KR102335524B1 - 뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 pten 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물 - Google Patents
뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 pten 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물에 관한 것으로 PTEN 유전자 이상에 의한 뇌종양 치료를 목적으로 인간의 뇌까지 전파될 수 있는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)에 PTEN 유전자를 포함하여, 이를 이용하는 경우 암세포에서 PTEN 단백질을 발현하여 뇌종양 세포 사멸을 통한 뇌종양 치료가 가능함을 확인하였다. 따라서 본 발명은 인간 PTEN 단백질 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스로서 뇌종양 세포에 감염되어 정상적인 PTEN 단백질을 발현하여 뇌종양 세포 사멸 또는 뇌종양 조직 축소를 통해 임상 증상 감소 도는 부분 관해 도는 완전 관해를 유도할 수 있는 치료용 바이러스 제제에 관한 것이다.
Description
본 발명은 뇌종양 치료를 위한 암용해바이러스(oncolytic virus) 개발 및 이를 이용한 치료 및 치료제에 대한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 벡터 기반 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자가 삽입된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료 조성물에 관한 것이다.
교묘세포종 또는 뇌종양은 뇌의 신경 아교 세포(glia, neuroglia, glial cell) 세포에서 유래하여 발생하는 가장 흔하고 심각한 증상의 암이다. 또한, 중추신경계에서 발생하는 심각한 암이기도 하다. 이러한 교묘세포종 또는 뇌종양에 사용되는 일반적인 치료법은 수술요법과 화학치료 또는 방사선 치료와 같은 방법을 병용으로 사용하고 있다. 환자에서 발생하는 가장 흔한 임상적 증상은 지속적인 두통, 구토, 부등상시, 미각 상실, 갑작스러운 성격 변화, 현기증, 뇌출혈 등 암 조직이 영향을 미치는 뇌 조직 부위에 따른 다양한 증상이 발생할 수 있다. 뇌 신생물 중 악성에 해당하는 75% 이상이 뇌종양 또는 교모세포종인 것으로 알려져 있다. 악성 뇌종양의 단계와 뇌종양의 모양은 glial 세포에서 유래되어 어떻게 어떤 형태로 뇌조직에 형성 여부에 영향을 받으며 이러한 이유로 인해 환자에 따른 효과적인 치료제가 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.
암용해바이러스(oncolytic virus) 치료는 암치료의 새로운 바이오의약품으로서 새로운 접근을 하고 있으며 실험과 임상 수준에서 상당한 발전을 이루고 있다. 최근에 바이러스 치료에 이용되는 oncolytic virus는 바이러스 자체가 oncolyitc 성질을 가지고 있는 것을 이용하는 방법과 암세포 특이적으로 작용하여 암세포 사멸 효과를 가지는 유전자를 삽입한 바이러스 또는 두 가지 방법 모두를 이용하고 있다.
이에, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)를 이용한 다양한 암치료 효과에 대한 연구가 진행되고 있다. NDV는 바이러스 자체적으로 암세포에서만 증식이 활발하게 일어나 암세포 사멸을 유도하는 oncolytic 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이는 정상세포에서 유도되는 인터페론 알파(interferon-α)가 암세포에서는 매우 약하게 또는 반응하지 않는 특성에 의해 oncolytic 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며 최근 연구에 따르면 특정 바이러스 단백질에 의한 암세포 면역반응 유도 및 세포사멸(apoptosis) 효과 증진에 따른 암세포 사멸 효과를 갖는 것으로 밝혀져 있다. NDV는 정상 세포에 감염되는 경우 감염된 세포에 의한 인터페론 알파에 의한 면역반응에 의해 쉽게 NDV 바이러스의 RNA 게놈이 파괴되어 증식하지 못하여 포유류 감염성이 없으며 바이러스에 의한 항체 형성도 되지 않는 것으로 밝혀져있다. 이러한 NDV의 특징은 바이러스를 이용한 암치료제로서의 장점이 될 수 있다. 1950년대 강독성(velogenic) NDV 바이러스 주를 이용한 암세포 사멸 효과를 시험하였으며 특정 경우에는 암환자를 대상으로 한 임상시험도 진행되었다. 여러 연구과 임상시험을 통해 NDV를 이용한 암 치료가 전망이 좋을 것이라는 여러 증거가 확보되었고, NDV는 정상적인 포유류 세포에는 감염되지 않을 뿐만 아니라 반복되는 NDV 접종에 의한 부작용 없이 암세포 사멸 효과나 암 조직 성장 저해 효과가 유지되며, 임상시험에서도 5년간 NDV 바이러스 접종으로 암환자가 5년이상 생존한 경우도 있었다. 그러나 강독성 NDV는 닭에 감염되는 치명적인 바이러스로서 양계 산업에 매우 위험한 바이러스로 강독성 바이러스로 암 치료제 개발에 한계가 발생하였다.
2000년대 많은 과학자들은 중간독(mesogenic) NDV 바이러스를 이용한 oncolytic 바이러스 개발을 시작하였다. 그러나 중간독 NDV 바이러스는 병원성이 줄어든 만큼 암세포 사멸 효과나 암 조직 성장 저해 효과등에서 강독주 NDV에 비해 효능이 떨어지는 것으로 확인되었다. 낮은 효능을 보이는 가장 큰 이유는 중간독 NDV 바이러스가 용원성(lysogenic) 바이러스와 같은 성격을 가지며 감염된 암세포에서 다른 암세포로 다시 재감염이 쉽게 일어나지 못하는 단점이 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고 뇌종양 치료에 NDV를 지속적으로 이용하고자 하는 가장 큰 장점은 NDV가 신경계 감염을 통해 뇌혈관막(Blood-Brain Barrier, BBB)를 통과하여 뇌까지 전파 감염될 수 있어 뇌종양 세포에 감염되어 뇌종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 큰 이유가 있기 때문이다. 이러한 중간독 NDV의 결점을 극복하기 위하여 다양한 암세포사멸과 암 조직 성장 억제 유전자를 포함하는 재조합 NDV가 개발되기 시작하였다. 암억제 유전자가 삽입된 재조합 NDV 바이러스는 기존의 중간독 NDV 바이러스에 비해 보다 좋은 효능을 보여주고 있으며 NDV에 관련된 다양한 연구를 통해 지속적인 발전을 이루고 있다.
한편, PTEN(Phophatase and tensin homolog)는 잘 알려진 암 억제 유전자로서 PIP3(Phospho-inositol triphosphate)의 3’ phosphate를 제거하여 PIP2(phospho-inositol biphosphate)로 전환시키는 효소이다. 이는 탈인산화(Dephosphorylation)을 통해 세포의 이동, 생존 세포 증식 등이 조절된다. 또한, PTEN 유전자의 결손이나 돌연변이에 의해 PTEN의 효소 활성이 없어져 암이 발생하는 동안 세포 사멸을 억제하고 세포 증식을 활발하게 촉진하는 것으로 알려져 있다. PTEN 유전자의 이상이 암 발생의 원인으로 알려진 것은 전립선암, 내배엽유래 암, 유방암, 폐암 등이 있으며 최근 뇌종양 환자의 50% 이상에서 PTEN 이상으로 인해 phosphatidylinositol 3-OH kinease 경로의 이상이 중요한 원인으로 밝혀지고 있다. PTEN의 약화된 탈인산화효소(phosphatase) 활성은 암 억제에 밀접한 관련이 있고 또한 세포 주기 조절, 증식 조절 등에 중요한 유전자이다. 따라서 본 발명은 재조합 NDV 바이러스에 뇌종양의 원인으로 알려져 있는 PTEN 유전자를 삽입하여 뇌종양에 대한 바이러스 치료제 개발을 위한 방법을 제공하기 위한 것으로, 더욱 구체적으로는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 벡터 기반 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자가 삽입된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 암 억제 유전자 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 바이러스를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 PTEN 유전자를 포함하며 이를 암세포 내에서 단백질로 발현 할 수 있는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
마지막으로, 본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 동물에서의 뇌종양 치료 효과를 평가하는 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 유효성분으로 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터에서, 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS 서열(GE(Gene end), IG(Intergenic sequence) 및 GS(Gene start)) 및 MCS(Multiple cloning site)로 이루어진 것인, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘벡터’는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘트랜스진 카세트(transgene cassette)’는 뉴캐슬병 바이러스의 NP 유전자와 P 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘LVP-K1 벡터’는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 kozak sequence를 더 포함하는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 LVP-K1 벡터에서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PTEN 유전자를 더 포함하는, LVP-K1-PTEN 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘벡터’는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘PTEN 유전자’는 NP와 P 유전자 사이에 도입된 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 LVP-K1-PTEN 벡터가 도입된 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC 14422BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 재조합 뉴캐슬병 바이러스로부터 정제된 항원을 더 포함하는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제9항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제9항의 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 뇌종양 예방 또는 치료 효과 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘방법’은 인간을 제외한 동물의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 것으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
마지막으로, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 뇌종양 발생 원인의 50% 이상으로 확인되고 있는 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 유전자 이상에 의한 뇌종양 치료를 목적으로 인간의 뇌까지 전파될 수 있는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)에 PTEN 유전자를 포함하여, 이를 이용하는 경우 암세포에서 PTEN 단백질을 발현하여 뇌종양 세포 사멸을 통한 뇌종양 치료가 가능함을 확인하였다. 따라서 상기 뇌종양 치료 효과를 위해 본 발명에서는 LVP-K1-PTEN oncolytic virus를 개발하여 안전하고, 효능이 뛰어난 뇌종양 치료제 개발을 완성하였고, 이는 뇌종양으로 인한 환자의 치료와 뇌종양 악화를 억제하여 뇌종양 치료에 기여할 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명의 NDV VG/GA strain을 cDNA로 합성하여 pBR322 벡터로의 삽입과정을 나타내며, 도 1b는 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 벡터의 유전자 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 바이러스 작출 후 바이러스의 확인, PTEN 유전자 확인, 벡시니아 바이러스의 제거 확인을 위한 RT-PCR 산물을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 PTEN mRNA의 상대적인 전사량을 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 4는 웨스턴 블랏(Western Blot)을 이용하여 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN, LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 상대적인 PTEN 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포의 사멸도를 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 6은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포의 세포 변성 효과(cytopathic effect)를 현미경을 통해 관찰한 도이다.
도 7은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 Xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 Xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 1일마다 그래프로 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 2는 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 바이러스 작출 후 바이러스의 확인, PTEN 유전자 확인, 벡시니아 바이러스의 제거 확인을 위한 RT-PCR 산물을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 PTEN mRNA의 상대적인 전사량을 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 4는 웨스턴 블랏(Western Blot)을 이용하여 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN, LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 상대적인 PTEN 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포의 사멸도를 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 6은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포의 세포 변성 효과(cytopathic effect)를 현미경을 통해 관찰한 도이다.
도 7은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 Xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 Xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 1일마다 그래프로 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 이로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w) %, 고체/액체는(w/v) %, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여보다 상세하게 설명하도록 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 유효성분으로 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
또한, 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS 서열(Gene end(GE), Intergenic sequence(IG), Gene start(GS)) 및 Multiple cloning site(MCS)로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)”는 약 15kb 정도 (-)sense RNA 게놈을 가지고 있는 paramyxovirus에 속하며 인체감염성 없는 포유류에 안전한 바이러스로 알려져 있다. NDV 게놈 RNA는 30 base 정도의 extragenic leader 서열을 가지고 있으며 50 base 정도의 tail 서열을 가지고 있다. 양쪽 말단의 두 서열은 바이러스의 유전자의 전사(transcription)와 복제 replication) 그리고 새롭게 합성된 RNA 게놈을 바이러스 파티클 안에 봉입(encapsidation) 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. NDV 유전자 구성은 양쪽 말단 리더와 꼬리 유전자 사이에 NP, P, M, F, HN 및 L을 포함하는 6개의 유전자로 구성되어 있으며 각각의 유전자는 nucleoprotein(NP), phosphoprotein(P), matrix protein(M), fusion protein(F), hemagglutinin-neuraminidase protein(HN), large protein(L)을 암호화하고 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 각각의 유전자 사이에 IGS(GE-IG-GS) 서열이 존재하고 있으며 숙주세포 감염 초기 각각의 유전자는 전사과정을 거쳐 숙주세포의 소포체(endoplasmic reticulum, ER)으로 이동 단백질을 합성하게 된다. 이후 M protein 합성량이 일정 수준 이상으로 올라가게 되면 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 하여 (-)sense RNA 게놈을 합성하게 된다. 완성된 바이러스 파티클은 세포 밖으로 배출되게 된다.
상기 뉴캐슬병 바이러스의 외부 유전자 도입 능력은 최대 6 kb 정도인 것으로 알려져 있으며 외래 유전자 도입은 주로 P과 M 유전자 사이 그리고 HN과 L 유전자 사이에 이루어져 왔다. 다만 6개의 유전자 사이에 외래유전자 도입이 모두 가능한 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 mRNA 발현, 단백질 발현 그리고 심한 경우 바이러스 증식에도 영향이 있는 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 정량적인 비교 시험은 이루어지지 않은 상태이다. 각각의 유전자 사이에는 GE-IG-GS 유전자가 있으며 특히 IG 유전자의 경우 NP-P, P-M, M-F 사이에는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 가지고 있으며 F-HN 사이는 35개, HN-L 사이는 47개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 바이러스 감염 후 (-)sense RNA 게놈은 NDV가 보유하고 있는 NP, P, 및 L 단백질에 의해 감염 초기 각 단백질의 mRNA를 합성하여 합성된 mRNA가 숙주 세포의 소포체로 이동하여 각 유전자의 단백질을 합성하게 된다. 이후 NP, P, L 단백과 M 단백의 상호작용에 의해 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 많은 copy의 (-)sense RNA 게놈을 합성하고 숙주세포 밖으로 방출되게 된다. 최초 감염시 자가 단백질 생산을 위한 mRNA의 합성량은 N 말단, 즉 NP mRNA가 가장 많이 합성되고 이후 N 말단으로부터 멀어질수록 mRNA 합성은 줄어드는 것으로 알려져 있다.
뉴캐슬병 바이러스의 cDNA 구축에는 NDV (-)sense RNA 게놈을 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)법을 통해 여러 조각의 double strand DNA로 만든 이후 각각의 조각을 다시 ligation 하여 전체 NDV의 cDNA clone을 만드는 방법이 사용되고 있다. 이 방법을 이용한 cDNA 작성은 reverse transcriptase의 특성상 point mutation이 일어날 가능성이 높아 cDNA를 다 작성한 이후에 sequencing을 통해 15 kb에 달하는 유전자 서열을 확인하고 하나 이상의 point mutation 이 발생하면 다시 NDV 게놈으로부터 cDNA를 만드는 과정을 반복해야 한다. cDNA 조각을 pBR322 벡터에 삽입하여 recombinant NDV를 구축한다.
또한, 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 통해 항원 단백질이 발현 또는 작동할 수 있도록 외래 유전자 삽입 가능한 위치에 쉽게 외래유전자를 도입할 수 있도록 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 만들어 삽입하였다. 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 외래 유전자 삽입위치 N말단 앞쪽에 GE-IG-GS sequence 및 multi cloning site(MCS)로 구성되어 있으며, 다양한 제한효소(restriction enzyme) 서열과 함께 rule of six에 맞춰 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이, HN 및 L 유전자 사이에 삽입하여 제작할 수 있다. 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이에 삽입하는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 완벽하게 만들어진 recombinant NDV에 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 각 유전자 사이에 넣고 4조각의 DNA로 나누어 각각의 NDV 조각 유전자를 pBR322 plasmid DNA에 라이게이션(ligation) 후 TOP10 E.coli 에 형질전환(transformation)하여 4종의 재조합 균주로 제작 보관한 후 새로운 유전자 도입 시 각 재조합 E. coli 균주로부터 유전자를 분리하고 본 유전자를 PCR을 이용하여 fragment를 획득한 후 overlap cloning 방법을 통해 재조합 NDV 바이러스를 제작하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기와 같은 방법으로 제작된 벡터는 매번 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 만드는 과정 중에 발생하는 point mutation을 막아주며 multiple cloning site(MCS)를 통해 쉽게 외래 유전자를 NDV cDNA에 삽입할 수 있다는 특징이 있다.
또한, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
이어서, 본 발명은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 사람의 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공한다.
또한, PTEN 유전자는 뇌세포에서 암세포가 빠르게 성장하면서 포도당을 젖산으로 변환시키며 에너지 생산을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 일련의 대사과정에서 PTEN-PI3K-AKT-mTOR 신호 체계는 포도당 대사의 중심적인 역할을 하게 되는데 포도당 흡수 및 운반 지질생성 유도 단백질 합성에서 당화로 인한 ATP 소비 증가 등에 관련되어 있으며 PTEN 유전자 이상으로 인한 일련의 대사과정이 암세포 성장과 밀접한 관련이 있는 것으로 연구되고 있다. 이러한 PTEN 유전자 정보(Gene ID: NCBI Reference Sequence: NG_007466.2)를 바탕으로 확립된 유전자이다.
또한, 상기 PTEN 단백질은 사람의 다양한 기관의 세포에서 발현되는 단백질을 말하며, 바람직하게는 Glial cell에서 발현되는 PTEN 단백질 일 수 있고 정확한 아미노산 서열은 서열번호 4에 의해 나열된 서열일 수 있다.
PTEN 단백질을 코딩하는 유전자 확보를 위한 방법은 유전자 합성기기를 이용하여 인공적으로 합성하거나, 사람 세포에 존재하는 PTEN 유전자로부터 상보적 결합이 가능한 primer를 이용하여 polymerase chain reaction(PCR) 방법을 이용할 수 있다. 발현 시스템에 따라 코돈(codon)최적화로 인하여 사람의 PTEN 단백질을 코딩하는 유전자와 상이함이 있을 수 있어 재조합 PTEN을 코딩하는 유전자는 PTEN 단백질의 아미노산 잔기를 포함하는 다양한 염기서열 형태로 존재할 수 있다.
상기 PTEN 단백질의 유전자가 도입되는 숙주세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있으며, 도입되는 PTEN 단백질의 발현율이 높은 세포라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 예를 들어, 대장균, 포유류 세포주, 곤충 세포주, 진균, 효모, 재조합 바이러스와 같은 진핵 및 원핵 숙주 등이 있다.
또한, PTEN 단백질의 발현은 단순한 subunit 단백질로 발현될 수 있고 또는 특정한 바이러스 또는 바이러스의 표면에 결합하여 외부로 노출되는 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는 바이러스에 의해 유전자가 숙주세포에 전달되어 세포주에서 발현되는 경우이며 바람직하게는 바이러스로 인해 전달된 PTEN 단백질의 정상적인 세포내 발현과 기능적인 활성이 유진되는 발현이 될 것이다.
상기 PTEN 단백질의 발현을 위한 바이러스로서는 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 벡시니아 바이러스(Vaccinia virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno associated virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 센다이 바이러스(Sendai virus), 폭스바이러스(Poxvirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 알파바이러스(Alphavirus)와 같이 외래 유전자 도입을 통해 단백질을 발현 할 수 있고, 높은 안정성, 높은 발현 능력 및 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 바이러스이면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 바람직하게는 피막 바이러스(enveloped virus)로서 폭스바이러스(Poxvirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 알파바이러스(alphavirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)가 될 수 있다. 더욱 바람직하게는 인체 감염성이 없는 안전한 바이러스이며 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)일 수 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 닭에게 감염되어 신경증상 및 호흡기 증상 등을 일으키는 법정 전염병으로 닭에게는 매우 치명적인 바이러스로 이러한 병원성에 따라 강병원성(velogenic), 약병원성(mesogenic), 비병원성(lentogenic)으로 나뉘며, 모두 PTEN 유전자 전달 바이러스 벡터 백신 제조에 모두 사용이 가능하나 바람직하게는 약병원성, 비병원성 바이러스가 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 비병원성 바이러스주를 이용한 재조합 바이러스가 될 것이다.
상기 PTEN 유전자를 발현하는 트랜스진 카세트(transgene cassette)와 MCS 그리고 NDV 바이러스주의 NP, P 유전자는 PTEN 단백질 유전자가 뇌종양 세포에 재조합 NDV를 통해 전달되어 정상적인 단백질로 발현 암세포 증식 억제, 사멸 효과 등을 발휘하는데 고안된 유전자 또는 유전자 조합이다. 따라서 NP 단백질로부터 트랜스진 카세트(transgene cassette), PTEN 유전자 그리고 P 유전자까지의 전체적인 조합은 기능적으로 PTEN 단백질 유전자의 전달 발현 기능적 활성에 최적의 염기서열을 제공한다. 이와 동일한 기능적 활성을 가지고 있는 다양한 염기서열이 가능할 것이며 바람직하게는 70% 이상의 동일한 염기서열일 것이다. 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일한 염기서열일 것이며 가장 바람직하게는 90% 이상의 기능적 활성을 가지는 염기서열일 것이다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC14496BP)는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 LVP-K1-PTEN 벡터가 도입된 것일 수 있으며, 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 정제된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 상술한 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 약학 조성물은 면역증강물질 또는 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 면역증강물질 또는 아쥬반트(adjuvant)는 암세포 면역 면역반응의 유도에 의한 치료 효과에 도움을 줄 수 있는 물질이 될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC14496BP)는 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 체내 흡수가 용이한 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다. 액체 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료용 바이러스에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 사람에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
바이러스 안정성 및 치료제로서의 안전성을 필요한 기술 분야는 당업자에게 공지되어 있으며 단백질, 당 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자 등이 사용될 수 있다. 추가될 수 있는 조성물로는 안정제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 투여 경로에 따라 바이러스는 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 치료용 바이러스는 암 조직에 직접 주사하거나 경구, 근육, 피하, 정맥 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 정맥 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 "개체"는 질병의 치료 및 증상의 완화에 대한 조절 또는 치료 방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌종양 세포의 증식 억제 또는 사멸 그리고 뇌종양 조직의 감소 증가 지연 등의 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌종양에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
나아가, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN은 통상의 바이러스 작출 방법을 통해 회수할 수 있다. PTEN 단백질 발현을 위한 감염성 클론 cDNA 서열번호 2를 제작 완료한 후 3종의 helper plasmid(NP, P, L), modified vaccina virus(MVA/T7)를 HEp-2 세포주에 주입하여 배양한 후 재조합 바이러스를 회수하는 절차는 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 세포주에 주입방법은 lipofectamine 3,000을 이용한 transfection을 실시하였으며 세포주는 HEp-2 cell을 이용하였다. 3~4일 배양 후 재조합 바이러스를 회수하여 8에서 10일령 SPF 유정란 allantoic cavity에 접종하여 바이러스를 배양한 후 allantoic fluid를 회수하여 다시 같은 방법으로 유정란에 blind passage를 최소 2대 이상 배양하여 바이러스 역가를 높이는 작업을 수행하였다. 이후 allantoic fluid로부터 통상의 정제 방법을 통해 정제한 후 적절한 세포주로 선정된 Vero 76 세포에서 배양하여 실험에 사용하였다. 상기 재조합 바이러스주 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 바이러스의 PTEN 단백질 발현 확인을 위한 방법은 Reverse transcription PCR 방법을 이용하여 PTEN 단백질의 유전자 안정성(도 2)과 mRNA 발현 및 Western blotting을 이용하여 PTEN 단백 발현을 확인하였으며 Western blot을 수행하기 이전에 바이러스 정제를 수행한다.
재조합 바이러스 배양액을 harvest 후 원심분리하여 clarification을 진행한다. Clarification은 원심분리나 micro filtration 방법을 사용할 수 있다. 원심분리 조건은 10,000 g, 10 분, 4 ℃ 조건에서 실행하여 supernatant를 다음 정제 과정에 사용할 수 있다. Micro filtration의 경우 filter의 pore size는 1.0 ㎛ 에서 0.2 ㎛ 사이의 filter를 사용할 수 있으며 바람직하게는 0.45 ㎛ pore size filter를 사용할 수 있다. Filtration 방법은 dead end filtration이나 cross flow filtration 방법을 사용할 수 있으며 두 방법 모두 적용 가능하다. 재조합 바이러스 정제는 크로마토그래피나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 친화성, 이온 교환, 크기별 배제 그리고 소수성 등의 결합력 차이를 통해 적절한 resin과 buffer의 조합을 통해 바이러스 정제가 가능하다. 통상적으로 바이러스 정제는 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 TNE buffer에 재부유하여 다음 공정에 사용한다. 재조합 바이러스는 양이온 교환수지 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였으며 샘플 loading 후 sodium chloride 농도 구배를 통해 특정 농도에서 추출되는 fraction을 회수하였다. 회수된 fraction은 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 주사용 생리식염수에 재부유하여 다음 공정에 사용한다.
또한, 본 발명은 사람의 뇌종양에 대한 치료 효과를 유도하기 위해 상기 바이러스 조성물의 치료 유효량을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 뇌종양 치료 유도법을 제공한다.
또한, 상기 치료 효과는 뇌종양으로 인한 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 뇌종양 세포의 혈액 또는 체액 또는 기관의 샘플에서 낮은 뇌종양 세포수의 차이나 뇌종양 조직의 감소, 뇌종양 세포의 사멸에 의해 입증된다.
또한, 치료제의 유효량은 치료 효과를 유도하여 사람에서 뇌종양에 의한 임상적 증상 감소 암세포의 감소 암 조직의 감소 등의 효과를 유도할 수 있는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 재조합 바이러스 조성물을 포함하는 치료제의 경우 정제된 바이러스의 양은 105.0 TCID50/ml 에서1011.0 TCID50/ml 일수 있다. 더 바람직하게는 108.0 TCID50/ml 에서 109.0 TCID50/ml 이상일 수 있다.
상기 치료 효과 유도법은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내 경로로 상기 조성물을 접종하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 이상의 조성물을 정맥 또는 암 조직에 직접 주사하는 것일 수 있다. 더 바람직하게는 정맥주사일 수 있다. 치료 효과에 따라 접종 횟수를 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 치료 효과 평가 방법을 제공한다.
또한, 상기 방법은 인간의 암세포주를 이용한 암세포 사멸 효과를 측정하는 것일 수 있다.
상기 암세포주는 뇌종양 유래 세포주일 수 있으며 바람직하게는 T98G 세포주일 수 있다. 이 외에도 환자 유래 암 세포주를 이용할 수 있으며 본 발명에서는 뇌종양 유래 세포주에만 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 LVP-K1-PTEN 바이러스를 뇌종양 세포를 이식한 마우스 즉 Xenograft 모델의 암 조직에 주사하여는 방법을 제공하는 것이다. 암 조직 생성 후 정맥 주사 또는 암 조직에 직접 주사하는 방법을 이용할 수 있으며 바이러스 주사로 인해 암 조직 완전 관해, 부분 관해 또는 축소 등의 효과를 측정 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> NDV VG/GA 주를 기본 backbone으로 한 재조합 NDV 바이러스 게놈 전사 벡터의 제조
NDV VG/GA는 약 15 kb 정도의 negative-sense 단일 가닥 RNA를 유전정보로 가지며 6개의 ORFs로 구성되어 있으며 바이러스의 구조를 이루는 단백질은 NP(nucleoprotein), P(phosphoprotein), M(matrix protein), F(fusion protein), HN(hemagglutinin-neuraminidase) 및 L(RNA-directed RNA polymerase) 유전자를 코딩한다. viral RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리(isolation) 후, 유전자에 특이적인 4쌍의 프라이머를 제작하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였다. 상기 유전자에 특이적인 5쌍의 프라이머는 표 1(본 발명의 cDNA 합성 후 pBR322 벡터로의 제한효소를 이용한 삽입과정 중 사용된 프라이머를 나타냄)에 나타내었다. RT-PCR은 42 ℃ 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃ 1분, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 1분의 반응을 총 30 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 반응하였으며, 네 조각의 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략은 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Restriction site |
| Fragment 1 (L2) | Forward | ACGCGTggtctcaggtttatatgcagggaa | MluⅠ |
| Reverse | TTAATTAAaccaaacaaagatttggtgaatg | PacⅠ | |
| Fragment 2 (L1) | Forward | ACTAGTtgagattctcaaggatgatggggt | SpeⅠ |
| Reverse | ACGCGTcgagtgcaagagactaatagtttt | MluⅠ | |
| Fragment 3 (F-HN) | Forward | GGCGCCattatcggtggtgtagctctcgg | Kas I |
| Reverse | ACTAGTaaagggacgattctgaattccccg | SpeⅠ | |
| Fragment 4 (P-M-F) | Forward | CCGCGGaaacagccaagagagaccgcagaa | SacⅡ |
| Reverse | GGCGCCaaccgggatccagaatcttctacccgt | Kas I | |
| Fragment 5 (NP-P) | Forward | GTTTAAACaccaaacagagaatccgtaagg | PmeⅠ |
| Reverse | CCGCGGctttgttgactcccctgttgttga | SacⅡ |
벡터의 재구성 효율을 높이기 위해 바람직하게는 low-copy-number plasmid인 modified pBR322 벡터로 인식부위와 절단부위가 상이한 PacⅠ과 PmeⅠ제한효소를 위치시켜 클로닝을 수행하였다. Modified pBR322 벡터는 바람직하게는 T7 RNA polymerase promoter의 통제 하에 있으며, NDV 게놈 말단에서 RNA를 분할하는데 사용되는 HDV(hepatitis delta virus) antigenome ribozyme과 T7 terminator 유전자에 의해 종결되도록 위치시켜 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 가능하게 하였다. 또한, NDV VG/GA strain의 완전한 게놈 서열을 포함시켜 정확하게 전사되도록 하였다.
이후, 하기 표 2(본 발명의 LVP-K1 벡터 제작을 위해 이용한 프라이머를 나타냄)와 표 3(본 발명의 LVP-K2 벡터 제작을 위해 이용한 프라이머를 나타냄)에 나타낸 바와 같이 네 조각으로 나뉘어 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략을 이용하여 NP 유전자와 P 유전자 사이에 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 도입 및 P 유전자와 M 유전자 사이에 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 도입하였다.
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Size (bp) |
| Fragment 1 (pBR322-NP) |
Forward | TTCTCGCTTCCGGCGGCATC | 5,036 |
| Reverse | CCGCTTCTACCCGTATTTTTTCTAAGCAGAGGAATTGGGATGACCTC | ||
| Fragment 2 (P-M) |
Forward | TACGGGTAGAAGCGGCCGCGGCCGGCCCCACACCCCACCCCTCAATCC | 2,938 |
| Reverse | CCGGGATCCAGAATCTTCTACCC | ||
| Fragment 3 (F-HN) |
Forward | GATTCTGGATCCCGGTTGGCG | 5,578 |
| Reverse | CCGCCATCACTTGACAGTTCC | ||
| Fragment 4 (L) |
Forward | GTCAAGTGATGGCGGAAGGG | 5,256 |
| Reverse | CGCCGGAAGCGAGAAGAATC |
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Size (bp) |
| Fragment 1 (pBR322-NP-P) |
Forward | TTCTCGCTTCCGGCGGCATC | 6,545 |
| Reverse | TTCTACCCGTATTTTTTCTTAAGTTTGCAGAGAGG | ||
| Fragment 2 (M-F) |
Forward | AAAATACGGGTAGAAGCGGCCGCCCAAGGTCCAACACCCCGAG | 3,728 |
| Reverse | GACGTCGCTAGCATCATCTAC | ||
| Fragment 3 (HN-L) |
Forward | GATGCTAGCGACGTCACATC | 3,245 |
| Reverse | CCGCCATCACTTGACAGTTCC | ||
| Fragment 4 (L) |
Forward | GTCAAGTGATGGCGGAAGGG | 5,626 |
| Reverse | CGCCGGAAGCGAGAAGAATC |
RNA-dependent RNA polymerase는 유전자 사이의 stop-start 메커니즘 IGS(GE-IG-GS)에 의해 순차적인 방식으로 전사를 시작한다. GS에서 전사의 재개시가 완전하지 않으므로 3' 말단에 위치한 mRNA의 전사 수준이 높다. 따라서 3' 말단 일수록 높은 mRNA 전사 수준을 보이며 5' 말단으로 갈수록 그 수준이 낮아진다. 그러므로 NP 유전자와 P 유전자 사이의 새로운 외부 유전자 삽입은 P 유전자와 M 유전자 및 HN 유전자와 L 유전자 사이에 비해 더 높은 수준의 mRNA 전사와 외부 단백 번역이 일어나므로 NP-P 사이의 유전자 삽입이 더 바람직하다고 할 수 있다.
상기 네 조각의 cDNA 절편은 말단 15 bp의 염기서열이 동일하며, 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS(GE-IG-GS) 서열 및 Multiple cloning site(MCS)로 이루어졌다. overlap cloning법을 이용해 NP 유전자와 P 유전자 사이(LVP-K1) 및 P 유전자와 M 유전자 사이(LVP-K2)에 삽입하여 외래 유전자 삽입용 LVP-K1(서열번호 1) 및 LVP-K2 벡터를 구축하였다.
<실시예 2> PTEN 유전자를 함유하는 재조합 NDV 바이러스 cDNA 제작
뉴캐슬병 바이러스(NDV) 바이러스 cDNA에 PTEN 단백질 유전자를 함유하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하였다.
LVP-K1(NP-MCS-P) 벡터는 Fse I 제한효소와 LVP-K2(P-MCS-M) 벡터는 Not I 제한효소로 필요한 PTEN 포함 DNA 절편을 얻어낸 후 준비된 NDV cDNA backborn의 NP와 P 유전자 사이(LVP-K1-PTEN 벡터) 그리고 P 유전자와 M 유전자 사이(LVP-K2-PTEN 벡터)에 삽입한다. 이후 완성된 plasmid는 전체 유전자 염기서열 분석을 통해 100% 일치함을 확인하였다.
<실시예 3> 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 작출
NDV 전사효소 복합체의 개별적인 클론(NP, P, L)을 pBR322 벡터로 클로닝 하여 helper plasmid로 이용하였다(pBR322-NP, pBR322-P 및 pBR322-L). 전날 6-well 플레이트에 5 × 105 cells/well로 HEp-2 세포를 준비 후 변형된 벡시니아 바이러스 (MVA-T7)를 1 MOI(Multiplicity of infection)로 감염시켰다. 상기 세포주에 T7 promoter에 의해 단백질이 발현되는 pBR322-NP, pBR322-P 및 pBR322-L Helper plasmid와 PTEN 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드인 LVP-K1-PTEN 또는 LVP-K2-PTEN 벡터를 각각 2.5 μg, 1.5 μg, 0.5 μg, 및 5 μg을 lipofectamine 3000(Invitrogen)과 적정비율로 혼합하여 형질전환 하였다. 이후 3일에서 4일간 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양 후 HEp-2 세포 상층액을 수확하였다. 이후 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종하였으며, 접종 4일 후 요막강액을 채취하였다.
이후, 백시니아 바이러스 제거를 위해 PBS를 이용하여 10-3으로 희석된 요막강액을 각각 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종 뒤 4일 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인 실험을 실시하였다. 바이러스 확인 실험은 요막강액을 Viral RNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리(isolation) 후, 추출한 RNA 5 ul와 하기 표 4(본 발명의 재조합 NDV 바이러스(LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN) 구축 확인에 필요한 프라이머)의 프라이머를 Forward 및 Reverse 각각 1 μl를 이용하여 ONE-STEP RT-PCR로 42 ℃에서 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃에서 1분, 60 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 반응을 총 35 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 수행하였으며 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, 백시니아 바이러스가 제거되고, 뉴캐슬병 바이러스 및 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 및 LVP-K2-PTEN 바이러스만 남아 있는 것을 확인하였다.
하기 표 5(PTEN 유전자를 LVP-K1 벡터에 삽입하기 위한 프라이머) 및 표 6(PTEN 유전자를 LVP-K2 벡터에 삽입하기 위한 프라이머)은 PTEN 유전자를 벡터에 삽입하기 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Size (bp) |
| NDV check | Forward | CCACAATTCCAAGATAACCGGAG | 327 |
| Reverse | GCTGCCACAATCAGATGCCTTTG | ||
| NP-PTEN-P check | Forward | AACAGATCACAAGGGCAACCG | 1,822 |
| Reverse | TGGTTTTCCCTGGGCCGTAATT | ||
| P-PTEN-M check |
Forward | GGCAAGCGGGCCTGATATAGG | 1,734 |
| Reverse | CTTCCCGTCCCCTGTGTCTTG | ||
| Vaccinia virus check | Forward | ATGACGATGAAAATGATGGTACATA | 1,059 |
| Reverse | CTCCAATACTACTGTAGTTGTAAGG |
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Size (bp) |
| Kozak PTEN (1st PCR) |
Forward | GCCACCATGACAGCCATCATCAAAG | 1,221 |
| Reverse | AGAAGCGGCCGCGGCCGGCCACCATGACAGCC | ||
| Fse I Kozak PTEN (2nd PCR) |
Forward | GCCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATG | 1,258 |
| Reverse | GTTGGACCTTGGTATGGCCGGCCTCAGACTTTTGTAATTTGTG |
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Size (bp) |
| Kozak PTEN (1st PCR) |
Forward | GCCACCATGACAGCCATCATCAAAG | 1,221 |
| Reverse | CGCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTA | ||
| Not I Kozak PTEN (2nd PCR) |
Forward | ATACGGGTAGAAGCGGCCGCCACCATGACAGCC | 1,254 |
| Reverse | TGGACCTTGGGCGGCCGCTCAGACTTTTGTAATTTG |
<실시예 4> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN 배양 및 정제
Vero 76 세포를 3 × 105 cells/mL로 배양 후 다음날 재조합 바이러스 0.05 MOI(Multiplicity of infection)를 접종 2일 후 가장 높은 역가의 바이러스 상층액을 얻었다. 이후, 바이러스 상층액은 부유물을 제거하기 위해 5,000 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하고 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액은 재조합 바이러스 농축을 위해 32,000 rpm 4 ℃에서 3 시간동안 초원심분리를 진행하였으며, 상층액을 제거 후 TNE buffer (10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA)로 재부유하였다. 농축된 바이러스는 30 ~ 60 % sucrose gradient 법을 이용해 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 동안 초원심분리를 진행하였다. 40 ~ 50 %에서 재조합 바이러스를 수득하였다. 마지막으로 수득한 재조합 바이러스를 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 초원심분리를 한번 더 진행하여 수크로스 (sucrose)를 제거하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 및 LVP-K2-PTEN을 정제하였다.
<실시예 5> T98G 세포 배양 및 Vero cell 배양
암세포 사멸효과를 확인하기 위해 T98G(CRL-1690™, ATCC) 뇌종양 세포를 이용하였다. T98G 세포의 배양은 다음과 같다. T98G 세포는 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Minimum Essential Medium(MEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여, 37 ℃ 배양기(5% CO2)에서 175T flask를 이용하여 배양하였다. 세포가 플라스크에 70 ~ 80 % monolayer를 형성하여 자라게 되면 1:4에서 1:6으로 subculture를 통해 세포를 유지한다. Seeding density는 2 ~ 4 × 104 cells/ml 정도로 한다. Vero cell(Vero 76 KCLB No. 21587)은 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10 % FBS를 포함하는 Minimum essential medium(MEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여 배양하였으며 175T Flask 플라스크를 이용하여 배양하였다. 세포가 70 ~ 80% 이상 monolayer를 형성하여 자라게 되면 subculture를 진행하여 유지한다. Vero cell의 split ratio는 1:8까지 가능하며 seeding density는 1×104 cells/ml 이다.
<실시예 6> Vero cell을 이용한 재조합 바이러스의 증식 확인
실시예 5에서 준비한 Vero cell을 이용하여 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스 및 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 바이러스의 증식에 대한 비교 실험을 실시하였다. 일반적으로 외래 유전자를 삽입한 바이러스의 경우 증식이 잘 되지 않는 현상이 자주 발생하여 PTEN 유전자를 삽입한 바이러스의 증식을 비교 확인하였다. 70 ~ 80% 이상 monolayer를 형성한 Vero 76 cell(175 T flask) 배양액을 제거한 후 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지를 10 ml을 플라스크에 넣고 조심해서 흔들어 세포를 세척한다. 이런 과정을 2~3회 반복하고 난 후 미리 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스 및 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 바이러스를 5 ml(1 MOI)을 플라스크에 넣고 37 ℃ incubator에서 10분 간격으로 흔들어 주며 1시간 동안 바이러스를 감작 시킨다. 이후 바이러스액을 제거하고 혈청이 없는 MEM 배지 10 ml을 플라스크에 넣어 남아있는 바이러스액을 제거한 후 다시 5% FBS가 첨가된 MEM 배지를 50 ml 씩 넣어주고 4시간 간격으로 각각의 플라스크에서 1 ml의 배양액을 채취하여 바이러스 역가를 TCID50 측정 방법으로 측정하였다.
<실시예 7> Vero cell에서 배양된 바이러스의 PTEN 유전자 확인
Vero cell에서 배양된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN이 Vero cell에서 배양되는 동안 PTEN 유전자 손실 없이 유지되는지 확인하기 위하여 7대 계대 배양된 바이러스를 PTEN 유전자 증폭을 위한 상기 표 4의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 유전자 확인을 하였다. 전기영동을 통해 획득한 유전자는 Sequencing 방법을 통해 PTEN 유전자임을 확인하였다.
<실시예 8> Real time qPCR 방법을 이용한 LVP-K1-PTEN 유전자의 mRNA 발현량 평가
미리 준비된 T98G 세포에 1 MOI로 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스 및 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 바이러스를 접종하고 하나의 플라스크는 어떤 바이러스도 접종하지 않고 6시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 모든 플라스크를 AccuPrep®Universal RNA extraction kit(바이오니아, 대전, 한국)를 이용하여 RNA를 확보한 후 하기 표 7(본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 PTEN mRNA의 상대적인 전사량을 나타내기 위한 프라이머와 프로브)의 primer와 probe를 첨가하여 real time PCR을 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 CT 값을 측정하여 mRNA의 발현량을 확인하였다. real time qPCR 조건은 다음과 같다. 42 ℃에서 10분, 95 ℃에서 2분간 반응한 후, 95 ℃에서 10초, 59.8 ℃에서 1분, 형광 수준 측정의 반응을 총 40 사이클 실시하였다. CFX Connect™ Real-Time System(cat. No. 1855201 Bio-Rad, USA)를 이용하였다.
| Gene | Direction | Sequence (5`→3`) | Size (bp) |
| PTEN Real-time |
Forward | TCCCAGTCAGAGGCGCTATGT | 152 |
| Reverse | GGCAGACCACAAACTGAGGA | ||
| Probe | TGCAAGTTCCGCCACTGAACA | - |
도 3에 나타낸 결과를 보면 PTEN 유전자를 가지고 있는 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종 샘플에서 mRNA 발현이 LVP-K1 바이러스 접종 그리고 바이러스가 접종되지 않은 T98G 세포주(대조군)에서 보다 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
<실시예 9> PTEN 단백질 western blotting을 통한 PTEN 단백질 발현량 비교
미리 준비된 T98G 세포에 세 가지 종류의 바이러스를 접종하고, 접종하지 않은 T98G 세포에서의 PTEN 단백질 발현을 비교하였다. 세 종류의 바이러스는 다음과 같다. LVP-K1-PTEN(PTEN 유전자를 NP와 P 유전자 사이에 삽입, 서열번호 2), LVP-K2-PTEN(PTEN 유전자를 P와 M 유전자 사이에 삽입), 그리고 PTEN 유전자를 삽입하지 않은 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스이다. Western blotting이 정량적인 단백질량을 정확히 평가할 수 없는 실험이나 상대적인 평가를 통해 단백질 발현량을 비교할 수 있다고 판단하여 실험을 실시하였다. 80% 이상 monolayer를 형성한 T98G 세포주에 실시예 6 또는 실시예 8에서와 같은 방법으로 titer 가 측정된 세 종류의 바이러스를 준비하여 MOI 1되게 접종한 후 9시간 후에 배양액 전체를 동결 해동을 3회 이상 반복한 후에 샘플을 채취하여 통상적인 SDS-PAGE(Gel 농도 12%) 방법을 통해 단백질을 분리하고 단백질은 transblottor(Thermo fisher)를 이용하여 PVDF membrane(25A, 15분)에 이송하였다. PVDF memebrane은 1% BSA 용액으로 blocking을 한 후 통상적인 western blotting 방법에 따라 실시하였다. PTEN에 특이적으로 결합하는 1차 항체는 PTEN 단클론 항체를 사용하였다(Cat No. ab32119, Abcam). 단백질 특이적인 발생 반응을 확인하기 위한 2차 항체는 anti-rabbit IgG goat horese peroxidase conjugate antibody(Invoitrogen)를 사용하였으며 항체 농도는 제조사의 권장량을 사용하였다. 2차 항체 반응 후 발색제로 ECL(Enhanced chemiluminescence, Bio-Rad) 용액을 적당량 넣고 발색이 되면 ChemiDoc™ MP Imaging System(Bio-Rad) 이용하여 단백을 확인하였다.
도 4의 결과에서 보듯이 바이러스 감염 후 PTEN 단백질 발현량은 PTEN 유전자가 NP와 P 유전자 사이에 삽입된 LVP-K1-PTEN 바이러스가 가장 선명하게 발색되어 다른 시험군 보다 많은 양의 단백질이 T98G 세포에서 발현되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 10> PTEN 유전자가 도입된 LVP-K1-PTEN 바이러스 감염으로 인한 뇌종양 세포 사멸 효과 확인
LVP-K1-PTEN 바이러스 감염으로 인한 뇌종양 세포 T98G 세포의 사멸 효과를 확인하기 위해 MTT assay 실험을 실시하였다. MTT assay 방법은 통상적인 MTT assay 방법에 따라 실시하였으며 자세한 실험과정을 기술한다. 96-well plate에 1개의 well당 1 × 104 개의 T98G 세포를 24시간동안 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Minimum Essential Medium(MEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여, 37 ℃ 배양기(5% CO2)에서 배양하고 LVP-K1-PTEN 바이러스와 LVP-K1 바이러스를 MOI가 0.1, 1, 2.5, 5가 되도록 감염시킨다. 결과의 신뢰성을 위해서, 같은 조건의 well을 4개씩 준비하여 진행하였다. 감염 후, 37 ℃ 배양기(5% CO2)에서 배양하고 감염 후 96시간 이후에 각각의 well에 20μl의 MTT 용액(CellTiter 96® AQueous One solution Cell Proliferation Assay, Bio-Rad, USA)를 첨가하고 1시간동안 배양기(5% CO2)에서 배양한다. iMark Microplate Reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 490nm의 파장을 가지는 빛의 흡광도를 측정하여 세포 사멸도를 측정한다.
그 결과 도 5에서 보는 것과 같이 MTT assay 결과 PTEN 유전자를 삽입한 바이러스가 PTEN 바이러스를 삽입하지 않은 바이러스보다 암세포 사멸 효과가 더 높게 나타났다. 특히 이러한 암세포 사멸 효과의 차이는 세포에 접종된 바이러스 농도가 낮을수록 차이를 보이는데 이는 재조합 NDV 바이러스인 LVP-K1 바이러스 역시 본래 oncolytic effect를 가지고 있어 높은 농도에서는 차이를 보이지 않으나 MOI 1 이하에서 PTEN 유전자를 삽입한 바이러스의 사멸 효과가 높은 것은 바이러스로 전달된 PTEN 유전자에 의해 암세포 내에서 정상적인 PTEN 단백질이 발현되고, 이러한 PTEN 단백질이 암세포의 자살(apoptosis) 효과를 높여 세포 사멸에 영향을 준 것으로 판단된다.
T98G 세포 배양액에 바이러스를 접종 후 현미경 관찰을 실험을 실시하여 세포변성 효과(cytopathic effect)에 관찰을 하였다. T98G 세포를 6 well plate에서 배양하여 90 % 이상 monolayer가 형성된 후 각각의 바이러스를 1 MOI로 접종하여 T98G 세포변성 효과를 현미경으로 관찰하였다. PTEN 유전자를 가지고 있는 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종 세포에서 PTEN 유전자가 없는 LVP-K1 바이러스 접종 세포보다 3시간 먼저 세포병변효과(CPE, Cytopathic effect)가 관찰되었으며 이후 18시간까지 관찰한 결과 더 빠른 세포병변효과가 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종 세포에서 관찰 되었다(도 6 참조).
<실시예 11> T98G 세포 이식 xenograft 모델 마우스를 이용한 LVP-K1-PTEN 바이러스의 암세포 증식 억제 효과 확인
Xenograft model을 이용하여 LVP-K1-PTEN 바이러스의 암 조직 성장 억제 효과를 측정하였다. 배양된 T98G 세포 6 × 106 cells 을 100 ul MEM 배지에 풀어 100 ul Matrigel(Corning)과 혼합하여 마우스 좌측 어깨 부위에 접종하였다. 사용된 마우스는 SPF female BALB/c 누드 마우스 14 ~ 19 g 정도의 20마리를 SLC(Japan)로부터 구입하여 무작위로 그룹당 4마리씩 구분하여 실험하였다. 각 실험 그룹은 PTEN 유전자가 도입된 LVP-K1-PTEN 바이러스를 꼬리 정맥과 암 조직에 직접 주사한 두 그룹 그리고 PTEN 유전자가 도입되지 않은 LVP-K1 바이러스를 꼬리정맥과 암 조직에 직접 주사한 두 그룹 그리고 PBS 접종 그룹(대조군)으로 하였다. 접종한 바이러스의 농도는 모두 108.0 TCID50/ml 이며 100 ul 씩 접종 하였다. 바이러스 접종은 암 조직 사이즈가 T98G 세포 접종 후 7일째 평균 120 ~ 150 mm3 도달했을 때부터 2일 간격으로 2회 접종하여 7일간 매일 암 조직 변화를 관찰하였다. 암 조직의 크기는 4π/3 × (가장 작은 직경/2)2 × (가장 큰 직경/2)2 공식을 통해 계산하였다.
표 8(본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소), 도 7, 도 8a, 및 도 8b을 통해 PTEN 유전자가 도입된 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종군에서 가장 빠르고 효과적으로 암 조직이 축소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이때 특이한 것은 일반적으로 암 조직에 직접 주사하는 경우가 정맥주사보다 더 좋은 효과를 보여주는 것으로 알려져 있으나, 본 실험 결과에서는 정맥주사를 통해서도 암 조직에 직접 주사하는 경우와 큰 차이 없이 암세포 증식을 저해할 수 있는 것으로 확인되었다.
결론적으로 포유류에서 면역반응을 일으키지 않고, 항체도 생성되지 않는 NDV 바이러스를 이용한 새로운 암치료용 바이러스 벡터 및 이를 이용한 바이러스의 제작을 통해 암세포 증식 억제 효과를 얻을 수 있음을 확인하였고, NDV 바이러스의 큰 단점이자 장점인 정상세포에서는 감염 즉시 선천 면역(innate immunity)에 의해 암세포에 도달하지 못하고 사라지는 NDV 바이러스가 많고, 또 정맥주사로 인한 희석 효과로 인해 기존에 사용해 오던 단순 재조합 바이러스가 아닌 암세포 증식 억제 효과, 세포자살 유도, 면역반응 유도등 다양한 유전자를 삽입하여 암세포에서 단백질로 발현되어 효능을 증가시키는 재조합 NDV 바이러스의 개발은 매우 중요한 과제이며 앞으로 추가적인 연구를 통해 더 많은 발전이 있어야 할 것이다.
본 발명은 뇌종양의 PTEN 유전자 돌연변이에 의한 정상적인 PTEN 단백질의 기능이 상실된 암세포에 oncolytic 기능을 어느 정도 가지고 있으며, 이에 PTEN 유전자를 추가 도입하고, 또 신경계를 따라 brain blood barrier를 통과할 수 있는 NDV 재조합 바이러스를 제작하고 이에 대한 효과가 개선되었음을 증명한 것이다.
기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> LIBENTECH Co.,LTD.
<120> Oncolytic recombinant newcastle disease virus contain PTEN gene
constructed by based on the Newcastle disease virus for
glioblastoma treatment and its composition
<130> PN2103-123
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LVP-K1
<400> 1
accaaacaga gaatccgtaa ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa 120
aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180
agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct 240
caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt 300
tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360
ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420
tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480
gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag 540
caacggtacc ccgttcgtca cagctggggt tgaagatgat gcaccagaag acattactga 600
taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg caaaggccat 660
gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca 720
aggcagggtc cagaagaagt acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac 780
aatcagacag tctctggcgg tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840
cacggcaggt gggacctcca cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag 900
gaacactggg ctaactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc 960
agcccttgca cttagcagcc tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt 1020
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat 1080
gagctttgca cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140
cctagataaa ggaactagca aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atatggccgc 1260
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc 1320
tgaggagacc agcagcatgg acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag 1380
cgacggaggc tcccaagccc cccaaggtgc actgaacaga tcacaagggc aaccggacac 1440
cggggatggg gagacccaat ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga 1500
agcgccaaac tctgcgcagg gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc 1560
tcaagacaat gacaccgact gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg 1620
tcatcccaat tcctctgctt agaaaaaata cgggtagaag cggccgcggc cggccccaca 1680
ccccacccct caatccgcaa tcccgcatgg ccaaacccac aaacgaaccc ccctgtctcc 1740
ctcctctccc ccagccccac aaccccacct gcccagggca acataggtac aatgcgaccc 1800
actaataatc aatacagggc caaagaaatt agaaaaaagt acgggtagaa gggagacatt 1860
cagagatcag ggcgagtcac ccgggtctct gctctccctt ctacctagtg gattaggatg 1920
gagatggcca cctttacaga tgcggagatc gacgagctat ttgagaccag tggaactgtc 1980
attgacagca taattacggc ccagggaaaa ccagtagaga ctgttggaag gagtgcaatc 2040
ccacaaggca aaactaaggc tttgagcgca gcatgggaga agcatgggag catccagtca 2100
ccagccagcc aagacacccc tgatcgacag gacagatcag ataaacaact gtccacaccc 2160
gagcaagcga gtccaaacga cagcccccca gccacatcca ctgaccagcc tcccactcag 2220
gctgcagatg aggccggcga tacacagctc aagaccggag caagcaactc tctgctgtcg 2280
atgcttgata aactcagcaa taagtcatct aatgctaaaa agggcccagg gtcgagccct 2340
caagaaaggc atcatcaacg tctgactcaa caacagggga gtcaacaaag ccgcggaaac 2400
agccaagaga gaccgcagaa ccaggccaag gccatccctg gaaaccaggt cacagacgcg 2460
aacacagcat atcatggaca atgggaggag tcacaactat cagctggtgc aacccatcat 2520
gctctccgat cagagcagag ccaagacaat actcctgcac ctgtggatca tgtccagcta 2580
cctgtcgact ttgtgcaggc gatgatgtct atgatggagg cgatatcaca gagggtaagt 2640
aaagttgact atcagctgga ccttgtcttg aaacagacat cttctatccc catgatgcgg 2700
tctgaaatcc agcagctgaa aacgtctgtt gcggtcatgg aagccaattt gggcatgatg 2760
aagatcctgg accctggttg tgccaacgtt tcatctctaa gtgatctacg ggcagttgcc 2820
cgatcccacc cggttttaat ttctggcccc ggagacccat ctccttatgt gacccaaggg 2880
ggcgaaatgg cactcaataa actttcgcaa ccggtgcaac acccctctga attgattaaa 2940
cccgccacgg caagcgggcc tgatatagga gtggagaaag acactgtccg tgcattgatc 3000
atgtcacgcc ctatgcatcc gagctcttca gctaggctct tgagcaaact ggacgcagcc 3060
ggatcgattg aggaaatcag aaaaatcaag cgccttgcac tgaatggcta atcaccaccg 3120
caacccgcag cagatccctg tccacccagc accacacggt atctgcacca agctcctctc 3180
tgcaaaccca aggtccaaca ccccgagcga caaccctgtc ctgcttcctc tgccccacta 3240
aatgatcgcg cagctgcaat caattcagct atattaagga ttaagaaaaa atacgggtag 3300
aatcggagtg ccccgattgt gccaagatgg actcatctag gacaatcggg ctgtactttg 3360
attctaccct tccttctagc aacctgctag cattcccgat agtcctacaa gacacagggg 3420
acgggaagaa gcaaatcgcc ccgcaataca ggatccagcg tcttgactcg tggacagaca 3480
gcaaagaaga ctcggtattc atcaccacct atggattcat ctttcaggtt gggaatgaag 3540
aagccactgt cggcatgatc aatgataatc ccaagcgcga gttactttcc actgccatgc 3600
tatgcctagg gagtgtacca aatgtcggag atcttgttga gctggcaagg gcctgcctca 3660
ctatggtggt aacatgcaag aagagtgcaa ctaacaccga gagaatggtc ttctcagtag 3720
tgcaggcacc ccaggtgctg caaagctgta gggttgtggc aaacaaatac tcgtcggtga 3780
atgcagtcaa gcacgtgaaa gcaccagaga agattcctgg gagcggaacc ctagagtaca 3840
aagtgaactt tgtctctctg accgtggtgc caagaaagga cgtctacaag ataccaactg 3900
cagcacttaa ggtctctggc tcaagtctgt acaatcttgc gctcaatgtc actattgatg 3960
tggaggtaga cccgaagagc ccgttggtca aatccctttc caagtccgac agtgggtact 4020
atgctaatct cttcttacat attgggctta tgtccactgt agataagaag gggaagaaag 4080
tgacatttga caagctggaa aggaagataa ggagacttga tctatctgta gggcttagtg 4140
acgtgctcgg accttccgtg cttgtaaagg cgagaggtgc acggactaag ctgctggcac 4200
ctttcttctc tagcagtggg acagcctgct atcccatagc aaatgcctct cctcaggtgg 4260
ccaagatact ctggagccaa accgcgtacc tgcggagtgt aaaagtcatt atccaagcgg 4320
gcacccagcg tgctgtcgca gtgaccgccg accacgaggt tacctctact aagctggaga 4380
aggggcatac cattgccaaa tacaatccct tcaagaaata ggctgcatct ctgagattgc 4440
actccgccca tcttcccgga tcaccatgac actaaataat gatctgtctt gattacttat 4500
agttagttcg cctgtctatc aaattagaaa aaacacgggt agaagattct ggatcccggt 4560
tggcgccttc aaggtgcaag atgggctcca gatcttctac caggatccca gtacctctta 4620
tgctgaccgt ccgagtcatg ttggcactga gttgcgtctg tccgaccagc gcccttgatg 4680
gcaggcctct tgcagctgca gggattgtgg taacaggaga caaagcagtc aacatataca 4740
cctcatctca gacagggtca atcataatca agttactccc aaatatgccc aaggataaag 4800
aggcgtgtgc aaaagccccg ttggaggcat acaacaggac attgactact ttgctcaccc 4860
cccttggtga ttctatccgt aggatacaag agtctgtgac cacgtccgga ggagggaaac 4920
agggacgtct tataggcgcc attatcggtg gtgtagctct cggggttgca accgctgcac 4980
agataacagc agcctcggct ctgatacaag ccaatcaaaa tgctgccaac atactccggc 5040
taaaagagag cattgctgca accaatgagg ctgtgcacga ggtcactaat ggattatcac 5100
aactagcagt ggcagttggg aagatgcagc aatttgttaa tgaccagttt aataaaacag 5160
ctcaggaatt ggactgtata aaaattacac agcaggttgg tgtagaactc aacctgtacc 5220
taactgaatt gactacagta ttcgggccac aaatcacttc ccctgcctta actcagctga 5280
ctatccaggc gctttacaat ctagctggtg ggaatatgga ttacttgttg actaagttag 5340
gtgtggggaa caaccaactc agctcattaa ttagtagtgg cctgatcacc ggcaacccta 5400
ttctgtacga ctcacagact caactcttgg gtatacaggt aaccctaccc tcagtcggga 5460
acctaaataa tatgcgtgcc acctacctgg aaaccttgtc tgtaagtaca accaaaggat 5520
ttgcctcagc acttgtccca aaagtagtga cacaggtcgg ttccgtgata gaagagcttg 5580
acacctcgta ctgtatagag accgatttgg atctatattg tacaagaata gtgacattcc 5640
ctatgtctcc tggtatttat tcctgtttga gtggcaatac atctgcttgc atgtactcaa 5700
agactgaagg cgcactcact acgccgtata tgaccctcaa aggctcagtt attgctaact 5760
gtaagatgac aacatgtaga tgtgcagacc ccccgggtat catatcgcaa aattatggag 5820
aagctgtgtc tctaatagat aggcaatcat gcaatatctt atccttagac gggataactt 5880
tgaggctcag tggggaattt gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata caagattctc 5940
aagtaatagt gacaggcaat cttgatatct cgactgagct tgggaatgtc aacaactcga 6000
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<210> 2
<211> 20314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LVP-K1-PTEN
<400> 2
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gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca 720
aggcagggtc cagaagaagt acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac 780
aatcagacag tctctggcgg tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840
cacggcaggt gggacctcca cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag 900
gaacactggg ctaactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc 960
agcccttgca cttagcagcc tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt 1020
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat 1080
gagctttgca cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140
cctagataaa ggaactagca aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atatggccgc 1260
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc 1320
tgaggagacc agcagcatgg acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag 1380
cgacggaggc tcccaagccc cccaaggtgc actgaacaga tcacaagggc aaccggacac 1440
cggggatggg gagacccaat ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga 1500
agcgccaaac tctgcgcagg gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc 1560
tcaagacaat gacaccgact gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg 1620
tcatcccaat tcctctgctt agaaaaaata cgggtagaag cggccgcggc cggccaccat 1680
gacagccatc atcaaagaga tcgttagcag aaacaaaagg agatatcaag aggatggatt 1740
cgacttagac ttgacctata tttatccaaa cattattgct atgggatttc ctgcagaaag 1800
acttgaaggc gtatacagga acaatattga tgatgtagta aggtttttgg attcaaagca 1860
taaaaaccat tacaagatat acaatctttg tgctgaaaga cattatgaca ccgccaaatt 1920
taattgcaga gttgcacaat atccttttga agaccataac ccaccacagc tagaacttat 1980
caaacccttt tgtgaagatc ttgaccaatg gctaagtgaa gatgacaatc atgttgcagc 2040
aattcactgt aaagctggaa agggacgaac tggtgtaatg atatgtgcat atttattaca 2100
tcggggcaaa tttttaaagg cacaagaggc cctagatttc tatggggaag taaggaccag 2160
agacaaaaag ggagtaacta ttcccagtca gaggcgctat gtgtattatt atagctacct 2220
gttaaagaat catctggatt atagaccagt ggcactgttg tttcacaaga tgatgtttga 2280
aactattcca atgttcagtg gcggaacttg caatcctcag tttgtggtct gccagctaaa 2340
ggtgaagata tattcctcca attcaggacc cacacgacgg gaagacaagt tcatgtactt 2400
tgagttccct cagccgttac ctgtgtgtgg tgatatcaaa gtagagttct tccacaaaca 2460
gaacaagatg ctaaaaaagg acaaaatgtt tcacttttgg gtaaatacat tcttcatacc 2520
aggaccagag gaaacctcag aaaaagtaga aaatggaagt ctatgtgatc aagaaatcga 2580
tagcatttgc agtatagagc gtgcagataa tgacaaggaa tatctagtac ttactttaac 2640
aaaaaatgat cttgacaaag caaataaaga caaagccaac cgatactttt ctccaaattt 2700
taaggtgaag ctgtacttca caaaaacagt agaggagccg tcaaatccag aggctagcag 2760
ttcaacttct gtaacaccag atgttagtga caatgaacct gatcattata gatattctga 2820
caccactgac tctgatccag agaatgaacc ttttgatgaa gatcagcata cacaaattac 2880
aaaagtctga ggccggcccc acaccccacc cctcaatccg caatcccgca tggccaaacc 2940
cacaaacgaa cccccctgtc tccctcctct cccccagccc cacaacccca cctgcccagg 3000
gcaacatagg tacaatgcga cccactaata atcaatacag ggccaaagaa attagaaaaa 3060
agtacgggta gaagggagac attcagagat cagggcgagt cacccgggtc tctgctctcc 3120
cttctaccta gtggattagg atggagatgg ccacctttac agatgcggag atcgacgagc 3180
tatttgagac cagtggaact gtcattgaca gcataattac ggcccaggga aaaccagtag 3240
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaaaactaa ggctttgagc gcagcatggg 3300
agaagcatgg gagcatccag tcaccagcca gccaagacac ccctgatcga caggacagat 3360
cagataaaca actgtccaca cccgagcaag cgagtccaaa cgacagcccc ccagccacat 3420
ccactgacca gcctcccact caggctgcag atgaggccgg cgatacacag ctcaagaccg 3480
gagcaagcaa ctctctgctg tcgatgcttg ataaactcag caataagtca tctaatgcta 3540
aaaagggccc agggtcgagc cctcaagaaa ggcatcatca acgtctgact caacaacagg 3600
ggagtcaaca aagccgcgga aacagccaag agagaccgca gaaccaggcc aaggccatcc 3660
ctggaaacca ggtcacagac gcgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 3720
tatcagctgg tgcaacccat catgctctcc gatcagagca gagccaagac aatactcctg 3780
cacctgtgga tcatgtccag ctacctgtcg actttgtgca ggcgatgatg tctatgatgg 3840
aggcgatatc acagagggta agtaaagttg actatcagct ggaccttgtc ttgaaacaga 3900
catcttctat ccccatgatg cggtctgaaa tccagcagct gaaaacgtct gttgcggtca 3960
tggaagccaa tttgggcatg atgaagatcc tggaccctgg ttgtgccaac gtttcatctc 4020
taagtgatct acgggcagtt gcccgatccc acccggtttt aatttctggc cccggagacc 4080
catctcctta tgtgacccaa gggggcgaaa tggcactcaa taaactttcg caaccggtgc 4140
aacacccctc tgaattgatt aaacccgcca cggcaagcgg gcctgatata ggagtggaga 4200
aagacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gccctatgca tccgagctct tcagctaggc 4260
tcttgagcaa actggacgca gccggatcga ttgaggaaat cagaaaaatc aagcgccttg 4320
cactgaatgg ctaatcacca ccgcaacccg cagcagatcc ctgtccaccc agcaccacac 4380
ggtatctgca ccaagctcct ctctgcaaac ccaaggtcca acaccccgag cgacaaccct 4440
gtcctgcttc ctctgcccca ctaaatgatc gcgcagctgc aatcaattca gctatattaa 4500
ggattaagaa aaaatacggg tagaatcgga gtgccccgat tgtgccaaga tggactcatc 4560
taggacaatc gggctgtact ttgattctac ccttccttct agcaacctgc tagcattccc 4620
gatagtccta caagacacag gggacgggaa gaagcaaatc gccccgcaat acaggatcca 4680
gcgtcttgac tcgtggacag acagcaaaga agactcggta ttcatcacca cctatggatt 4740
catctttcag gttgggaatg aagaagccac tgtcggcatg atcaatgata atcccaagcg 4800
cgagttactt tccactgcca tgctatgcct agggagtgta ccaaatgtcg gagatcttgt 4860
tgagctggca agggcctgcc tcactatggt ggtaacatgc aagaagagtg caactaacac 4920
cgagagaatg gtcttctcag tagtgcaggc accccaggtg ctgcaaagct gtagggttgt 4980
ggcaaacaaa tactcgtcgg tgaatgcagt caagcacgtg aaagcaccag agaagattcc 5040
tgggagcgga accctagagt acaaagtgaa ctttgtctct ctgaccgtgg tgccaagaaa 5100
ggacgtctac aagataccaa ctgcagcact taaggtctct ggctcaagtc tgtacaatct 5160
tgcgctcaat gtcactattg atgtggaggt agacccgaag agcccgttgg tcaaatccct 5220
ttccaagtcc gacagtgggt actatgctaa tctcttctta catattgggc ttatgtccac 5280
tgtagataag aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaggaaga taaggagact 5340
tgatctatct gtagggctta gtgacgtgct cggaccttcc gtgcttgtaa aggcgagagg 5400
tgcacggact aagctgctgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat 5460
agcaaatgcc tctcctcagg tggccaagat actctggagc caaaccgcgt acctgcggag 5520
tgtaaaagtc attatccaag cgggcaccca gcgtgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga 5580
ggttacctct actaagctgg agaaggggca taccattgcc aaatacaatc ccttcaagaa 5640
ataggctgca tctctgagat tgcactccgc ccatcttccc ggatcaccat gacactaaat 5700
aatgatctgt cttgattact tatagttagt tcgcctgtct atcaaattag aaaaaacacg 5760
ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ttcaaggtgc aagatgggct ccagatcttc 5820
taccaggatc ccagtacctc ttatgctgac cgtccgagtc atgttggcac tgagttgcgt 5880
ctgtccgacc agcgcccttg atggcaggcc tcttgcagct gcagggattg tggtaacagg 5940
agacaaagca gtcaacatat acacctcatc tcagacaggg tcaatcataa tcaagttact 6000
cccaaatatg cccaaggata aagaggcgtg tgcaaaagcc ccgttggagg catacaacag 6060
gacattgact actttgctca ccccccttgg tgattctatc cgtaggatac aagagtctgt 6120
gaccacgtcc ggaggaggga aacagggacg tcttataggc gccattatcg gtggtgtagc 6180
tctcggggtt gcaaccgctg cacagataac agcagcctcg gctctgatac aagccaatca 6240
aaatgctgcc aacatactcc ggctaaaaga gagcattgct gcaaccaatg aggctgtgca 6300
cgaggtcact aatggattat cacaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcaatttgt 6360
taatgaccag tttaataaaa cagctcagga attggactgt ataaaaatta cacagcaggt 6420
tggtgtagaa ctcaacctgt acctaactga attgactaca gtattcgggc cacaaatcac 6480
ttcccctgcc ttaactcagc tgactatcca ggcgctttac aatctagctg gtgggaatat 6540
ggattacttg ttgactaagt taggtgtggg gaacaaccaa ctcagctcat taattagtag 6600
tggcctgatc accggcaacc ctattctgta cgactcacag actcaactct tgggtataca 6660
ggtaacccta ccctcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctacc tggaaacctt 6720
gtctgtaagt acaaccaaag gatttgcctc agcacttgtc ccaaaagtag tgacacaggt 6780
cggttccgtg atagaagagc ttgacacctc gtactgtata gagaccgatt tggatctata 6840
ttgtacaaga atagtgacat tccctatgtc tcctggtatt tattcctgtt tgagtggcaa 6900
tacatctgct tgcatgtact caaagactga aggcgcactc actacgccgt atatgaccct 6960
caaaggctca gttattgcta actgtaagat gacaacatgt agatgtgcag accccccggg 7020
tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt gtctctaata gataggcaat catgcaatat 7080
cttatcctta gacgggataa ctttgaggct cagtggggaa tttgatgcaa cttatcaaaa 7140
gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat agtgacaggc aatcttgata tctcgactga 7200
gcttgggaat gtcaacaact cgataagtaa tgctttggat aagttagagg aaagcaacag 7260
caaactagat aaggtcaatg tcaaactgac cagcacatcc gctcttatta cctatatcgt 7320
tttaactgtc atatctcttg tatgtggtat acttagcctg gttctagcat gctacctgat 7380
gtacaagcaa aaggcgcaac agaagacctt gttgtggctt gggaataata ccctagacca 7440
gatgagggcc actacaaaaa tgtgaatgcg gatgagaggc agaaacatcc ccaatagcag 7500
tttgtgtgta aagtctgaca gcctgttaat tagaagaatt aagaaaaaac taccggatgt 7560
agatgaccaa agggcgatat acgggtagaa cggtcgggga ggccgtccct caatcgggag 7620
ccgggcctca caacatccgt tctaccgcat caccaatagc agttttcagt catggaccgc 7680
gcagttagcc aagttgcgct agagaatgat gaaagagagg caaagaatac atggcgcttg 7740
gtattccgga tcgcaatcct actctcaacg gtggtgacct tagccatctc tgcagccgcc 7800
cttgcatata gcatggaggc cagcacacct agcgatcttg taggcatacc gactgcgatc 7860
tctagagcag aggaaaagat tacatctgca ctcggttcca atcaagatgt agtagatagg 7920
atatataagc aggtggccct cgaatctcca ctggcattgc taaacaccga atctacaatt 7980
atgaacgcaa taacgtctct ctcttatcga atcaatgggg ccgcaaatag cagcggatgt 8040
ggagcaccca ttcatgatcc agattatatt ggaggaatag gtaaagaact tattgtagat 8100
gatgctagcg acgtcacatc atactatccc tctgcgttcc aagaacacct gaactttatc 8160
ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cggataccct catttgacat gagcgctacc 8220
cactactgtt atactcacaa tgtgatatta tctggctgca gagatcactc gcactcacat 8280
caatatttag cacttggtgt gcttcggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttccact 8340
ctgcgttcca tcaatctgga tgacacccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaacc 8400
cccttgggtt gtgatatgct gtgctctaaa gtcacagaga ctgaagaaga ggattataac 8460
tcagctatcc ccacgtcgat ggtacatgga aggttagggt tcgacggcca ataccacgag 8520
aaggacctag atgtcacaac actattcgag gactgggtgg caaactaccc aggagtaggg 8580
ggcgggtctt ttattgacaa ccgcgtatgg ttcccagttt acggagggct aaaacccaat 8640
tcgcccagtg acaccgcaca agaagggaaa tatgtaatat acaagcgata caatgacaca 8700
tgtccagatg agcaagatta tcagattcaa atggctaagt cttcatataa gcctgggcgg 8760
tttggaggga aacgcgtaca gcaggccatc ttatctatca aagtgtcaac atccttgggc 8820
gaggacccgg tactgactgt accgcccaac acagtaacac tcatgggggc cgaaggcaga 8880
gttctcacag tagggacatc tcatttcctt tatcagcgag ggtcatcata cttctcccct 8940
gccctactat atcctatgat agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca 9000
ttcaatgcct tcactcgacc aggtagtgtc ccttgccagg cttcagcaag atgccctaac 9060
tcatgtgtta ccggagtcta tactgatcca tatcccttgg tcttctatag gaaccacacc 9120
ttgcgagggg tattcgggac gatgcttgat gataaacaag caagactcaa ccctgtatct 9180
gcagtatttg acagcatatc ccgcagtcgc ataacccggg tgagttcaag cagcaccaag 9240
gcagcataca caacatcaac atgttttaaa gttgtaaaga ccaataaaac ctattgtctc 9300
agcattgccg aaatatccaa taccctcttc ggggaattca gaatcgtccc tttactagtt 9360
gagattctca aggatgatgg ggttagagaa gccaggtcta gccggttgag tcaactgcga 9420
gagggttgga aagatgacat tgtatcacct atcttttgcg acgccaagaa tcaaactgaa 9480
taccggcgcg agctcgagtc ctacgctgcc agttggccat aatcagctag tgctaatgtg 9540
attagattaa gtcttgtcgg tagtcacttg attaagaaaa aatgtgggtg gtagcgggat 9600
ataaggcaaa acaactcaag gaggatagca cgggtaggac atggcgagct ccggtcccga 9660
gagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tagtcaagca 9720
caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccactc cctgacgagt gtgacttcga 9780
ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa tcggcctccc ctgacactga 9840
gagaatgata aaacttggaa gggcagtgca ccagactctc aaccacaatt ccaagataac 9900
cggagtactc catcccaggt gtttagaaga attggctagt attgaggttc ctgactcaac 9960
caacaagttt cggaagatcg agaagaaaat ccaaattcac aacacaaggt atggagaact 10020
gttcacaaga ctgtgcacgc atgtagagaa gaaattgttg ggatcatctt ggtctaataa 10080
tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgtacagat ccggcattct ggtttcactc 10140
aaaatggtcc acaactaagt ttgcatggct ccatataaaa cagattcaaa ggcatctgat 10200
tgtggcagca agaacaaggt ccgcagccaa caaattggtg acgctgaccc ataaggtagg 10260
ccaagtcttt gttactcctg agcttgtcat tgtgacacat acagatgaga acaagttcac 10320
gtgtcttacc caggaacttg tgttgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 10380
caacataata tcatccacgg cggcacatct caggagccta tcagagaaaa ttgatgacat 10440
tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggtaat caagtctacg atgttgtagc 10500
actcatggag ggatttgcat acggcgccgt ccagctgctt gagccgtcag gtacattcgc 10560
aggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctcaaagac actttgatcg gcctccttcc 10620
taaggatata gcagaatctg tgactcacgc aatagccact gtattctctg gcttagaaca 10680
aaatcaagcg gctgagatgc tgtgcctgtt gcgtctatgg ggccacccat tacttgagtc 10740
ccgtattgcg gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca ccaaaaatgg tagactttga 10800
tatgatcctc caggtattgt ctttctttaa aggaacaatc atcaacggat acagaaagaa 10860
gaatgcaggt gtttggccac gtgtcaaagt agatacgata tacgggaagg tcattgggca 10920
gctacacgct gattcagcgg agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt acaagagttt 10980
atctgcgctt gaattcgagc catgtataga atacgaccct atcaccaatc tgagcatgtt 11040
tctaaaagac aaggcgatcg cacacccgaa agacaactgg ctcgccgcgt ttaggcgaaa 11100
ccttctctct gaggaccaga agaaacatgt aaaggaggca acctctacta accgtctctt 11160
gatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccatataag gagatggaat atctgacgac 11220
ccttgagtac ctaagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt 11280
gaaggttaat gggcggattt ttgctaagct aacaaagaaa ttaaggaact gtcaagtgat 11340
ggcggaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt caagggaatg gggtcattca 11400
ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt caattgtctt tcaacagcaa 11460
taagaaacgt atcactgact gcaaagaaag agtagcctca aaccgcaatc acgatcaaaa 11520
gagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgact gacctgcaaa agtactgtct 11580
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acctcacttc ttcgaatgga ttcatctaag actaatggat actacgatgt ttgtaggaga 11700
ccctttcaat cccccaagtg acccaactga ctgtgatctc tcaagagtcc caaatgatga 11760
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ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 12180
caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg cttccaaagg atttctgtta 12240
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aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt 12660
attatctggc gtgcatacag aggataatga ggcagaagag aaggcgttgg ctgaattttt 12720
actcaatcaa gaagtaattc atccacgtgt cgcacatgct atcatggaag caagctctat 12780
aggtaggagg aagcagattc aagggcttgt tgacacaaca aacaccgtaa tcaagattgc 12840
attgactagg aggccacttg gcatcaagag gctgatgcgg atagttaact actcgagcat 12900
gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ctcatctaac aggtctaacc accccttagt 12960
ttcctctaat atgtgttctc tgacgctagc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc 13020
attgacgggg ggtagaaaga tactgggtgt atctaatcct gatactatag aacttgtaga 13080
gggtgagatc cttagcgtca gcggaggatg cacaagatgt gacagcggag atgaacaatt 13140
cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat gacaccagca agaatcctcc 13200
gatgagagtg ccgtacctcg ggtcaaagac tcaagagagg agggccgcct cgcttgcgaa 13260
aatagctcat atgtcaccac atgtgaaagc tgctctaagg gcatcatccg tgttgatctg 13320
ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt aaaattgcaa gatctcggtg 13380
caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtccccctta cccacagctg ggaatctcca 13440
acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt 13500
gtcaccttat attcacatat ccaatgattc tcaaaggtta ttcacggaag aaggagtcaa 13560
agagggaaat gtagtttatc agcaaatcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcact 13620
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tgactttgcg agacttgact tagctatctt taagagttat gagcttaatc tagaatcata 13860
tcccacaata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttaa tcggccagtc 13920
tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa 13980
cacccggaat tggatcagcg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat tcgagtatgc 14040
agcacttgaa gtgcttctcg actgttctta tcagctctac tatctgagag taagaggcct 14100
agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat atgccaggaa ttctactttc 14160
caacattgca gctacaatat ctcatcccat cattcattca agattgcatg cagtaggcct 14220
ggtcaatcac gacgggtcac accaacttgc agacacagat ttcatcgaaa tgtctgcaaa 14280
actattagtc tcttgcactc gacgcgtggt ctcaggttta tatgcaggga ataagtatga 14340
tctgctgttc ccgtctgtct tagatgataa cctgagtgag aagatgcttc agctgatatc 14400
tcggttatgc tgcctgtata cggtgctctt tgctacaaca agagagatcc cgaaaataag 14460
aggcttatct gcagaagaga agtgttcagt acttactgag tacctactgt cagatgctgt 14520
gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca tagttacgtt 14580
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acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg cgtttttaca 14760
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atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga agcggagcca ttatgagtct 15000
tctcgaactg catgtgccgc atgagactat ctattacaat acgctcttct caaacgagat 15060
gaacccccca cagcggcatt tcggaccgac cccaacacag tttctgaatt cagttgttta 15120
taggaatcta caggcggagg taccatgtaa ggatggattt gtccaggagt tccgtccatt 15180
atggagagag aatacagaag aaagcgatct gacctcagat aaagcagtgg gttacatcac 15240
atctgcagtg ccctaccggt ctgtatcatt gctgcactgt gacattgaga ttcctccagg 15300
atccaatcaa agcttactgg atcaactggc taccaatctg tctctgattg ccatgcattc 15360
tgtaagggag ggcggggtcg tgatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat attacttcca 15420
tctactcatg aacttgttca ctccgtgttc tacgaaagga tatattctct ctaatggcta 15480
tgcatgtaga ggggatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggctatc gaggtgggcc 15540
tacatttgta catgaggtag tgaggatggc aaaaactcta gtgcagcggc acggtacact 15600
tttgtccaaa tcagatgaga tcacactgac taggttattt acctcacagc ggcagcgtgt 15660
aacagacatc ctatccagtc ctttaccgag actaataaag ttcttgagaa agaatatcga 15720
tactgcgcta attgaagccg ggggacaacc cgtccgtcca ttctgtgcag agagcttggt 15780
gaggacacta gcggacacaa ctcagatgac ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt 15840
cattcgatct gtgatctaca tggaggctga gggtgatctc gccgacacag tgttcttatt 15900
taccccctac aatctctcta cagacggtaa aaagagaaca tcacttaaac agtgcacaag 15960
gcagatctta gaggtcacaa tattgggtct tagagttgaa aatctcaata aagtaggtga 16020
tgtagtcagt ctagtactta aaggtatgat ttctctggag gacctgatcc ctctaagaac 16080
atacttgaag cgtagtacct gccctaagta tttgaagtct gttctaggta ttactaaact 16140
caaagaaatg tttacagaca cctctttatt atacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 16200
catgaaaact ataggcaacg cagtcaaggg atactacagt aactgtgact cttaaagata 16260
atcacatatt aataggctcc ttttctagtt aactgagccc ttgttgattt aatgatacta 16320
tattagaaaa aagttgcact ccgatccttt aggactcgtg ttcgaattca aataattgtc 16380
ttagaaaaaa gttgcgcgta attgttcttg aatgtagtcc tgtcattcac caaatctttg 16440
tttggtcggc atggcatctc cacctcctcg cggtccgacc tgggcatccg aaggaggacg 16500
cacgtccact cggatggcta agggagtagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt 16560
gaggggtttt ttgggcgcgc cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct 16620
ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca 16680
tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc 16740
gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg 16800
ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg 16860
ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga 16920
tggccttccc cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg 16980
ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg 17040
ctcttaccag cctaacttcg atcactggac cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct 17100
cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc 17160
tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg 17220
gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc aatcaattct tgcggagaac 17280
tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc gcgtccgcca tctccagcag 17340
ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca cgggtgcgca tgatcgtgct 17400
cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc 17460
accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac 17520
aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc 17580
ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc 17640
tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct ggtcccgccg 17700
catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc 17760
agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag 17820
aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc 17880
ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga 17940
tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg 18000
cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 18060
cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 18120
tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac 18180
tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 18240
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 18300
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 18360
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 18420
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 18480
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 18540
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 18600
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 18660
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 18720
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 18780
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 18840
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 18900
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 18960
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 19020
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 19080
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 19140
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 19200
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 19260
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 19320
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 19380
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 19440
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 19500
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc 19560
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 19620
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 19680
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 19740
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 19800
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca 19860
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 19920
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 19980
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 20040
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 20100
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 20160
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 20220
taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 20280
cgtcttcaag aattctaata cgactcacta tagg 20314
<210> 3
<211> 1212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTEN
<400> 3
atgacagcca tcatcaaaga gatcgttagc agaaacaaaa ggagatatca agaggatgga 60
ttcgacttag acttgaccta tatttatcca aacattattg ctatgggatt tcctgcagaa 120
agacttgaag gcgtatacag gaacaatatt gatgatgtag taaggttttt ggattcaaag 180
cataaaaacc attacaagat atacaatctt tgtgctgaaa gacattatga caccgccaaa 240
tttaattgca gagttgcaca atatcctttt gaagaccata acccaccaca gctagaactt 300
atcaaaccct tttgtgaaga tcttgaccaa tggctaagtg aagatgacaa tcatgttgca 360
gcaattcact gtaaagctgg aaagggacga actggtgtaa tgatatgtgc atatttatta 420
catcggggca aatttttaaa ggcacaagag gccctagatt tctatgggga agtaaggacc 480
agagacaaaa agggagtaac tattcccagt cagaggcgct atgtgtatta ttatagctac 540
ctgttaaaga atcatctgga ttatagacca gtggcactgt tgtttcacaa gatgatgttt 600
gaaactattc caatgttcag tggcggaact tgcaatcctc agtttgtggt ctgccagcta 660
aaggtgaaga tatattcctc caattcagga cccacacgac gggaagacaa gttcatgtac 720
tttgagttcc ctcagccgtt acctgtgtgt ggtgatatca aagtagagtt cttccacaaa 780
cagaacaaga tgctaaaaaa ggacaaaatg tttcactttt gggtaaatac attcttcata 840
ccaggaccag aggaaacctc agaaaaagta gaaaatggaa gtctatgtga tcaagaaatc 900
gatagcattt gcagtataga gcgtgcagat aatgacaagg aatatctagt acttacttta 960
acaaaaaatg atcttgacaa agcaaataaa gacaaagcca accgatactt ttctccaaat 1020
tttaaggtga agctgtactt cacaaaaaca gtagaggagc cgtcaaatcc agaggctagc 1080
agttcaactt ctgtaacacc agatgttagt gacaatgaac ctgatcatta tagatattct 1140
gacaccactg actctgatcc agagaatgaa ccttttgatg aagatcagca tacacaaatt 1200
acaaaagtct ga 1212
<210> 4
<211> 403
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTEN
<400> 4
Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile
20 25 30
Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn
35 40 45
Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His
50 55 60
Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys
65 70 75 80
Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu
100 105 110
Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys
115 120 125
Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys
130 135 140
Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr
145 150 155 160
Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr
165 170 175
Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala
180 185 190
Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile
210 215 220
Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr
225 230 235 240
Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu
245 250 255
Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His
260 265 270
Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu
275 280 285
Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys
290 295 300
Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu
305 310 315 320
Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr
325 330 335
Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu
340 345 350
Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp
355 360 365
Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp
370 375 380
Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile
385 390 395 400
Thr Lys Val
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGS
<400> 5
ttagaaaaaa tacgggtaga a 21
<210> 6
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kozak
<400> 6
gccacc 6
<210> 7
<211> 1470
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP
<400> 7
atgtcttctg tattcgatga gtacgagcag ctcctcgcgg ctcagactcg ccccaatgga 60
gctcatggcg gaggagagaa ggggagcacc ttaaaggtag aagtcccggt attcactctc 120
aacagtgatg acccagaaga tagatggaac tttgcagtgt tttgtcttcg gattgctgtt 180
agcgaggatg ccaacaaacc acttaggcaa ggtgctctca tatctctctt atgttcccac 240
tctcaagtga tgaggaacca tgttgccctt gcggggaaac agaatgaggc cacactggct 300
gttcttgaga tcgatggttt taccaacggc gtgccccagt tcaacaacag gagtggagtg 360
tctgaagaga gagcacagag atttatgatg atagcagggt ctctccctcg ggcatgcagc 420
aacggtaccc cgttcgtcac agctggggtt gaagatgatg caccagaaga cattactgat 480
accctggaga ggatcctctc tatccaggct caagtatggg tcacggtggc aaaggccatg 540
actgcatatg agacagcaga tgagtcagaa acaagaagaa tcaataagta catgcagcaa 600
ggcagggtcc agaagaagta catcctccac cccgtatgca ggagcgcaat ccaactcaca 660
atcagacagt ctctggcggt ccgcatcttt ttggttagcg agcttaagag aggccgcaac 720
acggcaggtg ggacctccac ctattacaac ttggtggggg atgtagactc atacatcagg 780
aacactgggc taactgcatt cttcctgaca cttaaatatg gaattaacac caagacatca 840
gcccttgcac ttagcagcct ctcaggcgat atccagaaaa tgaagcagct catgcgcttg 900
tatcggatga aaggagataa tgcgccgtac atgacattgc tcggtgacag tgaccagatg 960
agctttgcac ctgccgagta tgcacaactt tactcctttg ccatgggtat ggcatcagtc 1020
ctagataaag gaactagcaa ataccaattt gccagggact ttatgagcac atcattctgg 1080
agacttggag tagagtacgc tcaggctcaa ggaagtagca tcaatgagga tatggccgcc 1140
gagctaaagc taaccccagc agcaaggaga ggcctggcag ctgctgccca aagagtgtct 1200
gaggagacca gcagcatgga catgcccacc caacaagccg gggtcctcac tggactcagc 1260
gacggaggct cccaagcccc ccaaggtgca ctgaacagat cacaagggca accggacacc 1320
ggggatgggg agacccaatt tctggatctg atgagagcgg tggcaaatag catgagagaa 1380
gcgccaaact ctgcgcaggg cacccctcaa ccggggcctc ccccaacccc tgggccctct 1440
caagacaatg acaccgactg ggggtactga 1470
<210> 8
<211> 1188
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P
<400> 8
atggccacct ttacagatgc ggagatcgac gagctatttg agaccagtgg aactgtcatt 60
gacagcataa ttacggccca gggaaaacca gtagagactg ttggaaggag tgcaatccca 120
caaggcaaaa ctaaggcttt gagcgcagca tgggagaagc atgggagcat ccagtcacca 180
gccagccaag acacccctga tcgacaggac agatcagata aacaactgtc cacacccgag 240
caagcgagtc caaacgacag ccccccagcc acatccactg accagcctcc cactcaggct 300
gcagatgagg ccggcgatac acagctcaag accggagcaa gcaactctct gctgtcgatg 360
cttgataaac tcagcaataa gtcatctaat gctaaaaagg gcccagggtc gagccctcaa 420
gaaaggcatc atcaacgtct gactcaacaa caggggagtc aacaaagccg cggaaacagc 480
caagagagac cgcagaacca ggccaaggcc atccctggaa accaggtcac agacgcgaac 540
acagcatatc atggacaatg ggaggagtca caactatcag ctggtgcaac ccatcatgct 600
ctccgatcag agcagagcca agacaatact cctgcacctg tggatcatgt ccagctacct 660
gtcgactttg tgcaggcgat gatgtctatg atggaggcga tatcacagag ggtaagtaaa 720
gttgactatc agctggacct tgtcttgaaa cagacatctt ctatccccat gatgcggtct 780
gaaatccagc agctgaaaac gtctgttgcg gtcatggaag ccaatttggg catgatgaag 840
atcctggacc ctggttgtgc caacgtttca tctctaagtg atctacgggc agttgcccga 900
tcccacccgg ttttaatttc tggccccgga gacccatctc cttatgtgac ccaagggggc 960
gaaatggcac tcaataaact ttcgcaaccg gtgcaacacc cctctgaatt gattaaaccc 1020
gccacggcaa gcgggcctga tataggagtg gagaaagaca ctgtccgtgc attgatcatg 1080
tcacgcccta tgcatccgag ctcttcagct aggctcttga gcaaactgga cgcagccgga 1140
tcgattgagg aaatcagaaa aatcaagcgc cttgcactga atggctaa 1188
<210> 9
<211> 1095
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M
<400> 9
atggactcat ctaggacaat cgggctgtac tttgattcta cccttccttc tagcaacctg 60
ctagcattcc cgatagtcct acaagacaca ggggacggga agaagcaaat cgccccgcaa 120
tacaggatcc agcgtcttga ctcgtggaca gacagcaaag aagactcggt attcatcacc 180
acctatggat tcatctttca ggttgggaat gaagaagcca ctgtcggcat gatcaatgat 240
aatcccaagc gcgagttact ttccactgcc atgctatgcc tagggagtgt accaaatgtc 300
ggagatcttg ttgagctggc aagggcctgc ctcactatgg tggtaacatg caagaagagt 360
gcaactaaca ccgagagaat ggtcttctca gtagtgcagg caccccaggt gctgcaaagc 420
tgtagggttg tggcaaacaa atactcgtcg gtgaatgcag tcaagcacgt gaaagcacca 480
gagaagattc ctgggagcgg aaccctagag tacaaagtga actttgtctc tctgaccgtg 540
gtgccaagaa aggacgtcta caagatacca actgcagcac ttaaggtctc tggctcaagt 600
ctgtacaatc ttgcgctcaa tgtcactatt gatgtggagg tagacccgaa gagcccgttg 660
gtcaaatccc tttccaagtc cgacagtggg tactatgcta atctcttctt acatattggg 720
cttatgtcca ctgtagataa gaaggggaag aaagtgacat ttgacaagct ggaaaggaag 780
ataaggagac ttgatctatc tgtagggctt agtgacgtgc tcggaccttc cgtgcttgta 840
aaggcgagag gtgcacggac taagctgctg gcacctttct tctctagcag tgggacagcc 900
tgctatccca tagcaaatgc ctctcctcag gtggccaaga tactctggag ccaaaccgcg 960
tacctgcgga gtgtaaaagt cattatccaa gcgggcaccc agcgtgctgt cgcagtgacc 1020
gccgaccacg aggttacctc tactaagctg gagaaggggc ataccattgc caaatacaat 1080
cccttcaaga aatag 1095
<210> 10
<211> 1662
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F
<400> 10
atgggctcca gatcttctac caggatccca gtacctctta tgctgaccgt ccgagtcatg 60
ttggcactga gttgcgtctg tccgaccagc gcccttgatg gcaggcctct tgcagctgca 120
gggattgtgg taacaggaga caaagcagtc aacatataca cctcatctca gacagggtca 180
atcataatca agttactccc aaatatgccc aaggataaag aggcgtgtgc aaaagccccg 240
ttggaggcat acaacaggac attgactact ttgctcaccc cccttggtga ttctatccgt 300
aggatacaag agtctgtgac cacgtccgga ggagggaaac agggacgtct tataggcgcc 360
attatcggtg gtgtagctct cggggttgca accgctgcac agataacagc agcctcggct 420
ctgatacaag ccaatcaaaa tgctgccaac atactccggc taaaagagag cattgctgca 480
accaatgagg ctgtgcacga ggtcactaat ggattatcac aactagcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc aatttgttaa tgaccagttt aataaaacag ctcaggaatt ggactgtata 600
aaaattacac agcaggttgg tgtagaactc aacctgtacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac aaatcacttc ccctgcctta actcagctga ctatccaggc gctttacaat 720
ctagctggtg ggaatatgga ttacttgttg actaagttag gtgtggggaa caaccaactc 780
agctcattaa ttagtagtgg cctgatcacc ggcaacccta ttctgtacga ctcacagact 840
caactcttgg gtatacaggt aaccctaccc tcagtcggga acctaaataa tatgcgtgcc 900
acctacctgg aaaccttgtc tgtaagtaca accaaaggat ttgcctcagc acttgtccca 960
aaagtagtga cacaggtcgg ttccgtgata gaagagcttg acacctcgta ctgtatagag 1020
accgatttgg atctatattg tacaagaata gtgacattcc ctatgtctcc tggtatttat 1080
tcctgtttga gtggcaatac atctgcttgc atgtactcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tgaccctcaa aggctcagtt attgctaact gtaagatgac aacatgtaga 1200
tgtgcagacc ccccgggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtgtc tctaatagat 1260
aggcaatcat gcaatatctt atccttagac gggataactt tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata caagattctc aagtaatagt gacaggcaat 1380
cttgatatct cgactgagct tgggaatgtc aacaactcga taagtaatgc tttggataag 1440
ttagaggaaa gcaacagcaa actagataag gtcaatgtca aactgaccag cacatccgct 1500
cttattacct atatcgtttt aactgtcata tctcttgtat gtggtatact tagcctggtt 1560
ctagcatgct acctgatgta caagcaaaag gcgcaacaga agaccttgtt gtggcttggg 1620
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<223> L
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acctcacagc ggcagcgtgt aacagacatc ctatccagtc ctttaccgag actaataaag 6060
ttcttgagaa agaatatcga tactgcgcta attgaagccg ggggacaacc cgtccgtcca 6120
ttctgtgcag agagcttggt gaggacacta gcggacacaa ctcagatgac ccagatcatc 6180
gctagtcaca ttgacacagt cattcgatct gtgatctaca tggaggctga gggtgatctc 6240
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tcacttaaac agtgcacaag gcagatctta gaggtcacaa tattgggtct tagagttgaa 6360
aatctcaata aagtaggtga tgtagtcagt ctagtactta aaggtatgat ttctctggag 6420
gacctgatcc ctctaagaac atacttgaag cgtagtacct gccctaagta tttgaagtct 6480
gttctaggta ttactaaact caaagaaatg tttacagaca cctctttatt atacttgact 6540
cgtgctcaac aaaaattcta catgaaaact ataggcaacg cagtcaaggg atactacagt 6600
aactgtgact cttaa 6615
Claims (14)
- 서열번호 2로 표시되는 LVP-K1-PTEN 벡터.
- 제1항의 LVP-K1-PTEN 벡터를 도입한 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC 14496BP).
- 제2항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 조성물은 암세포 사멸효과를 갖는 것을 특징으로 하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 조성물은 암세포 증식억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제3항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제3항의 조성물을 개체에 투여하는 단계; 및 개체의 암세포 또는 암 조직의
변화를 측정하여 평가하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 방법은 인간을 제외한 동물의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 것인, 동물에서의 뇌종양 예방 또는 치료 효과 평가 방법. - 제2항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계;
상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및
상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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