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KR102343744B1 - 3차원 조직 배양을 위한 장치 및 방법 - Google Patents

3차원 조직 배양을 위한 장치 및 방법 Download PDF

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KR102343744B1
KR102343744B1 KR1020207023445A KR20207023445A KR102343744B1 KR 102343744 B1 KR102343744 B1 KR 102343744B1 KR 1020207023445 A KR1020207023445 A KR 1020207023445A KR 20207023445 A KR20207023445 A KR 20207023445A KR 102343744 B1 KR102343744 B1 KR 102343744B1
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tissue
poly
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bioreactor
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제이슨 미클라스
밀리차 라디식
니말란 타반디란
사라 바스콘셀로스
윤 샤오
보양 장
이무 자오
Original Assignee
밀리차 라디식
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Abstract

본 개시내용은 다른 적용분야 중에서도 약물 시험, 조직 복구 및/또는 치료, 및 재생 의학에 사용하기 위한, 본래의 조직의 본래의 생리학, 아키텍처, 및 기타 특성을 정확하게 모방한 3차원 생물학적 조직을 제조 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 및 장치를 제공한다.

Description

3차원 조직 배양을 위한 장치 및 방법 {DEVICES AND METHODS FOR THREE-DIMENSIONAL TISSUE CULTURING}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 10월 30일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/897,276을 우선권 주장하며, 이는 모든 목적상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 본래의 조직의 본래의 상태 및 구조, 예컨대 비제한적으로 본래의 생리학, 조직 아키텍처, 혈관계, 및 기타 특성을 정확하게 모방한 3차원 생물학적 조직, 뿐만 아니라 조직 스캐폴드를 제조 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 및 장치에 관한 것이다. 합성 또는 조작된 조직은 심장, 간, 신경, 혈관, 신장, 및 근육 조직을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 방법, 조성물, 및 장치는 약물 시험, 조직 복구, 조직 대체, 치료, 재생 의학 또는 그의 조합을 포함하는 다양한 적용분야에서 사용될 수 있다.
조직 공학은 생물학적 구조 및/또는 기능을 개선시키거나, 대체하거나, 또는 모방하기 위한 세포, 공학, 물질 및 방법, 뿐만 아니라 적합한 생화학적 (예를 들어, 성장 인자) 및 물리-화학적 인자 (예를 들어, 화학적으로-변형된 세포외 매트릭스)의 조합의 사용이다. 조직 공학은 조직 기능 또는 전체 기관을 복원하거나, 유지하거나, 또는 개선시키는 생물학적 대체물의 개발을 위해 공학 및 생명 과학의 원리를 적용하는 학제간 분야로서 널리 받아들여진다. 조작된 조직 시스템은 손상 또는 이환 조직 (예를 들어, 심근경색)을 복원 및/또는 복구하기 위한 재생 의학 영역에서 유의한 잠재력을 가질 뿐만 아니라, 약리학적 작용제와 연관된 약동학적 및 약역학적 반응을 예측 및/또는 시험하기 위한 보다 정확하고 생리학상 적절한 모델 시스템에의 접근을 제공함으로써 약물 발견 및 개발에 사용되도록 제안되어 왔다.
특히 조직 공학이 직면한 주요 도전과제는 본래의 조직의 구조, 생리학, 및 기능을 보다 우수하게 모방한 보다 복잡하고 생리학상 적절한 조작된 조직에 대한 필요이다. 이는 조작된 조직을 치료제의 스크린, 시험 및/또는 평가에 사용하고자 하는 경우에 특히 중요하며, 도전과제이다.
약물 발견 및 개발은 실험 세포 및 동물 모델에서의 약리학적 효과의 입증으로 시작해서 환자에서의 약물 안전성 및 효능 연구로 끝나는 힘든 시험 과정으로 이루어진다. 5,000종의 스크리닝된 화합물 중 단지 1종만이 안전하고 효과적인 신규한 의약으로서 FDA 승인을 받는 것으로 추정된다. 화합물의 대략 25%는 전-임상 독성학 연구에서 제거된다. 따라서, 전-임상 개발에서 유의한 수의 약물 후보가 시험 시스템에서의 허용되지 않는 독성 수준으로 인해 이 단계에서 더 진행하는데 실패한다.
전형적으로, 약물 후보를 평가할 때 다중 약리학적 파라미터가 고려된다. 인간 (및 독성학 평가에 사용된 동물)에서의 약물 및 그의 대사물의 흡수, 분포, 대사 및 배출 (ADME) 프로파일에 대한 지식은 집단 내 개체 사이에서의 효과상 차이를 이해하고 투여 양상을 최적화하기 위해 중요하다. 흡수 및 생체이용률은 체순환 또는 국부 작용 부위에 분포된 생물학적 활성 물질의 양의 표준 척도이다. 약물 작용의 지속기간은 종종, 약물-대사 효소에 의한 화학적 변형을 수반하는 대사를 통해 또는 체내 생물학적 활성 부위에의 결합 및 그로부터의 수송을 수반하는 배출에 의해, 신체가 얼마나 신속하게 활성 분자를 제거하는지에 따라 달라진다. 따라서, 전형적인 전-임상 연구는 상피막 (예를 들어, 위장 점막)을 가로지르는 투과를 모니터링하는 것, 약물 대사의 연구, 혈장 단백질 결합의 확인, 및 조직, 특히 약물 제품을 제거하는 기관, 예컨대 신장 및 간 안팎으로의 수송의 평가를 수반한다.
현행 전-임상 독성 및 약리학 연구는 전형적으로, 배양된 세포 또는 세포하 소기관을 수반하는 시험관내 검정 뿐만 아니라 약물 대사, 독성 및 가능한 효능을 조사하기 위한 생체내 동물 모델을 사용한다. 세포, 분자적 및 생화학적 검정에서의 기술적 진보는 유의하게 발전되어 왔지만, 여전히 다수의 유의한 문제점이 존재한다. 먼저, 정제 또는 재조합 효소 및 세포 배양물을 사용하는 시험관내 검정은 이후에 동물 모델에서 사용될 약리학적 및 독성학적 파라미터를 결정하는데 있어서 첫번째 단계를 제공하지만, 종종 너무 단순하여 본래의 인간 조직 또는 시스템에서의 약물 대사 동안 발생하는 수많은 사건을 고려하지 못한다. 두번째로, 동물 모델에서 수득된 데이터는 인간 시스템에 외삽시키는 것이 어려울 수 있다. 세번째로, HIV 감염 또는 알츠하이머병과 같은 만성 질환을 치료하는데 사용되는 많은 약물은 장기간에 걸쳐, 일부 경우에는 개체의 평생에 걸쳐 적용되는 투여 요법을 필요로 한다. 현재, 만성 독성의 발생은 장기간 환자 사용 동안에 가장 실제적으로 관찰된다.
약물 후보의 높은 실패율 및 이러한 실패와 연관된 높은 비용 및 다른 방해요인을 고려하면, 약물과 연관된 독성, 유효성, 및 전반적인 약역학적 및/또는 약동학적 특성을 비롯하여 약물이 인간 대상체와 어떻게 상호작용할 수 있는지 다양한 측면을 신뢰할 만하게 이해하고 예측할 수 있는 보다 효과적인 전-임상 모델 및 검정 시스템에 대한 높은 필요가 존재한다. 조직 공학은 대상체에 대한 약리학적 작용제의 상호작용 및 효과를 효과적이고, 신뢰할 만하고, 정확하게 평가하는데 사용될 수 있는, 본래의 조직, 예컨대 심장, 신경, 혈관, 신장, 및 근육 조직의 본래의 생리학, 아키텍처, 및 기타 특성을 정확하게 모방한 3차원 생물학적 조직을 제공하는 해결책일 수 있다. 그러나, 약물 효과를 평가하는데 신뢰할 만하게 사용될 수 있는 적합한 조작된 조직 시스템을 개발하는데 있어서 많은 유의한 복잡성을 고려하면, 약물 시험 및 개발에서의 조작된 조직의 사용은 현재 제한된 유용성 및 가치를 갖는다.
이는 특히 조작된 심혈관 조직 모델을 사용한 약물 스크리닝의 경우이다. 심혈관 질환은 전형적으로 높은 이환율 및 사망률과 연관되기 때문에, 약리학적 요법을 위한 중요한 표적이다. 시험관내 조작된 모델은 개선된 시스템 제어 및 보다 높은 처리량으로 인해 동물 모델에 대한 비용-효과적인 대안으로서 제공될 수 있다. 최근 수년간, 조직 공학 방법은 본래의 심근의 복잡성 및 전기-기계적 기능을 보다 우수하게 재현한 시험관내 기능적 3차원 (3D) 심장 조직을 생성하는데 유의하게 진보해왔다. 그러나, 현행 시스템은 본래의 심장 조직의 아키텍처 복잡성을 충분히 밀접하게 재현하는데 실패하였고, 따라서 실제 본래의 심장 조직의 생리학상 측면과 불충분하게 관련된다.
개선된 조작된 조직 모델 시스템은 약물 안전성 및 효능에 대한 의미있는 전-임상 정보를 수득하기 위한 더 나은 기회를 제공할 것이다. 이러한 시스템은 힘든 약물 개발 및 발견 과정을 개선시킬 것이다. 이러한 필요가 관련 기술분야에 존재한다. 본 개시내용은 다른 적용분야 중에서도 약물 시험, 조직 복구, 이식, 질환 치료, 재생 의학 또는 그의 조합에 사용하기 위한, 본래의 조직, 예컨대 예를 들어 심장, 신경, 혈관, 및 근육 조직의 본래의 생리학, 아키텍처, 및 기타 특성을 정확하게 모방한 3차원 생물학적 조직을 제조하기 위한 방법, 조성물, 및 장치를 제공함으로써 이들 관련 기술분야에서 인식되는 문제점에 대한 다양한 해결책을 제공한다.
[비특허문헌]
명세서에서 언급된 참고문헌
하기 참고문헌 각각은 본원에 참조로 포함된다.
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실시예 6에 대한 참고문헌: 하기 참고문헌 각각은 본원에 참조로 포함된다.
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본 개시내용은 다른 적용분야 중에서도 약물 시험, 조직 복구, 이식, 질환 치료, 재생 의학 또는 그의 조합에 사용하기 위한, 본래의 조직의 본래의 생리학, 아키텍처, 및 기타 특성을 정확하게 모방한 생물학적 조직, 바람직하게는 3차원 조직을 제조 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 및 장치를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 조작된 조직 구축물, 바람직하게는 3차원 조직 구축물을 배양, 성장 및/또는 시험하기 위한 다양한 조직 배양 또는 조직 공학 생물반응기 시스템을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 발명의 다양한 조직 배양 시스템으로부터 성장 또는 제조된 조작된 조직 구축물, 예를 들어 3차원 조직 구축물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 조직 배양 시스템 및 그 안에서 성장한 조직 구축물 둘 다에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 본 발명의 3차원 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
다양한 다른 측면에서, 본 개시내용은 조직, 특정 실시양태에서 3차원 조직을 배양하기 위한 장치 및 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 또한 본 발명의 장치 및 시스템의 제작 방법을 제공한다.
다양한 형태에서, 본 개시내용의 다양한 조직 시스템은 심장 조직, 간 조직, 신장 조직, 연골 조직, 피부, 골수 조직 또는 이러한 조직의 조합으로 구성된다. 특정한 실시양태에서, 3차원 조직 시스템은 심장 조직을 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 조직 시스템은 신장 조직으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 내에 형성된 조직은 3차원 조직이다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 웰 또는 채널, 웰 또는 채널에 걸쳐 지지되거나 현수된 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소를 갖는 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 웰 또는 채널은 내부에 시딩된 세포, 뿐만 아니라 성장 배지 및/또는 영양소 및/또는 인자를 수용하도록 구성된다. 시딩된 세포는 배양되어, 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소에 함유된, 그 주변의, 그 위의, 및/또는 그와 통합된 조직 배양물, 바람직하게는 특정 실시양태에서 3차원 조직 가닥을 형성한다.
제2 측면에서, 본 개시내용은 조직 배양물, 예를 들어 3차원 조직 가닥을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 생물반응기 시스템은 세포를 시딩하는데 적합한 웰 또는 채널, 및 1개 이상의 내강을 갖고, 웰 또는 채널 상에, 예를 들어 웰 또는 채널의 종축을 따라 지지되거나 현수된 관류가능한 스캐폴드를 포함한다. 세포가 임의적인 적합한 성장 배지, 성장 인자, 및 세포의 배양에 적합한 다른 영양소와 함께 웰 또는 채널 내에 시딩되면, 세포는 성장하여 관류가능한 스캐폴드를 둘러싸고/거나 그와 통합된 조직 가닥을 형성한다. 사용 중에, 영양소 및 성장 인자, 뿐만 아니라 시험 작용제 (예를 들어, 약물, 단백질, 독소 등)는 이러한 물질을 전달하기 위한 수단 (예를 들어, 튜브 또는 관을 통해 내강에 연결된 저장 요소)과 통합된 관류가능한 내강을 통해 조직 가닥으로 전달될 수 있다. 또한, 생물반응기 시스템은 다양한 실시양태에서 관류가능한 내강으로부터 배출되는 통로, 예를 들어 폐기물 및 다른 대사 산물이 조직 가닥으로부터 관류가능한 내강 내로 및 말단 저장소 외로 확산되도록 하는 드레인 또는 다른 말단 저장소를 또한 포함할 수 있다. 심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 생물반응기의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 관류가능한 내강 요소의 길이를 따라 형성된 조직 가닥의 종축에 평행 또는 수직인 방향일 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 수축력을 측정하는데 적합한, 조직 배양물, 예를 들어 3차원 조직 가닥을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면은 웰 또는 채널, 및 웰 또는 챔버 내에 배치되어 그 사이에 형성된 3차원 조직 가닥에 대한 적어도 2개의 고정점을 형성하도록 기능하는 적어도 1개의 세트의 대향 스캐폴드 요소 (단일 스캐폴드 또는 별개의 스캐폴드로 형성될 수 있음)를 갖는 생물반응기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 1개의 세트의 대향 스캐폴드 요소는 웰 또는 채널의 벽에 가역적으로 부착되지만, 웰 또는 챔버의 바닥과 요소 사이에 갭이 존재하도록 그 위에 현수된다. 제3 측면의 생물반응기는 2개의 이러한 요소를 갖는 것으로 제한되지 않고, 2개 초과, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 이러한 요소를 포함할 수 있다. 각각의 대향 요소 주변에서 형성되어 그들 사이에 연결되는 3차원 조직 가닥을 형성하는 능력이 존재하고, 조직 가닥이 대향 세트 또는 세트들의 스캐폴드 요소 사이에 배치되고 채널 또는 웰 상에 현수되도록 하는 한, 채널당 임의의 수의 요소가 제공될 수 있다.
스캐폴드 요소는 바람직하게는 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등이고, 이는 추가로 스캐폴드 요소에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘된 수축력의 측정이 가능하도록 구성된다.
제3 측면의 바람직한 실시양태에서, 각각의 웰 또는 채널은 한 세트 (2개) 또는 대향 스캐폴드 요소로 구성되고, 바람직하게는 그에 의해 단일 스캐폴드 요소가 웰 또는 채널의 종축의 대향 말단에 또는 그 근처에 배치된다.
제3 측면의 특정 실시양태에서, 스캐폴드 요소는 웰 또는 채널의 바닥 표면에서 들어올려진다.
제4 측면에서, 본 발명은 내부에 통합된 1개 이상의 내강 통로를 갖는 3차원 분지화된 조직 스캐폴드 또는 매트릭스 (예를 들어, 혈관화된 3차원 조직 구조를 모방함)를 포함하는, 3차원 조직을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 시딩된 세포를 성장시키기 위한 제1 부분 또는 영역 및 제1 부분을 통과하거나 그와 통합된 상호연결된 채널을 제공하기 위한 제2 부분 또는 영역을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상호연결된 채널은 제1 부분과 관련하여 관류가능하고, 생물학적 혈관계를 모방하도록 구성될 수 있다. 제1 부분은 1개 이상의 개방 영역 또는 챔버를 함유할 수 있고, 그에 의해 세포 및/또는 조직을 성장시키기 위한 챔버의 개방 네트워크가 제공된다. 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 또한 모든 구성요소 사이에 세공 또는 개방 연결부를 함유할 수 있다. 예를 들어, 개방 세공 또는 연결부는 세포를 성장시키기 위한 챔버의 개방 네트워크 사이에 위치할 수 있다. 또한, 개방 세공 또는 연결부는 1개 이상의 내강 통로와 함께 위치하거나 그와 통합될 수 있다. 개방 세공 또는 연결부는 생물반응기 시스템을 통한 세포, 배지, 성장 인자, 영양소, 및 폐기물의 이동을 용이하게 한다. 생물반응기는 생물반응기 시스템에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 스캐폴드 또는 매트릭스에 일반적으로 수직 또는 평행인 방향일 수 있다.
제5 측면에서, 본 개시내용은 수축력을 측정하는데 적합한, 조직 배양물, 예를 들어 3차원 관류가능한 조직 가닥을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 생물반응기 시스템은 세포를 시딩하는데 적합한 웰 또는 채널, 및 1개 이상의 내강을 갖고, 웰 또는 채널 상에, 예를 들어 웰 또는 채널의 종축을 따라 지지되거나 현수된 관류가능한 스캐폴드를 포함한다. 또한, 관류가능한 스캐폴드는 관류가능한 스캐폴드의 종축을 따라 웰 또는 챔버 내에 배치되어 그 사이에 형성된 3차원 조직 가닥에 대한 적어도 2개의 고정점을 형성하도록 기능하고, 조직 가닥의 수축 상태에 반응하여 변형 또는 굴곡될 수 있는 1개 세트 또는 그 초과의 대향 스캐폴드 요소 (단일 스캐폴드 또는 별개의 스캐폴드로 형성될 수 있음)로 구성된다. 제5 측면의 생물반응기는 2개의 이러한 변형가능한 요소를 갖는 것으로 제한되지 않고, 2개 초과, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 이러한 요소를 포함할 수 있다. 각각의 대향 요소 주변 및 관류가능한 요소의 종방향 길이를 따라 형성되는 3차원 조직 가닥을 형성하는 능력이 존재하고, 조직 가닥이 대향 세트 또는 세트들의 스캐폴드 요소 사이에 배치되고 채널 또는 웰 상에 현수되도록 그들 사이를 연결시키는 한, 채널당 임의의 수의 요소가 제공될 수 있다.
스캐폴드 요소는 바람직하게는 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등이고, 이는 추가로 스캐폴드 요소에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘된 수축력의 측정이 가능하도록 구성된다.
제5 측면의 바람직한 실시양태에서, 각각의 웰 또는 채널은 한 세트 (2개) 또는 대향 스캐폴드 요소로 구성되고, 바람직하게는 그에 의해 단일 스캐폴드 요소가 주어진 웰 또는 채널의 종축의 대향 말단에 또는 그 근처에 배치된다.
세포가 적합한 성장 배지, 성장 인자, 및 세포의 배양에 적합한 다른 영양소와 함께 주어진 웰 또는 채널 내에 시딩되면, 세포는 성장하여 관류가능한 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소를 둘러싸고/거나 그와 통합된 조직 가닥을 형성한다. 사용 중에, 영양소 및 성장 인자, 뿐만 아니라 시험 작용제 (예를 들어, 약물, 단백질, 독소 등)는 이러한 물질을 전달하기 위한 수단 (예를 들어, 튜브 또는 관을 통해 내강에 연결된 저장 요소)과 통합된 관류가능한 내강을 통해 조직 가닥으로 전달될 수 있다. 또한, 생물반응기 시스템은 다양한 실시양태에서 관류가능한 내강으로부터 배출되는 통로, 예를 들어 폐기물 및 다른 대사 산물이 조직 가닥으로부터 관류가능한 내강 내로 및 말단 저장소 외로 확산되도록 하는 드레인 또는 다른 말단 저장소를 또한 포함할 수 있다. 심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 생물반응기의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 관류가능한 내강 요소의 길이를 따라 형성된 조직 가닥의 종축에 평행인 방향일 수 있다.
5가지의 특정한 측면이 상기 기재되고 본원에 추가로 기재되지만, 본 발명은 이들 측면 및 그의 실시양태로 제한되지 않는다. 본 개시내용은 이들 측면 및 실시양태의 임의의 다른 적합한 변형 및 그의 조합을 고려한다.
고려되는 임의의 실시양태에서, 본원에 기재된 생물반응기에 의해 성장된 3차원 조직은 임의의 단세포 유형, 예컨대 심장 조직, 간 조직, 신장 조직, 연골 조직, 피부, 골수 조직 또는 이러한 조직의 조합 등으로부터의 세포로부터 형성될 수 있다. 3차원 조직을 성장시키는데 사용되는 세포는 임의의 상업적 공급원을 비롯하여 어느 곳에서나 공급될 수 있거나, 또는 심지어 개별 대상체 또는 환자로부터 공급될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 가닥은 상업적으로 입수가능한 간 세포주의 시드로부터 시작하여 성장할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 조직 가닥은 대상체로부터 직접적으로 수득된 세포, 예를 들어 생검으로부터 단리된 세포의 시드로부터 시작하여 성장할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 3차원 조직은 상이한 세포의 혼합물로부터 성장할 수 있다. 이러한 세포의 혼합물은 동일하거나 상이한 조직으로부터의 건강 또는 이환 세포의 혼합물, 상이한 공급원 또는 환자로부터의 세포의 혼합물, 또는 둘 다의 환자 및 상업적 공급원으로부터의 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조직을 성장시키는데 사용되는 세포는 또한 유전자 조작된 세포, 예컨대 약물-저항성 또는 약물-감수성 조작된 세포주일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 3차원 조직을 성장시키는데 사용되는 세포는 배아 줄기 세포 ("ESC"), 태아 줄기 세포 ("FSC"), 및 성체 (또는 체성) 줄기 세포 ("SSC")를 비롯한 줄기 세포일 수 있다. 효력 잠재력과 관련하여 줄기 세포는 전능 (일명 옴니포텐트) (배아 및 배아외 세포 유형으로 분화될 수 있는 줄기 세포), 만능 줄기 세포 (거의 모든 세포로 분화될 수 있음), 다능 줄기 세포 (다수의 세포 유형으로 분화될 수 있음), 소기능 줄기 세포 (단지 소수의 세포 유형으로 분화될 수 있음), 또는 단능 세포 (단지 1개의 세포 유형만을 생성할 수 있음)일 수 있다. 줄기 세포는 상업적으로 수득될 수 있거나, 환자로부터 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터 직접적으로 수득/단리될 수 있다.
다른 실시양태에서, 오피오이드 진통제, 항염증 약물, 예컨대 항히스타민제 및 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 이뇨제, 예컨대 탄산 안히드라제 억제제, 루프 이뇨제, 고효능 이뇨제, 티아지드 및 티아지드-유사 작용제, 및 칼륨-보존성 이뇨제, 신장 및 심혈관계에 영향을 미치는 작용제, 예컨대 안지오텐신 전환 효소 억제제, 심장 약물, 예컨대 유기 니트레이트, 칼슘 채널 차단제, 교감신경차단제, 혈관확장제, 베타-아드레날린성 수용체 효능제 및 길항제, .알파.-아드레날린성 수용체 효능제 및 길항제, 강심성 글리코시드, 항부정맥 약물, 고지단백혈증에 영향을 미치는 작용제, 예컨대 3-히드록시메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 억제제, 항신생물제, 예컨대 알킬화제, 항대사물, 천연 생성물, 항생제 및 다른 약물, 면역조절제, 항당뇨병제, 및 항미생물제, 예컨대 항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제, 항원충제, 및 항기생충제를 비롯하여, 임의의 적합한 실험 약물 또는 약리학적 시험 작용제는 본 발명의 3차원 시스템에 의해 시험될 수 있다.
본 발명의 임의의 실시양태에서, 스캐폴드, 매트릭스, 또는 다른 굴곡가능한 요소는 예를 들어 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 폴리스티렌을 비롯한 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다. 임의로 특정 실시양태에서, 스캐폴드 물질은 단백질, 약물, 영양소, 및 대사 폐기물을 비롯한 물 및 분자의 교환 및/또는 통과를 가능하게 하도록 관류가능할 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 관류가능성은 스캐폴드 물질 내 세공의 형성을 통해 구현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 마이크로제작, 소프트 리소그래피 공정 (스텝-및-플래쉬 임프린트 리소그래피 (SFIL)를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 3D 인쇄 (즉, 첨가식 제조), 고온 엠보싱, 압출, 사출 성형, 상-이동 에지 리소그래피, 및 나노스카이빙을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 제작될 수 있다.
특정한 측면에서, 본 발명은 복수개의 웰을 포함하는 조직 가닥의 배양을 위한 생물반응기에 관한 것으로, 각각의 웰은 내부에서 3차원 조직 가닥을 성장시키는데 적합한 종방향 챔버 및 각각의 종방향 챔버에 실질적으로 수직 배향으로 부착된 한 쌍의 선형 및 유연한 스캐폴드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 평면 상에 패턴으로 배열된 복수개의 밀봉된 웰을 갖는 장치; 내부에 시딩된 세포로부터 조직 가닥을 성장시키는데 각각 적합한 복수개의 성장 챔버 (각각의 밀봉된 웰은 단일 성장 챔버로 구성됨); 각각의 성장 챔버에 유연하게 연결된 복수개의 선형 스캐폴드로, 성장 챔버 내에서 형성되면 조직 가닥에 의해 캡슐화되도록 구성된 선형 스캐폴드를 포함하는, 조직 가닥의 수축력을 측정하기 위한 다중웰 생물반응기를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조직 배양을 위한 시드 세포를 수용하기 위한 종방향 생물반응기 채널; 및 생물반응기 채널의 길이에 걸쳐 현수되도록 지지된 종방향 스캐폴드로, 시드 세포가 스캐폴드의 길이를 따라 조직 구조를 형성하도록 하는 지지체를 제공하는 스캐폴드를 포함하는, 조직 가닥의 배양을 위한 장치에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조직 배양을 위한 시드 세포를 수용하기 위한 종방향 생물반응기 채널; 및 생물반응기 채널의 길이에 걸쳐 현수되도록 지지된 종방향 스캐폴드로, 시드 세포가 길이를 따라 조직 구조를 형성하도록 하는 지지체를 제공하고, 내강을 갖고, 내강을 통해 조직 구조의 관류를 가능하게 하는 스캐폴드를 포함하는, 조직 가닥의 배양을 위한 장치에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조직 배양을 위한 시드 세포를 수용하기 위한 생물반응기 챔버; 및 생물반응기 챔버 내에 수용된 스캐폴드로, 버팀대 및 관류 채널의 3차원 네트워크를 포함하고, 시드 세포가 3차원 네트워크 주위에 조직 구조를 형성하도록 하는 지지체를 제공하는 스캐폴드를 포함하는, 분지화된 조직의 배양을 위한 장치를 제공한다.
특정 실시양태에서, 생물반응기는 다중웰 플레이트이다.
특정 실시양태에서, 생물반응기는 12 웰, 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰을 갖는 다중벽 플레이트이다.
특정 실시양태에서, 생물반응기는 중합체로 구성된다.
특정 실시양태에서, 중합체는 생분해성 중합체이다. 생분해성 중합체는 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜)산 또는 폴리(카프로락톤), 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시알칸산, 키토산, 히알루론산, 히드로겔, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(L-락티드) (PLA), 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 중합체는 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리우레탄, 실크, 또는 나노제작 물질, 또는 중축합 반응에 의해 생성된 중합체, 또는 그의 공중합체 또는 혼합 중합체일 수 있다. 중합체는 나노구조물로 도핑될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 스캐폴드는 금속, 실크, 또는 중합체로 구성된다. 특정 실시양태에서, 스캐폴드는 장 물질, 모노크릴, 폴리글리콜리드, 프롤렌, 폴리글락틴, 폴리디옥사논, 폴리프로필렌, 나일론, 또는 폴리에스테르로 구성된다.
특정 실시양태에서 종방향 챔버는 세포에 의해 시딩되도록 구성된다.
다양한 실시양태에서, 세포는 심근세포, 간세포, 신세포, 연골세포, 피부 세포, 수축 세포, 혈액 세포, 면역계 세포, 배세포, 신경 세포, 상피 세포, 호르몬 분비 세포, 골수 세포, 또는 줄기 세포일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 각각의 종방향 챔버에 부착된 스캐폴드는 종방향 챔버의 배향에 대해 실질적으로 수직 배향, 실질적으로 평행 배향, 또는 실질적으로 대각선 배향이다. 스캐폴드는 조직 가닥의 성장 시 조직 가닥에 의해 포매되거나 부분적으로 포매되도록 구성될 수 있다. 스캐폴드는 성장한 조직 가닥에 의해 캡슐화되거나 부분적으로 캡슐화되고 그에 부착되어, 조직 가닥이 스캐폴드의 이동과 함께 이동하도록 구성될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 생물반응기는 생물반응기의 성장 챔버를 통과하는 전류를 생성하도록 구성된 한 쌍의 전극 (또는 복수개의 전극)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 각각의 종방향 챔버에 유연하게 연결된 스캐폴드는 종방향 챔버의 배향에 대해 실질적으로 수직 배향, 실질적으로 평행 배향, 또는 실질적으로 대각선 배향이다. 이러한 스캐폴드가 성장한 조직 가닥에 의해 캡슐화되거나 부분적으로 캡슐화되면 그에 부착되어 스캐폴드의 이동과 함께 이동한다.
특정 실시양태에서, 생물반응기는 관심 치료제 또는 독소 또는 시험 작용제에 대한 노출로부터 발생한, 내부에서 형성된 조직 가닥의 수축성에 대한 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 생물반응기는 (a) 실험적 약리학적 작용제의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, 및 (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 생물반응기의 조직 가닥의 수축력을 측정하는 단계; (b) 생물반응기의 조직 가닥을 시험 작용제와, 시험 작용제가 수축력에 영향을 미치는데 충분한 조건 하에 접촉시키는 단계; (c) 시험 작용제에의 노출 후에 조직 가닥의 수축력을 측정하는 단계; (d) (a) 및 (c)를 비교하여 시험 작용제가 수축력에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 수축력을 측정하는 단계는 종방향 스캐폴드가 외력에 의해 휴지 위치로부터 제2 위치로 이동한 경우에 종방향 스캐폴드에 대하여 조직 가닥에 의해 부여된 힘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것인, 조직의 수축력에 대한 시험 작용제의 효과를 측정하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 수축력은 전자 현미경검사 영상화와 함께 굴곡 시험에 의해 측정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 생물반응기의 조직 가닥을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; (b) 안전성 및/또는 효능을 나타내는 1종 이상의 생리학상 파라미터에 대한 효과를 측정하는 단계; (c) (b)를 시험 작용제에 노출시키지 않은 대조 생물반응기로부터 측정된 동일한 생리학상 파라미터와 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 (c)와 비교하여 (b)에서의 생리학상 파라미터의 통계적으로 유의한 변화는 시험 작용제에 안전성 및/또는 효능이 결여되어 있음을 나타내는 것인, 조직에 대한 시험 작용제의 안전성 및 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 각각 내부에서 3차원 조직 가닥을 성장시키기에 적합한 종방향 챔버로 형성된 밀봉된 웰의 어레이를 포함하는 플레이트를 마이크로제작하는 단계; 종방향 챔버 내에서 형성되면 조직 가닥에 의해 캡슐화되도록 구성된 선형 스캐폴드 한 쌍을 각각의 종방향 챔버에 부착시키는 단계를 포함하며, 여기서 선형 스캐폴드는 일반적으로 종방향 챔버에 대해 종방향으로 배향되는 것인, 조직 가닥의 배양을 위한 생물반응기를 제작하는 방법에 관한 것이다.
적용가능한 경우에 또는 구체적으로 청구하지 않은 경우에, 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나는, 실시양태가 본 발명의 상이한 측면 하에 기재되었더라도, 임의의 다른 1개 이상의 실시양태와 조합될 수 있는 것으로 고려된다.
이들 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명에 개시되거나, 그로부터 분명해지거나, 또는 그에 의해 포괄된다.
예로서 제공되는 것으로 본 발명을 기재된 구체적 실시양태 만으로 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다. 이하 예로서 본 출원의 예시적인 실시양태를 보여주는 첨부 도면을 참조할 것이다.
도 1a-1c는 본래의 심근에서의 심장 다발의 예를 보여준다.
도 2A-2B는 본 발명의 제1 실시양태, 즉 단일-와이어 3D 조직 배양 실시양태 (예를 들어, 바이오와이어 시스템)를 도시한 개략도를 제공한다. 섹션 B는 성장 챔버에서의 조직 배양의 진행을 도시하며, 시간의 경과에 따라 와이어 주변에 형성된 3차원 (3D) 조직 가닥으로서 파트 IV가 생성된다.
도 3A-3B는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 심장 조직을 생성하는데 적합한 예시적인 전기 자극 요법, 및 생성된 조직으로부터의 심장 세포의 단리를 보여준다.
도 4a-4d는 심장 조직 가닥의 장기간 배양 및 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 배양된 심장 조직의 수축 기구의 조직화를 위한 예시적인 프로토콜을 보여준다.
도 5a-5c는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따른, 7일에 걸친 심장 조직의 생성을 보여준다.
도 6a-6d는 단층 조직과 비교하여, 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 배양된 심장 세포의 형상 및 배향을 보여준다.
도 7a-7c는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 생성된 래트 심장 세포의 전기 자극으로부터의 예시적인 결과를 보여준다.
도 8a-8d는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따른 인간 심장 세포의 생성의 예시적인 영상 및 그로부터의 결과를 보여준다.
도 9a-9d는 생리학상 세포 비대가 촉진되고 심근세포 표현형이 개선된, 전기 자극과 조합되어 배양된 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 제조된 배양된 조직 가닥 세포의 예를 보여준다.
도 10a-10c는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 제조된 배양된 조직 가닥의 형태를 보여주고, 형태가 PDMS 템플릿으로부터 제거된 후에도 유지됨을 나타낸다.
도 11a-11d는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 성장한 hiPSC-유래 심근세포 조직 가닥이 전기 자극을 적용했을 때 성숙 징후를 나타냄을 보여준다.
도 12a-12b는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 성장한 다른 줄기 세포-유래 심근세포 조직 가닥의 전기 자극 촉진된 성숙의 예를 보여준다.
도 13은 연령 매칭 배상체 (EBd34)로부터의 세포와 비교하여 전기 자극된 조직 가닥에서의 보다 로드-형으로의 형상의 변화를 확인시켜주는, 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 제조된 배양된 조직 가닥 내 세포에 대한 세포 종횡비의 막대 그래프 분석을 보여준다.
도 14는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 성장한 조직 가닥으로부터의 다양한 세포 내 유전자 발현 분석 차트를 보여주며, 이는 심장 태아 유전자 프로그램의 하향조절 및 칼륨 채널 유전자의 상향조절을 입증한다.
도 15는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직 가닥에서의 심근세포 증식이 EB에서 보다 낮음을 예시하는 차트를 보여준다.
도 16은 세포 집단이 배양 후에 유의하게 달라지지 않았음을 입증하는, 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직 가닥에서 마커 출현율을 예시하는 차트를 보여준다.
도 17a-17d는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 생성된 조직 가닥의 기능적 평가로부터의 예시적인 결과를 보여준다
도 18a-18b는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직 가닥으로부터의 심장 세포에서의 전기 자극 및 포획률을 보여준다.
도 19는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 심장 세포에서 데스모솜의 존재와 상관시킨 전도 속도의 차트를 보여준다.
도 20a-20h는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 심장 세포에서 전기 자극이 Ca2+ 취급 특성의 개선을 촉진함을 보여준다.
도 21a-21h는 대조군과 비교하여, 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직 가닥으로부터 단리된 단세포 심근세포에서의 전기생리학적 특성을 예시하는 차트를 보여준다.
도 22a-22g는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직 가닥으로부터 단리된 단일 심근세포에서의 hERG 전류 및 IK1에 대한 전기 자극의 효과를 예시하는 차트를 보여준다.
도 23a-23h는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직으로부터 단리된 단일 심근세포에서의 Na+ 전류, 활동 전위 피크, 막 전도도, 막 전도도-휴지 전위 곡선 및 IK1-휴지 전위 곡선에 대한 전기 자극의 효과를 예시하는 차트를 보여준다.
도 24a-24e는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직에서의 활동 전위 지속기간 속도-의존성 적응 및 휴지 전위를 입증하는 차트를 보여준다.
도 25a-25b는 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템을 사용하여 생성된 조직 가닥에서의 선택된 심장 단백질의 발현을 보여준다.
도 26은 본 개시내용의 예시적인 바이오와이어 시스템에 따라 생성된 조직에 대해 수행된 측정의 표를 보여준다.
도 27은 개시된 장치의 예를 사용하여 배양된 조직에서의 Ca2+ 취급 특성 변화의 표를 보여준다.
도 28은 본 개시내용의 예에 따라 조직의 생성을 위해 사용된 예시적인 올리고뉴클레오티드 서열의 표를 보여준다.
도 29는 내강을 제공하는 관류가능한 종방향 요소를 포함하는 본 발명의 제2 실시양태, 즉 관류가능한 단일-와이어 3D 조직 배양 실시양태 (예를 들어, 바이오튜브)의 사진 및 이를 도시한 개략도를 제공한다.
도 30a-30d는 본 개시내용의 예시적인 바이오튜브 시스템에 따라 생성된 관류가능한 심장 조직 가닥의 생성을 예시하는 영상이다.
도 31a-31d는 본 개시내용의 예시적인 바이오튜브 시스템에 따라 생성된 인간 배관-템플릿 조직에 대한 산화질소 (NO) 처리를 예시한다.
도 32a-32b는 본 개시내용의 예시적인 바이오튜브 시스템에 따라 생성된 관류 및 전기 자극을 사용하여 생성된 조직의 기능적 특성을 예시하는 차트를 보여준다.
도 33a-b는 (a) 시험관내 연구로부터 생체내 임상 평가까지의 표준 약물 스크리닝 공정의 개략도 및 (b) 전통적인 약물 스크리닝 공정이 갖는 다양한 문제점과 관련하여 본 발명에 의해 제공되는 해결책을 제공한다.
도 34는 홈을 가로질러 마이크로-웰에 부착된 중합체 와이어를 포함하는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드/바이오와이어 II 시스템 (예를 들어, 바이오로드)의 다양한 구성요소를 보여주는 개략도를 제공한다. 시딩된 세포 (예를 들어, 심근세포)는 시간의 경과에 따라 홈이 있는 성장 챔버의 각각의 말단의 중합체 와이어 사이에 부착되고 그로 스트레칭되는 3차원 조직 가닥을 형성한다. 특정 실시양태에서 중합체 와이어 (예를 들어, POMac)는 UV 조명 하에 형광을 내었다.
도 35는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 96-웰 포맷의 구성을 보여주는 개략도를 제공한다.
도 36은 단계 1 (조직 형성, 여기서 웰은 시딩되고 세포가 성장함), 단계 2 (여기서 세포는 전기 자극에 의해 성숙됨), 및 단계 3 (약물 시험 단계)을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템 작동에 있어서의 시간선을 도시한 개략도를 제공한다.
도 37은 조직 가닥에 대한 수축력의 측정을 가능하게 하는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템, 즉 수축력 조직 배양 실시양태의 사진 및 이를 도시한 개략도를 제공한다. (A)-(C)는 (D1-D3)에 도시된 장치에 대한 예시적인 제작 공정을 도시한다. 특히, (A)는 고온 엠보싱 PMMA 베이스, 그 상에 부착된 중합체 와이어, 무바닥 96-웰 플레이트 오버레이, 및 플레이트 캡을 포함하는 96-웰 포맷을 도시한다. 개략도 (B)는 PMMA 베이스의 형성을 도시하고, 실제 PMMA 베이스의 영상을 포함한다. 개략도 (C)는 중합체 (예를 들어 POMac) 와이어의 형성을 도시한다. 개략도 (D)는 웰 / 성장 챔버 상의 중합체 와이어의 배열을 도시한다.
도 38은 도 37A-37D의 과정에 따라 제작된 개시된 장치의 예의 사진을 제공한다.
도 39a-e는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템에 따라 생성된 조직에서의 조직 압착 및 힘 측정치를 예시한다.
도 40A-40B는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템에 따라 생성된 조직의 힘 측정치 검증을 예시한다.
도 41A-41B는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템에 따라 생성된 조직의 기능적 평가를 보여준다.
도 42A-42B. 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템에 따른 조직 수축성 평가.
도 43A-43B는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템에 따라 생성된 조직에 대한 약물 시험의 결과를 보여준다.
도 44는 알파-액티닌 (세포골격 염색) 및 DAPI (핵을 나타내기 위함)에 대해 염색된 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 조직 가닥의 세포의 형광 현미경검사 영상이다.
도 45는 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 조직 가닥이 탄성과 관련하여 인간 심근을 시뮬레이션함을 입증하는 실험 결과를 제공한다.
도 46은 3개월에 걸친 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 POMac 중합체 와이어의 안정성 (탄성률의 면에서)을 입증하는 막대 차트를 제공한다.
도 47은 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 POMac 중합체 와이어가 탄성률에서의 어떠한 영향 없이 감마선 조사에 의해 살균될 수 있음을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 48은 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 배치 영상을 상업적으로 입수가능한 기기 (예를 들어, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 획득할 수 있는 하나의 방식을 입증하는 개략도를 제공한다.
도 49는 조직 가닥이 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템에 따른 단일 96-웰 플레이트 내에서 일관되고 매우 재현가능한 데이터를 생성함을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 50은 세포의 배향을 보여주는, 알파-액티닌으로 염색된 본 개시내용의 예시적인 바이오로드 시스템의 세포의 형광 현미경검사 영상을 제공한다.
도 51은 (a) 온화한 조건 하에서의 신속한 어셈블리를 위해 사용될 수 있고 가수분해에 의해 분해되는 UV-중합가능한 중합체인, POMac (생분해성 엘라스토머, 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트)) 예비중합체 용액의 합성을 도시한 개략도를 제공한다. POMac는 비-독성 단량체 (시트르산, 말레산 무수물, 1,8-옥탄디올)로부터 합성된다. 삽도는 주름-형상 나노-세공을 보이는 안지오칩 스캐폴드 표면의 SEM을 보여준다. PEGME 포로겐을 1일 동안 PBS 중에서 침출시켰다. 축척 막대: 500 nm. 도 51(b)는 3-D 스탬핑을 사용한 안지오칩 스캐폴드 마이크로-제작 공정의 개략도를 제공한다. 도 51(c)는 안지오칩 주변 및 내부에서의 겔/세포 제조물에 의한 안지오칩 표면의 시딩 (2)에 이은 겔 압착 (3)을 도시한다. 우측 도 (ii)는 안지오칩을 성장시키기 위한 3개의 개별 챔버를 포함하는 생물반응기를 도시한다. 도 51(d)는 상이한 구성 및 세공 크기의 안지오칩 스캐폴드의 마이크로-구조를 보여주는 SEM 영상을 제공한다. 도 51(e)는 10 마이크로미터 마이크로-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 SEM 영상을 제공한다. (A)는 그의 네트워크 벽 도처에 패턴화된 10 마이크로미터 관통-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 영상을 제공한다. 축척 막대: 600 마이크로미터. 영상은 다중 영상을 이은 것이다. (B) 상이한 각도에서 관찰한 10 마이크로미터 관통-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 SEM. 축척 막대는 영상 내에 제시된다. 도 51(f)는 3-D 안지오칩 스캐폴드의 마이크로CT를 제공한다. (A) 스캐폴드의 긴-에지 방향을 따라 그의 유입구로부터 분지까지의 3-D 안지오칩 스캐폴드의 단면의 마이크로CT 스캔. 축척 막대: 400 마이크로미터. (B) 상이한 각도에서 관찰한 안지오칩의 내부 네트워크의 마이크로CT. 스캐폴드를 그의 내부 네트워크를 통해 황산바륨 용액으로 관류시켰고, 개선된 가시화를 위해 그의 밀도를 증가시켰다. 스캐폴드 네트워크 벽의 두께는 50μm였다. 유입구, 유출구, 및 1차 분지는 50μm x 200μm의 내부 내강 치수를 가졌다. 2차 분지는 50μm x 100μm의 내부 내강 치수를 가졌다. 1차 및 2차 분지 내의 내피 세포가 동일한 수준의 전단 응력을 거치도록 네트워크를 설계하였다. 각각의 층 상의 네트워크를 수직 채널을 통해 연결하고, z-축에서 300μm 떨어뜨렸다. 스캐폴드 메쉬는 50μm 버팀대로 제조하였다. 버팀대를 긴-에지 방향에서 250μm 떨어져서, 짧은-에지 방향에서 100μm 떨어져서, 그리고 z-축에서 50μm 떨어져서 이격시켰다. 도 51(g)는 POMac 중합체 용액의 분자 구조적 특징화를 제공한다. (A) 푸리에 변환 적외선 (FT IR) 분광분석법. (B) 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법.
도 52 생물반응기 어셈블리. (A) 생물반응기의 4개의 구성요소 (캡, 폴리카르보네이트 몸체, PDMS 베이스, 및 폴리카르보네이트 베이스)의 영상. (삽도) 안지오칩 스캐폴드가 놓이는 PDMS 베이스 상의 트렌치 구조의 영상. 마이크로-포스트 어레이는, 세포가 바닥으로부터 스캐폴드 주변을 감쌀 수 있도록 안지오칩 스캐폴드를 베이스로부터 ~200μm 위로 들어 올리기 위해 사용되었다. PDMS 트렌치의 전체 높이는 700μm이다. 세포/겔 현탁액을 스캐폴드가 설치된 트렌치 내에 캐스팅하고, 상부까지 충전하였다. (B) 컬러 염료로 관류된 3개의 심장 조직과 어셈블리된 생물반응기의 영상. (삽도) 메인 웰 내 관류된 심장 조직의 확대 영상.
도 53A-53D는 안지오칩 스캐폴드의 물리적 특성의 평가 결과를 보여준다.
도 54A-54F는 안지오칩 실시양태에 따라 생성된 조직의 형성 및 혈관화를 예시한다.
도 55A-55D는 바이오분지 실시양태에 따라 생성된 혈관화 심장 조직의 검증을 예시한다.
도 56 예시적인 안지오칩 스캐폴드 제작 및 가시화. (a) 유리 슬라이드 상에 평행으로 패턴화된 다중 안지오칩 스캐폴드의 영상. (b) 컬러 염료로 관류된 안지오칩 간 조직의 영상, 그 옆은 축척을 위한 볼펜팁. (c) 생물반응기의 어셈블리 및 혈관화 조직의 어셈블리의 개략도. (d) 안지오칩 조직의 일부의 개략도. (e-g) (e) 1-D 튜브 (축척 막대: 1.5mm 및 500μm), (e) 2-D 안지오칩 스캐폴드 (축척 막대: 1mm 및 300μm) 및 3-D 스탬핑 기술을 사용하여 생성된 (g) 3-D 안지오칩 스캐폴드 (축척 막대: 1mm 및 500μm)의 SEM. (h) 황산바륨 용액으로 관류된 3-D 안지오칩 스캐폴드의 내부 3-D 네트워크의 마이크로CT 영상. (i) 채널 벽 상에 10μm 마이크로-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 SEM. 축척 막대: 200μm. (삽도) 10μm 마이크로-홀의 단면의 SEM. 적색 화살표는 마이크로-홀을 가리킴. 축척 막대: 50μm. (j) 무공성 및 나노-다공성 안지오칩 스캐폴드에 대한 포로겐 침출로부터 1일 내의 질량 손실 (평균±s.d., n=3). 무공성 및 나노-다공성은 각각 포로겐을 사용하여 또는 사용하지 않고 제작한 스캐폴드에 상응한다. (k) 포로겐 침출 후 안지오칩 스캐폴드의 표면의 SEM. 축척 막대: 500nm.
도 57 안지오칩 스캐폴드의 물리적 특징화. (a-b), (a) PBS 및 (b) 0.1M NaOH 용액 중에서의 나노-세공의 존재 또는 부재 하의 안지오칩 스캐폴드의 질량 손실 (평균±s.d., n=3). (c), 안지오칩 스캐폴드 (평균±s.d., n=4) 및 래트 대퇴 정맥 (평균±s.d., n=6)의 파열 압력. (d-f), 증가된 마크로-다공성: (d) 설계 A (축척 막대: 1mm 및 200μm), (e) 설계 B (축척 막대: 1mm 및 200μm), 및 (f) 설계 C (축척 막대: 1mm 및 300μm)의 격자 매트릭스를 갖는 안지오칩 스캐폴드의 SEM. (g), 3개의 상이한 격자 매트릭스 설계를 갖는 안지오칩 스캐폴드의 대표적인 단축 인장 응력-변형 플롯. 긴-에지 방향 (LD) 및 짧은-에지 방향 (SD)은 각각 심장의 원주방향 및 종방향 축에 상응한다. (h), 10μm 관통-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 내장된 네트워크로부터 주위 격자 매트릭스로 관류된 332 Da FITC의 저속 촬영 형광 영상. 축척 막대: 300μm. 최종 영상은 다중 영상을 이은 것이다. (i), 생존 세포에 의해 절단되는, 내장된 내부 네트워크로부터 주위 심장 조직으로 관류된 카르복시플루오레세인 디아세테이트 (CFDA, 557Da)의 저속 촬영 영상. 축척 막대: 300μm.
도 58 예시적인 안지오칩 네트워크의 내피화. (a-f), (a) 전체 네트워크 도면 (축척 막대: 100μm. 영상은 다중 영상을 이은 것임), (b) 코너의 도면 (축척 막대: 100μm), 및 (c) 직선 섹션 (축척 막대: 100μm), 및 (d) 분지를 포함하는, 안지오칩 스캐폴드의 내부 혈관계의 면역염색 (CD31). (e) 직선 섹션 (축척 막대: 100μm), 및 (f) 분지 (축척 막대: 100μm)에서의 10μm 마이크로-홀을 갖는 혈관계의 면역염색 (CD31). 백색 원은 마이크로-홀의 위치를 나타낸다. 백색 화살표는 단면도로부터의 마이크로-홀의 위치를 나타낸다. g, 내피화된 안지오칩 네트워크를 통한 인간 전혈 관류의 개략도. 안지오칩 스캐폴드는 메인 웰 내에 위치한다. 화살표는 유동 방향을 나타낸다. h-i, 헤파린첨가된 인간 전혈을 15dynes/cm2로 30분 동안 관류시킨 후의 (h) 비처리 스캐폴드 네트워크의 내강 표면 및 (i) 내피화된 네트워크의 내강 표면의 SEM. 축척 막대: (h, i)100μm, 및 (삽도) 50μm. 백색 화살표는 대표적인 혈소판을 표지한다. j, 혈소판에 의해 피복된 스캐폴드 네트워크의 내강 표면적의 정량화 (평균±s.d., n=3). (k) 내피화된 네트워크를 통한 대식세포의 관류의 개략도. l, 네트워크 분지 내 형광 표지된 RAW 267 세포의 부착 및 축적을 보여주는 형광 영상. 축척 막대: 200μm. 백색 화살표는 대식세포 응집체를 나타낸다. (m), 스캐폴드 네트워크의 내피화된 표면 상에서 외측으로 이동하는 형광 표지된 대식세포의 저속 촬영 영상. 축척 막대: 10μm. 백색 화살표는 대식세포 이동 방향을 나타낸다. 백색 점은 이전 포획 프레임에서 추적된 세포의 위치를 나타낸다. (n), 채널 벽 상의 10μm 마이크로-홀을 통한 형광 표지된 대식세포의 벽-횡단 이동. 축척 막대: 100μm. (삽도) 축척 막대: 50μm. 백색 화살표는 이동 중인 대식세포를 나타낸다.
도 59 혈관화된 간 조직 어셈블리. (a), 예시적인 안지오칩 스캐폴드 상에서의 5일에 걸친 래트 간세포의 조직 재형성 과정의 저속 촬영 영상. 축척 막대: 800μm. 최종 영상은 다중 영상을 이은 것이다. (b), CFDA로 형광 표지된 간 조직의 면역염색 (F-액틴)은 간세포 주변에의 래트 섬유모세포의 분포 및 형태를 보여준다. 축척 막대: 200μm. c, CFDA 및 아이오딘화프로피듐 (PI) 염색된 간 조직의 형광 영상은 높은 세포 생존율을 보여준다. 축척 막대: 200μm. (d), 청색 염료로 관류된 간 조직의 명시야 영상. 축척 막대: 600μm. (e-g), 내피 세포를 확인하기 위해 CD31에 대해 염색된 (e,f) (축척 막대: 200μm) 및 간세포를 확인하기 위해 알부민에 대해 염색된 (g) (축척 막대: 200μm) 간 조직의 조직학 단면. (h), 간 조직으로부터의 우레아 분비, 및 혈관 벽을 통해 간 조직으로 관류된 다음 후속해서 펙소페나딘으로 전환되고 다시 혈관계로 방출된 테르페나딘의 개략도. (i), 시간의 경과에 따른 생물반응기 메인 웰 및 유출구 웰로의 우레아 분비의 정량화 (평균±s.e.m., n=4). *, p<0.05를 갖는 군 사이의 유의차. (j), 유입구 웰로부터의 10μM의 테르페나딘의 24시간 관류 후의 생물반응기 유입구, 메인, 및 유출구 웰 내 펙소페나딘의 농도 (평균±s.e.m., n=4).
도 60 혈관화된 심장 조직 어셈블리. (a), 5일에 걸친 래트 심장 조직 재형성의 저속 촬영. (b), 래트 (래트-CM) 및 인간 심근세포 (HESC-CM) 둘 다에 대한 조직 압착으로 인해 감소하는 조직 너비의 정량화 (평균±s.d., n=3). (c-d), 전기 흥분성 파라미터 (평균±s.d., n=3). (e), 제4일-제6일의 인간 심장 조직의 수축의 퍼센트 진폭 (평균±s.e.m., n=4). (f-i), (f, g) 인간 심장 조직 (축척 막대: 20μm) 및 (h, i) 래트 심장 조직 (축척 막대: 10μm)에 대한 근절-α-액티닌 및 F-액틴의 면역염색. (j), 컬러 염료로 관류된 인간 심장 조직 패치의 명시야 영상. 축척 막대: 400μm. (k-m), 내피 세포를 확인하기 위해 (k) 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), (l) 마송 트리크롬, 및 (m) CD31로 염색된 인간 심장 조직의 조직학적 단면. 축척 막대: 200μm. (n), H&E로 염색된 ~1mm 두께 인간 심장 조직의 조직학 단면. 축척 막대: 100μm. (o), hESC-유래 심장 조직의 전도 속도 활성화 맵. (삽도) 전기 자극에 대한 전기 활성 반응. (p-q), (p) 10μM 에피네프린 또는 (q) 10μM 디곡신으로 관류된 인간 심장 조직의 초기 자발적 수축력 및 약물 자극된 수축 트레이스. r, 배지 관류의 존재 또는 부재 하에 배양된 래트 심장 조직의 단면의 CFDA 및 PI 염색 영상. 축척 막대: 200μm. (s), 배지 관류의 존재 또는 부재 하에 배양된 래트 심장 조직으로부터의 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 분비의 정량화 (평균±s.d., n=4). *, p<0.05를 갖는 군 사이의 유의차.
도 61 심장 조직의 외과적 문합술. a-b, (a) 동맥-대-동맥 이식편 및 (b) 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 래트 대퇴 혈관에 대한 안지오칩 심장 조직의 외과적 문합술. 혈액 관류는 문합술 후 즉시 확립되었다. 보다 우수한 시각적 대조를 위해 영상화 동안 이식물 아래에 종이를 놓아두었다. (c-n), 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 문합술의 부재 (c-h) 또는 존재 (i-n) 하에 수술 1주 후의 래트 심장 조직 이식물의 단면. 절편을 (c-d, i-j) 마송 트리크롬, (e, k) H&E, (f,l) CD31, (g, m) 평활근 액틴으로 염색하였다. 축척 막대: (c, i) 200μm 및 (d-h, j-n) 100μm. 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 문합술의 부재 (h) 또는 존재 (n) 하에 수술 1주 후의 래트 심장 조직 이식물의 단면에 대한 심장 트로포닌 T 및 DAPI에 대한 면역염색. (h, n) 축척 막대: 50μm. o, 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 문합술에 의한 수술 1주 후의 래트 뒷다리 이식물의 영상. 백색 점선은 안지오칩 이식물의 윤곽을 보여준다. p, 평활근 액틴에 의해 염색된 면적의 정량화 (평균±s.d.).
도 62 상이한 설계의 안지오칩 스캐폴드에 대해 단축 방향으로 측정한 유효 강성 (ELD, ESD), 이방성 비 (ELD/ESD), 극한 인장 응력 (UTSLD, UTSSD) 및 변형-대-실패 (εfLD 및 εfSD)의 요약 (평균±s.d.). 성체 래트 심근에 상응하는 특성을 비교상 제시한다. 긴-에지 방향 (LD) 및 짧은-에지 방향 (SD)은 각각 심장의 원주방향 및 종방향 축에 상응한다.
도 63 표준 및 연장된 생물반응기 설정을 사용한 배양 배지 및 혈액 관류의 특징화. 주어진 압력 수두 수준으로 안지오칩 스캐폴드를 통한 유량을 모델링하기 위해, 주어진 높이를 갖는 유체 칼럼으로부터 생성된 압력을 먼저 방정식, P = h g p에 기초하여 계산하였고, 여기서 P는 압력을 의미하고, h는 높이를 의미하고, g는 중력 상수이고, p는 유체의 밀도를 의미한다. 이어서, 유입구 압력 수두 밸브를 COMSOL 다중 물리에 도입하여 안지오칩 네트워크의 기하학적 모델을 생성하였다. 내장된 나비에-스토크스 방정식을 사용하여, 이어서 모델로부터 네트워크를 통한 체적 유량을 유도하였다. 하기 방정식
Figure 112020085298716-pat00009
에 기초하여 유래된 체적 유량으로부터 벽 전단 응력을 계산하였고, 여기서 τ는 전단 응력을 의미하고, μ는 점도를 의미하고, w 및 H는 너비를 의미하고, H는 채널의 너비 및 높이를 의미하고, Q는 체적 유량을 의미한다. 실험 체적 유량은 관류 1일 후에 수집된 유체의 양으로부터 유도되었고, 전단 응력은 상응하는 체적 유량으로부터 유도되었다.
도 64 3개의 상이한 격자 설계를 갖는 안지오칩 스캐폴드의 단축 인장 응력-변형 플롯. 0에서 0.1의 변형 사이의 플롯 섹션을 선형 회귀로 피팅시켜 유효 강성 (E)을 계산하였다. 선형 회귀 방정식 및 R-값을 제시한다. 인장 응력에서 유의한 강하 전 마지막 데이터 점을 극한 인장 응력 (UTS) 및 변형-대-실패 (εf)를 계산하는데 사용하였다.
도 65 래트 성체 심실 심근의 단축 인장 응력-변형 플롯. 긴-에지 방향 (LD) 및 짧은-에지 방향 (SD)은 각각 심장의 원주방향 및 종방향 축에 상응한다. 0에서 0.1의 변형 사이의 플롯 섹션을 선형 회귀로 피팅시켜 유효 강성을 계산하였다. 선형 회귀 방정식 및 R-값을 제시한다.
도 66 안지오칩 스캐폴드 네트워크의 내피화. (A-C) 네트워크 벽 상에 패턴화된 10μm 마이크로-홀을 갖는 스캐폴드 네트워크 상의 내피 세포 (CD31 면역염색됨) 피복의 공초점 스캔. 축척 막대: (A) 100μm, (B) 100μm, (C) 200μm. (D) 스캐폴드 네트워크 상의 내피 세포 (VE-카드헤린 면역염색됨) 피복의 공초점 스캔. 축척 막대: 50μm.
도 67 인간 전혈의 15 dynes/cm2로 30분 동안의 관류 후, 내피 세포 코팅의 존재 또는 부재 하의 안지오칩 스캐폴드 네트워크의 내강 표면의 대표적인 SEM. 인간 혈액에 1% 헤파린 (v/v)으로 헤파린첨가하여 취급 동안의 응고를 방지하였다. 축척 막대는 영상 내에 제시된다.
도 68 HES-3 NKX2-5 GFP 양성 세포 유래 심근세포 세포 혼합물의 유동 세포측정 분석. FL1-H는 NKX2-5 발현에 상응한다. NKX2-5 양성 세포를 심근세포인 것으로 간주하였다. 각각의 세포 혼합물 내 심근세포의 퍼센트를 W0 게이팅 영역에 의해 결정하였다.
도 69 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 외과적 문합술의 존재 또는 부재 하의 1주 후의 심장 조직 이식물의 H&E 염색된 조직학 단면. 낮은 배율 영상은 좌측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 400μm. 높은 배율 영상은 우측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 150μm.
도 70 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 외과적 문합술의 존재 또는 부재 하의 1주 후의 심장 조직 이식물의 마송 트리크롬 염색된 조직학 단면. 낮은 배율 영상은 좌측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 400μm. 높은 배율 영상은 우측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 150μm.
도 71 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 외과적 문합술의 존재 또는 부재 하의 1주 후의 심장 조직 이식물의 CD31 염색된 조직학 단면. 낮은 배율 영상은 좌측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 400μm. 높은 배율 영상은 우측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 150μm.
도 72 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 외과적 문합술의 존재 또는 부재 하의 1주 후의 심장 조직 이식물의 평활근 액틴 (SMA) 염색된 조직학 단면. 낮은 배율 영상은 좌측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 400μm. 높은 배율 영상은 우측 칼럼에 제시된다. 축척 막대: 150μm.
도 73 동맥-대-정맥 이식편의 구성으로의 직접 외과적 문합술의 존재 또는 부재 하의 1주 후의 심장 조직 이식물의 단면의 면역염색. 트로포닌 T, DAPI. 축척 막대: 50μm.
도 74 2개의 메인 웰이 각각의 유입구 웰 및 유출구 웰 사이에 포함된 이중-웰 생물반응기의 영상. 2개의 안지오칩 스캐폴드는 연속해서 연결될 수 있고, 유입구 웰로부터 유출구 웰로 순차적으로 관류된다. (삽도) 2개의 안지오칩 스캐폴드가 설치된 이중-웰의 확대 영상. 간세포는 제1 스캐폴드 상에 시딩될 수 있고, 심근세포는 제2 스캐폴드 상에 시딩되어 기관 수준 약물 상호작용을 조사하기 위한 "기관-온-어-칩" 시스템을 생성할 수 있다. 심장 조직을 자극하기 위해 한 쌍의 전극이 제2 챔버 내에 설치된다.
도 75는 챔버 어레이를 포함하고, 각각의 챔버가 웰 내에 위치하는 투과성/관류가능한 튜브 주변에서의 시딩 및 3D 조직 가닥의 성장을 위한 1개 이상의 웰을 함유하는, 다중웰 관류가능한 시스템을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 안지오튜브 시스템의 개략도를 제공한다. 각각의 챔버는 또한 조직 가닥을 고정시키기 위한 적어도 2개의 대향 요소를 함유할 수 있고, 그의 이동은 3D 조직 가닥의 수축/이완 사이클 동안 파악되고 측정될 수 있다. 챔버는 또한 심장 조직을 자극하기 위한 전극으로 구성될 수 있다.
도 76은 생물반응기의 기울기 높이의 함수로서 유량 (μl/분) 또는 전단 응력 (dynes/cm2)에 의해 측정된 바와 같은, 예시적인 안지오튜브 다중웰 관류가능한 생물반응기의 수동 관류의 결과를 입증한다.
도 77은 예시적인 안지오튜브 생물반응기의 단일 챔버에서의 3D 조직 가닥의 발생의 시간 경과를 보여준다. 시리즈의 제1 영상은 세포가 생물반응기 챔버 내에 처음 시딩된 시점을 보여준다. 시간 진행에 따라 세포는 성장하고, 챔버 내의 2개의 가요성 캔틸레버 요소에 대해 클러스터하기 시작하는 한편 가요성 요소 사이에 조직 연결을 유지한다. 사진에 제시된 특정한 실시양태는 단지 한 실시양태이고, 본 발명에 의하면 다른 구성이 고려된다. 예를 들어, 가요성 캔틸레버 요소는 상이한 형상 및/또는 길이 (예를 들어, 곡선형, 원형, 비선형, 편형, 원, 휨, 두께)를 갖는 것으로 형성될 수 있고, 캔틸레버 변위의 측정 및/또는 검출이 검출될 수 있도록 상이한 각도 또는 배향으로 투과성 관상 요소에 부착될 수 있다. 챔버는 또한 심장 세포를 자극하기 위한 전극을 함유할 수 있다. 우측의 막대는 3D 조직 가닥의 형성 동안 관찰할 수 있는 캔틸레버 변위의 정도를 입증한다.
도 78 예시적인 안지오튜브 생물반응기 챔버에서 형성된 3D 조직 가닥의 조직 가시화를 보여줌. 조직 가닥의 광 현미경검사 영상 (좌측 영상). F-액틴에 의해 염색된 동일한 조직 가닥 (중간 영상). 조직 가닥의 세포의 분포 및 형태 및 배향을 보여주기 위한 CFDA에 의한 3D 조직 가닥의 세포의 면역염색.
도 79는 시딩후 성장 5일 후 및 10일 후에 3D 조직 가닥의 캔틸레버 변위 (픽셀에 의해 측정된 바와 같음)를 측정한다.
도 80은 각각 96-웰 플레이트 포맷과 상용가능하도록 구성된 예시적인 바이오와이어, 바이오로드, 및 안지오튜브 시스템을 비교한다.
도 81은 고정된 스테이션 (A) 및 이동가능한 스테이션 (B)을 포함하는 중합체 시트의 기계적 특성을 측정하기 위한 시스템의 개략도를 제공한다.
도 82 상이한 화합물로 처리된 바이오와이어의 광 및 형광 현미경검사.
도 83은 유전자 발현에 대한 만성 약물 노출의 효과를 도시한다.
도 84 비처리 hESC-마이크로조직 (대조군) 또는 상이한 비대성 약물로 처리된 조건화 배지에서의 가용성 인간 BNP의 ELISA에 의한 정량화. N=3. 평균 +/- 표준 편차. 교차 반응성 문제로 인해, 본 발명자들은 AngII-처리된 샘플에서 BNP를 정량화할 수 없었다.
도 85 ISO, Et-1 및 AngII를 사용한 바이오와이어의 처리는 심근세포 비대를 유도한다. 배양 말미에 바이오와이어로부터 해리한 단일 Hes2 hESC 유래 심근세포에 대해 측정을 수행하였다. 세포 면적 (μm2), 평균 +/- s.e.m., n=3.
도 86은 ISO, AngII, 및 ET-1-처리된 바이오와이어 샘플에서의 수축력에 대한 효과를 보여준다.
도 87 바이오와이어에서의 대표적인 전도 속도 활성화 맵.
이하는, 본 발명을 실시함에 있어서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 도움을 주기 위해 제공되는 본 발명의 상세한 설명이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 실시양태에 변형 및 변화를 가할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태만을 기재하기 위한 것이고, 본 발명을 제한하고자 의도되는 것은 아니다.
본원에서 인용되거나 참조되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 도면 및 다른 참고문헌 및 본원에서 인용된 문헌에서 인용되거나 참조되는 모든 문헌은, 본원에서 또는 본원에 참조로 포함되는 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조업체의 지침, 기재사항, 제품 설명, 및 제품 시트와 함께, 본원에 참조로 포함되며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 여기에 기재된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 그와 관련하여 간행물에서 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하도록 본원에 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 그 전체 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적인 정의 (본원에서 달리 정의되지 않는 한)를 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 일반적으로, 본원에 기재되거나 고유한 분자 생물학 방법의 절차 등은 관련 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법이다. 이러한 표준 기술은 참조 매뉴얼, 예컨대 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., (2000, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratories); and Ausubel et al., (1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New-York)]에서 찾아볼 수 있다.
하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에서 그에 대해 부여된 의미를 가질 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알고 있거나 이해하고 있는 다른 의미가 또한 가능하고, 본 발명의 범주 내에 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
정의
구체적으로 명시되었거나 문맥으로부터 명백하지 않은 한, 본원에 사용된 용어 "약"은 관련 기술분야에서 정상 허용오차 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내인 것으로 이해된다. 약은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1 %, 0.05%, 또는 0.01% 내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 명확하지 않은 한, 본원에 제공된 모든 수치값은 용어 약에 의해 변형될 수 있다.
"효능제"는 일부 방식으로 그의 동족 수용체에 결합하고 그를 활성화시켜 직접적으로 또는 간접적으로 생리학상 효과를 발생시키는 약물, 작용제, 또는 화합물이다.
"길항제"는 수용체에 결합하여, 차례로 다른 분자에 의한 결합을 막는 작용제이다.
요소가 또 다른 요소에 "연결" 또는 "커플링"된 것으로 지칭된 경우에, 이는 다른 요소에 직접적으로 연결 또는 커플링될 수 있거나, 또는 개재 요소가 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 대조적으로, 요소가 또 다른 요소에 "직접적으로 연결" 또는 "직접적으로 커플링"된 것으로 지칭된 경우에는, 어떠한 개재 요소도 존재하지 않는다. 같은 숫자는 전체적으로 같은 요소를 표시한다. 본원에 사용된 용어 "및/또는"은 연관 열거 항목 중 1개 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
제약 기술분야에서, 용어 "효능"은 단일 약물-수용체 복합체로부터 생성된 조직에서의 반응의 강도를 기재할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, "효능"은 또한 세포 또는 조직의 표현형을 개선시키는 약물 또는 시험 작용제에 의해 도출된 반응으로서 정의될 수 있다.
용어 "제1", "제2" 등이 다양한 요소, 구성요소, 영역, 층 및/또는 섹션을 기재하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 이들 요소, 구성요소, 영역, 층 및/또는 섹션은 이들 용어로 제한되는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다. 이들 용어는 단지 하나의 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 섹션을 또 다른 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 섹션과 구별하기 위해 사용된다. 따라서, 하기 논의되는 제1 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 섹션은 예시적인 실시양태의 교시에서 벗어나지 않으면서 제2 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 섹션을 언급할 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어, 예컨대 "밑," "아래," "하부," "위," "상부" 등은 도면에 예시된 바와 같이 하나의 요소 또는 특색의 또 다른 요소(들) 또는 특색(들)과의 관계를 기재하기 위해 설명의 편의상 본원에 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시된 배향에 더하여 사용 또는 작업 시 장치의 상이한 배향을 포괄하는 것으로 의도되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 도면에서의 장치가 뒤집어지면, 다른 요소 또는 특색 "아래" 또는 "밑"으로서 기재된 요소는 이후에 다른 요소 또는 특색 "위"의 배향이 될 것이다. 따라서, 예시적인 용어 "아래"는 위 및 아래 배향 둘 다를 포괄할 수 있다. 장치는 다르게 배향될 수 있고 (90도 또는 다른 배향으로의 회전), 본원에 사용된 공간적으로 상대적인 기재는 그에 따라 해석된다.
본원에 사용된 용어 "히드로겔"은 다량의 물을 흡수할 수 있고 조직 공학 스캐폴드를 형성하기 위한 통상적인 물질인, 물리적 또는 화학적으로 가교된 중합체 네트워크를 지칭한다. 이는 제조 방법, 전하, 및 기계적 및 구조적 특징을 비롯한 다양한 파라미터에 따라 상이한 카테고리로 분류될 수 있다. 문헌 [S. Van Vlierberghe et al., "Biopolymer-Based Hydrogels As Scaffolds for Tissue Engineering Applications: A Review," Biomacromolecules, 2011, 12(5), pp. 1387-1408]을 참조할 수 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "마이크로제작"은 마이크로제작 및 나노제작을 비롯하여 나노미터 또는 마이크로미터 수준의 제작을 포함하는 개념이다. 마이크로제작을 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명에 적용가능할 수 있는 특정 마이크로제작 기술의 참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 번호 8,715,436, 8,609,013, 8,445,324, 8,236,480, 8,003,300, 뿐만 아니라 문헌 [Introduction to Microfabrication (2004) by S. Franssila. ISBN 0-470-85106-6]을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "마이크로제작 구조"는 나노미터 또는 마이크로미터 스케일로 제작된 구조를 비롯하여, 2 또는 3차원 공간을 차지하는 1개 이상의 구조를 포함하는 개념이다. 용어 "2차원"은 수직 또는 수평 공간상 표면을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약동학"은 약물에 대한 신체의 작용을 지칭한다. 약동학 과정은 약물의 흡수, 분포, 대사, 및 제거를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "약역학"은 신체에 대한 약물의 작용을 지칭한다. 특정 약물 부류는 신체에 대해 유사한 효과를 나타내기 때문에, 약역학 특성은 약물 또는 작용제가 분류되는 군을 결정한다.
본원에 사용된 용어 "PDMS"는 중합체 폴리(디메틸실록산)을 지칭한다. 폴리디메틸실록산 (PDMS)은 통상적으로 실리콘으로 지칭되는 중합체 유기규소 화합물 군에 속한다. PDMS는 가장 광범위하게 사용되는 실리콘계 유기 중합체이고, 특히 그의 독특한 레올로지 (또는 유동) 특성이 공지되어 있다. PDMS는 광학적으로 투명하고, 일반적으로 불활성, 비-독성, 및 비-인화성이다. 또한 디메티콘으로도 불리고, 이는 실리콘 오일 (중합된 실록산)의 여러 유형 중 하나이다.
본원에 사용된 용어 "PMMA"는 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 지칭한다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA)는 종종 유리에 대한 경량 또는 파쇄-저항성 대체재로서 사용되는 투명 열가소성 플라스틱이다. 이는 기술적으로 유리의 유형은 아니지만, 상기 물질은 때때로 기존부터 아크릴 유리로 불리고 있고, 플렉시글라스, 아크릴라이트, 루사이트 및 퍼스펙스로 공지되어 있다. 화학적으로, 이는 메틸 메타크릴레이트의 합성 중합체이다. PMMA는 극한 강도가 필요하지 않은 경우의 폴리카르보네이트 (PC)에 대한 경제적 대체재이다. 또한, PMMA는 폴리카르보네이트에서 발견되는 잠재적으로 유해한 비스페놀-A 서브유닛을 함유하지 않는다. 비-변형된 PMMA는 로딩되었을때, 특히 충격력 하에서 취성 방식으로 거동하고, 통상적인 무기 유리보다 더 스크래칭 경향이 있지만, 변형된 PMMA는 높은 스크래치 및 충격 저항성을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "POMac"는 1,8-옥탄디올, 시트레이트 산, 및 말레산 무수물의 혼합물을 포함하는 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC) 또는 POMac 예비중합체를 지칭한다. 문헌 [Tran et al., "Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism," Soft Matter, Jan 1, 2010; 6(11): 2449-2461]을 참조할 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"시험 작용제"는 대상체에서의 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 방지하는 그의 능력에 대해 평가되거나, 또는 대상체의 신체의 구조 또는 기능을 변경시키기 위해 의도되는 임의의 물질이다. 한 실시양태에서 시험 작용제는 문헌 [Food Drug and Cosmetic Act, Section 321(g)(1)] 하에 정의된 용어와 같은 "약물"일 수 있다. 시험 작용제는 화학적 화합물, 생물학적 작용제, 단백질, 펩티드, 항체, 핵산, 지질, 폴리사카라이드, 보충제, 진단제 및 면역 조절제를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 또한 "약리학적 작용제"로서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "독성"은 시험 작용제 또는 다른 제약과 조합되어 사용된 시험 작용제에 의해 유발된, 원치않거나 과도하게 과장된 약리학적 효과를 비롯한, 인간 세포 또는 조직에 대한 임의의 원치않는 효과로서 정의된다. 이러한 문맥에서 사용되는 유사한 용어는 "유해 반응"이다.
본원에 사용된 용어 "조직 가닥"은 다양한 실시양태, 예를 들어 바이오와이어, 바이오튜브, 바이오로드, 또는 안지오튜브 실시양태에서 성장 챔버 등을 제1 시딩하는 것에 의해 형성된 3차원 조직 배양물을 지칭하며, 여기서 성장 챔버는 조직 가닥을 성장시키는데 충분한 1개 이상의 현수된 성장 표면, 예를 들어 와이어, 튜브를 포함한다. 조직 가닥은 단일 성장 표면, 예를 들어 중합체 와이어 또는 튜브 주변에서 성장 또는 형성될 수 있거나, 또는 조직 가닥은 예를 들어 바이오로드 실시양태에서와 같이 1개 이상의 성장 요소 사이에서 성장할 수 있다.
"가변가능한" 중합체, 예를 들어 POMac와 관련하여 사용된 바와 같은 본원에 사용된 용어 "가변성"은 생성되는 중합체 생성물의 형성이 상이한 기계적 및/또는 물리적 특성, 예컨대 탄성, 강성, 및/또는 반응성, 또는 기타 특성을 갖도록 하는 방식으로 중합체의 중합 과정을 조정하는 능력을 지칭한다. 이러한 개념은 특정 중합체, 예컨대 POMac와 관련하여 지칭되고, 이는 본 발명의 장치의 다양한 구성요소, 예를 들어 중합체 와이어, 스캐폴드, 스캐폴드 층, 및 다른 구성요소를 형성하기 위해 바이오와이어, 바이오튜브, 바이오로드, 안지오칩, 및 안지오튜브 실시양태를 비롯한 본 발명의 다양한 실시양태/장치에서 유익하게 사용될 수 있다. 가변가능한 중합체, 예컨대 POMac는, 예를 들어 (a) UV 가교의 정도 또는 양 또는 (b) 중합체를 형성하는 예비중합체 유닛의 비, 예를 들어 POMac의 경우에 1,8-옥탄디올, 시트르산, 및 말레산 무수물의 비를 조정하는 것에 의해 조정가능한 또는 "가변가능한" 특성을 가질 수 있다. 또한, 특정 실시양태, 예컨대 안지오칩 실시양태는 다양한 크기의 세공으로 형성된 중합체 스캐폴드를 포함한다. 세공의 제어 형성은 또한 가변성 측면으로서 간주될 수 있고, 특히 세공 크기는 본원에 예시된 바와 같이 UV 가교 단계 동안 상이한 양의 폴리에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 (PEGDME) 또는 등가물을 포함시키는 것에 의해 제어될 수 있으며, 여기서 PEGDME는 형성되는 가교 네트워크에 대한 스페이서로서 작용할 것이고, 그에 의해 다양한 크기의 세공을 부여할 것이다.
조직 배양 장치
본 발명은 본래의 조직의 본래의 생리학, 조직 아키텍처, 혈관계, 및 기타 특성을 정확하게 모방한 3차원 생물학적 조직을 제조 및 사용하기 위한 다양한 조직 배양 시스템을 고려한다. 모방 조직은 심장, 간, 신경, 혈관, 신장, 및 근육 조직을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 방법, 조성물, 및 장치는 약물 시험, 조직 복구 및/또는 치료, 및 재생 의학을 포함하는 다양한 적용분야에서 사용될 수 있다. 본 발명의 조직 배양 장치는 특히 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하는 방법을 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 3차원 (3D) 심장 조직 또는 다른 수축 조직의 성장에 도움이 되는 마이크로환경을 생성하기 위해 아키텍처 및 전기적 지시와 조합될 수 있는 생물반응기 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 또한 개시된 장치를 제작하고, 개시된 장치를 조직 배양을 위해 사용하고, 생성된 조직을 이식 및 다른 적용분야에 사용하기 위한 방법 및 기술을 제공한다.
또 다른 측면은 세포가 생물반응기 채널 또는 챔버 (예를 들어, 마이크로제작 웰) 내의 스캐폴드 (예를 들어, 템플릿 봉합사) 주변 히드로겔, 예를 들어 콜라겐 겔에 시딩되는 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 이러한 예에서의 시드 세포 (특히, 세포가 전기적 특징을 갖는 경우, 예컨대 심장 세포)는 특정한 시간에서의 특정한 자극 주파수를 규정한 규정된 요법에 따라 전기장 자극을 받을 수 있다 (예를 들어, 진행 주파수는 수일에 걸쳐 증가함). 성숙과 일치하여, 생성된 조직 (예를 들어, 심장 조직)은 유의한 정도의 초미세구조 조직화, 개선된 전도 속도 및 증진된 Ca2+ 취급 및 전기생리학적 특성을 나타낸다.
다른 측면에서, 내강 (예를 들어, 배관 템플릿, 예컨대 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 배관 템플릿)을 갖는 관류가능한 스캐폴드가 생물반응기 채널 또는 챔버 (예를 들어, 마이크로제작 생물반응기 채널) 내에 현수된 관류가능한 생물반응기 시스템이 생성될 수 있다. 스캐폴드는 세포의 정렬 및 신장을 위한 가이던스를 제공할 수 있다. 약물 시험을 위한 이러한 장치의 실현가능성을 입증하기 위해, 세포 배양 채널 내에 산화질소 (NO)를 공급하여 심장 조직 내의 심근세포에 생화학적 자극을 제공할 수 있다. NO는 관류 소듐 니트로프루시드 (SNP) 용액으로부터 방출되고, 스캐폴드 내강으로부터 조직 배양물로 관류되어 (예를 들어, NO는 배관 벽을 통과함) 심근세포를 함유하는 조직 공간에 도달하였다. 개시된 생물반응기 장치의 예는 또한 전기 자극과 통합될 수 있고, 이는 추가로 세포, 예를 들어 심근세포의 표현형을 개선시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 배양된 조직의 수축력의 측정을 가능하게 하는 장치를 제공한다. 일부 예에서, 장치는 다중웰 구성을 가질 수 있고 (예를 들어, 96 웰 플레이트로서 구성됨), 이는 장치가 약물 스크리닝 및/또는 기능의 비-침습적 온-라인 모니터링과 상용가능하게 할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 마이크로유체 조직을 생성하기 위한 하이브리드 접근법을 제공한다. 이러한 접근법은 내장된 혈관계에 대해 기계적 지지체 (예를 들어, 생분해성 엘라스토머, (폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC))로 구성됨)를 제공하기 위해 얇은 채널 벽을 갖는 3-D 분지화된 마이크로-채널 네트워크를 갖는 예시적인 장치를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 시드 세포 (예를 들어, 심장 세포)에 의해 포매되는 히드로겔 (예를 들어, 콜라겐계 히드로겔)은, 심장 세포가 수성 매트릭스를 재형성하고 3-D 네트워크의 내장된 혈관계 주변에 압착되어 생리학상 세포 밀도를 갖는 미시적으로 수축하는 혈관화된 심장 근육을 형성할 수 있도록, 네트워크 주변에 캐스팅될 수 있다. 생성된 분지화된 조직, 또는 분지화 투과성 중합체 스캐폴드 단독은 이식을 위해 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 개시된 생물반응기 시스템은 시험관내에서 본래의 조직 아키텍처의 복잡성과 유사하거나 이를 재현할 수 있고, 따라서 배양되는 세포가 생체내에서 가정되는 것으로 기대되는 구조를 가정할 수 있게 한다. 이러한 구조를 재현하는 것은 세포를 성숙하게 할 수 있고, 그것이 생체내에서 가질 유사한 기능을 가정하게 할 수 있다. 다양한 예에서, 개시된 장치는 근육 세포, 예컨대 심근세포, 골격근 세포, 평활근 세포 뿐만 아니라 흥분성 조직, 예컨대 뉴런 및 풍부한 혈관계를 필요로 할 수 있는 세포, 예컨대 특히 간세포의 배양에 적합할 수 있다. 다양한 예에서, 개시된 장치는 다른 적용분야 중에서도 시험관내 약물 시험, 여러 상이한 구획을 갖는 인간-온-어-칩의 구축, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 환자 내로의 직접 문합술 및/또는 이식에 적합할 수 있다. 이식은 특히 외과용 커프, 우회로 이식, 누공 또는 동맥-심실 단락으로서 투과성 중합체 스캐폴드를 단독으로 사용하는 것을 포함할 수 있다. 직접 문합술의 존재 하에 (예를 들어, 동맥-심실 단락의 형태로) 또는 직접 문합술의 부재 하에 목적하는 표적 조직 위치에 배양 조직을 이식하는 것이 또한 가능할 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 측면에 대해 이하 보다 상세하게 언급될 것이다. 특히, 하기 실시예는 바이오와이어 시스템 (실시예 1, 단일-와이어 조직 배양 실시양태), 바이오튜브 시스템 (실시예 2, 관류가능한 와이어 조직 배양 실시양태), 바이오로드/바이오와이어II 시스템 (실시예 3, 수축력 조직 배양 실시양태), 바이오분지/안지오칩 시스템 (실시예 4, 혈관화 조직 배양 실시양태), 및 안지오튜브 시스템 (실시예 5, 관류가능한 수축력 조직 배양 실시양태)으로 지칭될 수 있는 본 개시내용의 다섯 (5) 가지의 예시적인 측면을 개시한다. 본 개시내용이 예시적인 측면과 함께 기재될 것이지만, 본 개시내용이 이들 측면으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
바이오와이어 시스템
본원에서 사용될 수 있는 것과 같은 본 개시내용의 제1 측면의 생물반응기 시스템은 "바이오와이어 시스템 또는 장치"로 지칭될 수 있고, 이는 본원에 기재된 특색 및 구성요소를 포함하는 생물반응기 시스템을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명의 바이오와이어 시스템 내에서 형성된 조직 배양물은 "바이오와이어"로 지칭될 수 있다. 본원의 바이오와이어 시스템의 설명은 본 개시내용을 이들 측면 또는 임의의 특정한 실시양태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 웰 또는 채널, 웰 또는 채널에 걸쳐 지지되거나 현수된 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소를 갖는 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 웰 또는 채널은 내부에 시딩된 세포, 뿐만 아니라 성장 배지 및/또는 영양소 및/또는 인자를 수용하도록 구성된다. 시딩된 세포는 배양되어, 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소에 함유된, 그 주변의, 그 위의, 및/또는 그와 통합된 조직 배양물, 바람직하게는 특정 실시양태에서 3차원 조직 가닥을 형성한다.
제1 측면의 특정 실시양태에서, 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소는 웰 또는 채널의 바닥 표면에서 들어올려진다.
제1 측면의 다양한 실시양태에서, 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소는 임의의 적합한 물질일 수 있고, 이는 천연 물질, 예컨대 콜라겐 및 콜라겐 유도체, 천연 봉합 물질 (예를 들어, 동물 장), 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 프로테오글리칸, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌 등, 뿐만 아니라 다양한 중합체 및 나노물질을 비롯한 합성 물질을 포함할 수 있다.
제1 측면의 특정 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 스캐폴드에 사용하기 위한 생체적합물질로서 적절한 물질을 선택하기 위한 기준을 인지할 것이다. 이러한 선택은 다양한 파라미터를 기초로 할 수 있고, 이는 그의 물질 화학, 분자량, 용해도, 형상 및 구조, 친수성/소수성, 윤활성, 표면 에너지, 수분 흡수 분해, 및 부식 메카니즘을 포함할 수 있다.
제1 측면의 특정 실시양태에서, 본 발명의 스캐폴드는 중합체 스캐폴드일 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 일반적으로, 높은 표면-대-부피 비, 매우 작은 세공 크기에 의한 높은 다공성, 생분해, 및 기계적 특성과 같은 그의 고유한 특성으로 인해 큰 관심을 끌고 있다. 이는 조직 공학 및 기관 치환의 적용분야에서 유의한 생체적합성, 화학의 다용도성, 및 생물학적 특성의 특유한 이점을 제공한다.
스캐폴드 물질은 합성적 또는 생물학적, 분해성 또는 비분해성일 수 있다. 중합체의 특성은 그의 구성 거대분자의 조성, 구조, 및 배열에 따라 달라진다. 그의 구조적, 화학적, 및 생물학적 특징면에서 상이한 유형, 예를 들어 세라믹, 유리, 중합체 등으로 카테고리화될 수 있다. 자연 발생 중합체, 합성 생분해성, 및 합성 비생분해성 중합체는 모두 본 발명의 스캐폴드를 형성하기 위한 중합체로서 사용될 수 있다.
천연 중합체가 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 스캐폴드 또는 세포 성장 기판으로서 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 천연 물질은 생물활성 특성으로 인해, 본원에 기재된 생물학적 시스템 내에서 세포의 성능이 증진되게 하는, 잠재적으로 세포와 보다 우수한 상호작용을 가질 수 있다. 천연 중합체는 단백질 (실크, 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 엘라스틴, 케라틴, 액틴, 및 미오신), 폴리사카라이드 (셀룰로스, 아밀로스, 덱스트란, 키틴, 및 글리코사미노글리칸) 또는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA) 등 또는 이들 물질의 조합으로서 분류될 수 있다.
본 발명의 생물반응기 시스템에 사용되는 스캐폴드는 또한 합성 생체적합물질을 포함할 수 있고, 이는 손상 또는 이환 조직의 구조 및 기능의 복원을 용이하게 할 수 있다. 합성 중합체는 그의 특성 (예를 들어, 다공성, 분해 시간, 및 기계적 특징)이 특정한 적용분야에 맞춰질 수 있기 때문에 생의학 분야에서 매우 유용하다. 합성 중합체는 종종 생물학적 스캐폴드보다 저렴하고; 균일하게 대량으로 생산될 수 있고, 긴 보관 시간을 갖는다. 많은 상업적으로 입수가능한 합성 중합체는 생물학적 조직의 그것과 대등한 물리화학적 및 기계적 특성을 나타낸다. 합성 중합체는 최대 군의 생분해성 중합체를 대표하며, 이는 제어된 조건 하에 생성될 수 있다. 이는 일반적으로, 예측가능하고 재현가능한 기계적 및 물리적 특성, 예컨대 인장 강도, 탄성률, 및 분해 속도를 나타낸다. PLA, PGA, 및 PLGA 공중합체는 조직 공학에서 특히 가장 통상적으로 사용되는 합성 중합체이다. PHA는 미생물 폴리에스테르 부류에 속하고, 조직 공학에서의 적용을 위해 점점 고려되고 있다. 모든 이들 합성 중합체가 본원에서 고려된다.
또한, 본 개시내용의 제1 측면의 생물반응기 시스템은 문헌 [Rosso et al., "Smart materials as scaffolds for tissue engineering," J Cell Physiol. 2006 Dec;209(3):1054]에 개시된 것과 같은 반합성물을 또한 사용할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 인테그린 결합 도메인, 성장 인자, 항트롬빈 서열, 플라스민 분해 부위, 및 형태발생 단백질에 특이적인 올리고펩티드 절단 서열을 함유할 수 있다. 이러한 반합성 물질은 합성 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 가공성, 기계적 강도) 및 천연 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 특이적 세포 인식, 세포 침습, 및 분화/증식 신호를 공급하는 능력) 둘 다를 갖는 "지능적" 반합성 생체적합물질을 부여하는 것을 목표로 한다. 그의 특징으로 인해, 이들 반합성 생체적합물질은 본원에 기재된 스캐폴드를 위한 물질의 공급원으로서의 역할을 하는데 있어서 임상적으로 유망한 신규한 다용도 부류의 생체모방 하이브리드 물질을 대표한다.
참조 기준으로서, 하기 중합체 및 물질이 본원에 기재된 생물반응기에서의 사용을 위해 고려된다:
PU: 폴리우레탄; PS: 폴리술폰; CP: 인산칼슘;
HA: 히알루론산; PP: 폴리프로필렌; BG: 생물활성 유리; ECM: 세포외 매트릭스;
PVA: 폴리비닐 알콜; PGA: 폴리글리콜리드; PLA: 폴리락티드; PPF: 폴리(프로필렌 푸마레이트);
PCA: 폴리시아노아크릴레이트; PCL: 폴리(ε-카프로락톤);
PDO: 폴리디옥사논; PHA: 폴리히드록시알카노에이트;
POE: 폴리(오르토 에스테르);
PEE: 폴리(에테르 에스테르);
PEO: 폴리(에틸렌 옥시드);
PBT: 폴리부틸렌 테레프탈레이트;
HAP: 히드록시아파타이트;
TCP: 인산삼칼슘;
PEG: 폴리(에틸렌 글리콜);
PEU: 폴리(에스테르 우레탄);
PAA: 폴리(아크릴산);
LDI: 리신 디이소시아네이트;
BCP: 2상 인산칼슘;
PAam: 폴리아크릴아미드;
PMMA: 폴리메틸메타크릴레이트;
PLLA: 폴리(L-락트산);
PLGA: 폴리(l-락티드-코-글리콜리드);
PTMC: 폴리(트리메틸렌 카르보네이트);
PDMS: 폴리디메틸실록산;
PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌;
PEVA: 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트);
PGCL: 폴리(글리콜리드-코-ε-카프로락톤);
PLCL: 폴리(l-락티드-코-카프로락톤);
PDLLA: 폴리(DL-락티드);
PLDLA: 폴리-L/D-락티드;
PLAGA: 폴리(락트산-글리콜산);
PHBHV: 폴리(3-히드록시부티레이트) 3-히드록시발레레이트;
PCLTMC: 폴리(카프로락톤-코-트리메틸렌 카르보네이트);
PNIPAAm: 폴리(N-이소프로필아크릴아미드);
PDMAEM: 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트) 히드로클로라이드;
PDLLA-CL: 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤);
PLLA-CL: 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤); 및
TCP: 인산삼칼슘.
POMac.
특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 스캐폴드는 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 또는 폴리스티렌, 또는 그의 조합으로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다. 임의로 특정 실시양태에서, 스캐폴드 물질은 단백질, 약물, 영양소, 및 대사 폐기물을 비롯한 물 및 분자의 교환 및/또는 통과를 가능하게 하도록 관류가능할 수 있다.
통상의 기술자는 조직 공학 스캐폴드의 제조 및 사용과 관련하여 최신 기술에서 이용가능한 자원을 참조할 수 있고, 특히 문헌 [Dhandayuthapani et al., "Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science, Vol. 2011 (2011), pages 1-19]에 기재된 스캐폴드 물질을 참조할 수 있음을 인지할 것이다.
웰 또는 채널의 형상은 임의의 특정한 방식으로 제한되지 않고, 사각형, 직사각형, 원형, 계란형, 타원형, 삼각형, 또는 형상의 임의의 조합일 수 있다. 웰 또는 채널의 다른 치수도 또한 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다. 예를 들어 채널의 깊이, 벽의 높이, 및 채널의 길이, 및 채널의 전반적 부피는 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
예를 들어, 채널의 길이, 높이, 및 너비는 약 0.1-1 mm, 또는 약 0.2-2 mm, 또는 약 0.3-3 mm, 또는 약 0.4-4 mm, 또는 약 0.5-5 mm, 또는 약 0.6-6 mm, 또는 약 0.7-7 mm, 또는 약 0.8-8 mm, 또는 약 0.9-9 mm, 또는 약 1-10 mm, 또는 그 초과일 수 있다.
채널의 표면은 또한 조직 배양 과정을 용이하게 할 수 있는 화학적 변형 (예컨대 예를 들어, 리간드, 하전된 물질, 결합제, 성장 인자, 항생제, 항진균제), 또는 물리적 변형 (예컨대 예를 들어, 스파이크, 만곡부, 폴드, 세공, 비평탄부, 또는 다양한 형상 및 토포그래피)을 비롯한 임의의 적합한 표면 처리에 의해 변형될 수 있다.
제1 측면의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템 내에서 시딩 및 배양될 수 있는 세포는 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 연골 세포, 피부 세포, 골수 세포, 또는 이러한 조직의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템은 심장 조직, 간 조직, 또는 신장 조직을 성장시키는데 적합하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 내에서 형성되는 조직은 3차원 조직이다.
제1 측면의 다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기 시스템은 줄기 세포, 또는 성숙한 조직 유형, 예를 들어 성숙한 심장, 간, 또는 신장 조직으로 발생할 수 있는 다른 전구 세포로 시딩될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 장치와의 사용을 위해 고려되는 줄기 세포는 임의의 정도의 효력을 가질 수 있으며, 전능/옴니포텐트 세포, 만능 세포, 다능 세포, 소기능 세포, 또는 단능 세포 (예를 들어, 전구 세포)를 포함한다.
심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 생물반응기 시스템의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 일반적으로 채널의 종축에 평행이거나 (생성되는 조직 가닥은 채널 내의 스캐폴드 상 및 그 주변에서 성장함), 또는 일반적으로 채널의 종축에 수직인 (생성되는 조직 가닥) 방향일 수 있다. 그러나, 전기장의 배향은 제한되지 않고, 전극의 위치설정은 적합한 전기장이 생성될 수 있도록 임의의 적합한 포맷일 수 있다. 특정 실시양태에서 (예를 들어 심장 세포), 전기장은 세포의 성숙을 용이하게 하여 실제 조직, 예를 들어 심장 조직의 생리학적 및 전기적 특성을 보다 밀접하게 모방한 조직을 형성한다.
제1 측면의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기는 복수개의 조직 가닥이 동시에 성장, 시험, 측정 및 평가 등이 될 수 있도록, 예를 들어 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트 포맷의 복수개의 개별 생물반응기로서 어셈블리될 수 있다.
제1 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 본 개시내용의 3차원 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
바이오와이어 시스템은 또한 히드로겔로 형성될 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 히드로겔은 다량의 물을 흡수할 수 있는 물리적 또는 화학적으로 가교된 중합체 네트워크이다. 이는 제조 방법, 전하, 및 기계적 및 구조적 특징을 비롯한 다양한 파라미터에 따라 상이한 카테고리로 분류될 수 있다. 히드로겔은 많은 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하고, 종종 비교적 온화한 조건 하에서 가공될 수 있고, 최소 침습 방식으로 전달될 수 있기 때문에 매력적인 스캐폴드 물질이다. 따라서, 히드로겔은 본원에서 스캐폴드 물질로서 사용될 수 있다. 히드로겔은 다른 물질 중에서, 풍부한 친수성 기를 갖는 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 천연 히드로겔 물질은 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난, 및 다른 자연 유래 중합체를 포함한다.
바이오튜브 시스템
본원에서 사용될 수 있는 것과 같은 본 개시내용의 제2 측면의 생물반응기 시스템은 "바이오튜브 시스템 또는 장치"로 지칭될 수 있고, 이는 본원에 기재된 특색 및 구성요소를 포함하는 생물반응기 시스템을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 바이오튜브 시스템 내에서 형성된 조직 배양물은 "바이오튜브"로 지칭될 수 있다. 본원의 바이오튜브 시스템의 설명은 본 개시내용을 이들 측면 또는 임의의 특정한 실시양태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
제2 측면에서, 본 개시내용은 관류가능한 내강을 갖는, 조직 배양물, 예를 들어 3차원 조직 가닥을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 생물반응기 시스템은 세포를 시딩하는데 적합한 웰 또는 채널, 및 1개 이상의 내강을 갖고, 웰 또는 채널 상에, 예를 들어 웰 또는 채널의 종축을 따라 지지되거나 현수된 관류가능한 스캐폴드를 포함한다. 세포가 적합한 성장 배지, 성장 인자, 및 세포의 배양에 적합한 다른 영양소와 함께 웰 또는 채널 내에 시딩되면, 세포는 성장하여 관류가능한 스캐폴드를 둘러싸고/거나 그와 통합된 조직 가닥을 형성한다. 사용 중에, 영양소 및 성장 인자, 뿐만 아니라 시험 작용제 (예를 들어, 약물, 단백질, 독소 등)는 이러한 물질을 전달하기 위한 수단 (예를 들어, 튜브 또는 관을 통해 내강에 연결된 저장 요소)과 통합된 관류가능한 내강을 통해 조직 가닥으로 전달될 수 있다. 또한, 생물반응기 시스템은 다양한 실시양태에서 관류가능한 내강으로부터 배출되는 통로, 예를 들어 폐기물 및 다른 대사 산물이 조직 가닥으로부터 관류가능한 내강 내로 및 말단 저장소 외로 확산되도록 하는 드레인 또는 다른 말단 저장소를 또한 포함할 수 있다. 심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 생물반응기의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 관류가능한 내강 요소의 길이를 따라 형성된 조직 가닥의 종축에 평행인 방향일 수 있다.
제2 측면의 특정 실시양태에서, 관류가능한 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소는 웰 또는 채널의 바닥 표면에서 들어올려진다.
제2 측면의 다양한 실시양태에서, 관류가능한 종방향 스캐폴드, 봉합사, 또는 다른 세포 성장 요소는 임의의 적합한 물질일 수 있고, 이는 천연 물질, 예컨대 콜라겐 및 콜라겐 유도체, 천연 봉합 물질 (예를 들어, 동물 장), 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 프로테오글리칸, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌 등, 뿐만 아니라 다양한 중합체 및 나노물질을 비롯한 합성 물질 (예를 들어, POMac)을 포함할 수 있다.
제2 측면의 특정 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 관류가능한 스캐폴드에 사용하기 위한 생체적합물질로서 적절한 물질을 선택하기 위한 기준을 인지할 것이다. 이러한 선택은 다양한 파라미터를 기초로 할 수 있고, 이는 그의 물질 화학, 분자량, 용해도, 형상 및 구조, 친수성/소수성, 윤활성, 표면 에너지, 수분 흡수 분해, 및 부식 메카니즘을 포함할 수 있다.
제2 측면의 특정 실시양태에서, 본 발명의 관류가능한 스캐폴드는 중합체 스캐폴드일 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 일반적으로, 높은 표면-대-부피 비, 매우 작은 세공 크기에 의한 높은 다공성, 생분해, 및 기계적 특성과 같은 그의 고유한 특성으로 인해 큰 관심을 끌고 있다. 이는 조직 공학 및 기관 치환의 적용분야에서 유의한, 생체적합성, 화학의 다용도성, 및 생물학적 특성의 특유한 이점을 제공한다.
관류가능한 스캐폴드 물질은 합성적 또는 생물학적, 분해성 또는 비분해성일 수 있다. 중합체의 특성은 그의 구성 거대분자의 조성, 구조, 및 배열에 따라 달라진다. 그의 구조적, 화학적, 및 생물학적 특징면에서 상이한 유형, 예를 들어 세라믹, 유리, 중합체 등으로 카테고리화될 수 있다. 자연 발생 중합체, 합성 생분해성, 및 합성 비생분해성 중합체는 모두 본 발명의 스캐폴드를 형성하기 위한 중합체로서 사용될 수 있다.
천연 중합체가 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 관류가능한 스캐폴드 또는 세포 성장 기판으로서 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 천연 물질은 생물활성 특성으로 인해, 본원에 기재된 생물학적 시스템 내에서 세포의 성능이 증진되게 하는, 잠재적으로 세포와 보다 우수한 상호작용을 가질 수 있다. 천연 중합체는 단백질 (실크, 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 엘라스틴, 케라틴, 액틴, 및 미오신), 폴리사카라이드 (셀룰로스, 아밀로스, 덱스트란, 키틴, 및 글리코사미노글리칸) 또는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA) 등 또는 이들 물질의 조합으로서 분류될 수 있다.
본 발명의 생물반응기 시스템에 사용되는 관류가능한 스캐폴드는 또한 합성 생체적합물질을 포함할 수 있고, 이는 손상 또는 이환 조직의 구조 및 기능의 복원을 용이하게 할 수 있다. 합성 중합체는 그의 특성 (예를 들어, 다공성, 분해 시간, 및 기계적 특징)이 특정한 적용분야에 맞춰질 수 있기 때문에 생의학 분야에서 매우 유용하다. 합성 중합체는 종종 생물학적 스캐폴드보다 저렴하고; 균일하게 대량으로 생산될 수 있고, 긴 보관 시간을 갖는다. 많은 상업적으로 입수가능한 합성 중합체는 생물학적 조직의 그것과 대등한 물리화학적 및 기계적 특성을 나타낸다. 합성 중합체는 최대 군의 생분해성 중합체를 대표하며, 이는 제어된 조건 하에 생산될 수 있다. 이는 일반적으로, 예측가능하고 재현가능한 기계적 및 물리적 특성, 예컨대 인장 강도, 탄성률, 및 분해 속도를 나타낸다. PLA, PGA, 및 PLGA 공중합체는 조직 공학에서 특히 가장 통상적으로 사용되는 합성 중합체이다. PHA는 미생물 폴리에스테르 부류에 속하고, 조직 공학에서의 적용을 위해 점점 고려되고 있다. 모든 이들 합성 중합체가 본원에서 고려된다.
또한, 본 개시내용의 제1 측면의 생물반응기 시스템은 문헌 [Rosso et al., "Smart materials as scaffolds for tissue engineering," J Cell Physiol. 2006 Dec;209(3):1054]에 개시된 것과 같은 반합성물을 또한 사용할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 인테그린 결합 도메인, 성장 인자, 항트롬빈 서열, 플라스민 분해 부위, 및 형태발생 단백질에 특이적인 올리고펩티드 절단 서열을 함유할 수 있다. 이러한 반합성 물질은 합성 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 가공성, 기계적 강도) 및 천연 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 특이적 세포 인식, 세포 침습, 및 분화/증식 신호를 공급하는 능력) 둘 다를 갖는 "지능적" 반합성 생체적합물질을 부여하는 것을 목표로 한다. 그의 특징으로 인해, 이들 반합성 생체적합물질은 본원에 기재된 스캐폴드를 위한 물질의 공급원으로서의 역할을 하는데 있어서 임상적으로 유망한, 신규한 다용도 부류의 생체모방 하이브리드 물질을 대표한다.
참조 기준으로서, 하기 중합체 및 물질이 본원에 기재된 제2 측면의 생물반응기에서의 사용을 위해 고려된다:
PU: 폴리우레탄; PS: 폴리술폰; CP: 인산칼슘;
HA: 히알루론산; PP: 폴리프로필렌; BG: 생물활성 유리; ECM: 세포외 매트릭스;
PVA: 폴리비닐 알콜; PGA: 폴리글리콜리드; PLA: 폴리락티드; PPF: 폴리(프로필렌 푸마레이트);
PCA: 폴리시아노아크릴레이트; PCL: 폴리(ε-카프로락톤);
PDO: 폴리디옥사논; PHA: 폴리히드록시알카노에이트;
POE: 폴리(오르토 에스테르);
PEE: 폴리(에테르 에스테르);
PEO: 폴리(에틸렌 옥시드);
PBT: 폴리부틸렌 테레프탈레이트;
HAP: 히드록시아파타이트;
TCP: 인산삼칼슘;
PEG: 폴리(에틸렌 글리콜);
PEU: 폴리(에스테르 우레탄);
PAA: 폴리(아크릴산);
LDI: 리신 디이소시아네이트;
BCP: 2상 인산칼슘;
PAam: 폴리아크릴아미드;
PMMA: 폴리메틸메타크릴레이트;
PLLA: 폴리(L-락트산);
PLGA: 폴리(l-락티드-코-글리콜리드);
PTMC: 폴리(트리메틸렌 카르보네이트);
PDMS: 폴리디메틸실록산;
PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌;
PEVA: 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트);
PGCL: 폴리(글리콜리드-코-ε-카프로락톤);
PLCL: 폴리(l-락티드-코-카프로락톤);
PDLLA: 폴리(DL-락티드);
PLDLA: 폴리-L/D-락티드;
PLAGA: 폴리(락트산-글리콜산);
PHBHV: 폴리(3-히드록시부티레이트) 3-히드록시발레레이트;
PCLTMC: 폴리(카프로락톤-코-트리메틸렌 카르보네이트);
PNIPAAm: 폴리(N-이소프로필아크릴아미드);
PDMAEM: 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트) 히드로클로라이드;
PDLLA-CL: 폴리(D,L-락티드-코- 카프로락톤);
PLLA-CL: 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤); 및
TCP: 인산삼칼슘.
POMac.
제2 측면의 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 관류가능한 스캐폴드는 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 또는 폴리스티렌, 또는 그의 조합으로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다. 임의로 특정 실시양태에서, 스캐폴드 물질은 단백질, 약물, 영양소, 및 대사 폐기물을 비롯한 물 및 분자의 교환 및/또는 통과를 가능하게 하도록 관류가능할 수 있다.
통상의 기술자는 조직 공학 스캐폴드의 제조 및 사용과 관련하여 최신 기술에서 이용가능한 자원을 참조할 수 있고, 특히 문헌 [Dhandayuthapani et al., "Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science, Vol. 2011 (2011), pages 1-19]에 기재된 스캐폴드 물질을 참조할 수 있음을 인지할 것이다.
웰 또는 채널의 형상은 임의의 특정한 방식으로 제한되지 않고, 사각형, 직사각형, 원형, 계란형, 타원형, 삼각형, 또는 형상의 임의의 조합일 수 있다. 웰 또는 채널의 다른 치수도 또한 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다. 예를 들어 채널의 깊이, 벽의 높이, 및 채널의 길이, 및 채널의 전반적 부피는 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
예를 들어, 채널의 길이, 높이, 및 너비는 약 0.1-1 mm, 또는 약 0.2-2 mm, 또는 약 0.3-3 mm, 또는 약 0.4-4 mm, 또는 약 0.5-5 mm, 또는 약 0.6-6 mm, 또는 약 0.7-7 mm, 또는 약 0.8-8 mm, 또는 약 0.9-9 mm, 또는 약 1-10 mm, 또는 그 초과일 수 있다.
채널의 표면은 또한 조직 배양 과정을 용이하게 할 수 있는 화학적 변형 (예컨대 예를 들어, 리간드, 하전된 물질, 결합제, 성장 인자, 항생제, 항진균제), 또는 물리적 변형 (예컨대 예를 들어, 스파이크, 만곡부, 폴드, 세공, 비평탄부, 또는 다양한 형상 및 토포그래피)을 비롯한 임의의 적합한 표면 처리에 의해 변형될 수 있다.
제2 측면의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템 내에서 시딩 및 배양될 수 있는 세포는 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 연골 세포, 피부 세포, 골수 세포, 또는 이러한 조직의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템은 심장 조직, 간 조직, 또는 신장 조직을 성장시키는데 적합하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 내에서 형성되는 조직은 3차원 조직이다.
제2 측면의 다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기 시스템은 줄기 세포, 또는 성숙한 조직 유형, 예를 들어 성숙한 심장, 간, 또는 신장 조직으로 발생할 수 있는 다른 전구 세포로 시딩될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 장치와의 사용을 위해 고려되는 줄기 세포는 임의의 정도의 효력을 가질 수 있으며, 전능/옴니포텐트 세포, 만능 세포, 다능 세포, 소기능 세포, 또는 단능 세포 (예를 들어, 전구 세포)를 포함한다.
심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 생물반응기 시스템의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 일반적으로 채널의 종축에 평행이거나 (생성되는 조직 가닥은 채널 내의 스캐폴드 상 및 그 주변에서 성장함), 또는 일반적으로 채널의 종축에 수직인 (생성되는 조직 가닥) 방향일 수 있다. 그러나, 전기장의 배향은 제한되지 않고, 전극의 위치설정은 적합한 전기장이 생성될 수 있도록 임의의 적합한 포맷일 수 있다. 특정 실시양태에서 (예를 들어 심장 세포), 전기장은 세포의 성숙을 용이하게 하여 실제 조직, 예를 들어 심장 조직의 생리학적 및 전기적 특성을 보다 밀접하게 모방한 조직을 형성한다.
제2 측면의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기는 복수개의 조직 가닥이 동시에 성장, 시험, 측정 및 평가 등이 될 수 있도록, 예를 들어 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트 포맷의 복수개의 개별 생물반응기로서 어셈블리될 수 있다.
제2 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 본 발명의 3차원 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 종방향 요소는 복수개의 내강을 포함할 수 있다. 요소의 두께 및/또는 직경은 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다. 내강의 직경은 크기면에서 임의의 적합한 범위에 걸쳐, 예를 들어 0.1-5 마이크로미터, 0.2-10 마이크로미터, 0.3-15 마이크로미터, 0.4-20 마이크로미터, 0.5-30 마이크로미터, 0.5-50 마이크로미터, 1.0-100 마이크로미터, 2.0-200 마이크로미터, 3.0-500 마이크로미터, 4.0-800 마이크로미터, 5.0 마이크로미터-1 밀리미터, 또는 1-10 밀리미터 또는 그 초과를 포함하여 달라질 수 있다. 내강은 일정한 직경을 가질 수 있거나, 또는 직경은 종방향 요소의 길이에 따라 달라질 수 있다. 종방향 요소의 표면은 평활 표면, 거친 표면, 가시 표면 등을 갖는 것을 비롯하여 임의의 적합한 특성을 가질 수 있다. 또한 요소는, 세포가 요소와 접촉하여 종방향 요소에 부착하는 것을 보조할 수 있는 추가의 구성요소, 예컨대 리간드, 항체, 하전된 분자, 소수성 분자 등과 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링될 수 있다.
스캐폴드의 배향, 특히 관류가능한 종방향 요소의 배향은 웰내 성장 챔버의 배향에 대해 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 성장 챔버는 종방향 요소의 배향과 일반적으로 수직으로 배향될 수 있는 일반적으로 종방향 성장 챔버일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 종방향 요소는 성장 챔버의 배향에 대해 일반적으로 수직 배향으로 배향될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 종방향 요소는 성장 챔버의 배향에 대해 일반적으로 평행 배향으로 배향될 수 있다. 다른 실시양태에서, 종방향 요소는 성장 챔버의 배향에 대해 일반적으로 대각선 배향으로 배향될 수 있다.
생물반응기 플레이트의 웰에 대한 종방향 요소의 부착은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 접착제, 용접, 또는 다른 기계적 수단에 의해 이루어질 수 있다. 웰과 종방향 요소 사이의 부착 지점은 규칙적, 무작위, 연속적, 또는 비연속적일 수 있다.
종방향 요소는 또한 특정 실시양태에서 영양소, 대사 폐기물, 단백질, 또는 심지어 전세포의 통과를 가능하게 하는 관류가능한 물질을 포함할 수 있다. 관류가능성은 요소를 형성하는데 사용된 물질의 특성을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해, 또는 요소를 형성하는 물질에 1개 이상의 세공을 형성하는 것에 의해 확립될 수 있다. 관류가능한 물질은 영양소, 대사 폐기물, 및 심지어 전세포의 자유로운 이동이 바이오튜브의 내강과 생물반응기의 성장 챔버 사이에서 자유롭게 이동하도록 할 것이다.
본 개시내용의 임의의 생물반응기의 생물반응기 구성요소 (예를 들어, 반응기 몸체, 뚜껑, 커버, 성장 챔버, 스캐폴드, 종방향 요소 등)는 다양한 중합체 (FDA 승인받은 것 포함), 예컨대 폴리락톤, 예컨대 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(글리콜리드) (PGA), 및 그의 공중합체 (PLGA), PDMS (폴리(디메틸실록산)), PMMA (폴리(메틸 메타크릴레이트)), 및 생분해성 중합체, 예컨대 POMac (폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트, 1,8-옥탄디올, 시트레이트 산, 및 말레산 무수물 유닛의 혼합물)를 비롯한 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 문헌 [Tran et al., "Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism," Soft Matter, Jan 1, 2010; 6(11): 2449-2461]을 참조할 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 중합체는 임의의 적합한 자연 발생 중합체 (예컨대 비제한적으로 셀룰로스, 실크, 쉘락, 고무 또는 그의 유도체) 또는 임의의 적합한 합성 중합체 (나일론, 폴리비닐 클로라이드 (PVC 또는 비닐), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴로니트릴, PVB, 실리콘 및 그의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 중합체는 생물반응기 내에서의 조직의 성장 및/또는 유지를 용이하게 할 수 있는 추가의 구성요소, 예컨대 리간드, 항체, 하전된 분자, 소수성 분자 등에 의해 공유적으로 또는 비공유적으로 변형될 수 있다. 특정한 유형의 중합체, 그의 변형 등은 본원에 기재된 바와 같은 각각의 적용에 내재된 중요한 물리적, 질량 수송, 및 생물학적 설계 변수를 다루기 위한 적절한 물질을 발견하는데 달려있음이 인지될 것이다.
본원에 기재된 생물반응기는 또한 세포의 시딩 또는 스캐폴드의 구조적 구성요소를 위한 히드로겔을 포함할 수 있다. 히드로겔은 다량의 물을 흡수할 수 있는 물리적 또는 화학적으로 가교된 중합체 네트워크이다. 이는 제조 방법, 전하, 및 기계적 및 구조적 특징을 비롯한 다양한 파라미터에 따라 상이한 카테고리로 분류될 수 있다. 히드로겔은 많은 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하고, 종종 비교적 온화한 조건 하에서 가공될 수 있고, 최소 침습 방식으로 전달될 수 있기 때문에 매력적인 스캐폴드 물질이다. 따라서, 히드로겔은 본원에서 스캐폴드 물질로서 사용될 수 있다. 히드로겔은 다른 물질 중에서, 풍부한 친수성 기를 갖는 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 천연 히드로겔 물질은 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난, 및 다른 자연 유래 중합체를 포함한다.
바이오로드 시스템
본원에서 사용될 수 있는 것과 같은 본 개시내용의 제3 측면의 생물반응기 시스템은 "바이오로드 시스템 또는 장치"로 지칭될 수 있고, 이는 본원에 기재된 특색 및 구성요소를 포함하는 생물반응기 시스템을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 바이오튜브 시스템 내에서 형성된 조직 배양물은 "바이오로드"로 지칭될 수 있다. 본원의 바이오튜브 시스템의 설명은 본 개시내용을 이들 측면 또는 임의의 특정한 실시양태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
제3 측면에서, 본 발명은 수축력을 측정하는데 적합한, 조직 배양물, 예를 들어 3차원 조직 가닥을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면은 웰 또는 채널, 및 웰 또는 챔버 내에 배치되어 그 사이에 형성된 3차원 조직 가닥에 대한 적어도 2개의 고정점을 형성하도록 기능하는 적어도 1개의 세트의 대향 스캐폴드 요소 (단일 스캐폴드 또는 별개의 스캐폴드로 형성될 수 있음)를 갖는 생물반응기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 1개의 세트의 대향 스캐폴드 요소는 웰 또는 채널의 벽에 가역적으로 부착되지만, 웰 또는 챔버의 바닥과 요소 사이에 갭이 존재하도록 그 위에 현수된다. 제3 측면의 생물반응기는 2개의 이러한 요소를 갖는 것으로 제한되지 않고, 2개 초과, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 이러한 요소를 포함할 수 있다. (a) 각각의 대향 요소 주변에서 형성되어 그들 사이에 연결되는 3차원 조직 가닥을 형성하는 능력이 존재하고, 조직 가닥이 대향 세트 또는 세트들의 스캐폴드 요소 사이에 배치되고 채널 또는 웰 상에 현수되도록 하는 한, 채널당 임의의 수의 요소가 제공될 수 있다.
스캐폴드 요소는 바람직하게는 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등이고, 이는 추가로 스캐폴드 요소에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘된 수축력의 측정이 가능하도록 구성된다.
제3 측면의 바람직한 실시양태에서, 각각의 웰 또는 채널은 한 세트 (2개) 또는 대향 스캐폴드 요소로 구성되고, 바람직하게는 그에 의해 단일 스캐폴드 요소가 웰 또는 채널의 종축의 대향 말단에 또는 그 근처에 배치된다.
제3 측면의 특정 실시양태에서, 스캐폴드 요소는 웰 또는 채널의 바닥 표면에서 들어올려진다.
제3 측면의 다양한 실시양태에서, 스캐폴드 요소는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있고, 이는 천연 물질, 예컨대 콜라겐 및 콜라겐 유도체, 천연 봉합 물질 (예를 들어, 동물 장), 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 프로테오글리칸, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌 등, 뿐만 아니라 다양한 중합체 및 나노물질을 비롯한 합성 물질 (예를 들어, POMac)을 포함할 수 있다.
제3 측면의 특정 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 스캐폴드 요소에 사용하기 위한 생체적합물질로서 적절한 물질을 선택하기 위한 기준을 인지할 것이다. 이러한 선택은 다양한 파라미터를 기초로 할 수 있고, 이는 그의 물질 화학, 분자량, 용해도, 형상 및 구조, 친수성/소수성, 윤활성, 표면 에너지, 수분 흡수 분해, 및 부식 메카니즘, 특히 그의 변형성, 가요성, 및 굴곡성 등을 포함할 수 있다.
제3 측면의 특정 실시양태에서, 스캐폴드 요소는 중합체 스캐폴드일 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 일반적으로, 높은 표면-대-부피 비, 매우 작은 세공 크기에 의한 높은 다공성, 생분해, 및 기계적 특성과 같은 그의 고유한 특성으로 인해 큰 관심을 끌고 있다. 이는 조직 공학 및 기관 치환의 적용분야에서 유의한, 생체적합성, 화학의 다용도성, 및 생물학적 특성의 특유한 이점을 제공한다.
스캐폴드 요소는 합성적 또는 생물학적, 분해성 또는 비분해성일 수 있다. 중합체의 특성은 그의 구성 거대분자의 조성, 구조, 및 배열에 따라 달라진다. 그의 구조적, 화학적, 및 생물학적 특징면에서 상이한 유형, 예를 들어 세라믹, 유리, 중합체 등으로 카테고리화될 수 있다. 자연 발생 중합체, 합성 생분해성, 및 합성 비생분해성 중합체는 모두 본 발명의 스캐폴드를 형성하기 위한 중합체로서 사용될 수 있다.
천연 중합체가 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 스캐폴드 요소로서 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 천연 물질은 생물활성 특성으로 인해, 본원에 기재된 생물학적 시스템 내에서 세포의 성능이 증진되게 하는, 잠재적으로 세포와 보다 우수한 상호작용을 가질 수 있다. 천연 중합체는 단백질 (실크, 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 엘라스틴, 케라틴, 액틴, 및 미오신), 폴리사카라이드 (셀룰로스, 아밀로스, 덱스트란, 키틴, 및 글리코사미노글리칸) 또는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA) 등 또는 이들 물질의 조합으로서 분류될 수 있다.
본 발명의 생물반응기 시스템에 사용되는 스캐폴드 요소는 또한 합성 생체적합물질을 포함할 수 있고, 이는 손상 또는 이환 조직의 구조 및 기능의 복원을 용이하게 할 수 있다. 합성 중합체는 그의 특성 (예를 들어, 다공성, 분해 시간, 및 기계적 특징)이 특정한 적용분야에 맞춰질 수 있기 때문에 생의학 분야에서 매우 유용하다. 합성 중합체는 종종 생물학적 스캐폴드보다 저렴하고; 균일하게 대량으로 생산될 수 있고, 긴 보관 시간을 갖는다. 많은 상업적으로 입수가능한 합성 중합체는 생물학적 조직의 그것과 대등한 물리화학적 및 기계적 특성을 나타낸다. 합성 중합체는 최대 군의 생분해성 중합체를 대표하며, 이는 제어된 조건 하에 생산될 수 있다. 이는 일반적으로, 예측가능하고 재현가능한 기계적 및 물리적 특성, 예컨대 인장 강도, 탄성률, 및 분해 속도를 나타낸다. PLA, PGA, 및 PLGA 공중합체는 조직 공학에서 특히 가장 통상적으로 사용되는 합성 중합체이다. PHA는 미생물 폴리에스테르 부류에 속하고, 조직 공학에서의 적용을 위해 점점 고려되고 있다. 모든 이들 합성 중합체가 본원에서 고려된다.
또한, 본 개시내용의 제3 측면의 생물반응기 시스템은 문헌 [Rosso et al., "Smart materials as scaffolds for tissue engineering," J Cell Physiol. 2006 Dec;209(3):1054]에 개시된 것과 같은 반합성물을 또한 사용할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 인테그린 결합 도메인, 성장 인자, 항트롬빈 서열, 플라스민 분해 부위, 및 형태발생 단백질에 특이적인 올리고펩티드 절단 서열을 함유할 수 있다. 이러한 반합성 물질은 합성 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 가공성, 기계적 강도) 및 천연 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 특이적 세포 인식, 세포 침습, 및 분화/증식 신호를 공급하는 능력) 둘 다를 갖는 "지능적" 반합성 생체적합물질을 부여하는 것을 목표로 한다. 그의 특징으로 인해, 이들 반합성 생체적합물질은 본원에 기재된 스캐폴드를 위한 물질의 공급원으로서의 역할을 하는데 있어서 임상적으로 유망한, 신규한 다용도 부류의 생체모방 하이브리드 물질을 대표한다.
참조 기준으로서, 하기 중합체 및 물질이 본원에 기재된 제3 측면 생물반응기에서의 사용을 위해 고려된다:
PU: 폴리우레탄; PS: 폴리술폰; CP: 인산칼슘;
HA: 히알루론산; PP: 폴리프로필렌; BG: 생물활성 유리; ECM: 세포외 매트릭스;
PVA: 폴리비닐 알콜; PGA: 폴리글리콜리드; PLA: 폴리락티드; PPF: 폴리(프로필렌 푸마레이트);
PCA: 폴리시아노아크릴레이트; PCL: 폴리(ε-카프로락톤);
PDO: 폴리디옥사논; PHA: 폴리히드록시알카노에이트;
POE: 폴리(오르토 에스테르);
PEE: 폴리(에테르 에스테르);
PEO: 폴리(에틸렌 옥시드);
PBT: 폴리부틸렌 테레프탈레이트;
HAP: 히드록시아파타이트;
TCP: 인산삼칼슘;
PEG: 폴리(에틸렌 글리콜);
PEU: 폴리(에스테르 우레탄);
PAA: 폴리(아크릴산);
LDI: 리신 디이소시아네이트;
BCP: 2상 인산칼슘;
PAam: 폴리아크릴아미드;
PMMA: 폴리메틸메타크릴레이트;
PLLA: 폴리(L-락트산);
PLGA: 폴리(l-락티드-코-글리콜리드);
PTMC: 폴리(트리메틸렌 카르보네이트);
PDMS: 폴리디메틸실록산;
PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌;
PEVA: 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트);
PGCL: 폴리(글리콜리드-코-ε-카프로락톤);
PLCL: 폴리(l-락티드-코-카프로락톤);
PDLLA: 폴리(DL-락티드);
PLDLA: 폴리-L/D-락티드;
PLAGA: 폴리(락트산-글리콜산);
PHBHV: 폴리(3-히드록시부티레이트) 3-히드록시발레레이트;
PCLTMC: 폴리(카프로락톤-코-트리메틸렌 카르보네이트);
PNIPAAm: 폴리(N-이소프로필아크릴아미드);
PDMAEM: 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트) 히드로클로라이드;
PDLLA-CL: 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤);
PLLA-CL: 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤); 및
TCP: 인산삼칼슘.
POMac.
제3 측면의 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 스캐폴드 요소는 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 또는 폴리스티렌, 또는 그의 조합으로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다. 임의로 특정 실시양태에서, 스캐폴드 물질은 단백질, 약물, 영양소, 및 대사 폐기물을 비롯한 물 및 분자의 교환 및/또는 통과를 가능하게 하도록 관류가능할 수 있다.
통상의 기술자는 조직 공학 스캐폴드의 제조 및 사용과 관련하여 최신 기술에서 이용가능한 자원을 참조할 수 있고, 특히 문헌 [Dhandayuthapani et al., "Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science, Vol. 2011 (2011), pages 1-19]에 기재된 스캐폴드 물질을 참조할 수 있음을 인지할 것이다.
스캐폴드 요소의 형상, 두께, 길이, 배향 및 표면 토포그래피 특성은 스캐폴드 요소가 그 사이에 연결된 조직 가닥의 수축 작용 또는 활성에 반응하여 형상을 변형, 굴곡, 또는 달리 변화시킬 수 있고, 이러한 변형, 굴곡, 또는 다른 형상 변화가 신뢰할 만하게 측정될 수 있는 한, 임의의 수의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
웰 또는 채널의 형상은 임의의 특정한 방식으로 제한되지 않고, 사각형, 직사각형, 원형, 계란형, 타원형, 삼각형, 또는 형상의 임의의 조합일 수 있다. 웰 또는 채널의 다른 치수도 또한 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다. 예를 들어 채널의 깊이, 벽의 높이, 및 채널의 길이, 및 채널의 전반적 부피는 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
예를 들어, 채널의 길이, 높이, 및 너비는 약 0.1-1 mm, 또는 약 0.2-2 mm, 또는 약 0.3-3 mm, 또는 약 0.4-4 mm, 또는 약 0.5-5 mm, 또는 약 0.6-6 mm, 또는 약 0.7-7 mm, 또는 약 0.8-8 mm, 또는 약 0.9-9 mm, 또는 약 1-10 mm, 또는 그 초과일 수 있다.
채널의 표면은 또한 조직 배양 과정을 용이하게 할 수 있는 화학적 변형 (예컨대 예를 들어, 리간드, 하전된 물질, 결합제, 성장 인자, 항생제, 항진균제), 또는 물리적 변형 (예컨대 예를 들어, 스파이크, 만곡부, 폴드, 세공, 비평탄부, 또는 다양한 형상 및 토포그래피)을 비롯한 임의의 적합한 표면 처리에 의해 변형될 수 있다.
제3 측면의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템 내에서 시딩 및 배양될 수 있는 세포는 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 연골 세포, 피부 세포, 골수 세포, 또는 이러한 조직의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템은 심장 조직, 간 조직, 또는 신장 조직을 성장시키는데 적합하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 내에서 형성되는 조직은 3차원 조직이다.
제3 측면의 다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기 시스템은 줄기 세포, 또는 성숙한 조직 유형, 예를 들어 성숙한 심장, 간, 또는 신장 조직으로 발생할 수 있는 다른 전구 세포로 시딩될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 장치와의 사용을 위해 고려되는 줄기 세포는 임의의 정도의 효력을 가질 수 있으며, 전능/옴니포텐트 세포, 만능 세포, 다능 세포, 소기능 세포, 또는 단능 세포 (예를 들어, 전구 세포)를 포함한다.
심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 생물반응기 시스템의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 일반적으로 채널의 종축에 평행이거나 (생성되는 조직 가닥은 채널 내의 스캐폴드 상 및 그 주변에서 성장함), 또는 일반적으로 채널의 종축에 수직인 (생성되는 조직 가닥) 방향일 수 있다. 그러나, 전기장의 배향은 제한되지 않고, 전극의 위치설정은 적합한 전기장이 생성될 수 있도록 임의의 적합한 포맷일 수 있다. 특정 실시양태에서 (예를 들어 심장 세포), 전기장은 세포의 성숙을 용이하게 하여 실제 조직, 예를 들어 심장 조직의 생리학적 및 전기적 특성을 보다 밀접하게 모방한 조직을 형성한다.
제3 측면의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기는 복수개의 조직 가닥이 동시에 성장, 시험, 측정 및 평가 등이 될 수 있도록, 예를 들어 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트 포맷의 복수개의 개별 생물반응기로서 어셈블리될 수 있다.
제3 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 본 발명의 3차원 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히 제3 측면에 관한 것으로, 생물반응기 시스템은 특히 조직 가닥, 예를 들어 심장 조직 가닥의 수축력을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 측정은 제약 작용제, 유전자 변형, 이환 세포 또는 조직의 존재, 독소 또는 연구 하에서 조직의 생리학에 영향을 미칠 수 있는 작용제의 도입과 함께 이루어질 수 있다.
제3 측면의 바이오로드 시스템은 또한 히드로겔로 형성될 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 히드로겔은 다량의 물을 흡수할 수 있는 물리적 또는 화학적으로 가교된 중합체 네트워크이다. 이는 제조 방법, 전하, 및 기계적 및 구조적 특징을 비롯한 다양한 파라미터에 따라 상이한 카테고리로 분류될 수 있다. 히드로겔은 많은 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하고, 종종 비교적 온화한 조건 하에서 가공될 수 있고, 최소 침습 방식으로 전달될 수 있기 때문에 매력적인 스캐폴드 물질이다. 따라서, 히드로겔은 본원에서 스캐폴드 물질로서 사용될 수 있다. 히드로겔은 다른 물질 중에서, 풍부한 친수성 기를 갖는 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 천연 히드로겔 물질은 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난, 및 다른 자연 유래 중합체를 포함한다.
안지오칩 시스템
본원에서 사용될 수 있는 것과 같은 본 개시내용의 제4 측면의 생물반응기 시스템은 "안지오칩 시스템 또는 장치"로 지칭될 수 있고, 이는 본원에 기재된 특색 및 구성요소를 포함하는 생물반응기 시스템을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 안지오칩 시스템 내에서 형성된 조직 배양물은 "안지오칩 또는 바이오분지"로 지칭될 수 있다. 본원의 바이오튜브 시스템의 설명은 본 개시내용을 이들 측면 또는 임의의 특정한 실시양태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
제4 측면에서, 본 발명은 내부에 통합된 1개 이상의 내강 통로를 갖는 3차원 분지화된 조직 스캐폴드 또는 매트릭스 (예를 들어, 혈관화된 3차원 조직 구조를 모방함)를 포함하는, 3차원 조직을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 시딩된 세포를 성장시키기 위한 제1 부분 및 제1 부분을 통과하는 상호연결된 채널을 제공하기 위한 제2 부분을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상호연결된 채널은 제1 부분과 관련하여 관류가능하고, 생물학적 혈관계를 모방하도록 구성될 수 있다. 제1 부분은 1개 이상의 개방 영역 또는 챔버를 함유할 수 있고, 그에 의해 세포 및/또는 조직을 성장시키기 위한 챔버의 개방 네트워크가 제공된다. 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 또한 모든 구성요소 사이에 세공 또는 개방 연결부를 함유할 수 있다. 예를 들어, 개방 세공 또는 연결부는 세포를 성장시키기 위한 챔버의 개방 네트워크 사이에 위치할 수 있다. 또한, 개방 세공 또는 연결부는 1개 이상의 내강 통로와 함께 위치하거나 그와 통합될 수 있다. 개방 세공 또는 연결부는 생물반응기 시스템을 통한 세포, 배지, 성장 인자, 영양소, 및 폐기물의 이동을 용이하게 한다. 생물반응기는 생물반응기 시스템에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 한 방향일 수 있다.
제4 측면의 다양한 실시양태에서, 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있고, 이는 천연 물질, 예컨대 콜라겐 및 콜라겐 유도체, 천연 봉합 물질 (예를 들어, 동물 장), 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 프로테오글리칸, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌 등, 뿐만 아니라 다양한 중합체 및 나노물질을 비롯한 합성 물질 (예를 들어, POMac)을 포함할 수 있다.
제4 측면의 특정 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스에 사용하기 위한 생체적합물질로서 적절한 물질을 선택하기 위한 기준을 인지할 것이다. 이러한 선택은 다양한 파라미터를 기초로 할 수 있고, 이는 그의 물질 화학, 분자량, 용해도, 형상 및 구조, 친수성/소수성, 윤활성, 표면 에너지, 수분 흡수 분해, 및 부식 메카니즘, 특히 그의 변형성, 가요성, 및 굴곡성 등을 포함할 수 있다.
제4 측면의 특정 실시양태에서, 3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 중합체 스캐폴드로 제조될 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 일반적으로, 높은 표면-대-부피 비, 매우 작은 세공 크기에 의한 높은 다공성, 생분해, 및 기계적 특성과 같은 그의 고유한 특성으로 인해 큰 관심을 끌고 있다. 이는 조직 공학 및 기관 치환의 적용분야에서 유의한 생체적합성, 화학의 다용도성, 및 생물학적 특성의 특유한 이점을 제공한다.
3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 합성적 또는 생물학적, 분해성 또는 비분해성일 수 있다. 중합체의 특성은 그의 구성 거대분자의 조성, 구조, 및 배열에 따라 달라진다. 그의 구조적, 화학적, 및 생물학적 특징면에서 상이한 유형, 예를 들어 세라믹, 유리, 중합체 등으로 카테고리화될 수 있다. 자연 발생 중합체, 합성 생분해성, 및 합성 비생분해성 중합체는 모두 본 발명의 스캐폴드를 형성하기 위한 중합체로서 사용될 수 있다.
천연 중합체가 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 스캐폴드 요소로서 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 천연 물질은 생물활성 특성으로 인해, 본원에 기재된 생물학적 시스템 내에서 세포의 성능이 증진되게 하는, 잠재적으로 세포와 보다 우수한 상호작용을 가질 수 있다. 천연 중합체는 단백질 (실크, 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 엘라스틴, 케라틴, 액틴, 및 미오신), 폴리사카라이드 (셀룰로스, 아밀로스, 덱스트란, 키틴, 및 글리코사미노글리칸) 또는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA) 등 또는 이들 물질의 조합으로서 분류될 수 있다.
3차원 스캐폴드 또는 매트릭스는 또한 합성 생체적합물질을 포함할 수 있고, 이는 손상 또는 이환 조직의 구조 및 기능의 복원을 용이하게 할 수 있다. 합성 중합체는 그의 특성 (예를 들어, 다공성, 분해 시간, 및 기계적 특징)이 특정한 적용분야에 맞춰질 수 있기 때문에 생의학 분야에서 매우 유용하다. 합성 중합체는 종종 생물학적 스캐폴드보다 저렴하고; 균일하게 대량으로 생산될 수 있고, 긴 보관 시간을 갖는다. 많은 상업적으로 입수가능한 합성 중합체는 생물학적 조직의 그것과 대등한 물리화학적 및 기계적 특성을 나타낸다. 합성 중합체는 최대 군의 생분해성 중합체를 대표하며, 이는 제어된 조건 하에 생성될 수 있다. 이는 일반적으로, 예측가능하고 재현가능한 기계적 및 물리적 특성, 예컨대 인장 강도, 탄성률, 및 분해 속도를 나타낸다. PLA, PGA, 및 PLGA 공중합체는 조직 공학에서 특히 가장 통상적으로 사용되는 합성 중합체이다. PHA는 미생물 폴리에스테르 부류에 속하고, 조직 공학에서의 적용을 위해 점점 고려되고 있다. 모든 이들 합성 중합체가 본원에서 고려된다.
또한, 본 개시내용의 제4 측면의 생물반응기 시스템은 문헌 [Rosso et al., "Smart materials as scaffolds for tissue engineering," J Cell Physiol. 2006 Dec;209(3):1054]에 개시된 것과 같은 반합성물을 또한 사용할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 인테그린 결합 도메인, 성장 인자, 항트롬빈 서열, 플라스민 분해 부위, 및 형태발생 단백질에 특이적인 올리고펩티드 절단 서열을 함유할 수 있다. 이러한 반합성 물질은 합성 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 가공성, 기계적 강도) 및 천연 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 특이적 세포 인식, 세포 침습, 및 분화/증식 신호를 공급하는 능력) 둘 다를 갖는 "지능적" 반합성 생체적합물질을 부여하는 것을 목표로 한다. 그의 특징으로 인해, 이들 반합성 생체적합물질은 본원에 기재된 스캐폴드를 위한 물질의 공급원으로서의 역할을 하는데 있어서 임상적으로 유망한 신규한 다용도 부류의 생체모방 하이브리드 물질을 대표한다.
참조 기준으로서, 하기 중합체 및 물질이 본원에 기재된 제4 측면 생물반응기에서의 사용을 위해 고려된다:
PU: 폴리우레탄; PS: 폴리술폰; CP: 인산칼슘;
HA: 히알루론산; PP: 폴리프로필렌; BG: 생물활성 유리; ECM: 세포외 매트릭스;
PVA: 폴리비닐 알콜; PGA: 폴리글리콜리드; PLA: 폴리락티드; PPF: 폴리(프로필렌 푸마레이트);
PCA: 폴리시아노아크릴레이트; PCL: 폴리(ε-카프로락톤);
PDO: 폴리디옥사논; PHA: 폴리히드록시알카노에이트;
POE: 폴리(오르토 에스테르);
PEE: 폴리(에테르 에스테르);
PEO: 폴리(에틸렌 옥시드);
PBT: 폴리부틸렌 테레프탈레이트;
HAP: 히드록시아파타이트;
TCP: 인산삼칼슘;
PEG: 폴리(에틸렌 글리콜);
PEU: 폴리(에스테르 우레탄);
PAA: 폴리(아크릴산);
LDI: 리신 디이소시아네이트;
BCP: 2상 인산칼슘;
PAam: 폴리아크릴아미드;
PMMA: 폴리메틸메타크릴레이트;
PLLA: 폴리(L-락트산);
PLGA: 폴리(l-락티드-코-글리콜리드);
PTMC: 폴리(트리메틸렌 카르보네이트);
PDMS: 폴리디메틸실록산;
PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌;
PEVA: 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트);
PGCL: 폴리(글리콜리드-코-ε-카프로락톤);
PLCL: 폴리(l-락티드-코-카프로락톤);
PDLLA: 폴리(DL-락티드);
PLDLA: 폴리-L/D-락티드;
PLAGA: 폴리(락트산-글리콜산);
PHBHV: 폴리(3-히드록시부티레이트) 3-히드록시발레레이트;
PCLTMC: 폴리(카프로락톤-코-트리메틸렌 카르보네이트);
PNIPAAm: 폴리(N-이소프로필아크릴아미드);
PDMAEM: 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트) 히드로클로라이드;
PDLLA-CL: 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤);
PLLA-CL: 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤); 및
TCP: 인산삼칼슘.
POMac.
제4 측면의 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 스캐폴드 요소는 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 또는 폴리스티렌, 또는 그의 조합으로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다. 임의로 특정 실시양태에서, 스캐폴드 물질은 단백질, 약물, 영양소, 및 대사 폐기물을 비롯한 물 및 분자의 교환 및/또는 통과를 가능하게 하도록 관류가능할 수 있다.
통상의 기술자는 조직 공학 스캐폴드의 제조 및 사용과 관련하여 최신 기술에서 이용가능한 자원을 참조할 수 있고, 특히 문헌 [Dhandayuthapani et al., "Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science, Vol. 2011 (2011), pages 1-19]에 기재된 스캐폴드 물질을 참조할 수 있음을 인지할 것이다.
스캐폴드 매트릭스 및 그 내의 다양한 요소 (예를 들어, 통합된 내강 부분, 및 성장 챔버 또는 셀의 상호연결된 네트워크)의 형상, 두께, 길이, 배향, 및 표면 토포그래피 특성은 스캐폴드 또는 매트릭스가 3차원 조직의 성장을 지지할 수 있는 한 임의의 수의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
네트워크를 포함하는 웰 또는 성장 챔버의 형상은 임의의 특정한 방식으로 제한되지 않고, 사각형, 직사각형, 원형, 계란형, 타원형, 삼각형, 또는 형상의 임의의 조합일 수 있다. 웰 또는 채널의 다른 치수도 또한 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다. 예를 들어 채널의 깊이, 벽의 높이, 및 채널의 길이, 및 채널의 전반적 부피는 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
예를 들어, 셀의 길이, 높이, 및 너비는 약 0.1-1 mm, 또는 약 0.2-2 mm, 또는 약 0.3-3 mm, 또는 약 0.4-4 mm, 또는 약 0.5-5 mm, 또는 약 0.6-6 mm, 또는 약 0.7-7 mm, 또는 약 0.8-8 mm, 또는 약 0.9-9 mm, 또는 약 1-10 mm, 또는 그 초과일 수 있다.
셀, 웰, 또는 채널의 표면은 또한 조직 배양 과정을 용이하게 할 수 있는 화학적 변형 (예컨대 예를 들어, 리간드, 하전된 물질, 결합제, 성장 인자, 항생제, 항진균제), 또는 물리적 변형 (예컨대 예를 들어, 스파이크, 만곡부, 폴드, 세공, 비평탄부, 또는 다양한 형상 및 토포그래피)을 비롯한 임의의 적합한 표면 처리에 의해 변형될 수 있다.
제4 실시양태의 다양한 실시양태에서, 조직 배양 시스템은 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 연골 세포, 피부 세포, 골수 세포, 또는 이러한 세포의 조합으로부터 기초한 조직을 성장시키는데 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템은 심장 조직, 간 조직, 또는 신장 조직을 성장시키는데 적합하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 내에서 형성되는 조직은 3차원 조직이다.
제4 측면의 다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기 시스템은 줄기 세포, 또는 성숙한 조직 유형, 예를 들어 성숙한 심장, 간, 또는 신장 조직으로 발생할 수 있는 다른 전구 세포로 시딩될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 장치와의 사용을 위해 고려되는 줄기 세포는 임의의 정도의 효력을 가질 수 있으며, 전능/옴니포텐트 세포, 만능 세포, 다능 세포, 소기능 세포, 또는 단능 세포 (예를 들어, 전구 세포)를 포함한다.
심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 생물반응기 시스템의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 일반적으로 생물반응기 시스템의 종축에 평행인 방향일 수 있다. 그러나, 전기장의 배향은 제한되지 않고, 전극의 위치설정은 적합한 전기장이 생성될 수 있도록 임의의 적합한 포맷일 수 있다. 특정 실시양태에서 (예를 들어 심장 세포), 전기장은 세포의 성숙을 용이하게 하여 실제 조직, 예를 들어 심장 조직의 생리학적 및 전기적 특성을 보다 밀접하게 모방한 조직을 형성한다.
제4 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 본 발명의 3차원 조직 시스템, 장치, 및/또는 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다. 제4 측면의 특정 실시양태에서, 2개 이상의 생물반응기 시스템은 그들이 기능적으로 상호작용하도록 서로 연결될 수 있다. 서로, 예를 들어 연속해서 말단 대 말단으로 연결된 2개 이상의 생물반응기 시스템은 동일한 유형의 조직 또는 완전히 상이한 조직으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 심장 조직을 포함하는 제1 생물반응기 시스템이 간의 제2 생물반응기 시스템과 연속해서 연결된 시스템이 고려된다. 이러한 시스템 쌍은 제1의 2개의 시스템과 추가로 연속해서 연결된 1개 이상의 추가의 생물반응기 시스템으로 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 건강한 심장 조직을 포함하는 제1 생물반응기 시스템은 이환 심장 조직을 포함하는 제2 생물반응기 시스템과 연속해서 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 제1 조직을 포함하는 제1 생물반응기 시스템에 대해 약물, 독소, 또는 다른 시험 작용제의 효과를 시험할 수 있을 뿐만 아니라, 하류의 제2 생물반응기 시스템, 예를 들어 간 조직에 대해 대사된 약물, 독소, 또는 다른 작용제의 효과를 시험할 수 있다.
생물반응기의 스캐폴드 요소 및 다른 요소는 또한 히드로겔로 형성될 수 있다. 히드로겔은 다량의 물을 흡수할 수 있는 물리적 또는 화학적으로 가교된 중합체 네트워크이다. 이는 제조 방법, 전하, 및 기계적 및 구조적 특징을 비롯한 다양한 파라미터에 따라 상이한 카테고리로 분류될 수 있다. 히드로겔은 많은 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하고, 종종 비교적 온화한 조건 하에서 가공될 수 있고, 최소 침습 방식으로 전달될 수 있기 때문에 매력적인 스캐폴드 물질이다. 따라서, 히드로겔은 본원에서 스캐폴드 물질로서 사용될 수 있다. 히드로겔은 다른 물질 중에서, 풍부한 친수성 기를 갖는 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 천연 히드로겔 물질은 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난, 및 다른 자연 유래 중합체를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 복수개의 안지오칩 시스템은 연속해서 구성될 수 있으며, 그에 의하면 제1 안지오칩은 1가지 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 심장)으로 형성되고, 제2 "하류" 또는 "상류" 안지오칩은 제2 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 이환 심장 또는 간)으로 형성된다. 이러한 방식으로, 약물의 상호작용이 다중 기관 또는 조직 시스템과 관련하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 간 조직으로 제조된 안지오칩 내로 도입될 수 있고, 이는 심장 조직으로 제조된 하류의 제2 안지오칩에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 약물은 먼저 간 조직과 상호작용할 수 있고, 그로부터 생성된 임의의 대사 산물은 하류의 심장 조직 안지오칩으로 유동하여, 약물의 대사의 심장 기능에 대한 효과를 시험하는 것을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 체내 기관간 약물 상호작용을 시험하는데 사용하기 위한 탠덤 (즉, 연속) 방식으로 배열된 복수개의 안지오칩 장치를 고려한다. 조직의 임의의 고안되는 조합이 탠덤으로, 예를 들어 심장/간 또는 간/심장으로 시험될 수 있다.
안지오튜브 시스템
본원에서 사용될 수 있는 것과 같은 본 개시내용의 제5 측면의 생물반응기 시스템은 "안지오튜브 시스템 또는 장치"로 지칭될 수 있고, 이는 본원에 기재된 특색 및 구성요소를 포함하는 생물반응기 시스템을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 안지오칩 시스템 내에서 형성된 조직 배양물은 "안지오튜브"로 지칭될 수 있다. 본원의 안지오튜브 시스템의 설명은 본 개시내용을 이들 측면 또는 임의의 특정한 실시양태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
제5 측면에서, 본 개시내용은 수축력을 측정하는데 적합한, 조직 배양물, 예를 들어 3차원 조직 가닥을 성장시키기 위한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 생물반응기 시스템은 세포를 시딩하는데 적합한 웰 또는 채널, 및 1개 이상의 내강을 갖고, 웰 또는 채널 상에, 예를 들어 웰 또는 채널의 종축을 따라 지지되거나 현수된 관류가능한 스캐폴드를 포함한다. 또한, 관류가능한 스캐폴드는 관류가능한 스캐폴드의 종축을 따라 웰 또는 챔버 내에 배치되어 그 사이에 형성된 3차원 조직 가닥에 대한 적어도 2개의 고정점을 형성하도록 기능하고, 조직 가닥의 수축 상태에 반응하여 변형 또는 굴곡될 수 있는 1개 세트 또는 그 초과의 대향 스캐폴드 요소 (단일 스캐폴드 또는 별개의 스캐폴드로 형성될 수 있음)로 구성된다. 제5 측면의 생물반응기는 2개의 이러한 변형가능한 요소를 갖는 것으로 제한되지 않고, 2개 초과, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 이러한 요소를 포함할 수 있다. 각각의 대향 요소 주변 및 관류가능한 요소의 종방향 길이를 따라 형성되는 3차원 조직 가닥을 형성하는 능력이 존재하고, 조직 가닥이 대향 세트 또는 세트들의 스캐폴드 요소 사이에 배치되고 채널 또는 웰 상에 현수되도록 그들 사이를 연결시키는 한, 채널당 임의의 수의 요소가 제공될 수 있다.
스캐폴드 요소는 바람직하게는 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등이고, 이는 추가로 스캐폴드 요소에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘된 수축력의 측정이 가능하도록 구성된다.
제5 측면의 바람직한 실시양태에서, 각각의 웰 또는 채널은 한 세트 (2개) 또는 대향 스캐폴드 요소로 구성되고, 바람직하게는 그에 의해 단일 스캐폴드 요소가 웰 또는 채널의 종축의 대향 말단에 또는 그 근처에 배치된다.
세포가 적합한 성장 배지, 성장 인자, 및 세포의 배양에 적합한 다른 영양소와 함께 웰 또는 채널 내에 시딩되면, 세포는 성장하여 관류가능한 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소를 둘러싸고/거나 그와 통합된 조직 가닥을 형성한다. 사용 중에, 영양소 및 성장 인자, 뿐만 아니라 시험 작용제 (예를 들어, 약물, 단백질, 독소 등)는 이러한 물질을 전달하기 위한 수단 (예를 들어, 튜브 또는 관을 통해 내강에 연결된 저장 요소)과 통합된 관류가능한 내강을 통해 조직 가닥으로 전달될 수 있다. 또한, 생물반응기 시스템은 다양한 실시양태에서 관류가능한 내강으로부터 배출되는 통로, 예를 들어 폐기물 및 다른 대사 산물이 조직 가닥으로부터 관류가능한 내강 내로 및 말단 저장소 외로 확산되도록 하는 드레인 또는 다른 말단 저장소를 또한 포함할 수 있다. 심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 생물반응기의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 관류가능한 내강 요소의 길이를 따라 형성된 조직 가닥의 종축에 평행인 방향일 수 있다.
제5 측면의 특정 실시양태에서, 관류가능한 종방향 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소는 3차원 조직 가닥이 그 위에서 형성될 수 있도록 웰 또는 채널의 바닥 표면에서 들어올려진다.
제5 측면의 다양한 실시양태에서, 관류가능한 종방향 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소는 임의의 적합한 물질일 수 있고 (및 동일하거나 상이한 물질일 수 있고), 이는 천연 물질, 예컨대 콜라겐 및 콜라겐 유도체, 천연 봉합 물질 (예를 들어, 동물 장), 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 프로테오글리칸, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 히알루론산, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌 등, 뿐만 아니라 다양한 중합체 및 나노물질을 비롯한 합성 물질 (예를 들어, POMac)을 포함할 수 있다.
제5 측면의 특정 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 관류가능한 스캐폴드 또는 굴곡가능한 요소에 사용하기 위한 생체적합물질로서 적절한 물질을 선택하기 위한 기준을 인지할 것이다. 이러한 선택은 다양한 파라미터를 기초로 할 수 있고, 이는 그의 물질 화학, 분자량, 용해도, 형상 및 구조, 친수성/소수성, 윤활성, 표면 에너지, 수분 흡수 분해, 굴곡성/변형성, 및 부식 메카니즘을 포함할 수 있다.
제5 측면의 특정 실시양태에서, 관류가능한 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소는 중합체 스캐폴드일 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 일반적으로, 높은 표면-대-부피 비, 매우 작은 세공 크기에 의한 높은 다공성, 생분해, 및 기계적 특성과 같은 그의 고유한 특성으로 인해 큰 관심을 끌고 있다. 이는 조직 공학 및 기관 치환의 적용분야에서 유의한 생체적합성, 화학의 다용도성, 및 생물학적 특성의 특유한 이점을 제공한다.
관류가능한 스캐폴드 물질 및 굴곡가능한 요소는 합성적 또는 생물학적, 분해성 또는 비분해성일 수 있다. 중합체의 특성은 그의 구성 거대분자의 조성, 구조, 및 배열에 따라 달라진다. 그의 구조적, 화학적, 및 생물학적 특징면에서 상이한 유형, 예를 들어 세라믹, 유리, 중합체 등으로 카테고리화될 수 있다. 자연 발생 중합체, 합성 생분해성, 및 합성 비생분해성 중합체는 모두 본 발명의 스캐폴드를 형성하기 위한 중합체로서 사용될 수 있다.
천연 중합체가 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 관류가능한 스캐폴드 또는 굴곡가능한 요소로서 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 천연 물질은 생물활성 특성으로 인해, 본원에 기재된 생물학적 시스템 내에서 세포의 성능이 증진되게 하는, 잠재적으로 세포와 보다 우수한 상호작용을 가질 수 있다. 천연 중합체는 단백질 (실크, 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 엘라스틴, 케라틴, 액틴, 및 미오신), 폴리사카라이드 (셀룰로스, 아밀로스, 덱스트란, 키틴, 및 글리코사미노글리칸) 또는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA) 등 또는 이들 물질의 조합으로서 분류될 수 있다.
본 발명의 생물반응기 시스템에 사용되는 관류가능한 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소는 또한 합성 생체적합물질을 포함할 수 있고, 이는 손상 또는 이환 조직의 구조 및 기능의 복원을 용이하게 할 수 있다. 합성 중합체는 그의 특성 (예를 들어, 다공성, 분해 시간, 및 기계적 특징)이 특정한 적용분야에 맞춰질 수 있기 때문에 생의학 분야에서 매우 유용하다. 합성 중합체는 종종 생물학적 스캐폴드보다 저렴하고; 균일하게 대량으로 생산될 수 있고, 긴 보관 시간을 갖는다. 많은 상업적으로 입수가능한 합성 중합체는 생물학적 조직의 그것과 대등한 물리화학적 및 기계적 특성을 나타낸다. 합성 중합체는 최대 군의 생분해성 중합체를 대표하며, 이는 제어된 조건 하에 생성될 수 있다. 이는 일반적으로, 예측가능하고 재현가능한 기계적 및 물리적 특성, 예컨대 인장 강도, 탄성률, 및 분해 속도를 나타낸다. PLA, PGA, 및 PLGA 공중합체는 조직 공학에서 특히 가장 통상적으로 사용되는 합성 중합체이다. PHA는 미생물 폴리에스테르 부류에 속하고, 조직 공학에서의 적용을 위해 점점 고려되고 있다. 모든 이들 합성 중합체가 본원에서 고려된다.
또한, 본 개시내용의 제5 측면의 생물반응기 시스템은 문헌 [Rosso et al., "Smart materials as scaffolds for tissue engineering," J Cell Physiol. 2006 Dec;209(3):1054]에 개시된 것과 같은 반합성물을 또한 사용할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 인테그린 결합 도메인, 성장 인자, 항트롬빈 서열, 플라스민 분해 부위, 및 형태발생 단백질에 특이적인 올리고펩티드 절단 서열을 함유할 수 있다. 이러한 반합성 물질은 합성 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 가공성, 기계적 강도) 및 천연 물질에 의해 제공되는 이점 (예를 들어, 특이적 세포 인식, 세포 침습, 및 분화/증식 신호를 공급하는 능력) 둘 다를 갖는 "지능적" 반합성 생체적합물질을 부여하는 것을 목표로 한다. 그의 특징으로 인해, 이들 반합성 생체적합물질은 본원에 기재된 스캐폴드를 위한 물질의 공급원으로서의 역할을 하는데 있어서 임상적으로 유망한 신규한 다용도 부류의 생체모방 하이브리드 물질을 대표한다.
참조 기준으로서, 하기 중합체 및 물질이 본원에 기재된 제5 측면 생물반응기에서의 사용을 위해 고려된다:
PU: 폴리우레탄; PS: 폴리술폰; CP: 인산칼슘;
HA: 히알루론산; PP: 폴리프로필렌; BG: 생물활성 유리; ECM: 세포외 매트릭스;
PVA: 폴리비닐 알콜; PGA: 폴리글리콜리드; PLA: 폴리락티드; PPF: 폴리(프로필렌 푸마레이트);
PCA: 폴리시아노아크릴레이트; PCL: 폴리(ε-카프로락톤);
PDO: 폴리디옥사논; PHA: 폴리히드록시알카노에이트;
POE: 폴리(오르토 에스테르);
PEE: 폴리(에테르 에스테르);
PEO: 폴리(에틸렌 옥시드);
PBT: 폴리부틸렌 테레프탈레이트;
HAP: 히드록시아파타이트;
TCP: 인산삼칼슘;
PEG: 폴리(에틸렌 글리콜);
PEU: 폴리(에스테르 우레탄);
PAA: 폴리(아크릴산);
LDI: 리신 디이소시아네이트;
BCP: 2상 인산칼슘;
PAam: 폴리아크릴아미드;
PMMA: 폴리메틸메타크릴레이트;
PLLA: 폴리(L-락트산);
PLGA: 폴리(l-락티드-코-글리콜리드);
PTMC: 폴리(트리메틸렌 카르보네이트);
PDMS: 폴리디메틸실록산;
PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌;
PEVA: 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트);
PGCL: 폴리(글리콜리드-코-ε-카프로락톤);
PLCL: 폴리(l-락티드-코-카프로락톤);
PDLLA: 폴리(DL-락티드);
PLDLA: 폴리-L/D-락티드;
PLAGA: 폴리(락트산-글리콜산);
PHBHV: 폴리(3-히드록시부티레이트) 3-히드록시발레레이트;
PCLTMC: 폴리(카프로락톤-코-트리메틸렌 카르보네이트);
PNIPAAm: 폴리(N-이소프로필아크릴아미드);
PDMAEM: 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트) 히드로클로라이드;
PDLLA-CL: 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤);
PLLA-CL: 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤); 및
TCP: 인산삼칼슘.
POMac.
제5 측면의 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 관류가능한 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소는 폴리(디메틸실록산 (PDMS)), 폴리(메틸메타크릴레이트 (PMMA)), 폴리스티렌, 또는 폴리스티렌, 또는 그의 조합으로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다. 임의로 특정 실시양태에서, 스캐폴드 및 굴곡가능한 요소는 단백질, 약물, 영양소, 및 대사 폐기물을 비롯한 물 및 분자의 교환 및/또는 통과를 가능하게 하도록 관류가능할 수 있다.
통상의 기술자는 조직 공학 스캐폴드의 제조 및 사용과 관련하여 최신 기술에서 이용가능한 자원을 참조할 수 있고, 특히 문헌 [Dhandayuthapani et al., "Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science, Vol. 2011 (2011), pages 1-19]에 기재된 스캐폴드 물질을 참조할 수 있음을 인지할 것이다.
웰 또는 채널의 형상은 임의의 특정한 방식으로 제한되지 않고, 사각형, 직사각형, 원형, 계란형, 타원형, 삼각형, 또는 형상의 임의의 조합일 수 있다. 웰 또는 채널의 다른 치수도 또한 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다. 예를 들어 채널의 깊이, 벽의 높이, 및 채널의 길이, 및 채널의 전반적 부피는 임의의 적합한 방식으로 달라질 수 있다.
예를 들어, 채널의 길이, 높이, 및 너비는 약 0.1-1 mm, 또는 약 0.2-2 mm, 또는 약 0.3-3 mm, 또는 약 0.4-4 mm, 또는 약 0.5-5 mm, 또는 약 0.6-6 mm, 또는 약 0.7-7 mm, 또는 약 0.8-8 mm, 또는 약 0.9-9 mm, 또는 약 1-10 mm, 또는 그 초과일 수 있다.
채널의 표면은 또한 조직 배양 과정을 용이하게 할 수 있는 화학적 변형 (예컨대 예를 들어, 리간드, 하전된 물질, 결합제, 성장 인자, 항생제, 항진균제), 또는 물리적 변형 (예컨대 예를 들어, 스파이크, 만곡부, 폴드, 세공, 비평탄부, 또는 다양한 형상 및 토포그래피)을 비롯한 임의의 적합한 표면 처리에 의해 변형될 수 있다.
제5 측면의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템 내에서 시딩 및 배양될 수 있는 세포는 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 연골 세포, 피부 세포, 골수 세포, 또는 이러한 조직의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 조직 배양 시스템은 심장 조직, 간 조직, 또는 신장 조직을 성장시키는데 적합하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 내에서 형성되는 조직은 3차원 조직이다.
제5 측면의 다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기 시스템은 줄기 세포, 또는 성숙한 조직 유형, 예를 들어 성숙한 심장, 간, 또는 신장 조직으로 발생할 수 있는 다른 전구 세포로 시딩될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 장치와의 사용을 위해 고려되는 줄기 세포는 임의의 정도의 효력을 가질 수 있으며, 전능/옴니포텐트 세포, 만능 세포, 다능 세포, 소기능 세포, 또는 단능 세포 (예를 들어, 전구 세포)를 포함한다.
심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 생물반응기 시스템의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 일반적으로 채널의 종축에 평행이거나 (생성되는 조직 가닥은 채널 내의 관류가능한 스캐폴드 상 및 그 주변에서 성장함), 또는 일반적으로 채널의 종축에 수직인 (생성되는 조직 가닥) 방향일 수 있다. 그러나, 전기장의 배향은 제한되지 않고, 전극의 위치설정은 적합한 전기장이 생성될 수 있도록 임의의 적합한 포맷일 수 있다. 특정 실시양태에서 (예를 들어 심장 세포), 전기장은 세포의 성숙을 용이하게 하여 실제 조직, 예를 들어 심장 조직의 생리학적 및 전기적 특성을 보다 밀접하게 모방한 조직을 형성한다.
제5 측면의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기는 복수개의 조직 가닥이 동시에 성장, 시험, 측정 및 평가 등이 될 수 있도록, 예를 들어 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트 포맷의 복수개의 개별 생물반응기로서 어셈블리될 수 있다.
제5 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 본 개시내용의 3차원 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
제5 측면의 특정 실시양태에서, 2개 이상의 생물반응기 시스템은 그들이 기능적으로 상호작용하도록 서로 연결될 수 있다. 서로, 예를 들어 연속해서 말단 대 말단으로 연결된 2개 이상의 생물반응기 시스템은 동일한 유형의 조직 또는 완전히 상이한 조직으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 심장 조직을 포함하는 제1 생물반응기 시스템이 간의 제2 생물반응기 시스템과 연속해서 연결된 시스템이 고려된다. 이러한 시스템 쌍은 제1의 2개의 시스템과 추가로 연속해서 연결된 1개 이상의 추가의 생물반응기 시스템으로 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 건강한 심장 조직을 포함하는 제1 생물반응기 시스템은 이환 심장 조직을 포함하는 제2 생물반응기 시스템과 연속해서 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 제1 조직을 포함하는 제1 생물반응기 시스템에 대해 약물, 독소, 또는 다른 시험 작용제의 효과를 시험할 수 있을 뿐만 아니라, 하류의 제2 생물반응기 시스템, 예를 들어 간 조직에 대해 대사된 약물, 독소, 또는 다른 작용제의 효과를 시험할 수 있다.
스캐폴드의 배향, 특히 종방향 요소 및/또는 굴곡가능한 요소의 배향은 웰내 성장 챔버의 배향에 대해 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 성장 챔버는 종방향 요소의 배향과 일반적으로 수직으로 배향될 수 있는 일반적으로 종방향 성장 챔버일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 종방향 요소는 성장 챔버의 배향에 대해 일반적으로 수직 배향으로 배향될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 종방향 요소 및/또는 굴곡가능한 요소는 성장 챔버의 배향에 대해 일반적으로 평행 배향으로 배향될 수 있다. 다른 실시양태에서, 종방향 요소 및/또는 굴곡가능한 요소는 성장 챔버의 배향에 대해 일반적으로 대각선 배향으로 배향될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 복수개의 종방향 요소를 포함하는 스캐폴드는, 성장 챔버 내에 시딩된 세포가 조직 가닥으로 배양됨에 따라 조직 가닥이 웰과 접촉하고 있는 종방향 요소 및 굴곡가능한 요소의 전체 또는 적어도 부분 상에서 성장하도록, 생물반응기의 복수개의 웰에 부착 (영구적 또는 가역적) 또는 장착 (영구적 또는 가역적)된다. 즉, 종방향 요소 및 굴곡가능한 요소는 조직 가닥의 세포에 의해 캡슐화되거나, 또는 종방향 요소의 적어도 부분은 조직 가닥의 세포에 의해 캡슐화되거나 적어도 그에 접촉되고, 종방향 요소는 서로 확고하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "확고하게 연결된"은 조직 가닥의 이동 (예를 들어, 심장 조직의 박동)이 굴곡가능한 요소의 이동에 반영되도록 조직 가닥과 종방향/굴곡가능한 요소 사이에 확립된 연결을 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 굴곡가능한 요소는 일반적으로 동일한 배향, 예를 들어 서로 평행이고, 종방향 요소와 수직일 수 있다. 다른 실시양태에서, 굴곡가능한 요소는 일반적으로 교차 포맷으로 배열될 수 있다. 다른 실시양태에서, 굴곡가능한 요소는 사인곡선, 지그-재그, 곡선 등의 형태를 취할 수 있다.
종방향 요소에 대한 굴곡가능한 요소의 부착, 및 생물반응기 플레이트의 웰에 대한 종방향 요소의 부착은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 접착제, 용접, 또는 다른 기계적 수단에 의해 이루어질 수 있다. 웰과 종방향 요소 사이의 부착 지점은 규칙적, 무작위, 연속적, 또는 비연속적일 수 있다.
종방향 요소는 또한 특정 실시양태에서 영양소, 대사 폐기물, 단백질, 또는 심지어 전세포의 통과를 가능하게 하는 관류가능한 물질을 포함할 수 있다. 관류가능성은 요소를 형성하는데 사용된 물질의 특성을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해, 또는 요소를 형성하는 물질에 1개 이상의 세공을 형성하는 것에 의해 확립될 수 있다. 이는 챔버의 교차 부분 사이에 분할 밀봉 또는 부분 밀봉을 효과적으로 형성하도록 성장 챔버를 횡단하는 종방향 요소를 위치시키는 특정 실시양태에서 유용할 수 있다. 즉, 종방향 요소는 특정 실시양태에서 채널의 베이스에 접촉하지 않으면서 (즉, 단지 채널의 측면에 대한 연결만 형성함) 성장 채널의 너비에 걸쳐 현수될 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 종방향 요소는 성장 채널과 종방향 요소 사이에 연결 (또는 복수개의 연결)이 생성되는 방식으로 성장 챔버를 통과할 수 있다. 관류가능한 물질은 영양소, 대사 폐기물, 및 심지어 전세포의 자유로운 이동이 종방향 요소가 챔버와 접촉하는 지점을 비롯한 성장 챔버 내에서 자유롭게 이동하도록 할 것이다.
생물반응기 구성요소 (예를 들어, 반응기 몸체, 뚜껑, 커버, 성장 챔버, 스캐폴드, 종방향 요소, 굴곡가능한 요소 등)는 다양한 중합체 (FDA 승인받은 것 포함), 예컨대 폴리락톤, 예컨대 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(글리콜리드) (PGA), 및 그의 공중합체 (PLGA), PDMS (폴리(디메틸실록산)), PMMA (폴리(메틸 메타크릴레이트)), 및 생분해성 중합체, 예컨대 POMac (폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트, 1,8-옥탄디올, 시트레이트 산, 및 말레산 무수물 유닛의 혼합물)를 비롯한 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 문헌 [Tran et al., "Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism," Soft Matter, Jan 1, 2010; 6(11): 2449-2461]을 참조할 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 중합체는 임의의 적합한 자연 발생 중합체 (예컨대 비제한적으로 셀룰로스, 실크, 쉘락, 고무 또는 그의 유도체) 또는 임의의 적합한 합성 중합체 (나일론, 폴리비닐 클로라이드 (PVC 또는 비닐), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴로니트릴, PVB, 실리콘 및 그의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 중합체는 생물반응기 내에서의 조직의 성장 및/또는 유지를 용이하게 할 수 있는 추가의 구성요소, 예컨대 리간드, 항체, 하전된 분자, 소수성 분자 등에 의해 공유적으로 또는 비공유적으로 변형될 수 있다. 특정한 유형의 중합체, 그의 변형 등은 본원에 기재된 바와 같은 각각의 적용에 내재된 중요한 물리적, 질량 수송, 및 생물학적 설계 변수를 다루기 위한 적절한 물질을 발견하는데 달려있음이 인지될 것이다.
스캐폴드 요소 및 생물반응기의 다른 요소는 또한 히드로겔로 형성될 수 있다. 히드로겔은 다량의 물을 흡수할 수 있는 물리적 또는 화학적으로 가교된 중합체 네트워크이다. 이는 제조 방법, 전하, 및 기계적 및 구조적 특징을 비롯한 다양한 파라미터에 따라 상이한 카테고리로 분류될 수 있다. 히드로겔은 많은 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하고, 종종 비교적 온화한 조건 하에서 가공될 수 있고, 최소 침습 방식으로 전달될 수 있기 때문에 매력적인 스캐폴드 물질이다. 따라서, 히드로겔은 본원에서 스캐폴드 물질로서 사용될 수 있다. 히드로겔은 다른 물질 중에서, 풍부한 친수성 기를 갖는 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 천연 히드로겔 물질은 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난, 및 다른 자연 유래 중합체를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 복수개의 안지오튜브 시스템은 연속해서 구성될 수 있으며, 제1 안지오튜브는 1가지 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 심장)으로 형성되고, 제2 "하류" 또는 "상류" 안지오튜브는 제2 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 이환 심장 또는 간)으로 형성된다. 이러한 방식으로, 약물의 상호작용이 다중 기관 또는 조직 시스템과 관련하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 간 조직으로 제조된 안지오튜브 내로 도입될 수 있고, 이는 심장 조직으로 제조된 하류의 제2 안지오튜브에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 약물은 먼저 간 조직과 상호작용할 수 있고, 그로부터 생성된 임의의 대사 산물은 하류의 심장 조직 안지오튜브로 유동하여, 약물의 대사의 심장 기능에 대한 효과를 시험하는 것을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 체내 기관간 약물 상호작용을 시험하는데 사용하기 위한 탠덤 (즉, 연속) 방식으로 배열된 복수개의 안지오튜브 장치를 고려한다. 조직의 임의의 고안되는 조합이 탠덤으로, 예를 들어 심장/간 또는 간/심장으로 시험될 수 있다.
세포/조직
개시된 장치는 임의의 세포, 예컨대 심장 조직, 골격근 조직, 평활근 조직, 간 조직, 신장 조직, 연골 조직, 피부, 골수 조직, 또는 이러한 조직의 조합 등으로부터의 세포로부터 유래된 조직과 함께 사용될 수 있다. 3차원 조직을 성장시키는데 사용되는 세포는 임의의 상업적 공급원을 비롯하여 어느 곳에서나 공급될 수 있거나, 또는 심지어 개별 대상체 또는 환자로부터 공급될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 가닥은 상업적으로 입수가능한 간 세포주의 시드로부터 시작하여 성장할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 조직 가닥은 대상체로부터 직접적으로 수득된 세포, 예를 들어 생검으로부터 단리된 세포의 시드로부터 시작하여 성장할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 3차원 조직은 상이한 세포의 혼합물로부터 성장할 수 있다. 이러한 세포의 혼합물은 동일하거나 상이한 조직으로부터의 건강 또는 이환 세포의 혼합물, 상이한 공급원 또는 환자로부터의 세포의 혼합물, 또는 둘 다의 환자 및 상업적 공급원으로부터의 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조직을 성장시키는데 사용되는 세포는 또한 유전자 조작된 세포, 예컨대 약물-저항성 또는 약물-감수성 조작된 세포주, 또는 GFP와 같은 다양한 바이오마커를 발현하는 것을 비롯한 다른 유형의 유전자 조작된 세포일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 임의의 장치에 의해 제조되는 본 발명의 3차원 조직은 심근세포, 예를 들어 인간 심근세포를 사용하여 제조되거나 성장될 수 있다. 심근세포는 지이 헬스케어 라이프사이언시스(GE Healthcare Lifesciences), 3H 바이오메디칼(3H Biomedical), 사이언셀 리서치 래보러토리즈(Sciencell Research Laboratories)와 같은 공급원으로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 세포는 특정한 마커, 예컨대 예를 들어 b-미오신 중쇄; a-심장 액틴; 트로포닌 I; 트로포닌 T; 근육-특이적 중간 필라멘트 단백질, 데스민; 심근세포-특이적 펩티드 호르몬, 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP); 및 커플링된 간극 연접 단백질, 코넥신-43 및 코넥신-40을 발현하는 것으로서 특징화될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 3차원 조직을 성장시키는데 사용되는 세포는 배아 줄기 세포 ("ESC"), 태아 줄기 세포 ("FSC"), 및 성체 (또는 체성) 줄기 세포 ("SSC")를 비롯한 줄기 세포일 수 있다. 효력 잠재력과 관련하여 줄기 세포는 전능 (일명 옴니포텐트) (배아 및 배아외 세포 유형으로 분화될 수 있는 줄기 세포), 만능 줄기 세포 (거의 모든 세포로 분화될 수 있음), 다능 줄기 세포 (다수의 세포 유형으로 분화될 수 있음), 소기능 줄기 세포 (단지 소수의 세포 유형으로 분화될 수 있음), 또는 단능 세포 (단지 1개의 세포 유형만을 생성할 수 있음)일 수 있다. 줄기 세포는 상업적으로 수득될 수 있거나, 환자로부터 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터 직접적으로 수득/단리될 수 있다.
본원에 사용된 "발생상 덜 강력한 세포"는 제한된 다계열 분화를 할 수 있거나 또는 단계열, 조직-특이적 분화를 할 수 있는 세포이며, 예를 들어 비처리 중간엽 줄기 세포는 특히 골세포 및 연골세포, 즉 중간엽 계열의 세포로 분화될 수 있지만, 다른 계열 (예를 들어, 신경 계열)의 세포로의 분화에 대해 단지 제한된 능력을 갖는다.
본원에 사용된 "발생상 보다 강력한 세포"는 그의 상응하는 발생상 덜 강력한 세포보다 더 다양한 세포 유형으로 용이하게 분화될 수 있는 세포이다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포는 골세포 및 연골세포로 용이하게 분화될 수 있지만, 신경 또는 망막 계열 세포로의 분화에 대해 단지 제한된 능력을 갖는다 (즉, 이와 관련해서는 발생상 덜 강력한 세포임). 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 중간엽 줄기 세포는, 특정 실시양태에서 예를 들어 중간엽-계열 및 신경-계열 세포 유형으로 용이하게 분화될 수 있기 때문에 발생상 보다 강력해질 수 있고; 세포의 가소성은 본 발명의 방법에 따라 처리된 경우에 증가된다.
본 발명의 장치에서 형성되는 조직은 전형적으로 1개 이상의 유형의 기능적, 중간엽 또는 실질 세포, 예컨대 평활근 또는 골격근 세포, 근세포 (근육 줄기 세포), 섬유모세포, 연골세포, 지방세포, 섬유근모세포, 외배엽 세포, 예컨대 관 및 피부 세포, 간세포 및 다른 간 세포 (예를 들어, 동모양혈관 간 내피 세포, 쿠퍼 세포 및 간 성상 세포), 신장 세포, 췌장섬 세포, 장 내에 존재하는 세포, 및 다른 실질 세포, 폐 내에 존재하는 세포, 골모세포 및 골 또는 연골을 형성하는 다른 세포, 및 조혈 세포를 포함할 것이다. 일부 경우에, 신경 세포를 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 혈관계는 전형적으로 내피 세포로부터 형성될 것이다. "실질 세포"는 프레임워크 또는 기질과 구별되는 바와 같은 기능적 기관 요소를 포함한다. "중간엽 세포"는 결합 및 지지 조직, 평활근, 혈관 내피 및 혈액 내의 세포를 포함한다.
장치는 또한 궁극적으로 3차원 조직을 형성하는 목적하는 세포의 시딩 전에, 장치의 외부 또는 내강내 (특정 실시양태에서) 표면 상에 내피 층을 성장시키기 위해 내피 세포주로 사전-시딩될 수 있다.
세포는 생검에 의해 수득되거나 또는 살아있는 공여자, 세포 배양물 또는 부검체로부터 수거될 수 있으며, 모든 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 세포는 바람직하게는 자기이다. 이식될 세포는 콜라게나제, 트립신 또는 다른 프로테아제 용액으로 소화시키는 것과 같은 표준 기술을 사용하여 해리될 수 있고, 이어서 즉시 또는 배양물 중에서 유지된 후에 몰드 또는 중합체 스캐폴드 내로 시딩된다. 세포는 추가의 또는 정상 기능을 제공하기 위해 정상이거나 또는 유전자 조작될 수 있다. 면역 불활성 세포, 예컨대 배아 또는 태아 세포, 줄기 세포, 및 면역억제에 대한 필요를 회피하기 위해 유전자 조작된 세포가 또한 사용될 수 있다. 면역억제를 위한 방법 및 약물은 이식 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
미분화 또는 부분적으로 분화된 전구체 세포가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 배아 배세포 (Gearhart, et al., 미국 특허 번호 6,245,566), 배아 줄기 세포 (Thomson, 미국 특허 번호 5,843,780 및 6,200,802), 중간엽 줄기 세포 (Caplan, et al., 미국 특허 번호 5,486,359), 신경 줄기 세포 (Anderson, et al., 미국 특허 번호 5,849,553), 조혈 줄기 세포 (Tsukamoto, 미국 특허 번호 5,061,620), 다능 성체 줄기 세포 (Furcht, et al., WO 01/11011)를 사용할 수 있으며, 상기는 모두 참조로 포함된다. 세포는 섬유모세포 피더 층과의 공동-배양에 의해 (Thomson, 미국 특허 번호 5,843,780 및 6,200,802), 또는 섬유모세포 조건화 배지를 사용한 피더-무함유 배양에 의해 (Xu, et al. Nat. Biotechnol., 19, 971 (2001)) 미분화 상태로 유지될 수 있다. 미분화 또는 부분적으로 분화된 전구체 세포는 성장 인자 또는 다른 세포-유형 특이적 유도 인자 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 작용제를 함유하는 배지에서의 배양에 의해 특정한 발생 경로 아래로 유도될 수 있다. 이러한 인자의 일부 예는 혈관 내피 성장 인자; 소닉 헷지호그; 인슐린-유사 성장 인자 II; 오스테오게닌; 세포독성 T 세포 분화 인자; 베타-카테닌; 골 형태발생 단백질 2; 인터류킨 2; 형질전환 성장 인자 베타; 신경 성장 인자; 인터류킨 I; 섬유모세포 성장 인자 2; 레티노산; 및 Wnt3을 포함한다.
줄기 세포는 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 것일 수 있고, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 말초 혈액 줄기 세포 및 심장 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다. "줄기 세포"는 자기-재생가능한 세포 분열을 거쳐 불확정 기간 동안 표현형상 및 유전형상 동일한 딸세포를 생성할 수 있고, 궁극적으로 적어도 1종의 최종 세포 유형으로 분화될 수 있는 만능, 다능 또는 전능 세포이다.
본질적인 줄기 세포는, 비제한적으로 자기-재생가능하고 다능 및/또는 만능인 분화 잠재력을 갖기 때문에 임의의 기관, 조직 유형 또는 세포 유형으로 발생하는 능력을 보유하는 배아성 줄기 세포 (ES)이다. 이들 세포는 배반포의 내부 세포 매스로부터 유래될 수 있거나, 또는 이식후 배아로부터의 원시 배세포 (배아성 배세포 또는 EG 세포)로부터 유래될 수 있다. ES 및 EG 세포는 마우스로부터 유래되며, 보다 최근에는 또한 비-인간 영장류 및 인간으로부터 유래된다. 문헌 [Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Matsui et al. (1991) Nature 353:750-2; Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:7844-8; Thomson et al. (1998) Science 282:1145-1147; and Shamblott et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-31].
용어 "줄기 세포," "배아 줄기 세포," "성체 줄기 세포," "전구 세포" 및 "전구 세포 집단"은 임의의 성체 조직 또는 기관 공급원으로부터 유래될 수 있고, 미분화 또는 계열 수임 세포로서 복제될 수 있고, 적어도 1종, 바람직하게는 다중, 세포 계열로 분화되는 잠재력을 갖는 세포로서 본 발명에 따른 의미로 이해되어야 한다.
본 발명의 생물반응기 장치가 제조된 후에, 장치 그 자체 또는 장치와 통합된 스캐폴드 물질 (예를 들어, 통합된 채널 / 혈관계를 갖는 단일 와이어 스캐폴드, 이중 와이어 스캐폴드, 중공 관상 스캐폴드, 3차원 스캐폴드)에 목적하는 세포 또는 세포의 세트가 시딩될 수 있다. 세포는 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Teebken, et al., Eur J. Vasa Endovasc. Surg. 19, 381 (2000); Ranucci, et al., Biomaterials 21, 783 (2000)]에 공지된 방법을 사용하여 규칙적 방식으로 장치 또는 스캐폴드 상에 시딩될 수 있다. 또한, 조직-조작 장치는 문헌 [Burg et al., J. Biomed. Mater. Res 51, 642 (2000)]의 방법을 사용하여 세포를 중합체 스캐폴드 도처에 시딩하고, 세포가 이식 전의 미리 결정된 양의 시간 동안 시험관내에서 증식되게 하는 것에 의해 개선될 수 있다.
본 발명의 목적상, "동물 세포"는 내피 세포, 실질 세포, 골수 세포, 조혈 세포, 근육 세포, 골모세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 배아 줄기 세포, 또는 섬유모세포를 포함할 수 있다. 실질 세포는 심장, 간, 췌장, 장, 뇌, 신장, 생식 조직, 폐, 근육, 골수 또는 줄기 세포를 비롯하여, 임의의 기관으로부터 유래될 수 있다.
한 실시양태에서, 몰드 또는 중합체 스캐폴드는 먼저 실질 세포, 예컨대 간세포 또는 근위 세관 세포, 또는 내피 세포의 층으로 시딩된다. 집단의 배가를 수득하기 위해, 이러한 층은 일정 기간, 예를 들어 1주 가량 동안 배양물 중에 유지될 수 있다. 이는 내부의 세포에 대한 충분한 산소 공급을 보장하기 위해 관류 생물반응기 내에 유지될 수 있다.
세포의 세트는 본 발명의 3차원 기구/장치 내에 첨가 또는 시딩될 수 있고, 이는 첨가 또는 시딩된 세포에 의한 세포 부착 및 성장을 위한 템플릿으로서의 역할을 할 수 있다. 첨가 또는 시딩된 세포는 실질 세포, 예컨대 간세포 또는 근위 세관 세포일 수 있다. 줄기 세포가 또한 사용될 수 있다. 제2 세트의 세포, 예컨대 내피 세포는 제1 세트의 세포를 시딩하는데 사용된 것 외의 다른 관을 통해 어셈블리된 기구 상에 첨가 또는 시딩될 수 있다. 세포 시딩은 느린 유동에 의해 수행된다. 실제로, 기구의 기하구조는 유량을 결정할 것이다. 일반적으로, 내피 세포는 진입하여 약 10-50 .mu.m인 마이크로기계화 채널 내에 관 벽을 형성할 수 있다. 따라서, 기관을 위한 기계적 프레임워크로서의 역할을 하는 것에 더하여, 어셈블리된 기구는 기관의 모든 마이크로구조적 복잡성을 위한 템플릿을 제공하며, 셀은 그 자체를 위치시키고 하위시스템, 예컨대 간 내 혈관을 형성하기 위한 기계적 지도를 갖는다.
분자, 예컨대 성장 인자 또는 호르몬은 장치/스캐폴드의 표면에 물리적으로 포획되거나 공유적으로 부착되어 (예를 들어, 흡수에 의해) 그 상에서 배양되는 세포의 성장, 분열, 분화 또는 성숙이 일어난다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 생물반응기 시스템의 장치/스캐폴드는 장치/스캐폴드를 구성하는 중합체에 직접적으로 통합된 (예를 들어, 공유적 또는 비-공유적 상호작용), 예를 들어 중합체 물질과 공유 또는 비-공유 결합을 형성하는, 성장 인자 및 호르몬 및 다른 적합한 조직 배양 작용제와 같은 물질을 포함할 수 있고, 이는 중합체의 벌크 가공 동안 첨가될 수 있다.
제조 방법
다양한 실시양태에서, 개시된 장치는 임의의 적합한 마이크로제작 기술을 사용하여 어셈블리 및/또는 제조될 수 있다. 이러한 방법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 예시적인 제작 방법이 본원에 제공된 실시예에 예시된다.
본원에 개시된 생물반응기 장치를 제조하는데 사용될 수 있는 마이크로제작 공정은 리소그래피; 에칭 기술, 예컨대 레이저, 플라즈마 에칭, 포토리소그래피, 또는 화학적 에칭, 예컨대 습식 화학, 건조, 및 포토레지스트 제거; 또는 3차원 인쇄 (3DP), 스테레오리소그래피 (SLA), 선택적 레이저 소결 (SLS), 탄도 입자 제조 (BPM) 및 융합 증착 모델링 (FDM)을 비롯한 고체 유리 형태 기술에 의하는 것; 마이크로기계화에 의하는 것; 규소의 열 산화; 전기도금 및 무전해 도금; 확산 공정, 예컨대 붕소, 인, 비소, 및 안티모니 확산; 이온 이식; 필름 증착, 예컨대 증발 (필라멘트, 전자 빔, 플래쉬, 및 섀도잉 및 단차 피복), 스퍼터링, 화학 증착 (CVD), 에피택시 (증기 상, 액체 상, 및 분자 빔), 전기도금, 스크린 인쇄, 적층 또는 그의 조합에 의하는 것을 포함한다. 문헌 [Jaeger, Introduction to Microelectronic Fabrication (Addison-Wesley Publishing Co., Reading Mass. 1988); Runyan, et al., Semiconductor Integrated Circuit Processing Technology (Addison-Wesley Publishing Co., Reading Mass. 1990); Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987-1998; Rai-Choudhury, ed., Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication (SPIE Optical Engineering Press, Bellingham, Wash. 1997)]을 참조한다. 몰드로서 사용되는 물질의 선택은 분지화 구조를 형성하기 위해 표면을 구성하는 방법을 결정한다. 하기 방법은 몰드를 제조하는데 바람직하다.
예를 들어, 포토리소그래피 공정 및 반도체 산업으로부터 유래된 방법을 사용하는 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS)의 제작을 위한 최신 기술이 사용될 수 있다. 보다 최근에 개발된 방법은 "소프트 리소그래피" (Whitesides et al, Angew chem. Int ed, 37; 550-575, (1998)) 및 마이크로유체 구축학 (미국 특허 번호 6,488,872, Beebe et al., Nature; 404:588-59 (2000))을 포함한다. 중합체 마이크로장치 제작의 검토 및 다른 논의는 문헌 [Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization; 2nd ed.; CRC Press: Boca Raton, 1997; Becker, H., and Locascio, L. E. "Polymer microfluidic devices." Talanta, 56(2):267-287, 2002; Quake, S. R., and Scherer, A. "From micro- to nanofabrication with soft materials." Science, 290(5496):1536-1540, 2000; and Whitesides, G. M., and Stroock, A. D. "Flexible methods for microfluidics." Physics Today, 54(6):42-48, 2001]을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 장치를 제작하는데 마이크로스테레오리소그래피 기술이 또한 고려된다. 마이크로스테레오리소그래피는 집속 광원을 광활성 단량체와 합체시킨 기술이며 (Chatwin, C., Farsari, M., Huang, S. P., Heywood, M., Birch, P., Young, R., and Richardson, J. "UV microstereolithography system that uses spatial light modulator technology." Applied Optics, 37(32):7514-7522, 1998; Cumpston, B. H., Ananthavel, S. P., Barlow, S., Dyer, D. L., Ehrlich, J. E., Erskine, L. L., Heikal, A. A., Kuebler, S. M., Lee, I. Y. S., McCord-Maughon, D., Qin, J. Q., Rockel, H., Rumi, M., Wu, X. L., Marder, S. R., and Perry, J. W. "Two-photon polymerization initiators for three-dimensional optical data storage and microfabrication." Nature, 398(6722):51-54, 1999; Neckers, D. C., Hassoon, S., and Klimtchuk, E. "Photochemistry and photophysics of hydroxyfluorones and xanthenes." Journal of Photochemistry and Photobiology A--Chemistry, 95(1):33-39, 1996)), 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 서로의 상부에서 순차적인 단면 층을 경화시키는 것은 3차원 구조를 생성한다. 종종, 이러한 공정은 평행 제작을 매우 용이하지 않게 하고, 고해상도 마이크로구조 제작을 위해서는 상대적으로 긴 시간이 요구된다. 이러한 공정은 본 발명의 장치를 제작하는데 사용될 수 있다.
개시된 장치는 또한 중합체 장치 제작을 위한 또 다른 전략인 고온 엠보싱을 수반하는 기술을 고려하며 (Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization; 2nd ed.; CRC Press: Boca Raton, 1997; Becker, H., and Heim, U. "Hot embossing as a method for the fabrication of polymer high aspect ratio structures." Sensors and Actuators A--Physical, 83(1-3):130-135, 2000), 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 이는 엠보싱 도구로 공지되어 있는 금속 또는 반도체 스탬프 또는 몰드를 필요로 하며, 이는 중합체 기판의 유리 전이 온도를 초과하여 가열된다. 상기 도구에 압력이 가해지고, 연화된 중합체에 네가티브 토포그래피가 전사된다. 시스템이 냉각되고, 스탬프가 제거되고, 중합체는 엠보싱 도구의 릴리프 구조를 보유한다. 이는 매우 해상된 설계로 이어지지만, 원본 도구를 마이크로기계화하기 위해서는 시설이 요구된다. 또한, 설계는 1개의 층으로 제한되고, 다중 층은 정확한 정렬에 의해 함께 적층되어야 한다
본 발명은 또한 개시된 장치를 제작하기 위해 소프트 리소그래피를 사용할 수 있다. 소프트 리소그래피는 다양한 특정 기술을 포괄한다. 일반적으로, 이들 공정은 포토리소그래피를 필요로 하지 않고; 중합체를 비롯한 다수의 상이한 표면 상에 특색을 패턴화하기 위해 엘라스토머 마스터 (종종 폴리(디메틸실록산), PDMS)가 임의의 릴리프 구조로 제조되고 사용된다 (Anderson, J. R., Chiu, D. T., Jackman, R. J., Cherniavskaya, O., McDonald, J. C., Wu, H. K., Whitesides, S. H., and Whitesides, G. M. "Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping." Analytical Chemistry, 72(14):3158-3164, 2000; Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., and Whitesides, G. M. "Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)." Analytical Chemistry, 70(23):4974-4984, 1998; Love, J. C., Anderson, J. R., and Whitesides, G. M. "Fabrication of three-dimensional microfluidic systems by soft lithography." MRS Bulletin, 26(7):523-528, 2001; Wu, H. K., Odom, T. W., Chiu, D. T., and Whitesides, G. M. "Fabrication of complex three-dimensional microchannel systems in PDMS." Journal of the American Chemical Society, 125(2):554-559, 2003; xia, Y. N., and Whitesides, G. M. "Soft lithography." Annual Review of Materials Science, 28:153-184, 1998). 전반적 방법은 다수의 특정 기술 (예를 들어, 마이크로접촉 인쇄, 복제 몰딩 (REM), 마이크로전사 몰딩, 모세관내 마이크로몰딩 (MIMIC), 및 용매-보조 마이크로몰딩 (SAMIM) (Xia, Y. N., and Whitesides, G. M. "Soft lithography." Annual Review of Materials Science, 28:153-184, 1998))으로 분류되어 있다. 그러나, 소프트 리소그래피 방법에 포함되는 개개의 기술은 모두, 종종 표면 마이크로기계화 실리콘 웨이퍼인, 릴리프 구조로부터의 PDMS 마스터의 제작을 필요로 한다. 각각의 이들 기술은 개시된 장치를 마이크로제작하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.
마이크로몰딩 기술이 또한 고려된다. 마이크로몰딩 기술은 널리 공지되어 있고 (Anderson, J. R., Chiu, D. T., Jackman, R. J., Cherniavskaya, O., McDonald, J. C., Wu, H. K., Whitesides, S. H., and whitesides, G. M. "Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping." Analytical Chemistry, 72(14):3158-3164, 2000; Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., and Whitesides, G. M. "Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)." Analytical Chemistry, 70(23):4974-4984, 1998; Wu, H. K., Odom, T. W., Chiu, D. T., and Whitesides, G. M. "Fabrication of complex three-dimensional microchannel systems in PDMS." Journal of the American Chemical Society, 125(2):554-559, 2003; Hanemann, T., Ruprecht, R., and Hausselt, J. H. "Micromolding and photopolymerization." Advanced Materials, 9(11):927-929, 1997), 이들 각각은 참조로 포함된다. 간략하게, 기술은 PDMS 몰드의 오목 영역을 단량체 또는 중합체 용액으로 채우고, 용액을 경화 또는 증발시켜 중합체를 고체화하는 것을 수반한다. 이들 방법에서, 몰드의 네가티브 전사가 수득된다. 마지막으로, 마스터가 제거되고, 이는 동일한 방식으로 재사용될 수 있다. 다른 소프트 리소그래피 기술과 마찬가지로, 각각의 층은 개별 마스터를 필요로 한다. 또한, 많은 경우에, 인접한 층이 물리적으로 부착된다. 대안적으로, 다층 PDMS 구조의 경우에 인접한 층은 접촉 시 공유 결합하며, 이는 접촉 전 정확한 정렬이 중요함을 시사한다.
스텝-및-플래쉬 임프린트 리소그래피 (S-FIL)가 또한 고려된다. S-FIL은 기계적 각인인쇄를 기초로 하는 나노패턴화의 또 다른 기술이지만, 액체 레지스트로서 UV 경화성 액체 물질을 사용한다. S-FIL에 의하면, 액체 레지스트는 기판 상에 액적 형태로 분배되고, 이어서 템플릿을 기판과 접촉시키고 기판에 대고 눌러 액체 레지스트가 스프레드되게 함으로써, 액체 레지스트 필름을 형성한다. 이어서 이러한 필름을 UV 광에의 노출에 의해 경화시킨다. S-FIL은 실온에서 수행될 수 있고, 따라서 통상적인 NIL과 같이 고온을 필요로 하지 않는다. 그러나, S-FIL은 S-FIL에 사용되는 통상적인 UV 경화성 액체 물질이 전형적으로 아크릴 관능성 단량체 및 올리고머의 자유 라디칼 중합을 수반하는 메카니즘을 기초로 하기 때문에 여전히 이상적이지 않다. UV 경화성 액체 물질은 경화 후에 전형적으로 광범위한 수축을 나타낸다. 또한, UV 경화성 액체 물질은 산소 감수성인 경향이 있고, 그에 의해 산소는 유리 라디칼 종을 스캐빈징하고, 레지스트 필름 표면에서의 중합을 억제한다. 그 결과, 레지스트 필름은 레지스트 필름에 형성된 결과물 패턴에서 결함을 생성하는 경향이 있다.
광중합체의 직접 포토리소그래피가 또한 고려된다. 이러한 기술은 중합체 마이크로장치의 제작을 위한 강건한 방법이다. 이러한 기술의 가장 통상적인 적용은 임의의 포토리소그래피 적용을 위한 포토레지스트의 사용에서 이다. 대부분의 포토레지스트는 3종의 구성요소: 레지스트를 기판 상에 스프레딩시키기 위한 용매, 에천트에 저항하는 유기 중합체, 및 UV 방사선에 노출되면 중합체의 반응 또는 용해를 유발하는 (화학 및 가공 단계에 의존함) 광증감제를 함유한다 (Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization; 2nd ed.; CRC Press: Boca Raton, 1997). 패턴화된 레지스트는 간단한 장치로서 사용될 수 있거나, 또는 또 다른 중합체를 위한 네가티브 몰드로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 소프트 리소그래피 기술을 위한 릴리프 구조). 목적하는 중합체가 레지스트 몰드에서 경화되면, 레지스트는 이어서 표준 방법을 통해 제거될 수 있다.
미국 특허 번호 6,488,872 (Beebe et al.)는 마이크로스케일 유체 채널을 갖는 기판으로 제조된 마이크로제작 장치에 관한 것으로, 비브(Beebe) 등의 마이크로스케일 유체 채널은 약 1 마이크로미터 내지 약 1 밀리미터의 단면 직경을 갖고, 그에 개시된 기술은 본 발명에 적용될 수 있으며 본원에 참조로 포함된다. 중합체 구성요소는 액체 상 중합성 혼합물의 직접 포토패턴화를 통해 카트리지 내부에 생성된다. 비브 등은 함께 가까이 있는 (즉 대략 300 마이크로미터) 구조는 물체 사이에서 발생하는 부분적인 중합으로 인해 전형적으로 동시에 제작하지 않는다고 언급하고 있다. 비브 및 동료들은 (Khoury, C., Mensing, G. A., and Beebe, D. J. "Ultra rapid prototyping of microfluidic systems using liquid phase photopolymerization." Lab On a Chip, 2(1):50-55, 2002; Beebe, D. J., Moore, J. S., Yu, Q., Liu, R. H., Kraft, M. L., Jo, B. H., and Devadoss, C. "Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(25):13488-13493, 2000; Beebe, D. J., Moore, J. S., Bauer, J. M., Yu, Q., Liu, R. H., Devadoss, C., and Jo, B. H. "Functional hydrogel structures for autonomous flow control inside microfluidic channels." Nature, 404(6778):588-590, 2000) 다관능성 단량체의 광중합을 사용하여 마이크로유체 시스템을 위한 채널, 밸브, 및 펌프를 제작하였다. 특히, 비브 등은 다양한 밸브 및 센서 설계를 위해 히드로겔 네트워크 (즉, 물의 존재 하에 팽윤되는 느슨하게 가교된 친수성 중합체)를 소수성 중합체 채널 내로 합체시켰다. 거시적 네트워크에서의 팽윤 동역학은 밸브 작업을 위해 매우 느리지만, 마이크로스케일에서 표면적 대 부피 비에서의 유의한 증가는 히드로겔 밸브의 상대적으로 신속한 작동을 용이하게 한다--대략 수초 (De, S. K., Aluru, N. R., Johnson, B., Crone, W. C., Beebe, D. J., and Moore, J. "Equilibrium swelling and kinetics of pH-responsive hydrogels: Models, experiments, and simulations." Journal of Microelectromechanical Systems, 11(5):544-555, 2002). 다른 그룹은 채널 내에서의 단일체의 직접 광중합을 사용하여 마이크로유체 밸브 (Hasselbrink, E. F., Shepodd, T. J., and Rehm, J. E. "High-pressure microfluidic control in lab-on-a-chip devices using mobile polymer monoliths." Analytical Chemistry, 74(19):4913-4918, 2002; Kirby, B. J., Shepodd, T. J., and Hasselbrink, E. F. "Voltage-addressable on/off microvalves for high-pressure microchip separations." Journal of Chromatography A, 979(1-2):147-154, 2002), 및 개별 또는 조합 화학 플랫폼 (Peters, E. C., Svec, F., Frechet, J. M. J., Viklund, C., and Irgum, K. "Control of porous properties and surface chemistry in "molded" porous polymer monoliths prepared by polymerization in the presence of TEMPO." Macromolecules, 32(19):6377-6379, 1999; Tripp, J. A., Svec, F., and Frechet, J. M. J. "Grafted macroporous polymer monolithic disks: A new format of scavengers for solution-phase combinatorial chemistry." Journal of Combinatorial Chemistry, 3(2):216-223, 2001)을 형성하였다.
특정 실시양태에서, 규소, 탄소 및 질소를 함유하는 멀티비닐 단량체성 전구체 물질 (즉, 세라세트(Ceraset))이 마이크로제작을 위해 사용될 수 있다. (Yang, H., Deschatelets, P., Brittain, S. T., and Whitesides, G. M. "Fabrication of high performance ceramic microstructures from a polymeric precursor using soft lithography." Advanced Materials, 13(1):54-58, 2001; Liew, L. A., Zhang, W. G., Bright, V. M., An, L. N., Dunn, M. L., and Raj, R. "Fabrication of SiCN ceramic MEMS using injectable polymer-precursor technique." Sensors and Actuators A--Physical, 89(1-2):64-70, 2001; Liew, L. A., Liu, Y. P., Luo, R. L., Cross, T., An, L. N., Bright, V. M., Dunn, M. L., Daily, J. W., and Raj, R. "Fabrication of SiCN MEMS by photopolymerization of pre-ceramic polymer?" Sensors and Actuators A--Physical, 95(2-3):120-134, 2002; Liew, L. A., Saravanan, R. A., Bright, V. M., Dunn, M. L., Daily, J. W., and Raj, R. "Processing and characterization of silicon carbon-nitride ceramics: application of electrical properties towards MEMS thermal actuators." Sensors and Actuators A--Physical, 103(1-2):171-181, 2003; Seok, W. K., and Sneddon, L. G. "Synthesis and ceramic conversion reactions of decaborane-CERASET polymers: New processable precursors to SiC/Si3N4/BN ceramics." Bulletin of the Korean Chemical Society, 19(12):1398-1402, 1998). 직접 포토리소그래피 UV 노출에 의한 광중합 후에, 마이크로제작 중합체는 열분해되어 고온 적용의 경우에 유용성을 갖는 무정형 Si--C--N 세라믹을 생성할 수 있다.
마이크로기계화는 약 50 내지 300 밀리미터 (mm), 바람직하게는 대략 100 mm 범위의 직경, 및 약 200 내지 1200 μm 범위의 두께의 표준 벌크 단결정 실리콘 웨이퍼 상에서 수행될 수 있다. 이들 웨이퍼는 다수의 표준 반도체 물질 판매업체로부터 수득될 수 있고, 절삭 및 연마되어 정확한 치수, 균일한 결정학적 배향, 및 고도로 연마된 광학적으로 편평한 표면을 제공한다. 파이렉스 보로실리케이트 또는 다른 유리로부터 제조된 웨이퍼를 또한 획득할 수 있고, 유리질 물질을 에칭하는데 사용되는 대안적 공정을 사용하여 마이크로기계화 공정에 삽입할 수 있다.
본 발명의 생물반응기 장치의 기하구조, 특히 요구되는 상이한 특색 깊이의 수는 제작을 위한 특정 공정 순서를 결정하는데 있어서의 인자이다. 가장 간단한 경우는 몰드에 대한 단일 깊이 치수의 경우이다. 구체적으로, 실리콘 기판의 경우에, 공정 순서는 다음과 같다: 먼저, 실리콘 웨이퍼를 세정하고, 감광성 물질의 층을 표면에 도포한다. 전형적으로, 층을 높은 회전 속도로 회전시켜 균일한 두께의 코팅을 수득한다. 포토레지스트를 베이킹한 다음, 웨이퍼를 반투명 마스크를 통해 자외선 또는 다른 단파장 광에 노출시킨다. 이 단계는 목적하는 영상 해상도에 따라 여러 차폐 기술 중 어느 하나를 사용하여 달성할 수 있다. 이어서 적절한 현상제 화학으로 레지스트를 현상시킨 다음, 웨이퍼를 하드-베이킹하여 레지스트로부터 잉여량의 용매를 제거한다. 리소그래피 공정이 완료되면, 여러 가능한 화학 중 하나를 사용하여 웨이퍼를 플라즈마 반응기 내에서 에칭할 수 있다. 에칭은 2차원 패턴을 제3 차원으로: 웨이퍼에 명시된 깊이를 전사하는 역할을 한다. 플라즈마 파라미터는 생성된 트렌치의 목적하는 형상 (반원형, 직선벽 프로파일, 각진 측벽)에 의해, 뿐만 아니라 차폐 포토레지스트 상의 실리콘에 대한 에천트의 선택성에 의해 결정된다. 에칭이 완료되면, 포토레지스트를 제거하고 조직 몰딩 공정에 사용하기 위한 웨이퍼를 제조할 수 있다.
본 발명은 본원에서 구체적으로 확인된 것 및 본원에서 명백하게 개시되지는 않았지만 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 임의의 다른 적합한 마이크로제작 공정을 비롯하여, 본 발명의 장치를 제조하기 위한 임의의 적합한 마이크로제작 공정을 고려한다.
적용분야
본 발명의 3차원 조직 시스템은 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에 유용하다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 3차원 조직 시스템은 다양한 조직 구조의 배양 및 생성에 적합할 수 있다. 개시된 장치는 생체내에서 발견되는 본래의 조직 아키텍처를 모방하거나 재현한 시험관내 플랫폼을 제공하기 위해, 세포가 그것이 정상적으로 생체내에서와 같은 방식으로 성숙 및 기능하도록 하기 위해 설계될 수 있다.
다른 실시양태에서, 개시된 장치는 근육 세포, 예컨대 심근세포, 골격근 세포, 평활근 세포를 비롯한 다양한 조직 뿐만 아니라 흥분성 조직, 예컨대 뉴런, 및 풍부한 혈관계를 필요로 할 수 있는 세포, 특히 간세포의 배양을 위해 적합할 수 있다.
다른 실시양태에서, 개시된 장치는 다른 적용분야 중에서도 시험관내 약물 시험을 비롯한 다양한 적용분야, 여러 상이한 구획을 갖는 인간-온-어-칩의 구축, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 환자 내로의 직접 문합술 및 이식에 적합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 3차원 조직 조작 시스템은 시험 작용제의 대사, 독성 및 효능을 시험하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 독성을 평가하는데 필요한 정보를 비롯한 정보를 수득하기 위해, 미지의 대사 또는 약동학 프로파일을 갖는 실험 약물 또는 "시험 작용제"를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 독성은 종종 약물-대-약물 상호작용의 결과로서 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시험 작용제와 공지의 약물 또는 다른 시험 작용제의 조합을 연구하는데 사용될 수 있다. 많은 환자가 다중 약물로 치료받기 때문에, 이들 방법은 임상 설정에서의 사용과 특히 관련된다.
일반적으로, 시험 작용제는 본 발명의 3차원 조직 조작 시스템에 의해, 치료적일 것으로 추정되는 투여량 범위로, 효과 (예를 들어, 대사 효과 또는 독성 또는 효능을 나타내는 효과)를 생성하는데 충분한 지속기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 시간은 약 1시간 내지 24시간의 범위일 수 있거나, 또는 필요에 따라 수일 또는 심지어 수주 동안 연장될 수 있다. 인큐베이션 조건은 전형적으로 약 37℃의 배양 온도 및 선택된 특정한 세포 유형과 상용가능한 배양 배지를 비롯하여, 관련 기술분야에 공지된 표준 배양 조건을 수반한다.
본 발명의 방법에 따라 분석될 수 있는 시험 작용제는 오피오이드 진통제, 항염증 약물, 예컨대 항히스타민제 및 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 이뇨제, 예컨대 탄산 안히드라제 억제제, 루프 이뇨제, 고효능 이뇨제, 티아지드 및 티아지드-유사 작용제, 및 칼륨-보존성 이뇨제, 신장 및 심혈관계에 영향을 미치는 작용제, 예컨대 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, 심장 약물, 예컨대 유기 니트레이트, 칼슘 채널 차단제, 교감신경차단제, 혈관확장제, .베타.-아드레날린성 수용체 효능제 및 길항제, .알파.-아드레날린성 수용체 효능제 및 길항제, 강심성 글리코시드, 항부정맥 약물, 고지단백혈증에 영향을 미치는 작용제, 예컨대 3-히드록시메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 억제제, 항신생물제, 예컨대 알킬화제, 항대사물, 천연 생성물, 항생제 및 다른 약물, 면역조절제, 항당뇨병제, 및 항미생물제, 예컨대 항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제, 항원충제, 및 항기생충제를 포함하나, 이들 작용제로 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본 발명의 3차원 조직 시스템은 치료제와 연관된 독성 (예를 들어, 약물 투여와 연관된 심장-독성, 또는 간 독성)을 검출/평가하는데 사용될 수 있다. 독성의 3가지 일반적인 부류가 존재한다. 급성 독성은 약물에의 노출 후 약 24시간 미만에 발생하는 독성 효과이다. 아급성 독성은 더 늦게, 약물에의 노출 후 약 14 내지 90일에 발생한다. 만성 독성은 약물에의 약 90일 (또는 그 초과) 노출 후에 발생한다. 관련 기술분야에서의 현행 방법은 살아있는 대상체에서의 연장된 모니터링 기간을 필요로 하기 때문에 아급성 및 만성 독성을 검출하는데 사용하기에 준최적이다. 본 발명의 방법은 이들 보다 긴 노출 간격을 포괄할 수 있는 한편, 효과를 보다 신속하게 검출할 수 있어서, 시험 작용제에 대한 인큐베이션 시간을 연장할 필요가 없다. 따라서, 인큐베이션 시간은 약 1시간 내지 24시간의 범위일 수 있거나, 또는 필요에 따라 수일 또는 심지어 수주 동안 연장될 수 있다.
시험 작용제의 투여에 의해 유발되는 바람직하지 않은 독성 효과는 여러 방식으로 스크리닝될 수 있다. 본 발명의 조직 조작 시스템은 시험 작용제의 독성 선량측정의 범위를 결정하는데 사용될 수 있다. 관심 조직에 대한 증가하는 농도의 시험 작용제 (즉, 용량)의 효과를 모니터링하여 독성을 검출할 수 있다. 독성 효과가 관찰되는 경우에, 이는 시험 작용제 농도/세포 cm2의 척도로 동일화할 수 있다. 조직 조작 시스템 내에서 세포의 분포에 따라 독성 농도를 계산함으로써, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이를 살아있는 시스템에 외삽시켜 다양한 체중 및 발생 단계의 대상체에서의 독성 용량을 추정할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여, 다양한 용량의 개별 시험 작용제 및 다른 제약과 시험 작용제의 조합물을 스크리닝하여, 불규칙 대사, 심장독성, 간 독성, 발암성, 신장 및 신경 독성 및 세포 사멸을 포함하나 이에 제한되지는 않는 독성 효과를 검출할 것이다. 대사에서의 불규칙한 변화를 검출하기 위해, 글루코스 대사를 포함하나 이에 제한되지는 않는 대사물 생산을 검정하기 위한 관련 기술분야에 공지되어 있는 표준 방법 및 효소적 검정을 사용할 수 있다. 검정되는 특정한 대사 경로 또는 측정되는 대사물은 선택된 조직 유형에 따라 달라질 수 있다.
발암성을 검출하는데 있어서, 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 유전자 발현에서의 변화, 단백질 수준, 항원 결정기를 포함하나 이에 제한되지는 세포 표면 마커의 발현에서의 증식 및 변화를 야기하는 비정상 세포 주기를 검출하는 방법을 사용하여 형질전환된 표현형에 대해 스크리닝될 수 있다. 유전자 발현 패턴은, 예를 들어 표준 혼성화 기술, 예컨대 RT-PCR, 계내 혼성화, 및 형광 계내 혼성화 (FISH), 노던 분석 또는 마이크로칩-기반 분석에 따라 관심 유전자의 mRNA 수준을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있다. 단백질 발현 패턴은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 정량적 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역형광, 및 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 아미노산 서열 분석 및/또는 단백질 농도 검정에 의해 결정될 수 있다. 세부사항에 대해서는, 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조한다. 세포 카운팅 및/또는 분리 기술, 예컨대 FACS 분석이 증식을 측정하거나 이상 세포 표면 마커 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
터널 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 표준 방법이 또한 세포 사멸을 검출하는데 사용될 수 있다. 독성학 스크리닝을 위한 시험관내 독성학의 전통적인 접근법은 락테이트 데히드로게나제 방출과 같은 세포 사멸 과정에서의 비교적 후기 사건을 측정하거나, 또는 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)로부터 입수가능한 생체 염료, 예컨대 트리판 블루, 4,6-디아미노페닐인돌 (DAPI), 아이오딘화프로피듐, 및 생/사 염색을 사용하여 생존 및 사멸 세포를 차별적 카운팅하였다. 생체내 치사율의 예측은 이러한 유형의 시험관내 스크린의 한가지 제안되는 적용이지만, 세포 사멸은 독성제에의 급성 노출 후에 동물의 사망을 유도하는 통상적인 메카니즘이 아니다. 대조적으로, 카스파제 활성화는 만성 독성, 세포 사멸, 과다증식 및 염증 반응의 통상적인 특색의 중심에 있다. 카스파제 활성화는 형광 분광분석법에 의해 독성 손상 후 비교적 신속하게 (30분 내지 4시간) 측정될 수 있어서, 이는 그 자체가 고처리량 스크리닝 기술로 이어진다. 세포의 아폽토시스 또는 괴사를 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 다른 마커 및 검정은, 영향을 받은 세포의 형질 막의 외층 상의 포스파티딜세린의 존재, 아넥신 V 염색, 및 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 닉-말단 표지 검정 (터널)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법을 사용하여, 다양한 용량의 개별 시험 작용제 및 시험 작용제 조합물을 다양한 유전적 배경을 갖는 조직으로 구성된 패널에서 스크리닝하여 시험 작용제의 약물유전학 독성 프로파일을 결정할 것이다. 예를 들어, 시험 작용제의 다중 용량, 또는 그와의 조합물을 1종 이상의 유전적 배경에 특이적인 독성 효과에 대해 스크리닝할 것이다. 유전적 분산에 대해 스크리닝될 독성 효과는 불규칙 대사, 발암성, 및 세포 사멸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조직 조작 장치는 상이한 대사 효소의 현재 공지된 유전자 다형성의 포괄적 어레이를 생성하기 위해 동시에 변형될 수 있다. 두드러진 예는 CYP450 모노옥시게나제 시스템으로, 여기서 집단은 약물 대사, 약물 클리어런스, 및 독성의 예측 모델에 영향을 미치고 복잡하게 하는 다중 이소형 및 다형성을 포함한다. 예를 들어, 티우퓨린, 예컨대 티오구아닌의 대사에서, 속도-제한 효소는 상이한 다형체 형태를 갖는 메틸트랜스퍼라제이다. 메틸트랜스퍼라제에서의 다형성은 티오퓨린의 대사에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 다형성이 티오퓨린의 보다 느린 대사를 발생시키는 경우는 임상 이익이 감소되고, 다형성이 증가된 대사 속도를 발생시키는 경우는 독성이 생길 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 효소, 예컨대 메틸트랜스퍼라제의 다양한 다형체 형태의 존재 하에 다양한 시험 작용제의 대사 프로파일을 결정하는데 사용될 수 있다.
다형성 변이 또는 다른 유전적 결함으로 인한 차별적 독성을 시험하는데 있어서, 약물 대사 및 독성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있는 특정 효소의 유전자 녹아웃 또는 녹인을 포함하는 유전자 조작된 세포를 본 발명의 시스템에 사용할 수 있다. 세포는 통상의 기술자에게 공지된 기술, 예컨대 특히 RNA 간섭 (RNAi), 안티센스 기술, 리보자임, 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 변형될 수 있다.
대사에 대한 효과를 평가하는 경우에, 대사물의 수준이 공지되어 있다면, 이는 대사 활성의 반영으로서 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법, 예컨대 액체 크로마토그래피를 사용하여 검출될 수 있다. 탠덤 질량 분광측정 검출과 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC/MS/MS)는 조기 흡수, 분포, 대사 및 제거 시험을 모니터링하기 위한 분석 방법으로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 뛰어난 감수성, 특이성 및 높은 샘플 처리량을 제공한다. 삼중 사중극자 기기 상에서의 반응 모니터링에 의해 제공되는 정량적 선택성은 높은 크로마토그래피 해상도 또는 광범위한 샘플 세정이 필요하지 않게 한다. 높은-샘플-밀도 마이크로타이터 플레이트와 조합된 자동화 샘플-가공 기술, 예컨대 온-라인 칼럼 스위칭을 사용하여 분석 처리량을 추가로 최대화할 수 있다. 최신 LC/MS/MS는 또한 단지 최소 수량의 생물학적 매트릭스를 사용하여 ml당 나노그램-미만 범위 아래로 확장된 검출 한계를 제공한다.
LC/MS/MS는 신규한 약물 후보의 신속 및 감수성 정량화 뿐만 아니라 대사물에 대한 중요한 구조적 정보를 제공하는 것을 가능하게 한다. 전체 스캔 LC/MS 분석은 관찰된 이온 종에 기초하여 가능한 산화 및/또는 접합성 대사 변환을 초기에 제시할 수 있다. MS/MS 모드에서, 기기는 선택된 관심 전구체 이온에 대해 조정될 수 있고, 이는 이어서 추가로 단편화되어 대사를 고유하게 확인하는 생산을 형성한다 (생산 스캔).
선택성은 일련의 전극에 의해 경계지어진 공간 내에 이온을 "트랩"하는 장치인 사중극자 이온 트랩에 의해 추가로 증진될 수 있다. 이온 트랩의 고유한 특색은 MS/MS 실험 (또는, 사실상, 멀티-단계 MS 실험)이 단일 질량 분석기 내에서 시간상 순차적으로 수행되어 풍부한 구조적 정보를 생성할 수 있다는 것이다. 하이브리드 사중극자-비행시간 (Q-TOF) LC/MS/MS 시스템이 또한 대사물 프로파일의 특징화에 사용될 수 있다. Q-TOF의 구성은 다양한 스캔 모드에서 질량 분해 및 질량 정확도에서의 높은 감수성을 생성한다.
핵 자기 공명 분광분석법과 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC-NMR)는 절대 분자 배위를 확인하는 방법을 제공한다. 선형 이온-트랩 질량 분광계는 유의하게 증진된 생산-스캐닝 능력을 보유하는 한편, 삼중 사중극자 MS의 모든 스캔 기능을 보유한다. 푸리에 변환 이온-사이클로트론 공명 MS (FI-ICRMS)의 초-고도 해상도 및 감수성은 생물학적 혼합물의 분석 및 특징화에 유용할 수 있다. 데이터 처리 및 해석 소프트웨어 패키지는 또한 본 발명의 조직 조작 장치를 사용하여 대사물의 효율적인 확인 및 정량화를 가능하게 한다.
시험관내 약물 대사를 연구하기 위해 널리 사용되는 방법은 조직 균질물의 사용이다. 본 발명의 3차원 시스템 내의 조직은 시험 작용제의 존재 하에 배양 및 수거되어, 효소 분석에서의 사용을 위한 조직 균질물 제제를 수득할 수 있다. 조직 균질물의 제조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 조직 균질화 단계 및 약물 대사에서 상용적으로 연구되는 2가지 주요 분획: 미토콘드리아-후 상청액 및 세포질 세망 (마이크로솜) 분획을 생성하기 위한 세포하 분획화 단계를 수반한다.
본 발명의 3차원 조직 배양 장치는 또한 시험 작용제의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 효능은 본 발명의 3차원 시스템 내에서 성장한 손상된 조직을 포함하는 질환 모델의 복구, 증진, 개선 및/또는 재생과 연관된 개개의 파라미터를 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 질환 모델에서, 손상은 유발될 수 있거나, 또는 유전성 유전적 이상과 관련된 상태를 비롯한 조직 공여자의 기존의 상태의 결과일 수 있다. 유발된 상태 또는 기존 상태는 이전의 약물 노출로부터 발생한 약화된 상태를 포함할 수 있다. 시험 작용제 또는 시험 작용제의 조합물은 본 발명의 질환 모델에서 효능에 대해 분석될 수 있다.
한 실시양태에서, 선택된 관심 조직은 세포 손상을 유발하여 (예를 들어, 독소, 돌연변이유발원, 방사선, 감염원 및 화학적 작용제) 조직에서 손상을 유도하기 위해 관련 기술분야에 공지된 작용제에 의해 처리될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택된 관심 조직은 질환 상태를 유도하기 위해 표준 재조합 기술을 사용하여 변경될 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합 기술을 사용하여 세포 내에 트랜스진을 삽입할 수 있거나, 또는 관심 유전자의 유전자 발현을 "녹아웃"시킬 수 있다. 상동 재조합의 검토를 위해, 문헌 [Lewin, B., Genes V, Oxford University Press, New York, 1994, pp. 968-997; and Capecchi, M., (1989) Science 244:1288-1292; Capecchi, M., (1989) Trends Genet. 5 (3):70-76]을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 선택된 관심 조직은 단일 유전자 결함 또는 다인성 결함일 수 있는 유전성 유전적 결함의 결과로서 손상된다. 유전성 장애의 논의에 대해서는, 문헌 [Thompson, McInnes and Willard, Genetics in Medicine, 5.sup.th Ed., W.B. Saunders Company, 1991]을 참조한다.
본 발명의 조직 조작 시스템은 시험 작용제의 효과적인 선량측정 범위를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 관심 조직에 대한 증가하는 농도의 시험 작용제 (즉, 용량)의 효과를 모니터링하여 효능을 검출할 수 있다. 치료 효과가 관찰되는 경우에, 이는 농도/세포 cm2의 척도로 동일화될 수 있다. 조직 조작 시스템 내에서 세포의 분포에 따라 유효 농도를 계산함으로써, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이를 살아있는 시스템에 외삽시켜 다양한 체중의 대상체에서의 치료 용량을 추정할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여, 다양한 용량의 개별 시험 작용제 및 시험 작용제 조합물을 다양한 유전적 배경을 갖는 조직으로 구성된 패널에서 스크리닝하여 시험 작용제의 약물유전학 효능 프로파일을 결정할 것이다. 예를 들어, 시험 작용제의 다중 용량, 또는 그와의 조합물을 1종 이상의 유전적 배경에 특이적인 효능 또는 그의 결여에 대해 스크리닝할 것이다.
본 발명의 방법은 임의의 종류의 조직을 사용하여 수행될 수 있다. 하기 설명은 본 발명의 3가지 바람직한 실시양태에 관한 특정 정보를 제공하며, 이는 간, 심장, 및 신장으로부터 유래된 세포와 함께 본 발명의 시스템/장치의 사용을 포함한다.
간
간은 호르몬 인슐린의 영향 하에 혈액으로부터 글루코스를 제거하고 이를 글리코겐으로 저장함으로써 탄수화물 대사에서 주요 역할을 한다. 혈중 글루코스의 수준이 하락하면, 호르몬 글루카곤은 간이 글리코겐을 분해하여 혈액으로 글루코스를 방출하도록 유발한다. 간은 또한, 주로 아미노산의 탈아미노화를 통해, 뿐만 아니라 생성된 독성 암모니아의 우레아로의 전환을 통해 (이는 신장에 의해 배설될 수 있음) 단백질 대사에서도 중요한 역할을 한다. 또한, 간은 트리글리세리드를 저장하고, 지방산으로 분해하고, 지단백질을 합성함으로써 지질 대사에 관여한다. 간은 또한 지방, 콜레스테롤, 인지질, 및 지단백질의 소화를 돕는 담즙을 분비한다.
대사 기능의 분석은 간에서의 독성을 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명의 간 조직 조작 시스템에서, 특정한 시험 작용제의 독성을 검출하기 위한 대사 검정이 바람직하다. 시토크롬 P450, 알칼리성 포스파타제, 당분해 효소, 예컨대 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 알파-글루쿠로니다제, 베타-글루쿠로니다제, 및 알파-아밀라제, NADPH-시토크롬 P450 리덕타제, 시토크롬 b5, N-데메틸라제, O-데메틸라제, 아세틸콜린에스테라제, 슈도콜린에스테라제 (다른 에스테라제 중 특히), 에폭시드 히드롤라제, 아미다제, 우리딘 디포스페이트 (UDP)-글루쿠로노실트랜스퍼라제, 페놀 술포트랜스퍼라제, 알콜 술포트랜스퍼라제, 스테로이드 술포트랜스퍼라제 및 아릴아민 술포트랜스퍼라제, UDP-글리코실트랜스퍼라제, 퓨린 포스포리보실트랜스퍼라제, N-아세틸트랜스퍼라제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 페닐에탄올아민 N-메틸트랜스퍼라제, 비-특이적 N-메틸트랜스퍼라제, 이미다졸 N-메틸트랜스퍼라제, 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제, 히드록시인돌-O-메틸트랜스퍼라제, 및 S-메틸트랜스퍼라제, 알콜 데히드로게나제, 알데히드 데히드로게나제, 크산틴 옥시다제, 아민 옥시다제 , 예컨대 모노아민 옥시다제, 디아민 옥시다제, 플라보단백질 N-옥시다제, 및 히드록실라제, 아로마타제, 시스테인 접합체 .베타.-리아제, 및 알킬히드라진 옥시다제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 대사 효소가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 검정을 사용하여 대사 활성에 대해 시험될 수 있다 (이는 적용분야의 다른 부분에 보다 상세하게 기재됨). 시험될 수 있는 시토크롬 p450 효소는 CYP1A1, CYP1A2, CYP2A3, CYP2B6, CYP2B7, CYP2B8, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C10, CYP2D6, CYP2D7, CYP2D8, CYP2E1, CYP2F1, CYP3A3, CYP3A4, CYP3A5, 및 CYP4B1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 시험 작용제는 항바이러스 활성, 가장 바람직하게는 간염에 대한 항바이러스 활성을 포함한다. 최근, 간염에 대한 안전하고 효과적인 치료에 대한 큰 필요가 존재한다 (Mutchnick, M. G., et. al., Antiviral Research (1994) 24:245-257). 예를 들어, 만성 B형 간염의 치료를 위한 뉴클레오시드 유사체 피알우리딘 (FIAU)의 사용에 대한 임상 시험은 일부 환자에서 사망으로 이어진 약물-관련 간부전으로 인해 최근 보류되었다. 간염에 대해 효능이 입증된 시험 작용제는 또한 투여 후 대사 기능, 바람직하게는 시토크롬 P450 및 알칼리성 포스파타제의 대사 기능을 모니터링함으로써 급성, 아급성 및 만성 독성에 대해 스크리닝될 수 있다.
시험 작용제는 암, 당뇨병, 급성 간염, 전격성 간염, 만성 간염, 간 경변증, 지방간, 알콜성 간병증, 약물 유발된 간병증 (약물 중독 간염), 울혈성 간염, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증 및 간 포르피린증, 및 담관주위염, 경화성 담관염, 간 섬유증 및 만성 활성 간염 (이는 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 결장염 및 크론병의 합병증으로서 높은 빈도로 발생하는 것으로 보고되어 있음)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환에 의해 영향을 받은 간 세포를 포함하는 본 발명의 조직 조작 시스템에서 효능에 대해 스크리닝될 수 있다.
바람직하게는, 시험 작용제는 간 세포괴사의 진행을 감소 또는 방지하고/거나 간 재생을 가속화하는 그의 능력에 대해 검정될 수 있다. 예를 들어, 간 조직의 재생 동안 상향조절되는 유전자인 Rasp-1의 발현 수준이 시험 작용제의 투여 후에 모니터링될 수 있다. Rasp-1은 미국 특허 번호 6,027,935에 기재되어 있고, 그의 내용은 Rasp-1 서열, 항체 및 검정에 대한 기재가 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 시험 작용제는 간염 바이러스 감염, 바람직하게는 B형 간염 및 C형 간염 감염의 치료에서의 효능에 대해 스크리닝된다. 인간 질환의 작용제로서 유의한 다른 간염 바이러스는 A형 간염, 델타형 간염, E형 간염, F형 간염, 및 G형 간염을 포함한다 (Coates, J. A. V., et al., Exp. Opin. Ther. Patents (1995) 5 (8): 747-756). 시험 작용제는 예를 들어 뉴클레오시드 유사체 항바이러스제, 면역조절제, 면역자극제 (예를 들어, 인터페론 및 다른 시토카인), 또는 흉선 펩티드, 이소프리노신, 스테로이드, 쉬프 염기-형성 살리실알데히드 유도체, 예컨대 투카레솔, 레바미솔 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 면역계-영향 약물 후보를 포함할 수 있다 (Gish, R. G., et al., Exp. Opin. Invest. Drugs (1995) 4 (2):95-115; Coates, J. A. V., et al., Exp. Opin. Ther. Patents (1995) 5 (8):747-765).
시험 작용제의 항간염 효능은 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제를 사용한 치료 후에, 배양 배지 내의 간염 바이러스 또는 바이러스 DNA의 양을 (예를 들어, 침강된 입자의) PCR 분석에 의해 결정할 수 있다. DNA 측정은 치료후 감염성을 평가하기 위해 바이러스 복제와 상관될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 로드를 직접적으로 측정할 수 있다. 다른 효능의 척도는 SGOT, ALT 및 LDH를 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소 수준의 측정, 조직학 분석, 및 응고 인자와 같은 전체 간 단백질의 정상적인 생산을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 시험 작용제의 효능은 C형 간염 바이러스로 감염된 간 조직에서 결정된다. 바람직한 실시양태에서, 시험 작용제는 간암 치료에서의 효능에 대해 스크리닝된다. 시험 작용제를 사용한 치료에 반응한 형질전환된 간 세포의 감소 또는 제거는 고칼슘혈증 및 CEA 발현에서의 감소를 측정함으로써 검출될 수 있다. 증식의 감소는 또한 세포 카운팅에 의해 결정될 수 있다.
심장
본 발명의 심장 조직 조작 시스템에서의 시험 작용제의 독성 효과는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정한 시험 작용제의 독성을 검출하기 위한 검정은 바람직하게는 QT 간격, 전기생리학에서의 변화 (예를 들어, K+/Ca2+ 채널에서의 변화, hERG) 및/또는 T-파 알테르난 (TWA)에 의한 부정맥의 측정을 포함한다.
심전도의 알테르난은 모든-다른-박동 기준에서 발생한 ECG 구성요소의 진폭 및/또는 형태에서의 변화로서 정의된다 (Walker, M. L. and Rosenbaum, D. S., (2003) Cardiovasc. Res. 57: 599-614). TWA는 T-파 진폭의 박동-대-박동 교대이고, 심장에서의 전기 불안정성과 밀접하게 연결된다. T 파의 박동-대-박동 마이크로볼트 변동은 고해상도 전극 및 신호 처리 기술을 사용하여 검출될 수 있다 (Gold, M. R., and Spencer, W. (2003) Curr. Opin. Cardiol. 18: 1-5). 일반적으로 128회의 다수의 박동이 샘플링되고, 다중 T-파 상응점의 전압이 산출 및 평균화된다. 고속-퓨리에 변환을 통해 이들 연속 진폭을 스펙트럼으로 나타내어 여러 빈도 피크를 생성한다. 이들 피크는 호흡, 다른 반복적 신체 이동, 및 주위 전기 잡음에 의한 흉곽 편위운동에 상응한다. 0.5 사이클/박동에서 피크가 존재하는 경우에, 이는 TWA에 의해 유발된 것이다. 알테르난 규모, V.sub.alt는 마이크로볼트에서의 짝수 또는 홀수 박동과 평균 진폭 사이의 차이를 나타낸다. 역치 1.9 uV는 유의성에 사용된다. 알테르난 비 (k)는 측정되는 또 다른 파라미터이며, 알테르난 진폭 대 배경 잡음의 SD 비를 나타낸다. 이는 유의성을 위해 3.0을 초과할 것이 요구된다. 또한, TWA가 1분 초과 동안 지속되어야 한다.
시험 작용제는 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 심근경색, 심근 허혈, 아테롬성동맥경화증 또는 고혈압의 효과, 심근병증, 심장 부정맥, 근육 이영양증, 근육 질량 이상, 근육 변성, 중증 근무력증, 감염성 심근염, 약물- 및 독소-유발된 근육 이상, 과민성 심근염, 자가면역 심내막염 및 선천성 심장 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 질환에 의해 영향을 받은 심장 세포를 포함하는 본 발명의 조직 조작 시스템에서 효능에 대해 스크리닝될 수 있다. 바람직하게는, 시험 작용제는 심장 재생을 가속화하거나 수축 특성을 개선시키는 그의 능력에 대해 검정될 것이다. 일반적으로, 효능은 개선된 수축성, 전기기계적 전도 및/또는 회합, 전기 기능장애에 대한 감수성, 심실 세동 (돌연사), 이오노트로피, 크로노트로피, 및 감소된 효소 (예를 들어, CPK 및 SGOT) 누출의 검출에 의해 나타내어질 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 장치는 예를 들어 연속 (즉, 탠덤), 평행 또는 그의 조합을 비롯하여 함께 사용되거나 커플링될 수 있으며, 여기서 약물 효과 및 다중 조직과의 상호작용을 연구하기 위해 제1 유형의 조직 (예를 들어, 간)으로 제조된 제1 장치는 제2 유형의 조직 (예를 들어, 심장)으로 제조된 제2 장치와 연속해서 연결될 수 있다. 예를 들어, 복수개의 안지오칩 또는 안지오튜브 시스템은 연속해서 구성될 수 있으며, 그에 의하면 제1 안지오칩/안지오튜브는 1가지 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 심장)으로 형성되고, 제2 "하류" 또는 "상류" 안지오칩/안지오튜브는 제2 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 이환 심장 또는 간)으로 형성된다. 이러한 방식으로, 약물의 상호작용이 다중 기관 또는 조직 시스템과 관련하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 간 조직으로 제조된 안지오칩/안지오튜브 내로 도입될 수 있고, 이는 심장 조직으로 제조된 하류의 제2 안지오칩/안지오튜브에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 약물은 먼저 간 조직과 상호작용할 수 있고, 그로부터 생성된 임의의 대사 산물은 하류의 심장 조직 안지오칩/안지오튜브로 유동하여, 약물의 대사의 심장 기능에 대한 효과를 시험하는 것을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 체내 기관간 약물 상호작용을 시험하는데 사용하기 위한 탠덤 (즉, 연속) 방식으로 배열된 복수개의 장치를 고려한다. 조직의 임의의 고안되는 조합이 탠덤으로, 예를 들어 심장/간 또는 간/심장으로 시험될 수 있다.
신장
제약 및 생물제제는 후천성 급성 신부전 (ARF) 에피소드의 대략 20%를 유발하는 신장 손상 (즉, 신독성)의 공통 공급원이다. 입원 환자에서의 급성 신부전 (ARF)의 발생은 5-배 내지 8-배 더 큰 사망 위험을 야기한다. 소형 용질 및 유체 클리어런스 기능을 사용한 혈액투석, 혈액여과 및 복막 투석 치료가 고칼륨혈증, 용적 과부하 및 요독성 합병증, 예컨대 심막염으로 인한 사망을 방지하지만, ARF 환자는 여전히 50 초과의 사망률을 갖는다. 이는 단지 여과 기능을 제공하고 지혈, 조절, 대사, 및 내분비 기능을 대체하는 것은 아니기 때문에, 완전한 신장 대체 요법이 아니다. 투석 중인 말기 신질환 환자는 계속해서 주요 의학적, 사회적 및 경제적 문제를 갖는다. 신독성을 유발하는 것으로 발견된 대부분의 약물은 1가지 이상의 공통 발병 메카니즘에 의해 독성 효과를 발휘한다. 이는 변경된 사구체내 혈류역학, 세관 세포 독성, 염증, 결정 신병증, 횡문근융해증, 및 혈전성 미세혈관병증을 포함한다. 문제가 되는 신장 손상 약물 및 그의 특정한 병원성 메카니즘에 대한 지식은 약물-유발되는 신장애를 인식하고 방지하는데 중요하다. 약물 및 생물제제의 신독성에 대한 잠재력을 측정하기 위한 보다 안전하고 보다 효과적인 검정은 의약으로 인한 오늘날의 신장 손상의 양을 감소시키는데 의심할 바 없이 유의하게 도움이 될 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서 바이오와이어 시스템, 바이오튜브 시스템, 바이오로드 시스템, 안지오칩 시스템, 또는 안지오튜브 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 신장 조직을 평가하는데, 특히 신장에 대한 약물 및 생물제제의 신독성 효과를 측정 또는 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 바이오와이어 시스템, 바이오튜브 시스템, 바이오로드 시스템, 안지오칩 시스템, 또는 안지오튜브 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물반응기 시스템은 임의의 관심 약물 또는 생물제제를 시험하는데 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 신독성인 것으로 공지되어 있는 활성제, 예컨대 방사선 조영 매체 (예를 들어, "조영제" 또는 "염료"), 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 암포테리신, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 아시클로비르, 겐타미신, 아세틸콜린에스테라제 억제제, 다른 신독성 약물, 및 내부적으로 생성된 물질, 예컨대 종양 용해 산물 및 횡문근융해증 산물 및 감염 또는 패혈증과 연관된 독소를 포함할 수 있고, 본 발명의 방법은 또한 이러한 신독성 물질의 과용량 또는 다른 섭취, 흡수 또는 그에 대한 노출로 인한 신장 손상을 방지하거나 완화시키는데 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 장치는 예를 들어 연속 (즉, 탠덤), 평행 또는 그의 조합을 비롯하여 함께 사용되거나 커플링될 수 있으며, 여기서 약물 효과 및 다중 조직과의 상호작용을 연구하기 위해 제1 유형의 조직 (예를 들어, 신장)으로 제조된 제1 장치는 제2 유형의 조직 (예를 들어, 심장)으로 제조된 제2 장치와 연속해서 연결될 수 있다. 예를 들어, 복수개의 안지오칩 또는 안지오튜브 시스템은 연속해서 구성될 수 있으며, 그에 의하면 제1 안지오칩/안지오튜브는 1가지 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 심장)으로 형성되고, 제2 "하류" 또는 "상류" 안지오칩/안지오튜브는 제2 유형의 세포 또는 조직 (예를 들어, 이환 심장 또는 신장)으로 형성된다. 이러한 방식으로, 약물의 상호작용이 다중 기관 또는 조직 시스템과 관련하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 간 조직으로 제조된 안지오칩/안지오튜브 내로 도입될 수 있고, 이는 신장 조직으로 제조된 하류의 제2 안지오칩/안지오튜브에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 약물은 먼저 간 조직과 상호작용할 수 있고, 그로부터 생성된 임의의 대사 산물은 하류의 신장 조직 안지오칩/안지오튜브로 유동하여, 약물의 대사의 기관 기능에 대한 효과를 시험하는 것을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 체내 기관간 약물 상호작용을 시험하는데 사용하기 위한 탠덤 (즉, 연속) 방식으로 배열된 복수개의 장치를 고려한다. 조직의 임의의 고안되는 조합이 탠덤으로, 예를 들어 신장/간 또는 간/신장으로 시험될 수 있다.
실시예
본 발명의 예시적인 실시양태에 대해 이하 상세하게 언급될 것이다. 특히, 하기 실시예는 바이오와이어 (실시예 1, 단일-와이어 조직 배양 실시양태), 바이오튜브 (실시예 2, 관류가능한 와이어 조직 배양 실시양태), 바이오로드/바이오와이어II (실시예 3, 수축력 조직 배양 실시양태), 바이오분지/안지오칩 (실시예 4, 혈관화 조직 배양 실시양태), 및 안지오튜브 (실시예 5, 관류가능한 수축력 조직 배양 실시양태)로 지칭될 수 있는 본 발명의 다섯 (5) 가지의 예시적인 실시양태를 개시한다. 본 발명이 예시적인 실시양태와 함께 기재될 것이지만, 본 발명이 이들 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 그와 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함될 수 있는 것과 같은 실시양태의 대안, 변형, 조합, 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
실시예 1: 바이오와이어
예시적인 단일 와이어 실시양태 (즉, 바이오와이어)의 구조, 제조, 및 사용
제1 실시양태에서, 본 발명은 웰 또는 채널, 채널의 길이에 걸쳐 지지되거나 현수된 종방향 스캐폴드 또는 봉합사를 갖는 생물반응기를 포함하는 3차원 조직을 성장시키기 위한 생물반응기 장치에 관한 것으로, 여기서 생물반응기 및 채널은 종방향 스캐폴드 주변에 3D 조직 가닥을 형성하기에 충분한, 내부에 시딩된 세포를 수용하도록 구성된다. 다양한 실시양태에서, 종방향 스캐폴드는 중합체 필라멘트, 예를 들어 POMac (폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) 또는 임의의 다른 적합한 중합체 스캐폴드 물질일 수 있다.
심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 생물반응기는 생물반응기의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 채널 (및 생성된 조직 가닥)의 길이를 따라 평행이거나 채널 (및 생성된 조직 가닥)의 길이를 따라 수직인 방향일 수 있다.
본원에 사용될 수 있는 바와 같은, 본 발명의 제1 실시양태는 "바이오와이어"로서 지칭될 수 있고, 이는 조직 가닥 그 자체 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 장치 상에서 성장한 세포) 또는 조직 가닥 및 생물반응기를 함께 포함하는 시스템을 지칭할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바이오와이어는 또한 그의 상업적 명칭 바이오와이어™로서 본원에서 지칭될 수 있고, 이는 조직 가닥 그 자체, 또는 조직 가닥 및 조직 가닥이 성장하거나 위치하는 생물반응기 장치를 포함하는 시스템 둘 다를 포괄한다. 이러한 실시양태에서, 장치는 복수개의 3차원 조직 가닥을 동시에 성장시킬 수 있도록 복수개의 생물반응기 채널 및 종방향 스캐폴드를 포함하는 구성까지 스케일 업될 수 있다.
이러한 제1 실시양태는 또한 생물반응기 내에서 조직 가닥을 성장시키는 방법, 3차원 조직 가닥 그 자체, 생물반응기 및 성장한 조직 가닥 둘 다를 포함하는 시스템, 및 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 조직 가닥 (또는 조직 가닥을 포함하는 시스템)을 사용 및/또는 시험하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시양태에서, 장치는 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트로 구성될 수 있다.
도 2A-2B는 개시된 장치의 예의 개략도를 보여준다. 이러한 예시적인 장치는 조직 가닥을 재생시키는데 적합할 수 있고, 여기서 장치는 세포 정렬 및 조직 내 신장을 촉진할 수 있는 특색을 포함한다.
예시적인 장치는 조직 배양을 위해 시딩되는 세포가 수용될 수 있는 종방향 생물반응기 채널을 포함할 수 있다. 종방향 스캐폴드는 채널의 길이에 걸쳐 지지 (예를 들어, 현수)될 수 있다. 스캐폴드는 시드 세포가 스캐폴드의 길이를 따라 조직 구조를 형성하도록 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 스캐폴드 및 채널 구성은 조직 배양 동안 세포 정렬 및 신장을 가능하게 할 수 있다.
도 2A는 마이크로제작 생물반응기로서의 장치의 예시적인 설계를 보여준다. 이러한 실시예에서, 장치는 스캐폴드로서 생물반응기 채널 또는 웰 내에 현수된 봉합사 (예를 들어, 6-0 봉합사) 템플릿을 포함한다. 장치는 적합한 마이크로제작 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 임의의 적합한 물질, 예컨대 폴리(디메틸실록산) (PDMS)으로 제조될 수 있다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA), 폴리스티렌 또는 다른 폴리우레탄, 예컨대 POMac를 비롯한 다른 물질이 사용될 수 있다. 예시적인 치수가 도면에 제시되지만, 다른 크기가 적합할 수 있다.
도 2B는 예시적인 장치를 사용하여 3D 조직 가닥, 본 예에서 심근세포 가닥을 생성하는데 있어서의 예시적인 단계를 보여준다. I에서, 스캐폴드 (예를 들어, 외과용 봉합사)는 채널의 중심에 놓여진다. II에서, 콜라겐 유형 I 겔 중의 심근세포 현탁액이 봉합사 주변의 메인 채널 내에 시딩된다. III에서, hESC-심근세포의 사전-배양물이 채널 내로 도입되고, 결정된 시간 길이에 걸쳐 배양된다. 세포가 겔을 재형성하게 하고 봉합사 주변이 수축하게 하는데 7일의 시간 길이가 적합한 것으로 확인되었다. IV에서, 생성된 조직 가닥은 결정된 시간 이후에 안정할 수 있고, 장치로부터 제거될 수 있다.
장치에 시드 세포 현탁액을 제공하는 겔은 전달되는 세포를 지지할 수 있는 임의의 적합한 겔, 예컨대 콜라겐 또는 콜라겐-유래 물질일 수 있다. 겔은 또한 다양한 성장 인자, 세포 배지 구성요소, 및/또는 영양소, 예컨대 비제한적으로 탄수화물, 단백질 및/또는 아미노산, 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 베타-신경 성장 인자 (BNGF), 인터류킨 (예를 들어, IL-4, IL-2, IL-6, IL-18, IL-15, IL-1), 시토카인, IL-6, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF), 인터페론 감마 (IFN-감마), 표피 성장 인자 (EGF), 재조합 인간 간세포 (RHH), 재조합 인간 인슐린 (RHI)을 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 성장 인자는 생물반응기에서 배양할 특정한 조직에 대해 특이적, 예를 들어 심장-특이적 또는 간세포-특이적 성장 인자일 수 있다. 이러한 인자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있을 것이다.
예시적인 장치는 임의의 적합한 기술, 예컨대 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 한 예에서, 2-층 SU-8 (마이크로켐 코포레이션(Microchem Corp.)) 마스터를 PDMS 몰딩에 사용하였다. 간략하게, 장치 특색을 2-층 설계에 상응하는 2개의 필름 마스크 (CADART) 상에 인쇄하였다. SU-8 2050을 4-인치 실리콘 웨이퍼 상에서 회전시키고, 베이킹하고, 제1-층 마스크 아래에서 UV 광에 노출시켜 봉합사 채널 및 185 μm의 두께를 갖는 챔버를 포함하는 제1 층을 생성하였다. 115 μm의 두께의 챔버만을 포함하는 제2 층을 상부에서 회전시켰다. 추가의 베이킹 후에, 제2-층 마스크를 제1 층 상의 특색과 정렬한 다음, UV 노출시켰다. 마지막으로, 웨이퍼를 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 (도 & 인갈스 인크.(Doe & Ingalls Inc.))를 사용하여 현상하였다. 이어서 PDMS를 SU-8 마스터 상에 캐스팅하고, 70℃에서 2시간 동안 베이킹하였다. 장치는 세포 현탁액 겔이 첨가될 수 있는 채널 내에 (예를 들어, 중심에) 현수된, 스캐폴드, 본 예에서는 한 조각의 외과용 봉합사를 보유하도록 구성되었다.
특정 물질, 기술 및 치수가 상기 기재되어 있지만, 다른 적합한 물질, 기술 및 치수가 예시적인 장치에 사용될 수 있다. 외과용 실크 봉합사가 기재되어 있지만, 다른 지지체, 예컨대 다른 물질 (예를 들어, 폴리(글리세롤 세바케이트), POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체) 길이가 조직 가닥의 배양을 지지하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
B. 예시적인 바이오와이어 조직 배양 시스템의 실험적 시험
성숙한, 박동하는 래트 및 인간 심장 조직을 실시예 1A의 장치를 사용하여 생성하고, 생성된 조직을 기능적 및 구조적 특성에 대해 평가하였다.
예시적인 방법 및 분석
신생아 래트 심근세포를 2-일령의 신생아 스프라그-돌리 래트로부터 이전에 기재된 바와 같이21 토론토 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인된 절차에 따라 수득하였다. 배양 배지는 10% (v/v) 소 태아 혈청, 1% (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) (HEPES), 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 및 나머지 둘베코 변형 이글 배지를 함유하였다.
사용된 심근세포는 2종의 상이한 인간 배아 줄기 세포주 (hESC, Hes2 및 Hes3) 및 2종의 상이한 hiPSC 세포주 (CDI-MRB 및 HR-I-2Cr-2R)로부터 유래되었다. hESC 세포주 및 hiPSC 세포주 HR-I-2Cr-2R 둘 다를 기재된 바와 같이 유지시켰다2,4. 배상체 (EB)를 이전에 기재된 바와 같이2,4 심혈관 계열로 분화시켰다. 간략하게, BMP4 (1 ng/ml)를 함유하는 스템프로(StemPro)-34 (인비트로젠(Invitrogen)) 배지 중에서 배양함으로써 EB를 생성하였다. 제1일에, EB를 수거하고, 유도 배지 (스템프로-34, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 2.5 ng/ml), 액티빈 A (6 ng/ml) 및 BMP4 (10 ng/ml)) 중에 현탁시켰다. 제4일에, 유도 배지로부터 EB를 수거하고, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF; 10 ng/ml) 및 DKK1 (150 ng/ml)이 보충된 스템프로-34 중에서 재-배양하였다. 제8일에, 배지를 다시 바꾸고, EB를 VEGF (20 ng/ml) 및 bFGF (10 ng/ml)를 함유하는 스템프로-34 중에서 실험 기간 동안 배양하였다. 배양을 처음 12일 동안 저산소 환경 (5% CO2, 5% O2)에서 유지시킨 다음, 남은 배양 기간 동안 5% CO2로 옮겼다. 특정 세포적 및 전기생리학적 분석을 위해 EB를 제20일 (EBd20) 뿐만 아니라 제34일 (EBd34) 및 제40일-제44일 (EBd44)에 조직에의 시딩을 위해 해리시켰다. CDI-MRB hiPSC-유래 심근세포는 셀룰라 다이나믹스 인터내셔널(Cellular Dynamics International)로부터 구입하여 해동 직후 조직 생산에 사용하였다.
신생아 래트 단리물로부터의 심장 세포를 먼저 보충제 4.5 μg/ml 글루코스, 1% (v/v) HEPES, 10% (v/v) 매트리겔 (BD 바이오사이언시스), 및 2 μg/ml NaHCO3을 함유하는 콜라겐 유형 I 기반 겔 (제조업체에 의해 기재된 바와 같이 1N NaOH 및 10x M199 배지에 의해 중화된 2.5 mg/ml의 래트 꼬리 콜라겐 유형 I (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))) 중에 200 x 106개/ml (달리 명시되지 않는 한)로 현탁시켰다. 이어서 현탁된 심장 세포를 예시적인 장치의 세포 배양 채널 내에 시딩하였다 (조직 가닥당 3 μl). 겔화를 유도하기 위해 37℃에서의 30분 인큐베이션 후에, 적절한 배지를 첨가하였다. 심장 조직 가닥을 2-3일마다 배지 교환하면서 최대 14일까지 배양물 중에 유지시켰다. 심장 조직 가닥을 상이한 세포 밀도 (100 및 200 x 106개/ml)에서 출발하여 시딩하여, 세포 시딩 밀도의 효과를 연구하였다. 콜라겐-기반 겔을 심장 세포의 로딩없이 예시적인 장치의 세포 배양 채널 내로 시딩하였고, 이는 세포-무함유 대조군으로서의 역할을 하였다. 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제작되고 신생아 래트 심근세포로 시딩된 5 cm 길이의 생물반응기 채널을 갖는 예시적인 장치에 의해 초-장 심장 조직 가닥이 생성되었다. 시딩 후에, 조직 가닥의 명시야 영상을 광학 현미경 (올림푸스(Olympus) CKX41)을 사용하여 매일 채취하고 (군당 n = 3), 5곳의 특유한 위치에서의 조직 가닥의 직경을 영상 분석에 의해 평균화하였다.
인간 심장 조직 가닥의 경우에, 상기 기재된 바와 같이 생성한 제20일 EB를 행크의 평형 염 용액 (NaCl, 136 mM; NaHCO3, 4.16 mM; Na3PO4, 0.34 mM; KCl, 5.36 mM; KH2PO4, 0.44 mM; 덱스트로스, 5.55 mM; HEPES, 5 mM) 중의 콜라게나제 유형 I (1 mg/ml; 시그마(Sigma)) 및 DNAse (1 mg/ml, 칼바이오켐(CalBiochem)) 중에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. EB를 원심분리하고 (800 r.p.m., 5분), 트립신 (0.25%, 깁코(Gibco))과 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 온화하게 피펫팅하여 세포를 해리시켰다. 해리 후에, 세포를 원심분리하고 (1,000 r.p.m., 5분), 카운팅하고, 0.5x106 개 세포/0.5 cm 길이의 가닥으로 시딩하였다. 이러한 비는 보다 긴 조직 가닥의 생성을 위해 유지시켰다. 세포 현탁액을 예시적인 장치의 메인 채널 내로 피펫팅함으로써 세포를 1X M199 배지 + 10% 성장 인자 감소된 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 중 24.9 mM 글루코스, 23.81 mM NaHCO3, 14.34 mM NaOH, 10 mM HEPES 중의 콜라겐 유형 I 겔 (4 μl/0.5 cm 와이어 길이; 2.1 mg/ml의 래트 꼬리 콜라겐 유형 I (BD 바이오사이언시스)) 내에 시딩하였다. CDI-MRB hiPSC-유래 심근세포를 해동하고, 카운팅하고, hESC-유래 심근세포와 동일한 농도로 시딩하였다. 시딩 후에, 세포를 배양물 중에 7일 동안 유지시켜 콜라겐 매트릭스가 재형성되게 하고 봉합사 주변에 어셈블리되게 하였다.
래트 심장 조직 가닥에 이전에 기재된 바와 같이2 상이한 전기 자극 조건을 적용하였다. 평행 자극 챔버를 2 cm 떨어져서 놓인 2개의 1/4-인치-직경 탄소 로드 (라드 리서치 인더스트리즈(Ladd Research Industries))와, 조직 가닥에 대해 수직으로 피팅시키고 (전기장이 조직 가닥 장축과 평행이 되도록), 백금 와이어 (라드 리서치 인더스트리즈)를 사용하여 자극기 (S88X, 그라스(Grass))에 연결시켰다. 수직 자극 챔버를 1 cm 떨어져서 놓인 2개의 탄소 로드와, 조직 가닥과 평행으로 구축하였다 (즉 전기장은 조직 가닥의 장축에 대해 수직임). 조직 가닥 구조가 확립되고 그의 자발적 박동이 동기화될 때까지 조직 가닥을 4일 동안 사전-배양한 다음, 배양 배지 내에 10 μM 아스코르브산을 보충하여 4일 동안 전기장 자극에 적용하는 한편 (2상, 직사각형, 1 ms 지속기간, 1.2 Hz, 3.5-4 V/cm), 대조군 조직 가닥은 전기 자극 없이 배양하였다. 전기 자극의 말미에, 래트 심장 조직 가닥을 cTnT 및 Cx-43에 대해 염색하거나, 또는 그의 기계적 특성을 원자력 현미경검사 (AFM)에 의해 측정하였다.
인간 심장 조직 가닥의 경우에, 7일 동안 사전배양한 후, 조직 가닥을 2 cm 떨어져서 놓인 2개의 1/4-인치-직경 탄소 로드 (라드 리서치 인더스트리즈, 버몬트주 벌링턴)가 피팅된 자극 챔버로 옮기고, 백금 와이어 (라드 리서치 인더스트리즈)를 사용하여 심장 자극기 (그라스 s88x)에 연결시켰다. 조직 가닥을 전극에 대해 수직으로 놓고, 7일 동안 전기 자극 (직사각형, 2상, 1 ms, 3-4 V/cm)을 적용하거나 또는 전기 자극 없이 배양하였다 (비자극 대조군 또는 CTRL). 2개의 전기장 자극 프로토콜을 사용하였다: (I) 자극을 1 Hz에서 시작하여 서서히 매일 3 Hz까지 (1, 1.83, 2.66 및 3 Hz) 증가시키고, 여기서 그 주의 나머지 동안 유지시키거나, 또는 (II) 자극을 1 Hz에서 시작하여 그 주 내내 서서히 6 Hz까지 증가시켰다 (1, 1.83, 2.66, 3.49, 4.82, 5.15 및 6 Hz, 1일 주파수). 도 3A는 실시예 1의 장치에서 배양된 조직에 적용된 예시적인 전기 자극 요법을 보여준다. 사전 배양된 조직 가닥에 대해 1주 동안 3-4 V/cm의 전기 자극을 적용하였다. 전기 자극은 1 Hz에서 시작하여 3 Hz까지 점진적으로 증가시키고, 여기서 그 주의 나머지 동안 유지시켰다 (저주파수 램프-업 자극 요법 또는 3 Hz 군). 또한, 자극 속도를 1에서 6 Hz로 점진적으로 증가시켰다 (고주파수 램프-업 자극 요법 또는 6 Hz 군).
증가된 배양 시간은 성숙에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌기 때문에11,28, 연령 매칭 EB (EBd34)를 추가의 대조군으로서 사용하였다. 장기간 자극 실험을 위해, 조직 가닥을 상기 기재된 바와 같이 7일 동안 사전배양한 다음, 7일의 6Hz 램프-업 프로토콜을 수행하고, 이 시점에서 주파수를 1 Hz로 감소시키고 (출생후 심박수 감소를 모방하기 위함), 추가로 14일 동안 유지시켰다. 도 4a는 여기에 사용된 예시적인 전기 자극 요법을 보여준다.
배양된 심근세포 조직 가닥이 단세포 기준에서 실제로 성숙을 나타내는지 확인하기 위해, 단세포를 사용하여 검정을 수행하였다. 도 3B는 자극 요법의 말미에 배양된 조직 가닥으로부터 기능적, 초미세구조적, 세포적 및 분자적 반응에 대해 평가될 세포를 단리하는 방법을 예시한다.
배양된 조직 가닥을 행크의 평형 염 용액 (NaCl, 136 mM; NaHCO3, 4.16 mM; Na3PO4, 0.34 mM; KCl, 5.36 mM; KH2PO4, 0.44 mM; 덱스트로스, 5.55 mM; HEPES, 5 mM) 중의 콜라게나제 유형 I (1 mg/ml; 시그마) 및 DNAse (1 mg/ml, 칼바이오켐)로 37℃에서 4시간 동안 소화시키고, 원심분리하고 (800 r.p.m., 5분), 트립신 (0.25%, 깁코)과 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 온화하게 피펫팅하여 세포를 해리시켰다. 단리된 단세포를 하기 기재된 바와 같이 매트리겔- 또는 라미닌-코팅된 유리 커버 슬립 상에 시딩한 후, 면적, 칼슘 과도 및 패치 클램프 측정을 수행하였다.
조직 어셈블리의 진행은 배양 중 2주 후에 (즉 7일 겔 압착에 이어 7일 자극) 다양한 수준에서 평가하였다: 기능적 (흥분 역치 (ET), 최대 포획률 (MCR), 전도 속도, Ca2+ 취급); 초미세구조적 (근절 발생, 데스모솜 빈도), 세포적 (세포 크기 및 형상, 증식, 심장 단백질: 액틴, 트로포닌 T 및 α-액티닌의 분포), 전기생리학적 (hERG, IK1, INa) 및 분자적 (심장 유전자 및 단백질의 발현 수준).
핵 신장 및 정렬을 정량화하였다. 조직 가닥 내의 세포 핵을 DAPI 염색에 의해 가시화하고, 공초점 현미경검사에 의해 3 μm 간격으로 z-적층 영상을 수득하였다. 공초점 영상의 각각의 적층을 이미지J(ImageJ) 1.45s (미국 국립 보건원)에서 문헌 [Xu et al.]27에 기재된 자동화 알고리즘에 의해 분석하였고, 샘플당 대략 1000개의 핵을 분석하였다. 핵 신장을 핵의 단축에 대한 장축의 비인 핵 종횡비로서 특징화하고, 핵 정렬은 배향 각도에 의해 특징화하였다. 대조군 단층 군에서 핵의 배향은 임의적으로 규정된 배향과 비교하여 특징화하는 한편, 조직 가닥 군에서는 봉합사 템플릿의 배향을 참조로 설정하였다.
래트 심장 조직 가닥을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.25% 트리톤 X-100으로 투과되게 하고, 10% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단시켰다. 하기 항체를 사용하여 면역염색을 수행하였다: 마우스 항-심장 트로포닌 T (cTnT) (압캠(Abcam); 1:100) 및 토끼 항-코넥신 43 (Cx-43) (압캠; 1:200), 염소 항-마우스-알렉사 플루오르 488 (잭슨 이뮤노 리서치; 1:400) 및 항-토끼-TRITC (인비트로젠; 1:200). 핵을 4',6- 디아미디노-2- 페닐인돌 (DAPI) (비오튬(Biotium); 1:100)로 대조염색하였다. 팔로이딘-알렉사 660 (인트로젠; 1:600)을 사용하여 F-액틴 섬유를 염색하였다. 공초점 현미경검사를 위해, 염색된 심장 조직 가닥을 도립 공초점 현미경 (올림푸스 IX81) 또는 정립 공초점 현미경 (자이스(Zeiss) LSM 510) 하에 가시화하였다.
하기 항체를 사용하여 인간 심장 조직 가닥의 면역염색을 수행하였다: 마우스 항-cTNT (1:100, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific); MS-295-P1), 마우스 항-α-액티닌 (1:200, 압캠, ab9465), 항-마우스-알렉사 플루오르 488 (1:400, 인비트로젠, A21202), 항-Ki67 (1:250, 밀리포어(Millipore), AB9260), 항-토끼-TRITC (1:400, 인비트로젠, 81-6114). DAPI를 사용하여 핵을 대조염색하였다. 팔로이딘 알렉사 플루오르 660 (1:1000, 인비트로젠, A22285)을 사용하여 액틴 섬유를 검출하였다. 염색된 세포를 형광 현미경 (레이카(Leica) CTR6000)을 사용하여 가시화하고, 레이카 어플리케이션 스위트(Leica Application Suite) 소프트웨어를 사용하여 영상을 포획하였다. 공초점 현미경검사를 위해 세포를 형광 공초점 현미경 (자이스 LSM-510)을 사용하여 가시화하였다.
4일 동안 전기 자극을 적용한 후에, 도립 광학 현미경 (니콘 이클립스(Nikon Eclipse)-Ti) 상에 탑재된 상업적 원자력 현미경 (AFM) (바이오스콥 카탈리스트(Bioscope Catalyst); 브루커(Bruker))을 사용하여 래트 심장 조직 가닥을 시험하였다. 5 nN 촉발력을 사용하여 1 Hz 압입률로 심장 조직 가닥의 중심을 고르게 커버하기 위해 9곳의 특유한 지점에서 구형 팁 (반경 = 5-10 μm)을 사용하여 힘-압입 측정을 수행하였다. 캔틸레버 (MLCT-D, 브루커)는 0.03 N/m의 명목상 스프링 상수를 가졌다. 헤르츠 모델을 적용하여 만곡에 힘을 가하여 영률을 추정하였고, 상세한 데이터 분석은 다른 부분에 기재되어 있다30. 모든 AFM 측정은 유체 환경에서 실온에서 수행하였다.
투과 전자 현미경검사 (TEM)를 사용하여 조직을 또한 조사하였다. 조직 가닥을 0.1 M PBS 중 4% 파라포름알데히드, 1% 글루타르알데히드로 적어도 1시간 동안 고정시키고, PBS pH 7.2로 3회 세척하였다. 후고정을 0.1 M PBS, pH 7.2 중 1% 사산화오스뮴을 사용하여 1시간 동안 수행하고, 25에서 100%까지의 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시켰다. 에폰(Epon) 수지를 사용하여 조직에 침투시키고, 플라스틱 디쉬 내에서 40℃에서 48시간 동안 중합시켰다. 조직을 절편화 후에 우라닐 아세테이트 및 시트르산납으로 염색하였다. 히타치(Hitachi) H-7000 투과 전자 현미경에서 영상화를 수행하였다.
광학 맵핑을 위해, 조직 가닥을 전압 감수성 염료 (Di-4-ANEPPS 5μM, 인비트로젠)와 함께 따뜻한 타이로드 용액 (NaCl 118 mM, KCl, 4.7 mM, CaCl2 1.25 mM, MgSO4 0.6 mM, KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 25 mM, 글루코스 6 mM; 사용전 카르보젠 95% O2, 5% CO2를 적어도 20분 동안 짧게 버블링하여 산소를 공급함) 중 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 염료 형광을 고속 CMOS 카메라 (울티마(Ultima)-L, 시메디아(Scimedia))가 장착된 MVX-10 올림푸스 형광 현미경 상에서 기록하였다29-30. 1-cm 센서는 100x100 픽셀 해상도를 가졌고, 공간 해상도는 50 내지 100 m/픽셀로 달랐다. 200 프레임/s로 영상화를 수행하였다. 녹색 필터 (올림푸스 U-MWIG2 필터 큐브)가 포함된 수은 아크 공급원 (엑스-사이트 이그잭트(X-Cite Exacte))을 사용하여 형광을 여기시켰다. 마이크로조작기 (월드 프리시전 인스트루먼츠(World Precision Instruments)) 상에 탑재된 스테인레스 스틸 바늘 내에 삽입된 2개의 미세 와이어 (AWG#32)로 제조된 양극성 전극을 사용하여 구축물을 전기적으로 점-자극하였다. 전기장 자극을 위해, 도 3에 도시된 챔버를 사용하였다. 조직 가닥을 함유하는 플레이트를 가열된 플레이트 (MATS-U55S, 올림푸스) 상에 놓고, 온도를 38℃에서 조절하였다. 브레인비전(BrainVision) 소프트웨어 (시메디아)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
세포내 기록을 또한 채취하였다. 37 ± 0.5℃에서 높은-임피던스 유리 마이크로전극 (50-70 MΩ, 3 M KCl로 충전됨)을 사용하여 조직 가닥 내에서 활동 전위를 기록하였다. 95% O2 및 5% CO2로 평형화되고 최종 pH가 7.4인 118 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.8 CaCl2, 1.2 MgSO4, 23 NaHCO3, 20 글루코스, 2 Na-피루베이트를 함유하는 (mM 단위) 크렙 용액을 조직 가닥에 따랐다. 마이크로전극을 액소패치(Axopatch) 200B 증폭기 (액손 인스트루먼트(Axon Instrument)) 전류-클램프에 연결시켰다. 신호를 1 KHz에서 여과하고, 2 KHz에서 샘플링하고, 클램프피트(Clampfit) 10 (액손 인스트루먼트)으로 분석하였다. 휴지 전위를 I=0 모드에서 측정하였다. 일부 실험의 경우에, 조직 가닥을 전기장 자극 세트를 사용하여 2배의 흥분 역치로 조율하였다.
패치-클램프 기록을 채취하였다. 배양된 조직 가닥 또는 EB로부터 단리한 단세포를 라미닌-코팅된 유리 커버 슬립 (라미닌(Laminin), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 10 μg/cm2) 상에 밤새 시딩한 후에, 패치-클램프 실험을 수행하였다. 액소패치 200B 증폭기를 실온 (23-25℃)에서 사용하여 전세포 패치-클램프 기록을 행하였다. 클램프피트 8.0 (액손 인스트루먼트)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 세포의 휴지 전위를 측정하는 경우에는 증폭기를 I = 0으로 설정하였다. 활동 전위는 전류-클램프 모드 방법을 사용하여 기록하였다. 근세포를 1 Hz로 자극하고, 막 탈분극의 최대 속도, 활동 전위 피크 및 10th 활동 전위의 APD90을 측정하였다. 막 전위를 액체 경계 전위에 대해 교정하지 않았고, 이는 사용된 용액에 대해 15.9 mV (클램프피트 8.0으로 추정)인 것으로 추정되었다. Na+ 전류, hERG 전류 및 Ik1 전류를 또한 70-80% 직렬 저항 보상으로 전압-클램프 조건 하에 기록하였다. -120 mV에서 +30 mV 범위의 일련의 시험 펄스를 500 ms 동안 10 mV 증분으로 적용한 다음 활성화 측정에서 정상-상태를 위해 100 ms 동안 시험 펄스를 -10 mV로 적용함으로써, -80 mV의 유지 전위로부터 Na+ 전류를 유도하였다. 이러한 프로토콜은 중첩되는 전압-의존성 Ca2+ 전류를 동시에 활성화시키지만, 이들 Ca2+ 전류는 (프리펄스 프로토콜을 사용하여) 유발된 Na+ 전류의 3% 미만인 것으로 추정되었다. 2,000 ms 동안 15 mV 증분으로 -45 mV에서 60 mV 범위의 전압 스텝으로 탈분극 후에 -50 mV (500 ms 동안)로의 스텝에 반응한 꼬리 전류를 측정하여 hERG를 평가하였다. hERG 꼬리 전류의 피크 진폭을 측정하고 비교하였다. IK1 전류는 이들 연구와 동등한 것으로 확인된 2가지 방식으로 측정하였다. 완전한 I-V 관계를 위해, Ba2+ 부재 하에 측정된 전류로부터 500 μM Ba2+의 존재 하에 측정된 전류를 차감하여 (-40 mV의 유지 전위로부터 10 mV 증분으로 -120에서 -10 mV 범위의 전압 스텝을 위해 트레이스-트레이스) Ba2+-감수성 전류를 평가하였다. IK1 밀도를 측정하기 위해, -100 mV에서 Ba2+ 부재 하에 측정된 것으로부터 배경 전류를 차감하였다
140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 1.2 CaCl2, 10 HEPES, 10 D-글루코스를 함유하는 (mM 단위), NaOH에 의해 pH 7.35로 조정된 조 용액 중에서 패치-클램프 기록을 수행하였다. 120 칼륨 아스파르테이트, 20 KCl, 4 NaCl, 1 MgCl2, 5 MgATP, 10 HEPES, 10 EGTA를 함유하는 (mM 단위), KOH에 의해 pH 7.2로 조정된 용액으로 채운 경우에, 피펫 저항성은 약 5.5-7.5 MΩ였다 (계산된 K+의 반전 전위는 pH 조정 후에 -95.6mV임). 도페틸리드 100 nM31 및 BaCl2 500 μM11을 사용하여 hERG 전류 및 Ik1을 각각 차단하였다.
칼슘 과도 측정치를 채취하였다. 조직 가닥을 상기에 상세하게 기재된 바와 같이 콜라게나제 및 트립신과 함께 인큐베이션하여 해리시켰다. 해리된 심근세포를 성장 인자 무함유 매트리겔 (RPMI 배지 중 1:60으로 희석됨)-코팅된 25-mm 현미경 유리 커버슬립 상에 밤새 플레이팅하였다. 이어서 세포를 배양 배지 중 5 μM 플루오-4 아세톡시메틸 에스테르 (플루오-4 AM)와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 후속하여, 심근세포를 염료-무함유 배지로 2회 세척하고, 30분 동안 인큐베이터로 되돌려 놓았다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (자이스 LSM 510)을 사용하여 플루오-4 AM의 형광 강도를 측정하였다. 플루오-4 AM-로딩된 심근세포를 함유하는 커버슬립을 특별한 챔버 상으로 옮기고 단단히 고정시켰다. 대략 1.8-1.9 ml의 배양 배지를 챔버에 첨가하였고, 이를 현미경 상의 온도 제어-플레이트 (37℃) 상에 놓아 두었다. 플루오-4를 아르곤 레이저 (488 nm)를 통해 여기시키고, 505 nm 방출 필터를 통해 방출된 형광을 수집하였다. 시토졸 칼슘 농도의 일시적 변동을 나타내는 플루오-4 AM 형광 강도에서의 변화를 프레임 및 라인 스캔 모델에서 기록하였다. 영상 및 형광 데이터는 자이스 소프트웨어를 통해 획득하였다. 형광 데이터를 오리진(Origin) 8.5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 형광 신호 (F)를 플루오-4 AM 로딩 후 기준선 형광에 대해 정규화하였다. 신호의 상승기는 선형 모델에 의해 피팅시키고, 신호의 감쇠기는 오프셋(Offset) 모델을 사용하여 ExpDecay에 의해 피팅시켰다. 카페인, 베라파밀 (시그마) 및 탑시가르긴 (인비트로젠)을 영상화 동안 심근세포를 함유하는 챔버 내에 도면에 표시된 농도로 직접 첨가하였다. 박동 속도에서의 차이가 측정에 영향을 미치지 않도록 확실하게 하기 위해, 유사한 평균 박동 주파수로의 세포 박동 (대조군의 경우에 9.4 ± 0.7 bpm, 3 Hz의 경우에 9 ± 0.7 bpm, 및 6 Hz 요법의 경우에 10 ± 0.8 bpm)를 칼슘 과도 측정에 사용하였다.
정량적 RT-PCR을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다32. 하이 퓨어(High Pure) RNA 단리 키트 (로슈(Roche))를 사용하여 전체 RNA를 제조하고, RNase-무함유 DNase (로슈)로 처리하였다. 랜덤 육량체 및 올리고 (dT)를 슈퍼스크립트(SuperScript) VILO (인비트로젠)와 함께 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. RT-qPCR을 라이트사이클러(LightCycler) 480 SYBR 그린 I 마스터 (로슈)를 사용하여 라이트사이클러 480 (로슈) 상에서 수행하였다. 발현 수준을 하우스키핑 유전자 TATA 박스 결합 단백질 (TBP) 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)에 대해 정규화하였다. 올리고뉴클레오티드 서열을 도 28에 제시한 표 3에 요약한다.
유동 세포측정법 분석을 수행하였다. 조직 가닥 또는 EB로부터 상기 기재된 바와 같이 콜라게나제 및 트립신을 사용한 해리에 의해 세포를 수득하고, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 10분 동안 고정시켰다. 세포내 에피토프의 경우에, 세포를 빙상의 5% 소 태아 혈청 (FBS) 및 0.1% 트리톤 X를 함유하는 PBS 중에서 10분 동안 투과되게 한 후, 30분 동안 PBS 중 5% FBS의 차단 단계를 수행하였다. 세포를 빙상의 차단 완충제 중 하기 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다: 항-CD31-PE (1:100), 항-CD90-APC (1:500, BD 바이오사이언시스, 각각 553373 및 559879); 항-cTNT (1:100, 써모 사이언티픽, MS-295-P1); 항-칼포닌 H1 (1:250, 압캠, ab46794); 항-비멘틴 (1:100, 시그마 알드리치, V6630). 사용된 2차 항체는 항-마우스-알렉사 플루오르 488 (1:400, 인비트로젠, A21202) 및 항-토끼-Cy5 (1:500, 잭슨 이뮤노리서치, 111-175-144)였다. 각각의 검정에서 심근세포의 백분율에서의 내재적 가변성으로 인해, 각각의 마커에 대해 양성인 세포의 백분율 (상기 2차 항체만이 제어함)을 각각의 실험의 출발 세포 집단 (EBd20)에 대해 정규화하여 세포 집단에서의 변화가 발생한 경우에 정확하게 평가하였다.
조직 가닥을 (2X) 노벡스(Novex) 트리스-글리신 SDS 샘플 완충제 (라이프 테크놀로지스(Life technologies)) 중에 용해시키고, 노벡스 트리스-글리신 겔 (라이프 테크놀로지스) 내에서의 전기영동에 의해 단백질을 분리하고, 이를 바이오트레이스(Biotrace) NT (니트로셀룰로스, 폴 코포레이션(Pall Corp.))로 옮겼다. 막을 항-미오신 중쇄 (전체, 압캠, ab15), 포스포람반(포스포람반) 1D11 (토론토 대학의 에이.그라몰리니(A. Gramolini) 박사로부터) 또는 GAPDH (밀리포어, MAB374) 항체를 사용하여 프로빙하였다. 사용된 2차 항체는 퍼옥시다제 접합되었다 (DAKO, P0448 또는 P0447). 막을 ECL 시약 루미나타 클래시코 섭스트레이트(Luminata Classico Substrate) (밀리포어)를 사용하여 현상시켰다.
시그마플롯(SigmaPlot) 12.0을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 실험군 사이의 차이는 스튜던트 t 검정 또는 이원 ANOVA에 의해 분석하였다. 데이터의 정규성 및 분산에 기초하여 적절한 경우에 정규성 검정 (샤피로-윌크) 및 쌍별 다중 비교 절차 (홀름-시닥 방법)를 이원 ANOVA 검정 또는 카이-제곱 검정에 사용하였다. P< 0.05는 모든 통계적 검정에 대해 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 결과 및 논의
래트 심장 조직 가닥의 생성 및 특징화
개시된 장치는 본래의 심근의 매우 이방성인 구조의 시험관내 재현을 가능하게 할 수 있다. 지지 와이어는 심근세포가 그 주변에서 신장하고 정렬되는 템플릿으로서의 역할을 하는 생체내 모세혈관과 유사한 기능을 제공할 수 있다. 원발성 신생아 래트 심근세포를 사용하여 현수된 템플릿을 포함하는 마이크로제작된 PDMS 플랫폼 내의 유형 I 콜라겐-기반 겔 내부에 시딩함으로써 3D, 자기-어셈블리 심장 조직 가닥을 생성하였다. 시딩된 신생아 래트 심근세포 (8.75 x106개 세포/ml)는 1주 내에 봉합사 템플릿 주변에 콜라겐 겔 매트릭스를 재형성하고 수축시켜, 조직 가닥 구조를 형성하였다 (도 5a 참조). 세포-무함유 겔은 배양 시간 동안 압착되거나 분해되지 않았기 때문에 겔 압착은 시딩된 세포의 존재하에서만 발생하였고, 압착률은 세포 시딩 밀도와 양으로 상관되었다. 예시적인 장치의 치수를 맞춤화함으로써 상이한 치수의 심장 조직 가닥을 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 5b에 제시된 바와 같이 5 cm만큼 긴 조직 가닥을 생성할 수 있다. 적합한 치수의 장치를 사용하여 보다 긴 조직 가닥의 생성이 가능할 수 있다.
도 5c는 겔 압착의 정량화 및 심근세포의 초기 시딩 밀도에 대한 그의 의존성을 보여준다 (평균 ± SD, n = 3). 심근세포를 시딩하지 않은 경우에 (겔 단독), 겔은 압착되지 않고 조직 가닥 구조를 형성하지 않았다. 보다 높은 시딩 밀도 (200 x106개 세포/ml)를 갖는 조직 가닥은 재형성 동안 보다 낮은 시딩 밀도 (100 x106개 세포/ml)를 갖는 것보다 더 빨리 압착하였다.
도 6에 예시된 바와 같이, 봉합사 템플릿은 심근세포가 신장 및 정렬되도록 조직 가닥에서 토포그래피 지시를 제공할 수 있다. 도 6a는 DAPI로 대조염색된 핵 (좌측) 및 알렉사 488로 염색된 심장 트로포닌-T (cTnT) (우측)를 갖는 조직 가닥의 공초점 영상을 보여준다. DAPI로 대조염색된 세포 액의 영상 분석은 봉합사 템플릿의 축을 따른 핵 신장 및 정렬을 보여주었다. 도 6b에서, 단층으로서 배양된 vs. 조직 가닥 내에 시딩된 심장 세포의 핵 종횡비 (샘플당 ~1000개의 핵을 특징화함)를, 2개의 군 사이의 유의차 (***, p < 0.001)를 갖는 1st 사분위수, 중앙값, 및 3rd 사분위수를 보여주는 박스 플롯으로 제시한다. 도 6c는 조직 가닥 군 및 단층 군의 핵 종횡비의 분포를 보여주는 히스토그램이다 (평균 ± SD, 군당 n = 3). 단층 군에서 보다 낮은 종횡비 범위에서 유의하게 보다 높은 빈도가 존재하였고 (*, p < 0.05), 조직 가닥 군에서 보다 높은 종횡비 범위에서 보다 높은 빈도가 존재하였다 (#, p < 0.05). 또한 핵 배향의 특징화는 (도 6d 참조) 단층 군에서 핵의 무작위 분포를 보여준 반면에 (0°로서 무작위 방향), 배양된 조직 가닥 내의 세포 핵은 봉합사 템플릿의 축에 따라 배향되었다 (0°로서 봉합사 템플릿의 배향).
신생아 래트 심장 조직 가닥은 시딩 3 내지 4일 후에 자발적으로 박동하기 시작하여 겔 압착 동안 박동을 계속하였고, 이는 예시적인 장치가 히드로겔 매트릭스 내에서 세포의 전기기계적 커플링을 가능하게 함을 입증한다. 보다 높은 시딩 밀도 (200 x106개/ml)를 갖는 조직 가닥의 자발적 박동이 보다 빨리 시작되었고, 보다 낮은 시딩 밀도 (100 x106개/ml)를 갖는 것에서보다 더 우세하였으며, 이는 보다 많은 심근세포의 존재 및 보다 우수한 커플링의 결과인 것으로 생각된다. 면역조직화학 염색은 래트 심장 조직 가닥이 근절 단백질, cTnT를 발현함을 보여주었다 (도 6a, 우측 참조).
래트 조직 가닥의 전기 자극
개시된 실시예 1 장치의 다용도성을 입증하기 위해, 전기 자극을 추가로 적용하여 심근세포의 표현형을 개선시켰다. 도 7a는 상이한 전기 자극 조건 하에서의 조직 가닥의 실험 설정을 보여준다. 외부 자극기에 연결된 탄소 로드는 심장 조직 가닥에 대해 제4일에 시작하여 4일 동안 평행 또는 수직 전기장 자극을 제공하였다.
면역조직화학적 염색을 수행하였다. 도 7b는 상이한 전기 자극 조건의 적용 후의 배양된 래트 심근세포 조직 가닥의 대표적인 공초점 영상을 보여준다. 평행-자극된 조직 가닥은 비자극 (대조군) 및 수직-자극된 조직 가닥과 비교하여 봉합사 템플릿을 따라 배향된 더 많은 cTnT+ 구조 (좌측) 및 코넥신 43 (Cx-43)의 보다 강력한 발현 (우측)을 나타내었다. Cx-43은 심근세포 사이의 보다 우수한 커플링을 나타내는 인접한 심근세포 사이의 간극 연접에 대한 마커이다.
장치 밖에서 래트 심장 조직 가닥을 취급한 경우에, 평행-자극된 조직 가닥이 비자극 대조군보다 더 강성인 것으로 인식되었다. 이를 AFM 분석에 의해 추가로 평가하였고 (군당 n = 3), 비자극 대조군과 비교하여 평행-자극된 조직 가닥의 유의하게 (p = 0.009) 개선된 기계적 특성이 밝혀졌다 (도 7c 참조).
인간 심장 조직 가닥의 조작
지시된 분화 프로토콜로부터 수득한 hPSC-심근세포 및 지지 세포를 사용하여 템플릿 폴리디메틸실록산 (PDMS) 채널 내의 유형 I 콜라겐 겔 내 멸균 외과용 봉합사 주변에 세포 시딩함으로써 3D, 자기-어셈블리 심장 조직 가닥을 생성하였다. 도 8a-d는 Hes2 hESC-유래 심근세포를 사용하여 수득한 결과를 예시한다. 도 8a는 장치 템플릿 내에서 7일 동안의 hESC-심근세포의 사전-배양의 예시적인 영상을 보여준다. 시딩된 세포는 제1주 동안 콜라겐 겔 매트릭스를 재형성하고 ~40% 겔 압착으로 수축시켰다. 도 8b는 표시된 배양 일에서의 겔 압착의 정량화를 보여주며 (평균 +/- s.d., n = 3 (제0일), n = 4 (제1일-제7일)), 이는 ~600 μm의 최종 너비를 보여주었다. 이는 PDMS 템플릿으로부터 배양된 조직 가닥의 제거를 가능하게 하였다.
조직학은 봉합사의 축에 따른 세포 정렬을 보여주었다. 도 8c는 조직 가닥 절편의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 마송 트리크롬 (MT) 염색을 보여준다 (화살표는 봉합사 축을 나타냄). 조직 가닥은 시딩 2 내지 3일 후에 동시적 및 자발적으로 박동하는 것을 발견하였고, 겔 압착 후에 박동을 계속하였고, 이는 설정이 전기기계적 세포 커플링을 가능하게 함을 입증한다. 조직 가닥은 자발적 박동 주파수를 증가시킴으로써 전기적으로 조율될 수 있고, 생리학상 효능제, 예컨대 에피네프린 (β-아드레날린성 자극)에 반응할 수 있다. 도 8d는 임펄스 전파의 광학 맵핑을 보여준다. 임펄스 전파 기록 (좌측 트레이스 기록), 전기 자극에 대한 반응 (중간 트레이스 기록, 자극 주파수는 아래에 적색 트레이스로 도시됨) 및 약리학적 자극 하에서의 자발적 반응 빈도의 증가 (에피네프린, 우측 트레이스 기록)와 함께, 자발적 전기 활성을 보여주는 전위차 형광단 (DI-4-ANEPPS)으로 영상화된 조직 가닥의 대표적인 도면 (좌측).
1주 동안의 사전-배양 후에, 조직 가닥을 7일 동안 전기장 자극에 적용하거나 또는 자극 없이 배양하였다 (비자극 대조군) (도 3A에 제시된 바와 같음). 효과가 자극 속도에 따라 달라지는지 여부를 평가하기 위해, 자극 속도를 1에서 3 Hz로 (도 3A 참조, 저주파수 램프-업 요법, 이하 저주파수 또는 3 Hz로 지칭됨) 또는 1에서 6 Hz로 (도 3A 참조, 고주파수 램프-업 요법, 이하 고주파수 또는 6 Hz로 지칭됨) 점진적으로 매일 증가시키는 2가지 상이한 프로토콜을 사용하였다.
인간 자극된 조직 가닥에서의 생리학상 비대
배양 2주 후, 면역염색은 세포가 조직 가닥 도처에서 심장 수축 단백질 근절 α-액티닌, 액틴 및 심장 트로포닌 T를 강력하게 발현함을 입증하였다 (도 9a, 10, 11 및 12 참조).
도 9는 전기 자극과 조합되어 배양된 조직 가닥이 생리학상 세포 비대를 촉진하고 심근세포 표현형을 개선시킴을 보여준다. 도 9a는 심근세포 정렬 및 빈번한 Z 디스크를 보여주는 (화살표는 봉합사 축을 나타냄) 비자극 (대조군) 및 전기 자극된 조직 가닥 (3 및 6 Hz 램프-업)의 대표적인 공초점 영상을 보여준다. 축척 막대 20 μm. 도 9b는 상이한 조건에서의 심근세포 세포 형상의 분석을 보여준다 (로드 및 원형 둘 다의 경우에 평균 +/- s.d., EBd34 vs. 3 Hz P = 0.01; 원형 및 로드-형 둘 다의 경우에 EBd34 vs. 6 Hz P = 0.03). 군당 n = 3. 도 9c는 근절 구조 (근절 패널, 백색 막대; Z 디스크, 흑색 화살표; H 존, 백색 화살표; m, 미토콘드리아) 및 데스모솜의 존재 (데스모솜 패널, 백색 화살표)를 보여주는 비자극 (대조군) 및 전기 자극된 조직 가닥의 대표적인 초미세구조 영상을 보여준다. 축척 막대 1 μm. 도 9d는 H 존 대 근절의 비 (CTRL vs. 6 Hz, P = 0.005), I 밴드 대 Z 디스크의 비 (CTRL vs. 3 Hz, P = 0.01; CTRL vs. 6 Hz, P = 0.003) 및 막 길이당 데스모솜의 수 (CTRL vs. 6 Hz, P = 0.0003)를 보여주는 형태측정 분석을 보여준다 (평균 +/- s.d.). 조건당 n = 4. *는 군 및 대조군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. 정상 성체 세포에서 H 존 대 근절의 비는 1이고, I 밴드 대 Z 디스크의 비는 2이다. 도 9a-9d는 Hes2 hESC-유래 심근세포를 사용한 결과를 예시한다.
도 10은 배양된 조직 가닥의 형태학을 예시한다. 도 10a는 조직 가닥이 PDMS 템플릿으로부터 제거된 후 구조를 유지함을 보여준다. 도 10b는 (I) 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 (II) 마송 트리크롬 (MT) 염색된 조직 가닥 절편의 저배율 영상을 보여준다. (III) 상세한 봉합사/세포-함유 겔 계면을 보여주는 MT 염색된 절편의 고배율 영상. 도 10c는 상세한 근절 구조를 보여주는 α-액티닌 및 액틴 염색된 조직 가닥의 고배율 공초점 영상을 보여준다. 화살표는 봉합사 축을 나타낸다. 도 10a-10c는 Hes2 세포주로부터 수득된 hESC-유래 심근세포를 사용한 결과를 예시한다.
도 11은 CDI-MRB 세포주 hiPSC-유래 심근세포 조직 가닥이 또한 전기 자극에 적용한 경우에 성숙 징후를 나타냄을 예시한다. 도 11a는 심근세포 정렬 및 빈번한 Z 디스크를 보여주는 (화살표는 봉합사 축을 나타냄) 비자극 (대조군) 및 전기 자극된 조직 가닥 (6 Hz 램프-업 프로토콜)의 대표적인 공초점 영상을 보여준다. 도 11b는 전기 자극이 흥분 역치 및 조직 상호연결성을 개선시킴을 보여준다 (최대 포획률; CTRL vs. 6 Hz, P = 0.03, 점 자극에 의해 측정됨). 초미세구조 분석은 고주파수의 전기 자극 (6 Hz 램프-업 요법)이 심근세포 자기-조직화를 유도함을 입증하였다. 도 11c는 근절 구조를 보여주는 비자극 (대조군) 및 전기 자극된 조직 가닥의 대표적인 영상을 보여준다 (근절, 백색 막대; Z 디스크, 흑색 화살표; H 존, 백색 화살표; m, 미토콘드리아; 신생 삽입 디스크, 적색 화살표). 축척 막대 1 μm. 도 11d는 H 존 대 근절의 비 (CTRL vs. 6 Hz, P = 0.001) 및 I 밴드 대 Z 디스크의 비 (CTRL vs. 6 Hz, P = 0.004)를 보여주는 형태측정 분석을 보여준다 (평균 ± s.d.). 정상 성체 세포에서 H 존 대 근절의 비는 1이고, I 대 Z 디스크의 비는 2이다. 조건당 n = 3-4.
도 12는 전기 자극이 다른 hPSC-유래 심근세포의 성숙을 촉진함을 예시한다. 도 12a는 Hes3 세포주 hESC-유래 심근세포 조직 가닥에 대한 결과를 예시하고, 도 12b는 HR-I-2Cr-2R 세포주 hiPSC-유래 심근세포 조직 가닥에 대한 결과를 예시한다. 도 12a(I) 및 12b(I)는 심근세포 정렬 및 빈번한 Z 디스크를 보여주는 비자극 (대조군) 및 전기 자극된 조직 가닥 (6 Hz 램프-업 프로토콜)의 대표적인 공초점 영상을 보여준다. 도 12a(II) 및 12b(II)는 전기 자극이 hESC- 및 iPSC-유래 심장 조직 가닥의 흥분 역치 및 조직 상호연결성을 개선시킴을 보여준다 (최대 포획률, 점 자극에 의해 측정됨). 조건당 n = 4-7. 평균 ± s.d., *는 통계적 유의성을 나타낸다. 도 12a(III) 및 12b(III)는 심근세포 조직 가닥 자기-조직화의 초미세구조 분석을 보여준다 (Z 디스크, 흑색 화살표; 신생 삽입 디스크, 적색 화살표). 축척 막대 1 μm.
이들 예시적인 결과는 수축 기구의 근절 밴딩 (도 9a, 11 및 12 참조) 및 봉합사 축에 따른 근원섬유 정렬이 성체 심장의 구조와 질적으로 유사함을 보여준다22. 3 및 4주 동안 배양을 유지시킨 조직 가닥은 공초점 및 투과 전자 현미경검사에 의해 입증되는 바와 같이 세포 정렬 및 그의 수축 기구 구조를 유지하였다 (도 4 참조).
심장 발생 초기에, 심근세포는 출생 후에 로드-형상 표현형으로 분화되는 원형 형상 세포이다33. 성인 심근세포는 해리 직후에 로드-형 형상을 유지하면서34 구조적으로 경질 아키텍처를 나타내는 한편, hESC-심근세포는 원형을 유지한다. 연령 매칭 EB (EBd34) 및 조직 가닥을 해리하여 세포를 매트리겔-코팅된 플레이트 내에 시딩하였다. EBd34로부터 ~80%의 심근세포가 원형 표현형을 나타내었고, 전기 자극된 샘플에서 그 수는 유의하게 더 낮았다 (~50% 미만) (도 9b 참조). 로드-형 심근세포의 백분율은 EBd34와 비교하여 전기 자극된 조직 가닥에서 유의하게 더 높았다 (~4 배) (도 9b 참조).
도 13은 배양된 조직 가닥 내 세포에 대한 세포 종횡비의 분석을 보여준다. 분석은 전기 자극된 조직 가닥에서, 연령 매칭 배상체 (EBd34)로부터의 세포와 비교하여, 보다 로드-형으로의 세포 형상의 변화를 확인시켜 주었다. 심장 세포는 0.5 빈 증분으로 그의 종횡비에 따라 플롯팅하였다 (n = 3). 측정은 조직 가닥으로부터의 해리 후에 단세포 hESC-유래 심근세포 (Hes2 세포주)에서 수행하였다.
발생 동안, 심근세포는 증가된 세포 크기에 이어 근절 구조에서의 변화 및 태아 유전자의 하향조절을 특징으로 하는 생리학상 비대를 거친다35. 연령 매칭 EB (EBd34)로부터의 심근세포와 비교하여 조직 가닥 상태에서 심근세포 크기 (플레이팅된 세포의 면적)의 유의한 증가가 존재한다 (도 26의 표 1 참조, EBd34 vs. CTRL P = 0.034; EBd34 vs. 3 Hz P = 0.003; EBd34 vs. 6 Hz 요법 P = 0.01). 표 1에서, 배양 말미에 조직 가닥으로부터 해리시킨 단일 Hes2 hESC 유래 심근세포에 대해 측정을 수행하였다. *는 군 및 EBd34 사이의 통계적 유의성을 나타낸다. 세포 면적 (μm2), 평균 ± s.d., n = 3. 심방 나트륨이뇨 펩티드 (NPPA), 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (NPPB) 및 α-미오신 중쇄 (MYH6)는 태아 심근세포에서 고도로 발현되고 이환된 성체 심실 심근세포에서 병리학적 비대 동안 상향조절되는 분자이다.
도 14는 배양된 조직 가닥의 유전자 발현 분석을 보여준다. 분석은 심장 태아 유전자 프로그램의 하향조절 및 칼륨 채널 유전자의 상향조절을 보여주었다. 심장 트로포닌 T (TNNT), 코넥신43 (GJA1), 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (NPPB), 심방 나트륨이뇨 펩티드 (NPPA), α-미오신 중쇄 (MYH6), β-미오신 중쇄 (MYH7), 리아노딘 수용체 2 (RYR2), 칼륨 내향-정류 채널 유전자 (KCNJ2). 심장 태아 유전자 NPPA, NPPB 및 MYH6은 hESC-유래 심근세포 조직 가닥에서 유의하게 하향조절된 반면에, KCNJ2는 연령 매칭 EB와 비교하여 상향조절되었다 (EBd34; 평균 ± s.e.m., n = 3-6). Hes2 세포주 hESC-유래 심근세포.
세포 크기 증가와 더불어, 연령 매칭 EB와 비교하여 hESC-유래 심근세포 조직 가닥에서의 태아 심장 유전자 프로그램 (NPPA, NPPB, MYH6)의 하향조절은 (도 14 참조) 생리학상 비대 및 보다 성숙한 표현형을 시사한다. 세포 흥분성 및 K+ 항상성에서 중요한 역할을 하는 칼륨 내향-정류 채널 유전자 (KCNJ2)36는 EBd34와 비교하여 상향조절되었다.
조직 가닥에서 배양된 hESC-심근세포는 또한 EB에서의 그것보다 더 낮은 증식률을 나타내었고 (도 15 참조), 각각의 조건에서의 심근세포의 백분율은 2주 동안의 배양 후에 변화 없이 유지되었다 (48.2 ± 10.7%, 도 16 참조).
도 15는 배양된 조직 가닥에서의 심근세포 증식은 EB에서보다 낮음을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 증식은 근절 α-액티닌 및 Ki67에 대한 이중 염색에 의해 평가하였다 (조건당 n = 3-4, 평균 ± s.d.). *, **, # 및 &는 EBd34와 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (EBd20 vs. EBd34, P = 0.002; EBd34 vs. CTRL, P = 0.019; EBd34 vs. 3 Hz, P = 0.016; EBd34 vs. 6 Hz, P = 0.015). 측정은 조직 가닥으로부터의 해리 후의 단일 Hes2 hESC 유래 심근세포에 대해 수행하였다.
도 16은 조직 가닥 내 세포 집단이 배양 후에 유의하게 달라지지 않음을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 상이한 마커에 대해 양성인 세포의 백분율을 EBd20 (출발 집단)에 대해 정규화하였다. EBd20, EBd34 및 조직 가닥 (CTRL 및 6 Hz)으로부터의 세포를 CD31 (내피 세포), CD90 (섬유모세포), 칼포닌 (평활근 세포), 비멘틴 (모든 비-근세포) 및 심장 트로포닌 T (심근세포)에 대해 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다 (조건당 n = 3-6, 평균 ± s.d.). 조직 가닥으로부터의 해리 후에 hESC-유래 심근세포 Hes2 세포주를 사용한 결과를 보여준다.
EBd20 집단 내 CD31 (2.4 ± 1.5%, 내피 세포32), CD90 (34.4 ± 23%, 섬유모세포32), 칼포닌 (35 ± 22%, 평활근 세포) 또는 비멘틴 (80 ± 22%, 비-근세포) 양성 세포의 초기 백분율은 조직 가닥 배양 후에 대부분 유지되었고, 이는 관찰된 개선이 특정한 세포 유형의 유도와 관련이 없음을 시사한다.
배양된 인간 조직 가닥 내에서의 수축 기구의 성숙
비자극 조직 가닥 내의 세포는 잘-규정된 Z 디스크 및 근원섬유를 나타내었지만 (도 9c, 11 및 12 참조), Z 디스크 정렬의 어떠한 징후도 나타내지 않았다. 대조적으로, 고주파수 요법 하에 자극된 조직 가닥은 성숙의 징후, 예컨대 정렬된 Z 디스크를 수렴하고 나타내는 빈번한 근원섬유와 함께 조직화된 근절 밴딩 (도 9c, 6 Hz; 도 11 및 12 참조), 수많은 미토콘드리아 (도 9c, 6 Hz; 도 11 및 12 참조) 및 데스모솜 (도 9c 참조)을 나타내었다. 6 Hz 조건에서, 미토콘드리아는 대조군 또는 3 Hz 조건에서보다 수축 기구에 더 가까이 위치하였다 (도 9c, 6 Hz; 도 11 및 12 참조).
전기 자극된 샘플은 유의하게 더 높은 근절당 H-존 (도 9d 참조, CTRL vs. 6 Hz, P = 0.005; 도 11d, CTRL vs. 6 Hz, P = 0.001) 및 Z 디스크당 I-밴드 (도 11d 참조, CTRL vs. 3 Hz, P = 0.01; CTRL vs. 6 Hz, P = 0.003; 도 11d, CTRL vs. 6 Hz, P = 0.0004)의 존재에 의해 제시되는 바와 같이, 비자극 대조군보다 성숙한 세포와 더 상용성인 근절 조직화를 나타내었다. 6 Hz 요법으로 자극된 조직 가닥은 또한 비자극 대조군 및 3 Hz-자극된 조직 가닥 둘 다에 비해 막 길이당 유의하게 더 많은 수의 데스모솜을 나타내었다 (도 9d 참조, P = 0.0003). hiPSC-유래 심근세포 조직 가닥에서, 신생 삽입 디스크에 의한 면적이 빈번하게 관찰되었다 (도 11c 및 12b 참조).
인간 조작된 조직 가닥의 기능적 평가
도 17은 조작된 조직 가닥의 기능적 평가로부터의 예시적인 결과를 보여준다. 전기 자극은 흥분 역치 (도 17a) (CTRL (n = 4) vs. 6 Hz (n = 3), P = 0.03, 전기장 자극 및 비디오현미경검사에 의해 측정된 바와 같음; 3 Hz, n = 3), 최대 포획률 (도 17b) (CTRL (n = 4) vs. 6 Hz (n = 4), P = 0.022, 점 자극 및 광학 맵핑에 의해 측정된 바와 같음; 3 Hz, n = 3) 및 전기 임펄스 전파 속도 (도 17c) (CTRL (n = 13) vs. 3 Hz (n = 10), P = 0.014; CTRL vs. 6 Hz (n = 5), P = 0.011, 점 자극 및 광학 맵핑에 의해 측정된 바와 같음)를 개선시키는 것으로 발견되었다. 평균 +/- s.d. 도 17d는 조직 가닥에서의 전도 속도 활성화 맵의 대표적인 영상을 보여준다. *는 군 및 대조군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. 히트 맵 = 0에서 200 ms. 도 17a-17d는 Hes2 세포주로부터 수득된 hESC-유래 심근세포를 사용한 결과를 예시한다.
도 18은 6 Hz 램프 업 자극된 조직 가닥의 최대 포획률이 점 자극과 비교하여 전기장에 의해 더 높아짐을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 도 18a는 예시적인 전기 점 자극을 보여준다. 도 18a(I)에서, 자극 주파수를 적색으로 제시하고, 자극 부위에서 근위 (하부 트레이싱) 및 원위 (상부 트레이싱) 포획을 흑색으로 제시한다. 각각의 신호 사이의 시간 지연은 전도 속도의 표시를 제공한다. 근위 및 원위 부위 둘 다에서의 전파 신호의 일치하는 포획은 조직 가닥에서의 기능적 차단의 부재 및 양호한 전기 집적을 입증하였다. 도 18a(II)에서, 3, 4, 5 및 6 Hz에서의 I에 표시된 신호의 증폭은 4 Hz를 초과하면 1:1 포획이 사라지고 이때 포획은 2:1이 됨을 입증하였다. 근위 및 원위 부위 사이에서의 전파는 4 Hz를 초과하여 자극된 경우에 1:1로 남아있었다. 영상에서 적색 동그라미는 점 자극 부위를 나타낸다. 도 18b는 예시적인 전기장 자극을 보여준다. 도 18b(I)에서, 전기장 자극 주파수를 적색 트레이싱으로 제시하고, 조직 가닥의 상이한 부위에서의 포획을 흑색으로 제시한다. 예상되는 바와 같이, 각각의 신호 사이에는 어떠한 시간 지연도 관찰되지 않았고, 세포는 대략 동일한 시간에 전기 자극을 수용함을 나타내었다. 도 18b(II)에 제시된 바와 같이 1:1 속도로의 포획은 5.2 Hz를 초과하여 사라졌고, 이때 이는 6 Hz에서 간헐적이 되었다. 도 18a-18b는 hESC-유래 심근세포 Hes2 세포주를 사용한 결과를 예시한다.
도 19는 데스모솜의 존재와 상관되는, 전도 속도에서의 개선을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 전도 속도는, 세포내 필라멘트를 세포 표면 단백질에 연결시키고, 수축 및 힘 전달 동안 심장 근육의 완전성을 유지시키는 것을 담당하는 세포 부착 단백질의 분자 복합체인 데스모솜의 수와 직접 상관된다 (R2 = 0.8526, CV vs. 데스모솜의 평균 수/면적). Hes2 세포주 hESC-유래 심근세포.
6 Hz 요법을 사용한 전기 자극은 배양된 조직 가닥의 전기 특성을 유의하게 개선시켰고, 이는 임펄스 전파의 광학 맵핑과 함께 배양 말미에 점 자극에 의해 분석된 바와 같이 (도 18a 참조), 흥분 역치에서의 통계적으로 유의한 감소 (도 19a 참조, CTRL vs. 6 Hz, P = 0.03) 및 최대 포획률에서의 증가 (도 19b 참조, CTRL vs. 6 Hz, P = 0.022, 도 11, 12)로 이어졌다. 광학 맵핑은 점 자극 (4 Hz)에 의한 것보다 전기장 자극 (5.2 Hz)에 의해 더 큰 MCR을 입증하였다 (도 18b 참조, 6 Hz에서의 간헐적 포획과 함께 5.2 Hz 포획). 전기장 자극 동안, 모든 세포는 동시에 자극을 수용하였고, 반응은 각각의 세포의 전파 한계에 의해 제한되지 않았다. 배양 말미에 점 자극으로 평가된 전도 속도 (CV)는 ~40였고, 비자극 대조군과 비교하여 배양 동안 전기 자극된 샘플에서 (각각 3 Hz 및 6 Hz) ~50% 더 높았다 (도 17c 및 17d 참조, CTRL vs. 3 Hz, P = 0.014; CTRL vs. 6 Hz, P = 0.011). 전기 특성 (ET, MCR 및 CV)에서의 개선은 저주파수 요법과 비교하여 고주파수 요법에 의해 더 두드러졌다. 전도 속도에서의 개선은 세포-세포 부착 단백질의 분자 복합체인 데스모솜의 평균 수와 직접 상관되는 것으로 발견되었다 (도 19 참조, R2 = 0.8526).
자극은 배양된 인간 조직 가닥에서 Ca2+ 취급 특성을 개선시킨다
도 20은 전기 자극이 Ca2+ 취급 특성에서 개선을 촉진한다는 것을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 예시적인 결과는 비자극 대조군 세포 (도 20a), 3 Hz 램프-업 (도 20b), 및 6 Hz 램프-업 프로토콜 (도 20c)에서의 카페인에 반응한 Ca2+ 방출을 입증한다. 도 20d는 상이한 실험 군 사이에서 피크 형광 강도의 카페인-유도된 변화를 입증하는 예시적인 결과를 보여준다 (카페인의 투여 전 피크 형광 강도를 정규화한 후 평균 ± s.e.m.) (CTRL vs. 3 Hz, P = 1.1x10-6; CTRL vs. 6 Hz, P = 2.1 x10-7; 3 Hz vs. 6 Hz, P = 0.003; n = 10 (CTRL), n = 8 (3 Hz) 및 n = 9 (6 Hz). 도 20e는 6 Hz 자극된 세포에서 카페인 5 mM (화살표)의 투여 전 및 후의 Ca2+ 과도의 대표적인 형광 기록을 보여준다. 예시적인 결과는 또한 6 Hz 세포에서의 카페인 첨가 전 베라파밀 (도 20f) 또는 니페디핀 (도 20g)에 의한 L-유형 Ca2+ 채널의 억제 및 탑시가르긴 (도 20h)에 의한 SERCA 채널의 차단을 입증한다. *는 군 및 대조군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. #는 3 Hz 및 6 Hz 군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. 도 20a-20h는 Hes2 세포주로부터 수득된 hESC-유래 심근세포를 사용한 결과를 예시하고, 조직 가닥으로부터의 해리 후에 단세포 심근세포에서 수행된 측정을 나타낸다.
모든10 또는 대부분의12 hESC-심근세포는 수축을 위해 근소포체 Ca2+ 방출보다 근초 Ca2+ 유입에 의존하며, 이는 성체 심근과 뚜렷하게 다르다. 근소포체 리아노딘 채널 개방제인 카페인의 효과를 조직 가닥으로부터 단리된 단세포 내 시토졸 Ca2+에 대해 시험하였다. 이전의 작업에 따르면10, 비자극 대조군의 어떠한 hESC-심근세포도 카페인에 반응하지 않았지만 (도 20a 참조), 3 및 6 Hz 조건 둘 다로 전기 자극된 세포는 시토졸 Ca2+의 증가를 유도함으로써 카페인에 반응하였다 (도 20b 및 20c 참조). Ca2+ 과도 진폭의 정량화는 전기 자극된 세포가 비자극 대조군과 비교하여 자극 주파수 의존성 방식으로 카페인에 반응하여 유의하게 더 높은 진폭 강도를 나타냄을 보여주었다 (도 20d 및 20e 참조). 6 Hz 조직 가닥으로부터의 세포 내 L-유형 Ca2+ 채널의 베라파밀 (도 20f 참조) 또는 니페디핀 (도 20g 참조)에 의한 차단은, 성숙한 세포에서 예상되는 바와 같이, Ca2+ 과도의 중지로 이어졌다. L-유형 Ca2+ 채널의 차단후 카페인의 첨가는 시토졸 내로의 Ca2+ 방출로 이어?병? (도 20f 및 20g 참조). 탑시가르긴의 첨가에 의한 근소포체 Ca2+ ATPase (SERCA)의 이온 수송 활성의 차단은 (도 20h 참조) 근소포체로부터 Ca2+의 고갈로 인해 시간의 경과에 따라 칼슘 과도의 중지로 이어졌다. 6 Hz 조건으로부터의 심근세포는 또한 시토졸 내로의 Ca2+ 방출의 동역학을 나타내는 파라미터인 보다 신속한 상승 기울기 및 피크까지의 시간, 및 시토졸로부터 Ca2+ 클리어런스의 동역학을 나타내는 파라미터인 보다 신속한 τ-감쇠 및 베이스까지의 시간을 입증하였다 (도 27의 표 2 참조). 표 2는 6 Hz 요법으로 자극된 심근세포에서의 Ca2+ 취급 특성에서의 변화가 보다 성숙한 Ca2+ 취급 특성과 상용가능함을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 측정은 배양 말미에 조직 가닥으로부터 해리한 단수화 심근세포에 대해 수행하였다. *는 통계적 유의성 vs. 비자극 대조군을 나타낸다 (평균 ± s.e.m.).
종합하면, 이들 데이터는 배양 동안 6 Hz 자극 요법을 거친 심장 조직 가닥은 기능적 근소포체와 상용가능한 Ca2+ 취급 특성을 나타냄을 보여주었다.
자극은 배양된 인간 조직 가닥 전기생리학적 특성을 변경한다.
도 21은 배양된 조직 가닥으로부터 단리되고 패치-클램프에 의해 기록된 단세포 심근세포 또는 배상체에서의 전기생리학적 특성을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 6개의 Hz 자극된 조직 가닥 (흑색), 대조군 조직 가닥 (백색), EBd44 및 EBd20을 나타낸다. 예시적인 결과는 hERG 꼬리 전류 밀도 (도 26a), -100 mV에서 측정된 IK1 전류 밀도 (도 21b), 세포 정전용량 (도 21c), 휴지 막 전위 (도 21d), 활동 전위의 최대 탈분극률 (도 21e), 활동 전위 피크 전압 (도 21f), 90% 재분극에서 측정된 활동 전위 지속기간 (도 21g) 및 자발적 박동 (자동성) 또는 비 자발적 박동 (비 자동성)을 나타내는 세포의 비 (도 21h)를 보여준다. 도 21a-21h는 Hes2 세포주로부터 수득된 hESC-유래 심근세포를 사용한 결과를 예시한다. 평균 ± s.e.m.
도 22는 6 Hz 또는 대조군 조직 가닥으로부터 단리된 단일 심근세포에서의 hERG 전류 및 IK1에 대한 전기 자극의 효과를 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 예시적인 결과는 hERG 전류의 대표적인 트레이스 (도 22a 및 22b), 6 Hz-자극된 조직 가닥으로부터 단리된 심근세포의 활동 전위 구성에 대한 도페틸리드의 효과 (도 22c), hERG 꼬리 전류의 전류 밀도-전압 관계 (삽도는 hERG의 꼬리 전류 부분의 확대도 및 기록 프로토콜을 나타냄) (도 22d), IK1의 대표적인 트레이스 (도 22e 및 22f), 및 IK1의 전류 밀도-전압 곡선 (도 22g)을 보여준다. 도 22a-22g는 조직 가닥으로부터의 해리 후의 hESC-유래 심근세포 Hes2 세포주를 사용한 결과를 예시한다. 평균 ± s.e.m.
도 23은 조직 가닥으로부터 단리된 단일 심근세포에서의 Na+ 전류, 활동 전위 피크, 막 전도도, 막 전도도-휴지 전위 곡선 및 IK1-휴지 전위 곡선에 대한 전기 자극의 효과를 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 예시적인 결과는 6 Hz 및 대조군 조직 가닥으로부터 기록된 활성화 트레이스에서의 대표적인 Na+ 전류 정상-상태의 확대도 (도 23a 및 23b, 삽도는 원래의 트레이스의 전면도 및 기록 프로토콜임), 활성화 곡선에서 Na+ 전류 정상-상태, 6 Hz 군 V1/2 = -61.06 ± 0.65 mV; 대조군 V1/2 = -71.24 ± 0.24mV 및 EBd44 군 V1/2 = -70.35 ± 0.60 mV (도 23c), Na+ 전류 밀도 (도 23d), 활동 전위 진폭 (도 23e), -100 mV에서의 막 전도도 (도 23f), 막 전도도-휴지 전위 관계 곡선 (도 28g), 및 IK1-휴지 전위 관계 곡선 (도 23h)을 보여준다. 도 23a-23h는 hESC-유래 심근세포 Hes2 세포주를 사용한 결과를 예시한다. 평균 ± s.e.m.
도 24는 높은-임피던스 유리 마이크로전극을 사용하여 기록된, 무손상 6 Hz 조직 가닥에서의 활동 전위 지속기간 속도-의존성 적응 및 휴지 전위를 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 예시적인 결과는 1, 3 및 5.5 Hz의 전기장 자극을 사용하여 기록한 6 Hz 램프 업 조직 가닥의 활동 전위 (도 24a), 6 Hz 조직 가닥에서의 자발 전위 (도 24b), 6 Hz 램프-업 자극 요법을 거친 조직 가닥에서 90% 재분극 (APD90) 시 측정된 활동 전위 지속기간의 속도-의존성 적응 (도 24c), 휴지 전위 (도 24d) 및 무손상 조직 가닥에서의 활동 전위의 피크 전압 (도 24e)을 보여준다. 도 24a-24e는 hESC-유래 심근세포 Hes2 세포주를 사용한 결과를 예시한다. 평균 ± s.e.m.
성숙도를 평가하기 위해, 조직 가닥 및 EB로부터 유래된 심근세포에서 활동 전위, hERG 및 IK1 전류를 측정하였다11 (도 21 참조). hERG 전류는 비자극 대조군 (0.52 ± 0.10 pA/pF)보다 6 Hz-자극된 조직 가닥 (0.81 ± 0.09 pA/pF)에서 더 컸고 (P = 0.0434) (도 21a 참조) 그의 생물물리학적 특성에는 차이가 없었다 (도 22 참조). 둘 다의 조직 가닥 군으로부터의 심근세포는 제20일 또는 제44일에 EB로부터의 것과 비교하여 더 높은 hERG 수준을 가졌다 (도 21a 참조). 유사하게, IK1 밀도는 대조군 (0.94 ± 0.14 pA/pF, CTRL)보다 6 Hz- 조직 가닥 (1.53 ± 0.25 pA/pF, 6 Hz)에서 더 컸고 (P = 0.0406), 둘 다의 조직 가닥 군에서의 IK1 수준은 EB-유래 심근세포에서 기록된 것보다 더 컸다 (P = 0.0005) (도 21b 참조). 세포 크기의 척도인 세포 정전용량은 대조군 조직 가닥 (14.23 ± 0.90 pF; CTRL)과 비교하여 6 Hz- 조직 가닥 (19.59 ± 1.41 pF; 6 Hz)에서 더 큰 (P = 0.0052) 값 및 EB-유래 심근세포에서 더 작은 (P = 0.0041) 정전용량을 나타내었다 (도 21c 참조). 조직 가닥으로부터의 심근세포의 휴지 막 전위 (Vrest)는 EB-심근세포에서보다 더 음성이었다 (P< 0.0001) (도 21d 참조). 흥미롭게도, ~16 mV인 액체 경계 전위에 대해 보정한 후에, 패치-클램프 방법에 의해 조직 가닥 심근세포에서 기록된 Vrest의 값은 K+에 대한 네른스트 전위에 대한 평형 전위 훨씬 미만이었고 (EK = -96 mV), 이는 Na+ 펌프에 의해 생성될 수 있는37-38 과분극 전류가 Vrest에 강력하게 영향을 미친다는 것을 시사한다. 이와 일치하여, 조직 가닥으로부터의 심근세포는 매우 낮은 휴지 막 전도도를 갖고, 이는 Vrest와 상관되는 반면에 (R = 0.5584, P< 0.0001), IK1 전류는 Vrest와 음의 상관관계를 나타냄을 발견하였다 (R = 0.2267, P = 0.0216, 도 23 참조). 최대 탈분극률 (도 21e 참조) 및 활동 전위의 피크 전압 (도 21f 참조)은 2개의 조직 가닥 군 사이에 상이하지 않았다. 그러나, 둘 다의 특성은 EB와 비교하여 개선되었다 (각각 P = 0.5248 및 P = 0.0488). 활동 전위 지속기간은 더 길었고 (P = 0.0021), 조직 가닥-유래 심근세포보다 EB-유래 심근세포에서 더 크게 변동되었으며 (도 21g 및 24 참조), 이는 조직 가닥의 보다 적은 전기생리학적 다양성 및 보다 많은 성숙을 시사한다. 자동성은 대조군 조직 가닥과 비교하여 EB-유래 심근세포에서 더 컸고 (P = 0.0414) (도 21h), 이는 6 Hz-자극된 조직 가닥과 대등하였다. 종합하면, 이들 결과는 조직 가닥 및 6 Hz 요법으로의 전기 자극이 전기생리학적 성숙을 촉진한다는 결론을 지지한다.
배양된 인간 조직 가닥에서의 전기생리학적 측정
봉합사는 주위 심장 조직보다 더 강성이기 때문에, 봉합사의 존재는 능동 힘 및 기계적 자극 둘 다의 직접 측정을 막는다. 이러한 한계는 생분해성 봉합사의 사용에 의한 추가 연구에서 극복될 수 있다. 따라서, 제시되는 전기생리학적 측정 (도 21 참조)을 사용하여 조건화된 세포의 기능적 성숙을 측정하였다. 모든 측정치, hERG 전류, IK1 전류, 세포 정전용량, 휴지 막 전위, 최대 탈분극률, 활동 전위의 피크 전압, 활동 전위 지속기간 및 자동성은 EB 대조군에서 배양된 것과 비교하여 조직 가닥에서 배양된 심근세포에서 개선을 나타내었다. 조직 가닥의 전기 자극은 hERG, IK1 및 세포 정전용량을 증진시켰지만 (도 21a-21b 참조), 다른 척도에 따르면 자극 및 비자극 조직 가닥 사이에 어떠한 차이도 없었다. 특히, 활동 전위 동안 막 탈분극의 최대 속도는 6 Hz 및 대조군 조직 가닥 사이에 상이하지 않았고 (P = 0.5248) (도 21e 참조, 122.5 ± 9.30 mV/ms; 6 Hz vs. 111.8 ± 14.67 mV/ms; CTRL), 관찰사항은 조직 가닥 군 사이에 Na+ 전류 밀도에서의 차이의 결여와 상관되었다 (도 23d 참조). Vrest는 단일 단리된 근세포의 패치-클램프 기록 (-98.58 ± 2.87 mV; 6 Hz vs. -99.44 ± 5.37 mV; CTRL) 또는 무손상 조직 가닥에서의 예리한 마이크로전극 기록 (-97.08 ± 3.95 mV; 6 Hz vs. -98.5 ± 6.09 mV; CTRL, P = 0.8425, 도 24 참조)을 사용한 경우에 조직 가닥 군 사이에 상이하지 않았다 (P = 0.88). 6Hz로 자극된 조직 가닥은 또한 활동 전위 지속기간의 속도-의존성 적응을 나타내었고, 1 Hz에서 5.5 Hz로의 자극 주파수의 증가에 의해 활동 전위 지속기간은 감소되었다 (도 24 참조).
세포 정전용량 측정치는 비자극 대조군과 비교하여 6 Hz-자극 요법에서 표 1의 크기 측정치와 일치하였고 (도 26 참조), 이는 전기 자극이 조직 가닥 내 심근세포의 성숙을 유도함을 시사한다. 정전용량 측정치는 EB와 비교하여 6 Hz 자극된 hESC-심근세포 조직 가닥의 세포 크기에서의 개선을 예시하지만, 상기 값은 성인 심실 근세포와 일치하는 크기는 달성되지 않음을 분명하게 나타내었다. 새롭게 단리된 건강한 성인 심실 심근세포의 정전용량은 179-227 pF 범위인 것으로 보고되어 있고39; 새롭게 단리된 성인 심방 심근세포의 정전용량은 66 pF인 것으로 보고되어 있다. 흥미롭게도, 2D 기판 상에서의 배양 1일 후에 성체 심방 심근세포의 정전용량은 23 pF로 저하되었고40, 이는 심근세포의 그의 3D 환경으로부터의 제거는 세포 정전용량에 현저하게 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 본원에 보고된 정전용량 값은 심장-특이적 내인성 MYH6 프로모터로부터의 제어되는 블라스티시딘-저항성 유전자 발현을 조작하는 것에 의해 유래된 iPSC-심근세포에 대해 타인이 보고한 값보다 작았지만 (15.8-88.7 pF)4, 다른 hESC-심근세포 (21.6 ± 1.3 pF, 7 내지 40 pF 범위) 및 인간 태아 심근세포 보고값 (연령 90-110일, 20.3 ± 4.6 pF)과 유사하였다41-42. hPSC의 분화된 자손이 매우 초기의 인간 발생 (< 6주)을 반영한 것으로 기재되어 있기 때문에43, 시험관내 성숙에 필요한 전기 자극 속도는 생체내 배아 발생과 상이할 가능성이 있다. 이에 불구하고, 점진적으로 보다 높은 전기 자극 속도에 의해 수득한 시험관내 심장 조직 가닥의 주목할 만한 성숙은 시험관내에서 보다 성숙한 수축성 심장 조직을 생성하기 위한 중요한 도구를 제공하였다.
배양된 조직 가닥은 미오신 중쇄 및 포스포람반의 발현을 유사한 수준으로 나타내었다.
도 25는 선택된 심장 단백질의 조직 가닥에서의 발현이 상이한 조건에서 유사함을 입증하는 예시적인 결과를 제시한다. 예시적인 결과는 조직 가닥 용해물 (n = 3)의 웨스턴 블롯팅에 의해 평가된 전체 심장 미오신 중쇄 발현 (도 25a) 및 포스포람반 발현 (도 25b)을 보여준다. 도 25a-25b는 hESC-유래 심근세포 Hes2 세포주를 사용한 결과를 예시한다.
심근세포 근원섬유 초미세구조에서의 변화가 수축성 단백질 발현에서의 변화와 연관되는지 여부를 조사하기 위해, 웨스턴 블롯팅에 의해 조직 가닥에서 전체 미오신 중쇄 (MHC)의 발현을 분석하였고 (도 25a 참조), 전체 MHC는 전기 자극 (3 및 6 Hz) 및 비자극 (CTRL) 심장 조직 가닥에서 유사한 수준으로 발현됨을 발견하였다. 또한, Ca2+ 흡수의 조절에 관여하고, 기능적 근소포체를 나타내지 않는 hESC-심근세포에서 부재하는 것으로 이전에 기재된 바 있는10 근소포체 분자인 포스포람반의 발현을 또한 조사하였다. 포스포람반은 사실, hESC-심근세포 조직 가닥에 유사한 수준으로 존재하는 것으로 발견되었다 (도 25b 참조).
hESC-심근세포 내 기능적 근소포체 결여의 가능한 원인은 포스포람반 발현의 결여인 것으로 보고되어 있다10. 본 연구의 모든 조건에서 세포 내 포스포람반 발현은 유사한 수준으로 검출될 수 있었고, 이는 이것이 전기 자극에 의해 개선된 Ca2+ 취급 특성의 원인이 아님을 시사한다. 본 연구 및 이전의10 연구에서 세포 사이의 포스포람반 발현에서의 차이는, 본 연구가 지시된 분화 프로토콜을 사용하는 반면에 다른 연구10는 혈청-기반 자발적 분화로부터의 심근세포를 사용하였다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
전기장 자극은 이전에 원발성 공급원 및 동물 조직으로부터의 세포와 함께 사용되었지만22-23, 3D 조직 조립의 기하학적 제어 및 hPSC-유래 심근세포 및 지지 세포의 전기 자극의 조합이 인간 심장 조직의 전기 및 초미세구조 특성을 개선시켜, 세포 성숙을 발생시킨다는 것이 본원에서 최초로 제시된다. 조직 가닥 봉합사 매트릭스 재형성 동안 장치 플랫폼에 고정된 채로 유지되어, 봉합사 축에 따른 세포 정렬을 발생시키는 장력을 생성한다.
정상 인간 태아 심박수는 대체로 ~3 Hz로 유지되는 반면에44 성인 휴지 심박수는 ~1 Hz로44 유의하게 다르다. 속도 변화는 수축성 단백질 발현에서의 변화와 연관되고, 이는 자극 속도에 대한 심장 성숙의 가능한 의존성을 시사한다. 1에서 6 Hz로의 점진적인 증가가 시험된 최고의 조건이라는 사실은 3 Hz가 평균 태아 심박수라는 점에서 놀라운 것이다44. 이는 시험관내 설정에서 다른 중요한 세포 유형의 결여에 대한 보상 메카니즘 및 세포-세포 발생 가이던스일 수 있다. 전기장 자극 주파수를 배양 중 7일에 걸쳐 서서히 증가시키기 때문에, 6 Hz 군은 자극의 가장 마지막 날에서만 포획을 상실할 수 있다 (속도 5.2 Hz 초과). 따라서, 이는 최고 가능한 속도에서의 자극일 수 있고, 속도 그 자체가 아니며, 시험관내 심근세포 성숙에 대한 통제 지시이다.
자극 조건에서 명백한 가시성 Z 디스크, H 존 및 I 밴드를 갖는 개선된 세포 및 근필라멘트 구조는 자극된 조직 가닥의 보다 우수한 전기 특성, 예컨대 보다 낮은 ET, 보다 높은 MCR, 보다 높은 전도 속도, 개선된 전기생리학적 및 Ca2+ 취급 특성, 및 칼륨 내향-정류 채널 유전자 (KCNJ2)의 상향조절과 상관되었다. M-선 및 T-관의 결여는, 이전의 보고와 일치하여45-46, 말단 분화의 부재를 나타내었다. EB와 비교하여 조직 가닥에서 구조 단백질 mRNA의 하향조절이 존재하였지만, 단백질 수준에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 기계적 자극은 구조 단백질, 예컨대 미오신 중쇄의 강건한 유도로 이어지고, hPSC-유래 심근세포의 증식을 유도하는 것으로 보고되어 있고14,47, 이는 6 Hz로의 조직 가닥의 전기 자극이 단순히 보다 우수한 기계적 자극 환경을 제공하는 것이 아님을 시사한다. 이전에, 기계적 자극은 전기생리학적 성숙으로 이어지지 않았다47. 공동으로 또는 순차적으로 심장 부하의 모방으로서 스트레치와 함께 전기 자극의 사용은14 hPSC-유래 심근세포에서 말단 분화를 유도하고 근필라멘트 단백질의 발현을 상향조절하기 위해 요구될 수 있다. 다른 전략은 T3 갑상선 호르몬 48, 인슐린 유사 성장 인자-1 의 존재 하에서의 배양49, 라미닌 또는 본래의 탈세포화 심장 ECM의 히드로겔 혼합물에의 첨가50 및 보다 강성인 기판 상에서의 배양51,52을 포함할 수 있다.
일부 인간 줄기 세포주가 다른 것보다 더 심근세포성이고12,16 이들 차이는 또한 생산된 세포의 성숙도와 관련될 수 있는 것으로 널리 받아들여진다. 이전의 보고에서10-11,53, 많은 및 통상적으로 대부분의 세포가 분화의 말미에 카페인에 대해 비반응성이었다. 따라서, Ca2+ 취급 특성에서의 차이는 또한 세포주 가변성으로 인할 수 있다. 본원에서, 주어진 세포주 내에서, 조직 가닥에서의 배양 및 전기장 자극은 기능적 근소포체와 일치하게 심근세포의 Ca2+ 취급 특성을 증진시키는 것으로 입증되었다.
조직 가닥 심근세포는 EBd20 또는 EBd44로부터 수득된 심근세포보다 분명히 더 성숙하였고, 이는 자동성에 대한 더 큰 성향, 보다 탈분극된 막 전위, 감소된 세포 정전용량 및 더 적은 hERG 및 IK1 전류를 보여주었다. EBd20 심근세포의 전기생리학적 측정은 조직 가닥 내로의 그의 혼입 전에 세포 특성을 나타내었고, EBd44 심근세포는 조직 가닥 배양 시간보다 약간 더 긴 기간 동안 배양되어, 성숙에 대한 배양 시간의 독립적 효과의 평가를 가능하게 하였다54,11. 낮은 막 전도도와 EK 미만의 Vrest의 조합이, 심근세포가 배아 상태로부터 성숙을 거침에 따라 "중간체" 표현형을 나타낼 수 있는 것으로 생각되는 것이 흥미롭다.
조직 가닥에서의 hPSC-심근세포의 특성을 마우스 또는 인간 발생과 상관시키는 것은 성숙 단계를 측정하는데 도움이 될 수 있지만, 설치류 심근세포는 생리학상 특유하고, 연령-규정된 건강한 인간 심장 샘플은 불충분하다. 또한, 시험관내 성숙은 배아 발생과 상용가능하지 않을 수 있다. 겔 압착 시 작은 크기 (반경 ~300 μm)의 조직 가닥은 조직 가닥이 관류 없이 배양물 중에 유지될 수 있는 것을 보장하기 위해 산소 공급을 위한 확산 한계에 가깝게 선택되었다. 혈관 세포의 첨가는 생존을 개선시키고 이후의 생체내 연구에서 숙주 조직과의 통합을 촉진하기 위해 필수적일 것이다14. 따라서, 실시예 1A의 장치는 이후의 생체내 연구에서 세포가 생존하고 최저의 부작용 (예를 들어 부정맥)으로 성체 심장에 통합되는 최고의 능력을 생성할 최적 성숙 수준을 결정하는데 사용될 수 있는, 등급화된 성숙 수준의 인간 심장 조직의 생성을 가능하게 하는 고유한 플랫폼을 제공할 수 있다.
실시예 2: 바이오튜브
A. 예시적인 중공/관류가능한 와이어 실시양태 (즉, 바이오튜브)의 구조, 제조, 및 사용
제2 실시양태에서, 본 발명은 웰 또는 채널, 채널의 길이에 걸쳐 지지되거나 현수된 내강을 포함하는 종방향 스캐폴드를 갖는 생물반응기를 포함하는 관류가능한 내강을 포함하는, 3차원 조직을 성장시키기 위한 생물반응기 장치에 관한 것으로, 여기서 생물반응기 및 채널은 내강을 포함하는 조직 가닥을 형성시키기에 충분하게 내부에 시딩된 세포를 수용하도록 구성된다. 심장 세포 (또는 다른 전기적 자극 세포)를 수반하는 실시양태에서, 생물반응기는 생물반응기 시스템의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 채널 (및 생성되는 조직 가닥)의 길이에 평행이거나, 또는 채널 (및 생성되는 조직 가닥)의 길이에 수직인 방향일 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제2 실시양태는 "바이오튜브"로 지칭될 수 있고, 이는 조직 가닥 그 자체 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 장치 상에서 성장한 세포) 또는 조직 가닥 및 생물반응기를 함께 포함하는 시스템을 지칭할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바이오튜브는 또한 그의 상업적 명칭 바이오튜브™로서 본원에서 지칭될 수 있고, 이는 조직 가닥 그 자체, 또는 조직 가닥 및 조직 가닥이 성장하거나 위치하는 생물반응기 장치를 포함하는 시스템 둘 다를 포괄한다. 이러한 실시양태에서, 장치는 내강을 포함하는 복수개의 3차원 조직 가닥을 동시에 성장시킬 수 있도록 복수개의 생물반응기 채널 및 종방향 스캐폴드를 포함하는 구성까지 스케일 업될 수 있다. 이러한 제2 실시양태는 또한 생물반응기에서 조직 가닥을 성장시키는 방법, 3차원 조직 가닥 그 자체, 생물반응기 및 성장한 조직 가닥 둘 다를 포함하는 시스템, 및 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공, (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 조직 가닥 (또는 조직 가닥을 포함하는 시스템)을 사용 및/또는 시험하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시양태에서, 장치는 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트로 구성될 수 있다.
도 29는 관류가능한 조직 가닥의 배양에 적합한 예시적인 장치의 개략도 및 영상을 보여준다. 바이오튜브 장치는 실시예 1의 바이오와이어 장치와 유사할 수 있고, 배양된 조직 가닥의 관류를 가능하게 하기 위해 첨가된 특색을 갖는다.
예시적인 장치는 조직 배양을 위한 시드 세포를 수용할 수 있는 종방향 생물반응기 채널을 포함할 수 있다. 종방향 스캐폴드는 생물반응기 채널의 길이에 걸쳐 지지 (예를 들어, 현수)될 수 있다. 스캐폴드는 스캐폴드의 길이를 따라 조직 구조를 형성하기 위해 시드 세포에 대한 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 스캐폴드는 또한 내강을 가질 수 있고, 내강을 통한 배양된 조직 가닥의 관류를 가능하게 할 수 있다.
이러한 실시양태에서, 생물반응기 채널의 한쪽 말단에 유입구와 유체 연통된 유체 저장소 (예를 들어, 약물 저장소)가 추가로 존재할 수 있다. 생물반응기 채널의 대향 말단의 유출구는 외부 양압 또는 음압 공급원에 (예를 들어, 연결 채널을 통해) 유체 연통될 수 있다. 음압 또는 양압의 사용은 스캐폴드의 내강을 통한 유체 유동 및/또는 관류를 촉진하는데 도움이 될 수 있다. 유체 저장소 및/또는 연결 채널은 예시적인 장치의 부분일 수 있거나, 또는 이들은 장치에 연결될 수 있는 분리된 구성요소일 수 있다. 이들 구성요소는 모두 기판, 예컨대 유리 슬라이드에 의해 지지될 수 있고 그에 결합될 수 있다. 실제 영상이 도 29의 상부-좌측 코너에 제시된다.
예시적인 장치는 마이크로제작 생물반응기 채널 또는 챔버를 포함할 수 있고, 마이크로제작 플랫폼 (예를 들어, PDMS로 제조됨) 및 현수된 관상 템플릿 형태의 스캐폴드 (예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 마이크로-배관으로 제조됨)를 포함할 수 있다. 내강 (예를 들어, 관상 템플릿)을 갖는 스캐폴드를 사용하여 조직을 배양함으로써, 생성된 조직은 조직의 관류를 가능하게 하는 내강과 함께 제공될 수 있다.
바이오튜브 실시양태는 실시예 1의 바이오와이어 장치와 유사한 방식으로 제작될 수 있다. 한 예에서, PDMS 플랫폼을 제작하기 위해, 표준 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 2-층 SU-8 (마이크로켐 코포레이션, 매사추세츠주 뉴턴) 마스터를 제조하였다20. 제1 층은 템플릿 채널 및 세포 배양 챔버를 포함하였고, 제2 층은 단지 세포 배양 챔버 만을 포함하였다. 이어서 PDMS를 SU-8 마스터 상에 캐스팅하고, 70℃에서 2시간 동안 베이킹하였다. 이어서 관상 템플릿을 PDMS 플랫폼의 2개의 말단에 고정시킨 다음, 70% 에탄올 중에서 밤샘 UV 조사하여 생물반응기 멸균하였다. 배관 템플릿을 통한 관류를 제공하기 위해, 2개의 마이크로제작 모듈, 약물 저장소 및 연결 채널을 예시적인 생물반응기 장치에 첨가하였다. 둘 다의 모듈은 단일-층 SU-8 마스터를 사용하여 PDMS를 제1 몰딩함으로써 제작하였다 (길이 x 너비 x 높이 = 10 x 1 x 0.3 mm). 약물 저장소는 8 mm 생검 펀치 (스클라(Sklar))를 사용하여 PDMS를 컷팅하여 생성하였다. 생물반응기 채널을 PTFE 배관 (내부 직경 (ID) = 0.002 인치, 외부 직경 (OD) = 0.006 인치, 제우스(Zeus))을 사용하여 약물 저장소 및 연결 채널에 연결시켰다. 타이곤 배관 (ID = 0.01 인치, OD = 0.03 인치, 토마스 사이언티픽(Thomas Scientific))으로 관류 시스템을 연동 펌프에 의해 생성되는 외부 음압에 연결시켰다. 관류 속도는 연동 펌프로부터 유출구에서 수집된 액체 부피에 의해 특징화하였다. 모든 연결 지점은 에폭시 글루에 의해 밀봉되었고, 3개의 마이크로제작 모듈은 유리 슬라이드에 플라즈마 결합되었다.
특정 물질, 기술 및 치수가 상기 기재되어 있지만, 다른 적합한 물질, 기술 및 치수가 예시적인 장치에 사용될 수 있다. 다른 적합한 물질의 예는 폴리(글리세롤 세바케이트), POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 유형의 배관 및 연결이 기재되어 있지만, 유체 연통의 다른 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 저장소, 생물반응기 채널 및 연결 채널은 분리된 구성요소인 것 보다, 오히려 모두 함께 마이크로제작될 수 있다.
B. 예시적인 바이오튜브 실시양태의 실험적 시험
실시예 방법 및 분석
신생아 래트 심근세포 또는 인간 ESC-유래 심근세포를 실시예 1 장치의 조사에 대해 상기 기재된 바와 같이 수득하였다. 대안적으로, HES3 hESC의 NKX2-5 유전자좌 내에 삽입된 eGFP cDNA를 함유하는 NKX2-5-eGFP 리포터 인간 배아 줄기 세포주 (hESC)22를 기재된 바와 같이 유지시켰다23. 심장 분화 전에, TrypLE 익스프레스 (깁코)를 사용하여 세포가 단세포가 되게 하고, 감소된 성장 인자 매트리겔 (BD 바이오사이언시스)의 박층 상에 260,000개 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하고, 마우스 배아 섬유모세포 조건화 배지 (MEF-CM)로 배양하였다. 심장 분화를 유도하기 위해, 액티빈 A 50-100 ng/mL 및 BMP4 7-10 ng/mL를 사용하여 기재된 바와 같이 매트릭스 샌드위치 프로토콜을 사용하였다24. 생성된 심근세포 단층 배양물을 이전에 기재된 바와 같이 제19일에 소화시켰다19.
조직 가닥을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.25% 트리톤 X-100에 의해 투과되게 하고, 10% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단시켰다. 하기 항체를 사용하여 면역염색을 수행하였다: 마우스 항-심장 트로포닌 T (cTnT) (압캠; 1:100), 마우스 항-α-액티닌 (압캠; 1:200) 및 항-토끼-TRITC (인비트로젠; 1:200), 항-마우스-TRITC (잭슨 이뮤노 리서치; 1:200). 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (비오튬; 1:100)을 사용하여 핵을 대조염색하였다. 팔로이딘-알렉사 660 (인트로젠; 1:600)을 사용하여 F-액틴 섬유를 염색하였다. 공초점 현미경검사를 위해, 염색된 심장 조직 가닥을 도립 공초점 현미경 (올림푸스 IX81) 또는 정립 공초점 현미경 (자이스 LSM 510) 하에 가시화하였다.
신생아 래트 심장 세포를 배관 템플릿을 포함하는 예시적인 관류가능한 생물반응기 장치 내에 시딩하였다. 7일 동안 배양한 후에, 배양된 심장 조직 가닥을 절편화하고, 환경 SEM (히타치 S-3400 N) 하에 가시화하였다. 조직 가닥을 70 Pa 및 15 kV의 가변 압력 모드 하에 영상화하였고, 챔버 온도는 -20℃였다.
단면을 가시화하기 위해, 관류가능한 심장 조직 가닥을 cTnT 항체에 이어서 TRITC로 염색하였다. 이어서 염색된 조직 가닥을 크리오스타트 (레이카 CM3050S)를 사용하여 500 μm 후박 절편으로 동결절편화하고, 슈퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 유리 슬라이드 (VWR)에 탑재하였다. 단면화된 조직 가닥의 영상을 올림푸스 형광 현미경 (IX81)으로 획득하였다.
예시적인 장치의 실행가능성을 입증하기 위해, FITC-표지된 폴리스티렌 비드 (스페로테크 인크.(Spherotech Inc.))를 약물 저장소에 첨가하고, 제8일에 래트 심장 조직 가닥을 자발적으로 박동하게 하면서 이를 통해 관류시켰다. 명시야 및 형광 비디오 및 영상을 형광 현미경 (올림푸스 IX81)으로 획득하였다.
NO 관류의 정량화를 수행하였다. 소듐 니트로프루시드 (SNP) (시그마)를 증류수에 용해시켜 200 mM SNP 용액을 제조한 다음, 이를 약물 저장소에 첨가하였다. 외부 연동 펌프에 의해 배관 템플릿을 통한 관류를 구동시켰다. SNP 용액이 배관을 통해 관류하면, 연동 펌프를 정지시키고, 전체 관류 시스템을 세포 배양 인큐베이터 내에 유지시켰다. 세포 배양 채널 내 (PTFE 배관 외) NO 양은 형광측정 산화질소 검정 키트 (칼바이오켐(Calbiochem), 482655)를 사용하여 정량화하였다. 간략하게, 상이한 시점 (0.5시간, 6시간, 및 24시간)에 세포 배양 채널 (8 μl, n = 3)로부터 수집한 샘플을 니트레이트 리덕타제에 의해 니트라이트로 전환시킨 다음, 형광 화합물 1-H-나프토트리아졸로 발색시켰다. 형광 신호를 플레이트 판독기 (아폴로(Apollo) LB 911, 베르톨트 테크놀로지스(Berthold Technologies))에 의해 정량화하고, 니트레이트 표준과 비교하였다.
인간 심장 조직 가닥의 NO 처리를 수행하였다. 제7일에, 200 mM SNP 용액을 관류시킴으로써 인간 심장 조직 가닥의 NO 처리를 개시하고, SNP 용액이 배관을 통해 관류하면 연동 펌프를 정지시켰다. 조직 가닥을 37℃에서 유지시키면서 인간 심장 조직 가닥의 박동 활성을 처리 전 및 처리 후 24시간에 올림푸스 IX81에 의해 16.67 프레임/초로 기록하였다. 인간 심장 조직 가닥의 박동 활성을 문헌 [Sage et al.]에 기재된 영상 분석 방법에 의해 정량화하였다28. 간략하게, NO 처리 전 및 처리 후 인간 심장 조직 가닥 상의 동일한 위치에서의 1개의 스팟의 이동을 특징화하였다.
전기 자극 및 관류를 수행하였다. 인간 관류가능한 심장 조직 가닥의 경우에, 평행 전기 자극 만을 상기 기재된 바와 같이 적용하였다. 제4일에 시작하여, 전기장 자극 (2상, 직사각형, 1 ms 지속기간, 1 Hz, 3.5-4 V/cm)을 4일 동안 적용하고, 대조군 조직 가닥은 전기 자극 없이 배양하였다. 자극된 조직 가닥 및 대조군 조직 가닥 둘 다는 외부 시린지 펌프 (PHD 울트라; 하버드 어패러투스(Harvard Apparatus))에 의해 구동되는 PTFE 배관 내에서 2 μl/분의 유량으로 배양 배지에 의해 관류되었다. 전기 자극의 말미에, 자극된 인간 심장 조직 가닥 및 대조군 인간 심장 조직 가닥의 전기 특성을 이전에 기재된 바와 같이 외부 전기장 조율 하에 흥분 역치 (ET) 및 최대 포획률 (MCR) 면에서 특징화하였다29.
시그마플롯 11.0을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 실험군 사이의 차이는 t-검정 또는 일원 ANOVA를 사용하여 분석하였고, 유의차는 p < 0.05로 간주하였다.
실시예 결과 및 논의
관류가능한 심장 조직 가닥의 생성 및 특징화
원발성 신생아 래트 및 hESC-유래 심근세포를 사용하여 관류가능한 심장 조직 가닥을 생성하였다.
도 30은 배양된 관류가능한 심장 조직 가닥의 예시적인 영상을 보여준다. 도 30a는 신생아 래트 심근세포 (200 x106개 세포/ml)가 겔을 재형성하고, 배관 템플릿 (ID = 50.8 μm, OD = 152.4 μm) 주변에 압착됨을 보여준다. 조직 가닥 말단에서 배관 내강을 보여주는 근접도를 상부-우측에 제공한다. 도 30b는 심장 조직이 배관 표면에 부착되고 재형성 후에 균일한-두께의 층을 형성하였음을 입증하는 SEM 영상을 보여준다. 도 30c는 심장 트로포닌-T (cTnT)의 발현을 갖는 관류가능한 심장 조직 가닥의 단면의 원형 형태를 보여주는 대표적인 위상 대조 영상 (좌측) 및 공초점 영상 (우측)을 보여준다. 도 30d는 FITC-표지된 폴리스티렌 비드 (직경 1 μm)로 관류된 배관-템플릿 조직 가닥을 보여준다. 점선은 세포 배양 채널의 벽을 예시한다. FITC-표지된 비드는 화살표로 나타내었다. 별표는 심장 조직 가닥 내의 심근세포로부터의 자가 형광을 나타낸다. 이 영상을 과다-노출시켜 형광 비드를 보다 우수하게 가시화하였다.
둘 다의 세포 유형은 심장 조직 가닥을 형성할 수 있고 자발적으로 박동할 수 있었다 (도 30a 참조). SEM 영상에 제시된 바와 같이, 세포는 자기-재형성 후 PTFE 배관의 평활 표면에 부착되었다 (도 30b 참조). 이들 관류가능한 조직 가닥의 단면은 자기-재형성된 세포가 배관 템플릿을 에워싸고, cTnT를 발현함을 보여주었다 (도 30c 참조).
관류가능한 조직 가닥을 배양하기 위한 예시적인 장치의 실행가능성을 FITC-표지된 형광 비드를 사용한 관류에 의해 입증하였다. 연동 펌프에 의해 구동되는 관류 속도는 2±0.16 μl/분 (n = 3)인 것으로 정량화되었다. 명시야 비디오는 래트 심장 조직 가닥의 둘 다의 자발적 박동 활성 및 형광 비드의 관류를 보여주었다. 비드의 이동은 형광 시야 하에서 보다 우수하게 가시화되었다. 비디오의 스냅샷 (도 30d 참조)을 과다노출시켜 형광 비드의 보다 우수한 가시화를 제공하였다. 심근세포의 자가 형광으로 인해 심장 조직 가닥이 또한 이 영상에서 가시화되었다.
관류에 의한 배양된 인간 심장 조직 가닥의 NO 처리
도 31은 인간 배관-템플릿 조직 가닥에 대한 산화질소 (NO) 처리의 예시적인 결과를 보여준다. 도 31a는 0.5시간, 6시간, 및 24시간 동안의 SNP (200 mM) 관류 후에 배관 벽을 통해 통과한 NO 양의 정량화를 보여준다. 도 31b는 24시간 NO 처리가 조직 가닥의 박동을 기저 수준과 비교하여 유의하게 감속시키는 한편, 비처리 조직 가닥에서는 어떠한 유의한 변화도 없음 (군당 n = 3, p < 0.01)을 보여준다. 도 31c는 영상 분석에 의한 정량화를 보여주고, 이는 NO 처리 24시간 후의 조직 가닥의 박동 속도가 기저 수준과 비교하여 덜 빈번함을 입증한다. 도 31d는 대조군 (우측)과 비교하여 NO-처리된 조직 가닥 (좌측) 내에서 파괴된 α-액티닌 구조를 보여주는 공초점 영상을 보여준다.
관류가능한 심장 조직 가닥에서 약물 시험의 실행가능성을 입증하기 위해, 약리학적 작용제, NO 공여자 SNP를 배관 내강을 통해 관류되는 배양 배지에 적용하였다. NO이 배관 내강에서 생성됨에 따라, 이는 배관 벽을 통해 확산되어 세포 배양 외부 채널에 도달하였고, 여기서 NO의 전체량을 정량화하였다. 200 mM SNP로부터 방출된 NO의 양을 수시간에 걸쳐 SNP 용액으로부터의 NO 방출의 지속을 검증하는 형광측정 검정에 의해 정량화하였다 (도 31a 참조). 세포 배양 채널 내의 누적된 NO 양은 100 μM (8μl 중 800 pmol)이었고, 이는 생체내 생리학상 NO 수준을 초과하였다31.
겔 압착 시, 조직 가닥 내의 hESC-유래 심근세포는 자발적 박동을 시작하였다. 배관 내강을 통한 NO-공여자 SNP의 관류에 의해 수행된 24시간 동안의 NO 처리 후에, 인간 심장 조직 가닥의 자발적 박동은 감속되었고, 이를 영상 분석에 의해 추가로 특징화하였다 (도 31b 및 31c 참조). 상이한 조직 가닥 사이에서의 박동 주파수 변화를 비교하기 위해, NO 처리 24시간 후의 빈도를 기저 수준 (처리 전)으로 정규화하였다. NO 처리 후의 박동 주파수는 기저 수준보다 유의하게 낮아졌고 (74±3%, n = 3), 대조군 조직 가닥은 동일하게 유지되었다 (100±9%, n = 3).
관류를 통한 NO 처리에 의해 유발된 hESC 유래 심근세포에 기초한 조직 가닥 내의 심근세포의 세포골격의 분해를 α-액티닌에 대한 면역염색과 함께 공초점 현미경검사를 사용하여 특징화하였다 (도 31d 참조).
대조군 조직 가닥에서는 α-액티닌으로 표지된 근절 Z-디스크의 가로무늬 패턴을 분명하게 식별하는 것이 가능하였지만, NO 처리된 조직 가닥은 전반적으로 점상 패턴을 나타내었다. 알렉사 488 표지된 α-액티닌 염색은 NKX2-5에 대해 유전적으로 표시된 녹색 형광 단백질 (GFP)과 구별될 수 있음이 또한 인지된다.
배양된 심장 조직 가닥의 전기 자극 및 관류
도 32는 관류 및 전기 자극을 사용하여 배양된 조직 가닥의 기능적 특성을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 도 32a는 hESC 유래 심근세포에 기초한 전기 자극된 관류 조직 가닥이 비자극된 대조군과 비교하여 더 낮은 흥분 역치를 갖는다는 것을 입증한다 (***, p < 0.001). 도 32b는 hESC 유래 심근세포에 기초한 전기 자극된 관류 조직 가닥이 비자극된 대조군과 비교하여 더 높은 최대 포획률을 갖는다는 것을 입증한다 (*, p < 0.05).
배관 및 평행 전기 자극을 통해 동시에 배지 관류를 거친 관류가능한 인간 심장 조직 가닥은 전기장 자극 하에 ET 및 MCR에 의한 평가 시 비자극된 대조군과 비교하여 개선된 전기 특성을 나타내었다. ET는 동시 수축을 유도하는데 요구되는 최소 전기장 전압으로, 자극된 조직 가닥의 감소된 ET는 (도 32a 참조) 보다 우수한 전기 흥분성을 나타낸다. MCR은 동시 수축을 유지하는 동안 달성할 수 있는 최대 박동 주파수로, 자극된 조직 가닥의 증가된 MCR (도 32b 참조)은 개선된 세포 정렬 및 상호연결성을 나타낸다.
본래의 심근은 지지 혈관계를 포함하는 공간적으로 잘-규정된 심장 다발로 이루어지고 (도 1a 참조), 심장 다발 내의 심근세포는 고도로 이방성이다 (도 1b 참조). 본 개시내용은, 실시예 2A의 장치에서, 본래의 심장 다발의 구조 및 기능을 재현한 시험관내 심장 조직 가닥을 생성하기 위한 마이크로제작 생물반응기를 제공한다. 이는 다른 조작된 심장 조직과 비교하여 본래의 심근 매스 전달 특성을 보다 우수하게 모방한 심장 다발 모델 내에서의, 관류에 의한 심근세포에 대한 약물 효과를 조사하는 첫번째 연구이다. 이러한 예시적인 장치는 심장 세포에 대해 신장 및 정렬을 위한 토포그래피 지시를 제공하고, 또한 다른 지시, 예를 들어 전기 자극과 통합된다.
겔 압착은 생체내 이식32 및 시험관내 모델16,33을 위한 3D 마이크로조직 구축물을 생성하기 위해 조직 공학에 널리 적용되어 왔다. 스캐폴드-기반 구축물과 비교하여, 겔 압착으로부터의 자기-어셈블리 구축물은 압착 후 보다 큰 세포 밀도로 인해 증가된 수축력을 생성한다34. 또한, 겔 압착에 의해 제조된 마이크로조직 구축물은 통상적인 모델보다 훨씬 더 높은 처리량을 제공하기 때문에, 약물 시험을 위한 마이크로어레이로서 관심이 증가하고 있다 16,33,35,36. 본 연구에서, 유형 I 콜라겐은 본래의 심근의 주요 ECM 구성요소 중 하나이기 때문에, 이를 주요 겔 매트릭스로서 선택하였다. 이전의 시험관내 콜라겐-기반 모델은 그의 불량한 기계적 특성으로 인해 단지 수일 동안만 무손상으로 유지되었다33. 현수된 템플릿에 의해 제공되는 기계적 지지체를 갖는 본 예시적인 마이크로제작 장치에서, 심장 조직 가닥은 생물반응기 내에서 수주 동안 안정한 상태로 유지되었다. 다른 시험관내 모델과 비교하여 보다 큰 스케일 (최대 5 cm 길이)의 심장 조직을 생성하는 것이 가능하고, 세포 배양 채널의 치수는 용이하게 맞춤화될 수 있고, 이는 심장 조직 가닥의 형태에 대한 추가의 제어를 제공할 수 있다. 세포 배양 채널은 초기에 산소 및 영양소 공급에 대한 제한를 고려하여 높이 300 μm로 설계되었다37. 또한, 템플릿의 존재는 생물반응기 장치로부터 조직 가닥의 용이한 해체 및 추가의 특징화를 위한 배양 말미에서의 심장 조직 가닥의 손쉬운 취급을 가능하게 한다.
일부 예에서, 마이크로제작 생물반응기 장치는 또한 인간 심장의 높이와 대등한 5 cm 길이의 심장 조직 가닥을 생성하는데 사용될 수 있다. 마크로-스케일 조직 가닥을 생성하는 능력과 함께 개개의 심장 조직 가닥을 취급하는 것의 실행가능성은, 문헌 [Onoe et al.]에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 이를 함께 다발화 또는 직조하여 보다 두꺼운 구조를 생성하는 것에 의한 다중 심장 조직 가닥의 정렬의 조사 가능성을 높인다38. 심장 조직 가닥 또는 심장 조직 가닥 다발에 의해 생성되는 힘을 특징화하기 위해, 분해성 봉합사를 사용하여 템플릿-무함유 심장 조직 가닥을 생성할 수 있다.
예시적인 마이크로제작 생물반응기 장치를 검증하기 위해, 신생아 래트 심근세포를 예비 연구에 사용하였다. 본래의 래트 심근에서의 세포 밀도 (~108개 세포/ml)와 비교하여39 보다 높은 세포 밀도 (> 5x107개 세포/ml)로 시딩한 경우에만, 제3일-제4일에 심장 조직 가닥이 자발적 박동을 시작하였다. 템플릿은 본래의 심근 내의 심근세포의 이방성 특성을 재현하여 세포가 이를 따라 신장하고 정렬되도록 접촉 가이던스를 제공하였다. 3D 조직 내에서는 세포 막을 규정하기 어렵기 때문에 세포 핵에 대해 영상 분석을 수행하였다. 그러나, 핵 정렬은 세포 정렬의 충분한 지표이고, 또한 본래의 심근의 특징 중 하나이다 (도 1c 참조).
예시적인 장치를 추가로 발전시키기 위해, 6-0 실크 봉합사 대신 템플릿으로서 PTFE 배관을 사용하였다. 상업적으로 입수가능한 PTFE 배관은 생체적합성이고 (USP 클래스 VI), 극도로 비-흡수성이고, 크기상 모세관후 세정맥과 비슷한 마이크로-스케일 치수 (ID = 50 μm, OD = 150 μm)이기 때문에 이를 선택하였지만54, 다른 물질 및 치수가 적합할 수 있다. 내부 내강의 작은 크기로 인해, 관류 구동을 위해 양압 대신 음압을 사용하였다. 2개의 마이크로제작 모듈을 예시적인 시스템에 첨가하여 장기간 관류 및 조직 가닥의 인큐베이션이 가능하게 하였다. 자기-재형성 동안 조직 가닥의 단축에 의해 나타내어지는 바와 같이, PTFE 배관 상에의 세포 부착은 주로 PTFE 배관 표면의 평활로 인해 실크 봉합사 상에서의 그것만큼 강력하지 않다 (도 30b 참조). 그러나, 세포-겔 복합체는 원형 단면을 갖는 배관 주변에서 그 자체를 여전히 어셈블리할 수 있었다.
본 연구에서, NO는 하기 이유로 모델 약물로서 선택되었다: (1) NO는 본래의 심근 내의 내피 세포에 의해 생산된 다음 방사 방향으로 심근세포로 수송되고40, 예시적인 장치의 시나리오는 그의 재현을 목표로 함; (2) NO는 혈관-의존성 및 -비의존성 효과 둘 다를 통해 심근 기능을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 함40; (3) NO가 예컨대 허혈-재관류 손상에서 심근세포 질환 발생 및 방지에 직접적으로 연루된다는 것을 보여주는 증가하는 증거가 존재함41; (4) NO는 작은 기체 분자로, 배관 벽을 용이하게 통과할 수 있음. SNP는 임상 연구에 사용되는 통상적인 NO 공여자이기 때문에 NO 공여자로서 선택하였다42,43. 또한, SNP 수용액은 시험관 내에서 수시간에 걸쳐 일정 속도로 NO를 방출하는 것으로 보고되어 있다44.
NO 처리 시험을 위해, hESC-유래 심근세포로부터 인간 심장 조직 가닥을 생성하였다. 인간 심장 조직 가닥은 제1일의 조기에 자발적 박동을 시작하였고, 박동은 7일 내에 동기화되었다. NO 처리 24시간 후에, 인간 심장 조직 가닥의 박동 주파수는 그의 기저 수준과 비교하여 유의하게 감속되었다. 이러한 결과는 NO의 생체내 혈관확장제 효과와 상응하고45, 이는 문헌 [Chiusa et al.]에서 확인되는 근원섬유성 세포골격의 분해에 의해 유발될 수 있다46. 그러나, NO는 보다 낮은 농도에서 다양한 세포내 메카니즘과 함께 양극성 수축촉진 효과를 보이며, 시험관내 모델에 대한 표준화의 결여로 인해 연구 사이에 불일치가 존재하였다40. 따라서 예시적인 마이크로제작 생물반응기 장치는 조직 수준에서 심근세포에 대한 NO의 효과를 밝히기 위한 플랫폼으로서의 역할을 할 수 있다.
개시된 장치의 다용도성을 입증하기 위해, 전기 자극가 심근세포의 표현형을 개선시키는 것으로 보고되어 있으므로 이를 시스템과 통합시켰다2,20. 심장 조직 가닥 내 세포는 이방성이기 때문에, 평행- 및 수직- 전기장 전기 자극 둘 다를 래트 조직 가닥에서 연구하였다. 단리된 신생아 래트 심장 근원섬유에 가까운 (61 kPa) 평행 전기 자극 하에서의 보다 높은 조직 강성은47 면역조직화학 염색에 의해 특징화되는 바와 같이 보다 조직화된 세포 수축 기구에 기여하였다. 관류가능한 인간 심장 조직 가닥을 전기 자극하고 동시에 관류시켰고, 이는 전기 자극 및 생리학상 방식으로 전달되는 제약 작용제 사이의 상호작용 연구에 대한 가능성을 이끌어 내었다. 인간 만능 심근세포에 기초한 조직 가닥의 전기 자극 단독에 대한 보다 상세한 연구를 수행하였고, 점진적 빈도 증가의 전기 자극은 hPSC-유래 심근세포의 성숙을 근원섬유 구조 및 전기 특성 면에서 현저하게 개선시키는 것으로 나타났다19.
관류가 산소 및 영양소 공급을 유의하게 개선시키기 때문에, 배지 관류는 시험관내 심장 구축물 내 심근세포의 생존율 및 기능성을 개선시키는 것으로 인식된다48. 대부분의 이전 연구에서, 생물반응기는 세포-적재 다공성 스캐폴드를 샌드위치시킴으로써 배지 관류를 제공하였고, 심근세포를 유동에 직접적으로 노출시켰다48-50. 이는, 수송 거리를 최소화할 뿐만 아니라 심근세포가 전단되는 것을 보호하는 밀집된 혈관망을 통해 혈액 공급이 유동하는 본래의 심근을 정확하게 재현한 것이 아니다51. 보다 최근에, 전기 자극 및 배지 관류를 동시에 제공하기 위한 생물반응기가 개발되었고, 관류 및 자극은 심장 구축물의 수축 기능성을 개선시키는데 있어서 상승작용적 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다52,51. 그러나, 이들 시스템에서의 심장 구축물은 등방성 다공성 스캐폴드를 기반으로 하여, 이방성 심장 조직에 대한 전기 자극의 효과에 대한 정보를 제공할 수 없었다.
이전의 연구는 심장 구축물에 대한 고처리량 시험관내 약물 시험을 가능하게 하는 관류 생물반응기의 설계를 기재한다53,50. 문헌 [Kaneko et al.]은 약물 시험에 대한 단세포 수준 상호작용을 평가하기 위해 마이크로챔버 어레이 칩을 설계하였다53. 문헌 [Agarwal et al.]은 이방성 심장 마이크로구조에 의해 실시간으로 생성되는 확장기 및 수축기 응력을 특징화할 수 있는 캔틸레버 마이크로어레이로 구성된 생물반응기를 설계하였고, 생물반응기는 이들 심장 마이크로조직에 전기 자극을 제공할 수 있었다50. 이들 2가지 연구는 심장 기능을 단세포 또는 단층 수준에서 특징화하였고, 이는 복합 천연 시스템에서와 같이 심장 질환의 정확한 정보를 제공하는데 불충분할 수 있다. 또한, 이들 연구에서 조사되는 약물은 혈액 구획 대신 세포에 직접적으로 적용되고, 유동의 존재는 심근세포에 대해 전단 응력을 제공하며, 이는 둘 다 본래의 심장에서 심근세포가 거치는 것과 비교하여 비생리학적 환경의 생성에 기여한다.
개시된 장치는 하기 중 하나를 비롯하여 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다: (1) 이방성 정렬을 갖는 본래의 심장 다발 구조의 보다 우수한 모방체임; (2) 템플릿의 존재는 이후의 특징화를 위한 보다 용이한 취급을 가능하게 하고, 전체 구조를 수주 동안 안정하게 유지시킴; (3) 장치는 용이하게 맞춤화될 수 있고 고처리량 약물 스크리닝에 적용될 수 있음; (4) 장치는 그 자체로 토포그래피 자극을 제공함; (5) 장치는 다기능적이고, 기타 다른 자극 (예를 들어 기계적 자극)과 통합될 수 있음; (6) 관류가능한 예시적인 시스템은 심장 다발 모방체를 통한 관류에 의해 심근세포에 적용되는 약리학적 작용제를 연구하기 위한 제1 플랫폼이고, 심장 질환 발생 및 치료에 대한 가치있는 지식을 제공할 수 있음.
상업적으로 입수가능한 PTFE 배관의 투과성은, 오직 소분자만이 배관 벽을 통해 인지가능하게 확산될 수 있고 단백질은 그렇지 않기 때문에, 시험될 수 있는 약물 후보에 대한 제한을 제공할 수 있다. 그러나, 다른 물질이 사용될 수 있고, 예를 들어 배관 물질은 보다 우수한 투과성을 위해 미세다공성이어야 한다. 다른 관련 약리학적 작용제 및 배관 내강 내 시딩 내피 세포를 조사하여 내피 세포와 심근세포 사이의 상호작용을 연구하기 위해 추가의 연구를 수행할 수 있다.
결론적으로, 예시적인 장치에서의 배양은 성체-유사 인간 심근세포를 수득하기 위한 제1 단계를 나타내는, 하기 중 하나 이상: 1) hESC-심근세포 아키텍처의 개선 및 생리학상 비대의 유도, 2) 근절 성숙의 유도 및 3) 자극 주파수 의존성 방식으로 전기생리학적 특성의 개선을 제공할 수 있다.
실시예 3: 바이오로드
도 33은 약물 발견 경로의 전형적인 시나리오를 도시한다. 인지될 바와 같이, 약물 발견 및 개발은 시험관내 실험 세포 및 동물 모델에서의 약리학적 효과의 입증으로 시작해서 약물 안전성 및 효능, 임상 및 전-임상 연구로 끝나는 힘든 시험 과정으로 이루어진다. 화합물 중 단지 매수 소수만이 안전하고 효과적인 신규한 의약으로서 FDA 승인을 받는 것으로 추정된다. 화합물의 대략 25%는 전-임상 독성학 연구에서 제거된다. 따라서, 전-임상 개발에서 유의한 수의 약물 후보가 시험 시스템에서의 허용되지 않는 수준의 독성으로 인해 이 단계에서 진행에 실패한다. 많은 실패는 현행 방법 및 기술을 사용하여 평가하기 어려운, 약물에 의해 유발되는 심장독성 효과와 관련된다.
세포, 분자 및 생화학적 검정에서의 기술적 진보는 유의하게 발전되어 왔지만, 약물 독성 효과를 평가하기 위한 현재 이용가능한 기술과 관련하여 여전히 다수의 유의한 문제점이 존재한다. 먼저, 정제 또는 재조합 효소 및 세포 배양물을 사용하는 시험관내 검정은 이후에 동물 모델에서 사용될 약리학적 및 독성학적 파라미터를 결정하는데 있어서 첫번째 단계를 제공하지만, 종종 너무 단순하여 본래의 인간 조직 또는 시스템에서의 약물 대사 동안 발생하는 다인성 사건을 고려하지 못한다. 두번째로, 동물 모델에서 수득된 데이터는 인간 시스템에 신뢰할 만하게 외삽될 수 없다. 세번째로, HIV 감염 또는 알츠하이머병과 같은 만성 질환을 치료하는데 사용되는 많은 약물은 장기간에 걸쳐, 일부 경우에는 개체의 평생에 걸쳐 적용되는 투여 요법을 필요로 한다. 현재, 만성 독성의 발생은 장기간 환자 사용 동안에 가장 실제적으로 관찰된다.
특히 심장 독성과 관련하여 약물 후보의 높은 실패율을 고려하면, 독성, 특히 심장 독성을 결정하고, 측정하고, 평가하고, 달리 검출하기 위한 신규하고 개선된 방법이 매우 요망된다.
A. 예시적인 이중-와이어 수축력 조직 배양 실시양태 (즉, 바이오로드 또는 바이오와이어 II)의 구조, 제조, 및 사용
제3 실시양태에서, 본 발명은 수축력을 측정하는데 적합한 3차원 조직을 성장시키기 위한 생물반응기 장치에 관한 것이다.
도 34는 본원에서 "바이오로드" 또는 바이오와이어 II"로 지칭될 수 있는 본 발명의 이중-와이어 수축력 조직 배양 실시양태의 설계의 개략도를 제공한다. 개략도에 제시된 바와 같이, 바이오로드 실시양태는 마이크로웰 또는 마이크로챔버, 및 마이크로챔버를 일반적으로 수직 배열로 교차하는 한 쌍의 홈으로 형성된 마크로웰 또는 마크로챔버를 포함한다. 마이크로챔버는 세포 및/또는 조직이 성장하도록 구성되고, 목적하는 조직의 세포로 시딩될 수 있다. 홈은, 중합체 와이어가 홈 내에 놓인 경우에 마이크로챔버의 개방 공간을 횡단하도록, 한 쌍의 중합체 와이어를 수용하도록 구성된다. 마이크로챔버와 관련하여 중합체 와이어 / 홈의 배향은 수직 구성으로 제한되지 않고, 생성된 3D 조직 가닥이 채널 내에 형성되고, 세포가 중합체 와이어 사이에 상호연결 또는 세포 가교 또는 가닥을 형성하도록 중합체 와이어의 각각의 말단에 부착되는 한 임의의 적합한 각도일 수 있다. 바람직하게는 중합체 와이어는 일반적으로 서로 평행으로, 일반적으로 마이크로채널과는 평행으로 위치한다. 그러나, 임의의 적합한 구성이 고려된다. 예를 들어, 중합체 와이어 및 홈은 일반적으로 서로 평행으로, 및 일반적으로 마이크로채널의 일반적인 배향에 대해 수직으로 배열될 수 있다. 다른 실시양태에서, 중합체 와이어 및 홈은 마이크로채널의 일반적인 배향에 대해 상이한 각도로 배열될 수 있다. 또한, 중합체 와이어가 일반적으로 직선 구성으로 도시된 것에 반하여, 와이어는 또한 곡선 및/또는 달리 비-직선 부분을 갖는 것으로 구성될 수 있다. 중합체 와이어는 바람직하게는 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등일 수 있고, 중합체 와이어에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘되는 수축력의 측정이 가능하도록 추가로 구성될 수 있다. 바이오로드 실시양태는 또한 중합체 와이어가 수축력의 측정을 함께 용이하게 하는 상이한 특성을 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 바이오로드는 와이어 중 1개가 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등이고, 또 다른 와이어는 경질인 것으로 구성될 수 있다. 이러한 방식으로, 수축 활성은 가요성 와이어의 이동에 기초하여 모니터링 및/또는 측정될 수 있다. 와이어의 임의의 적합한 구성이 계획되고, 조직 가닥 수축력이 측정될 수 있는 한 사용될 수 있다. 바이오로드 실시양태는 또한 도 35에 따라, 각각 마크로웰 및 마이크로챔버 및 중합체 와이어를 포함하는 개별 바이오로드 성장 챔버의 어레이로서 구성될 수 있다.
도 36에 제시된 바와 같이, 마이크로웰은 심장 세포를 자극하기 위한 2개의 전극과 함께 (마이크로채널의 끝 말단) 구성될 수 있다. 도 36은 또한 바이오로드 시스템을 사용하여 약물을 시험하는데 요구되는 전형적인 시간프레임을 도시하며, 이는 "단계 1" (조직 가닥 형성), "단계 2" (전기 자극을 사용한 조직의 성숙), 및 "단계 3" (시험 단계)을 포함한다. 보다 상세하게, 약물 스크리닝 적용으로서, 조작된 심장 조직은 강력한 데이터를 제공하기 위해 건강한 성체 심장 조직을 가능한 한 많이 모방해야한다. 높은 충실도의 심장 조직을 갖도록, 본 실시양태에 전기 자극을 합체시킬 수 있다. 비교하자면, 현행 심장 분화 기술은 단지 미성숙한 심장 근육 세포를 제공할 수 있을 뿐이다. 전기 자극은 심장 조직의 성숙 정도를 유의하게 증진시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 배양의 제1 주는 조직 형성에 초점을 맞추고, 제2 주는 전기 자극을 도입하여 조직을 성숙시키고, 제3 주 이후는 단기간 및 장기간 약물 시험에 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 특정한 프로토콜은 제한적인 것으로 의도되지 않고, 다른 전기 자극 프로토콜이 본원에서 계획되고 고려된다. 프로토콜 파라미터, 예컨대 전기 자극 지속기간 및 조율 주파수에 대해 임의의 적합한 방식으로 조정을 가할 수 있다.
도 37에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바이오로드 실시양태는 웰 또는 채널, 및 생물반응기 채널의 종방향 치수에 대해 일반적으로 수직으로 배향되고 채널의 대향 말단에 또는 그 근처에 채널의 너비에 걸쳐 배치되는 2개의 종방향 요소 (예를 들어, 와이어 또는 봉합사)를 포함하는 스캐폴드를 갖는 생물반응기를 포함할 수 있다. 종방향 요소는 내부에 둘 다의 요소를 포함하는 조직 가닥을 형성하기 위한, 생물반응기 채널 내에의 세포의 시딩을 위한 고정체 또는 지지체로서 기능할 수 있다
종방향 요소는 바람직하게는 굴절가능한, 변형가능한, 굴곡가능한 것 등일 수 있고, 종방향 요소에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘된 수축력의 측정이 가능하도록 추가로 구성된다. 생물반응기는 생물반응기의 채널에 걸쳐 전기장이 생성되도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 채널 (및 생성된 조직 가닥)의 길이에 대해 평행이거나 채널 (및 생성된 조직 가닥)의 길이에 대해 수직인 방향일 수 있다.
본원에서 사용될 수 있는 용어 "바이오로드"는 조직 가닥 그 자체 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 장치 상에서 성장한 세포) 또는 조직 가닥 및 생물반응기를 함께 포함하는 시스템을 지칭할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바이오로드는 또한 그의 상업적 명칭 바이오로드™로서 본원에서 지칭될 수 있고, 이는 조직 가닥 그 자체, 또는 조직 가닥 및 조직 가닥이 성장하거나 위치하는 생물반응기 장치를 포함하는 시스템 둘 다를 포괄한다.
바이오로드 실시양태는 수축력 측정을 위한 복수개의 3차원 조직 가닥을 동시에 성장시킬 수 있도록 복수개의 생물반응기 채널 및 종방향 스캐폴드를 포함하는 구성까지, 예를 들어 도 37A에 제시된 바와 같은 96-웰 플레이트 포맷으로 스케일 업될 수 있다.
바이오로드 실시양태는 또한 생물반응기 내에서 조직 가닥을 성장시키는 방법, 3차원 조직 가닥 그 자체, 생물반응기 및 성장한 조직 가닥 둘 다를 포함하는 시스템, 및 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공 및 (f) 예를 들어 조직 가닥에의 시험 작용제의 투여에 반응하여 종방향 요소에 대하여 조직 가닥에 의해 발휘되는 수축력의 측정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 조직 가닥 (또는 조직 가닥을 포함하는 시스템)을 사용 및/또는 시험하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시양태에서, 장치는 다중웰 플레이트, 예컨대 6-웰, 12-웰, 24-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트로 구성될 수 있다.
도 37 및 38은 수축력의 측정에 적합할 수 있는 조직의 배양에 적합한 예시적인 바이오로드 장치의 개략도 및 영상을 보여준다. 이러한 예에서, 장치는 다중 조직 가닥의 동시 배양을 위해 다중 웰을 갖는 플레이트 구성까지 스케일 업될 수 있다. 그러나, 다른 예에서 장치는 단일 조직 가닥의 배양을 위해 구성될 수 있다 (예를 들어, 단일 웰을 가짐).
예시적인 장치는 조직 배양을 위한 시드 세포를 수용할 수 있는 종방향 생물반응기 채널을 포함할 수 있다. 생물반응기 채널에 대해 수직으로 배향된 2개의 와이어를 포함하는 스캐폴드는 생물반응기 채널의 대향 말단 근처에 생물반응기 채널의 너비에 걸쳐 지지 (예를 들어, 현수)될 수 있다. 와이어는 생물반응기 채널의 길이를 따라 조직 구조를 형성하기 위한, 시드 세포를 위한 고정체로서의 역할을 할 수 있다. 와이어는 굴절가능한 것일 수 있다. 장치는 조직 가닥에 의해 발휘되는 수축력의 측정을 가능하게 할 수 있다.
일부 예에서, 장치는 복수개의 생물반응기 웰을 갖고, 각각의 웰은 상기 기재된 바와 같은 생물반응기 채널 및 스캐폴드를 포함하는, 다중웰 장치일 수 있다.
도 37A에 제시된 바와 같이, 장치가 다중웰 플레이트로서 구성된 경우에, 이는 4가지 구성요소: 베이스 층, 지지체 (예를 들어, 와이어), 웰-플레이트 (예를 들어, 96 웰을 규정함) 및 플레이트 캡을 포함할 수 있다. 보다 적은 웰이 존재하는 예에서, 장치는 보다 적은 층을 사용하여 마이크로제작될 수 있다 (예를 들어, 단지 1개의 웰이 존재하는 경우에 웰-플레이트가 필요하지 않을 수 있음). 웰 및/또는 와이어의 치수의 비례적 변화가 장치의 스케일-업 (예를 들어, 384 웰 플레이트 포맷까지) 또는 스케일-다운에 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 웰 및/또는 와이어의 치수의 비례적 변화를 사용하여 다른 다중웰 플레이트 구성, 예컨대 6-웰, 12-웰 및 24-웰 플레이트를 생성할 수 있다. 실시예 1 및 실시예 2의 장치의 제작을 위해 사용된 기술, 뿐만 아니라 특히 고온-엠보싱 및 주입-몰딩 기술을 비롯한 임의의 적합한 기술을 사용하여 예시적인 장치를 제작할 수 있다.
도 37B1은 고온 엠보싱 기술을 사용하여 폴리(메틸 메타크릴레이트) PMMA 베이스를 생성하는 예시적인 제작 공정을 개략적으로 보여준다. 도 37B2는 고온 엠보싱 후의 SU-8 마스터 및 PMMA 베이스를 개개의 웰 치수의 보다 근접한 도면으로 보여준다. 도 37C는 와이어 제작 공정 (우측) 및 제작 후의 와이어 (좌측)의 예시이다. 도 37D1은 설치된 와이어를 갖는 96 웰-플레이트 기반 PMMA 베이스의 개략적 예시이다. 도 37D2는 플레이트의 단일 웰의 상세도이다. 도 37D3은 웰의 1개의 행에 설치된 와이어를 갖는 제작된 PMMA 베이스의 영상 및 와이어를 갖는 단일 웰의 보다 근접한 상부도이다.
한 예에서, 베이스 층 패턴은 오토캐드(AutoCAD)에서 사전-설계되고, 표준 소프트 리소그래피 기술을 통해 SU-8 마스터에 변환된다. 이어서 SU-8 마스터를 고온 엠보싱 마스터로 전사하고, 적합한 고온 엠보싱 기술을 사용하여 PMMA 내에 마이크로-웰의 어레이를 생성하는데 사용하였다 (도 37B1 참조). 대안적으로, 조직 배양 폴리스티렌 또는 임의의 수의 생물학적 불활성 캐스팅가능한 중합체, 예컨대 폴리카르보네이트를 또한 사용할 수 있다. 1개의 생물반응기 마이크로-웰을 96 웰 플레이트의 단일 웰의 중심에 위치시켰다. 마이크로-웰의 치수는 길이 5mm x 너비 1mm x 깊이 300μm였다. 상이한 조직 유형에 대해 다른 치수가 사용될 수 있다. 마이크로-웰의 모든 칼럼을 통하는 2개의 보편적 홈을 마이크로-웰의 둘 다의 짧은 측면으로부터 1mm에 위치시켰다 (도 37B2 참조). 홈은 너비 100 μm x 깊이 100 μm였다. 상이한 조직에 대해 다른 홈 치수가 적합할 수 있다. 홈을, 세포 어셈블리를 위한 스캐폴드 (예를 들어, 와이어)를 하우징하는데 사용하였다. 그러나, 홈은 임의적이고, 와이어가 마이크로웰의 상부에 부착될 수 있기 때문에 기능상 요구되지 않는다.
제시된 예에서, 중합체 와이어를 생물반응기 마이크로-웰에서의 조직 배양을 위한 지지체로서 사용하였다. 제어된 치수를 갖는 와이어 (단면상 100 μm x 100 μm)를 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC)로 제조하였다 (도 37C 참조). 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC) 예비중합체를 제조하기 위해, 1,8-옥탄디올, 시트레이트 산, 및 말레산 무수물을 5:1:4 몰비로 혼합하고, 질소 퍼지 하에 160℃에서 용융시켰다. 이어서 온도를 140℃로 강하시키고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 예비중합체 용액을 1,6디옥산 중에 용해시키고, 증류수 중 적가 침전을 통해 정제하였다. 침전된 중합체를 2일 동안 동결건조시킨 다음, 5% w/w UV 개시제 (이르가큐어(Irgacure) 2959)와 혼합하였다. 와이어 제작을 위해, SU-8 마스터를 사용하여 표준 소프트 리소그래피에 의해 마이크로-채널을 포함하는 PDMS 캡을 생성하였다. 이어서 PDMS 캡을 유리 슬라이드 상에 가볍게 눌렀다. 이어서 POMaC의 예비중합체 용액을 시린지 펌프에 의해 또는 간단히 모세관 효과에 의해 이들 마이크로-채널 내로 관류시켰다. 예비중합체가 전체 채널을 통과한 후에, UV 램프 하에 45분 동안 가교시켰다. 목적하는 기계적 특성, 즉 가변성을 달성하기 위해 다른 적합한 경화 시간이 또한 가능하다. PDMS 캡을 박리하고, 와이어를 유리 슬라이드 상에 유지시켰다. 와이어는 PDMS에 비해 유리에 대한 POMaC의 더 높은 친화도로 인해 PDMS 마이크로-채널로부터 이형되었다. 이어서 이들 와이어를 PMMA 베이스 층 상의 홈 내에 위치시켰다 (도 37D1-D3 참조).
어셈블리 후에, 모든 마이크로-웰은 2개의 지지체의 스캐폴드를 포함하였고, 이러한 예에서 자가-형광 및 가요성 와이어는 웰의 에지에 위치하였다. 상업적으로 입수가능한 96 무바닥 웰-플레이트 및 캡을 사용하여 플레이트의 어셈블리를 완료하였다. 구체적으로, 와이어를 적소에 확보하고 교차-오염 없이 독립적인 웰을 생성하기 위해 무바닥 96 웰-플레이트를 PMMA 베이스 층의 상부에 위치시켰다.
도 38A-38C는 상기 기재된 바와 같이 제작된 예시적인 장치의 실제 영상을 보여준다. 1개의 생물반응기 웰이 96 웰 플레이트의 각각의 웰 내에 위치한다. 생물반응기 웰의 측면에 놓인 와이어는 수축력 측정을 가능하게 한다. 도 38A는 상면도 및 저면도를 보여준다. 도 38B는 단일 웰의 근접도를 보여준다. 도 38C는 96 웰 플레이트의 다중 웰의 도면을 보여준다.
특정 물질, 기술 및 치수가 상기 기재되어 있지만, 다른 적합한 물질 (예를 들어, 특히 폴리스티렌 및/또는 폴리우레탄), 기술 및 치수가 예시적인 장치에 사용될 수 있다. 중합체 와이어가 사용되는 것으로 기재되어 있지만, 다른 물질의 길이를 포함하는 다른 지지체가 적합할 수 있다. 예를 들어, 와이어는 폴리(글리세롤 세바케이트), POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질로 제조될 수 있다.
B. 예시적인 바이오로드/바이오와이어 II 실시양태의 실험적 시험
예시적인 방법 및 분석
심근세포는 인간 배아 줄기 세포주 (hESC, Hes2)로부터 유래되었다. 배상체 (EB)를 심혈관 계열로 분화시키고, 이전에 장치 1 방법에 기재된 바와 같이 해리시켰다. 세포 시딩 전에, 마이크로-웰 표면을 5% (w/v) 플루로닉 산 (시그마 P2443)으로 세정한 다음, 생물-안전성 캐비넷 내에서 공기 건조시켰다. hESC 유래된 심근세포를 보충제 0.45 g/ml 글루코스, 1% (v/v) HEPES, 10% (v/v) 매트리겔 (BD 바이오사이언시스), 및 0.2 g/ml NaHCO3을 함유하는 콜라겐 유형 I 기반 겔 (제조업체에 의해 기재된 바와 같이 1N NaOH 및 10x M199 배지에 의해 중화된 3.0 mg/ml의 래트 꼬리 콜라겐 유형 I (BD 바이오사이언시스)) 중에 200 x 106개/ml (달리 명시되지 않는 한)로 현탁시켰다. 이어서 현탁된 심근세포를 세포 배양 채널 내에 시딩하였다 (웰당 2.5 μl). 겔화를 유도하기 위해 37℃에서의 30분 인큐베이션 후에, 적절한 배지를 첨가하였다. 시딩 후에, 세포를 배양물 중에 7일 동안 유지시켜 콜라겐 매트릭스가 재형성되게 하고 와이어 주변에 어셈블리되게 하였다. 심장 조직 가닥을 2-3일마다 배지 교환하면서 최대 21일까지 배양물 중에 유지시켰다. 바람직하게는, 조직 가닥은 배양물 중에 적어도 2주 동안 유지시켜 성숙되게 해야 하지만; 최대 배양 지속기간에 대한 제한은 없다. 심장 조직 가닥을 시딩하여, 장기간 배양 중 조직의 안정성 및 재현성을 관찰하였다. 시딩 후에, 조직 가닥의 명시야 영상 (예에 대해 도 39a 참조)을 광학 현미경 (올림푸스 CKX41)을 사용하여 매일 채취하고 (군당 n = 3), 4곳의 특유한 위치에서의 조직 가닥의 직경을 이미지J(imageJ)에 의해 분석하였다 (예에 대해 도 39b 참조). 조직 가닥 길이를 또한 동일한 방법으로 분석하였다.
도 39는 다중웰 플레이트 구성을 갖는 개시된 장치에서의 조직 압착 및 힘 측정을 입증하는 예시적인 결과를 보여준다. 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 유래 심근세포를 세포 공급원으로서 사용하였다. 도 39a는 시딩으로부터 시작하여 (제0일), 겔 압착을 통해 (제1일 내지 제6일), 안정기 (제6일 내지 제21일)에서의 심장 조직 형성 및 안정화를 보여준다. 도 39b는 3주 연속 배양 동안 압착 및 조직 재형성 동안의 조직 너비 및 길이의 정량화를 보여준다 (평균 ± SD, n=3). 너비 및 길이 둘 다는 제1주 내에 유의하게 변화되었고, 다음 2주의 배양 동안 안정하게 유지되었다.
실시예 3의 장치를 사용하여 배양된 조직 가닥에서 전기 자극을 검증하기 위해, 편의상 동일한 치수를 갖는 PDMS 마이크로-웰을 사용하였다. 전기 자극을 실시예 1의 장치의 조사에서와 유사한 설정을 사용하여 조직에 적용하였다. 2개의 1/4 -인치-직경 탄소 로드 (라드 리서치 인더스트리즈)를 내부 에지로부터 2cm 떨어져서 놓았다. 조직을 탄소 로드에 대해 수직으로 놓고, 탄소 로드의 중심과 동일한 높이에 두었다. 2개의 탄소 로드를 백금 와이어 (라드 리서치 인더스트리즈)를 사용하여 외부 전기 자극기 (그라스 S88X)에 연결시켰다. 세포 압착 7일 후에, 조직을 자극 챔버 내의 전기 자극에 도입하였다. 조율 주파수는 실시예 1의 장치의 조사에 기재된 바와 같이 1 Hz에서 시작하여 주 내내 서서히 매일 6 Hz까지 증가시켰다 (1, 1.83, 2.66, 3.49, 4.82, 5.15 및 6 Hz, 1일 주파수). 1Hz 전기 조율을 사용하여 추가의 1주 배양을 계속하여, 조직 성숙 및 단기간 또는 장기간 약물 시험 실험을 위한 충분한 시간이 되게 하였다.
PMMA 플레이트의 경우에, 금 전극이 마이크로-웰의 둘 다의 짧은 말단에 인쇄될 것이고 (도 37D2 참조), 이는 플레이트의 에지로 연장되어 전기장 자극을 위한 외부 전기 자극기 (그라스 S88x)와 연결될 것이다. 이러한 예에서 치수는 0.2mm x 1mm x 0.1mm 높이이다.
조직 수축 거동 추적 및 측정을 수행하였다. POMac는 광범위한 파장에서 자가-형광성이고; 따라서 와이어의 굴곡 이동을 추적하기 위해 DAPI 채널 (예를 들어 461 nm 파장) 하에서 형광 현미경을 사용하여 와이어를 영상화하였다. POMac는 FITC 및 Tritc 채널 하에서를 포함하여, 광범위한 파장에서 자가-형광성이다. 영상을 25 초당 프레임 (fps)으로 채취하였다 (도 39c 참조). 영상 순서를 트래킹 플러그인을 사용하여 이미지J 소프트웨어에 의해 분석하였다. 심장 조직으로부터 기원한 힘을 계산하기 위해, 중간 섹션에 균일하게 분포된 로드에 의한 빔 굴절 공식을 여기서 사용하였다. 도 39c는 시간의 경과에 따른 조작된 심장 조직의 수축 거동으로 인한 단일 와이어의 굴곡 거동을 보여준다. 조작된 심장 조직은 2 Hz 주파수로 조율되었다. 이러한 영상 순서로부터, 박동의 수축 및 이완 시간을 추정할 수 있다. 도 39d는 2개의 고정된 말단을 갖는 빔 굴절 시나리오의 예시를 보여준다. 조직 스트레칭 와이어는 균일하게 분포된 로드, Wo (힘 베어링 길이당 로드)로 간주될 수 있고, 이는 영상 순서상 와이어의 중심점의 변위에 의해 계산될 수 있고, F도 마찬가지로 계산될 수 있다. 도 39e는 정적 장력 F1 (세포 압착 및 재형성으로 인함) 및 동적 장력 F2 (조직의 수축으로 인함) 및 둘 다의 힘을 탈커플링시키기 위한 절차를 보여준다. 간략하게, 전체 빔 길이는 L이다. 조직이 주변을 감싸는 와이어의 섹션은 로드를 거친다. 여기서, 로드는 이러한 섹션 도처에 고르게 분포되는 것으로 가정되고, Wo는 길이당 로드이다. 플루로닉 산 코팅으로 인해, 조직 형성은 매우 대칭적이고 와이어에 대해 수직이다. 조직의 측면과 웰 벽 사이의 거리는 a이며, 이는 둘 다의 측면에 대해 동일한 것으로 가정하였다. 중심점에서의 굴절은 y이다.
도 39d의 공식에 따르면, 영상 분석에 의해, 중심점에서의 굴절을 용이하게 수득할 수 있다. 이 경우에, 단면적당 Wo 및 힘이 계산되었다 (조직의 중간점에서의 응력). 와이어의 굴절은 2가지 상이한 장력에 따라 달라졌다. 하나의 장력은 겔 압착 및 세포 어셈블리 과정에 의해 생성되었다. 이러한 장력은 F1로, 이는 짧은 시간 프레임 (예를 들어 시간) 동안 정적이고, 조직이 이완 상태에 있는 경우에 y1으로부터 계산된다 (도 39e 참조). 전체 굴절 y2는 2개의 장력, F1 및 F2에 의해 유발되었다. 장력 F2는 동적이고, 조직의 수축 거동에 적용된다. 장력 F2는 측정 목표이다. 정확한 수축력 F2를 측정하기 위해, 압착 장력 F1을 탈커플링시키는 것이 필요하다.
힘 측정치 검증을 수행하였다. 바이오그라프(Biograf) 힘 트랜스듀서 (켄트 사이언티픽(Kent Scientific))에 의해 모든 직접 힘 측정을 수행하였다. 작은 크기의 조직 및 와이어로 인해, 기하학적 유사성 규칙을 사용하여 와이어를 포함하는 웰의 스케일 업을 설정하였다.
도 40은 힘 측정치 검정을 예시한다. 방정식을 검증하기 위해, 힘 트랜스듀서의 감수성으로 인해 스케일-업 설정이 필요하였다. 도 40A는 계산된 힘과 측정된 힘을 비교하기 위한 스케일-업 설정의 개략적인 예시를 보여준다. 힘은 굴절 y, 와이어 길이 L, 및 힘 프로브의 와이어 고정된 말단 및 에지로부터의 거리 a를 도 40D에 제공된 공식으로 치환하여 계산하였다. 측정된 힘은 바이오그라프 기기 (켄트 사이언티픽)를 사용하여 수득하였다. 2개의 상이한 와이어 단면을 공식 검증에 사용하였다. 도 40B로부터, 동일한 샘플로부터의 측정 및 계산 데이터는 0.5mm의 와이어 굴절까지 일치하였다. 이 경우에, 힘 계산은 굴절이 와이어 길이의 20%를 초과하는 경우에 정확한 것으로 간주되지 않았다. (n=3).
웰 너비 L은 2.5mm, 힘 트랜스듀서 프로브 직경은 0.6mm였고, 따라서 프로브를 중심점에 둔 경우에 a = 0.95mm였다. POMaC의 탄성률은 그의 경도에 따른 스트레칭과 함께 응력-변형률 곡선에 의해 계산하였다. 시험 동안, 힘 프로브는 중심점에서 POMac 와이어에 대해 이동하였다 (도 40A 참조). 힘 판독 및 변위를 동시에 기록하였다. 2개의 상이한 와이어 크기의 단면은 0.3mm x 0.3mm 및 0.4mm x 0.4mm였다. 변위, 탄성률 및 단면적을 사용하여 공식으로부터 계산된 힘을 트랜스듀서로부터 판독한 힘과 비교하였다,
제21일에, 자극된 인간 심장 조직 가닥 및 대조군 인간 심장 조직 가닥의 전기 특성을 실시예 1의 장치의 조사에 대해 상기 기재된 바와 같이 외부 전기장 조율 하에 흥분 역치 (ET) 및 최대 포획률 (MCR) 면에서 특징화하였다.
실시예 3의 장치에서 배양된 심장 조직의 특징화를 위해 면역염색 및 공초점 현미경검사를 수행하였다. 예시적인 결과를 도 41에 제시한다. 도 41A는 종점 측정으로서 제21일에서의 흥분 역치 및 최대 포획률에 의한 전기 특성의 평가를 보여준다 (평균 ± SD, n=3). 도 41B는 시딩 후 제21일의 세포성 단백질 발현에 대한 형광 영상을 보여준다 (종점 평가): 간극 연접 단백질, 코넥신 43 (Cx43)); 근절 단백질 심장 트로포닌 T (cTnT) 및 F-액틴 (적외선 적색); 알파-액티닌. f-액틴 및 알파-액티닌에 대한 염색은 공동국재화된 고유한 줄무늬 구조를 나타내었다. 도 42A는 자발적 박동의 수축력을 정량화하기 위해 제2일, 제3일, 제6일, 제10일, 제13일, 제17일, 제21일에 취한 비디오로부터의 결과를 보여준다. 수축력은 제1주에 신속하게 증가하였고, 제2 및 제3주에 정체기에 도달하였다. 도 42B는 0.5Hz에서 3Hz로의 조율 주파수를 사용하여 제21일 (종점 평가)에 굴절로부터 계산된 단면당 힘을 보여준다. 0.5Hz에서 생성된 힘에 대해 정규화한 후에, 도 42B는 양의 힘-주파수 관계를 보여주었다 (평균 ± SD, n=3).
3주의 말미에, 조직 가닥을 cTnT, 코넥신 43, F-액틴 및 알파-액티닌에 대해 염색하였다. 조직 가닥을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.25% 트리톤 X-100에 의해 투과되게 하고, 5% 소 태아 혈청 (FBS)으로 차단시켰다. 하기 항체를 사용하여 면역염색을 수행하였다: 마우스 항-심장 트로포닌 T (cTnT) (압캠; 1:200), 토끼 항-코넥신 43 (Cx-43) (압캠; 1:200), 마우스 항-α-액티닌 (압캠; 1:200), 염소 항-마우스-알렉사 플루오르 488 (잭슨 이뮤노 리서치; 1:400), 항-토끼-TRITC (인비트로젠; 1:200), 항-마우스-TRITC (잭슨 이뮤노 리서치; 1:200). 팔로이딘-알렉사 660 (인비트로젠; 1:200)을 사용하여 F-액틴 섬유를 염색하였다. 공초점 현미경검사의 경우에, 염색된 심장 조직 가닥을 정립 공초점 현미경 (자이스 LSM 510) 하에 가시화하였다 (도 41B 참조).
7개의 상이한 시점 (시딩 후 2, 3, 6, 10, 13, 17, 21일)에서, 자발적 박동의 수축 거동을 평가하였다. 상이한 시점에서의 평가를 위해, 형광 현미경 상에서 정확하게 동일한 설정을 사용하였고, 조직의 동일한 위치를 위치시켜 양호한 비교를 보장하였다.
약물 시험을 수행하였다. 약리학적 작용제에 대한 반응을 연구하기 위한 이들 조직 가닥의 잠재력을 입증하기 위해, 연구는 조직이 노르에피네프린, E-4301 및 이소프로테레놀을 비롯한 널리 공지된 심장 화합물에 적절하게 반응하는지 여부를 검사하였다.
실시예 결과 및 논의
제약 개발에 들인 많은 노력과 지출에도 불구하고, 심장-관련 부작용으로 인해 철회가 야기되는 시장 진입 중인 많은 약물이 여전히 존재한다. 많은 연구 그룹은 임상 시험 개시 전에 검증되지 않은 약물 후보를 제거하기 위해 약물 후보의 시험관내 스크리닝에 특이적인 심장 조직에 현재 초점을 맞추고 있다55-59. 이러한 적용분야를 위한 성공적인 플랫폼을 설계하기 위해, 다양한 기준이 고려될 수 있다. 무엇보다도, 장치에 사용되는 물질이 웰내 약물 농도에 영향을 미치지 않는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 전체 플랫폼은 불활성, 비-흡수성 물질을 사용하여 제작될 수 있다. PDMS는 용이하게 조작될 수 있고 양질의 특색으로 제작될 수 있는 매우 인기있는 물질이다. 따라서 많은 그룹이 심장 약물 시험을 위한 마이크로장치를 구축하는데 PDMS를 사용하고 있다60-61. 그러나, PDMS는 매우 약물 흡수성이고, 이러한 물질로의 풍부하고 용이한 약물 흡수를 야기하는 대부분의 약물 후보의 소수성으로 인해 약물 전달 비히클로서의 용도로 승인받았다62-65. 이 경우에, PDMS 및 다른 약물 흡수성 중합체는 장치에서의 시험 동안 약물과 접촉하여 사용될 수 없다.
둘째로, 조작된 심장 조직 (ECT)은 적절한 세포 성장 및 약물 효과의 조사를 가능하게 하기 위해 용이하게 재현되고 적어도 3주 동안 배양물 중에서 안정하게 유지되는 것이 유용할 수 있다. 이러한 3주 배양 동안의 관찰은 조직의 파괴 없이 완료되어야 한다. 포스트 굴절 특징화는 조직 수축 거동을 특징화하기 위한 널리-허용되는 방식이다55,58,60-61,66-68. 이러한 접근법에서, 심장 마이크로-조직은 한 쌍의 실린더형 포스트를 함유하는 마이크로웰 내에서 생성된다. 조직은 포스트 주변에서 어셈블리되고, 포스트 굴절은 수축력의 측정을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 과정은 종종 제어가 어렵다. 조직은 종종 포스트의 유의한 변형으로 인해 포스트에서 미끄러진다. 이는 배양 과정 동안 시편의 손실을 유발할 수 있다. 제작 과정은 샘플 손실을 방지하기 위해 포스트의 상부에 캡을 첨가하는 경우에 유의하게 더 어려워진다. 또한, 포스트 굴절 설계의 힘 측정은 포스트 상의 조직의 위치에 유의하게 의존한다. 조직은 장기간 배양 동안 통상적으로 상향으로 이동하고, 측정은 현미경검사에 의해 정확하게 용이하게 수행되지 않는다. 사실상, 포스트 상의 조직의 정확한 위치를 결정하기 위해서는, 웰을 절단할 필요가 있고, 조직은 측면으로 영상화될 필요가 있다.
상기 기재된 예시적인 장치는 고처리량 약물 시험 장치로서의 역할을 할 수 있고, 상기 유용한 기준 중 1개 이상을 만족시킬 수 있다. 실시예 3의 예시적인 장치는 상기 제한 중 1개 이상을 극복할 수 있다. 세포가 주변에서 자기-어셈블리되는 지지 와이어는 모두 동일한 수준에서 위치될 수 있고, 따라서 조직은 항상 동일한 장소에서 종료될 수 있다. 지지 와이어는 벽 내에 확고하게 피팅될 수 있고, 어떠한 자유 말단도 존재하지 않으며, 따라서 조직은 와이어로부터 미끄러질 수 없다. 또한, 와이어 굴절은 수축력의 정확한 측정 뿐만 아니라 능동 장력으로부터 수동 장력의 탈커플링을 가능하게 할 수 있다.
이러한 예시적인 장치에서, PMMA 및 POMaC가 배지 및 배양물 중의 조직과 접촉하는 물질로서 사용되었다. POMaC는 PDMS와 비교하여 덜 소수성이고69, 따라서 약물 흡수의 기회를 감소시킬 수 있다. 또한, 장치 웰이 불활성 PMMA로 구축되기 때문에 최소 부피의 POMaC가 사용될 수 있다. 예에서 POMaC 와이어는 25kPa의 탄성률을 갖고, 이는 생리학상 관련 마이크로-환경을 제공할 수 있는 본래의 심장 조직 및 조작된 심장 조직의 기계적 특성과 가깝다 47. 상이한 사전-로드는 다양한 UV 경화 에너지를 사용하여 PoMAC 와이어의 가변가능한 기계적 특성으로 시뮬레이션될 수 있다. 따라서, 수득되는 데이터는 생리학적 및 병리학적 경우 둘 다에 대해 보다 임상적으로 관련될 수 있다. 또한, 힘 측정은 PDMS와 같은 보다 강성인 물질과 비교하여 POMaC와 같은 보다 연질인 물질에 의해 보다 감수성일 수 있다. 이는 소형화된 조직 크기에 의한 고처리량 설계에 유익할 수 있다. 제작 과정은 본원의 예에 개시된 바와 같이 고온 엠보싱 기술을 사용한 상업적 제조로 스케일 업될 수 있다 (도 38 참조).
실시예 3의 예시적인 장치는 배양된 조직의 높이 평가에 대한 필요를 감소시키거나 제거할 수 있다. 시딩 부피 및 세포 밀도가 규정되어 있고 와이어가 모두 동일하고 일정한 위치에 놓이기 때문에, 조작된 심장 조직은 전체 배양 기간 동안 항상 동일한 위치에 있을 수 있다. 힘 계산을 위한 파라미터는 굴절 트래킹 영상 순서에서 용이하게 검색될 수 있다. 포스트에서 발견되는 것과 같은 자유-말단 없이, ECT는 미끄러지거나 샘플 손실을 유발할 어떠한 방법도 갖지 않을 수 있다. 도 39c는 와이어가 조직 수축 동안 어떻게 굴곡되는지를 예시하는 형광 영상의 시간-경과 샘플이다. 심장 조직은 시딩 후 제2일에 박동을 시작하여 전체 배양 기간에 걸쳐 박동을 유지하였다. 이는 히드로겔 매트릭스 내 세포의 높은 수준의 전기기계적 커플링을 입증하였다. 추가로, 전기 자극을 사용하여 21일 배양 후에, 도 39b는 조직 치수가 제1주 동안 신속하게 변화되고, 제2주 시작 시 정체기에 도달하여 전체 배양 기간 동안 치수를 유지함을 보여주었다. 결과는 인간 심장 조직이 제1주 내에 겔 압착 및 자기-어셈블리를 완성함을 확인시켜 주었다. 작은 표준 편차는 조직이 매우 재현가능함을 시사한다.
검증 실험은 2가지 측면, 힘 측정 검증 및 조직 특징화를 갖는다. 도 40에서의 힘 측정에 대한 검증 시험은 도 39d의 공식을 사용한 계산이 굴절이 와이어 길이의 20% 내인 경우에 정확하다는 것을 확인시켜 주었다. 보다 큰 굴절은 다른 공식의 사용을 필요로 할 수 있다. ECT의 전기 특성은 전기 자극 후에 개선되었고, 특히 흥분 역치 (ET)는 자극된 샘플에서 유의하게 감소되었다. 최대 포획률 (MCR)이 유의하게 변화되지 않았지만, 추세는 개선을 나타내는 것으로 간주되었다 (도 41A 참조). 코넥신 43의 면역염색은 간극 연접 단백질이 세포 표면에서 발현됨을 나타내었다. cTnT 염색은 세포 내 근절 단백질의 존재를 확인시켜 주었다. 심근세포의 근절-α-액티닌 및 f-액틴 구조가 또한 제시되었고, 함께 국재화되었고, 이는 ECT에서의 세포 신장을 나타낸다 (도 41B 참조).
도 42A는 배양 3주 내 수축력의 변화를 보여준다. 7개의 상이한 시점 (시딩 후 2, 3, 6, 10, 13, 17, 21일)에서, 자발적 박동의 수축 거동을 평가하였다. 수축력은 히드로겔 내 세포의 상승된 전기 커플링으로 인해 제1주 내에 유의하게 증가되었다. 제2 및 제3주 배양은 수축력에서의 어떠한 유의한 개선도 나타내지 않았다. 도 42B에 제시된 힘-주파수 관계는 ECT가 2.5Hz의 전기 자극까지 바우디치(Bowditch) 계단 현상을 갖는 본래의 심장 조직과 유사함을 시사한다.
도 43은 약물 시험으로부터의 예시적인 결과를 보여준다. 노르에피네프린은 심박수를 직접적으로 증가시킴으로써 투쟁-또는-도피 반응에 작용하는 스트레스 호르몬이다72. 도 43A는 대조군과 비교하여 주어진 약물 농도에서의 대표적인 조직 박동 패턴을 보여준다. 노르에피네프린 10μM의 첨가는 유의하게 증가된 박동 주파수를 야기한다. E4301은 인간 Ikr 심장 이온 채널에 대한 차단제로서 작용하고, 그의 차단은 후탈분극 및 위험한 부정맥을 야기할 수 있다 56. 100nM E4301 첨가는 이러한 작용제의 기능을 명백하게 나타내는 지속된 이완 및 이따금의 후박동을 야기하였다. 이소프로테레놀은 심장 박출량을 증가시키는 비-선택적 베타-아드레날린성 효능제이다. 높은 투여량은 조직을 탈감작시키고 역효과를 유발할 수 있다73. 도 43B는 약물 첨가 전의 힘에 대해 정규화된 조직 수축력의 용량 반응 추세를 보여주었다. 조직은 100 nM 및 1μM에서 양의 수축촉진 작용을 가졌고 (수축성에서의 증가), 10 μM에서 약간 음의 수축촉진 효과를 가졌다 (수축성에서의 감소).
도 43은 약물 시험으로부터의 예시적인 결과를 보여준다. 노르에피네프린은 심박수를 직접적으로 증가시킴으로써 투쟁-또는-도피 반응에 작용하는 스트레스 호르몬이다72. 도 43A는 대조군과 비교하여 주어진 약물 농도에서의 대표적인 조직 박동 패턴을 보여준다. 노르에피네프린 10μM의 첨가는 유의하게 증가된 박동 주파수를 야기한다. E4301은 인간 Ikr 심장 이온 채널에 대한 차단제로서 작용하고, 그의 차단은 후탈분극 및 위험한 부정맥을 야기할 수 있다 56. 100nM E4301 첨가는 이러한 작용제의 기능을 명백하게 나타내는 지속된 이완 및 이따금의 후박동을 야기하였다. 이소프로테레놀은 심장 박출량을 증가시키는 비-선택적 베타-아드레날린성 효능제이다. 높은 투여량은 조직을 탈감작시키고 역효과를 유발할 수 있다73. 도 43B는 약물 첨가 전의 힘에 대해 정규화된 조직 수축력의 용량 반응 추세를 보여주었다. 조직은 100 nM 및 1μM에서 양의 수축촉진 작용을 가졌고 (수축성에서의 증가), 10 μM에서 약간 음의 수축촉진 효과를 가졌다 (수축성에서의 감소).
요약하면, 이러한 예시적인 장치는 적어도 부분적으로 성숙된 인간 심장 조직을 고처리량 방식으로 생성할 수 있다. 설계는 PDMS의 사용을 감소 또는 제거할 수 있고, 통상적으로 사용되는 96 웰-플레이트 포맷과 충분히 상용가능하였다. 힘 및 수축 특성의 다른 주요 측면, 예컨대 박동 주파수, 수축 및 이완 시간의 소형화 및 자동화 측정이 성공적으로 수행될 수 있다. 인간 심장 조직은 또한 널리-공지된 약물: 노르에피네프린, E-4301 및 이소프로테레놀에 적절하게 반응하였다.
예시적인 장치는 다용도성일 수 있고, 다양한 적용분야에 적용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 지지체 와이어가 1개의 웰에 설치되기 때문에, 1개의 와이어 물질은 다른 목적을 용이하게 하기 위해 바뀔 수 있다. 예를 들어, 1개의 와이어는 점 전기 자극을 전도하도록 백금 와이어 또는 다른 전기 전도성 중합체로 바뀔 수 있다. 자성 물질 (중합체)로 제조된 와이어를 사용하여, 외부 자장은 심장 로드의 모방으로서 전기 및 기계적 자극을 함께 가능하게 할 수 있다74. 이러한 설정은 ECT의 성숙을 발생시키는데 추가로 도움이 될 수 있다.
도 44는 알파-액티닌 (세포골격 염색) 및 DAPI (핵을 나타내기 위함)에 대해 염색된 바이오로드 실시양태의 조직 가닥의 세포의 형광 현미경검사 영상을 제공한다. 조직 내에 높은 정도의 세포 정렬을 갖는 충분히 신장된 세포와 함께 분명한 근절 구조를 관찰할 수 있으며, 이들 각각은 전기 자극의 결과로서 고도로 성숙한 심장 조직을 보여준다.
도 45는 바이오로드 실시양태의 조직 가닥이 탄성과 관련하여 인간 심근을 시뮬레이션함을 입증하는 실험 결과를 제공한다. 조직 탄성면에서 인간 심근은 약 20kPa 내지 0.5 MPa의 범위이다. 대체 심장 조직을 이식한 경우에, 본래의 생리학적 환경을 시뮬레이션하도록 이식된 조직 고정점이 본래의 조직의 유사한 기계적 특성을 갖도록 확실하게 하는 것이 중요하며, 이는 시험관내 및 생체내 적용 둘 다를 위해 이상적이다. 바람직한 측면에서, 바이오로드 장치의 중합체의 기계적 특성은 상이한 가교 에너지를 사용하여 중합을 제어함으로써 가변가능하다. 가변성은 또한 중합 반응 동안 중합체 유닛 혼합물의 비에 의해 제어될 수 있다. 막대 그래프는 바이오로드 장치의 POMac 중합체 와이어 / 굴곡가능한 요소가 2개의 상이한 에너지 수준으로 가교된 경우의 특유한 탄성률을 보여준다. 둘 다의 에너지 (4320 mJ/cm2 및 8610 mJ/cm2)에서의 탄성률은 성체 심근의 범위 내에 완전히 속하지만, 더 낮은 경화 에너지에 의하면 탄성률은 더 낮다. 특정한 병리학적 상태를 생성하기 위해 증가된 경화 에너지를 사용하여 중합체 와이어의 기계적 특성을 또한 증가시킬 수 있다.
도 46은 3개월의 기간에 걸친 바이오로드 실시양태의 POMac 중합체 와이어의 안정성 (탄성률의 면에서)을 입증하는 막대 차트를 제공한다. 데이터는 3개월의 기간 후에도 탄성률이 비교적 일정하게 유지됨을 나타내고, 이는 POMac 와이어가 시간의 경과에 따라 실질적으로 안정함을 입증한다.
도 47은 바이오로드 실시양태의 POMac 중합체 와이어가 2가지의 상이한 경화 에너지에서도 탄성률에서의 어떠한 영향 없이 감마선 조사에 의해 살균될 수 있음을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 48은 바이오로드 플레이트의 배치 영상을 상업적으로 입수가능한 기기 (예를 들어, 몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 획득할 수 있는 하나의 방식을 입증하는 개략도를 제공한다. 배치에서 겔 압착 및 조직 압착에 의해 생성된 수동 장력에 대한 사진을 찍기 위해 몰레큘라 디바이시스로부터의 상업적으로 입수가능한 스펙트라맥스(Spectramax) 장치가 본 발명자들의 실험실에서 사용된다.
도 49는 조직 가닥이 래트 신생아 세포 공급원을 사용한 단일 96-웰 플레이트 내에서 일관되고 매우 재현가능한 데이터를 생성함을 입증하는 데이터를 제공한다. 상이한 시험으로부터의 샘플의 힘을 비교하였다. 또한 도 49의 하부 우측의 막대 그래프에 제시된 바와 같이, 동일한 박동 주파수 하에서의 조직 수축, 이완, 및 휴지 시간을 비롯한 파라미터는 거의 변동을 갖지 않았다. 이들 증거는 바이오로드 장치에서의 조직 가닥의 높은 수준의 재현성을 보여준다. 도 50은 신장된 세포 구조, 일관된 배향, 및 세포하 구조를 보여주는, 96 웰-플레이트에서의 바이오로드 조직 가닥의 계내 알파-액티닌 면역형광 영상이다.
상기 실험적 시험에 의해 지지되는 바와 같이, 바이오로드 실시양태는 최소한:
용이한 취급 및 장기간 관찰을 가능하게 함
조직 공학 분야에서 고처리량 플랫폼을 제공함
약물 시험을 위한 완전한 약물 불활성 환경을 제공함
PDMS 무함유
높은 충실도 심장 조직
성숙을 발생시키기 위해 전기 자극을 합체시킴
상이한 경화 에너지, 및 중합체 유닛 조성/비를 사용한 중합체의 중합에 의한, 중합체 와이어 (즉, 굴곡가능한 요소)의 제어되는 (즉, 가변가능한) 기계적 특성
계내 장기간 및 종점 평가
칼슘 과도 측정
IHC 염색
다양한 응용을 가능하게 하기 위해 와이어의 한쪽 측면을 다른 물질로 가능하게 변경시킴
Pt 와이어를 사용한 점 전기 자극
자장을 사용한 기계적 스트레칭
을 포함하는, 수많은 이점 및 특색을 갖는다.
실시예 4: 바이오분지/안지오칩
A. 예시적인 혈관화된 조직 배양 실시양태 (즉, 바이오분지/안지오칩)의 구조, 제조, 및 사용
제4 실시양태에서, 본 발명은 1개 이상의 내부 내강 통로를 갖는 3차원 분지화된 조직 (예를 들어, 혈관화된 3차원 조직 구조를 모방함)을 포함하는, 3차원 조직을 성장시키기 위한 생물반응기 장치에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 실시양태는 시딩된 세포를 성장시키기 위한 제1 부분 및 제1 부분을 통과하는 상호연결된 채널을 제공하기 위한 제2 부분을 함유하는, 3차원 형상 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스 유닛을 갖는 생물반응기를 포함할 수 있다. 생물반응기는 생물학적 혈관계를 모방하도록 구성될 수 있다. 스캐폴드는 채널, 바람직하게는 관류가능한 채널의 네트워크가 형성된 조직 구조를 형성하도록, 시딩된 세포에 대한 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 채널의 네트워크는 또한, 채널 투과성을 증진시킬 뿐만 아니라 세포 (예를 들어 단핵구)의 이동을 용이하게 하기 위해, 채널 벽 상에 마이크로-홀 (10-20um 직경)을 포함할 수 있다. 생물반응기는 생물반응기를 가로질러 전기장을 생성하도록 구성된 전극을 포함하도록 추가로 구성될 수 있다. 전기장의 방향은 임의의 방향일 수 있지만, 바람직하게는 스캐폴드의 종축과 일반적으로 평행인 방향일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전기장의 방향은 스캐폴드의 종축과 일반적으로 수직일 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제4 실시양태는 "바이오분지"로 지칭될 수 있고, 이는 3차원 조직 형성 그 자체 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 장치 상에서 성장한 세포) 또는 조직 형성 및 생물반응기를 함께 포함하는 시스템을 지칭할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바이오분지는 또한 그의 상업적 명칭 바이오분지™로서 본원에서 지칭될 수 있고, 이는 조직 형성 그 자체, 또는 조직 형성 및 조직이 성장하거나 위치하는 생물반응기 장치를 포함하는 시스템 둘 다를 포괄한다. 이러한 제4 실시양태는 또한 분지화된 생물반응기에서 조직을 성장시키는 방법, 3차원 조직 그 자체, 생물반응기 및 성장한 조직 둘 다를 포함하는 시스템 (즉, 통합형 생물반응기), 및 (a) 실험적 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 효능 및 안전성 (독성 포함)의 시험, (b) 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 약동학 및/또는 약역학의 규정, (c) 대상체에 대한 약리학적 작용제 (소분자 약물, 생물제제, 핵산-기재 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 특성 및 치료 효과의 특징화, (d) 신규한 약리학적 작용제의 스크리닝, (e) 손상 및/또는 이환 조직을 치료하기 위한 재생 의학에 사용하기 위한 이식가능한 조작된 조직의 제공, (예를 들어, 전기 전도 결함을 갖는 환자를 비롯하여 (iPSC-CM) 심장 질환 상태를 연구하기 위한 본 개시내용의 조직 구축물, 장치, 및/또는 시스템의 사용), 및 (f) 개인맞춤형 의약을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용분야에서 조직 가닥 (또는 조직 가닥을 포함하는 시스템)을 사용 및/또는 시험하는 방법에 관한 것이다.
도 51 및 52는 분지화된 혈관계를 포함할 수 있는 분지화된 조직의 배양에 적합한 예시적인 장치를 보여준다. 실시예 4의 장치는 실시예 1의 장치와 유사할 수 있지만, 단일 채널 대신 실시예 4의 장치는 3차원 분지화된 채널을 가질 수 있다. 실시예 4의 장치의 제작을 위한 예시적인 방법이 하기 기재된다.
예시적인 장치는 조직 배양을 위한 시드 세포가 수용될 수 있는 생물반응기 챔버를 포함할 수 있다. 스캐폴드는 생물반응기 챔버 내에 수용될 수 있다. 생물반응기 챔버는 스캐폴드를 베이스 상에 지지하기 위한 돌출부 (예를 들어, 포스트)를 포함할 수 있다. 이는 배양된 조직이 스캐폴드를 캡슐화하게 할 수 있다. 스캐폴드는 버팀대 및 관류 채널의 3차원 네트워크를 포함할 수 있다. 스캐폴드는 생물학적 혈관계를 모방하도록 구성될 수 있다. 스캐폴드는 3차원 네트워크 주위에 조직 구조를 형성하여 3차원적으로 분지화된 혈관계를 갖는 조직 구조의 생성을 가능하게 하는, 시드 세포에 대한 지지체로서의 역할을 할 수 있다.
본 개시내용은 분지화된 조직 구조를 배양하는데 적합한 스캐폴드를 제작하는 방법을 제공한다. 스캐폴드는 내부 공동 (예를 들어, 튜브, 2D 분지화된 마이크로-채널 네트워크, 또는 3-D 분지화된 마이크로-채널 네트워크) 및/또는 현수된 구조물 (예를 들어, 메쉬 또는 격자 매트릭스)를 포함할 수 있고, 생분해성 물질 (또는 POMaC)로 형성될 수 있다.
예시적인 제작 방법은 내부 공동 및/또는 현수된 구조물을 갖는 3-D 구조를 제작하기 위해 3-D 스탬핑 방법을 사용한다. 이러한 예에서 3-D 구조는 2개 또는 다중 패턴화 중합체 시트를 함께 정렬, 적층 및 결합시키는 것을 수반하는 층-층 공정으로 제작될 수 있다. 이에 따라 2개 이상의 층을 갖고, 그의 층에 의해 규정되는 내부 공동 및/또는 현수된 구조물을 갖는 3-D 스캐폴드를 제작할 수 있다.
마이크로제작 방법은 스캐폴드 물질에 대해 제1 접착 강도를 갖는 물질로 형성된 몰드를 사용할 수 있다 (예를 들어, 생체중합체 물질 또는 생분해성 물질, 예컨대 도 51(a)에 제시된 바와 같은 POMaC). 몰드는 스캐폴드 물질에 대해 제2 접착 강도를 갖는 기판 상에 제공될 수 있다. 몰드 내에 층을 몰딩한 후에 층이 기판에 대한 접착을 유지하면서 몰드로부터 이형될 수 있도록, 제2 접착 강도는 제1 접착 강도보다 더 클 수 있다. 본 개시내용은 PDMS를 사용하고 기판으로서 유리 슬라이드를 사용하여 몰드를 형성하는 것이, 스캐폴드 물질로서 POMaC와 적합한 차등 접착 강도를 달성한다는 것을 발견하였다.
스캐폴드 물질의 예비중합체는 몰드 내로 도입되고 그 안에서 경화되어, 기판에 의해 지지되는 스캐폴드의 제1 층을 형성할 수 있다. 스캐폴드 물질이 몰드에 대해서보다 기판에 대해서 더 큰 접착 강도를 갖기 때문에, 층은 기판에 대한 접착을 유지하면서 몰드로부터 이형될 수 있다. 이는 스캐폴드가 층-층으로 구축되게 하면서 보다 용이하게 제조되게 할 수 있다.
스캐폴드에 대해 추가의 층(들)이 형성될 수 있다. 추가의 층(들)은 동일한 몰드 또는 상이한 몰드를 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 추가의 층은 동일한 몰드 물질로 형성되고 동일한 몰드 물질로 형성된 몰드 베이스에 의해 지지되는 상이한 제2 몰드를 사용하여 형성될 수 있다. 추가의 층은, 제2 몰드 내에서 경화된 후에, 제2 몰드에 대한 접착을 유지하면서 몰드 베이스로부터 이형될 수 있다. 이는 각각의 추가의 층이 보다 용이하게 제조되게 하여, 스캐폴드가 층-층으로 구축됨에 따라 보다 정확한 정렬, 적층, 및 결합을 가능하게 할 수 있다. 추가의 층이 제1 층 또는 이전-결합 층에 적절하게 결합된 후에, 추가의 층은 제2 몰드로부터 이형되어 다음의 추가의 층을 수용하는 것을 준비할 수 있다.
스캐폴드의 모든 층이 이에 따라 결합되고 스캐폴드가 완성되면, 스캐폴드를 기판으로부터 이형시킬 수 있다.
제작 방법의 예에서 (도 51(b)에 제시된 바와 같음), PDMS 몰드는 스캐폴드 구조의 각각의 개별 층에 대해 표준 소프트 리소그래피에 의해 제작된다. 베이스 층 (바닥 제1 층)을 위해 1개의 몰드 및 모든 다른 후속 상부 층을 위해 다중 몰드가 생성될 수 있다. 베이스 층을 위한 PDMS 몰드는 기판, 예컨대 유리 슬라이드 상에 비-영구적으로 캡핑될 수 있다. 이어서 모든 후속 상부 층을 위한 PDMS 몰드는 또 다른 편평 PDMS 시트 상에 비-영구적으로 캡핑될 수 있다.
이어서 중합체 혼합물이 몰드 내로 주입될 수 있다. 중합체 혼합물을 포함하는 몰드는 UV 광에 노출되고, 부분적으로 가교 및 고체화될 수 있다. 이어서 유리 슬라이드 캡을 갖는 베이스 층을 위한 PDMS 몰드가 유리 슬라이드로부터 탈-캡핑될 수 있다. 주입된 중합체는, 가교되면, PDMS 몰드에 대해서보다 유리 슬라이드에 대해 더 강한 부착을 나타낼 수 있고, 따라서 유리 슬라이드에 대한 부착을 유지하면서 PDMS 몰드로부터 이형될 수 있다.
이어서 PDMS 시트 캡을 갖는 모든 후속 상부 층을 위한 PDMS 몰드가 PDMS 시트로부터 탈-캡핑될 수 있다. PDMS 몰드는 PDMS보다 중합체와 접촉하는 더 큰 표면적을 갖는다. 따라서 중합체는 PDMS 시트보다 PDMS 몰드 상에 더 강력하게 부착될 수 있고, 따라서 PDMS 몰드로부터 이형되지 않을 수 있다.
이어서 상부 층을 위한 PDMS 몰드 내의 각각의 중합된 중합체는 PDMS 몰드에 의해 비교적 용이하게 제조될 수 있고, 추가의 UV 가교에 의해 유리 슬라이드 상의 베이스 층 중합체에 정렬, 적층 및 결합될 수 있다. UV 가교 후에, 모든 적층된 중합체 층은 서로 영구적으로 결합될 수 있다.
유리 슬라이드는 현재 상부 중합체 층을 받치고 있는 PDMS 몰드보다 중합체 스캐폴드에 더 강력하게 접착할 수 있다. 따라서 중합체 스캐폴드는 PDMS 몰드로부터 탈착되고, PDMS 몰드가 제거되면 유리 슬라이드 상에 부착된 채로 유지될 수 있다.
보다 두꺼운 스캐폴드를 생성하기 위해, 상부 스캐폴드 층을 위한 패턴화된 중합체를 갖는 더 많은 몰드가 현재의 스캐폴드에 동일한 방식으로 전사, 적층 및 결합될 수 있다.
중합체 스캐폴드는 유리 슬라이드에 영구적으로 부착될 수 없기 때문에, 스캐폴드를 물 또는 완충제 용액 중에 침지시킴으로써 전체 스캐폴드를 유리 슬라이드로부터 간단하게 이형시킬 수 있다.
이러한 예시적인 제작 방법은 통상적인 3-D 제작 기술의 1개 이상의 단점을 극복할 수 있다. 예를 들어, 통상적인 3-D 중합체 스캐폴드 제작이 갖는 한계는 얇은 패턴화된 중합체 시트를 전사하고 이를 함께 적층시키는 용이하고 실용적인 방식의 결여를 포함한다. 중합체 시트가 그의 몰드로부터 완전히 이형되면, 이어서 얇은 시트는 용이하고 정확하게 취급될 수 없고, 따라서 정확한 정렬이 전형적으로 어렵거나 불가능하다. 정확한 정렬의 부재하에서는 정밀한 내부 공동 (예컨대 정확하고 얇은 채널 벽을 갖는 마이크로-채널) 및 현수된 구조물을 생성하는 것이 어렵거나 불가능할 것이다.
POMaC는 유리 (보다 강한 접착) 및 PDMS (보다 약한 접착)에 대해 차등 비-영구적 접착 강도를 나타낸다. 개시된 제작 방법은 PDMS 몰드를 사용하여 얇은 POMaC 중합체 시트를 포획하고 이형시키는데, 뿐만 아니라 보다 큰 제어 및 정확성으로 다른 패턴화된 시트에 정렬 및 결합시키는데 이러한 특성을 사용한다.
개시된 제작 방법이 POMaC 물질을 사용하여 기재되어 있지만, 다른 물질이 또한 사용될 수 있다. 개시된 제작 방법은 몰딩될 수 있고 물질에 대해 차등 비-영구적 접착 강도를 나타내는 이러한 한 쌍의 기판 (예컨대 유리 및 PDMS)이 존재하는 경우에 임의의 물질에 대해 수행되는 것으로 기대될 수 있다.
본 개시내용은 통상적으로는 달성된 바 없는, 유리 슬라이드 및 PDMS에만 용이하고 정확하게 전사될 수 있는 생분해성 물질을 사용한 제작 방법을 제공한다. 예를 들어, 유사한 생분해성 물질, 예컨대 PGS는 PDMS에 완벽하게 점착되고, 따라서 동일한 방식으로 사용될 수 없다. 본 개시내용은 이러한 제작 방법에 적합한 물질을 발견하였고, 기술을 입증하였다.
3-D 인쇄와 비교하여, 개시된 제작 방법은, 희생 물질 없이, 현수된 구조물 뿐만 아니라 생체적합물질 스캐폴드 내 내부 공동의 생성을 가능하게 할 수 있다. 3-D 인쇄에 의하면, 인쇄된 생체적합물질과 상용성인 희생 물질을 발견하는 것이 전형적으로 어렵다. 어떠한 희생 물질도 사용하지 않는 경우에, 현수된 구조물을 생성하기 위해서는 물질이 공중에서 인쇄되어야 하고, 이는 생체적합물질과 관련하여 극도의 도전과제이다. 개시된 방법은 각각의 개별 중합체 시트의 사전-패턴화를 가능하게 할 수 있고, 이어서 시트는 간단하게 함께 적층될 수 있으며, 각각의 층은 이형되어 현수된 구조물을 비교적 용이하게 생성할 수 있다. 그러나, 현행 3D 인쇄 한계에도 불구하고, 분지화된 네트워크, 마크로세공, 및 마이크로세공을 비롯하여 목적하는 마이크로구조가 형성될 수 있는 한, 본 발명은 3D 인쇄 방법론의 사용을 배제하지 않는다.
개시된 방법은 특히 와이어, 튜브, 2-D 분지화된 네트워크, 3-D 분지화된 네트워크, 및 메쉬 구조를 비롯하여, 다양한 1-D, 2-D 및 3-D 구조를 제조하는데 사용될 수 있다. 개시된 방법은 내부 공동을 갖는 구조, 예컨대 튜브, 2-D, 3-D 분지화된 네트워크 및 메쉬 구조를 생성하는데 특히 유용할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 2-D 및 3-D 마이크로-채널 네트워크 스캐폴드 및 그의 제작은, 스캐폴드의 설계, 스캐폴드 내에 내장된 마이크로-채널 네트워크의 포함, 뿐만 아니라 적합한 생체적합물질을 사용하여 이러한 스캐폴드를 정확하게 제작하는 능력과 같은 다양한 면에서 통상적인 기술을 넘어 유리할 수 있다.
한 예에서, 예비중합체 용액을 사용하여 장치를 제작하였다. 도 51(a)는 예시적인 예비중합체 용액의 화학적 합성, 뿐만 아니라 중합체 광-가교 메카니즘 및 나노-세공 형성의 개략적 예시를 보여준다. 도 51(a)의 삽도는 나노-스케일 주름-형상 세공을 보이는 예시적인 생성된 스캐폴드 표면의 SEM 영상을 보여준다. (축척 막대: 500nm).
한 예에서, 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMac) 예비중합체를 제조하기 위해, 1,8-옥탄디올, 시트레이트 산, 및 말레산 무수물을 5:1:4 몰비로 혼합하고, 질소 퍼지 하에 160℃에서 용융시켰다. 이어서 온도를 140℃로 강하시키고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 예비중합체 용액을 1,6디옥산 중에 용해시키고, 증류수 중 적가 침전을 통해 정제하였다. 침전된 중합체를 2일 동안 동결건조시킨 다음, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메틸 에테르 (PEGDM, Mw~500, 시그마) 60% w/w 및 5% w/w UV 개시제 (이르가큐어 2959)와 혼합하였다.
예비중합체 구성요소의 비는 생성되는 중합체의 물리적 특성을 조정하기 위해 바뀔 수 있다.
스캐폴드 패턴은 오토캐드에서 사전-설계되고, 이전에 기재된 바와 같이 표준 소프트 리소그래피 기술을 통해 SU-8 마스터에 변환된다. 실리콘 엘라스토머 [폴리(디메틸실록산), PDMS]를 SU-8 마스터에 대해 몰딩하고, 실온에서 2일 동안 경화시켰다.
이어서 제1 층 및 스캐폴드의 다른 층을 위한 패턴화된 PDMS를 유리 슬라이드 및 편평 PDMS에 각각 일시적으로 결합시켜 정적 접착을 통해 닫힌 채널을 형성하였다. 이어서 예비중합체 용액을 패턴화된 채널 내로 주입하고, 밤새 실온에 두었다. 다음으로, 주입된 중합체 용액을 UV 램프 하에 5분 동안 가교시킨 다음, 제1 층이 유리 슬라이드에 접착되고 패턴화된 PDMS로부터 탈착되는 한편 다른 층은 패턴화된 PDMS에 접착되고 편평 PDMS로부터 탈착되도록, PDMS 몰드를 층간박리시켜 패턴화된 중합체 구조를 이형시켰다. UV 정렬기 (Q2001, 퀸텔 코포레이션(Quintel Co.), 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 모든 패턴화된 층을 제1 층 또는 이전 층에 정렬시키고 압축한 다음, 1분 동안 추가로 UV 노출시켜 층을 함께 영구적으로 결합시켰다. 마지막으로 제작된 스캐폴드를 PBS 중에 밤새 침지시켜 PEGDM 포로겐을 침출시켰다. 이러한 예에서, 4개의 스캐폴드가 한 번에 제작될 수 있었다.
도 51(b)(1-5)은 단일 층 혈관망 제작을 위한 예시적인 혈관 스캐폴드 층-층 몰딩 및 결합 절차의 개략적 다이어그램이다. 삽도는 채널 내강 단면의 SEM 영상을 보여준다. (축척 막대: 100μm). 도 51(b)(6)은 멀티-층 혈관망 제작의 예를 보여주는 개략도이다.
예시적인 장치는 배지 관류 하에 스캐폴드 상에서의 내피 세포 및 심근세포의 공동-배양을 위한 생물반응기로서 역할을 할 수 있다. 이러한 예에서, 장치는 4가지 구성요소: 캡, 저장소, PDMS 슬래브, 및 베이스를 포함하였다 (도 51(c)(ii) 참조). 이러한 예의 장치는 3개의 스캐폴드를 개별 배양 챔버 내에서 한 번에 배양하기 위해 설계되었다. 저장소 부분 (2.5 cm 두께)은 스캐폴드 네트워크를 통해 관류되고 내부로부터 배양 중인 조직에 산소 및 영양소를 공급하는 내피 성장 배지를 넣기 위한 6개의 웰, 및 조직 표면에 영양소를 제공하는 심근세포 성장 배지를 함유하는 3개의 웰을 포함한다. PDMS 슬래브 (2 mm 두께)는 스캐폴드가 놓일 수 있는 3개의 트렌치를 포함한다. 트렌치는 세포/겔이 전체 스캐폴드를 캡슐화할 수 있도록 바닥으로부터 스캐폴드를 위로 들어 올리는데 도움이 되는 마이크로-포스트를 포함하는 베이스 층을 갖는다. 트렌치는 또한 스캐폴드의 유입구 및 유출구가 정확하게 피팅된 개방 유입구 및 유출구 채널을 포함한다.
도 52는 실시예 4의 장치를 위한 예시적인 홀더를 보여준다. 이러한 예에서, 홀더는 겔 침윤 및 보다 효과적인 재형성을 가능하게 하는데 도움이 되도록 조직을 현탁된 상태로 유지시키기 위해 설계된 트렌치 및 포스트를 합체시킨다. 트렌치의 예시적인 치수가 도면에 제시된다.
스캐폴드를 트렌치 상에 위치시킨 후에, PDMS 개방 유입구 및 유출구 채널이 저장소 구성요소에 의해 캡핑되어 스캐폴드를 고정시키도록 PDMS 슬래브를 베이스 구성요소 및 저장소 구성요소 사이에 샌드위치시킬 수 있다. 3개의 구성요소는 스테인레스 스틸 스크류에 의해 고정되고 캡핑된다. 내피 세포 배지는 상부 웰로부터 스캐폴드 네트워크를 통해 캡핑된 채널로 관류되고, 이는 2개의 웰 사이의 압력 수두 차이에 의해 구동되는 바닥 웰로 빠져나간다.
도 51(c)(i)은 겔 압착을 나타내는 예시적인 장치를 사용한, 심장 세포 시딩/조직 형성의 예시적인 과정을 예시한다.
도 51(d)는 (i) 2-D 혈관 스캐폴드, 및 (ii) 3-D 혈관 스캐폴드의 단면도를 보여주는 SEM 영상을 보여준다. 상이한 격자 매트릭스 설계를 갖는 단일-층 혈관 스캐폴드의 상면도를 보여주는 SEM 영상이, 단일 메쉬 층 설계를 예시하는 도 51d(iii), 포스트에 의해 지지된 2개의 밀집된 메쉬 층을 갖는 설계를 예시하는 도 51d(iv), 및 포스트에 의해 지지된 2개의 느슨한 메쉬 층을 갖는 설계를 예시하는 도 51d(v)에 제시된다.
도 51(e)는 10 마이크로미터 마이크로-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 SEM 영상을 제공한다. (A)는 그의 네트워크 벽 도처에 패턴화된 10 마이크로미터 관통-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 영상을 제공한다. 축척 막대: 600 마이크로미터. 영상은 다중 영상을 이은 것이다. (B) 상이한 각도에서 관찰한 10 마이크로미터 관통-홀을 갖는 안지오칩 스캐폴드의 SEM. 축척 막대는 영상 내에 제시된다.
도 51(f)는 3-D 안지오칩 스캐폴드의 마이크로CT를 제공한다. (A) 스캐폴드의 긴-에지 방향을 따라 그의 유입구로부터 분지까지의 3-D 안지오칩 스캐폴드의 단면의 마이크로CT 스캔. 축척 막대: 400 마이크로미터. (B) 상이한 각도에서 관찰한 안지오칩의 내부 네트워크의 마이크로CT. 스캐폴드를 그의 내부 네트워크를 통해 황산바륨 용액으로 관류시켰고, 개선된 가시화를 위해 그의 밀도를 증가시켰다. 스캐폴드 네트워크 벽의 두께는 50μm였다. 유입구, 유출구, 및 1차 분지는 50μm x 200μm의 내부 내강 치수를 가졌다. 2차 분지는 50μm x 100μm의 내부 내강 치수를 가졌다. 1차 및 2차 분지 내의 내피 세포가 동일한 수준의 전단 응력을 거치도록 네트워크를 설계하였다. 각각의 층 상의 네트워크를 수직 채널을 통해 연결하고, z-축에서 300μm 떨어뜨렸다. 스캐폴드 메쉬는 50μm 버팀대로 제조하였다. 버팀대를 긴-에지 방향에서 250μm 떨어져서, 짧은-에지 방향에서 100μm 떨어져서, 그리고 z-축에서 50μm 떨어져서 이격시켰다.
도 51(g)는 POMac 중합체 용액의 분자 구조적 특징화를 제공한다. (A) 푸리에 변환 적외선 (FT IR) 분광분석법. (B) 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법.
특정 물질, 기술 및 치수가 상기 기재되어 있지만, 다른 적합한 물질, 기술 및 치수가 예시적인 장치에 사용될 수 있다. 장치는 예를 들어 상이한 분지 구성으로의 조직의 배양을 가능하게 하기 위해, 상이한 채널 및 층 구성으로 설계될 수 있다.
개시된 장치는 임의의 적합한 기술을 사용하여 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 장치는 중합체 물질, 예컨대 폴리(디메틸실록산) (PDMS) 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA) 물질을 사용하여 형성될 수 있다. 일부 예에서, 세포, 조직 및/또는 배양 배지와 접촉하게 될 것으로 예상되는 장치의 부분 (예를 들어, 생물반응기 채널 또는 챔버 및 스캐폴드)은 폴리(디메틸실록산) (PDMS)을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 물질로 제조될 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리(글리세롤 세바케이트), 시트르산 무함유 POMac, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 다양한 폴리우레탄 뿐만 아니라 그의 공중합체, 실크, 마이크로구조화, 나노제작 물질, 및/또는 나노구조물, 예컨대 특히 나노로드 또는 양자점으로 도핑된 물질을 포함할 수 있다.
개시된 장치는 특히 시험관내 약물 시험, 동물 또는 인간 환자에서의 직접 문합술, 또는 동물 또는 인간 환자에의 이식을 비롯한 다양한 적용분야에 유용할 수 있다. 개시된 장치는 또한 마이크로제작 칩의 형태로 제공될 수 있다.
본 개시내용은 또한 개시된 장치를 사용하여 조직을 배양하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법을 하기에 추가로 논의한다. 방법은 시드 세포를 장치 내의 생물반응기 채널 또는 생물반응기 챔버 내로 도입하는 것 (예를 들어, 시드 세포가 포매된 겔을 도입하는 것)을 포함할 수 있다. 이어서 시드 세포를 생물반응기 채널 또는 생물반응기 챔버 내에서 배양할 수 있다. 배양 동안, 특정한 시점에 특정한 자극 주파수를 규정한 규정된 요법에 따라 세포에 전기 자극을 제공할 수 있다.
개시된 장치 및 방법은 근육 세포 (예를 들어, 심근세포, 골격근 세포 또는 평활근 세포), 흥분성 세포 (예를 들어, 뉴런) 또는 혈관계를 요구하는 세포 (예를 들어, 간세포)를 비롯하여 인간 또는 동물 조직의 배양에 사용될 수 있다. 다른 세포가 또함 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 특히 상피 세포, 내피 세포, 평활근 세포, 및 다양한 유형의 줄기 세포, 예컨대 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 제대혈 유래 줄기 세포, 및 이들 세포 유형의 분화된 자손이 또한 배양될 수 있다.
개시된 장치의 보다 큰 인식 및 이해를 가능하게 하기 위해, 예시적인 장치를 사용한 조직 배양의 예를 하기 기재한다. 개시된 장치의 예를 사용하여 생성된 조직을 조사하기 위해 예시적인 연구를 또한 수행하였다. 이들 예시적인 연구는 다른 적용분야 중에서도, 시험관내 약물 시험을 비롯한 다양한 적용분야에 적합할 수 있는 생물학적으로 관련된 조직의 생성, 여러 상이한 구획을 갖는 인간-온-어-칩의 구축, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 환자에의 직접 문합술 및 이식을 위한 개시된 장치의 용도를 검증하는데 도움이 될 수 있다.
B. 안지오칩: 기관-온-어-칩 공학 및 직접 외과적 문합술을 위한 내장된 혈관계를 갖는 생분해성 스캐폴드
신규한 3-D 스탬핑 기술을 사용하여, 본 실시예는 합성 생분해성 엘라스토머 (폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트 - POMac)로 제조된 안지오칩 스캐폴드를 교시한다. 안지오칩은 상이한 유형의 실질 세포의 어셈블리를 지지하는, 가변가능한 기계적 특성을 갖는, 내피 세포로 코팅되고 격자 매트릭스 내에 포매된 내부 3-D, 관류가능한, 분지화된 마이크로-채널 네트워크를 함유한다. 가변성은 가교 에너지의 양 및/또는 중합체 반응 동안 상이한 중합체 유닛의 비를 조정하는 것에 의해 적어도 달성될 수 있다. 예를 들어, POMac의 경우에, 보다 강성인 특성을 갖는 보다 소수성인 중합체를 제조하기 위해, 시트르산의 양을 감소시킬 수 있다. 설계는 본 발명자들로 하여금 조작된 혈관망을 위한 물질 선택을 실질에의 세포 시딩을 위한 물질 선택과 효과적으로 탈커플링되게 하였고, 이는 개방 채널을 유지하면서 광범위한 재형성을 가능하게 하였다. 혈관 벽 내 나노-세공 및 마이크로-홀의 합체는 혈관 투과성을 증진시키고, 세포간 크로스토크 및 모델 염증 세포의 혈관외유출을 허용하였다. 안지오칩을 사용하여 조작된 혈관화된 간 조직 및 심장 조직은 그의 내부 혈관계를 통해 전달된 임상 관련 약물을 가공하는 것으로 제시되었다. 안지오칩 심장 조직은 또한 래트 뒷다리의 대퇴 혈관에 직접 외과적 문합술을 통해 이식되었고, 즉시 혈액 관류를 확립하였다.
서론
멀티-세포 계면 온-어-칩의 성공적인 공학은 주로 닫힌 2-D 마이크로유체 플랫폼의 상이한 기관 (예를 들어, 폐, 장)의 혈관 계면에 초점을 맞춰왔다. 그러나, 실질 기관 (예를 들어 심근, 간)을 위해 조직-수준 조직화 구조의 형성은 3-D 환경을 수반한다. 예를 들어, 심장 근육의 육안 수축 및 생리학적 성숙은 신장된 세포를 포함하는 정렬된 조직 다발의 형성에 의존한다. 간 조직은 간세포의 3-D 응집을 필요로 한다. 실질 세포로 구성된 현재의 3-D 마이크로-조직은 혈관계의 부재 하에 연구되고 있는 한편, 혈관계-온-어-칩은 주로 실질 세포와 개별적으로 연구되고 있다. 따라서, 3-D 기능적 조직 환경 내에 본질적인 혈관 계면을 합체시키는 것은 높은-충실도의 기관-온-어-칩 모델을 향한 중요한 단계이다.
유사한 혈관화 도전을 마크로-스케일로 거친 바 있다. 수많은 조직 유형이 시험관내에서 성공적으로 조작되었지만, 임상 변환은 얇은 조직 또는 낮은 대사 요구량을 갖는 조직 (예를 들어 피부, 연골 및 방광)에 대해서만 달성되었다. 큰 고형 조직 (예를 들어 심근, 간)은 산소 수준에 매우 감수성이고, 산소 공급 없이는 수시간 내에 취약해지게 된다. 이들 고형 조직은 시험관내 신속한 혈관화 및 생체내 직접 혈관 통합으로부터 큰 이익을 얻을 것이다. 지금까지, 혈관화된 조직의 외과적 문합술은 혈관상을 채취하기 위해 다중 수술을 필요로 하는 혈관 외식편을 사용해서만 입증되었다.
혈관망은 히드로겔 내에 희생 탄수화물-유리 격자, 플루로닉(Pluronic) F127, 건조 알기네이트 섬유, 또는 젤라틴을 포매시키는 것에 의하는 감형 제작에 의해 조작될 수 있다. 그러나, 소프트 히드로겔은 취약한 중공 네트워크를 위한 일시적인 구조 지지체만을 제공하고 광범위한 조직 재형성을 허용하지 않으며, 이는 히드로겔 구조를 필연적으로 변경시키고 포매된 네트워크를 붕괴시킨다. 합성 생분해성 중합체는 조작된 혈관에 대해 충분한 구조 지지체를 제공할 수 있지만, 그의 낮은 투과성은 혈관과 실질 공간 사이의 생체분자 교환 및 세포 이동을 막는다. 또한, 현행 제작 기술은 시딩된 실질 세포가 3-D 내에서 상호연결된 조직을 형성하는 것을 막는 물리적 장벽을 갖는 적층 채널 네트워크를 생성할 수 있을 뿐이다.
이들 2개의 대향 물질 기준을 수용하기 위해, 여기서 본 발명자들의 신규한 3-D 스탬핑 기술에 의해 실현되는 2개의 고유한 특색을 함유하는 내장된 분지화 마이크로-채널 네트워크를 갖는 안지오칩, 안정한 생분해성 스캐폴드를 제공한다. 먼저, 합성 내장된 혈관 벽은 얇고 유연하지만 수축 조직 내에서 관류가능한 혈관계를 기계적으로 지지하는데 충분히 강력하고, 직접 외과적 문합술을 가능하게 할 수 있다. 두번째로, 효율적인 분자 교환 및 세포 이동을 가능하게 하기 위해, 나노-세공 및 마이크로-홀을 혈관 벽에 합체시켯다. 안지오칩 내에 안정한 투과성 혈관망을 확립시킴으로써 물질 제약이 제한되었고, 이는 광범위한 조직 재형성을 허용하는 실질 공간 내에 세포로 포매된 임의의 소프트 천연 세포외 매트릭스 (예를 들어 콜라겐, 매트리겔)를 사용하는 것을 가능하게 하였다. 재형성된 조직을 구조적으로 강화시키기 위해, 안지오칩 실질 공간 구조는 또한 본래의 조직 (예를 들어, 심근)의 이방성 기계적 특성을 모방하도록 미세-조정될 수 있고, 이는 달리 균질한 히드로겔을 사용하여 달성하기는 어려울 것이다. 이러한 방법론에 기초하여, 마이크로-스케일 기관-온-어-칩 모델 및 조직 대체 둘 다를 위한 기능적 및 혈관화된 심장 및 간 조직을 생성하였다.
결과
생분해성 엘라스토머, 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC) (도 51a)를 사용하여 신규한 3-D 스탬핑 기술에 의해 안지오칩 스캐폴드를 구축하였다. POMaC는 온화한 조건 하에 신속한 어셈블리를 가능하게 하는 UV-중합성이고, 가수분해에 의해 분해되고, 비-독성 단량체 (시트르산, 말레산 무수물, 1,8-옥탄디올)로부터 합성된다 (도 51a). 3-D 스탬핑에 의해, 얇은 POMaC 시트를 스케일화 가능한 방식으로 UV 조명 하에 사전-패턴화하고 (도 51b), 서로 층-층 스탬핑하여, 수마이크로미터 미만의 정확한 정렬을 갖는 복합 현수된 구조물 및 내부 공동을 형성하였다. POMaC는 PDMS의 표면 상에서의 유리 라디칼 중합의 산소-유도된 억제로 인해 광-가교 후 유리 (강함) 및 폴리디메틸실록산 (PDMS) (약함)에 대해 비-영구적 및 차등 접착을 나타내었고, 이는 비-중합된 POMaC 층을 계면에서 이탈시켰다. 이러한 특징을 사용하여, 패턴화된 POMaC 시트를 강건하게 전사시키고, 정렬하고, 하나의 기판 (PDMS)으로부터 이형시킨 다음, 유리 기판에 의해 지지되는 POMaC 구조에 결합시켰다 (도 51b). 이러한 방법은 통상적인 3-D 인쇄에서와 같은 공중에서 생체적합물질을 인쇄하는 도전과제를 우회하였고, 희생 물질의 사용을 회피시켰다. 3-D 스탬핑은 1-D 튜브 (도 56e)에서부터 실질 세포를 지지하기 위해 맞추어진 격자 매트릭스 내의 혈관상을 모방한 2-D 분기 도관 (도 56f) 또는 3-D 분지화 네트워크 (도 56g)까지 다양한 복잡한 구조로의 POMaC의 패턴화를 가능하게 하였다 (도 f, g, h 및 도 51b).
상호연결된 내부 네트워크는 x-y 뿐만 아니라 y-z 평면으로 분지화되었고, 단일 유입구 및 유출구를 통해 관류가능하였다 (도 56h, 51f). 네트워크 내의 최소 마이크로-채널은 100μm x 50μm이고, 25-50μm의 벽 두께를 갖는다. 채널 벽을 가로지른 생체분자의 교환 및 세포 이동을 개선시키기 위해, 10μm 마이크로-홀을 상부 채널 벽에 패턴화하였다 (도 56i, 도 51e). 산소 및 영양소 교환을 추가로 증진시키기 위해, 포매에 이어 포로겐 침출에 의해 (이는 질량 감소에 의해 확인되고 (도 56j) 기재된 바와 같은 주름형 나노-세공을 생성함 (도 56k)) 나노-세공을 벌크 POMaC 중합체 물질에 합체시켰다.
관류 배양을 위해, 안지오칩 스캐폴드를 맞춤화된 생물반응기의 유입구와 유출구 웰 사이의 메인 웰에 설치하였다 (도 56c). 배양 배지 또는 내피 세포 (EC) 현탁액을 유입구와 유출구 웰 사이의 액체 압력 수두 차이에 의해 구동되는 내부 네트워크를 통해 관류시켰다 (도 56c, 도 52, 도 62). 이러한 설계는 거대 외부 펌프에 대한 필요를 없앴고; 이에 간단한 도구 (예를 들어, 마이크로피펫)를 사용하여 조직 실질 공간 및 내부 혈관계 둘 다에의 접근을 허용하는 개방 구성을 보존하고, 손쉬운 조직 제거를 가능하게 하였다 (도 56b). EC는 내부 네트워크 내에서 배양하였고, 실질 세포는 조직 재형성을 가능하게 하는 본래의 세포외 매트릭스 (ECM)를 갖는 격자 매트릭스 내에서 배양하였다 (도 56d).
안지오칩 스캐폴드는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 수개월에 걸쳐 서서히 분해되어 알칼리성 조건 (0.1M NaOH) 하에 4일 내에 완료되었다 (도 57a, b). 안지오칩 파열 압력은 래트 대퇴 정맥의 그것과 대등하였고 (도 57c), 래트 (130mmHg) 또는 인간 (120mmHg)에서의 정상 수축기 혈압보다 거의 7배 더 컸고, 이는 네트워크가 말초 순환에서 혈액 관류를 견디는데 충분할 것임을 나타낸다.
실질 세포를 지지하도록 의도되는 스캐폴드 격자는 수직 포스트 (50μm 직경)에 의해 연결된 메쉬의 다중 층으로 구성되었다. 이러한 고유한 특색은 다른 제작 방법 (예를 들어, 레이저 마이크로절제)에 의해서는 달성될 수 없고, 격자 내에 100% 상호연결성을 제공하여, 두꺼운 구축물 내 세포 시딩을 용이하게 하고 실질 세포가 x-y 및 y-z 평면 둘 다로 상호연결된 조직을 형성하게 한다. 격자의 기하구조 및 밀도는 설계 B에서와 같이 성체 래트 심실 심근의 이방성 강성과 유사하도록 스캐폴드 기계적 특성을 미세-조정하기 위해 3가지 상이한 설계에서 달라진다 (도 57d-f, 도 64, 도 65, 도 62). 이방성은 메쉬의 직사각형 형상에 의해 짧은-에지 방향 (SD)보다 긴-에지 방향 (LD)으로 더 높은 버팀대의 공간 밀도를 사용하여 가능해졌다 (도 57g). 유효 강성 (E) 및 극한 인장 강도 (UTS) 둘 다는 격자 밀도 증가와 함께 증가되었다. 추가의 설계 반복은 특정 적용분야 (예를 들어 인간 심근 또는 인간 간)에 맞추어진 기계적 특성을 갖는 스캐폴드를 생성할 수 있다.
합성 중합체의 제한된 투과성은 다른 생분해성 마이크로유체 스캐폴드의 성공을 제한한다. 10μm 마이크로-홀을 갖는 세포-무함유 안지오칩 스캐폴드 네트워크는 마이크로-홀이 없는 것보다 (각각 투과성 (2.0±0.2)x10-6cm s-1 및 투과성 (0.9±0.03)x10-6cm s-1, n=3) 소분자에 대해 투과성이 2배 더 컸고 (332Da FITC, 투과성 (4.4±0.1)x10-6cm s-1 n=3, 도 57h), 대분자에 대해 투과성이 4배 더 큰 (70kDa TRITC-덱스트란, 투과성 (3.7±1.5)x10-6cm s-1, n=3) 것으로 관찰되었다. 둘 다의 경우에, 스캐폴드 네트워크의 투과성은 70 kDa FITC-덱스트란에 대한 생체내 포유동물 세정맥의 투과성 ((0.15±0.05)x10-6cm s-1)보다 더 컸다. 세포-무함유 네트워크의 높은 투과성은 EC가 생체내에서 혈관의 투과성을 통제하는 방법과 유사한, 마이크로유체 혈관의 최종 투과성을 결정하는데 있어서 EC 코팅이 지배 인자이게 하였다. 실질 공간 내 확산된 생체분자의 분포 및 대사 전환을 확인하기 위해, 살이있는 세포 추적 염료, 카르복시플루오레세인 디아세테이트 (CFDA, 557 Da)를 심장 세포에 의해 둘러싸인 스캐폴드 네트워크를 통해 관류시켰고, 이는 밀집 조직 내에서의 대사 전환 및 분자 분산과 일치하게 실질 내에서 살아있는 세포를 염색하였다 (도 57i).
인간 제대 정맥 EC (HUVEC)와의 내피화 시, CD31 면역-염색은 세포-세포 연접에서 발현된 VE-카드헤린을 포함하는 (도 66) 내장된 네트워크의 내강 표면 상에서의 융합성 내피를 밝혀내었다 (제2일, 도 58a-d). EC는 혈관 벽 상의 마이크로-홀을 물리적으로 피복하여 (도 58e, f; 도 66), 3-D 네트워크의 분지점에서도 혈관 벽을 입체조형적 및 융합적으로 코팅하였다. 혈액 상용성을 평가하기 위해, 인간 전혈을 EC 코팅의 존재 또는 부재 하에 안지오칩 네트워크를 통해 15dynes/cm2 (~5μL/분; Re, 0.023)로 관류시켰다 (도 58g). 1차 및 2차 분지 내의 Ec가 동일한 전단 응력을 거치도록 안지오칩 네트워크를 설계하였다. EC 코팅의 부재 하에, 유의하게 더 많은 혈소판이 네트워크 표면에 결합하였고 (도 58j 도 67) 그의 확장된 위족 형태에 의해 나타내어지는 바와 같이 활성화되었다 (도 58h, i). 부착된 혈소판은 혈류 패턴에 따라 퍼지는 추세를 나타내었고, 분지 및 턴의 정체 영역에서 더 많이 축적되었다 (도 38h; 도 67). 관류된 Raw264.7 대식세포는 분지점에서 일부 축적 및 접착 (도 58k, l), 내피화된 표면을 따른 이동 (도 58m) 및 혈관 벽 상의 마이크로-홀을 통한 실질 공간으로의 횡단-이동 (도 58n)을 나타내었다. 내장된 혈관계와 실질 공간 사이의 이러한 혈관외유출은 안지오칩 스캐폴드의 특유한 특색이고, 스캐폴드 분해와 관계없이 제1일에 관찰되었다.
3D 혈관화된 간 조직을 생성하기 위해, 10% 래트 원발성 섬유모세포 (ECM 재형성 및 겔 압착을 용이하게 하기 위함)와 혼합한 원발성 래트 간세포를 내피화된 안지오칩 스캐폴드의 실질 공간 내에 시딩하여, 네트워크 주변에 생존 세포의 응집을 발생시켰다 (도 59a-d). 조직학 단면은 격자 도처 및 혈관망 주변에 분포된 간세포 (알부민 염색됨)를 예시하였고, EC (CD31 염색됨)는 네트워크의 내부 내강을 코팅하였다 (도 59e-g). 유출구 웰에서의 우레아 분비는 내피화된 안지오칩 조직에서 유지되었지만 내피화의 부재 하에서는 시간의 경과에 따라 저하되었고 (도 58h, i), EC로부터의 지속적인 주변분비 신호전달은 기재된 바와 같이 간세포의 건강을 유지시키는 것으로 나타났다. 메인 웰과 비교하여 유출구 웰에서의 보다 높은 우레아 농도는 내장된 혈관계로의 분비를 지시하는 간세포의 분극을 시사할 수 있다. 간 조직을 심장-독성으로 인해 시장으로부터 철회된 항히스타민제인 테르페나딘으로 챌린지하였다 (도 59h). 테르페나딘은 일반적으로 간에서 효소 시토크롬 P450 CYP3A4 이소형에 의해 비-심장-독성 펙소페나딘으로 대사된다. 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)은 유출구 웰에서 펙소페나딘의 존재를 밝혀내었고, 이는 관류된 약물이 내장된 혈관계로부터 간 조직으로 전달되고, 대사된 다음, 혈관계로 다시 방출되었음을 나타낸다 (도 59j).
5일 내에 축합된 조직을 형성하는 혈관망 주변에 압착된 신생아 래트 또는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 유래 심근세포로부터 심장 조직을 생성하였다 (도 60a, b). 동시적 육안 수축이 제4일의 조기에 관찰되었고, 인간 및 래트 조직 둘 다의 전기 흥분성 파라미터는 표준 범위에 속하였다 (도 60c, d). 수축 조직은 시간의 경과에 따라 증가되는 각각의 박동 및 수축 진폭에서 스캐폴드를 압축시켰고, 이는 조직이 성숙함에 따라 수축력이 증가함을 나타낸다 (도 60e). 내장된 기계적으로 안정한 혈관계는 심장 조직이 관류시키면서 자발적으로 수축되게 하였다 (도 60j). 수축 단백질 근절-α-액티닌 및 구조 단백질 F-액틴은 신장된 세포에서 가시화되었다 (도 60f-i). 제7일의 조직한 단면은 EC가 혈관 내강을 코팅하였고, 심지어 1mm-두께 멀티-층 안지오칩 스캐폴드 (도 60n)에서도 심근세포가 격자 도처에 분포되고 혈관 주변에 밀집해서 패킹되어 있음을 보여주었다 (도 60k-m). 인간 심장 조직 (31±6% 심근세포, n=9, 도 68)은 전도 차단 없이 전체 조직을 가로지르는 Ca2+ 파의 전파를 보여주었다 (3.5±2.6cm s-1, n=5) (도 60o). 전도 속도는 조직 어셈블리 전에 심근세포 집단을 풍부하게 하고 전기기계적 자극을 적용하는 것에 의해 추가로 개선될 수 있다. 에피네프린 (10μM) 및 디곡신 (10μM)을 내장된 혈관계를 통해 관류시켜 심장 조직을 자극하였다. 30분 내에, 조직은 에피네프린에 대해 예상되는 양의 심박수변동 반응 (도 60p) 및 디곡신에 대해 음의 심박수변동 반응 (도 60q)을 나타내었다. 유동의 중요성을 평가하기 위해, 래트 심장 조직을 배지 관류의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 생존율은 제7일에 괴사 코어를 발생시키는 비-관류 조직과 비교하여 관류 조직 내에서 더 높았다 (도 60r). 대부분의 세포 사멸 (즉, 락테이트 데히드로게나제 방출)은 처음 3일 내에 발생하였고, 배지 관류는 제2일 및 제3일에 세포 사멸의 완화를 돕는다 (도 60s).
안지오칩 스캐폴드는 래트 심장 조직의, 성체 루이스 래트의 뒷다리의 대퇴 혈관에의 직접 문합술을 가능하게 하였다 (도 61). 유사한 시트르산 기반 중합체는 혈관 이식편에서 항혈전성이고 생체내 EC 성장을 지지하는 것으로 나타났다. 이러한 개념 증명 연구를 위해, 최악의-경우 시나리오를 조사하였다: 동물은 수술 동안 단지 헤파린첨가만 되었고 EC는 사용하지 않았다. 안지오칩 조직의 유입구 및 유출구 (내부 치수 100μm x 200μm 및 외부 치수 200μm x 300μm)를 2개의 구성으로 연결시켰다: 동맥-대-동맥 이식편 (도 61a) 또는 동맥-대-정맥 이식편 (도 61b). 둘 다의 구성에서, 내장된 네트워크를 통한 혈액 관류가 수술 후 즉시 확립되었다. 혈액 맥동이 또한 관찰되었고, 동맥-대-동맥 구성에서 더 두드러지게 관찰되었다. 생체내에서 1주 후에, 어떠한 조직학적 거부 징후도 관찰되지 않았고, 세포는 안지오칩을 밀집해서 감쌌다 (도 61c-n; 도 69-73). 적혈구는 직접 문합술에 의해 이식된 조직 네트워크에서만 관찰되었다 (도 61i, j, o). 이식물 주변의 혈관의 존재로부터 관찰되는 바와 같이 본래의 혈관신생이 또한 발생하였다 (도 61f, l). 심근세포의 존재는 트로포닌 T 면역-염색에 의해 확인되었고, 이는 안지오칩의 격자 내에 얽혀 있는 신장된 심근세포를 보여주었다 (도 61h, n). 평활근 액틴 (SMA) 양성 세포의 존재는 단리된 신생아 래트 심장 세포에서 단지 2%였고; 유의한 SMA 염색 (도 61g, m)은 치유 반응과 일치하는 벽 세포 또는 근섬유모세포의 이식된 조직으로의 침투를 시사하였다. 숙주 재형성에 중요한 광범위 세포 침윤은 안지오칩 실질-공간의 개방 다공성 구조를 신뢰하게 한다. 직접 문합술에 의한 이식물은 대조군보다 유의하게 더 높은 세포 침윤을 나타내었고, 이는 보다 큰 정도의 조직 재형성이 유도되었음을 시사한다 (도 61p).
논의
안지오칩 스캐폴드 설계에서, 본 발명자들은 조작된 혈관망을 위한 물질 선택을 실질-공간에 대한 물질 선택으로부터 효율적으로 탈커플링시켰고, 이는 본 발명자들로 하여금 혈관계의 초기 아키텍처를 제어하게 하고 시험관내 및 생체내 즉시 관류가 확립되게 하는 한편, 실질 세포의 생리학상 재형성을 지속시켰다. 이러한 마이크로-공학 접근법은 안지오칩 스캐폴드가 실질 세포의 어셈블리 전 하루 내에 완전히 내피화되는 내장된 관류가능한 혈관망을 갖기 때문에, 조직 혈관화에 어떠한 지연도 제공하지 않았다. 신규한 3-D 스탬핑 기술은 본 발명자들로 하여금 10μm 홀을 갖는 25μm만큼 얇은 중합체 시트를 취급가능하게 하여 단지 2-3 세포 두께의 혈관 벽이 생성되게 하였고, 이에 따라 EC와 실질 공간 사이에서, 매우 짧은 거리 (~10 세포) 내에서 통상적으로 유의하게 붕괴되는 주변분비 신호전달을 지속시켰다. 나노-세공 및 마이크로-홀과 조합된 얇은 채널 벽은 이전에는 단지 히드로겔 시스템에 의해서만 달성가능했던 효과적인 분자 교환을 가능하게 하는 주요 특색이다. 이러한 설계는 혈관화된 3-D 조직 모델에서, 대류-확산에 의한 시험 약물의 전달을 위한 생리학적으로 관련된 모드로 세포 혈관외유출을 가능하게 하였다. 상이한 기관 내 고유한 환경과 매칭시키기 위해 혈관 투과성을 추가로 미세-조정하기 위해서는, 기관 특이적 EC를 사용해야 한다.
안지오칩 플랫폼은 다중 안지오칩을 연속해서 연결하여 기관-수준 상호작용을 재현시킴으로써, 단일 장치 상에 상이한 조직의 용이한 통합 (예를 들어, 간 및 심장)을 가능하게 하였다 (도 74). 통상적인 마이크로유체는 통합을 어렵게 하는 거대 외부 설정을 필요로 한다. 통상적인 칩의 닫힌 구성은 마이크로-피펫팅에 의한 액체 분배를 위해 개방 웰에 매우 의존하는 생물학적 실험실 및 제약 산업에서의 현행 실시와 호환되지 않는다. 표준 다중웰 플레이트와 유사한 본 발명자들의 플랫폼은 개방 구성을 유지하여, 실질 공간 및 내부 혈관계 둘 다는 간단한 피펫팅에 의해 용이하게 접근될 수 있고, 각각의 조직 유형에 대해 각각의 구획 내에서 상이한 배지가 사용되게 하여 공동-배양 조건을 최적화 할 필요를 없앤다.
마크로-스케일 조직 대체로서, 안지오칩 스캐폴드 제조 방법은 스케일화 가능하고, 보다 큰 기관 제작으로의 이동을 위해 자동화될 수 있다. 이것은 외과적 문합술을 위한 충분한 기계적 안정성 및 동시에 개선된 혈관 투과성을 나타내는 최초로 조작된 혈관망이다. 실질 공간 내 직사각형 (이방성을 위해) 또는 정사각형 (등방성을 위해) 격자를 사용하여 조직 강성을 미세-조정하는 것이 또한 가능하며, 이는 히드로겔에 의해서는 달성하기 어렵다. 안지오칩 스캐폴드는 또한 현존 방법을 사용하여 헤파린을 공유적으로 고정시키는 것에 의해 화학적으로 변형되어 혈전형성을 감소시킬 수 있다. 적절한 스캐폴드 분해 속도는 벽 세포가 효과적으로 동원된 후 숙주 재형성을 위해 중요하다. 따라서 생체내에서의 안지오칩의 장기간 분해는 이후에 조사되어야 하고, 중합체-쇄 상의 시트르산 함량을 조정하여 본래의 벽 세포 및 ECM이 합성 중합체 혈관 벽의 역할을 서서히 대체할 수 있게 하는 것에 의해, 특정 적용분야를 위해 미세-조정되어야 한다.
요약하면, 안지오칩은 규정된 혈관계를 갖는 둘 다의 시험관내 심장 및 간 조직 모델 및 직접 외과적 문합술에 의한 생체내 이식물을 생성하는데 사용되었다. 고유하게, 이러한 플랫폼은 시험관내 시험 결과의 생체내 검증으로의 직접적이고 신속한 변환 및 효과적인 재생 전략의 개발을 가능하게 할 수 있었다.
방법
POMaC 합성. 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC) 예비중합체를 제조하기 위해, 1,8-옥탄디올, 시트르산, 및 말레산 무수물을 5:1:4 몰비로 혼합하고, 질소 퍼지 하에 160℃에서 용융시켰다. 혼합 후에 온도를 140℃로 강하시키고, 혼합물을 2-3시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 예비중합체 용액을 1,6디옥산 중에 용해시키고, 다이렉트-큐(Direct-Q) 5 물 정제 시스템 (밀리포어, 매사추세츠주 빌러리카)으로부터 생산된 탈이온 증류수 중에의 적가 침전을 통해 정제하였다. 침전된 중합체를 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 광-가교 전에, POMaC 예비중합체를 5% (w/w) UV 개시제 (이르가큐어 2959, 시그마)와 혼합하였다. 나노-세공 스캐폴드를 제조하기 위해, POMaC 중합체를 또한 60% (w/w)의 포로겐 폴리(에틸렌 글리콜) 디메틸 에테르 (PEGDM, Mw~500, 시그마)와 혼합하였다 (도 51a). 무공성 스캐폴드는 PEGDM을 첨가하지 않고 제조하였다.
핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법 및 푸리에 변환 적외선 분광분석법 (FT IR). 1H에 대해 699.806 MHz에서 작동하는 애질런트(Agilent) DD2 분광계 (애질런트, 캘리포니아주 월넛 크릭) 상에서 25℃에서 1D 1H CPMGT2 스펙트럼을 획득하였다. 분광계에는 5 mm HFCN 콜드 프로브(Cold Probe)가 부착되었다. 스펙트럼은 11160.7 Hz 스펙트럼 윈도우에 걸쳐 200 ms CPMGT2 필터를 사용하여 100446 지점, 10s 재순환 지연, 2 정상 상태 스캔, 및 16 과도로 획득하였다. MNova 소프트웨어 (v. 9.0.0, 스페인 산티아고 데 콤포스텔라)를 사용하여 NMR 프로세싱을 수행하였다. 간략하게, 스펙트럼을 푸리에 변환시키고, 위상화하고, 기준선 보정한 후에 분석하였다. 전송 스펙트럼은 신속 회수 중수소화 트리글리신 술페이트 검출기를 포함하는 스펙트럼 원(Spectrum One) FTIR 분광계에 커플링된 ATR 상부-플레이트 부속품 (퍼킨엘머, 인크. 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 수득하였다. 스펙트럼을 4000 및 650 cm-1 사이의 영역에서 기록하였다.
안지오칩 제작. 각각의 층의 안지오칩 스캐폴드를 먼저 오토캐드에서 생성하고, 이전에 기재된 바와 같이 표준 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 개개의 SU-8 마스터에 변환시켰다. 실리콘 엘라스토머 (폴리(디메틸실록산), PDMS)를 SU-8 마스터에 대해 몰딩시키고, 실온에서 2일 동안 경화시켰다 (도 51b). 베이스 층 및 3-D 스캐폴드의 상부 층을 위한 패턴화된 PDMS 몰드를 유리 슬라이드 및 편평 PDMS 시트에 각각 캡핑시켰다. 이어서 POMaC 용액을 유입구 및 유출구를 통해 패턴화된 네트워크 내로 주입하고, 밤새 실온에 두었다. 주입은 POMaC 용액 방울을 유입구 홀 상부에 적용하여 완만한 양압을 적용함으로써 달성하였다. 밤새, POMaC 용액은 메인 메쉬 네트워크로부터 연장된 수직 칼럼을 비롯한 전체 PDMS 몰딩을 채웠다. PDMS가 다공성이고 공기 누출을 가능하게 하기 때문에, 유입구에서의 완만한 양압은 몰드 내부의 임의의 포획 공기를 밀어내었다. 다음으로, 포로겐과 혼합된 중합체, 60% (w/w) PEGDM/ POMaC 용액의 경우에는 주입된 POMaC 용액을 10 mJ/cm2s 강도의 UV 광 하에서 4분 동안, 또는 PEGDM이 전혀 첨가되지 않은 경우에는 10분 동안 가교시켰다. 그 후, PDMS 몰드를 탈캡핑시키고, 패턴화된 중합체 구조를 노출시켰다. 제1 층을 위한 패턴화된 POMaC 시트를 유리 슬라이드 상에 부착하고, 다음 층을 위한 패턴화된 POMaC 시트는 PDMS 몰드 상에 부착하였다. 이어서 PDMS 몰드 상의 노출된 POMaC 시트를 맞춤화된 UV 마스크 정렬기 (Q2001, 퀸텔 코포레이션, 캘리포니아주)를 사용하여 유리 슬라이드 상의 패턴화된 POMaC 시트에 대해 정렬시키고 눌렀다. 층을 함께 결합시키기 위해, 이어서 샘플을 UV에 10 mJ/cm2s 강도로 4분 또는 PEGDM이 전혀 첨가되지 않은 경우에는 10분 동안 노출시켰다. UV 노출 후에, 이어서 PDMS 몰드를 이형시켜, 함께 결합되고 유리 슬라이드에 부착된 2개의 패턴화된 POMaC 시트를 남겼다. 이러한 공정을 반복하여 추가의 패턴화된 POMaC 시트를 확립된 베이스 구조에 결합시켰다. 마지막으로, 제작된 스캐폴드를 PBS 중에 침지시켜 이를 유리 슬라이드로부터 이형시키고, 실온에서 밤새 인큐베이션하여 PEGDM 포로겐을 침출시켰다. 다중 스캐폴드는 단일 공정에서 단일 유리 슬라이드 상에 평행으로 패턴화되었다 (도 56a).
스캐닝 전자 현미경검사. 안지오칩의 구조를 예시하기 위해, 안지오칩 스캐폴드를 포로겐 침출 전에 히타치 SEM S-3400을 사용하여 영상화하였다. 스캐폴드를 횡으로 절단하여 단면을 노출시켰다. 스캐폴드의 나노-세공을 영상화하기 위해, PBS 중에서의 포로겐 침출 후에, 스캐폴드를 먼저 에탄올 중에서 탈수시킨 다음, 초임계점 건조에 의해 제조하여 영상화 전 나노-세공 구조의 붕괴를 방지하였다.
마이크로CT. 안지오칩 스캐폴드의 내부 아키텍처를 가시화하기 위해, μCT40 (스캔코 메디칼(Scanco medical))을 사용하여 폴리스티렌 슬라이드 상에 고정시킨 스캐폴드를 스캔하였다. 프로그램 μCT 레이 V40을 사용하여 획득된 영상에 대해 역치를 적용하여, 배경을 제거하고 스캐폴드를 3-D로 재구축하였다. 스캐폴드의 내부 내장된 네트워크를 가시화하기 위해, 네트워크를 PBS 중 2% (w/v) 젤라틴 (돼지 피부, 유형 A, 시그마)과 1:1 (v/v) 비로 혼합된 황산바륨 현탁액 (105% w/v, 폴리바 플러스(Polibar plus), 테라펙스(Therapex))으로 채웠다. 주입된 용액이 실온에서 겔화 되게 하고, μCT를 사용하여 영상화하였고, 여기서 역치를 획득된 영상에 적용하여 내장된 네트워크가 스캐폴드의 다른 구조에 대비하여 보이게 하였다.
스캐폴드 분해. 나노-다공성 스캐폴드 샘플을 제조하기 위해, 60% 포로겐 함량을 갖는 스캐폴드 (3mmx10 mmx200μm)를 먼저 4분 동안 10 mJ/cm2s 강도로 UV 가교시킨 다음, 증류수 중에서 세척하여 포로겐을 침출시켰다. 무공성 스캐폴드 샘플을 제조하기 위해, 0% 포로겐 함량을 갖는 스캐폴드 (3mmx10 mmx200μm)를 10분 동안 10 mJ/cm2s의 강도로 UV 가교시켰다. 스캐폴드의 분해 속도는 PBS (pH 7.4, 37℃) 중에서 또는 0.1 M NaOH 중에서 시간의 경과에 따라 스캐폴드 질량 손실을 추적함으로써 결정하였다. 각각의 인큐베이션 기간 후에, 샘플을 먼저 증류수로 완전히 세척한 다음 건조시켰다. 질량 손실은 초기 질량을 특정 시점에서 측정된 질량과 비교하여 계산하였다.
파열 압력. 안지오칩 스캐폴드의 파열 압력을 결정하기 위해, 스캐폴드의 유입구를 타이곤 배관을 사용하여 압력 게이지를 갖는 질소 탱크에 연결시키고, 스캐폴드의 유출구는 에폭시 글루로 밀봉시켰다. 스캐폴드 네트워크로부터 누출이 관찰될 때까지 압력을 서서히 증가시키고, 피크 압력을 파열 압력으로서 기록하였다. 유입구 또는 유출구에서 접합부로부터 누출이 처음 관찰되는 경우에, 기록을 폐기하였다.
기계적 시험. 안지오칩 스캐폴드의 기계적 특성을 PBS 중에서 근운동기록기 (켄트 사이언티픽)를 사용하여 안지오칩 스캐폴드의 원주방향 (긴 에지를 따라) 및 종축 방향 (짧은 에지를 따라)으로 측정하였다. 0에서 0.1의 변형으로부터의 단축 인장 응력-변형 곡선의 기울기를 사용하여 전체 안지오칩 스캐폴드의 유효 강성을 계산하였다 (도 64, 도 65). 변형-대-실패 값은 곡선을 따라 파단점에서의 변형으로부터 결정하였다. 성체 래트 심근의 기계적 강성을 토론토 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인된 절차에 따라 희생시킨 루이스 래트의 성체 심장으로부터 측정하였다. 성체 래트 심근을 심장의 원주방향 또는 종방향을 따라 너비 2-4 mm 및 두께 2-4 mm를 갖는 7 mm 길이 스트립으로 슬라이싱하였다. 심근의 단축 기계적 강성을 0에서 0.1의 변형으로부터의 인장 응력-변형 곡선의 기울기로부터 결정하였다. 이방성 비는 원주방향에서의 유효 강성을 종방향에서의 유효 강성으로 나누어 결정하였다. 3가지 상이한 스캐폴드 설계는 상이한 격자 구조를 가졌지만, 유입구, 유출구 및 1차 분지에 대해 웰 두께 50μm, 내부 내강 치수 50μm x 200μm, 및 2차 분지에 대해 내부 내강 치수 50μm x 100μm를 갖는 동일한 내장된 내트워크를 가졌다. 스캐폴드 격자는 50μm 버팀대로 제조하였다. 설계 A에서, 버팀대를 긴-에지 방향에서 250μm 떨어져서, 짧은-에지 방향에서 100μm 떨어져서, 그리고 z-축에서는 떨어진 공간 없이 이격시켰다. 설계 B에서, 버팀대를 긴-에지 방향에서 250μm 떨어져서, 짧은-에지 방향에서 100μm 떨어져서, 그리고 z-축에서 50μm 떨어져서 이격시켰다. 설계 C에서, 버팀대를 긴-에지 방향에서 550μm 떨어져서, 짧은-에지 방향에서 175μm 떨어져서, 그리고 z-축에서 50μm 떨어져서 이격시켰다.
투과성. 내장된 네트워크로부터 주변 수용액으로의 대분자 및 소분자의 투과성을 형광 염료: TRITC-덱스트란 (~70 kDa, 시그마) 및 FITC (~400Da, 시그마)를 각각 사용하여 측정하였다. TRITC-덱스트란 및 FITC 용액을 10 또는 100 μM의 유입구 농도로 20시간 동안 네트워크를 통해 0.7μL/분으로 관류시켰다. 20시간 후에, 중간 웰 내의 용액을 수집하고, 형광 분자의 농도를 형광-플레이트 판독기를 사용하여 결정된 표준 곡선과 상관시켰다. 전체 안지오칩 스캐폴드의 소분자 및 대분자에 대한 채널 투과성은, 네트워크 내부의 형광 분자의 평균 농도가 유입구에서의 농도와 동일하다는 가정 하에, 픽 법칙을 사용하여 순 확산 속도 (중간 챔버 내의 전체 축적 형광 분자/시간), 네트워크의 내강 표면적으로부터 결정하였다.
생물반응기 설계. 생물반응기는 안지오칩 스캐폴드의 유입구 및 유출구를 통한 유체 관류를 가능하게 하고, 뿐만 아니라 조직 어셈블리를 용이하게 하기 위해 맞춤화되었다. 생물반응기는 4개의 구성요소: 캡, 폴리카르보네이트 몸체, PDMS 베이스, 및 폴리카르보네이트 베이스로 구성되었다 (도 56c). 생물반응기는 개별 챔버 내에 3개의 스캐폴드를 한 번에 수용하도록 설계되었다. 폴리카르보네이트 몸체 (2.5 cm 두께)는 3개의 행으로 위치하는 9개의 웰을 포함하였고: 상부 행은 유입구 웰을 포괄하고, 중간 행은 메인 웰을 포괄하고, 여기에 안지오칩 스캐폴드가 위치하며, 하부 행은 유출구 웰을 포괄하였다. PDMS 슬래브 (1 mm 두께)는 3개의 트렌치 (700μm 깊이)를 포함하였고, 여기에 안지오칩 스캐폴드가 위치하였다. 트렌치의 바닥에서 마이크로-포스트 (200μm 높이)이 패턴화되어, 세포/겔이 스캐폴드 아래를 관통하고 전체 스캐폴드를 캡슐화할 수 있도록 안지오칩 스캐폴드를 베이스로부터 위로 들어 올렸다. 트렌치는 또한 개방 유입구 및 유출구 채널을 포함하였고, 안지오칩 스캐폴드의 유입구 및 유출구는 정확하게 피팅될 수 있었다. 안지오칩 스캐폴드를 위치시킨 후에, PDMS 베이스를 이어서, PDMS 베이스 상의 개방 유입구 및 유출구 채널이 그 안에 피팅된 안지오칩의 유입구 및 유출구로 캡핑되도록 폴리카르보네이트 베이스와 폴리카르보네이트 몸체 사이에 샌드위치시켰다. 3개의 구성요소는 스테인레스 스틸 스크류에 의해 고정되었다. 용액 및/또는 세포 현탁액은 안지오칩 스캐폴드의 내장된 네트워크를 통해 유입구 웰로부터 유출구 웰로 관류되고, 이는 유입구 및 유출구 웰 사이의 압력-수두 차이에 의해 구동되었다 (도 63). 생물반응기를 멸균 조건에서 해체하여 안지오칩을 이식 또는 분석을 위해 제거하였다.
내피 세포 배양. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 론자(Lonza)에서 구입하여 제조업체의 지침에 따라 내피 성장 배지 (EGM, 론자)로 배양하였다. 계대 3 HUVEC를 모든 실험에 사용하였다.
내피화 및 조직 어셈블리. 안지오칩 스캐폴드 상 뿐만 아니라 내부 네트워크 내부에의 세포 부착을 증진시키기 위해, 어셈블리 전에 스캐폴드를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 0.2% w/v 젤라틴 (돼지 피부로부터, 유형 A, 시그마)으로 2시간 동안 코팅시켰다. PDMS 베이스 상에의 세포 부착을 방지하기 위해, 어셈블리 전에 PDMS 베이스를 PBS 중 5% w/v 플루로닉 F-127 (시그마)로 2시간 동안 코팅시켰다. 안지오칩 스캐폴드를 생물반응기 내에 놓은 후에, 먼저 내피 세포 배지 중의 농축된 내피 세포 현탁액 20 μL (25 x106개 세포/mL)를 네트워크 내로 1분 동안 관류시켜 스캐폴드의 내장된 네트워크 내로 내피 세포를 시딩하였다. 이어서 유동을 정지시켜 세포가 정적 조건 하에 2시간 동안 부착되게 하였다. 비부착된 세포는 1 mL의 내피 세포 배지를 유입구 웰에 첨가하여 플러싱하고, 안지오칩 스캐폴드를 통해 0.7μL/분 (0.62 dynes/cm2, Re, 0.01) 미만의 유량 하에 관류를 개시하여 세포에게 충분한 배지를 공급하면서 세포에 대해 최소 응력을 가하였다. 네트워크 내에서, 내피 세포가 밤새 증식하고 융합성 네트워크를 형성하게 하였다. 제1일에, 간 조직을 생성하기 위해, 원발성 성체 래트 간세포를 안지오칩 스캐폴드 상에 15μL 매트리겔 (BD 바이오사이언시스)과 함께 100 x106개 세포/mL로 시딩하였다. 심장 조직을 생성하기 위해, 신생아 래트로부터 단리하거나 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터 유래된 심근세포를 15μL (단일 층 네트워크) 또는 40 μL (3중 층 네트워크) 콜라겐/매트리겔 혼합물과 함께 각각의 안지오칩 스캐폴드 상에 100 x106개 세포/mL로 시딩하였다. 콜라겐/매트리겔 혼합물의 조성은 다음과 같았다: 4.5 μg ml-1 글루코스, 1% HEPES, 10% (v/v) 매트리겔 (BD 바이오사이언시스), 및 2 μg ml-1 NaHCO3으로 보충된, 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 1 N NaOH 및 10x M199 배지에 의해 중화된 2.5 mg ml-1 래트 꼬리 콜라겐 유형 I (BD 바이오사이언시스). 37℃에서의 30분 겔화 후에, 심근세포 배지 또는 간세포 배지 1mL를 중간 웰에 첨가하였다. 실질 세포의 시딩 후에, 배지 관류 속도를 0.7μL/분 (0.62 dynes/cm2, Re, 0.01)으로 증가시키면서 유입구 웰에 추가의 내피 세포 배지 4 mL를 또한 첨가하였다.
전혈 관류. 인간 전혈을 토론토 대학 기관 가이드라인에 따라 승인된 연구 윤리 위원회 프로토콜 하에 3명의 공여자로부터 수집하였다. 전혈을 1% (v/v) 헤파린으로 처리하여 취급 동안의 응고를 방지하였다45. 전혈을 내피화된 스캐폴드 또는 비-내피화된 스캐폴드를 통해 15 dynes/cm2로 37℃에서 30분 동안 관류시켰다. 유입구 웰에 부착된 연장된 압력 칼럼을 갖는 변형된 생물반응기를 사용하여 높은 전단 응력 관류를 달성하였다 (도 63). 연장된 칼럼을 0.25 m의 높이까지 혈액으로 채워 안지오칩 스캐폴드 네트워크 내에 5μL/분 (15dynes/cm2 Re, 0.023)의 유량을 생성하였다. 혈액 관류가 단지 30분만 지속되었기 때문에 ~150μL의 혈액만이 관류되었고, 이는 30분의 기간에 걸쳐 칼럼의 높이 및 유량을 유의하게 변화시키지 않았다. 관류 후에 네트워크를 염수로 플러싱하고, PBS 중의 2% (v/v) 글루타르알데히드 중에서 4℃에서 48시간 동안 고정시켰다. 고정된 스캐폴드를 동결 절편화하여 네트워크의 내부 내강 표면을 드러내고, SEM으로 영상화하였다. 혈소판 면적은 어도비 포토샵(Adobe Photoshop)을 사용하여 각각의 세포 클러스터의 윤곽을 나타냄으로써 수동으로 정량화하였다. 분석은 맹검에 의해 수행하였다.
대식세포 부착 및 이동. Raw264.7 대식세포를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS, 깁코, 캐나다), 1% (v/v) HEPES (100 유닛/mL, 깁코, 캐나다) 및 페니실린-스트렙토마이신 (100 mg/mL, 깁코, 캐나다)과 함께 4.5 g/L 글루코스를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 깁코, 캐나다) 중에서 배양하였다. Raw264.7 대식세포를 계대 10에서 사용하였다. 실험 전에, 대식세포를 셀트랙커(CellTracker)α레드 CMPTX (몰레큘라 프로브스) 또는 셀트랙커α그린 (몰레큘라 프로브스)으로 표지하였다. 제2일에 내피화된 스캐폴드를 대식세포 현탁액으로 10 x106개 세포/mL로 37℃에서 1시간 동안 0.7μL/분 (0.62 dynes/cm2, Re, 0.01)의 유량으로 관류시켰다. 내피화된 채널 내강 표면 상에서의 대식세포 외측 이동을 1시간 관류 동안 포획하였다. 대식세포 부착 영상을 형광 현미경을 사용하여 1시간 관류의 말미에 포획하였다. 1시간 관류 후에, 스캐폴드를 다시 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후 스캐폴드를 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 올리푸스 FV5-PSU 공초점 현미경으로 영상화하여 10 μm 홀을 통한 대식세포 이동을 관찰하였다.
간세포 단리 및 배양. 원발성 래트 간세포를 8주령의 수컷 스프라그 돌리 래트로부터 토론토 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 변형된 2 단계 단리 절차를 사용하여 단리하였다. 간략하게, 래트에 헤파린첨가한 다음 이소플루란으로 마취시켰다. 마취 하에 복강을 개방하고, 대정맥 및 하행 대동맥을 결찰하여 혈관계로부터 간을 단리하였다. 이어서 간을 PE-50 배관을 사용하여 캐뉼라삽입하고, 관류시켰다. 먼저, 간을 250 mL의 세척 완충제 (12.5 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) 및 0.5 mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA)을 함유하는 행크의 평형 염 용액, HBSS (깁코))로 관류시킨 다음, 250 mL의 소화 완충제 (4 mM CaCl2 및 0.1% 콜라게나제 유형 2를 함유하는 HBSS (워싱턴))로 관류시켰다. 간을 제거하고, 수동으로 크렙스-헨셀라이트 완충제 (시그마-알드리치, K3753) 중에서 세포 현탁액으로 해리시켰다. 불용성 파편은 세포 현탁액을 면 거즈 및 100 μm 필터를 통해 통과시켜 제거하였다. 간세포를 300xg에서 시작하여 50xg로 감소되는 일련의 원심분리 단계에 의해 정제하였다. 사용된 간세포 세포 현탁액은 90%를 초과하여 생존하고 95%를 초과하여 순수한 것으로 결정되었다. 간세포를 즉시 사용하거나 또는 이후의 사용을 위해 동결시켰다. 간세포를 DMEM (깁코) 및 MCDB-131 완전 (베크 테크 인크(Vec Tech Inc)) 배지 플러스 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS), 1% (v/v) 페니실린 스트렙토마이신 및 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄-X (깁코)의 50:50 블렌드 중에서 배양하였다.
신생아 래트 심근세포 단리 및 배양. 신생아 래트 심장을 토론토 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 이전에 기재된 바와 같이 소화시켜 신생아 래트 심근세포 및 섬유모세포를 단리하였다. 시험관내 실험을 위해 신생아 (1-2일령) 스프라그-돌리 래트를 사용하였고, 생체내 실험을 위해 신생아 (1-2일령) 루이스 래트를 사용하였다. 간략하게, 신생아 래트를 먼저 안락사시켰다. 심장을 제거하고 4등분하였다. 4등분된 심장을 Ca2+ 및 Mg2+ 무함유 완충제 (HBSS (깁코)) 중 0.06% (w/v) 트립신 용액 (시그마, 캐나다) 중에서 4℃에서 밤새 소화시켰다. 이어서, HBSS 중 콜라게나제 II (미국 워싱턴 220 유닛/mL)를 사용하여 4등분된 심장을 37℃에서 연속 5회 4-8분 소화로 추가로 소화시켰다. 콜라게나제 소화 후에, 세포를 40분 동안 사전-플레이팅하였다. 심근세포가 풍부화된 비-부착 세포를 수집하여 사용하거나 또는 다시 플레이팅하고 사용전 밤새 배양하였다. 래트 심근세포를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS, 깁코, 캐나다), 1% HEPES (100 유닛/mL, 깁코, 캐나다) 및 페니실린-스트렙토마이신 (100 mg/mL, 깁코, 캐나다)과 함께 4.5 g/L 글루코스를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 깁코, 캐나다) 중에서 배양하였다.
hESC-유래 CM 분화 및 배양. 이전에 기재된 기술을 사용하여 HES-3 NKX2-5 GFP 양성 세포를 배양하였다. 세포를 미토마이신 C 유사분열 불활성화 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 상의 6-웰 조직 배양 플레이트 내에서 20% 녹-아웃 혈청 대체제, 100 μM 비필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 50 U/ml 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신 (인비트로젠), 10-4 M β-메르캅토에탄올 (시그마) 및 20 ng/mL hbFGF (R&D 시스템)로 보충된 DMEM/F12 (50/50 (v/v), 미디어테크(Mediatech))로 이루어진 hESC 배지 중에 유지시켰다. 융합되면, 트리플 이 익스프레스(Tryple E Express) (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 실온에서 세포를 단세포로 해리시키고, 조건화 배지 중 0.13 - 0.33 x106개 세포/cm2의 범위의 농도로 플레이트 코팅된 ES 품질 매트리겔 (BD 사이언시스) 상으로 옮겼다48. 이전에 수집한 MEF로부터의 조건화 배지에 h-bFGF를 보충하고, 분화 유도시까지 매일 바꿔주었다. 유도 전에 세포를 RPMI/B27 (라이프 테크놀로지스) 중에서 세척하고, 6-12 μM 범위의 CHIR 99021 (스템젠트(Stemgent))이 보충된 RPMI/B27로 배지를 대체하여 분화를 유도하였다. 정확하게 유도 24시간 후에, 배지를 신선한 RPMI/B27로 대체하였다. 유도 후 72시간 째에, 각각의 웰 내 배지 1 mL를 5 μM Wnt 억제제 IWP-4 (스템젠트)를 함유하는 1mL 신선한 RPMI/B27과 혼합하였다. 제5일에 배지를 대체하고, 제7일에 인슐린을 함유하는 RPMI/B27 (라이프 테크놀로지스)로 바꾼 다음, 그 후 해리까지 3일마다 대체하였다. 제20일-제30일에 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터 내에서 콜라게나제 유형 II (1mg/ml)를 120분 동안 사용하여 세포 단층을 해리시킨 다음, 37℃ 수조 내의 트리플 이 익스프레스 중에서 5분 동안 추가로 해리시켰다. FACSC칼리버 (BD 사이언시스)를 사용하여 세포 분석을 달성하여 NKX2-5 GFP 리포터에 의해 결정되는 바와 같은 최종 CM 농도를 결정하였다.
조직학 및 면역형광 염색. 면역-형광 염색을 수행하여 배양된 안지오칩 조직의 형태를 평가하였다. 먼저 조직을 PBS 중 4% (w/v) 파라포름알데히드 중에서 실온에서 15분 동안 고정시켰다. 이어서, 조직을 계내 투과시키고, PBS 중5% FBS 및 0.25% 트리톤 X100으로 1시간 동안 차단시켰다. 다음으로, 안지오칩 심장 조직을 1차 항체, 근절 α-액티닌 (마우스, 1:200 희석, 시그마) 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 다음, 상응하는 2차 항체, 알렉사 488 접합된 항-마우스 IgG (1:200 희석, 시그마) 및 F-액틴 (팔로이딘 660 접합됨, 시그마)과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 심장 조직을 올림푸스 FV5-PSU 공초점 현미경을 사용하여 영상화하였다. 안지오칩 간 조직을 먼저 CFDA로 표지한 다음 상기 기재된 바와 같이 고정시키고, F-액틴 (팔로이딘 660 접합됨, 시그마)으로 1시간 동안 염색하였다. 혈관계를 가시화하기 위해, 내피화된 안지오칩 스캐폴드를 4% PFA 중에 고정시키고 5% FBS 중에서 1시간 동안 차단시켯다. 이어서, 스캐폴드를 1차 항체, CD31 (마우스, 1:200 희석, 시그마) 중에서 인큐베이션시킨 다음, 2차 항체; 알렉사 647 접합된 항-마우스 IgG (1:200 희석, 시그마)와 함께 인큐베이션시켰다. PBS 중 카르복시플루오레세인 디아세테이트 (CFDA, 1:1000 희석, 인비트로젠) 및 아이오딘화프로피듐 (PI, 인비트로젠)을 사용하여 37℃에서 30분 동안 생 및 사 염색을 수행하였다. 생 및 사 염색에 의해 심장 조직의 단면을 가시화하기 위해, 조직을 횡으로 절반 슬라이싱하고, 수동으로 회전시켜 단면이 보이게 하였다. 내피 세포 및 실질 세포 둘 다를 가시화하기 위해, 배양된 조직을 10% 포르말린 중에 4℃에서 3일 동안 고정시키고, 파라핀 포매하고, 토론토 대학 건강 네트워크의 병리상태 연구 프로그램 실험실에서의 조직학을 위해 4μm 슬라이스로 절편화하였다. 조직학 절편은 조직 단면을 횡방향으로 보여주었고, 이를 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), 마송 트리크롬 염색, CD31, 또는 알부민으로 염색하였다.
우레아 검정. 안지오칩 간 조직을 메인 웰에서 10 mM 중탄산암모늄을 함유하는 1mL 간세포 배지와 함께 인큐베이션하고, 유입구 웰로부터 10 mM 중탄산암모늄을 함유하는 1mL 내피 세포 배지로 관류시켰다. 각각 24시간 인큐베이션 후에, 메인 웰 및 유출구 웰로부터의 배지를 수집하였다. 배지를 간략하게 원심분리하여 (5분 동안 300 x g) 임의의 세포를 제거하고, -20℃에서 동결시켰다. 콴티크롬(QuantiChrom) 우레아 검정 키트 (바이오어세이 시스템즈(BioAssay Systems))를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 우레아를 검출하였다. 검출을 위해 배지를 전형적으로 희석하지 않고 사용하였다.
간 약물 시험. 배양 제3일에, 간세포 배양 배지 중 테르페나딘 (10μM, 시그마)을 유입구 웰에 넣고, 내피화된 간 조직을 통해 0.7μL/분 (0.62 dynes/cm2, Re, 0.01)으로 24시간 동안 관류시켰다. 24시간 인큐베이션 후에, 유입구 웰, 중간 웰, 및 유출구 웰 내의 배지를 수집하고, 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)에 의해 펙소페나딘의 농도에 대해 분석하고, 표준 곡선과 상관시켰다. DMSO를 약물을 최초로 용해시키는데 사용하였다. 배지 중 DMSO의 최종 농도는 항상 0.1% 미만이었다.
조작된 심장 조직의 기능적 특성. 안지오칩 심장 조직을 자극하고 그의 전기 흥분성 파라미터를 측정하기 위해, 1cm 떨어져서 이격된 2개의 탄소 전극을 각각의 메인 웰 내에 조직의 대향 측면 상에 평행으로 놓았다. 백금 와이어를 사용하여 전극을 외부 전기 자극기 (그라스 s88x)에 연결시켰다. 2 ms 지속기간의 단상 펄스 및 초당 1 펄스의 주파수를 사용하여, 먼저 흥분 역치 (영상 영역에서 조직의 75%의 동시 수축을 관찰할 수 있는 최소 전압)를 결정하였다. 이어서 결정된 흥분 역치 전압의 200%에서 최대 포획률 (최대 박동 주파수)을 결정하였다. 조직 수축의 진폭을 수축 사이의 조작된 조직에서의 너비의 변화로부터 결정하였다. 조직 재형성의 진행에 접근하기 위해, 심장 조직의 명시야 영상을 세포 시딩 후 처음 5일에 매일 채취하였다. 중심의 짧은 에지를 가로지르는 조직의 너비는 영상으로부터 이미지J를 사용하여 측정하였다.
광학 맵핑. 형광 영상화를 사용하여 IDL로 작성된 주문-제작 프로그램 (엑셀리스(Exelis), 미국 버지니아주 맥린)으로 활성화 맵을 생성하였다. 칼슘 염료 플루오-4를 사용하고, 쇼트 아크 머큐리(Short Arc Mercury) 광원 (엑스-사이트 이그잭트, 루멘 다이나믹스(Lumen Dynamics), 캐나다 온타리아주 미시소거)을 사용하여 여기시키고, 482nm에서 대역 통과 여과하고, 1.6 내지 2.5x 범위의 광학 배율을 갖는 형광 마크로-줌 현미경 시스템 (MVX-10, 올림푸스 코포레이션(Olympus Corporation), 일본 도쿄) 내에 설치된 488 nm 장파장-통과 필터 (셈로크 코포레이션(Semrock Corp), 미국 뉴욕 로체스터)를 통해 방출을 측정하였다. 고속 CMOS 카메라 (미캠-L(Micam-L), 스키메디아 유에스에이(Scimedia USA), 미국 캘리포니아주 코스타 메사)를 사용하여 형광을 초당 200 프레임으로 기록하였다. 1cm2 센서는 100x100 픽셀을 가져, 픽셀당 40 내지 60 마이크로미터의 해상도를 제공하였다.
락토스 데히드로게나제 (LDH) 검정. 안지오칩 심장 조직을 심근세포 배지를 사용하여, 내장된 네트워크를 통한 0.7μL/분 (0.62 dynes/cm2, Re: 0.01)의 배지 관류의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 조직이 존재하는 중간 웰로부터 심근세포 배지 1 mL를 수집하고, 6일 동안 매일 신규한 배지로 대체하였다. LDH 독성 검정 키트 (케이만 케미칼(Cayman Chemical))를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수집된 배지를 락토스 데히드로게나제 (LDH) 농도에 대해 분석하고, 표준 곡선과 상관시켰다.
심장 약물 시험. 배양 제7일에, 심장 조직의 자발적 수축을 명시야 비디오로서 기록하였다. 이어서, 심장 배양 배지 중 에피네프린 (10μM, 시그마) 또는 디곡신 (10μM, 시그마)을 유입구 웰 내에 넣고, 내피화된 심장 조직을 통해 30분 동안 0.7μL/분 (0.62 dynes/cm2, Re: 0.01)으로 관류시켰다. 30분 인큐베이션 후에, 심장 조직의 자발적 수축을 다시 명시야 비디오로서 기록하였다. 이미지J를 사용하여 기록된 비디오로부터 수축 빈도를 분석하였다. DMSO를 약물을 용해시키는데 사용하였다. 배양 배지 중 DMSO의 최종 농도는 0.1% (v/v) 미만으로 희석되었다.
래트 대퇴 혈관 수술. 하기 모든 절차는 동물 관리 위원회에 의해 승인된 프로토콜 하에 토론토 대학의 비교 의약 동물 실험 학부에서 수행하였다. 루이스 신생아 래트 심근세포와 함께 배양된 안지오칩 스캐폴드를 제7일에 이식 실험에 사용하였다. 안지오칩 스캐폴드는 생체내 실험을 위해 내피화되지 않았다. 먼저, 찰스 리버(Charles River)로부터의 성체 수컷 루이스 래트 (150-250g)를 1-3% 이소플루란으로 1L/분의 유량으로 마취시켰다. 진통제를 투여하고 (5mg/kg 케토프로펜, SQ), 수술을 위해 둘 다의 뒷다리를 준비하였다. 수술 절차를 위해, 해부 현미경을 사용하여 뒷다리 영역의 확대도를 수득하였다. 피부를 면도하고, 좌측 다리 상에 무릎에서 시작하여 중앙 넓적다리까지 대략 2 cm 길이의 절개부를 만들었다. 이어서, 피하 지방 조직 및 기저 신경혈관 다발을 드러내었다. 대퇴 동맥 및 정맥을 해부하고, 신경으로부터 분리시켰다. 동맥 우회 구성을 위해, 대퇴 동맥 절편 (대략 1.5 cm 길이)을 완전히 노출시키고 안지오칩 심장 조직의 삽입을 위해 결찰시켰다. 동맥의 2개의 말단을 마이크로수술 봉합 클램프를 사용하여 클램핑하여 수술 동안 혈류를 일시적으로 중지시켰다. 1개의 25 게이지 커프 (폴리이미드 튜브)를 동맥의 각 말단에 삽입하고, 7-0 봉합사로 고정시켰다. 생분해성 수술 커프를 또한 추가의 적용에 사용할 수 있다. 이어서 안지오칩 심장 조직의 유입구 및 유출구를 커프 내에 삽입하고, 조직 글루 (시아노아크릴레이트)를 사용하여 밀봉하였다. 이어서 클램프를 제거하고, 혈액 관류를 확립하였다. 동맥-대-정맥 구성을 위해, 대퇴 동맥 및 대퇴 정맥의 절편 (대략 5mm 길이)을 완전히 노출시키고, 안지오칩 심장 조직의 삽입을 위해 결찰시켰다. 동맥 및 정맥의 2개의 말단을 마이크로수술 봉합 클램프를 사용하여 클램핑하여 수술 동안 혈류를 일시적으로 중지시켰다. 1개의 25 게이지 커프 (폴리이미드 튜브)를 동맥 및 정맥의 각 상부 말단에 삽입하고, 7-0 봉합사로 고정시켰다. 동맥 및 정맥의 하부 말단은 7-0 봉합사로 밀봉하였다. 이어서 안지오칩 심장 조직의 유입구 및 유출구를 커프 내에 삽입하고, 조직 글루 (시아노아크릴레이트)를 사용하여 밀봉하였다. 이어서 클램프를 제거하고, 혈액 관류를 재-확립하였다. 마지막으로, 대조군으로서 역할을 하도록 또 다른 심장 조직 패치를 유사한 방식에 의하되 문합술 없이 우측 다리에 피하로 이식하였다. 수술후 통증 관리를 위해, 래트에게 2일 동안 케토프로펜 (5mg/kg, 매일 피하 주사)을 제공하였다. 1-주 시점에 동물을 인도적으로 안락사시키고, 조직 이식물을 단리하여 조직학 절편화하였다.
통계적 분석. 독립적 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 실험군 사이의 유의차를 결정하였다. 도 59j에서는, 유출구 웰 내의 펙소페나딘 농도가 증가만 할 것으로 예상되고 어떠한 펙소페나딘도 함유하지 않는 유입구 웰 대조군보다 낮아질 수 없기 때문에 대응표본 단측 스튜던트 t-검정을 사용하였다. 스튜던트 검정에 더하여, 도 59i 통계에서는 또한 시그마 플롯에서 삼원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 정규성 검정 (샤피로-윌크) 및 쌍별 다중 비교 절차 (홀름-시닥 방법)를 사용하였다. P<0.05는 모든 통계 검정에 대해 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 적용
본원의 실시예에 개시된 예시적인 장치는 다양한 조직 구조의 배양 및 생성에 적합할 수 있다. 개시된 장치는 세포가 생체내에서 정상적으로 이루어지는 방식으로 성숙 및 기능하도록 생체내에서 발견되는 본래의 조직 아키텍처를 모방하거나 재현한 시험관내 플랫폼을 제공하기 위해 설계될 수 있다.
다양한 예에서, 개시된 장치는 근육 세포, 예컨대 심근세포, 골격근 세포, 평활근 세포 뿐만 아니라 흥분성 조직, 예컨대 뉴런 및 풍부한 혈관계를 필요로 할 수 있는 세포, 예컨대 특히 간세포를 비롯한 다양한 조직의 배양을 위해 적합할 수 있다.
다양한 예에서, 개시된 장치는 시험관내 약물-시험, 여러 상이한 구획을 갖는 인간-온-어-칩의 구축, 뿐만 아니라 다른 적용분야 중에서도 동물 또는 인간 환자 내로의 직접 문합술 및 이식을 비롯한 다양한 적용분야에 적합할 수 있다.
상기 기재된 본 개시내용의 실시양태는 단지 예인 것으로 의도된다. 본 개시내용은 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 본 개시내용의 의도되는 범주에서 벗어나지 않으면서 개시내용에 대해 변경, 변형 및 변동이 이루어질 수 있다. 본원에 개시되고 제시된 시스템, 장치 및 공정은 특정한 수의 요소/구성요소를 포함할 수 있지만, 시스템, 장치 및 어셈블리는 추가의 또는 더 적은 이러한 요소/구성요소를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 개시된 임의의 요소/구성요소는 단수인 것으로 언급될 수 있지만, 본원에 개시된 실시양태는 복수개의 이러한 요소/구성요소를 포함하는 것으로 변형될 수 있다. 상기-기재된 실시양태 중 하나 이상으로부터 선택된 특색은 조합되어 분명하게 기재되지 않은 대안적 실시양태를 생성할 수 있다. 개시된 범위 내의 모든 값 및 하위-범위가 또한 개시된다. 본원에 기재된 대상은 기술 내의 모든 적합한 변화를 포괄하고 포함하는 것으로 의도된다. 언급된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예 5: 안지오튜브
서론
이러한 예에서, 본 발명자들은 안지오튜브로 명명되는 관류가능한 마이크로-튜브로 표매된 96 웰-플레이트인 안지오튜브 플레이트를 제안한다. 포매된 안지오튜브는 밤새 신속하게 내피화되어 혈관 모방체를 형성할 수 있다. 안지오-튜브 주변에서, 다양한 세포, 예컨대 심근세포, 간세포, 평활근 및 족세포 등이 어셈블리되어 기능적 3-D 조직을 형성할 수 있다. 이러한 간단한 구성은 다양한 유형의 조직에 3-D 혈관 계면을 합체시키는데 보편적으로 적용될 수 있다. 안지오튜브은 작고 큰 생체분자의 교환을 위한, 뿐만 아니라 혈관 계면을 가로지르는 세포, 예컨대 단핵구의 이동을 가능하게 하는 패턴화된 10um 마이크로-홀을 갖는 얇은 채널 벽 (25-50um)을 갖는다. 따라서, 혈관 벽을 가로지르는 세포간 상호작용, 혈관 투과성, 및 화학주성을 모두 연구할 수 있다.
추가의 외부 특색, 예컨대 실질 조직의 수동 장력 및 능동 수축의 측정을 가능하게 하는 캔틸레버 구조가 또한 안지오튜브에 합체될 수 있다. 이러한 특색은 평활근 조직의 수축 및 이완 뿐만 아니라 심장 근육 조직의 능동 수축을 검사하는데 중요하다. 이러한 유형의 판독은 외부 자극에 대한 가치있는 조직-수준 반응을 제공하며, 조직의 파괴 없이 계속해서 온-라인으로 수행될 수 있다.
마지막으로, 안지오튜브가 다중 웰을 통해 연결되는 96-웰 플레이트 내에 포매되기 때문에, 상이한 유형의 조직이 동일한 안지오튜브 주변에서 상이한 웰 내에서 배양될 수 있다. 동일한 안지오튜브를 통해, 다중 조직 유닛이 함께 자동적으로 연결되게 되어, 사용자로 하여금 시험관내에서 통합 인간 생리학을 재현한 기관간 수준 상호작용을 용이하게 조사하게 한다. 예를 들어, 많은 약물은 그들이 다른 생명유지 기관으로 전달되기 전에 간에 의해 다중 형태로 전환 및 프로세싱된다. 따라서 약물은 최초의 스크리닝 동안에는 그의 본래의 형태에서 비독성일 수 있지만, 동물 또는 인간 시험에서 독성이 될 수 있다. 따라서, 간 조직 유닛을 다른 기관 유닛과 통합시키는 것은 조기 스크리닝 단계에서 기관간 수준 독성을 잠재적으로 밝혀낼 수 있다.
예비 결과
챔버 어레이를 포함하고, 각각의 챔버가 웰 내에 위치하는 투과성/관류가능한 튜브 주변에서의 시딩 및 3D 조직 가닥의 성장을 위한 1개 이상의 웰을 함유하는 안지오튜브 다중웰 관류가능한 시스템 (도 75). 각각의 챔버는 또한 조직 가닥을 고정시키기 위한 적어도 2개의 대향 요소를 함유할 수 있고, 그의 이동은 3D 조직 가닥의 수축/이완 사이클 동안 파악되고 측정될 수 있다 (도 75). 챔버는 또한 심장 조직을 자극하기 위한 전극으로 구성될 수 있다.
안지오튜브는 플레이트 각도를 기울이는 것에 의해 유입구 웰로부터 유출구 웰로 관류될 수 있고, 이에 따라 유입구 및 유출구 웰 사이에 압력 수두 차이가 생성될 수 있다. 도 76은 생물반응기의 기울기 높이의 함수로서 유량 (μl/분) 또는 전단 응력 (dynes/cm2)에 의해 측정된 바와 같은, 안지오튜브 다중웰 관류가능한 생물반응기의 수동 관류의 결과를 입증한다. PBS는 안지오튜브를 관류하였다.
안지오튜브 생물반응기의 단일 챔버 내에서의 3D 조직 가닥 발생의 시간 경과를 보여주기 위해, 래트 심근세포를 안지오튜브 상에 콜라겐/매트리겔 매트릭스 내에 캐스팅하였다 (도 77). 시리즈의 제1 영상은 세포가 생물반응기 챔버 내에 처음 시딩된 시점을 보여준다. 시간 진행에 따라 세포는 성장하고, 챔버 내의 2개의 가요성 캔틸레버 요소에 대해 클러스터하기 시작하는 한편 가요성 요소 사이에 조직 연결을 유지한다. 사진에 제시된 특정한 실시양태는 단지 한 실시양태이고, 본 발명에 의하면 다른 구성이 고려된다. 예를 들어, 가요성 캔틸레버 요소는 상이한 형상 및/또는 길이 (예를 들어, 곡선형, 원형, 비선형, 편형, 원, 휨, 두께)를 갖는 것으로 형성될 수 있고, 캔틸레버 변위의 측정 및/또는 검출이 검출될 수 있도록 상이한 각도 또는 배향으로 투과성 관상 요소에 부착될 수 있다. 챔버는 또한 심장 세포를 자극하기 위한 전극을 함유할 수 있다. 우측의 막대는 3D 조직 가닥의 형성 동안 관찰할 수 있는 캔틸레버 변위의 정도를 입증한다.
조직 가닥의 광 현미경검사 영상은 캔틸레버 주변을 감싼 조직을 보여준다 (도 78, 좌측 영상). 안지오튜브 주변에 형성된 3-D 조직 가닥의 형태를 보여주기 위해, 조직을 근절-α-액티닌 및 F-액틴으로 염색하여 (도 78) 조직 가닥의 세포의 분포 및 형태 및 배향을 나타내었다.
캔틸레버가 심장 조직 가닥의 능동 수축을 검출하는데 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 시딩후 성장 5일 후 및 10일 후에 캔틸레버 변위를 측정하였다 (픽셀에 의해 측정된 바와 같음) (도 79). 본 발명자들은 캔틸레버의 굴곡 정도에서 증가를 관찰하였다. 이러한 추세는 시간의 경과에 따른 조직 가닥의 성숙을 나타낸다.
결론
안지오튜브 플레이트는 다양한 유형의 조직을 생성하기 위해 보편적인 구성을 사용하는 다용도성 플레이트이다. 구성은 단순하지만, 내장된 혈관 계면을 가로지르는 복잡한 세포 상호작용을 3-D 환경으로 재현할 수 있다. 가장 중요하게는, 설정은 다기관 구성으로의 스케일링을 위해 자연스럽게 적합화된다. 통상적인 96 웰-플레이트 포멧의 안지오튜브 플레이트는 또한 고처리량 약물 독성 스크리닝의 기존 산업 기반시설, 예컨대 로봇 액체 분배기 및 다중웰 플레이트 판독기에 대해 또한 용이하게 적합화된다.
실시예 6: 바이오와이어 (시험관내 만성 약물 노출의 인간 줄기 세포-유래 심장 모델)
동물 모델 시스템은 질환의 분자적 근거에 대한 중요한 이해를 제공하는데 있어서 주된 역할을 한다. 이러한 정보는 인간 질환의 연구에 성공적으로 적용되고, 이러한 변환은 인간 세포를 기반으로 한 모델의 이용가능성에 의해 유의하게 강화될 것이다. 인간 심근세포의 생리학이 설치류와는 유의하게 상이하기 때문에, 이는 심혈관 질환의 경우에 특히 중요할 것이다. 본원에서, 본 발명자들은 조직 공학 및 인간 배아 줄기 세포-유래 심근세포 (hESC-CM)을 통한 인간 심근의 3차원 모델을 사용하여, hESC-CM이 이소프로테레놀, 엔도텔린-1 또는 안지오텐신 II에 의한 만성 치료에 반응할 수 있고 만성 약물 노출과 상용가능한 변화를 거칠 수 있는지 여부를 검토하였다. 본 발명자들은 이소프로테레놀, 엔도텔린-1 또는 안지오텐신 II로 처리된 hESC-CM이 파괴된 근원섬유 정렬, 증가된 세포 크기, 및 유의하게 감소된 수축력을 나타냄을 보여준다. 이소프로테레놀-처리된 hESC-CM 조직은 인간 심부전에 대한 현재의 황금 표준 바이오마커인 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 및 심방 나트륨이뇨 인자 (ANF) 유전자 발현의 유도를 나타낸다. BNP는 또한 이소프로테레놀 및 엔도텔린-1 둘다로 처리된 세포의 조건화 배지에서도 관찰할 수 있었다. 이는 hESC-CM이 적절한 환경적 스트레스 신호에 반응할 수 있고, 생체내 만성 약물 노출과 상용가능한 변화를 거칠 수 있음을 입증한다.
서론
동물 모델은 심장 질환을 모델링하고 신규한 약물의 안전성 및 효능을 시험하기 위해 통상적으로 사용된다. 마우스는 상대적 입수가능성 및 게놈을 정확하게 조작할 가능성으로 인해 가장 많이 사용되는 동물 모델이다 [1]. 그러나, 마우스와 인간 심장 생리학 사이에는 유의차가 존재한다. 예를 들어, 마우스 심박수는 인간보다 10배 더 빠르다. 수축 단백질, 예컨대 α- 및 β-미오신 중쇄도 또한 마우스 및 인간에서 상이한 발현을 갖는다. 또한, 마우스 심근세포의 재분극은 주로 Ito, IK,slow1, IK,slow2, ISS 이온 채널에 의해 구동되는 반면에, 인간 심근세포에서는 주로 Ikr 및 Iks에 의해 구동된다 [1-3]. 이는 약물에 대한 상이한 반응을 야기할 수 있고, 따라서 약물 스크리닝 모델로서 그의 효과적인 사용을 방해한다.
이용가능한 인간 약물 스크리닝 모델은 유전적으로 불안정하고/거나 심장 세포의 특이성이 결여되어 있을 수 있는 종양-유래 세포주 또는 환자의 샘플에 의존한다. 대부분의 심장 독성/부정맥 연구는 지금까지 단일 이온 채널 유전자가 비-심장 세포에서 발현되는 이종 발현 시스템에 의존해왔다. 이들 모델은 심근세포의 대부분의 특징을 복제할 수 없기 때문에 여러 한계를 갖고, 따라서 인간 조직의 시험관내 모델을 생성하는데 이상적이지 않다.
인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포 (각각 hESC 및 iPSC)의 생성 및 그로부터의 진실한 심근세포로 분화될 가능성 [4-6]은 건강한 [7, 8] 및 이환된 인간 심장 조직 [9, 10]의 시험관내 모델을 생성할 예외적인 기회를 나타낸다. 따라서, hESC 및 iPSC-유래 심근세포 (CM)는 전임상 약물 스크리닝을 위한 플랫폼의 개발 및 임상 용도를 위한 최적화에 대한 잠재력을 보유한다 [7, 11]. 이들 기술은 동물 모델에서는 종종 독성이 아니지만 인간 심장 세포에 대해서는 독성을 나타낼 수 있는 약물을 분류하는데 사용될 수 있다.
이환 심근세포의 인간 모델은 시험관내에서 질환 특징을 복제하는 특정 돌연변이를 갖는 세포주의 사용에 의존해왔다. 최근에, 인간 iPSC-유래 CM은 심장 부정맥, 예컨대 긴 QT 증후군을 모델링하는데 사용되었다 [12-14]. 이러한 희귀 유전 장애는 심장 근육이 재분극되는 것을 오래걸리게 하고, 돌연사로 이어질 수 있는 부정맥을 야기한다. 긴 QT 증후군 환자로부터 유래된 iPSC 세포주로부터의 심근세포를 사용하여, 저자들은 생성된 CM이 질환의 전기생리학적 서명을 나타냄을 입증하였고, 발병기전의 메카니즘의 연구 및 치료 약물 시험을 위한 강력한 시스템을 확립하였다. 다양한 유전성 심장 장애를 갖는 환자로부터의 인간 iPSC-CM의 라이브러리를 또한 상이한 유전적 배경의 환자에 대한 심장 약물 독성 감수성에서의 차이를 모델링하는데 사용하였고, 이는 전임상 약물 스크리닝을 위해 인간 세포를 사용하는 것의 중요성을 강조하였다 [15]. 그러나, 비-유전적 심근병증의 높은 유병률로 인해, 건강한 hESC-CM으로부터 비-유전적 질환 모델을 개발하는 것은 신규한 치료제의 효능에 대한 시험관내 스크리닝 플랫폼으로서의 사용을 위한 거대한 잠재력을 가질 것이기 때문에, 매우 이익이 될 것이다.
심근병증은 특히 심근경색, 유전자 돌연변이, 및 만성 약물 노출의 결과일 수 있다. 이소프로테레놀, 안지오텐신 II 및 엔도텔린-1은 동물 모델에서 심근병증을 재현하는데 성공적으로 사용되어 온 분자이다. 따라서, 이는 만성 약물 노출로 인한 심근병증과 상용가능한 부작용의 시험관내 스크리닝을 위한 도구로서 인간 줄기 세포-유래 CM의 잠재적 적용분야를 조사하기 위한 도구로서의 사용을 위한 적합한 후보이다.
만성 약물 적용의 연구에 적합한 심장 조직 모델로서 역할하도록 hESC-CM의 잠재력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 hESC-CM으로부터 3차원 심장 조직을 생성하고, 이소프로테레놀, 엔도텔린-1 또는 안지오텐신 II에의 만성 노출에 대한 그의 반응을 조사하였다. 이들 작용제를 사용한 처리한 후에, 인간 조직은 파괴된 근절 조직화, 태아 유전자 프로그램의 유도 (뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 및 심방 나트륨이뇨 인자 (ANF)의 상향조절), BNP의 분비, 세포 크기의 증가 및 유의하게 감소된 수축력을 비롯한 병리학적 비대의 특징을 나타낸다. 이는 hESC-CM이 생체내 모델에서와 상용가능한 방식으로 만성 약물 노출에 반응할 수 있고, 만성 약물 노출에 대한 전임상 적용에 유용할 수 있음을 나타낸다.
물질 및 방법
인간 배아 줄기 세포 유지 및 분화. 본 발명자들은 기재된 바와 같이 유지된 Hes2 hESC 세포주로부터 유래된 심근세포를 사용하였다 [5, 16]. 배상체 (EB)를 이전과 같이 심혈관 계열로 분화시켰다 [5, 16]. 간략하게, BMP4 (1 ng/ml)를 함유하는 스템프로-34 (인비트로젠) 배지 중에서 배양함으로써 EB를 생성하였다. 제1일에, EB를 수거하고, 유도 배지 (스템프로-34, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 2.5 ng/ml), 액티빈 A (6 ng/ml) 및 BMP4 (10 ng/ml)) 중에 현탁시켰다. 제4일에, 유도 배지로부터 EB를 수거하고, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF; 10 ng/ml) 및 DKK1 (150 ng/ml)이 보충된 스템프로-34 중에서 재-배양하였다. 제8일에, 배지를 다시 바꾸고, EB를 VEGF (20 ng/ml) 및 bFGF (10 ng/ml)를 함유하는 스템프로-34 중에서 실험 기간 동안 배양하였다. 배양을 처음 12일 동안 저산소 환경 (5% CO2, 5% O2)에서 유지시킨 다음, 남은 배양 기간 동안 5% CO2로 옮겼다. 제20일 (EBd20)에 바이오와이어에의 시딩을 위해 EB를 해리시켰다.
바이오와이어 생성: 제 20일에 EB를 행크의 평형 염 용액 (NaCl, 136 mM; NaHCO3, 4.16 mM; Na3PO4, 0.34 mM; KCl, 5.36 mM; KH2PO4, 0.44 mM; 덱스트로스, 5.55 mM; HEPES, 5 mM) 중의 콜라게나제 유형 I (1 mg/ml; 워싱턴) 및 DNAse (1 mg/ml, 칼바이오켐) 중에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. EB를 원심분리하고 (800 r.p.m., 5분), 트립신 (0.25%, 깁코)과 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 온화하게 피펫팅하여 세포를 해리시켰다. 해리 후에, 세포를 원심분리하고 (1,000 r.p.m., 5분), 카운팅하고, 0.5x106 개 세포/0.5 cm 길이의 와이어로 시딩하였다. 이러한 비는 보다 긴 바이오와이어의 생성을 위해 유지시켰다. 세포 현탁액을 PDMS 템플릿의 메인 채널 내로 피펫팅함으로써 세포를 1X M199 배지 + 10% 성장 인자 감소된 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 중 24.9 mM 글루코스, 23.81 mM NaHCO3, 14.34 mM NaOH, 10mM HEPES 중의 콜라겐 유형 I 겔 (4 μl/0.5 cm 와이어 길이; 2.1 mg/ml의 래트 꼬리 콜라겐 유형 I; BD 바이오사이언시스) 내에 시딩하였다. 시딩 후에, 기재된 바와 같이 세포를 배양물 중에 7일 동안 유지시켜 콜라겐 매트릭스가 재형성되게 하고 봉합사 주변에 어셈블리되게 하였다 [8].
7일 동안의 사전 배양 후에, 바이오와이어를 무작위로 6-웰 플레이트로 옮기고, 스템프로-34 배지 내에서 이소프로테레놀 (100nM), 안지오텐신 II (200nM [17]) 또는 엔도텔린-1 (150nM) (시그마)의 부재 또는 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 이러한 프로토콜은 기재된 바와 같은 마우스의 만성 처리를 복제하기 위해 선택하였다 [18]. 단일-세포 분석을 위해, 바이오와이어를 행크의 평형 염 용액 (NaCl, 136 mM; NaHCO3, 4.16 mM; Na3PO4, 0.34 mM; KCl, 5.36 mM; KH2PO4, 0.44 mM; 덱스트로스, 5.55 mM; HEPES, 5 mM) 중의 콜라게나제 유형 I (1 mg/ml; 시그마) 및 DNAse (1 mg/ml, 칼바이오켐)로 37℃에서 4시간 동안 소화시키고, 원심분리하고 (800 r.p.m., 5분), 트립신 (0.25%, 깁코)과 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 온화하게 피펫팅하여 세포를 해리시켰다. 단리된 단세포를 매트리겔-코팅된 유리 커버 슬립 상에 시딩한 후, 세포 면적 및 칼슘 과도 측정을 수행하였다.
대안적으로, 3D 조작된 심장 조직에 의해 생성된 힘을 측정하기 위해, 8 마이크로조직을 수용할 수 있는 PDMS 조직 챔버로 이루어진 생물반응기를 사용하였다. 각각의 조작된 심장 조직은 이전에 기재된 바와 같이 콜라겐 I 히드로겔 (3.0 mg/mL) 25 μL 중에 현탁된 EB의 해리로부터 수득된 1.5 x 106개의 세포로 이루어졌다 [19]. 간략하게, PDMS 챔버의 각각의 웰은 겔 압착 동안 각각의 심장 조직에 대한 고정점으로서 역할을 하는 2개의 포스트를 가졌다. 추가로, 포스트의 굴절을 추적함으로써 생성된 심장 조직의 수축력을 결정하였다. 심장 조직은 7일 사전-배양에 이어 엔도텔린-1, 안지오텐신 II 또는 이소프로테레놀에 의한 7일 처리를 거쳤다. 처리 후에, 셀센스(CellSens) 소프트웨어 (올림푸스)를 사용하여 0.5 또는 1 Hz로 조율하면서 각각의 심장 조직에 대해 포스트의 상부 표면을 한 번에 1회 비디오 판독하여 각각의 심장 조직의 수축력을 결정하였다. 이어서 각각의 비디오를 일련의 Tiff 이미지로 전송하여 이미지J에서 열었다. 이미지J 플러그인 스팟트래커(SpotTracker)를 사용하여 [20], 포스트가 이동한 거리를 결정하였다. 캔틸레버 빔-부분 획일적 굴절에 대해 중첩 방법을 사용하여, 점 힘을 계산한 다음 조직 단면적에 대해 정규화하여 (원형으로 가정함) 면적당 심장 힘을 결정하였다.
평가. 조직 어셈블리의 진행을 다양한 수준에서 평가하였다: 초미세구조적 (근절 구조), 세포적 (세포 크기 및 형상, 증식, 심장 단백질: 액틴, 트로포닌 T 및 α-액티닌의 분포), 분자적 (유전자 발현 수준), 및 기능적 (수축력, 전도 속도, Ca2+ 취급).
면역염색 및 형광 현미경검사. 하기 항체를 사용하여 면역염색을 수행하였다: 마우스 항-cTNT (1:100, 써모 사이언티픽; MS-295-P1), 마우스 항-α-액티닌 (1:200, 압캠, ab9465), 항-마우스-알렉사 플루오르 488 (1:400, 인비트로젠, A21202), 항-토끼-TRITC (1:400, 인비트로젠, 81-6114). DAPI를 사용하여 핵을 대조염색하였다. 팔로이딘 알렉사 플루오르 660 (1:1000, 인비트로젠, A22285)을 사용하여 액틴 섬유를 검출하였다. 염색된 세포를 형광 현미경 (레이카 CTR6000)을 사용하여 가시화하고, 레이카 어플리케이션 스위트 소프트웨어를 사용하여 영상을 포획하였다. 공초점 현미경검사를 위해 세포를 형광 공초점 현미경 (자이스 LSM-510)을 사용하여 가시화하였다.
투과 전자 현미경검사 (TEM). 조직을 0.1 M PBS 중 4% 파라포름알데히드, 1% 글루타르알데히드로 적어도 1시간 동안 고정시키고, PBS pH 7.2로 3회 세척하였다. 후고정을 0.1 M PBS, pH 7.2 중 1% 사산화오스뮴을 사용하여 1시간 동안 수행하고, 25에서 100%까지의 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시켰다. 에폰 수지를 사용하여 조직에 침투시키고, 플라스틱 디쉬 내에서 40℃에서 48시간 동안 중합시켰다. 조직을 절편화 후에 우라닐 아세테이트 및 시트르산납으로 염색하였다. 히타치 H-7000 투과 전자 현미경에서 영상화를 수행하였다.
광학 맵핑. 바이오와이어를 전압 감수성 염료 (Di-4-ANEPPS 5 μM, 인비트로젠)와 함께 따뜻한 타이로드 용액 (NaCl 118 mM, KCl, 4.7 mM, CaCl2 1.25 mM, MgSO4 0.6 mM, KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 25 mM, 글루코스 6 mM; 사용전 카르보젠 95% O2, 5% CO2를 적어도 20분 동안 짧게 버블링하여 산소를 공급함) 중 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 염료 형광을 고속 CMOS 카메라 (울티마-L, 시메디아)가 장착된 MVX-10 올림푸스 형광 현미경 상에서 기록하였다) [21, 22]. 1-cm 센서는 100x100 픽셀 해상도를 가졌고, 공간 해상도는 50 내지 100 μm/픽셀로 달랐다. 200 프레임/s로 영상화를 수행하였다. 녹색 필터 (올림푸스 U-MWIG2 필터 큐브)가 포함된 수은 아크 공급원 (엑스-사이트 이그잭트)을 사용하여 형광을 여기시켰다. 마이크로조작기 (월드 프리시전 인스트루먼츠) 상에 탑재된 스테인레스 스틸 바늘 내에 삽입된 2개의 미세 와이어 (AWG#32)로 제조된 양극성 전극을 사용하여 구축물을 전기적으로 점-자극하였다. 바이오와이어를 함유하는 플레이트를 가열된 플레이트 (MATS-U55S, 올림푸스) 상에 놓고, 온도를 38℃에서 조절하였다. 브레인비전 소프트웨어 (시메디아)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
칼슘 과도 측정. 바이오와이어를 행크의 평형 염 용액 (NaCl, 136 mM; NaHCO3, 4.16 mM; Na3PO4, 0.34 mM; KCl, 5.36 mM; KH2PO4, 0.44 mM; 덱스트로스, 5.55 mM; HEPES, 5 mM) 중의 콜라게나제 유형 I (1 mg/ml; 워싱턴) 및 DNAse (1 mg/ml, 칼바이오켐)와 함께 37℃에서 2시간 동안의 인큐베이션을 통해 해리시켰다. 이어서, 바이오와이어를 원심분리하고 (800 r.p.m., 5분), 트립신 (0.25%, 깁코)과 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 온화하게 피펫팅하여 세포를 해리시켰다. 해리된 심근세포를 성장 인자 무함유 매트리겔 (RPMI 배지 중 1:60으로 희석됨)-코팅된 25-mm 현미경 유리 커버슬립 상에 밤새 플레이팅하였다. 이어서 세포를 배양 배지 중 5 μM Rhod-3 AM 칼슘 영상화 염료 (인비트로젠)와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 후속하여, 심근세포를 염료-무함유 배지로 2회 세척하고, 30분 동안 인큐베이터로 되돌려 놓았다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (자이스 LSM 510)을 사용하여 형광 강도를 측정하였다. Rhod-3 AM-로딩된 심근세포를 함유하는 커버슬립을 특별한 챔버 상으로 옮기고 단단히 고정시켰다. 대략 1.8-1.9 ml의 배양 배지를 챔버에 첨가하였고, 이를 현미경 상의 온도 제어-플레이트 (37℃) 상에 놓아 두었다. 시토졸 칼슘 농도의 일시적 변동을 나타내는 Rhod-3 AM 형광 강도에서의 변화를 프레임 및 라인 스캔 모델에서 기록하였다. 영상 및 형광 데이터는 자이스 소프트웨어를 통해 획득하였다. 형광 데이터를 오리진 8.5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 형광 신호 (F)를 플루오-4 AM 로딩 후 기준선 형광에 대해 정규화하였다. 신호의 상승기는 선형 모델에 의해 피팅시키고, 신호의 감쇠기는 오프셋 모델을 사용하여 ExpDecay에 의해 피팅시켰다.
ELISA. 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트를 사용하여 조건화 배지로부터 가용성 BNP의 정량화를 수행하였다.
정량적 RT-PCR. RT-PCR을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 [23]. 하이 퓨어 RNA 단리 키트 (로슈)를 사용하여 전체 RNA를 제조하고, RNase-무함유 DNase (로슈)로 처리하였다. 랜덤 육량체 및 올리고 (dT)를 슈퍼스크립트 VILO (인비트로젠)와 함께 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. RT-qPCR을 라이트사이클러 480 SYBR 그린 I 마스터 (로슈)를 사용하여 라이트사이클러 480 (로슈) 상에서 수행하였다. 발현 수준을 하우스키핑 유전자 TATA 박스 결합 단백질 (TBP) 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)에 대해 정규화하였다.
통계적 분석. 시그마플롯 12.0을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 통계는 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 정규성 검정 (콜모고로프-스미르노프)에 이어 등분산 검정을 수행하였다. 정규성 검정이 실패하면, 크루스칼-왈리스 순위 일원 ANOVA를 수행하였다. P < 0.05는 모든 통계 검정에 대해 유의한 것으로 간주되었다.
결과
심장의 아키텍처는 매우 정교하였다. 시험관내에서 그의 일부 특징을 복제하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 시험관내 검정에서 이전에 기재된 바와 같은 3차원, 자기-어셈블리 심장 조직 모방체, 예컨대 바이오와이어를 사용하였다 [8]. 배상체의 해리로부터 수득한 인간 ESC-유래 CM을 콜라겐 유형 I 겔 내에 시딩하였다. 도 82A에 도시된 바와 같이 매트릭스 재형성 및 겔 압착을 허용하는 배양 1주 후에 [8], 바이오와이어를 이소프로테레놀 (ISO, 100nM), 엔도텔린-1 (Et-1, 150 nM [17, 24], 또는 안지오텐신 II (AngII, 200 nM)를 사용한 처리에 의해 상이한 화합물에 1주 동안 만성 노출시켰다. 이러한 프로토콜은 생체내 심장 독성 및 결과적인 심장 비대의 원인이 되는 만성 처리를 복제하기 위해 선택되었다 [18]. 이어서 본 발명자들은 근절 구조, 태아 유전자 프로그램의 발현, 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 및 트로포닌의 분비, 세포 크기 및 수축력에서의 변화를 분석함으로써 인간 ESC-유래 CM에서의 변화가 생체내에서 기재된 변화와 일치하는지 여부를 평가하였다.
공초점 현미경검사에 의한 α-액티닌, 액틴, 심장 트로포닌 T 및 코넥신 43의 분석은 ISO를 사용한 만성 처리가 비처리 바이오와이어 대조군과 비교하여 근절 구조의 실질적 파괴를 유발하였음을 밝혀내었다 (도 82B). Et-1 및 AngII를 사용한 처리도 또한, ISO보다 낮은 정도이기는 하지만, α-액티닌 염색을 통해 제시되는 바와 같이 조직화된 근원섬유 줄무늬 패턴의 파괴로 이어졌다 (도 82B). 투과 전자 현미경검사 분석 (도 82C)은, 비처리 대조군과 비교하여 ISO, Et-1 및 AngII를 사용하여 처리한 hESC-CM에서 특유한 Z-디스크의 유의한 부재 및 규정된 근절 구조의 결여에 의해 예시되는 바와 같은, 인간 CM 수축 기구에서의 이들 분자의 파괴 효과를 확인시켜주었다.
만성 약물 노출은 심장에 대한 유해 효과와 함께 태아 유전자 프로그램, 특히 BNP 및 심방 나트륨이뇨 인자 (ANF)의 유도로 이어질 수 있다. 본 발명자들의 샘플에서 태아 유전자 프로그램의 발현의 분석은 ISO를 사용한 처리가 비처리 대조군과 비교하여 ANF 및 BNP 유전자 발현을 유의하게 유도하였지만 (도 84), AngII 및 Et-1을 사용한 처리에 의해서는 유전자 발현에서 어떠한 변화도 검출되지 않음을 보여주었다. 흥미롭게도, 초기 및 후기 시점에서의 처리된 세포의 조건화 배지의 분석은 ISO 및 Et-1 조건 하에서 처리후 제2일에 이미 BNP의 분비의 각각 2.5-배 및 5-배 증가를 나타내었다. 배지를 바꾼 후에, 배지 중 BNP의 수준을 제2일 및 제7일에 분석하였다. 단지 24시간 동안의 조건화에도 불구하고 (48시간 동안 조건화된 배지 중에서 BNP를 측정한 제2일 조건과 비교되는 바와 같이), 제7일에 ISO 및 Et-1-처리된 조건에서 각각 70% 및 7-배 증가를 검출하는 것이 여전히 가능하였다. AngII 조건으로부터 조건화 배지의 분석은 ELISA에서 BNP 및 AngII 사이의 교차 반응성으로 인해 가능하지 않았다.
세포 크기에서의 변화를 [8]에서와 같이 처리 말미에 바이오와이어의 해리에 의해 분석하였다. 이어서 단세포를 매트리겔-코팅된 웰 상에 물질 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 낮은 밀도로 시딩하고, CM 마커 심장 트로포닌 T를 사용한 염색 후에 면적 측정을 수행하였다. 처리된 조건에서 세포 크기가 증가하는 경향이 존재하였다. 세포 크기의 100% 증가가 ET-1로 처리된 세포에서 관찰되었고, ISO 및 AngII로 처리된 세포는 각각 35 및 38%의 크기 증가를 나타내었다.
다음으로, 본 발명자들은 각 조건에서 3D 인간 심장 조직의 수축력을 평가하였다. 바이오와이어 내 봉합사의 존재는 힘 측정을 허용하지 않기 때문에, 본 발명자들은 이전에 본 발명자들에 의해 개발되고 검증된, 3D 심장 조직의 수축력을 계산하기 위해 굴절가능한 포스트를 사용한 래트 신생아 심근세포를 사용하는 플랫폼을 사용하였다 [19]. 비처리 대조군과 비교하여 모든 조건에서 hESC-유래 CM 3D 조직의 수축력에서의 유의한 감소가 존재하였다 (도 86). 이는 도 87에서 관찰되는 수축 기구 조직화의 파괴와 상용가능하다. 생/사 염색을 사용한 3D 조직에서의 세포 생존율의 평가는 ISO 및 비처리 대조군 사이에 어떠한 차이도 없음을 밝혀내었다 (도 87). 배양 말미에서의 점 자극에 대해 평가된 전도 속도도 또한 ISO 및 비처리 대조군 사이에 동일하였다 (도 87). 또한, 배양 말미에 바이오와이어로부터 단리된 단세포로부터의 칼슘 과도의 분석은 ISO-처리 및 비처리 세포 둘 다 유사한 특징을 나타냄을 보여주었다.

Claims (94)

  1. 생물반응기에서 성숙한 심장 조직을 생성하는 방법이며, 여기서 생물반응기는
    내부에 시딩된 세포로부터 조직을 성장시키기 위해 구성된 웰을 갖고, 여기서 웰은 바닥을 갖는 것인 장치; 및
    센싱 요소와 웰의 바닥 사이에 갭이 있도록 웰을 가로질러 배치된 적어도 2개의 탄성 센싱 요소
    를 포함하고, 여기서 센싱 요소는 (a) 그 사이에 형성된 조직의 부착을 허용함으로써 웰의 바닥 상에 조직이 현수되도록 구성되고, (b) 센싱 요소에 대하여 조직에 의해 발휘된 수축력에 반응하여 변형됨으로써 조직 고유의 생리학적 환경을 시물레이션하고/하거나 수축력을 측정하도록 구성된 것이고,
    상기 방법은,
    (a) 복수개의 심근세포를 웰 내로 시딩하는 단계;
    (b) 복수개의 심근세포에 1 Hz의 전기 자극을 적용하는 단계; 및
    (c) 전기 자극을 6 Hz까지 서서히 매일 증가시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물반응기가 웰 당 2 내지 25개의 센싱 요소를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 생물반응기가 다중웰 플레이트인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 다중웰 플레이트가 6 웰, 12 웰, 24 웰, 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 센싱 요소가 합성물질 및 생물학적 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하며, 여기서 중합체가 분해성 또는 비분해성인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 중합체가
    폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산, 폴리(카프로락톤), 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시알칸산, 키토산, 히알루론산, 히드로겔, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 폴리(메틸메타크릴레이트) (PMMA), 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC), 시트르산 무함유 POMaC, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리우레탄, 실크, 나노제작 물질, 또는 그의 공중합체, 혼합 중합체 또는 조합
    중 적어도 하나인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 중합체가 POMaC인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 센싱 요소가 나노구조물로 도핑된 중합체를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 센싱 요소가 장 물질, 모노크릴, 폴리글리콜리드, 프롤렌, 폴리글락틴, 폴리디옥사논, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 센싱 요소가, 중합 반응 동안 기계적 특성이 가변가능한 중합체를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 센싱 요소가 다공성이어서 영양소 및 성장 인자를 심장 조직으로 전달하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 센싱 요소가 20 kPa 내지 0.5 MPa의 탄성을 갖는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 센싱 요소가 중합체 와이어인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 웰이 종축을 갖도록 구성된 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 센싱 요소가 웰의 종축에 대해 수직, 평행 또는 대각선인 배향을 갖는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 생물반응기가 생물반응기의 웰을 가로질러 전류를 생성하도록 구성된 전극을 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 복수개의 심근세포가 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체, 아가로스, 메틸셀룰로스 또는 히알루로난을 포함하는 히드로겔 내에 시딩되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 전기 자극이 하루에 0.83 Hz의 속도로 증가되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 전기 자극이 7일 동안 적용되는 것인 방법.
  20. 생물반응기에서 시험 작용제의 발암성을 검출하는 방법이며, 여기서 생물반응기는
    내부에 시딩된 세포로부터 조직을 성장시키기 위해 구성된 웰을 갖고, 여기서 웰은 바닥을 갖는 것인 장치; 및
    센싱 요소와 웰의 바닥 사이에 갭이 있도록 웰을 가로질러 배치된 적어도 2개의 탄성 센싱 요소
    를 포함하고, 여기서 센싱 요소는 (a) 그 사이에 형성된 조직의 부착을 허용함으로써 웰의 바닥 상에 조직이 현수되도록 구성되고, (b) 센싱 요소에 대하여 조직에 의해 발휘된 수축력에 반응하여 변형됨으로써 조직 고유의 생리학적 환경을 시물레이션하고/하거나 수축력을 측정하도록 구성된 것이고,
    상기 방법은,
    (a) 상기 조직을 시험 작용제와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 조직 내의 세포를 형질전환된 표현형에 대해 스크리닝하는 단계이며, 여기서 형질전환된 표현형의 존재가 시험 작용제의 발암성을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 (b)가 유전자 발현 또는 단백질 수준에서의 변화를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 단계 (b)가 세포 표면 마커의 발현에서의 증식 및 변화를 야기하는 비정상 세포 주기를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 생물반응기가 웰 당 2 내지 25개의 센싱 요소를 포함하는 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 생물반응기가 다중웰 플레이트인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 다중웰 플레이트가 6 웰, 12 웰, 24 웰, 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰을 포함하는 것인 방법.
  26. 제20항에 있어서, 센싱 요소가 합성물질 및 생물학적 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하며, 여기서 중합체가 분해성 또는 비분해성인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 중합체가
    폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산, 폴리(카프로락톤), 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시알칸산, 키토산, 히알루론산, 히드로겔, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 폴리(메틸메타크릴레이트) (PMMA), 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC), 시트르산 무함유 POMaC, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리우레탄, 실크, 나노제작 물질, 또는 그의 공중합체, 혼합 중합체 또는 조합
    중 적어도 하나인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 중합체가 POMaC인 방법.
  29. 제20항에 있어서, 센싱 요소가 나노구조물로 도핑된 중합체를 포함하는 것인 방법.
  30. 제20항에 있어서, 센싱 요소가 장 물질, 모노크릴, 폴리글리콜리드, 프롤렌, 폴리글락틴, 폴리디옥사논, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  31. 제20항에 있어서, 센싱 요소가, 중합 반응 동안 기계적 특성이 가변가능한 중합체를 포함하는 것인 방법.
  32. 제20항에 있어서, 센싱 요소가 다공성이어서 영양소 및 성장 인자를 조직으로 전달하는 것인 방법.
  33. 제20항에 있어서, 센싱 요소가 20 kPa 내지 0.5 MPa의 탄성을 갖는 것인 방법.
  34. 제20항에 있어서, 센싱 요소가 중합체 와이어인 방법.
  35. 제20항에 있어서, 웰이 종축을 갖도록 구성된 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 센싱 요소가 웰의 종축에 대해 수직, 평행 또는 대각선인 배향을 갖는 것인 방법.
  37. 제20항에 있어서, 생물반응기가 생물반응기의 웰을 가로질러 전류를 생성하도록 구성된 전극을 추가로 포함하는 것인 방법.
  38. 제20항에 있어서, 세포가 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체, 아가로스, 메틸셀룰로스 또는 히알루로난을 포함하는 히드로겔 내에 시딩되는 것인 방법.
  39. 제20항에 있어서, 조직이 심장 조직인 방법.
  40. (i) 내부에 시딩된 세포로부터 이환 조직을 성장시키기 위해 구성된 웰을 갖고, 여기서 웰은 바닥을 갖는 것인 장치; 및
    센싱 요소와 웰의 바닥 사이에 갭이 있도록 웰을 가로질러 배치된 적어도 2개의 탄성 센싱 요소
    를 포함하는 생물반응기이며, 여기서 센싱 요소는 (a) 그 사이에 형성된 이환 조직의 부착을 허용함으로써 웰의 바닥 상에 이환 조직이 현수되도록 구성되고, (b) 센싱 요소에 대하여 이환 조직에 의해 발휘된 수축력에 반응하여 변형됨으로써 이환 조직 고유의 생리학적 환경을 시물레이션하고/하거나 수축력을 측정하도록 구성된 것인 생물반응기; 및
    (ii) 생물반응기에서 성장한 이환 조직
    을 포함하는 질환 모델 개발 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 이환 조직이, 건강한 조직을 세포 손상을 유발할 수 있는 작용제와 접촉시킴으로써 유도되는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  42. 제40항에 있어서, 세포가 기존의 상태를 갖는 공여자로부터 수거되는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  43. 제40항에 있어서, 생물반응기가 웰 당 2 내지 25개의 센싱 요소를 포함하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  44. 제40항에 있어서, 생물반응기가 다중웰 플레이트인 질환 모델 개발 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 다중웰 플레이트가 6 웰, 12 웰, 24 웰, 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰을 포함하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  46. 제40항에 있어서, 센싱 요소가 합성물질 및 생물학적 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하며, 여기서 중합체가 분해성 또는 비분해성인 질환 모델 개발 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 중합체가
    폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산, 폴리(카프로락톤), 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시알칸산, 키토산, 히알루론산, 히드로겔, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 폴리(메틸메타크릴레이트) (PMMA), 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC), 시트르산 무함유 POMaC, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리우레탄, 실크, 나노제작 물질, 또는 그의 공중합체, 혼합 중합체 또는 조합
    중 적어도 하나인 질환 모델 개발 시스템.
  48. 제47항에 있어서, 중합체가 POMaC인 질환 모델 개발 시스템.
  49. 제40항에 있어서, 센싱 요소가 나노구조물로 도핑된 중합체를 포함하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  50. 제40항에 있어서, 센싱 요소가 장 물질, 모노크릴, 폴리글리콜리드, 프롤렌, 폴리글락틴, 폴리디옥사논, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  51. 제40항에 있어서, 센싱 요소가, 중합 반응 동안 기계적 특성이 가변가능한 중합체를 포함하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  52. 제40항에 있어서, 센싱 요소가 다공성이어서 영양소 및 성장 인자를 이환 조직으로 전달하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  53. 제40항에 있어서, 센싱 요소가 20 kPa 내지 0.5 MPa의 탄성을 갖는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  54. 제40항에 있어서, 센싱 요소가 중합체 와이어인 질환 모델 개발 시스템.
  55. 제40항에 있어서, 웰이 종축을 갖도록 구성된 것인 질환 모델 개발 시스템.
  56. 제55항에 있어서, 센싱 요소가 웰의 종축에 대해 수직, 평행 또는 대각선인 배향을 갖는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  57. 제40항에 있어서, 생물반응기가 생물반응기의 웰을 가로질러 전류를 생성하도록 구성된 전극을 추가로 포함하는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  58. 제40항에 있어서, 세포가 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체, 아가로스, 메틸셀룰로스 또는 히알루로난을 포함하는 히드로겔 내에 시딩되는 것인 질환 모델 개발 시스템.
  59. (i) 기존의 상태를 가진 공여자로부터 수거한 복수개의 이환 세포를 생물반응기 내로 시딩하는 단계이며, 여기서 생물반응기는
    내부에 시딩된 복수개의 이환 세포로부터 이환 조직을 성장시키기 위해 구성된 웰을 갖고, 여기서 웰은 바닥을 갖는 것인 장치; 및
    센싱 요소와 웰의 바닥 사이에 갭이 있도록 웰을 가로질러 배치된 적어도 2개의 탄성 센싱 요소
    를 포함하고, 여기서 센싱 요소는 (a) 그 사이에 형성된 이환 조직의 부착을 허용함으로써 웰의 바닥 상에 이환 조직이 현수되도록 구성되고, (b) 센싱 요소에 대하여 이환 조직에 의해 발휘된 수축력에 반응하여 변형됨으로써 이환 조직 고유의 생리학적 환경을 시물레이션하고/하거나 수축력을 측정하도록 구성된 것인 단계; 및
    (ii) 복수개의 이환 세포를 배양하여 이환 조직을 형성하는 단계
    를 포함하는, 질환 모델을 개발하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 생물반응기가 웰 당 2 내지 25개의 센싱 요소를 포함하는 것인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 생물반응기가 다중웰 플레이트인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 다중웰 플레이트가 6 웰, 12 웰, 24 웰, 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰을 포함하는 것인 방법.
  63. 제59항에 있어서, 센싱 요소가 합성물질 및 생물학적 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하며, 여기서 중합체가 분해성 또는 비분해성인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 중합체가
    폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산, 폴리(카프로락톤), 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시알칸산, 키토산, 히알루론산, 히드로겔, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 폴리(메틸메타크릴레이트) (PMMA), 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC), 시트르산 무함유 POMaC, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리우레탄, 실크, 나노제작 물질, 또는 그의 공중합체, 혼합 중합체 또는 조합
    중 적어도 하나인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 중합체가 POMaC인 방법.
  66. 제59항에 있어서, 센싱 요소가 나노구조물로 도핑된 중합체를 포함하는 것인 방법.
  67. 제59항에 있어서, 센싱 요소가 장 물질, 모노크릴, 폴리글리콜리드, 프롤렌, 폴리글락틴, 폴리디옥사논, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  68. 제59항에 있어서, 센싱 요소가, 중합 반응 동안 기계적 특성이 가변가능한 중합체를 포함하는 것인 방법.
  69. 제59항에 있어서, 센싱 요소가 다공성이어서 영양소 및 성장 인자를 이환 조직으로 전달하는 것인 방법.
  70. 제59항에 있어서, 센싱 요소가 20 kPa 내지 0.5 MPa의 탄성을 갖는 것인 방법.
  71. 제59항에 있어서, 센싱 요소가 중합체 와이어인 방법.
  72. 제59항에 있어서, 웰이 종축을 갖도록 구성된 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 센싱 요소가 웰의 종축에 대해 수직, 평행 또는 대각선인 배향을 갖는 것인 방법.
  74. 제59항에 있어서, 생물반응기가 생물반응기의 웰을 가로질러 전류를 생성하도록 구성된 전극을 추가로 포함하는 것인 방법.
  75. 제59항에 있어서, 복수개의 이환 세포가 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체, 아가로스, 메틸셀룰로스 또는 히알루로난을 포함하는 히드로겔 내에 시딩되는 것인 방법.
  76. (i) 복수개의 건강한 세포를 생물반응기 내로 시딩하는 단계이며, 여기서 생물반응기는
    내부에 시딩된 복수개의 건강한 세포로부터 건강한 조직을 성장시키기 위해 구성된 웰을 갖고, 여기서 웰은 바닥을 갖는 것인 장치; 및
    센싱 요소와 웰의 바닥 사이에 갭이 있도록 웰을 가로질러 배치된 적어도 2개의 탄성 센싱 요소
    를 포함하고, 여기서 센싱 요소는 (a) 그 사이에 형성된 건강한 조직의 부착을 허용함으로써 웰의 바닥 상에 건강한 조직이 현수되도록 구성되고, (b) 센싱 요소에 대하여 건강한 조직에 의해 발휘된 수축력에 반응하여 변형됨으로써 건강한 조직 고유의 생리학적 환경을 시물레이션하고/하거나 수축력을 측정하도록 구성된 것인 단계;
    (ii) 복수개의 건강한 세포를 배양하여 건강한 조직을 형성하는 단계; 및
    (iii) 건강한 조직을 세포 손상을 유발할 수 있는 작용제와 접촉시키거나 또는 재조합 기술을 통해 건강한 조직에서 질환 상태를 유도하는 단계
    를 포함하는, 질환 모델을 개발하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 작용제가 독소, 돌연변이유발원, 방사선, 감염원 또는 화학적 작용제인 방법.
  78. 제76항에 있어서, 재조합 기술이 세포 내에 트랜스진을 삽입하거나 또는 관심 유전자의 유전자 발현을 녹아웃시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  79. 제76항에 있어서, 생물반응기가 웰 당 2 내지 25개의 센싱 요소를 포함하는 것인 방법.
  80. 제76항에 있어서, 생물반응기가 다중웰 플레이트인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 다중웰 플레이트가 6 웰, 12 웰, 24 웰, 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰을 포함하는 것인 방법.
  82. 제76항에 있어서, 센싱 요소가 합성물질 및 생물학적 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하며, 여기서 중합체가 분해성 또는 비분해성인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 중합체가
    폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산, 폴리(카프로락톤), 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시알칸산, 키토산, 히알루론산, 히드로겔, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(L-락티드) (PLA), 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 폴리(메틸메타크릴레이트) (PMMA), 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리(옥타메틸렌 말레에이트 (무수물) 시트레이트) (POMaC), 시트르산 무함유 POMaC, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리우레탄, 실크, 나노제작 물질, 또는 그의 공중합체, 혼합 중합체 또는 조합
    중 적어도 하나인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 중합체가 POMaC인 방법.
  85. 제76항에 있어서, 센싱 요소가 나노구조물로 도핑된 중합체를 포함하는 것인 방법.
  86. 제76항에 있어서, 센싱 요소가 장 물질, 모노크릴, 폴리글리콜리드, 프롤렌, 폴리글락틴, 폴리디옥사논, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  87. 제76항에 있어서, 센싱 요소가, 중합 반응 동안 기계적 특성이 가변가능한 중합체를 포함하는 것인 방법.
  88. 제76항에 있어서, 센싱 요소가 다공성이어서 영양소 및 성장 인자를 건강한 조직으로 전달하는 것인 방법.
  89. 제76항에 있어서, 센싱 요소가 20 kPa 내지 0.5 MPa의 탄성을 갖는 것인 방법.
  90. 제76항에 있어서, 센싱 요소가 중합체 와이어인 방법.
  91. 제76항에 있어서, 웰이 종축을 갖도록 구성된 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 센싱 요소가 웰의 종축에 대해 수직, 평행 또는 대각선인 배향을 갖는 것인 방법.
  93. 제76항에 있어서, 생물반응기가 생물반응기의 웰을 가로질러 전류를 생성하도록 구성된 전극을 추가로 포함하는 것인 방법.
  94. 제76항에 있어서, 복수개의 건강한 세포가 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체, 아가로스, 메틸셀룰로스 또는 히알루로난을 포함하는 히드로겔 내에 시딩되는 것인 방법.
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