KR102366234B1

KR102366234B1 - 데스모디움 스컥스(Desmodium sequax Wall) 유래의 피부 주름 개선효과를 보이는 용매 추출물 또는 이의 분획물

Info

Publication number: KR102366234B1
Application number: KR1020200085618A
Authority: KR
Inventors: 손광희; 박호용; 신동하; 최상호
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2022-02-23
Anticipated expiration: 2040-07-10
Also published as: KR20220007419A

Abstract

본 발명은 데스모디움 스컥스(Desmodium sequax Wall) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물; 의약외품 조성물; 탄력증진용 화장료 조성물; 및 상기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 중금속 및 호기성 세균이 검출되지 않는 안전성을 보유하면서 피부 주름을 예방 또는 개선하는 효과가 있다.

Description

데스모디움 스컥스(Desmodium sequax Wall) 유래의 피부 주름 개선효과를 보이는 용매 추출물 또는 이의 분획물 {Skin wrinkle improvement effects of solvent extracts from Desmodium sequax Wall or fractions thereof}

본 발명은 데스모디움 스컥스(Desmodium sequax Wall) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물; 의약외품 조성물; 탄력증진용 화장료 조성물; 및 상기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선 방법에 관한 것이다.

사람의 피부는 생리적 노화와 같은 내인적 원인 혹은 자외선 자극과 같은 외부적 요인에 의해서 스트레스를 받고 구조적 노화의 과정을 겪는다. 특히 자외선 노출과 같은 외부적 자극은 세포 내에 유해 과산화물의 증가를 가져오며, 이들로부터 세포를 보호하기 위한 자연스런 방어기작 반응으로서 피부세포 색소의 합성 혹은 각질화가 촉진된다. 궁극적으로 이러한 과정은 피부 톤이 검게 되거나 주름의 형태로 나타나서 향장 측면에서 해결할 문제이다.

피부의 노화에 영향을 주는 이상의 일련의 과정은 항산화 소재에 의한 산화물 억제, 혹은 자외선 노출된 피부세포의 보호 기작을 가지는 소재에 의해 해결될 수 있어서 오가피, 두릅과 같은 천연물 혹은 플라본 화합물의 광노화 억제가 보고되어 있다. 이는 최근 자외선으로부터 피부를 보호하는 효과가 탁월한 천연소재 발굴 활성화에 기인하며 대상 자원은 자외선에 상시 노출되는 육상 식물군이 가장 좋은 후보군이다. 특히 열대 지역의 자원은 자외선 노출이 높은 기후 특성상 자연생태적으로 우수한 항산화 및 자외선 방지 효과가 좋은 소재를 기대할 수 있다.

또한, 자외선은 파장에 따라 UVA, UVB, UVC로 구분하며 파장이 가장 짧아서 오존층에 쉽게 흡수되는 UVC(200-280 nm)를 제외한 UVA (320-400 nm)와 UVB (280-320 nm)가 피부에 직접 도달한다. 특히 양적으로 95%를 차지할 뿐 아니라 초기 자극감 없이 피부암까지 이를 수 있는 가장 유해한 UVA가 피부 보호 측면에서는 가장 경계해야할 자외선이다.

광노화를 포함하는 피부의 노화는 일반적으로 피부기저층의 결합조직 손상을 통해 주름의 형태로 드러나기도 하는데, 이러한 경우 콜라젠이나 히알루론산을 공급해 주거나, 결합조직의 분해를 억제함으로써 광노화에 의한 주름 발생을 억제할 수 있다. 이러한 이유로 피부기저층의 결합조직 분해에 관여하는 효소를 억제하는 활성 소재는 피부의 주름을 완화하는 향장 재료로 보고되고 있다.

한편, 고도화된 소비자의 성향은 합성물보다 천연물 요구도가 현저히 높아지고 있으며, 동물실험이 금지된 화장품 소재의 열악한 개발환경 속에서, 상대적으로 안전성이 높은 천연 소재는 더 많은 관심을 받고 있다. 특히 자외선 노출도가 높은 열대에서 서식하는 ‘식물 자원’은 국가간 이익 공유에 대한 ABS 제도에도 불구하고 광노화 관련 바이오소재의 기원으로서 가치가 매우 높다.

식물 천연물은 항산화 기능을 갖는 활성을 기대할 수 있으며 또한 주름 생성의 경로에 작용하는 단백질 분해효소인 콜라게나제 혹은 엘라스타제의 활성억제를 통해 주름 발생을 억제할 수 있다. 최근, 앉은 부채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물(한국공개특허 10-2019-0130543)과 같은 식물 추출물을 포함하는 조성물의 주름 개선 효능에 대한 연구가 이루어지고 있다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 데스모디움 스컥스 추출물 및 이의 분획물의 항산화 효과, 콜라게나제 및 엘라스타제의 활성을 저해하는 효과를 확인하고, 이를 통한, 항산화·미백·피부노화 방지 효과가 있음을 확인하였으며, 현저한 주름 개선 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, “데스모디움 스컥스 (Desmodium sequax Wall)”는 콩과(Fabaceae)에 속하는 데스모디움 속(genus)으로서, 상기 데스모디움은 열대 및 아열대 지역에 분포되어 있으며 데스모디움 스컥스를 포함하여 약 350여개의 종이 존재한다. 주로 눈에 띄지 않는 콩과 식물로 밝은 색과 큰 꽃을 가지며 녹색비료, 사료 및 일부 약초로 쓰인다고 알려져 있다.

본 발명에서는 데스모디움 속에서도 데스모디움 스컥스가 피부 세포에 대한 자외선 보호 효과, 특히, 피부 주름 개선 및 탄력 증진에 우수한 효과를 보유하며, 안정성을 보유할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어, “추출물”은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 데스모디움 스컥스 추출물을 의미한다. 상기 데스모디움 스컥스 추출물은 상기 데스모디움 스컥스의 식물전체, 뿌리, 줄기, 잎 또는 꽃 중 어느 하나 이상, 이의 건조물, 가공물 등을 단독으로 또는 조합하여, 물 또는 다양한 유기용매 등으로 추출하여 수득할 수 있다.

이때, 사용되는 유기용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 물, 극성용매 또는 비극성용매가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등), 이들의 혼합용매 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올 또는 그의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 상기 추출물을 수득하기 위한 방법 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 데스모디움 스컥스의 식물전체, 이의 건조물, 가공물 등을 상기 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, “분획물”은 여러 다양한 구성성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 피부 주름 예방 또는 개선의 효과를 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 증류수, 알코올 등의 극성용매; 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 바람직하게는 탄소수 1(C₁) 내지 탄소수 4(C₄)의 알코올을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 데스모디움 스컥스의 추출물 또는 분획물은 총 중량에 대하여 100 중량부당 0.000001 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “주름”은 자외선에 의한 피부세포의 손상과 이로 인해 표현형으로 나타나는 피부기저층의 소실 및 각질화를 포함 하는 전주기적 과정을 말한다. 또한 상기 자외선에 의한 피부손상은 과산화물을 매개로 하는 각질화 및 주름 발생을 개선하는 것을 포함한다.

본 발명의 용어, “주름 예방 또는 개선”이란 피부에 주름이 생기는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 주름은 자외선에 의한 광노화로 인한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 자외선A(UVA)에 의한 것일 수 있으며, 이의 과산화물을 매개로 발생하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, “광노화”는 자외선에 의한 피부세포의 손상과 이로 인해 표현형으로 나타나는 색소침착, 각질화 및 주름의 발생을 포함 하는 전주기적 과정을 말한다. 또한, 상기 광노화는 주로 자외선 UVA의 자극에 의한 것일 수 있으며, 주름의 주요 원인일 수 있다. 따라서 이의 억제활성 내용은 과산화물을 매개로 하는 색소발생, 각질화 및 주름 발생을 예방 또는 개선하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, “화장료 조성물”은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 구체적으로, 저자극성 화장료 피부 보호제, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 세럼, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 크림, 에센스, 스트레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

상기 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물의 DPPH 라디칼 소거능과 같은 항산화 효과를 확인하고, 콜라게나아제 및 엘라스타아제 억제 활성과 자외선으로부터의 세포 보호 활성이 농도의존적으로 있음을 확인하였고, 세포 독성이 낮고, 세균 및 중금속 함량이 우수함을 확인하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 일 실시양태는, 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 용어, “데스모디움 스컥스”, “추출물”, “분획물” 및 “주름 개선”은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, “의약외품” 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함 된다.

본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 데스모디움 스컥스의 추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 본 발명의 물질 P, 항산화제, 계면활성제 및 점증제를 포함하는 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는, 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 용어, “데스모디움 스컥스”, “추출물”, “분획물” 및 “화장료 조성물”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “탄력 증진”은 피부 탄력 상태를 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 것을 의미한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는, 데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선 방법을 제공한다.

상기 용어, “데스모디움 스컥스”, “추출물”, “분획물” 및 “주름 예방 또는 개선”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체" 란, 피부 주름 또는 염증이 생성될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라, 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 및 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물을 매일 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 피부 주름 또는 염증 개선을 위하여 단독으로, 또는 다른 조성물과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 중금속 및 호기성 세균이 검출되지 않는 안전성을 보유하면서 피부 주름을 예방 또는 개선하는 효과가 있다.

도 1은 LC/MS 및 HR ESI-MS에 의한 SD-018pA의 화학식 분석을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 분획물 SD-18mLH20, 물질 SD-018pA의 인간섬유아세포 대상 피부 주름의 원인이 되는 자외선에 대한 피부세포 보호 효과 활성을 나타내는 그래프이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 데스모디움 스컥스(Desmodium Sequax Wall) 추출물 SD-018m, SD-018e 및 원제 TG-1의 제조

데스모디움 스컥스(Desmodium sequax Wall) 추출물을 제조하기 위하여, 데스모디움 스컥스를 채취하여 상온에서 건조하였다. 건조물은 적당한 크기로 절단하여 블렌더(blender mixer)를 이용하여 분쇄하여 분쇄물을 확보하였다. 이러한 데스모디움 분쇄물로부터 추출물을 확보하기 위하여 다음과 같이 용매의 조건에 따라 데스모디움 스컥스 추출물(SD-018)을 확보하였다. 이후, 데스모디움 스컥스 분쇄물 10g을 100mL의 70%(v/v) 메탄올(HPLC grade, 99.9%)에 현탁하여 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 추출액은 여과지(Whatman, No. 2)를 이용하여 걸러내고, 증발기(evaporator)를 이용한 감압농축하여 건조물 함량이 약 25~50mg이 되도록 각각의 튜브에 분주하여, 30~50℃에서 완전히 감압건조하여 추출물을 얻었고 무게를 정량하였다.

이를 통해, 수득한 데스모디움 스컥스 메탄올 추출물을 SD-018m으로 명명하였고, 에탄올을 용매로 수득한 데스모디움 스컥스 에탄올 추출물은 SD-018e로 명명하였다.

또한, 상기 SD-018e를 유효성분으로 포함하여 락토오즈 담체와 혼합건조하여 구성한 원제 SD-018eTG-1 (TG-1)을 조제하였다.

실시예 2. 데스모디움 스컥스(Desmodium Sequax Wall) 유래의 분획물 SD-018mLH20 및 물질 SD-018pA의 조제

데스모디움 스컥스 추출물로부터 분획물을 분획하기 위하여 Acquity UHPLC (Waters, USA)를 사용하였으며, 질량분석은 Orbitrap Fusion Mass Spectrometer (ThermoFisher Scientific, USA)를 통해 확인하였다. 또한, 분석에 적용한 컬럼은 Acquity BEH C18(1.7μm, 2.1 mm × 150 mm, Waters, USA)이었고, 용매조건은 A (0.1% formic acid, H2O)와 B (0.1% formic acid, CH3CN),검출은 PDA (200 nm-500 nm)와 MS (m/z; 150.0000-1,800.0000)이었다. 용매 펌프 속도는 0.4 mL/min이었고, 농도 구배는 A에 대한 B용액의 비율로 5 B% (0-1 min), 5-70 B% (1-20 min), 70-100 B% (20-24 min), 100 B% (24-27 min)의 구간으로 진행하였다.

보다 구체적으로, 메탄올 추출물의 추가 분리정제를 위해 에틸 아세테이트(ethyl acetate; Sigma, USA)와 3차 증류수를 1:1 비율로 담은 분액깔때기에서 액체-액체 분배를 수행하여, 용매 층으로 이동한 부분을 3 차에 걸쳐 회수하여 감압 농축하였고, 추출물 무게의 4배에 해당하는 실리카(Silica gel; 60, 0.040-0.063 mm, Merck, USA) 분말에 흡착시켜 dry packing을 위한 시료를 제조하였다. 이를 dry packing용 시료를 클로로폼(chloroform; Sigma, USA)을 이동상으로 미리 충진 된 silica open column 상단에 얹고 (6 g 실리카 당, 추출물 건조중량 160 mg의 비율로 주입(loading)), 클로로폼과 메탄올 혼합 용매를 이용하여 (CHCl₃:CH₃OH,49:1부터 4:1 까지 단계별 구배) 비극성 분획부터 용출시키며 분취물을 받았다. 분취물은 TLC (silica plate, 전개용매 조성 = CHCl₃:CH₃OH,4:1,anisaldehyde염색) 및 in vitro tyrosinase 저해도를 기준으로 스크리닝하여 활성이 확인되는 곳의 분취를 확보하여, 메탄올로 충진 된 Sephadex-LH20 오픈 컬럼을 통하여 정제된 SD-018mLH20를 확보하였다. 또한, 실리카 분획은 HPLC (Agilent 100, Agilent, USA)를 이용하여 순도 및 조성을 분석하였다. 분석용 컬럼은 YMC-Triart C18column(150×4.6 mm, 5 μm, 12 nm, YMC, Japan)이었으며, 이동상 용매는 acetonitrile 40%의 isocratic 조건이었고, 유속 0.5 mL/min의 속도로 20분까지 용출시켰다. LC/MS 분석 기준에서 tR(retentiontime)9.98~10.22사이 피크를 기준으로 판별하여, 수득한 분자량 288의 저분자 물질 SD-018pA를 확보하였다.

상기 매스 피크에 의한 분리된 SD-018pA에 대한 분자량 및 화학식을 LC/MS로 분석하고, 별도의 HR ESI-MS (한국기초과학지원연구원)를 통해 유도체의 화학식을 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 분획물의 화학식을 확인하였다.

실시예 3. DPPH 소거능 및 폴리페놀 함량 분석

데스모디움 스컥스 추출물의 항산화 활성을 분석하기 위해 DPPH 소거능 및 폴리페놀의 양을 분석하였다.

보다 구체적으로, 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu (FC) 방법을 개량하여 사용하였다. 농도 1 mg/mL인 시료 80 μL와 50% FC 시약(Sigma, USA) 20 μL을 혼합하여 3 분간 반응한 후, 2% 탄산나트륨(Na2CO3,Sigma,USA)100μL와 혼합하여 microplate reader (Infinite M200-Pro, TECAN, Switzerland)로 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 3 반복 평균값 및 편차를 계산하여, 건조 추출물 무게(g)에 대한 gallic acid (Sigma, USA)의 당량 무게(mg GAE)로 표시하였다.

(적용 농도, 1 mg/ml)	총폴리페놀 함량 (mgGAE/g-시료)
SD-018m 추출물	22.65±3.80

또한, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능 평가는 농도별 희석된 시료 10 μL과 190 μL의 0.1 mM DPPH 용액을 기준으로 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)에서 반응 시간별로 517 nm 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조구를 기준으로 라디칼 소거 정도를 백분율로 나타내고, 양성 대조구로 아스코르브산(ascorbic acid; Sigma, USA)을 사용하여 소거 활성을 비교 분석하였다.

DPPH 라디칼 소거활성 (%) = {(H0- H)/H0}× 100

(H = 시료 및 양성 대조구의 흡광도; H0=Blank실험구의 흡광도)

시료농도, ug/ml	0.05	0.5	5	50	500
SD-018m의 DPPH 소거능, %	-0.26	0.08	1.65	26.34	76.25
대조구, % (아스코르브산)	0.06	6.68	70.87	86.92	87.15

그 결과, 표 2에서 볼 수 있듯이, 데스모디움 추출물이 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능이 증가함을 확인하였다.

이를 통해, 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 보여 라디칼 소거 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 4. SD-018pA의 콜라젠 억제

데스모디움 스컥스의 에탄올 추출물을 0.8:1 ~ 1:12의 비율로 락토스와 섞어 동결건조한 제형 TG-1을 확보한 뒤, 콜라게나아제(Collagenase)에 대한 저해활성의 측정하였다.

보다 구체적으로, 상기 콜라게나아제 저해활성은 Wittenauer의 방법을 개선하여 진행하였다. Clostridium histolyticum collagenase (EC 3.4.24.3, Sigma, USA) 효소와 FALGPA (N-{3-[2-furyl]acryloyl}-Leu-Gly-Pro-Ala) 기질을 사용하여, 완충용액 50 mM Tris buffer (pH 7.5, 10 mM CaCl₂,400mMNaCl)85μL 와 시료 40 μL, 0.3 mg/mL collagenase 20 μL를 혼합하여 10 min간 반응시키고 0.2 mg/mL FALGPA를 55 μL 첨가하여 마이크로플레이트 리더기에서 340 nm 흡광도를 10 분간 측정하였다. 용매 음성 대조구와 1,10-phenanthroline을 양성 대조구로 아래의 식과 같이 저해활성을 계산하였고, 처리 농도별 저해율을 바탕으로 회귀식을 통해 half max 수치 IC₅₀을 도출하였다.

Collagenase 저해율 (%) = {1 - (저해제 처리군의 흡광도)/(저해제 무처리군의 흡광도)} × 100

시료	SD-018pA	대조구, O-phenanthroline
IC₅₀,uM	307.4	57.5

그 결과, 표 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물을 포함하는 제형이 양성 대조구보다 현저하게 높은 콜라게나아제 저해활성을 보이는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물이 양성 대조구 대비 현저한 피부 주름 예방 또는 개선 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 5. SD-018mLH20의 엘라스타제 활성 억제능 평가

데스모디움 스컥스 추출물 SD-018mLH20의 엘라스타제 활성 억제능을 평가하였다.

보다 구체적으로, 계대배양한 인간섬유아세포(HDF)에서 추출한 엘라스타제 효소액과 0.2M tris-HCl 완충액 및 SD18pM LH20 5μg/mL을 각각 96 well plate에 처리한 후 엘라스타제 기질인 STANA액을 넣어주어 37℃에서 90분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 엘라스타제 활성 억제능을 평가하였다. 각 반복 실험 별 결과 값은 표 4에 나타내었다.

시험은 2회 반복하여 실시한 후 각 흡광도 값을 아래의 식에 대입하여 엘라스타제 활성 억제능(%)을 구하였으며, 시료의 각 농도에 대한 결과값은 2회 반복 시험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

SD-018mLH20 시료농도, ug/ml	활성 평균, 표준편차
무처리군	0.00 ± 0.00
5	17.60 ± 0.86
50	56.42 ± 0.20

그 결과, 표 4에서 볼 수 있듯이, 데스모디움 추출물 SD18pM LH20은 5μg/mL에서 무처리군 대비 17.60%, 50μg/mL에서 56.42%의 엘라스타제 활성 억제능을 나타내었다.

이를 통해, 이를 통해, 본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물이 농도의존적으로 피부 주름 예방 또는 개선 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 6. 데스모디움 스컥스 유래 분획물 SD-18m LH20의 인간섬유아세포 대상 세포독성 활성

계대배양한 B16F10 세포를 96-well plate에 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 24시간 동안 배양한 후 배양액을 혈청이 들어있지 않은 배양액으로 교체하였다. 이후, 1μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL 및 20μg/mL로 희석한 SD-18m LH20을 처리하고 24시간 동안 상기와 같은 조건에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후, 차광상태에서 MTT 용액을 각 well에 처리하여 2시간 반응시킨 뒤, 상등액을 제거하고, 생성된 formazan을 DMSO로 완전히 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 반복 시험별 결과 값은 표 5에 나타내었다.

시험은 2회 반복하여 실시한 후 각 흡광도 값을 아래의 식에 대입하여 세포독성률(%)을 구하였으며, 시료의 각 농도에 대한 결과 값은 2회 반복 시험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

농도, ug/ml	독성 평균, 편차
0 (무처리군)	0.00 ± 0.00
1	-12.37 ± 2.15
5	6.17 ± 0.41
10	2.31 ± 1.88
20	15.43 ± 0.71

그 결과, 표 6에서 볼 수 있듯이, SD-18m LH20은 1μg/mL 농도에서 -12.37%, 5μg/mL 농도에서 -6.17%, 10μg/mL 농도에서 2.31%, 20μg/mL 농도에서 15.43%의 세포독성률을 나타내었다.

이를 통해, 데스모디움 스컥스 유래 분획물 SD-18m LH20이 10μg/mL 미만에서 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 7. 데스모디움 스컥스 분획물 SD-18m LH20 및 물질 SD-018pA의 인간섬유아세포 대상 자외선에 대한 피부세포 보호 효과 활성

인간섬유아세포(HDF)에 시료를 농도별로 24시간 처리한 후, UVA 5 J/cm²를 조사하여 세포 보호 효과를 측정하였다.

보다 구체적으로, UV 손상된 세포의 회복성을 제공하는 천연물질의 처리농도별 세포생존율을 지표로 검정하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 데스모디움 스컥스 분획물 SD-018m LH20의 농도 1.5 ~ 12.5 ug/ml에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가함을 확인하였고, SD-018pA의 농도 25 ~ 50 ug/ml에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가함을 확인하였다.

이를 통해, 데스모디움 스컥스 분획물 SD-018m LH20의 농도 1.5 ~ 12.5 ug/ml에서 농도 의존적으로 자외선으로부터의 세포 보호 효과가 있음을 확인하였고, SD-018pA의 농도 25 ~ 50 ug/ml에서 농도 의존적으로 자외선으로부터의 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 8. TG-1의 세균 및 중금속 분석

데스모디움 스컥스 추출물을 포함하는 원제 TG-1의 세균 분석을 실시하였다.

구체적으로, TG-1의 호기성 세균은 0~0.5 mg/ml 사이의 희석된 TG-1 수용액을 NB 플레이트에 도말하여 1일 후부터 모니터링 하여 cfu로 표시하였다.

그 결과, 전 구간에서 콜로니의 발생이 없음을 확인하였다.

또한, 상기 TG-1의 중금속 함유를 분석하였다.

구체적으로, TG-1 성분중 중금속은 Thermo Sci. iCAP Qc Inductively Coupled Plasma ICP-MS를 통해 분석하였다.

그 결과, 표 6에서 볼 수 있듯이, 비소, 카드뮴, 납, 수은이 검출한계 0.5 mg/kg 조건에서 검출되지 않았다.

실시예 9. 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물을 포함하는 화장품의 제조

본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물을 포함하는 화장품을 제조하였다.

보다 구체적으로, 하기 표 7에 기재된 조성으로 유화제형의 화장품을 제조하였으며, 제조 방법은 다음과 같다.

1) 1 내지 10의 원료를 혼합한 혼합물을 65 ~ 85℃로 가열하였다.

2) 11의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.

3) 12 내지 14의 원료의 혼합물을 65~85℃로 가열하여 완전히 분산시켰다.

4) 상기 단계 3)을 거치면서, 단계 3)의 혼합물에 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 7,000~12,000 rpm에서 2 ~ 3분간 유화시켰다.

5) 15의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2~5분간 더 유화시켰다.

6) 16 내지 18의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.

7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25~35℃로 냉각시킴으로써 유화제형의 화장품을 제조하였다.

조성		제형 1	제형 2	제형 3
1	스테아린 산	0.3	0.3	0.3
2	스테알리 알콜	0.2	0.2	0.2
3	클리세릴 모노스테아레이트	1.2	1.2	1.2
4	폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우린산 에스테로	2.2	2.2	2.2
5	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
6	파라옥시안식향산 프로필	0.05	0.05	0.05
7	세틸에틸헥사노에이트	5	5	5
8	트리글리세라이드	2	2	2
9	호호바 오일	5	5	5
10	밀납	0.4	1.0	2.0
11	사이클로메치콘	3	3	3
12	정제수	<100	<100	<100
13	글리세린	5	5	5
14	트리에탄올아민	0.15	0.15	0.15
15	폴리아크릴산 중합체	0.12	0.12	0.12
16	색소	0.0001	0.0001	0.0001
17	향	0.10	0.10	0.10
18	SD018 추출물 또는 분획물	0.00001	0.0001	0.001

그 결과, 본 발명의 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물을 포함하는 3가지 제형의 화장품을 제조하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

데스모디움 스컥스 (Desmodium sequax Wall) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 데스모디움 스컥스 추출물은 데스모디움 스컥스를 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조되는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 데스모디움 스컥스 추출물 또는 분획물은 데스모디움 스컥스의 뿌리, 줄기, 잎 또는 꽃 중 어느 하나 이상에서 추출하여 제조되는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 주름은 자외선에 의한 광노화로 인한 것인, 화장료 조성물.
데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 탄력 증진용 화장품 조성물.
데스모디움 스컥스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 주름 예방 또는 개선 방법.