KR102328832B1 - 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법 - Google Patents

Abstract

소 정자 등의 소 생식세포의 동결 보존액 및 동결 보존 방법을 제공한다. 수평균 분자량 1,000~20,000의 ε- 폴리 -L- 라이신의 아미노기의 50~99 몰%에 대해, 숙신산 무수물을 반응시켜 카르복실기를 적당량 도입한 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산) 0.3~0.9 w/w%와 글리세린 2~4 w/w%를 생리적 용액에 용해시킨 동결 보존액을 사용한다. 동결 보존 방법의 바람직한 실시 형태는 소 정액을 생리적 용액에 따라 2.5~10 배로 희석하고, 2~8℃에서 유지한 1차 희석 공정과 2~8℃에서 유지하면서 1차 희석 공정에 의해 얻어진 현탁액에 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산)과 글리세린을 첨가한 생리적 용액을 점적에 의해 첨가함으로써, 추가로 희석하여 소 정액이 5~20배 희석되도록 하는 2차 희석 공정을 포함한다.

Description

소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법{COMPOSITION FOR CRYOPRESERVATION OF BOVINE REPRODUCTIVE CELLS AND CRYOPRESERVATION METHOD THEREFOR}

본 발명은 예를 들면 소(bovine) 생식세포의 동결 보존에 유용한 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법에 관한 것이다.

동물의 세포 또는 조직을 장기간 보존하기 위해, 0℃ 이하의 온도에서의 동결 보존법이 일상적으로 사용되고 있다. 그렇지만 동물의 세포 또는 조직은 물을 함유하고 동결하면, 동결 중에 수분자끼리 용질이나 혼입물의 매질을 배제하면서 결정화하여 수분자만으로 이루어진 빙결정을 형성하기 때문에, 함수물 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산하고 동결 농축이 발생하는 것으로 알려져 있다.

이러한 동결 농축을 방지하기 위해, 다양한 저분자 화합물을 첨가하는 방법이 이루어지고 있다. 예를 들면, 세포의 동결 보존을 수행할 경우에 동결 보존 중에 일어나는 세포 내의 결정화에 의한 세포로의 손상을 최소한으로 억제하기 위해, 동결 보호제로서 저분자의 디메틸 설폭사이드나 글리세롤 등을 첨가하는 방법이 이루어지고 있다.

특히 소의 자축 생산성 향상을 도모하기 위해서는 소 생식세포에 유용한 동결 보존 방법의 개발이 중요하다.

예를 들면, 소 정자의 동결에 사용되는 동결 보호제로서는 글리세린이 알려져 있다. 또한 소 난자 및 배아의 동결에 사용되는 동결 보호제로서는 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로판다이올이 알려져 있다. 또한 소 체세포의 동결에 사용되는 동결 보호제로서는 디메틸 설폭사이드가 알려져 있다.

그렇지만 이러한 종래의 동결 보호제는 모두 세포 독성이 강한 등의 문제가 있었다.

그런데 PCT/JP2009/002941(일본특허 제5726525호)는 아미노기와 카르복실기를 곁사슬에 가지는 양성 고분자 전해질을 함유하는 동결 보존액을 개시한다. 그렇지만 해당 동결 보존액이 생식세포나 체세포 등의 소 세포의 동결 보존에 사용할 수 있는 것은 알려지지 않았었다.

위에서 설명한 바와 같이 소의 자축 생산성 향상을 도모하기 위해서는 소 생식세포에게 유용한 신규 동결 보존제 및 동결 보존 방법의 개발이 중요하다. 그렇지만 종래의 소 세포의 동결에 사용되는 동결 보호제는 모두 세포 독성이 강한 등의 문제가 있었다.

그래서 본 발명은 이들의 실정을 감안해 소 생식세포를 포함한 소 세포의 동결에 유용한 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 열심히 연구를 한 결과, ε-폴리-L-라이신(PLL)의 아미노기를 숙신산 무수물과 반응시켜 카르복실기를 적당량 도입한 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산)이 단독으로 또는 종래의 동결 보호제와 병용함으로써, 소 생식세포 또는 체세포의 동결 보존에 유용한 것을 발견하여 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하를 포함한다.

하기 식(I)으로 표시되는 구성 단위 및 하기 식(II)으로 표시되는 구성 단위를 포함하고, 하기 식(II)으로 표시되는 구성 단위의 비율이 50~99 몰%인 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산)과 글리세린을 포함한, 소 정자 등 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 이것을 사용하는 동결 보존 방법.

<화학식 I>

<화학식 II>

본 발명에 의하면, 소 생식세포에 유용한 동결 보존용 조성물을 제공할 수 있고, 소의 자축 생산성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 소 체세포에게 독성이 낮은 동결 보존용 조성물을 제공할 수 있다.

[도 1] 동결배아의 전용 빨대(straw)로의 봉입 양식을 나타내는 도면이다.
[도 2] 동결 보존한 소 체세포(소 피부 유래 섬유아세포)의 동결 융해 후에 파종한 접착 세포수(동결 보호제 제거 후 파종)를 나타내는 그래프이다.
[도 3] 동결 보존한 소 체세포(소 난구세포)의 동결 융해 후에 파종한 접착 세포수(동결 보호제 제거 후 파종)를 나타내는 그래프이다.

본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물은 수평균 분자량 1,000~20,000의 ε-폴리-L-라이신의 아미노기의 50~99 몰%에 대해 숙신산 무수물을 반응시켜 카르복실화함으로써 블록(block)한 것(이하, 「부동 폴리아미노산」이라고 칭한다)을 포함하는 것이다.

구체적으로는, 본 발명의 부동 폴리아미노산은 하기 식(I)으로 표시되는 구성 단위 및 하기 식(II)으로 표시되는 구성 단위를 포함하고(또는 로 구성되고), 또한 하기 식(II)으로 표시되는 구성 단위의 비율이 50~99 몰%인 양성 고분자 전해질이다.

<화학식 I>

<화학식 II>

본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물에 의하면, 동결 융해 후의 소 생식세포 또는 체세포의 생존율 및 증식을 유의하게 향상시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물에 의하면, 동결 융해 후의 소 정자 또는 배아의 발생 능력을 손상시키지 않고, 인공 수정이나 배아 이식에 의한 수태율을 유의하게 향상시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, ε-폴리-L-라이신으로서는 미생물 또는 효소에 의해 생산되는 수평균 분자량이 1,000~20,000, 특히 1,000~10,000의 ε-폴리-L-라이신을 들 수 있다. ε-폴리-L-라이신은 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 방선균에 의해 생산되어 오로지 식품첨가물로서 사용되어 있고, 중합도 15~35의 것 외, 중합도가 20 이하인 것의 생산도 시도되고 있다(예를 들면, 특개 2003-171463호 공보 및 특개 2005-318815호 공보). 수평균 분자량 또는 수평균 중합도의 측정은 SDS-PAGE(황산 도데실 나트륨-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동)법에 의해, 예를 들면, 아토(주) 제의 전기 영동 장치 및 덴시토그래프(AE-6920V 형)를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 이 때, 표준 단백질 마커를 사용한다. 또한 ε-폴리-L-라이신은 가열 처리에 의한 고분자량화에 의해 분자량 30,000 이상으로 사용할 수도 있다. 그렇지만 점도의 상승을 방지하는 등의 관점에서 상기의 분자량 범위가 바람직하다.

하기에 나타내는 반응에 의해, ε-폴리-L-라이신의 아미노기는 부분적으로 숙신산 무수물에 의해 카르복실화되고, 블록된다.

<화학식 III>

이 때, ε-폴리-L-라이신의 아미노기에 대해, 바람직하게는 50~99 몰%, 특히 50~93 몰%, 보다 바람직하게는 50~90 몰%, 또한 바람직하게는 55~80 몰%, 가장 바람직하게는 58~76 몰%를 카르복실화함으로써 블록한다.

ε-폴리-L-라이신의 아미노기에 대해서 52~53 몰%의 숙신산 무수물을 반응시킴으로써 약 50 몰%의 아미노기를 블록할 수 있다. 또한 100 몰%의 숙신산 무수물을 반응시킨 경우, 통상의 반응 조건에서 90~95 몰%의 아미노기를 블록할 수 있다. 블록률이 상기의 범위를 초과해도, 또한 하회해도, 동결 보존 효과가 작아진다.

본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물은 생리적 수용액에 부동 폴리아미노산을 용해한 것이다. 생리적 수용액으로서는 생리 식염수 외, 각종 세포 또는 조직용 일반적인 배양액을 사용할 수 있다. 예를 들면, 둘베코 수정 이글 MEM 배지(DMEM)를 바람직한 것으로서 들 수 있다.

본 발명의 제1 실시형태에서는 본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물은 상기에 설명한 부동 폴리아미노산과 글리세린을 포함한, 소 정자의 동결 보존용 조성물이다. 본 발명에 따른 소 정자의 동결 보존용 조성물은 예를 들면 0.25~1.0 w/w%, 바람직하게는 0.3~0.9 w/w% 또는 0.3~0.8 w/w%의 농도의 부동 폴리아미노산, 및 1.5~4.5 w/w% 또는 1.5~4.4 w/w%, 바람직하게는 2.0~4.0 w/w%의 농도의 글리세린을 포함한다. 해당 글리세린 함유량은 종래에 있어서 소 정자의 동결 보존에 사용되는 양을 유의하게 감소 또는 반감한 양이며, 본 발명에 따른 소 정자의 동결 보존용 조성물은 세포 독성이 낮은 동결 보호제이다.

제1 실시형태에 의한 바람직한 동결 보존 방법에 따르면, 부동 폴리아미노산 및 글리세린을 첨가한 생리적 용액에 의해 소의 정액을 5~20배에 희석함으로써, 0.3~0.9 w/w%의 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산)과 2~4 w/w%의 글리세린과 소의 정액에서 유래하는 부분을 함유하는 동결 보존액 안에 소 정자를 현탁시키도록 하는 희석 공정과 소 정자를 현탁시킨 동결 보존액을 관형 용기 안에서 동결에 제공하는 공정과 이 후, -60℃ 이하의 온도로 유지함으로써 보존을 하는 공정을 포함한다.

상기 희석 공정은 바람직하게는 소의 정액을 생리적 용액에 의해 2.5~10배 희석하고, 2~8℃로 유지하는 1차 희석 공정과 2~8℃로 유지하면서 1차 희석 공정에 의해 얻어진 현탁액에 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산)과 글리세린을 첨가한 생리적 용액을 점적에 의해 첨가함으로써, 추가로 희석함하여 소의 정액이 5~20배 희석되도록 하는 2차 희석 공정을 포함한다.

또한 바람직하게는 지름이 5 mm 이하인 동결 보존용 빨대를 사용해 프로그램 냉각기 등에 의한 냉각 속도 100℃/분 이하의 완만 동결법으로 또는 액체 질소 침지에 의해 냉각 속도 300℃/분 이상의 유리화 동결법으로 -140℃ 이하까지 냉각한다. 또한 바람직하게는 동결 융해 6시간 후에서 운동 정자율을 30% 이상으로 하고, 고속 직진 운동률을 10% 이상으로 할 수 있다.

생리적 용액으로서는 등장성 트리스·구연산 완충액(트리스(하이드록시메틸 아미노메탄), 구연산, 글루코스, 염화나트륨 등의 수용액(생리 식염수 포함), 또는 이것에 난황, 아미노산 등을 적절히 첨가한 것, M199, CR1aa, 둘베코 수정 배지(DMEM), 이글 MEM 배지(MEM) 등의 적어도 일종을 적절히 사용할 수 있다. 배지는 예를 들면 1000mg/L~4500mg/L의 글루코스 또는 기타 단당류, 이당류 등을 포함할 수 있다.

소 정자의 보존에 바람직한 생리적 용액의 예로서는 아래와 같이 조제한 트리스 구연산·완충액 기반의 것을 들 수 있다. 즉, 일 구체예에 있어서, 17.031g의 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄(와코순약공업), 9.519g의 구연산 일수화물(와코 순약공업), 3.000g의 글루코스(와코 순약공업) 및 4.625g의 염화나트륨(와코 순약공업), 또한 100만 IU/4.6ml SPUF의 페니실린 G 칼륨(만유 제약)을 3ml, 1000mg역가/4.3ml SPUF의 스트렙토마이신(메이지 제과)을 3ml 추가하고, 증류수로 1000ml에 메스 업하여 140.6mM의 트리스(하이드록시메틸 아미노메탄), 45.3mM의 구연산, 16.7mM의 글루코스, 79.1 mM의 염화나트륨을 포함한 수용액으로 한 것을 사용할 수 있다.

소 정자의 보존에 바람직한 생리적 용액의 다른 예로서는 난황을 첨가한 트리스·구연산 완충액(난황 트리스 당액(ET))을 들 수 있다. 이것은 사단법인 가축 개량 사업단이 「Sort 90」의 상품명으로 시판하는 정액 일차 희석액이다.

본 발명의 제2 실시형태에서는 본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물은 상기에 설명한 부동 폴리아미노산, 에틸렌글리콜, 프로판다이올, 소 태자 혈청을 포함한, 소 배아의 동결 보존용 조성물이다. 동결 보존 대상의 소 배아로서는 예를 들면 체외수정(IVF)에 의해 6~9일간(바람직하게는 7~8일간) 발생시킨 소 배아 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 소 배아의 동결 보존용 조성물은 예를 들면 5~10 w/w%(바람직하게는 7 w/w%) 농도의 부동 폴리아미노산, 4~6 w/w% 농도, 예를 들면 5 w/w% 농도의 에틸렌글리콜, 4~8 w/w% 농도, 예를 들면 6 w/w% 농도의 프로판다이올(1,3-프로판다이올; 프로필렌 글리콜) 및 15~25 w/w% 농도, 바람직하게는 20 w/w% 농도의 소 태자 혈청을 포함한다.

본 발명의 제3 실시예에서는 본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물은 상기에 설명한 부동 폴리아미노산과 소 태자 혈청을 포함한, 소 체세포의 동결 보존용 조성물이다. 동결 보존 대상의 소 체세포로서는 예를 들면 섬유아세포, 난구세포, 간엽계 세포, 골수 유래 간엽계 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 소 체세포의 동결 보존용 조성물은 예를 들면 5~30 w/w%(바람직하게는 5~25 w/w%) 농도의 부동 폴리아미노산, 및 65~85 w/w%(바람직하게는 70~80w/w%) 농도의 소 태자 혈청을 포함한다.

또한 본 발명에 따른 소 체세포의 동결 보존용 조성물은 디메틸 설폭사이드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 소 체세포의 동결 보존용 조성물은 예를 들면 0.1~10 w/w%(바람직하게는 4~6 w/w%, 5 w/w%) 농도의 디메틸 설폭사이드를 포함할 수 있다.

이상으로 설명한 본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물 안에 각종 소 세포를 현탁해, 예를 들면 -20~-100℃, 바람직하게는 -60~-90℃ 또는 -70~-90℃, 특히 바람직하게는 -80℃ 전후의 냉각기 안에서 동결함으로써, 각종 소 세포를 동결 보존할 수 있다. 소 정자에 대해서는 예를 들면 1500만~3000만개(바람직하게는 2000만~3000만개)의 소 정자를 0.25~0.5mL의 동결 보존용 조성물에 현탁해, 동결에 제공한다. 소 배아에 대해서는 예를 들면 1~50개(바람직하게는 1~2개)의 소 배아를 0.01~0.25mL(바람직하게는 0.02~0.05mL)의 동결 보존용 조성물에 현탁해, 동결에 제공한다. 소 체세포에 대해서는 예를 들면 50만~200만개(바람직하게는 50만~100만개)의 소 체세포를 0.2~2mL(바람직하게는, 1mL)의 동결 보존용 조성물에 현탁해, 동결에 제공한다.

동결한 소 세포를 사용할 경우에는 각종 소 세포의 일반적인 융해 방법에 준해, 동결한 소 세포를 융해하고 사용할 수 있다. 또한 부동 폴리아미노산은 세포 독성이 낮고 디메틸 설폭사이드 등과 달리 융해 시에 제거할 필요는 없다.

또한 본 발명에 따른 소 세포의 동결 보존용 조성물을 소 세포의 동결 보존용 키트로서 제공할 수도 있다. 해당 키트에는 동결 보존용 조성물과 함께 예를 들면 동결 보존에 사용하는 용기, 키트의 취급 설명서 등을 포함할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕 부동 폴리아미노산을 사용한 소 정자의 동결 보존

1-1. 동결 보존 용액의 조제

ε-폴리-L-라이신(Chisso사 제, 분자량 4000)의 25% 수용액에 몰%로 65%의 숙신산 무수물(와코 순약공업제)을 첨가하고, ε-폴리-L-라이신 분자 중의 아미노기의 60 몰%에 대해 카르복실화함으로써 블록한 부동 폴리아미노산을 제작했다.

이어서, 제작한 부동 폴리아미노산(CPLL)의 용액(약 33 w/w%의 수용액) 및 글리세린(Gly)을 둘베코 수정 배지(DMEM, Gibco(등록상표) 11330-032, 글루코스양: 3151mg/L)에 소정의 비율(글리세린 V/V%, CPLL w/w%)이 되도록 첨가했다. 이 때, pH가 7.0~8.0의 범위 내가 되도록 1N의 염산 또는 수산화나트륨 수용액으로 중화했다.

1-2. 소 정자의 동결 보존 방법

종웅우에서 채취한 정액은 정자의 수·운동성 등을 검사한 후, 1차 희석액(「1-1.」에서 사용한 둘베코 수정 배지)에서 5배 정도로 희석한 후, 저온실(4℃)에서 정치하고 천천히 냉각했다. 정액의 온도가 4℃ 정도까지 내린 단계에서 1차 희석액으로 최종 희석량의 반량까지 점적으로 희석했다. 그 후, 4℃ 정도의 온도를 유지하면서, 내동제가 들어간 2차 희석액(「1-1.」에서 얻어진 「동결 보존 용액」)을 점적으로 최종 희석량까지 희석하고, 동결 보존용 빨대(후지평공업주식회사 제품 「0.5ml 세 133형」, 지름 4mm×133mm)에 분주·주입했다. 그 후 잠시 정치하고, 프로그램 냉각기를 사용한 냉각 속도 100℃/분 이하의 완만 동결법으로 -150℃ 전후까지 냉각·동결한 후, 액체 질소 안에 보존했다. (2차 희석액 중의 내동제의 첨가량 글리세린: 13 v/v%: 종래형, 글리세린 6.5 v/v% + CPLL 1.0 w/v%: 신규형).

동결 보존된 정자 현탁액의 융해는 액체 질소 안에서 동결 보존용 빨대를 꺼낸 후 30~38℃의 온탕 안에 15초 침지함으로써 수행되었다.

1-3. 소 정자의 동결 보존 결과 및 고찰

동결 보존한 소 정자의 동결 융해 후의 생존성 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

표 1에 나타난 바와 같이, 소 정자의 동결 보존에 CPLL가 사용될 수 있는 것이 분명해졌다. 또한 CPLL를 첨가함으로써, 종래부터 사용되고 있는 Gly를 감소(반감)할 수 있었다. 이것은 새로운 조성의 세포 독성이 낮은 동결액을 의미한다.

동결 보존한 소 정자의 인공 수정에 의한 수태 성적을 이하의 표 2에 나타낸다.

표 2에 나타난 바와 같이, CPLL를 사용한 동결 소 정자의 인공 수정으로 유효한 수태율을 얻을 수 있었다. 이것은 동결 융해 후 발생 능력도 손상되지 않은 것을 의미한다.

1-4. 동결 융해 6시간 후의 정자 생존성(운동성) 평가

목적:

동결 융해 직후의 정자 생존성에 차이가 보이지 않았지만(표 1), 인공 수정에 의한 수태율에는 차이가 인정된 것에서(표 2) 그 요인을 검색했다.

방법:

종래법(6.5% 글리세린) 또는 신규법(3.25% 글리세린 + 0.5% CPLL)에 의해 동결되고 융해된 각각의 정자를 6시간 보온 보존한 후, 정자의 운동성을 조사했다. 소 정자의 운동성 평가에는 정자 운동 분석 장치(CASA; SMAS 3, Detect제) 및 측정용 챔버(MicroCell, Vitrolife 제)를 사용하여, 37℃에서 정자 운동 파라미터(운동률 Mot, 전진 운동률 Prog, 직선 속도 VSL, 곡선 속도 VCL, 평균 속도 VAP, 두부 진폭 AHL, 두부 진동수 BCF)를 측정했다. VAP＞10㎛/sec를 운동 정자, VAP＞50㎛/sec 및 STR＞0.75를 전진 운동 정자로 했다.

결과:

결과를 이하의 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타난 바와 같이, 동결 융해 6시간 후의 정자 생존성(운동성)은 종래법보다 신규법이 유의하게 양호했다.

고찰:

동결 융해 직후의 정자 생존성(운동성)에는 차이가 없기는 하지만 융해한 뒤 일정시간 경과한 정자의 생존성에 차이가 인정되었다.

인공 수정으로 자궁목관 또는 자궁체부로 주입된 정자는 4시간 정도 걸쳐 수정의 장소인 난관팽대부에 도달하는 것에서, 융해 후 일정시간 경과한 정자의 생존성 차이는 수태율로 영향을 줄 가능성이 시사된다.

1-5. 동결 융해 후 정자 두부의 세포막 평가

목적:

동결 융해 직후의 정자 생존성에 차이가 보이지 않았지만(표 1), 융해 6시간 후의 정자 생존성에 차이가 인정된 것에서(표 3) 그 요인을 검색했다.

방법:

종래법(6.5% 글리세린) 또는 신규법(3.25% 글리세린 + 0.5% CPLL)에 의해 동결되고 융해된 각각의 정자를 SYBR14와 propidium iodide(PI)로 염색을 하고, 정자 두부 세포막의 장애를 조사했다.

또한 세포막에 장애가 없는 경우는 SYBR14에 의해 녹색으로 물들고, 장애가 있을 경우에는 propidium iodide에 의해 붉게 물든다.

결과:

결과를 이하의 표 4에 나타낸다.

표 4에 나타난 바와 같이, 동결 융해 후의 정자 두부 세포막에 장애가 없는 비율은 종래법보다 신규법이 유의하게 많았다.

고찰:

동결 융해 6시간 후의 정자 생존성에 차이가 인정되는 요인의 하나는 동결 융해에 의한 정자 세포막으로의 손상에 의한 것과 추측된다.

〔실시예 2〕 부동 폴리아미노산을 사용한 소 배아의 동결 보존

2-1. 동결 보존 용액의 조제

ε-폴리-L-라이신(Chisso사 제, 분자량 4000)의 25% 수용액에 몰%로 65%의 숙신산 무수물(와코순약공업 제)을 첨가하고, ε-폴리-L-라이신 분자 중의 아미노기의 60 몰%에 대해 카르복실화함으로써 블록한 부동 폴리아미노산을 제작했다.

이어서, 제작한 부동 폴리아미노산 용액(CPLL), 에틸렌글리콜(EG), 프로판다이올(PD) 및 소 태자 혈청(FCS 또는 CS)을 인산 완충 생리식염수(PBS, Gibco 제)에 소정의 비율(w/w%)이 되도록 첨가했다. 이 때, pH가 7.0~7.5의 범위 내가 되도록 1N의 염산 또는 수산화나트륨 수용액으로 중화했다.

2-2. 소 배아의 동결 보존 방법

상실 배아에서 배반포기 배아로 성장한 소 배아는 20% 소 태자 혈청을 더한 PBS로 세척한 후, CPLL를 더한 동결 보존액에 침지하고, 즉시 0.25ml의 동결 보존용 빨대(IMV 제)에 동결액과 함께 봉입되었다(도 1). 봉입 후, 10분~20분의 평형 처리 후, 프로그램 냉각기에 의해 냉각 속도 100℃/분 이하의 완만 동결법으로 -30℃까지 냉각한 후, 액체 질소 안에 침지함으로써 동결이 이루어졌다. 동결 후에는 사용까지 액체 질소 안에서 보존되었다.

동결 보존된 동결 배아의 융해는 액체 질소 안에서 동결 보존용 빨대를 꺼내고, 5초간 공중에 유지된 후, 30~38℃의 온탕 안에 15 초간 침지함으로써 수행되었다.

2-3. 소 배아의 동결 보존 결과 및 고찰

동결 보존한 소 배아의 동결 융해 후의 생존성 결과를 이하의 표 5에 나타낸다.

표 5에 나타난 바와 같이, 소 배아의 동결 보존(완만 동결법)에 CPLL가 사용될 수 있는 것이 분명해졌다. 또한 종래의 동결 보호제(농도)에 CPLL를 첨가함으로써, 종래와 다르지 않는 생존성을 확보할 수 있었다. 이것은 새로운 조성의 동결액을 의미한다.

동결 보존한 소 배아의 배아 이식 성적을 이하의 표 6에 나타낸다.

표 6에 나타난 바와 같이, CPLL를 사용한 동결 소 배아의 배아 이식으로 유효한 수태율을 얻을 수 있었다. 이것은 동결 융해 후 발생 능력은 손상되지 않은 것을 의미한다.

동결 보존한 소 배아의 동결 융해 후에 동결액 노출 시 배아의 생존성 결과를 이하의 표 7에 나타낸다.

〔실시예 3〕 부동 폴리아미노산을 사용한 소 체세포의 동결 보존

3-1. 동결 보존 용액의 조제

ε-폴리-L-라이신(Chisso 사 제, 분자량 4000)의 25% 수용액에 몰%로 65%의 숙신산 무수물(와코순약공업 제)을 첨가하고, ε-폴리-L-라이신 분자 중의 아미노기의 60 몰%에 대해 카르복실화함으로써 블록한 부동 폴리아미노산을 제작했다.

이어서, 제작한 부동 폴리아미노산 용액(CPLL), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 소 태자 혈청(CS)을 둘베코 수정 배지(DMEM, Sigma Aldrich 제)에 소정의 비율(w/w%)이 되도록 첨가했다. 이 때 pH가 7.0~7.5의 범위 내가 되도록 1N의 염산 또는 수산화나트륨 수용액으로 중화했다.

3-2. 소 체세포의 동결 보존 방법

조직 배양용 플라스크(디시)로 컨플루언트(confluent)까지 배양된 소 체세포는 PBS 세척, 트립신에 의한 효소 처리 등 정법에 의해 회수되었다. 회수된 소 체세포는 동결 보존용 튜브(1.0ml용, Falcon 제) 안의 동결 보존액에 침지되고, 즉시 -80℃ 초저온(deep) 냉장고 내에 놓여져 동결 및 보존되었다(장기간 저장의 경우는 액체 질소 안에 보관).

동결 보존된 체세포의 융해는 보관 장소보다 꺼내진 후, 즉시 30~38℃의 온탕 안에 튜브 내에 쌀알 크기 정도의 얼음 결정이 남을 때까지 침지되고, 정법에 의해 원심 조작에 의해 동결 보존액이 제거된 후, 세포 배양용 디바이스에 파종되었다. 또한 본 동결 보존액에 의한 동결에서는 융해 후의 동결 보존액의 제거가 불필요했다(제거하지 않고 파종하는 것이 가능했다).

3-3. 소 체세포의 동결 보존 결과 및 고찰

동결 보존한 소 체세포(소 피부 유래 섬유아세포)의 동결 융해 직후의 생존성 결과를 이하의 표 8에 나타낸다. 또한 동결 보존한 소 체세포(소 피부 유래 섬유아세포)의 동결 융해 후의 세포 증식성 결과를 이하의 표 9에 나타낸다. 또한 동결 보존한 소 체세포(소 피부 유래 섬유아세포)의 동결 융해 후에 파종한 접착 세포수(동결 보호제 제거 후 파종)를 도 2에 나타낸다.

동결 보존한 소 체세포(소 난구세포)의 동결 융해 직후의 생존성 결과를 이하의 표 10에 나타낸다. 또한 동결 보존한 소 체세포(소 난구세포)의 동결 융해 후의 세포 증식성 결과를 이하의 표 11에 나타낸다. 또한 동결 보존한 소 체세포(소 난구세포)의 동결 융해 후에 파종한 접착 세포수(동결 보호제 제거 후 파종)를 도 3에 나타낸다.

표 8~11 및 도 2~3에 나타난 바와 같이, 소 체세포의 동결 보존에 CPLL를 사용할 수 있는 것이 분명해졌다.

표 8 및 9 및 도 2에 나타난 바와 같이, 소 피부 유래 섬유아세포에서는 동결 보호제로서 CPLL는 DMSO의 대체가 되고, CPLL만을 동결 보호제로서 동결 보존이 가능했다. 또한 동결 융해 후의 증가 능력은 DMSO보다 CPLL 사용이 높았다. 또한 CPLL는 동결 융해 시에 제거를 할 필요는 없고 제거하지 않고 세포를 파종할 수 있었다.

한편, 표 10 및 11, 및 도 3에 나타난 바와 같이, 난구세포에서는 동결 보호제로서 CPLL는 DMSO의 대체가 되고, CPLL만을 동결 보호제로서 동결 보존이 가능했다. 또한 동결 융해 후의 증가 능력에서 섬유아세포(CPLL 5%)와 난구세포(CPLL 25%)의 지적 CPLL 농도가 달랐다.

Claims (2)

1. 소 배아를 현탁시켜 동결하기 위한 소 배아의 동결 보존액으로서,
   하기 식(I)으로 표시되는 구성 단위 및 하기 식(II)으로 표시되는 구성 단위를 포함하고, 하기 식(II)으로 표시되는 구성 단위의 비율이 50~99 몰%인 양성 고분자 전해질(부동 폴리아미노산) 5~10 w/w%, 에틸렌글리콜 4~6 w/w%, 프로판다이올 4~8 w/w%, 및 소 태자 혈청 15~25 w/w%를 포함하는, 소 배아의 동결 보존액.
   

   

   
   

   
2. 청구항 1의 동결 보존액에 의해 냉각 속도 100℃/분 이하의 완만 동결법으로 냉각 및 동결을 하는, 소 배아의 동결 보존 방법.

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