ± s.e.m. (n=3 실험)으로 예시된다.
도 3d는 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 각막에서 p53, p63, p21 및 p16의 mRNA 발현의 그래프를 제시한다. 막대는 Abcb5 WT 마우스에서의 mRNA 발현 수준의 백분율로서 Abcb5 KO 마우스에서의 상대 mRNA 발현 수준을 나타낸다 (평균 ± s.e.m., n=4 실험).
도 3e는 세포 주기 조절 및 정상 각막 발생 및 재생에서의 ABCB5의 역할의 개략적 요약도를 제시한다. Abcb5 KO 마우스에서 ABCB5 발현의 종료 (청색)는 BrdU(+) 표지-보유 세포의 상실, 및 p63을 비롯한 중요한 세포 주기 조절자의 하향 조절을 야기한다. 이는 Abcb5 KO 마우스에서의 증진된 Ki67 발현에 의해 입증되는 바와 같은 증가된 세포 증식으로 이어진다. 증대된 증식 및 세포 주기로부터의 퇴거 불능은 감소된 PAX6 및 KRT12 발현에 의해 입증되는 현저한 분화 결핍 및 증진된 TUNEL 염색에 의해 입증되는 Abcb5 KO 마우스에서의 증가된 아폽토시스 속도를 설명한다.
도 4a는 C57BL/6 수용자 마우스에 이식된 뮤린 동계 공여자 세포 이식물의 분석을 제시한다.
도 4b는 면역결핍 NSG 수용자 마우스에 이식된 인간 이종 공여자 세포 이식물의 분석을 제시한다. 영상은 실험적으로 유도된 LSCD의 치료를 위해 수행된 이식 5주 후의 조직을 제시한다. 도 4a 및 4b에서, 수용자 마우스는 공여자 세포 무함유 (각각 2행), ABCB5(-) 세포 함유 (각각 3행), 비분리 윤부 상피 세포 함유 (각각 4행), 또는 ABCB5(+) 세포 함유 (각각 5행) 피브린 겔 이식편을 제공받았다. 참조로서, 정상 비치료 (LSCD가 유도되지 않음) C57BL/6 및 NSG 뮤린 각막을 도 4a 및 도 4b의 각각 1행에 제시한다. 각막 투명성은 슬릿 램프 검사에 의해 평가하였다 (도 4a, 4b, 1열). 상피 완전성 및 재생은, 상피 두께 및 중층화에 대해서는 H&E 염색에 의해 (2열 - 20x 배율; 3열 - 40x 배율), 신생혈관화와 연관된 배상 세포 검출에 대해서는 과아이오딘산-쉬프 염색 (PAS)에 의해 (도 4a, 4열), 및 분화된 각막 상피 세포의 검출에 대해서는 Krt12 염색 (녹색)에 의해 (도 4a, 4b, 5열) 평가하였다. 핵은 DAPI에 의해 염색된다 (적색). 우측의 막대 그래프는 이식 5주 후 수용자 각막에서의 뮤린 KRT12(+) 세포 (도 4a) 또는 인간 KRT12(+) 세포 (도 4b)의 백분율을 제시한다. 도 4b에서 우측 하부 패널은 각막 수선에 대한 인간 공여자 세포 기여를 평가하기 위한, 인간 세포로 이식된 뮤린 눈의 RT-PCR 분석을 제시한다.
도 5a는 BrdU 펄스-추적 실험을 위한 실험 설계의 개략적 요약도를 제시한다.
도 5b는 BrdU를 제공하지 않은 WT 마우스 (좌측 2개 패널) 또는 BrdU를 제공하고 8주 추적한 WT 마우스 (우측 2개 패널)의 윤부 상피 세포에서 BrdU 표지-보유 세포의 특이적 염색을 도시한, 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다. 윤부 상피 세포를 회수하고 항-BrdU 항체 (Ab), 또는 이소형 대조군 Ab로 염색하였다. 게이트 내 BrdU-양성 세포의 백분율을 각각의 플롯 상에 표시한다.
도 6은 윤부 상피의 위치를 보여주는, 인간 공여자 각막으로부터의 접선 윤부 단면의 개략도를 제시한다. ABCB5(+) 세포 (녹색 세포로 개략적으로 도시됨)는 기저 상피 층에 위치하는 것으로 발견되었다.
도 7은 LSCD를 갖는 환자 (환자 1)로부터의 윤부 생검을 제시한다. 화학 화상을 입은 환자 1로부터 윤부 생검을 수득한 후, 관통 각막성형술 플러스 사체 공여자 눈 (공여자 1)으로부터의 각막-윤부 동종이식편을 제공하였다. 일련의 생검 단면을 H&E, 이소형 대조군 Ab 또는 ABCB5 mAb로 염색하였다. 공여자 1의 윤부 상피에서의 ABCB5 염색은 ABCB5-양성 세포 집단을 밝혀낸 반면에, ABCB5 양성은 환자 1의 윤부 상피에서 감소되었다. 면역형광 염색 사진은 20x 배율에서의 순차적 사진의 몽타주이다.
도 8은 LSCD를 갖는 환자 (환자 2)로부터의 윤부 생검을 제시한다. 자가면역 각막 융해, 말초 궤양성 각막염 및 부분적인 윤부 줄기 세포 결핍을 갖는 환자 2로부터 윤부 생검을 수득한 후, 환자의 정상 반대쪽 눈 (공여자 2)로부터의 각막-윤부 자가이식편을 제공하였다. 일련의 생검 절편을 H&E, 이소형 대조군 Ab 또는 ABCB5 mAb로 염색하였다. ABCB5 양성이 공여자 2의 윤부 상피의 기저 층에 존재한 반면에, 유의하게 감소된 상피 층 및 ABCB5 염색 부재가 환자 2의 윤부에서 관찰되었다. 면역형광 염색의 사진은 20x 배율에서의 순차적 사진의 몽타주이다.
도 9는 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스의 윤부 또는 중심 각막 상피의 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다. 전방 산란 (FSC) 및 측방 산란 (SSC)은 각각 세포 크기 및 입상도를 보여준다. Abcb5 KO 마우스의 중심 각막 상피는 Abcb5 WT 상피 (좌측 패널)와 비교하여, 보다 작은 세포 (좌측 게이트)는 그렇지 않지만 보다 큰 세포 (우측 게이트)의 감소로 인해 감소된 상피 세포의 개수를 제시한다. 윤부 상피 세포 (우측 패널)의 개수에서는 어떠한 감소도 존재하지 않았다. 4개의 눈으로부터 풀링된 샘플의 대표적인 결과를 제시한다 (n=3 실험).
도 10은 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스의 윤부 (상단) 또는 중심 각막 (하단)으로부터 수거된 상피 세포의 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다. 발견된 세포를 이소형 대조군 항체, 항-Pax6 항체 또는 항-Krt12 항체로 염색하였다. Abcb5 KO 마우스의 중심 각막에서 PAX6(+) 및 KRT12(+) 상피 세포의 감소된 빈도가 존재하였고, Abcb5 KO 마우스의 윤부에서 PAX6(+) 세포의 상응하는 감소된 빈도가 존재하였다. 적색 게이트는 이소형 대조군 염색과 비교하여 PAX6(+) 또는 KRT12(+) 세포를 식별시켜 준다. n=3 실험의 대표적인 분석을 제시한다.
도 11a는 2 mm 트레핀으로 마킹되고 상피가 제거되어 변연절제된 상처 영역을 제시한다.
도 11b는 상처 변연 및 노출된 중심 각막 기질을 도시하는, 중심 상피 변연절제 직후의 각막의 DAPI-염색된 단면을 제시한다. 영상은 10x 배율에서의 순차적 사진의 몽타주이다.
도 11c는 변연절제 1, 24, 및 48시간 후에 모니터링한 각막 상피 상처 폐쇄의 형광 영상을 제시한다.
도 11d는 상처 폐쇄 속도의 그래프를 제시하며, Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스 사이에 유의차는 존재하지 않았다 (n=2 반복 실험의 요약).
도 12는 각막 상피 변연절제 상처 48시간 후의 Abcb5 WT (상단) 및 Abcb5 KO (하단) 마우스의 대표적인 DAPI-염색된 복합 각막 단면을 제시하며, Abcb5 KO 마우스에서 상피 세포의 감소된 개수가 입증된다. 백색 파선은 상피와 기질의 경계를 표시하고; 백색 박스는 20x 배율에서 보여지는 영역을 나타내고 (몽타주 사진은 10x 배율에서의 것임); 백색 선은 상피 세포가 계수된 영역의 경계를 표시한다. 상피 세포는 2회의 개별 실험에서 군당 3마리의 반복 마우스에서 적어도 3개의 연속 복합 단면 내 표준화된 영역 내에서 계수하였다 (데이터는 도 2f에 제시됨).
도 13은 각막 상피 변연절제 상처 48시간 후의 Abcb5 WT (상단) 및 Abcb5 KO (하단) 마우스의 대표적인 TUNEL-염색된 복합 각막 단면을 제시하며, Abcb5 KO 마우스에서 아폽토시스 세포의 증가된 개수가 입증된다. 백색 박스로 규정된 영역은 20x 배율로 보여진다 (몽타주 사진은 10x 배율에서의 것임). TUNEL-양성 상피 세포의 개수를 계수하고, 2회의 반복 실험으로부터의 데이터를 도 2h에 요약한다.
도 14a는 공여자 각막으로부터 ABCB5(+) 및 ABCB5(-) 윤부 상피 세포의 회수 및 분리에 이어 공여자 세포를 함유하는 피브린 겔의 제조에 대한 개략도를 제시한다.
도 14b는 수용자 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍의 유도 및 공여자 이식편의 이식에 대한 개략도를 제시한다.
도 15a는 뮤린 공여자 윤부 상피 세포의 분류 게이트 및 생존율을 제시하는 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다. 생존율은 DAPI를 제외한 세포의 백분율로 제시된다.
도 15b는 뮤린 공여자로부터 단리된 윤부 상피 세포의 ABCB5(+)-보강 및 ABCB5(-)-보강 하위집단의 순도 및 생존율을 도시하는 분류-후 분석을 제시한다. 생존율은 DAPI를 제외한 세포의 백분율로 제시된다.
도 15c는 인간 공여자 윤부 상피 세포의 분류 게이트 및 생존율을 제시하는 대표적인 유동 세포측정 분석을 제시한다.
도 15d는 인간 공여자로부터 단리된 윤부 상피 세포의 ABCB5(+)-보강 및 ABCB5(-)-보강 하위집단의 순도 및 생존율을 도시하는 분류-후 분석을 제시한다. 생존율은 DAPI를 제외한 세포의 백분율로 제시된다.
도 16은 유도된 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD) 제공에 이어 하기 동계 뮤린 윤부 상피 세포 하위집단: (i) 세포 무함유 (음성 대조군), (ii) ABCB5(+) 세포, (iii) ABCB5(-) 세포 또는 (iv) 비분리 세포 함유 공여자 피브린 겔 이식물의 생착 5주 후 수용자 C57BL/6J 마우스의 대표적인 H&E 복합 각막 단면을 제시한다. 정상 비치료 각막 (LSCD 없음)은 양성 대조군으로서 제공하였다. 양성 대조군은 전형적인 중층 각막 상피 및 홍채각막각을 디스플레이한다. 세포 무함유 이식물을 제공받은 마우스는 LSCD 후에 발생하는 전형적인 결막화를 디스플레이하였고, 즉 비중층 결막 상피가 광범위한 염증, 신생혈관화 및 기질 부종을 갖는 각막을 덮는다. 유착 (홍채가 각막에 부착된 경우)은 전형적인 심한 전안부 염증이다. 대조적으로, ABCB5(-) 세포는 그렇지 않지만, ABCB5(+) 세포의 이식물을 제공받은 마우스는 어떠한 염증, 신생혈관화, 기질 부종, 또는 유착의 증거없이 회복된 중층 각막 상피를 디스플레이하였다. 비분리 윤부 상피 세포의 이식물을 제공받은 마우스는 비중층 상피를 갖는 기질 부종 영역을 디스플레이하였고, 다른 각막 부분은 정상 중층 상피 세포를 함유하였다.
도 17은 LSCD 유도에 이어 하기 인간 윤부 상피 세포 하위집단: (i) 세포 무함유 (음성 대조군), (ii) ABCB5(+) 세포, (iii) ABCB5(-) 세포, 및 (iv) 비분리 세포 함유 공여자 피브린 겔 이식편의 5주 후 수용자 면역결핍 NSG 마우스의 대표적인 H&E 복합 각막 단면을 제시한다. 정상 비치료 NSG 각막 (LSCD 없음)은 양성 대조군으로서 제공하였다. 양성 대조군은 전형적인 중층 각막 상피 및 홍채각막각을 디스플레이한다. 세포 무함유 이식물을 제공받은 마우스는 LSC 결핍 후에 발생하는 결막화의 증거를 디스플레이하였고, 즉 비중층 결막 상피가 광범위한 신생혈관화 및 유착을 갖는 각막을 덮는다 (전안부 염증은 NSG 마우스에서 그의 면역결핍으로 인해 소거됨). 대조적으로, ABCB5(+) 세포를 함유하는 이식물을 제공받은 마우스는 회복된 중층 상피 영역을 디스플레이한 반면에서, ABCB5(-) 세포 이식편을 제공받은 마우스는 그렇지 않았다.
도 18은 LSCD 유도에 이어 하기 동계 뮤린 윤부 상피 세포 하위집단: (i) 세포 무함유 (음성 대조군), (ii) ABCB5(+) 세포, (iii) ABCB5(-) 세포, 또는 (iv) 비분리 세포 함유 공여자 피브린 겔 이식편의 5주 후 수용자 C57BL/6J 마우스의 대표적인 면역형광 Krt12 염색 (녹색)을 제시한다. 여기서 양성 대조군으로서 제시된 정상 비치료 뮤린 각막 (LSCD 없음)은 높은 강도의 KRT12 염색을 디스플레이하였다. 예상된 바와 같이, 세포 무함유 이식편을 제공받은 마우스는 어떠한 KRT12 발현도 디스플레이하지 않았다. 대조적으로, ABCB5(+) 세포를 이식받은 마우스는 비분리 윤부 상피 세포를 이식받은 마우스와 비교하여 유의하게 증진된 KRT12 발현을 나타내었다. ABCB5(-) 세포를 이식받은 마우스에서는 어떠한 KRT12 발현도 검출되지 않았다. 백색 박스는 40x 배율로 제시된 영역을 도시한다. 몽타주 영상은 10x 배율로 제시된다.
각막 상피 항상성 및 재생은 눈의 기저 윤부 상피에 존재하는 윤부 줄기 세포 (LSC) 집단에 의해 유지된다 [1-3]. 이들 세포는 손상된 세포를 대체하기 위한 새로운 각막 세포를 생성하고, 손상 또는 질환으로 인한 LSC의 상실은 전세계적으로 실명의 주요 원인이다 [4]. 건강한 눈으로부터의 LSC의 이식은 종종 LSCD를 갖는 환자가 이용가능한 유일한 치료 옵션이다. 이식 성공은 최우선적으로 이식편 내의 LSC의 빈도에 의존한다 [5]. 그러나, 본 발명 이전에는, 이러한 세포 하위세트의 향후의 보강을 가능하게 하는 윤부 줄기 세포 유전자가 보고된 적이 없다 [5].
본 발명은, 부분적으로, ATP-결합 카세트, 서브패밀리 B (MDR/TAP), 구성원 5 (ABCB5) [6,7]가 LSC를 마킹하고, 윤부 줄기 세포 유지, 각막 발생 및 수선에 필요하며, 공여자로부터 향후 단리될 ABCB5-양성 (ABCB5 (+)) LSC는 이식 시 각막을 회복시키는 배타적 능력을 보유한다는 발견을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태는 안구 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법, 눈의 ABCB5(+) 줄기 세포를 단리하는 방법, 이식을 위한 안구 이식편을 선택하고/거나 생성하는 방법, 및 안구 세포 재생을 촉진하는 방법, 뿐만 아니라 그의 세포 표면 상에서의 ABCB5의 발현을 특징으로 하는 단리된 안구 줄기 세포를 함유하는 이식편 및 제제에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 본원에서 ABCB5가 야생형 마우스에서 생체내 표지-보유 LSC 상에서 및 건강한 인간의 ΔNp63α-양성 LSC 상에서 균일하게 발현된다는 것을 입증하였다. 이러한 발견과 일치되게, 본 발명자들은 또한 ABCB5-양성 윤부 줄기 세포 빈도가 LSCD 환자에서 유의하게 감소됨을 입증한다. 새롭게 생성된 Abcb5 녹아웃 (KO) 마우스를 사용한 ABCB5 기능 상실 연구는 증진된 증식 및 아폽토시스로 인한 정지 LSC의 고갈을 유발하고, 결함있는 각막 분화 및 상처 치유를 야기하였고, 이는 각막을 회복시키는 것에 대한 ABCB5(+) LSC의 입증된 능력을 설명한다. 뮤린 유전자 KO, 생체내 윤부 줄기 세포 추적 및 윤부 줄기 세포 이식 모델로부터의 결과, 및 인간 생검 시편의 표현형 및 기능적 이식물 분석에서의 공동 발견은 ABCB5가 포유동물 LSC를 식별한다는 수렴선상 증거를 제공한다. 각막 발생 및 수선에서 본질적 기능을 갖는 분자적으로 규정된 LSC의 식별 및 향후의 단리는 각막 질환, 특히 LSCD로 인한 각막 실명의 치료를 위한 중요한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "ABCB5(+) 줄기 세포"는 자가-재생능 및 다중 성체 세포 계통의 성숙한 세포로의 분화능을 갖는 세포를 지칭한다. 이들 세포는 세포 표면 상에서의 ABCB5의 발현을 특징으로 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ABCB5(+) 줄기 세포는 윤부 줄기 세포이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ABCB5(+) 줄기 세포는 망막 줄기 세포이다. ABCB5(+) 줄기 세포는 눈의 기저 윤부 상피 또는 망막 색소 상피 (RPE)로부터 수득 (예를 들어, 단리 또는 유래)될 수 있다. 일부 실시양태에서, ABCB5(+) 줄기 세포는 인간 눈으로부터 수득된다. 다른 ABCB5(+) 줄기 세포 유형, 예컨대 예를 들어 중심 각막으로부터 수득되는 것은 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태에서 사용될 수 있다.
ABCB5(+) 안구 줄기 세포는 기저 윤부 상피 또는 RPE의 안구 세포를 비롯한 눈 조직 샘플을 단리한 다음, ABCB5(+) 줄기 세포를 정제하는 것에 의해 대상체로부터 수득될 수 있다. 통상의 기술자는 샘플이 다수의 방식으로 ABCB5를 갖는 안구 줄기 세포에 대해 보강될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 안구 줄기 세포는 항체 또는 다른 결합 분자에 의한 세포 표면 분자 상의 ABCB5의 결합을 통해 선택될 수 있다. 안구 세포는 공여자로부터 직접 수득될 수 있거나, 또는 동결보존 저장물로부터 검색될 수 있다. 안구 줄기 세포는, 예를 들어 ABCB5에 대한 항체를 사용하여 단리될 수 있고, 이후의 사용을 위해 표준 방법론을 사용하여 배양물 중에 유지되거나, 예를 들어 액체 질소 중에 동결될 수 있다. 눈으로부터 세포를 수득하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 방법의 비제한적 예는 실시예 섹션에 기재되어 있고, 도 14a에 도시되어 있다.
본 발명은 안구 세포의 혼합 집단으로부터 ABCB5(+) 줄기 세포를 분리하기 위해 ABCB5-결합 분자, 예컨대 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, F(ab')2, Fab, Fd, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편을 사용하는 임의의 적합한 방법을 고려한다. 따라서, 안구 세포의 세포 현탁액을 제공하는 단계; 세포 현탁액을 ABCB5(+) LSC 상의 ABCB5를 비롯한 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 조합물과 접촉시키는 단계; 및 세포 현탁액으로부터 모노클로날 항체에 의해 결합된 세포를 분리하고 회수하는 단계를 포함하는, ABCB5(+) 줄기 세포 집단을 생성하는 방법이 본 발명에 포함된다. 모노클로날 항체는 고체-상에 연결될 수 있고, 눈 조직 샘플로부터 윤부 줄기 세포를 포획하는데 사용될 수 있다. 이어서 결합된 세포는 항체 및 고체 상의 속성에 따라 공지된 방법에 의해 고체 상으로부터 분리될 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 클론 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 본 발명의 세포 집단을 제조하는데 적절한 모노클로날 기반 시스템은 양성 또는 음성 선택을 위한 항체를 사용하는 자기 비드/상자성 입자 칼럼; 비오틴 또는 스트렙타비딘 친화도를 기반으로 하는 분리; 및 다른 세포 현택액 중에 혼합된 면역형광-염색된 LSC의 고속 유동 세포측정 분류를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 LSC 집단의 단리 및 표면 항원 ABCB5에 대해 생성된 모노클로날 항체 (예를 들어, ABCB5에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체)를 사용한 증진을 포함한다. 일부 경우에, ABCB5에 선택적으로 결합하는 상업적으로 입수가능한 항체 또는 항체 단편이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 모노클로날 항체가 다른 항원 (즉, ABCB5 이외의 항원)에 결합할 수 있는 친화도보다 더 큰 친화도로 ABCB5에 결합하거나 이에 결합할 수 있는 경우에 ABCB5에 선택적으로 결합하는 것으로 간주된다. 이러한 결합은 표준 단백질-단백질 상호작용 검정 (예를 들어, 항체-항원 또는 리간드-수용체 검정), 예컨대 예를 들어 제한 없이 효소-연결된 면역흡착 검정, 방사성면역검정 및 방사선면역필터 결합 검정을 비롯한 경쟁적 검정, 포화 검정 또는 표준 면역검정에 의해 측정되거나 결정될 수 있다.
ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 단리될 수 있다. 본원에 사용된 "단리된 ABCB5(+) 줄기 세포"는 그것이 원래 발견되는 유기체로부터 제거된 세포 또는 이러한 세포의 후손을 지칭한다. 단리된 세포는 또한 천연 환경 이외의 조건에 놓인 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 이후에 제2 유기체에 도입될 수 있거나, 또는 그것 (또는 그것이 유래된 세포 또는 세포 집단)이 단리된 유기체로 재도입될 수 있다. 이러한 세포는, 본 발명의 방법에 따라 조작되면, 여전히 단리된 세포인 것으로 간주된다. 용어 "단리된"은 이후의 다른 세포와의 조합물 또는 혼합물로의 또는 생체내 환경에서의 세포의 이후 사용을 배제하지 않는다.
본원에서 "조성물"은 단리된 세포 제제, 또는 조직 이식편 및 인공 이식편 (예를 들어, 무세포성 콜라겐 이식편)을 비롯한 이식편을 지칭할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 일부 경우에, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된다. 조성물은 ABCB5(+) 줄기 세포가 제제 중에 존재하는 우세한 세포 하위유형인 경우에 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된 것으로 간주된다. 예를 들어, ABCB5(+) 줄기 세포-보강 조성물은 조성물 중 세포의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)인 조성물이다. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된 조성물은 조성물 중 세포의 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이 ABCB5(-) 세포인 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 세포는 안구 세포가 유일하다. 즉, 일부 실시양태에서, 조성물은 비-안구 세포를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 ABCB5(-) 세포를 함유하지 않을 수 있다.
ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 실질적으로 순수한 제제로서 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC) 이외의 세포가 실질적으로 없는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 ABCB5(+) 줄기 세포 제제는 제제 중에 존재하는 총 세포의 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)인 제제를 구성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 및/또는 실질적으로 순수한 ABCB5(+) 세포 제제는 바람직할 수 있는 임의의 다른 성분, 예를 들어 세포 보존 또는 박테리아 성장 감소를 위한 작용제와 함께 주사 바이알, 앰플, 또는 주입 백과 같은 완성 제약 용기 내에 포장될 수 있다. 세포 제제는 단위 투여 형태로 존재할 수 있다.
ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 안구 병태를 치료하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 안구 병태는 안구 상처이며, 이는 안구 반흔형성으로 이어질 수 있고, 이어서 감소된 시력 또는 실명을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 각막 질환, 예컨대 예를 들어 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)으로 인한 실명을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC 및/또는 ABCB5(+) RPE 줄기 세포)는 망막 질환, 예컨대 예를 들어 황반 변성 또는 망막염/색소성 망막염을 치료하는데 사용될 수 있다. 황반 변성은 뚜렷하고 명료한 시야를 위해 필요한 중심 시각의 상실을 유발하는 황반의 열화를 포함한 일군의 병태를 지칭한다. 이는 65세 이상에서 시각 상실 및 실명의 주요 원인이다. 황반 변성은 또한 AMD 또는 ARMD (연령-관련 황반 변성)로 지칭될 수 있다. 망막염은 망막의 염증을 지칭하며, 이는 실명으로 이어질 수 있다. 유전적 상태 또는 염증 반응의 결과일 수 있는 색소성 망막염은 중심 시각 상실로 이어질 수 있는 진행성 말초 시각 상실 및 야간 시각 곤란 (야맹증)을 특징으로 하는 일군의 유전성 장애를 지칭한다.
단리된 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSCS 및/또는 ABCB5(+) RPE 줄기 세포)는 그를 필요로 하는 대상체에게 대상체에서 안구 세포를 재생시키는데 유효한 양 (본원에서 ABCB5(+) 줄기 세포의 "유효량"으로 지칭됨)으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 약 107개의 ABCB5(+) 줄기 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 단일의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 101 내지 약 107, 약 101 내지 약 106, 약 101 내지 약 105, 약 101 내지 약 104, 약 101 내지 약 103, 약 101 내지 약 102개의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107개 또는 그 초과의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 101개 미만의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 (예를 들어, ABCB5(+) 줄기 세포 제제 또는 이식편 형태의 조성물로서) 대상체에게 1회 초과하여 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 대상체는 수주, 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐 다중 용량 또는 이식편 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 초과)의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포를 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 제1 적용이 있고 다시 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 18개월, 21개월 또는 24개월 후에 투여된다. 적용 횟수 및 적용 빈도는, 제1 줄기 세포 투여/이식 후에 달성된 세포 재생의 정도에 의존할 수 있다. 줄기 세포 적용의 횟수 및 빈도는 의학 전문가 (예를 들어, 외과의사, 의사)에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 안구 병태를 갖는 대상체는, 예를 들어 각막 상피 내에 안구 상처 (예를 들어, 사멸, 손상 또는 감염된 안구 세포)를 갖는다. 따라서, 각막 상피는 본 발명에 따라 안구 병태를 갖는 대상체에서 상처형성된 것일 수 있다. ABCB5(+) 윤부 줄기 세포 이식편이 각막을 회복시키는데 사용될 수 있는 것으로 발견되었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 대상체의 각막 상피 표면의 완전성은 유효량의 ABCB5(+) LSC의 투여 후에 회복된다. 각막 재생은, 예를 들어 각막 투명성 (예를 들어, 불투명한 각막이 아닌 투명한 각막의 발생) 및/또는 시력을 기반으로 하여 평가될 수 있다. 안구 세포/줄기 세포 이식의 성공 (예를 들어, 세포 재생, 시력의 정도)을 평가하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 그 중 임의의 것이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 안구 세포/줄기 세포 이식의 성공을 평가하는 방법의 예는, 제한 없이, 슬릿 램프 영상화, 하이델베르크 망막 단층촬영 (HRT), 광 간섭 단층촬영 (OCT) 및 2-광자 영상화를 포함한다. 다른 예는, 제한 없이, 로즈 벵갈(Rose Bengal) (4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인) 염료 및 다른 상피 염색 용액의 사용을 포함한다.
ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 대상체에 대해 자가이거나 (동일한 대상체로부터 수득됨) 또는 대상체에 대해 동종 또는 동계인 세포와 같은 비-자가일 수 있다. 대안적으로, ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 대상체에 대해 이종인 공급원으로부터 수득될 수 있다.
동종은 대상체와 동일한 종에 속하거나 그로부터 유래되었지만 유전적으로 상이한 세포를 지칭한다. 따라서, 동종 인간 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포는 윤부 줄기 세포의 의도되는 수용자 이외의 인간으로부터 수득된 윤부 줄기 세포이다. 동계는 유전적으로 동일하거나 밀접하게 관련되고 대상체와 면역학적으로 상용성인 (즉, 동일한 유전자형을 갖는 개체 또는 조직으로부터의) 세포를 지칭한다. 이종은 대상체와 상이한 종의 유기체로부터 유래되거나 그로부터 수득된 세포를 지칭한다.
본 발명에 따른 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)는 투여 단계 전에 생체외 확장될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, ABCB5 발현은 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)의 시험관내 식별, 단리, 클로닝, 증식 및 확장을 위한 근거를 제공한다. 본 발명은 다른 세포로부터 ABCB5(+) 줄기 세포를 분리하기 위한 작용제, 예를 들어 단리된 펩티드, 예를 들어 ABCB5에 결합하는 항체를 사용하는 임의의 적합한 방법을 고려한다. 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 예를 들어 배지, 보충제 및 시약의 조합물을 사용한 적절한 배양 환경에서 유지될 수 있다. 임의로, 피더 세포 집단 또는 피더 세포 집단으로부터 수득되는 조건화 배지가 ABCB5(+) 줄기 세포 집단을 확장시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 줄기 세포 확장을 위해 사용될 수 있는 접착, 부착 및 매트릭스 인자는, 제한 없이, E-카드헤린, 콜라겐, 피브로넥틴, 슈퍼피브로넥틴, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, ICAM-I, 라미닌, 오스테오폰틴, 프로테오글리칸, E-셀렉틴, L-셀렉틴, VCAM 및 비트로넥틴을 포함한다.
본 발명에 따라 줄기 세포 확장에 사용될 수 있는 생물활성제 및 보충제는, 제한 없이, 효소 (예를 들어, 카텝신 G, Flt-3/Fc), 단백질 및 펩티드 (예를 들어, 액티빈 A, 알부민, 안지오제닌, 안지오포이에틴, BAX 억제 펩티드, 헤레귤린 베타-1, SMAC/디아블로), 비타민, 호르몬 및 다양한 다른 물질 (예를 들어, L-아스코르브산, 덱사메타손, EGF, EGF-수용체, 배아 유체 (소), flt3-리간드, 프로게스테론, 레티노산, 레티닐 아세테이트, 트롬보포이에틴 및 TPO), 항체, 케모카인, 시토카인, 성장 인자 및 수용체를 포함한다.
본 발명에 따라 줄기 세포 확장에 사용될 수 있는 배양 시약은, 제한 없이, 항생제 (예를 들어, 시클로헥시미드, 에토포시드, 겐타미신, 미토마이신, 페니실린-스트렙토마이신), 전형적 배지 (예를 들어, 클레이콤 배지, 둘베코 변형 이글 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지, 최소 필수 배지), 세포 동결 배지-DMSO, L-글루타민 부재 클레이콤 배지, 스템라인(Stemline)® 배지 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국)를 포함한다.
본원에 사용된 대상체는 포유동물, 예컨대 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류일 수 있다. 인간 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC) 및 인간 대상체는 특히 중요한 실시양태이다.
본 발명의 조성물은 줄기 세포 (예를 들어, 윤부 줄기 세포), 또는 줄기 세포의 단리된 제제, 그의 세포 표면 상에서의 ABCB5의 발현을 특징으로 하는 줄기 세포를 포함할 수 있다. 조성물은 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)로 보강된 제제를 포함할 수 있거나, 또는 실질적으로 순수한 ABCB5(+) 줄기 세포 집단 (예를 들어, ABCB5(+) LSC)을 포함할 수 있다. 조성물은 본원에 논의된 안구 이식편을 포괄하는 것으로 의도된다.
조성물은, 일부 실시양태에서, 세포 재생 및 분화를 촉진하기 위한 추가의 생물활성제 및 보충제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 이러한 생물활성제 및 보충제는 상기 기재되어 있고, 제한 없이, 다양한 효소, 단백질 및 펩티드, 비타민, 항체, 케모카인, 시토카인, 성장 인자 및 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역억제제 및/또는 항혈관생성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 이식편 거부를 방지하고/거나 치료하는 데 사용될 수 있는 시클로스포린 (예를 들어, CyA)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 베바시주맙 (예를 들어, 아바스틴(AVASTIN)®)을 포함할 수 있다. 항혈관생성제의 사용은, 일부 경우에, 이식 후에 종종 발생하여 이식편 거부로 이어질 수 있는 혈관 형성을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역억제제 및/또는 항혈관생성제는 조성물의 성분으로서 투여되지 않고, 오히려 ABCB5(+) 줄기 세포의 투여 전 또는 후에 독립적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 국소 투여를 위해 제제화된다. 국소 투여를 위해 제제화된 조성물의 예는 안구 이식편이다. 본 발명에 따른 이식을 위한 안구 이식편은 ACBC5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ACBC5(+) LSC) 및 임의로 안구 세포 재생을 촉진하는 다른 안구 세포 및 생물활성 인자 (예를 들어, 시토카인, 성장 인자)를 함유하는 기질을 지칭하며, 이러한 기질은 대상체의 눈에 이식되거나 삽입되어 손상되거나 감염된 조직을 대체 (예를 들어, 안구 상처를 치료)할 수 있다. 안구 이식편은 안구 세포, 예컨대 예를 들어 각막 및/또는 망막 세포를 비롯한 혼합 세포 집단을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식을 위한 안구 이식편은 ABCB5(+) LSC로 보강된다.
각막은 홍채, 동공 및 전방을 덮는 눈의 투명한 앞 부분이다. 각막은 전방 및 수정체와 함께 빛을 굴절시키고, 각막은 눈의 총 광출력의 대략 2/3를 차지한다. 영장류의 각막은 5가지의 층: 각막 상피 (다세포 상피 조직 층), 보우만 층 (콜라겐 섬유의 응축된 층), 각막 기질 (콜라겐 섬유, 예를 들어 콜라겐 제I형 피브릴, 및 각막세포의 중간 층), 데스메 막 (각막 상피 세포가 유래되는, 콜라겐 제IV형 피브릴로 구성된 박층) 및 각막 내피 (미토콘드리아-풍부 세포의 단순한 편평 또는 낮은 직육면체 층)를 갖는다. 본 발명에 따라 단리된 제제 및 안구 이식편을 비롯한 조성물은 ABCB5(+) 줄기 세포에 더하여, 5가지 각막 층의 세포 하위유형 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 5가지 각막 층의 세포 하위유형 중 어느 하나 이상을 함유하지 않는다.
망막은 눈의 내부 표면을 정렬시키는 광-감수성 조직 층이다. 망막은 그 자체가 간상, 원추 및 신경절 세포와 같은 광수용체 세포를 비롯하여, 시냅스에 의해 상호연결되는 여러 뉴런 층을 갖는다. 본 발명에 따른 단리된 제제 및 안구 이식편을 비롯한 조성물은 ABCB5(+) 줄기 세포에 더하여, RPE의 망막 상피 세포를 비롯한 망막의 뉴런 세포 하위유형 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 망막의 뉴런 세포 하위유형 중 어느 하나 이상을 함유하지 않는다.
이식에의 사용을 위해 의도되는 조성물 (예를 들어, 안구 이식편) 중 세포는 동종 또는 동계일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 피부 줄기 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포)가 아니다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 세포는 ABCB5(+) 중간엽 줄기 세포는 함유하지 않는다 (즉, 배제한다).
일부 실시양태에서, 안구 이식편을 비롯한 조성물은 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된다. 일부 실시양태에서, 안구 이식편은 ABCB5(+) LSC로 보강된다. 일부 실시양태에서, 안구 이식편은 ABCB5(+) RPE 줄기 세포로 보강된다. 예를 들어, 안구 이식편은 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포가 이식편 중에 존재하는 우세한 세포 하위유형인 경우에 ABCB5(+) LSC 보강된 것으로 간주된다. 예를 들어, 안구 이식편은 LSC가 이식편 중 다른 세포 하위유형의 개수를 초과하는 경우에 ABCB5(+) LSC로 보강된 것이다. 일부 실시양태에서, 이식편 중 세포의 적어도 50%가 ABCB5(+) 줄기 세포 또는 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 안구 이식편 중 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 ABCB5(+) 줄기 세포 또는 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 안구 이식편 중 세포의 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만이 ABCB5(-) 세포이다.
본 발명의 조성물은 기질, 예컨대 예를 들어 생분해성 스캐폴드, 예컨대 예를 들어 피브린 겔을 비롯한 상처 치유를 촉진하는 생체적합성 물질을 포함할 수 있다. 피브린 겔은 전형적으로, 혈액 응고에 관여하는 주요 단백질인 피브로겐 및 트롬빈으로부터 제조된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 기질의 다른 예는, 제한 없이, 양막, 아미노글리칸 스캐폴드, 및 접착제를 포함한다. ABCB5(+) 줄기 세포는, 예를 들어 이식을 위한 안구 이식편을 형성하기 위해 기질에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어 각막 또는 망막의 표면에 이식될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 국소로 투여된다. 줄기 세포 이식편이 눈에 이식된 경우에, 이식편은 그 위치에서 봉합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 줄기 세포 조성물은 주사된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내로, 동맥내로 또는 혈관내로 주사된다. 다른 투여 경로가 고려된다. 본 발명의 조성물 및/또는 ABCB5(+) 줄기 세포는 운반체의 존재 또는 부재 하에 투여될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포 집단은, 예를 들어 안구 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
ABCB5 발현은 이식을 위한 안구 세포 제제 (예를 들어, 이식편)를 선택하는데 사용될 수 있으며, 이에 의해 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된 안구 세포 제제의 선택이 가능해진다. 본 발명에 따른 이러한 방법은 안구 세포 제제에서 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) 윤부 줄기 세포)의 개수를 식별하는 단계, ABCB5(+) 줄기 세포의 개수를 세포 제제의 총 세포 집단과 비교하는 단계, 및 비교에 기초하여, 이식을 위한 안구 세포 제제를 선택하는 단계를 포함한다. 안구 세포 제제에서 ABCB5(+) 줄기 세포의 개수는 ABCB5에 선택적으로 결합하는 어느 하나 이상의 공지된 분자를 사용하여 식별할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ABCB5(+) 줄기 세포는 세포를 ABCB5에 선택적으로 결합하는 항체 또는 다른 결합 분자와 접촉시키는 것에 의해 식별될 수 있다. 가시 염료 (예를 들어, 로다민 또는 다른 줄기 세포 마커 염료)가 ABCB5(+) 줄기 세포를 식별하는데 또한 사용될 수 있다. ABCB5(+) 줄기 세포는 또한 다른 특이적 관심 마커의 존재 또는 부재를 기반으로 하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포-특이적 마커를 인식하기 위해 작용제가 사용될 수 있고, 예를 들어 줄기 세포 상의 세포-표면 마커 또는 항원을 인식하고 이에 결합하는 표지된 항체는 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 패닝 방법, 자기 입자 선택, 입자 분류기 선택, 및 밀도 분리를 비롯한 통상의 기술자에게 공지되어 있는 다른 방법을 사용하여 ABCB5(+) 줄기 세포를 분리하고 단리하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 안구 세포 제제는 그것이 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) 윤부 줄기 세포)로 보강된 경우에 이식을 위해 선택된다. 이러한 ABCB5(+) 보강 세포 제제는 이식 성공을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 안구 세포 제제 (예를 들어, 이식편)는 총 세포 집단의 적어도 0.03%가 ABCB5(+)인 경우에 이식을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안구 세포 제제는 총 세포 집단의 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.10%, 적어도 0.15%, 적어도 0.20%, 적어도 0.30%, 적어도 0.40%, 적어도 0.50%, 적어도 0.60%, 적어도 0.70%, 적어도 0.80%, 적어도 0.90%, 적어도 1.0%, 적어도 2.0%, 적어도 3.0%, 적어도 4.0%, 적어도 5.0%, 적어도 10.0 %, 적어도 20.0 %, 적어도 30.0 %, 적어도 40.0 %, 적어도 50.0 %, 적어도 60.0 %, 적어도 70.0 %, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9% 또는 100%가 ABCB5(+)인 경우에 이식을 위해 선택된다.
본 발명의 ABCB5(+) 줄기 세포는 또한 인공 이식편, 예컨대 예를 들어 인공 각막 이식편을 제조/생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 이식편은 무세포성 콜라겐 또는 다른 무세포성 생체적합성 물질로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포는 무세포성 매트릭스에 시딩되어 인공 이식편, 예컨대 예를 들어 인공 각막을 생성한다.
국소 투여를 위한 조성물, 예컨대 예를 들어 안구 이식편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단, 예컨대 예를 들어 문헌 [Rama, J. et al.] [5]에 기재되어 있는 수단에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 방법의 예는 다음과 같다. ABCB5(+) 줄기 세포를 수득하고 피브린 겔 상에서 배양한다 (예를 들어, 치사 조사된 피더 세포, 예를 들어 3T3-J2 세포 사용). 360° 윤부 결막절개를 수행하고, 섬유혈관 각막 판누스를 조심스럽게 제거한다. 피브린-배양된 ABCB5(+) 상피 시트를 윤부에 걸쳐 준비된 각막 상처 베드 상에 위치시킨다 (예를 들어, 결막 내성장과의 경쟁을 감소시키기 위해 약 2-3 mm). 이어서 결막을 주변 피브린 시트에 걸쳐 봉합사 (예를 들어, 8.0 비크릴 봉합사)로 봉합하여 시트의 경계를 보호하고, 그것이 표면에 부착되는 것을 돕는다. 안검을 닫힌 채로 유지시키고 (예를 들어, 스테리-스트립(STERI-STRIP)™ (3M™ 넥스케어(NEXCARE)™)에 의함), 1주 동안 패치를 대어놓는다.
본 발명은 또한 다른 세포, 조직 및/또는 전체 동물이 발생될 수 있는 전능, 다능 또는 만능 줄기 세포 (예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC))를 생성하기 위해, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, ABCB5(+) 윤부 줄기 세포 또는 ABCB5(+) 각막 줄기 세포)를 사용하는 것을 고려한다. 따라서, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 전능, 다능 또는 만능 줄기 세포가 되도록 직접 재프로그래밍 또는 유도하는 방법이 본 발명의 일부 측면에서 제공된다. 본원에 사용된 용어 "재프로그래밍"은 세포 또는 세포의 집단 (예를 들어, 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포)의 발생 잠재력을 역전시키는 과정을 지칭한다. 따라서, 재프로그래밍은 세포를 보다 높은 발생 잠재력을 갖는 상태로, 즉 덜 분화된 상태로 후진을 유도하는 과정을 지칭한다. 재프로그래밍되는 세포는 재프로그래밍 전에 부분적 또는 말단 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍은 분화 상태의 완전 또는 부분 역전, 즉 세포의 발생 잠재력의 전능, 다능 또는 만능 상태를 갖는 세포의 발생 잠재력으로의 증가를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍은 세포가 배아 줄기 세포의 발생 잠재력, 즉 배아 줄기 세포 표현형을 갖도록 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포를 전능, 다능 또는 만능 상태로 유도하는 것을 포괄한다. 재프로그래밍은 또한 추가 조작 시 세포가 전능, 다능 또는 만능 상태로의 완전한 재프로그래밍에 대해 보다 감수성이 되도록 하는 상태로의, 세포의 분화 상태의 부분 역전을 포괄한다.
전능, 다능 또는 만능 줄기 세포는 ABCB5(+) 줄기 세포 (본원에서 "재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포"로 지칭됨)로부터 여러 재프로그래핑 인자를 사용하여 생성될 수 있다. 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포보다 더 큰 발생 잠재력을 갖는 생성된 세포는 이어서, 추가의 조작을 위한 줄기 세포의 공급원이 될 수 있다. 본원에 사용된 "재프로그래밍 인자"는 그의 발현이 세포, 예를 들어 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포의 덜 분화된 또는 미분화된 상태로의, 예를 들어 만능 상태 또는 부분적 만능 상태의 세포로의 재프로그래밍에 기여하는 발생 잠재력 변경 인자를 지칭한다. 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF 4 및 c-MYC (달리 "야마나카(Yamanaka) 인자"로 공지됨 [32], 그 전문은 본원에 참조로 포함됨). 다른 재프로그래핌 인자는, 제한 없이, SOX 1, SOX 3, SOX15, SOX 18, NANOG, KLF1, KLF 2, KLF 5, NR5A2, LIN28, 1-MYC, n-MYC, REM2, TBX3, TERT 및 LIN28을 포함한다. 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포를 재프로그래밍하기 위해 상기 전사 인자 중 2종 이상의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 세포를 전능, 다능 또는 만능 상태로 재프로그래밍하는 방법은 문헌 [Stadtfeld and Hochedlinger] [33]에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포는, 본 발명의 일부 실시양태에서, 질환 모델링, 약물 독성 스크리닝/약물 발견, 유전자 요법 및 세포 대체 요법을 비롯한 기본 및/또는 임상 적용에 사용될 수 있다.
예를 들어, 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포는, 제한 없이, 겸상 적혈구성 빈혈, 파킨슨병, A형 혈우병, 심장 질환, 예컨대 허혈성 심장 질환, 알츠하이머병, 척수 손상, 졸중, 화상, 당뇨병, 골관절염 및 류마티스 관절염을 비롯한 다양한 병태 (예를 들어, 유전적 병태)를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포는 환자와 유전적으로 매칭되는 세포 유형을 제공하기 위한 기관 이식에 사용될 수 있다.
재프로그래밍된 ABCB5(+) 줄기 세포의 다른 기본 및 임상 용도가 고려된다.
재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포로부터 분화 세포를 생성하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 상기 방법은 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포에서, 보다 성숙한 분화 세포 유형, 예컨대 예를 들어 혈액 세포, 혈소판, 기질 세포, 골 세포, 근육 세포, 피부 세포, 지방 세포 또는 신경 세포로의 분화를 촉진하는데 필요한 어느 하나 이상의 분화 인자를 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "분화 인자"는 세포가 목적하는 세포-유형으로 분화하는 것을 유도하는, 발생 잠재력 변경 인자, 예컨대 단백질 또는 소분자를 지칭하고, 예를 들어 분화 인자는 세포의 발생 잠재력을 감소시킨다. 특정 세포 유형으로의 분화는 하나 초과의 분화 인자의 동시적 및/또는 연속적 발현을 수반할 수 있다. 상기 방법은 분화 세포를 형성하기 위해 분화를 촉진하는 조건 하에 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포를 성장시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포는 본 발명의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포 (예를 들어, 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포 또는 단리된 ABCB5(+) RPE 줄기 세포)로부터 생성될 수 있고, 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포는 하나 이상의 목적하는 세포 유형으로 분화될 수 있다. 본원에 사용된 "줄기 세포"는 자가-재생능을 갖고 다중 세포 유형으로 분화되는 발생 잠재력을 갖는 미분화 또는 부분 분화 세포이다. "만능 세포"는 상이한 조건 하에 모든 3종의 배세포 층, 즉 내배엽 (예를 들어, 장 조직), 중배엽 (혈액, 근육, 및 혈관 포함), 및 외배엽 (예컨대 피부 및 신경)의 세포 유형 특징으로 분화하는 발생 잠재력을 갖는 세포이다. "다능" 세포는 3종 전부는 아니지만, 1종 이상의 배엽 세포로 분화하는 발생 잠재력을 갖는 세포이다. 이들 세포는 예를 들어, 성체 줄기 세포, 예컨대 예를 들어, 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포를 포함한다. "전능" 세포는 배아외 조직을 비롯한 유기체 내 모든 분화 세포로 분화하는 발생 잠재력을 갖는 세포이다. 줄기 세포는 분화 표현형에 대한 성향을 가질 수 있지만; 이들 세포는 줄기 세포 표현형으로의 역전 및 재-발현을 위해 유도될 수 있다. 이러한 과정은 "탈분화" 또는 "재프로그래밍"으로 지칭된다.
본 발명의 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포, 재프로그래밍된 ABCB5(+) 세포 및 분화 세포는 이들 세포 유형에 대한 표준 조건 하에 조작될 수 있다. 세포의 처리는 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 체내에 또는 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 조작은 고산소 또는 저산소 조건 하에 수행될 수 있다.
"배양 배지"는 세포 생존율을 유지하고 증식을 지지하는 영양분을 함유한다. 전형적인 배양 배지는 염, 완충제, 아미노산, 글루코스 또는 다른 당(들), 항생제, 혈청 또는 혈청 대체품, 및/또는 다른 성분, 예컨대 펩티드 성장 인자를 포함한다. 전능, 다능 및 만능 세포를 유도하고 유지하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 배양 배지는 또한 세포 특이적 성장 인자, 예컨대 안지오제닌, 골 형태발생 단백질-1, 골 형태발생 단백질-2, 골 형태발생 단백질-3, 골 형태발생 단백질-4, 골 형태발생 단백질-5, 골 형태발생 단백질-6, 골 형태발생 단백질-7, 골 형태발생 단백질-8, 골 형태발생 단백질-9, 골 형태발생 단백질-10, 골 형태발생 단백질-11, 골 형태발생 단백질-12, 골 형태발생 단백질-13, 골 형태발생 단백질-14, 골 형태발생 단백질-15, 골 형태발생 단백질 수용체 IA, 골 형태발생 단백질 수용체 IB, 뇌 유래 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체-알파, 시토카인-유도된 호중구 화학주성 인자 1, 시토카인-유도된 호중구, 화학주성 인자 2-알파, 시토카인-유도된 호중구 화학주성 인자 2-베타, 베타-내피 세포 성장 인자, 내피 1, 표피 성장 인자, 상피-유래 호중구 유인제, 섬유모세포 성장 인자 4, 섬유모세포 성장 인자 5, 섬유모세포 성장 인자 6, 섬유모세포 성장 인자 7, 섬유모세포 성장 인자 8, 섬유모세포 성장 인자 b, 섬유모세포 성장 인자 c, 섬유모세포 성장 인자 9, 섬유모세포 성장 인자 10, 산성 섬유모세포 성장 인자, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 신경교 세포주-유래 호중구 인자 수용체-알파-1, 신경교 세포주-유래 호중구 인자 수용체-알파-2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질-알파, 성장 관련 단백질-베타, 성장 관련 단백질-감마, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 각질세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 백혈병 억제 인자 수용체-알파, 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체-알파, 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타, 전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기 세포 인자, 줄기 세포 인자 수용체, 형질전환 성장 인자-알파, 형질전환 성장 인자-베타, 형질전환 성장 인자-베타-1, 형질전환 성장 인자-베타-1-2, 형질전환 성장 인자-베타-2, 형질전환 성장 인자-베타-3, 형질전환 성장 인자-베타-5, 잠재성 형질전환 성장 인자-베타-1, 형질전환 성장 인자-베타-결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자-베타-결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자-베타-결합 단백질 III, 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 수용체, 혈관 내피 성장 인자, 및 키메라 단백질 및 그의 생물학적 또는 면역학적 활성 단편을 포함할 수 있다.
세포의 분화 상태는 평가를 위해 마련된 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포의 분화 상태는 비처리 세포 또는 동일한 재프로그래밍 또는 분화 인자의 발현을 야기하는 DNA를 전달하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 DNA로 처리된 세포와 비교할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 실시의 구체적인 예를 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다. 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 본 발명은 다양한 조성물 및 방법에서 그 적용을 발견할 것이다.
실시예
C57BL/6J, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), B6;SJL-Tg(ACTFLPe)9205Dym/J, 및 B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J 마우스를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory) (메인주 바 하버)에서 구입하였다. Abcb5 녹아웃 (KO) 마우스를 하기 기재된 바와 같이 생성하였다. 모든 동물을 보스톤 아동 병원(Boston Children's Hospital) 및 하버드 의과 대학 셰픈스 눈 연구 협회(Schepens Eye Research Institute, Harvard Medical School)의 협회 가이드라인에 따라 유지시켰다. 4 내지 12주령의 마우스를 하기 실험에 사용하였다.
실시예 1. ABCB5는 윤부 줄기 세포 (LSC)의 분자 마커이다.
ABCB5가 포유동물 눈에서 느리게 순환하는, 표지-보유 윤부 줄기 세포의 마커인지 여부를 조사하기 위해, 생체내 BrdU-기반 '펄스 및 추적' 실험 [2]을 수행하였고, 여기서 느리게 순환하는 세포를 표지하기 위해 Abcb5 야생형 (WT) 마우스에 대해 9-일의 기간에 걸쳐 매일 전신 BrdU 투여한 다음 (펄스), 8-주 BrdU-유리 기간 (추적) 후 윤부 줄기 세포 표지 보유를 평가하였다 (도 5a). 해리된 뮤린 각막 및 윤부 상피 세포의 유동 세포측정 분석은 BrdU 표지-보유 세포가 윤부에서는 검출될 수 있지만 중심 각막에서는 그렇지 않음을 밝혀내었다 (도 1b 및 도 5b). 전층 뮤린 각막의 BrdU 면역조직화학적 염색은 이전의 발견 [2]과 일치되게, 표지-보유 윤부 줄기 세포 (LSC)가 뮤린 윤부 상피의 기저층에 위치함을 확인시켜 주었다 (도 1c). 또한, 표지-보유 LSC는 ABCB5를 발현하였다 (도 1c). 유동 세포측정 정량화는 ABCB5(+) 세포가 우세하게 BrdU-양성이며 (90.5 ± 0.5%, 평균 ± s.e.m.), ABCB5/BrdU-이중 양성 세포는 모든 윤부 상피 세포의 1.8%를 차지함을 확인시켜주었다 (도 1d).
마우스에서의 발견과 유사하게, 인간 ABCB5(+) 세포도 또한 윤부 상피의 기저 층에 위치하였고 (도 1e 및 도 6), 면역조직화학적 분석은 ABCB5(+) 세포가 윤부 줄기 세포 마커 ΔNp63α를 공발현하고 (도 1f 및 1g), 각막 분화 마커 KRT12의 발현은 부재함 (도 1h)을 밝혀내었다. 유동 세포측정법은 또한 ABCB5(+) 세포가, ABCB5(-) 세포는 그렇지 않지만, 유의한 수준의 ΔNp63α를 발현함 (각각 28.9 ± 5.7% 및 0.1 ± 0.1%, P=0.0364) (도 1g)을 밝혀내었고, 본질적으로 모든 ΔNp63α(+) LSC가 ABCB5를 발현함 (ΔNp63α(+) LSC: 95.3 ± 4.8%, ΔNp63α(-) 세포: 3.6 ± 2.1%, P=0.0032)을 보여주었다. 또한, 인간 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD) 환자는 건강한 공여자에 비해 유의하게 감소된 ABCB5(+) 빈도를 나타내었다 (각각 2.8 ± 1.6% 및 20.0 ± 2.6%, P<0.0001) (도 1i, 도 7 및 8, 표 1).
<표 1> LSCD 환자 정보
Figure 112015090956087-pct00001
Abcb5 WT 마우스에서 표지-보유 윤부 줄기 세포 상에서, 그리고 건강한 인간에서 ΔNp63α(+) LSC 상에서 ABCB5의 발현, 및 임상 LSCD 환자에서 감소된 ABCB5(+) 세포 빈도의 공동 발견은 ABCB5가 LSC를 마킹함을 제시하였다.
실시예 2. ABCB5는 각막 발생 및 재생을 조절한다.
각막 발생 및 재생에서 ABCB5(+) LSC의 잠재적인 기능적 역할을 조사하기 위해, 뮤린 Abcb5 유전자 (진뱅크(GenBank) JQ655148)의 엑손 10의 결실을 보유하는 Abcb5 KO 마우스를 생성하였다. 뮤린 Abcb5 유전자의 엑손 10은 인간 ABCB5 (진뱅크 NM_178559)의 세포외 루프-연관 아미노산 잔기 493-508과 상동성인 분자의 기능적으로 중요한 세포외 도메인을 코딩한다.
먼저 조건부 녹아웃 표적화 구축물을 재조합공학 (즉, 재조합-매개 유전 공학)에 의해 생성하였다 [25]. 간략하게, 2개의 loxP 부위가 플랭킹된 네오마이신 내성 카세트 (플라스미드 pL-452 기반)를 BAC 클론 RP23- 161L22에, 뮤린 Abcb5 유전자 (진뱅크 수탁 번호 JQ655148)의 엑손 10의 458 염기쌍 상류에 삽입하였다 (도 2a 및 2b). BAC 클론의 표적화된 영역을 pL-253 플라스미드로의 갭 수선에 의해 검색하였다. 검색된 플라스미드는 엑손 10의 상류에 6006 염기 쌍 (삽입된 neo 카세트는 포함시키지 않음) 및 엑손 10의 하류에 6384 염기 쌍을 함유하였다. 네오마이신 내성 카세트를 Cre 레콤비나제의 아라비노스 유도에 의해 잘라내어 엑손 10의 상류에 단일 loxP 부위를 남겼다. 2개의 FRT 부위 및 1개의 loxP 부위가 플랭킹된 네오마이신 내성 카세트 (플라스미드 pL-451 기반)를 엑손 10의 460 염기 쌍 하류에 삽입하여 표적화 구축물을 완성하였다. 표적화 플라스미드는 DNA 서열분석 및 제한 맵핑에 의해 확인하였다. 선형 플라스미드로 TC1 (129S6/SvEvTac 유래) 배아 줄기 (ES) 세포를 형질감염시키고, G418 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주) 및 피알루리딘(Fialuridine) (모라벡 바이오케미칼스(Moravek Biochemicals), 캘리포니아주)에서 선택하였다. 내성 콜로니를 확장시키고, 장거리 PCR에 의해 스크리닝하여 표적화 클론을 식별하였다 [22]. 좌측 아암은 6250 염기 쌍 PCR 산물을 생성하는 5'-GTTGAGGGGAGCAGCCAGAGCAAGGTGAGAAAGGTG-3' (서열 1) 및 5'-TTAAGGGTTATTGAATATGATCGGAATTGGGCTGCAGGAATT-3' (서열 2) 프라이머로 증폭시켰다 (도 2b). 우측 아암은 6384 염기 쌍 PCR 산물을 생성하는 5'-TGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGAT-3' (서열 3) 및 5'-CTGGTCCCTCTCCTGTGATCTACACAGGCC-3' (서열 4) 프라이머로 증폭시켰다 (도 2b). 2개의 Abcb5-표적화 ES 클론이 식별되었다. 이들 클론을 확장시키고 C57BL/6 배반포에 주사하였고, 이어서 이를 위임신 암컷의 자궁으로 옮겼다. 높은-백분율의 키메라 수컷 마우스 (Abcb5neo - loxP /wt)를 C57BL/6 배경과 교배시켜 배선 전이를 획득하였다. Abcb5neo - loxP 대립유전자의 배선 전이는, 385 염기 쌍 표적화 대립유전자 및 284 염기 쌍 WT 대립유전자를 증폭시키기 위해 설계된 5'-GGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGG-3' (서열 5), 5'- GGCTGGGGCAACTGAAAAGTAGCAT-3' (서열 6), 및 5'-TTTCAGCTTCAGTTTATCACAATGTGGGTT-3' (서열 7) 프라이머를 사용한 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 확인하였다. 이어서 이형접합 Abcb5neo - loxP 마우스를 hACTB-FLPe 트랜스제닉 마우스와 이종교배시켜 [26], 네오마이신 내성 카세트를 제거하였다. 494 염기 쌍 네오마이신 내성 카세트-결실 대립유전자 및 390 염기 쌍 WT 대립유전자를 증폭시키기 위해 설계된 5'- ACTT GGTGCGGTGACTCTGAATTTTGC-3' (서열 8) 및 5'- TAGCAACATTTCTGGCATTTTAGGCTG-3' (서열 9) 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 PCR 분석을 수행하여 Abcb5loxP /wt 마우스의 게놈에서 네오마이신 내성 카세트의 제거를 확인하였다. Abcb5 KO 동물에서 ABCB5 단백질 발현의 종료는 뮤린 조직의 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다 (도 2c). Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 세포 용해물을 모노클로날 ABCB5 항체 3C2-1D12 [6,27] (5.5μg/ml) 또는 α-튜불린 토끼 폴리클로날 항체 (1:5000 희석) (압캠(Abcam), 매사추세츠주)를 사용하여 이뮤노블롯하였다. HRP-접합된 특이적 2차 항체 (1:5000 희석) (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주)에 의한 처리 후에, 증진된 화학발광에 의해 신호를 필름 상에 가시화하였다.
ABCB5 기능의 완전한 상실의 결과를 결정하기 위해, Abcb5loxP 마우스를 접합체 단계에서 Cre 레콤비나제를 발현하는 EIIa-Cre 마우스와 교배시켜 뮤린 Abcb5 유전자의 엑손 10을 결실시켰다 [14,15] (도 2b). 2개의 loxP 부위 사이의 게놈 영역의 결실은 322 염기 쌍 cre-결실 대립유전자 (null) 및 113 염기 쌍 WT 대립유전자를 증폭시키기 위해 설계된 5'- GGCTGGGGCAACTGAAAAGTAGCAT-3' (서열 10), 5'- GCAAATGTGTACTCTGCGCTTATTTAATG-3' (서열 11) 및 5'- TGGTGCAGACTACAGACGTCAGTGG-3' (서열 12) 프라이머를 사용한 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 확인하였다 (도 2c). 엑손 10의 배선 결실을 갖는 이형접합 Abcb5null /WT 마우스를 이종교배시켜 동형접합 Abcb5null/null 돌연변이체 (Abcb5 KO 마우스)를 생성하였다. 마우스를 129S6/SvEvTac/C57BL/6 혼합 유전적 배경 하에 유지시키고, 한배새끼를 실험 분석을 위한 대조군으로서 사용하였다.
Abcb5 KO 마우스가 살아있는 상태로 태어났고, 출생 시 신체 검사 시, 슬릿 램프 검사에 의해 검출가능한 Abcb5 KO 각막의 육안 해부학적 결함이 없으며, 그의 WT 한배새끼와 구별불가능한 것으로 보였다 (도 2d). 그러나, 돌연변이체 각막의 조직학적 분석은 WT 대조군과 비교하여 각막 상피의 평탄화를 특징으로 하는 심한 발생 이상을 입증하였고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색 및 유동 세포측정법에 의해 증명되는 바와 같이 중심 각막에서 상피 세포 개수가 유의하게 감소되었지만 윤부에서는 그렇지 않았다 (중심 각막: 각각 2688 ± 399 세포 및 4427 ± 346 세포, P=0.0165; 윤부: 각각 3015 ± 433 세포 및 3629 ± 94 세포, P=0.2377) (도 2d 및 도 9). Abcb5 KO 각막은 또한 LC 비오틴 염색에 의해 결정된 바와 같이 중증 상피 치밀 접합부 결함을 나타내었고 (도 2e), 돌연변이체 마우스는 WT 마우스와 비교하여 유의하게 감소된 윤부 및 각막 PAX6 및 각막 KRT12 발현을 나타내어 (윤부 PAX6: 각각 0.3 ± 0.3% 및 18.0 ± 4.6%, P= 0.0181; 각막 PAX6: 각각 8.3 ± 4.6% 및 42.0 ± 7.6%, P= 0.0192; 각막 KRT12: 각각 6.5 ± 6.5% 및 47.7 ± 8.2%, P= 0.0382) (도 2e, 도 10), 정상 각막 발생에서 ABCB5의 새로운 본질적인 역할을 입증하였다.
실시예 3. ABCB5는 윤부 줄기 세포 정지를 조절한다.
각막 재생이 무손상 ABCB5 기능에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, Abcb5 KO 및 WT 마우스에 대해 중심 각막 상피 변연절제 손상을 입힌 후 각막 재생을 평가하였다 (도 11a-11d). 케타민 (120 mg/kg 체중, 호스피라(Hospira), 일리노이주) 및 크실라진 (10 mg/kg 체중, 번스 베터리너리 서플라이(Burns Veterinary Supply), 뉴욕주)의 복강내 주사에 이어 각각의 눈에의 1방울의 0.5% 프로파라카인 점안제 (아콘(Akorn), 일리노이주)의 국소 적용에 의해 마취한 후에, 2 mm 트레핀으로 중심 각막 영역에 경계를 정하고 기저막은 무손상인채로 두고 작은 스칼펠로 원형 내의 상피를 제거하여 2 mm 직경의 상피 상처를 생성하였다. 각각의 동물에서, 절차는 오른쪽 눈에 대해 수행하였다. Ak-스포어 안연고 (바시트라신 아연, 네오마이신 술페이트 및 폴리믹신 B 술페이트, 아콘, 일리노이주)를 상처형성 직후에 이어 다음 48시간 동안 하루에 2회 양쪽 눈에 적용하여 각막 감염 및 건조를 방지하였다. 무통각은 수술 후 48시간 동안 12시간 마다 부프레넥스(Buprenex) (레킷 벤키저 파마슈티칼스(Reckitt Benckiser Pharmaceuticals), 영국 30 버크셔)의 1 mg/kg 용량으로의 피하 주사에 의해 제공하였다. 상처 치유는 앞서 기재된 바와 같이 [29] 모니터링하였다. 동물을 수술 48시간 후에 안락사시키고, [31]에 기재된 바와 같이 수행하는 LC-비오틴 염색 방법을 사용하여 각막 상피 치밀 접합부의 완전성을 평가하였다. 간략하게, 1 mg/ml EZ-링크-술포-NHS-LC-비오틴 (피어스(Pierce), 일리노이주)을 HBSS (행크 균형 염 용액, 론자(Lonza), 메릴랜드주) 플러스 2 mM MgCl2 중에 용해시켜 LC-비오틴 염색 용액을 제조하고, 1 mM CaCl2를 안락사 시점에 15분 동안 상처형성 및 비-상처형성 눈에 적용하였다. 눈을 PBS (론자, 메릴랜드주)로 세정하고, 적출하고, 동결 절편화를 위해 조직-텍 OCT (사쿠라 파인텍(Sakura Finetek), 캘리포니아주)에 넣어두었다.
Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스 사이에 상처 폐쇄 속도에서 어떠한 유의차도 관찰되지 않았지만 (도 11c 및 11d), 조직학적 분석은 Abcb5 KO 마우스에서, Abcb5 WT 마우스와 비교하여, 감소된 개수의 상피 세포 (각각 403.3 ± 29.7 및 737.2 ± 28.2, P < 0.0001) (도 2f 및 도 12), 증진된 Ki67 발현에 의해 입증된 바와 같은 유의하게 증가된 세포 증식 (윤부: 각각 54.0 ± 5.0% 및 0.3 ± 0.2%, P < 0.0001; 각막: 각각 41.2 ± 12.8% 및 1.0 ± 0.5%, P= 0.0257) (도 2g), 및 TUNEL 염색에 의해 입증된 바와 같은 유의하게 증진된 아폽토시스 속도 (윤부: 각각 41.2 ± 12.8% 및 1.0 ± 0.5%, P=0.001; 각막: 각각 49.0 ± 1.0% 및 0.4 ± 0.3%, P<0.0001) (도 2h 및 도 13)와 더불어 상피의 매우 불규칙적인 외관을 특징으로 하는 중증의 비정상적 각막 회복을 밝혀내었다.
펄스-추적 BrdU-표지화 (도 5a 및 5b) 및 해리된 뮤린 윤부 상피 세포의 유동 세포측정 분석은 초기 1-주 추적 기간 후에는 Abcb5 KO-유래 및 Abcb5 WT-유래 시편에서 BrdU-표지된 상피 세포 개수 사이에 어떠한 유의차도 존재하지 않음을 밝혀내었고, 이는 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 윤부 세포에 의한 동일한 BrdU 흡수 (각각 1.9 ± 0.7% 및 1.5 ± 0.4%, P=0.6971)를 나타낸다. 대조적으로, 8-주 추적 기간 후에는, 표지-보유 LSC 빈도가 Abcb5 KO 마우스에서 Abcb5 WT 대조군과 비교하여 현저하고 유의하게 감소되었고 (89%만큼) (빈도: 각각 0.1 ± 0.1% 및 0.9 ± 0.3%, P=0.0152) (도 3a 및 3b), 이는 ABCB5 기능의 종료가 정상적으로 정지된 LSC의 세포 증식을 유도함을 입증하였다. 이러한 결과와 일치되게, 세포 증식을 나타내는 Ki67 발현이 Abcb5 KO 각막에서 Abcb5 WT 대조군 각막과 비교하여 유의하게 증진되었다 (윤부: 각각 24.0 ± 5.0% 및 1.5 ± 1.5%, P<0.0001; 각막: 각각 53.0 ± 16.0% vs. 11.0 ± 2.1%, P=0.0297) (도 3c). 또한, 입증된 증가된 증식과 일치되게, RNA 발현의 실시간 정량적 PCR (qPCR) 분석은 Abcb5 KO 각막 상피 세포에서 G0/G1 세포 주기 체크포인트 및 세포 정지를 제어하는 세포 주기 조절자인 p53 패밀리 (p53 및 p63) 및 Cip/Kip 패밀리 (p21 및 p27)의 WT 대조군에 비한 유의한 하향-조절을 밝혀내었다 (WT p53 41.6 ± 16.4%, P=0.0377; WT p63 31.2 ± 13.8%, P=0.0155; WT p21 37.2±13.8%, P=0.0197; WT p27 36.8 ± 7.0%, P=0.0029) (도 3d). 따라서, ABCB5는 느리게 순환하는 LSC의 유지에 필요하다. 세포 주기로부터의 탈피는 LSC 유지 및 향후 정상 분화를 위한 필요조건이기 때문에, 이들 결과는 Abcb5 KO 마우스에서 관찰된 각막 분화 결함에 대한 설명을 제공한다 (도 3e).
실시예 4. 윤부 줄기 세포 결핍의 치료에서 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포의 재생 역할.
이식 결과를 개선하기 위해 ABCB5가 이식편 내에서 윤부 줄기 세포의 향후의 보강을 위한 분자 마커를 대표하는지 여부를 조사하기 위해, 이식된 윤부 상피 세포의 각막-재생 잠재력을 검사하였다. (도 14a 및 14b 및 도 15a-15c). 뮤린 공여자 윤부 상피 세포를 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)이 유도된 동계 C57BL/6J 수용자 마우스의 눈에 이식하였다. 인간 공여자 윤부 상피 세포를 윤부 줄기 세포 결핍이 유도된 면역결핍 NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) 마우스의 눈에 이식하였다. 4종의 유형의 공여자 이식을 수행하였다: (i) ABCB5(+) 윤부 상피 세포, (ii) ABCB5(-) 윤부 상피 세포, (iii) 비분리 윤부 상피 세포, 및 (iv) 세포 무함유 이식편 (피브린 겔 운반체 단독) (피브린 겔 비히클 중 500 세포/이식편, 1 편측 눈 이식편/마우스, n=5 마우스/치료군) (표 2).
<표 2> 이식에 사용된 공여자 세포의 개수 및 생존율
Figure 112015090956087-pct00002
이식 3일 전에, 뮤린 및 인간 공여자 세포를, [30]에 기재된 바와 같이 피브리노겐 및 트롬빈 원액 (티슈콜-키트 이뮤노(TISSUCOL-Kit Immuno), 백스터(Baxter), 독일)을 1.1% NaCl 및 1 mM CaCl2 중에 10 mg/ml 피브리노겐 및 3 IU/ml 트롬빈의 최종 농도로 용해시킴으로써 제조된 피브린 운반체 상에 시딩하였다. 이식 당일에, 0.5-mm 버가 달린 알게르브러쉬(Algerbrush) II 각막 녹빛 고리 제거기 (앰블러 서지칼(AMBLER Surgical), 펜실베니아주)를 사용하여 각막 및 윤부 상피를 제거함으로써, 마취된 수용자 마우스에서 전체 LSCD를 유도하였다 [16]. LSCD 유도 후에, 수용자 마우스에게 4개의 봉합을 통해 고정된 피브린 겔 운반체-기반 이식물을 제공하였다. 안검을 8-0 나일론 봉합사로 봉합하여 눈을 폐쇄된 채로 유지시켰다. Ak-스포어 안연고 (바시트라신 아연, 네오마이신 술페이트 및 폴리믹신 B 술페이트, 아콘, 일리노이주)를 상처형성 직후에 이어 다음 48시간 동안 하루에 2회 양쪽 눈에 적용하여 각막 감염 및 건조를 방지하였다. 무통각은 수술 후에 제공되는 5-10 mg/kg 메타캄(Metacam) (베링거 잉겔하임 파마슈티칼스(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals), 코네티컷주)의 피하 주사에 의해, 그리고 수술 후 24시간 동안 12시간 마다 0.05- 0.1 mg/kg의 부프레넥스 (레킷 벤키저 파마슈티칼스, 영국 버크셔)의 피하 주사에 의해 제공하였다. 또한, 수술 회복 후에, 처음 5일 동안 항염증 인플레인프란 포르테(Inflanefran Forte) 점안제 (앨러간(Allergan), 매사추세츠주)로, 이어서 5일 동안 매일 1% 아바스틴(Avastin) (베바시주맙(Bevacizumab), 제넨테크(Genentech), 캘리포니아주) 점안제로 또한 마우스를 치료하였다. 안락사 시까지 매주 슬릿 램프 검사를 수행하였다. 눈을 사후 적출하고, 메타크릴레이트 포매를 위해 10% 완충 포르말린 (테크노비트(Technovit), 헤라우스 쿨제르(Heraeus Kulzer), 독일) 중에 고정시키거나 또는 조직-텍 OCT (사쿠라 파인텍, 캘리포니아주) 중에 순간 동결시켰다.
동계 뮤린 Abcb5(-) 윤부 세포 이식편 또는 비히클-단독 음성 대조군의 수용자는 이식 5-주 후 분석 시, 지속적 LSCD와 일치하는 불투명 각막, 침윤 배상 세포와 함께 상피 결막화, 및 분화된 KRT12(+) 세포의 부재 (각각 0%)를 디스플레이하였다 (도 4a, 도 16). 비분리 윤부 세포를 함유하는 동계 이식편 수용자는 부분적인 각막 회복과 함께 중심 각막에서 검출가능하게 분화된 KRT12(+) 세포를 디스플레이하였지만 (세포 중 17%, Abcb5(-) 또는 비히클-단독 치료 요법과 비교하여 유의하게 증진됨, P<0.01), LSCD-특징적 배상 세포 및 상피 결막화의 지속을 나타내었다 (도 4a, 도 16). 대조적으로, 동계 ABCB5(+) 윤부 세포 이식편은 수용자 마우스에서 정상 조직학을 갖는 투명한 각막이 발생되게 하였고, 보다 높은 개수의 분화된 KRT12(+) 각막 상피 세포가 생성되게 하였고 (세포 중 47%, 비분리 또는 ABCB5(-) 윤부 세포 치료 요법과 비교하거나 비히클-단독 대조군과 비교하여 유의하게 증가됨, P<0.001), 배상 세포 형성 또는 상피 결막화를 방지하였다 (도 4a, 도 16).
새롭게 단리된 인간 ABCB5(-) 윤부 세포 이식편 또는 비히클-단독 음성 대조군의 면역손상 NSG 수용자도 또한 이식 5-주 후 지속적 LSCD와 일치하는 상피 결막화 및 분화된 KRT12(+) 세포의 부재 (각각 0%)를 디스플레이하였다 (도 4b, 도 17 및 18). 새롭게 단리된 인간 비분리 윤부 세포 이식편의 면역손상 NSG 수용자는, 뮤린 비분리 윤부 세포 이식 실험에서의 발견과 유사하게, 부분적인 각막 회복과 함께 중심 각막에서 분화된 KRT12(+) 세포의 검출가능성을 디스플레이하였지만 (세포 중 12%, ABCB5(-) 또는 비히클-단독 치료 요법에 비해 유의하게 증진됨, P<0.01), LSCD 특징적 상피 결막화의 지속을 나타내었다 (도 4b, 도 17). 두드러지게, 새롭게 단리된 인간 ABCB5(+) 윤부 세포 이식편만이 수용자 NSG 마우스에서 높은 개수의 KRT12+ 세포 (세포 중 31%, 비히클-단독과 비교하거나 ABCB5(-) 또는 비분리 윤부 세포 치료 요법과 비교하여 유의하게 증가됨, P<0.001)를 함유하는 중층 상피 층의 존재 및 LSCD 특징적 상피 결막화의 부재와 함께 정상 조직학을 갖는 투명한 각막이 발생되게 하였다 (도 4b, 도 17).
인간 공여자 세포가 이러한 이종이식 모델에서 각막 회복을 발생시키는지 확인하기 위해, 재생된 각막 조직을 인간 기원의 모든 세포의 식별자인 인간-특이적 β2 마이크로글로불린 (β2M)의 발현 및 각막 분화의 마커로서 인간-특이적 PAX6 및 KRT12의 발현에 대해 RT-PCR에 의해 평가하였다. 인간 ABCB5(+) 또는 비분리 인간 윤부 세포로 이식된 수용자의 각막 상피만이 인간-특이적 β2M, PAX6 및 KRT12 전사체를 함유한 반면에, 각막 회복을 나타내지 않는 비히클-단독-이식된 대조군 눈은 그렇지 않았고, 이는 RT-PCR 검정 시스템의 인간 특이성을 확인시켜주었다 (도 4b). 또한, 비분리 또는 ABCB5(+) 세포 이식편과 비교하여 ABCB5(-)에서의 유사한 생존율에도 불구하고 (표 2, 도 15a-15c), ABCB5(-) 세포-이식된 눈은 인간-특이적 β2M, PAX6 또는 KRT12 전사체 발현이 불충분하였고 (도 4b), 이는 장기 생착 능력이 인간 ABCB5(+) 윤부 세포 집단 내에 배타적으로 함유되어 있음을 나타낸다.
본원에 제공된 실시예는 ABCB5(+) 세포 빈도가 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)을 감소시키고, ABCB5-양성이 윤부 줄기 세포 (LSC)로 보강된 느리게 순환하고 ΔNp63α-양성인 집단을 우선적으로 특성화하고, 향후 단리될 ABCB5(+) 윤부 세포는 LSCD를 배타적으로 역전시킬 수 있음을 입증하고, 이는 ABCB5-양성이 LSC를 규정함을 나타낸다. 이들 발견은 Abcb5 유전자 녹아웃 (KO) 마우스에서 ABCB5 기능 상실이 LSCD를 유도하고, LSC 자가-재생능의 종료를 통해 LSC-의존적 각막 발생 및 재생을 손상시킨다는 것을 입증하는 데이터에 의해 추가로 지지된다. 이들 결과는 여러 중요한 의미를 갖는다.
첫번째로, 장기간의 임상적 성공이 이식편 내 윤부 줄기 세포 빈도에 의존적인 것으로 밝혀졌고 [5], 본 발명 이전에는 어떠한 유망한 윤부 줄기 세포 보강을 위한 마커도 이용가능하지 않았기 때문에, 인간 LSC의 성공적인 보강은 LSCD 요법 분야를 결정적으로 진전시킬 잠재력을 갖는다. 실제로, 이들 실시예는 이식편 내 유망한 윤부 줄기 세포 보강이 LSCD 치료적 성공을 유의하게 증진시킬 수 있음을 제시한다. 윤부 줄기 세포 표면 상에서의 ABCB5 발현은, 세포내 발현되는 ΔNp63α, 또는 LSCD를 역전시킬 수 있는 LSC의 유망한 단리를 위해 성공적으로 사용되지 못한 대안적 후보 윤부 줄기 세포 마커 [17]와는 달리, 본원에 입증된 바와 같이 모노클로날 항체-기반 세포 분류 전략 및 유의한 윤부 줄기 세포 보강을 가능하게 한다. 이는 윤부 줄기 세포 단리를 위한 또한 임상적 윤부 줄기 세포 이식을 위한 잠재적인 마커로서 ABCB5의 유망성을 강조한다.
두번째로, 본원에 제공된 데이터는 줄기 세포 정지의 유지에서 ABCB5의 신규한 생체내 생리학적 역할을 밝혀내었다. 구체적으로, 새롭게 생성된 Abcb5 KO 마우스에서 ABCB5 기능의 종료는 느리게 순환하는 LSC의 상실과 함께 윤부 줄기 세포 마커 ΔNp63α를 비롯한 G0/G1 세포 주기 진행을 조절하는 분자의 억제된 발현을 야기하였다. 이는 정상적으로 정지된 LSC에 의한 ABCB5와 ΔNp63α의 관찰되는 공발현을 설명하고, 세포가 세포 주기로부터 탈피하는 능력은 줄기 세포 풀 보존 및 정상 분화 둘 다를 위해 중요하기 때문에, Abcb5 KO 각막에서 관찰되는 윤부 줄기 세포 증식의 유도 및 분화 세포의 감소와 연관된 아폽토시스에 대한 설명을 제공한다.
추가의 물질 및 방법:
BrdU 펄스 및 추적 실험. 4-주령 Abcb5 KO 마우스 및 그의 Abcb5 WT 한배새끼에 대해 9 연속일 동안 50mg/kg 브로모데옥시우리딘 (BrdU, BD 파밍겐 (BD Pharmingen), 캘리포니아주)을 매일 복강내 주사하였다 (도 5a). 마지막 BrdU 주사 후 1주 또는 8주째에 희생시킨 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스로부터 단리된 각막 및 윤부 상피 세포를 유동 세포측정법 및 면역형광에 의해 분석하였다. 동일 연령의 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 한배새끼로부터의 윤부 및 중심 각막 상피 세포를 실험 대조군으로 사용하였다. 유동 세포측정법 및 면역조직화학적 염색을 사용하여 윤부 및 중심 각막 상피 내 BrdU-양성 및 BrdU-음성 세포의 빈도를 결정하였다.
인간 및 뮤린 각막 세포 단리. 동의 공여자로부터 유래된 사체 인간 각공막 조직을 하트랜드 라이온스 아이 뱅크스(Heartland Lions Eye Banks) (미주리주 캔자스 시티), 바스콤 팔머 아이 인스티튜트(Bascom Palmer Eye Institute) (플로리다주 마이애미), 및 카버 의과 대학(Carver College of Medicine) (아이오와주 아이오와 시티)으로부터 획득하였다. 공막 림, 홍채 및 섬유주의 제거 후에, 윤부 및 중심 각막을 현미경 하에 박리하였다. 이어서 윤부 및 중심 각막 조직을 2.4 단위/ml 디스파제 II (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나주)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.5M EDTA (인비트로젠, 캘리포니아주)와 함께 37℃에서 10회 5-분 주기로 인큐베이션하여 상피 세포를 회수하였다 [22,23]. 뮤린 윤부 및 각막 상피 세포는 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 마우스로부터 다음과 같이 획득하였다. CO2 혼수상태에 의한 안락사에 이은 안구 적출 직후, 윤부 및 중심 각막 조직을 해부 현미경 하에 마이크로 가위로 떼어내고, 낮은 Ca2 + 각질세포 무혈청 배지 (KSFM, 인비트로젠, 캘리포니아주)에 넣고, 4℃에서 5분 동안 250 g에서 원심분리하였다. 상청액의 제거 후에, 조직 펠릿을 0.5% 트립신 용액 (론자, 메릴랜드주) 중에서 소화시켰다 [24]. 이식 실험을 위해, ABCB5(+) 및 ABCB5(-) 윤부 상피 세포를 ABCB5 모노클로날 항체 (mAb) 표지화를 사용하여 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 단리하였다 [18]. 간략하게, 인간 또는 뮤린 윤부 상피 세포를 1차 ABCB5 mAb (20μg/μl)로 30분 동안 4℃에서 표지하고, 세척하여 과량의 항체를 제거한 다음, 2차 항-마우스 FITC 접합된 IgG와 30분 인큐베이션하였다. ABCB5(+) 및 ABCB5(-) 분류 게이트는 변형된 디지털 밴티지 세포 분류기 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) 및 MGH 패솔로지 플로우 사이토메트리 코어(MGH Pathology Flow Cytometry Core), 심체스(Simches) 연구 빌딩, 보스톤) 상에서 도 15a-15c에 디스플레이된 바와 같이 확립하였다. 여기를 위해 70 MW UV 레이저를 사용하여 식별되는 바와 같은 모든 DAPI(+) 세포 (1 μg/ml DAPI, 시그마-알드리치, 미주리주, 분류 직전에 첨가됨)를 제외함으로써, 오직 생존 세포만을 분류를 위해 선택하였다. ABCB5(+) 및 ABCB5(-) 분류된 세포의 순도 및 생존율을, 샘플을 재-분석하는 대표적인 분류후 분석에서 확립하였다 (도 15a-15c). ABCB5(+) 세포 정제는 뮤린 ABCB5(+) 윤부 세포의 경우에 255-배 증가 (분류 전 0.37% 양성 및 분류 후 51% 양성, 표 2) 및 인간 ABCB5(+) 윤부 세포의 경우에 292-배 증가 (분류 전 0.03% 양성 및 분류 후 59% 양성, 표 2)되게 하였다. ABCB5(-) 세포 보강은 마우스 및 인간 샘플 둘 다에서 ABCB5(+) 세포의 완전한 부재를 야기하였다 (표 2).
유동 세포측정 분석. 인간 ABCB5(+) 윤부 상피 세포가 ΔNp63α 또는 KRT12를 공발현하는지 여부 및 뮤린 ABCB5(+) 윤부 상피 세포가 PAX6 및 KRT12를 공발현하는지 여부를 결정하기 위해 이중-색상 유동 세포측정법을 사용하고, 앞서 기재된 바와 같이 [18] 수행하였다. 인간 및 뮤린 ABCB5 및 KRT12 공발현 분석을 위해, 세포를 먼저 마우스 항-ABCB5 mAb와 인큐베이션하고, 염소 항-마우스 FITC IgG로 대조염색한 다음, 염소 폴리클로날 항-KRT12 항체와 인큐베이션하고, 디라이트(Dylight) 649 당나귀 항-염소 IgG로 대조염색하였다. 인간 ABCB5 및 ΔNp63α 공발현 및 뮤린 ABCB5 및 PAX6 공발현 분석을 위해, 세포를 마우스 항-ABCB5 mAb와 인큐베이션하고, 염소 항-마우스 FITC IgG로 대조염색하고, BD 시토픽스/시토펌 완충제 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주) 중에서 투과성이 되게 하고, ΔNp63α 또는 PAX6 Ab로 염색하고, 염소 항-토끼 알렉사(Alexa) 647 IgG로 대조염색하였다. 염색 완충제 또는 BD 펌/세척 완충제 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주)에 의한 염색 단계를 각각의 단계 사이에 수행하였다. 이중-색상 유동 세포측정법은 [18]에 기재된 바와 같이, 벡톤 디킨슨 FACS캔(FACScan) (벡톤 디킨슨, 뉴저지주) 상에서 Fl1 (FITC) 및 Fl4 (알렉사 647 및/또는 디라이트 649) 스펙트럼에서의 형광 방출의 획득에 의해 수행하였다. 뮤린 ABCB5 및 BrdU 공발현 분석은 FITC BrdU 플로우 키트 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. ABCB5(+) 및 ABCB5(-) 세포에 의한 상기-열거된 마커의 발현 수준 사이의 통계적 차이는 독립표본 t 검정을 사용하여 결정하였다. P<0.05인 양측 P 값을 유의한 것으로 간주하였다.
RT-PCR 및 정량적 실시간 PCR. 세포 주기 유전자 발현 분석을 위해, 전체 RNA를 RT2 qPCR 등급 RNA 단리 키트를 사용하여 Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 각막으로부터 단리해낸 다음, 역전사효소-PCR용 RT2 제1 가닥 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (SA바이오사이언시스, 캘리포니아주)에 따라 역전사시켰다. 샘플을 [28]에 기재된 바와 같이 SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 (SA바이오사이언시스, 캘리포니아주), 뮤린 세포 주기 어레이 (카탈로그 번호 PAMM-020Z, SA바이오사이언시스, 캘리포니아주) 및 동역학적 PCR (ABI 7700 서열 검출기; 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 캘리포니아주)을 사용하여 검정하였다. 모든 정량화는 내인성 대조군 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH) 및 β-액틴에 대해 정규화하여, 초기 농도에서의 가변성 및 전체 RNA에 대한 품질, 및 역전사 반응의 효율을 확인하였다. Abcb5 KO 및 Abcb5 WT 마우스 사이에 유전자 발현 수준에서의 통계적 차이는 단일 샘플 t 검정을 사용하여 결정하였다. P<0.05인 양측 P값을 유의한 것으로 간주하였다. 인간-특이적 유전자 전사체의 검출을 위해, RNA이지 플러스 단리 키트 (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주)를 사용하여 전체 RNA를 이식된 뮤린 눈 및 비-손상 뮤린 또는 인간 대조군 각막으로부터 단리해낸 다음, 하이 피델리티 RT 키트 (어플라이드 바이오시스템스, 캘리포니아주)를 사용하여 전사시켰다. PCR은 택 2X 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주) 및 하기 유전자-특이적 프라이머: 인간 β2-마이크로글로불린 (B2M, NM_004048): 정방향 5'-GTGTCTGGGTTTCATCCATC-3' (서열 13), 역방향 5'-AATGCGGCATCTTCAACCTC-3' (서열 14); 인간 쌍형성 박스 6 (PAX6, NM_000280.3): 정방향 5'-CAGCGCTCTGCCGCCTAT-3' (서열 15), 역방향 5'-CATGACCAACACAGATCAAACATCC-3' (서열 16); 인간 케라틴 12 (KRT12, NM_000223.3): 정방향 5'-GAAGCCGAGGGCGATTACTG-3' (서열 17), 역방향 5'- GTGCTTGTGATTTGGAGTCTGTCAC-3' (서열 18); 및 뮤린 β-액틴 (Actb, NM_007393): 정방향 5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3' (서열 19), 역방향 5'-AAACGCAGCTCAGTAACAG-3' (서열 20)을 사용하여 수행하였다.
조직병리학 및 면역조직화학적 염색. 무손상 마우스 안구 조직을 회수하기 위해, 전체 참수한 마우스 머리를 4% 파라포름알데히드 (PFA) 중에서 밤새 고정시킨 다음, 안검이 부착된 채로 눈을 적출하고, 1x 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 30% 수크로스 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션하고, 조직-텍 OCT 화합물 (사쿠라 파인텍 USA, 캘리포니아주) 중에 포매시키고, 순간 동결시켰다. 각각의 조직 블록으로부터의 대표적 냉동 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 면역형광 염색을 위해, 냉동 절편 (10μm)을 차가운 메탄올 중에 10분 동안 고정시키고, 1x PBS 중 10% 2차 혈청 + 2% 소 혈청 알부민 (BSA) 중에서 1시간 동안 차단시키고, 1차 항체 (또는 이소형 대조군)에 이어 적절한 2차 항체와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 수회 세척 후, 이어서 슬라이드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 함유하는 경질-설정 마운팅 배지 중에서 커버슬립하였다. BrdU 계내 키트 (BD 파밍겐, 캘리포니아주)를 사용하여 BrdU 염색을 수행한 다음, 1:250 희석된 토끼 ABCB5 항체 (NBP1-50547, 노부스(Novus), 콜로라도주)로 염색하였다. 계내 세포 사멸 키트 (로슈, 인디애나주)를 사용하여 TUNEL 염색을 수행하고, DAPI (인비트로젠, 매사추세츠주)를 사용하여 모든 유핵 세포를 염색하였다. 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) E800 면역형광 현미경을 사용하여 모든 조직 절편을 분석하였다. 포토샵 (어도비(Adobe))을 사용하여 복합 각막 사진을 어셈블리하여 순차적 영상을 오버레이 및 매칭시켰다. 부가되는 사진을 50% 투명도로 낮추고, 영상을 매칭시키고, 복합 사진을 0% 투명도로 되돌려 스티칭을 행하였다. 완전한 각막 절편의 복합 사진에서 2 mm 트레핀으로 규정된 영역 내 DAPI-양성 세포의 개수를 계수함으로써 각막 당 상피 세포의 평균 개수 (도 2d)를 결정하였다. 마우스당 적어도 3개의 복합 각막 절편을 분석하고, 그룹당 5마리의 마우스를 4회의 반복 실험으로 분석하였다. Ki67 (도 2i 및 3c), TUNEL (도 2i) 및 KRT12 (도 4a 및 4b)를 발현하는 상피 세포의 백분율은 본원에 기재된 기술을 사용하여 DAPI-양성 각막 상피 세포의 총 개수 중 양성 세포의 개수를 계수함으로써 결정하였다. 독립표본 t 검정을 사용하여 Abcb5 WT 및 Abcb5 KO 마우스 사이의 비교를 수행하였다. 이식 실험의 결과를 일원 ANOVA에 이어 본페로니(Bonferroni) 사후 검정을 사용하여 비교하였다. P < 0.05인 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
항체. 하기 1차 항체를 유동 세포측정 실험에서 사용하였다: 토끼 폴리클로날 항-ΔNp63α 항체 (클론H-129, 산타 크루즈(Santa Cruz), 캘리포니아주), 마우스 모노클로날 항-ABCB5 항체 (클론 3C2-2D12) [6], 염소 폴리클로날 항-시토케라틴 항체 (클론 L15, 산타 크루즈, 캘리포니아주), 토끼 폴리클로날 항-PAX6 항체 (코반스(Covance), 캘리포니아주), 토끼 폴리클로날 항-ABCB5 항체 (노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals), 콜로라도주), 토끼 폴리클로날 IgG 이소형 대조군 항체 (압캠, 매사추세츠주), 마우스 IgG1k 이소형 대조군 항체 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주), 및 염소 IgG 이소형 대조군 항체 (산타 크루즈, 캘리포니아주). 2차 항체는 염소 항-마우스 FITC (시그마-알드리치, 미주리주), 알렉사 647 염소 항-토끼 IgG (인비트로젠, 뉴욕주) 및 디라이트 649 당나귀 항-염소 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주)였다. 인간 조직병리학 및 면역조직화학적 분석을 위해, 하기 1차 항체: 마우스 모노클로날 항-ABCB5 (클론 3C2-1D12) [6] 및 1:75 희석된 ΔNp63α에 대한 토끼 항체 (sc8344, 산타 크루즈, 캘리포니아주)에 이어서, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주로부터 수득된 적절한 2차 항체: 1:75 희석된 FITC-당나귀 항-토끼 또는 1:250 희석된 알렉사 플루오로 594-염소 항-마우스를 사용하였다. 모든 경우에, 이소형-매칭 항체 토끼 IgG (550875, BD 파밍겐, 캘리포니아주) 및 마우스 IgG1카파 이소형 대조군 항체 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주)를 음성 대조군으로서 제공하였다. 조직병리학 및 면역조직화학적 분석을 위해, 마우스 조직을 하기 1차 항체: 1:250 희석된 토끼 항-ABCB5 항체 (NBP1-50547, 노부스, 콜로라도주), 1:300 희석된 토끼 항-Pax6 (PRB278P, 코반스, 캘리포니아주), 1:50 희석된 염소 항-시토케라틴 12 (L15) (sc17101, 산타 크루즈, 캘리포니아주), 1:1000 희석된 토끼 항-시토케라틴 14 (AF64) (PRB-155P, 코반스, 캘리포니아주), 1:200 희석된 토끼 항-Ki67 (ab66155, 압캠, 매사추세츠주)에 이어서, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주로부터 수득된 적절한 2차 항체: 1:250 희석된 당나귀 항-염소 알렉사 플루오르 488 (705-545-003), 1:20 희석된 당나귀 항-토끼 알렉사 플루오르 594 (711-585-152), 1:250 희석된 염소 항-토끼 디라이트 549 (111- 504-144), 또는 1:250 희석된 Cy3-당나귀 항-토끼 (711-165-152)로 염색하였다. 모든 경우에, 이소형 매칭 항체 (토끼 IgG (550875, BD 파밍겐, 캘리포니아주) 및 염소 IgG (sc2028, 산타크루즈, 캘리포니아주)를 음성 대조군으로서 제공하였다.
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<참고문헌>
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본 발명의 적어도 하나의 실시양태의 여러 측면이 이와 같이 기재되어 있지만, 다양한 변경, 변형 및 개선이 용이하게 이루어질 것임이 통상의 기술자에게 인지되어야 한다. 이러한 변경, 변형 및 개선은 본 개시내용의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 취지 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 기재 및 도면은 단지 예로서 존재하는 것이다.
등가물
여러 본 발명의 실시양태가 본원에 기재되고 예시되어 있지만, 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 고려할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 배위는 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 배위는 본 발명의 교시가 사용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 의존할 것임을 용이하게 인지할 것이다. 통상의 기술자는 단지 상용 실험을 사용하여, 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범위 내에서, 본 발명의 실시양태는 구체적으로 기재되고 청구된 바와 달리 실시될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않으면, 본 개시내용의 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 정의되고 사용된 바와 같은 모든 정의는 사전적인 정의, 참조로 포함된 참고문헌의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미에 대해 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 단수 용어는 명세서 및 청구범위에서 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 어구 "및/또는"은 명세서 및 청구범위에서, 결합된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다"를, 즉 일부 경우에서는 함께 존재하고 다른 경우에서는 따로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 복수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 결합된 요소의 "하나 이상의"로 이해되어야 한다. 다른 요소는 구체적으로 식별되는 요소와의 관련 또는 비관련에 불문하고 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별되는 요소 외에 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서 "포함하는"과 같은 개방형 표현과 결합하여 사용되는 경우에, "A 및/또는 B"의 언급은, 한 실시양태에서, 오직 A (임의로 B 외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, 오직 B (임의로 A 외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (임의로 다른 요소 포함) 등을 지칭할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 경우에, "또는" 또는 "및/또는"은 포함의 의미로, 즉 요소의 개수 또는 목록 중, 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 하나 초과, 및 임의로, 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 오직 명확히 반대로 표시된 용어, 예컨대 "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나" 또는, 청구범위에 사용된 경우에, "이루어진"은 요소의 개수 또는 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 배제의 용어, 예컨대 "어느 하나", "중 하나", "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나"가 선행하면, 오직 배제적 대안 (즉, "이것 또는 저것이나 모두는 아닌 것")을 표시하는 것으로 해석될 것이다. "로 본질적으로 이루어진"이 청구범위에 사용된 경우에, 특허법 영역에서 사용되는 바와 같은 통상의 의미를 가질 것이다.
하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에 있는 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하나, 요소의 목록에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 필수적으로 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것은 아님을 이해해야 한다. 이러한 정의는 요소가 구체적으로 식별된 요소와의 관련 또는 비관련에 불문하고, 어구 "적어도 하나"가 언급하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 외에 임의로 존재할 수 있도록 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A (및 임의로 B 외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 A 외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소 포함) 등을 지칭할 수 있다.
명백하게 달리 나타내지 않는 한, 하나를 초과하는 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 작용이 언급되어 있는 순서에 제한되지는 않는 것으로 또한 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 대상과 관련하여 참조로 포함되고, 일부 경우에 이는 그 문헌의 전체를 포괄할 수 있다.
청구범위 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "포함하는", "비롯한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "로 구성된" 등은 개방형, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다만 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 문헌 [United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03]에 기재된 바와 같이, 각각 폐쇄형 및 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Children's Medical Center Corporation Schepens Eye Research Institute VA Boston Healthcare System <120> ABCB5(+) STEM CELLS FOR TREATING OCULAR DISEASE <130> C0875.70066WO00 <140> TBD <141> 2014-02-19 <150> US 61/766,424 <151> 2013-02-19 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 gttgagggga gcagccagag caaggtgaga aaggtg 36 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 ttaagggtta ttgaatatga tcggaattgg gctgcaggaa tt 42 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tggggcagga cagcaagggg gaggat 26 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 ctggtccctc tcctgtgatc tacacaggcc 30 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 ggaagacaat agcaggcatg ctggg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 ggctggggca actgaaaagt agcat 25 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 tttcagcttc agtttatcac aatgtgggtt 30 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 acttggtgcg gtgactctga attttgc 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 tagcaacatt tctggcattt taggctg 27 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 ggctggggca actgaaaagt agcat 25 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 gcaaatgtgt actctgcgct tatttaatg 29 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 tggtgcagac tacagacgtc agtgg 25 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 gtgtctgggt ttcatccatc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 aatgcggcat cttcaacctc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 cagcgctctg ccgcctat 18 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 catgaccaac acagatcaaa catcc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gaagccgagg gcgattactg 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 gtgcttgtga tttggagtct gtcac 25 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 tcctagcacc atgaagatc 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 aaacgcagct cagtaacag 19

Claims (56)

  1. 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포의 집단을 안구 병태를 갖는 대상체에서 안구 세포를 재생시키는데 유효한 양으로 포함하며, 여기서 상기 집단이 적어도 90% 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포를 포함하는, 안구 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 안구 병태가 각막 질환, 망막 질환 또는 안구 상처인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 각막 질환이 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)으로 인한 실명인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 망막 질환이 황반 변성 또는 망막염인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포가 안구 이식편으로서 투여되는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포가 동종 줄기 세포, 동계 줄기 세포, 단리된 ABCB5(+) 인간 안구 줄기 세포, 또는 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포인 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포가 투여 전에 생체외 확장된 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1 내지 107개의 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포가 이식에 의해 투여되는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포가 운반체 또는 기질과 함께 투여되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 기질이 피브린 겔, 양막, 아미노글리칸 또는 그의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물 또는 인간인 조성물.
  12. 안구 세포의 혼합 집단을 제공하는 단계, 및
    인간 ABCB5에 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 상기 혼합 집단으로부터 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는, 안구 세포의 혼합 집단으로부터 윤부 줄기 세포를 단리하는 방법.
  13. 기질을 단리된 줄기 세포로 시딩하여 안구 이식편을 생성하는 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 줄기 세포의 적어도 90%가 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포인, 대상체로의 이식을 위한 안구 이식편을 생성하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 안구 줄기 세포가 시딩 단계 전에 생체외 확장된 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 기질이 피브린 겔, 양막, 아미노글리칸 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  16. 대상체로의 이식을 위한 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포로 보강된 안구 이식편으로서, 여기서 상기 단리된 ABCB5(+) 줄기 세포가 ABCB5(+) 안구 줄기 세포일 수 있고, 상기 안구 이식편에서 줄기 세포의 적어도 90%가 ABCB5(+) 안구 줄기 세포인 안구 이식편.
  17. 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포를 안구 세포 재생을 촉진하는데 유효한 양으로 포함하고, 여기서 상기 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포는 안구 이식편으로서 대상체에게 투여될 수 있고, 상기 조성물에서 줄기 세포의 적어도 90%가 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포인, 안구 세포 재생을 촉진하기 위한 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포가 동종 줄기 세포, 동계 줄기 세포 또는 단리된 ABCB5(+) 인간 윤부 줄기 세포인 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포가 투여 전에 생체외 확장된 것인 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 대상체에게 1 내지 107개의 단리된 ABCB5(+) 윤부 줄기 세포가 이식에 의해 투여되는 것인 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 대상체가 포유동물 또는 인간인 조성물.
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