KR102301101B1

KR102301101B1 - 천연 오일 및 천연 추출물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102301101B1
Application number: KR1020210043862A
Authority: KR
Inventors: 박명화
Original assignee: 박명화
Priority date: 2021-04-05
Filing date: 2021-04-05
Publication date: 2021-09-09
Anticipated expiration: 2041-04-05
Also published as: KR102551364B1; KR20220138322A

Abstract

본 발명은 식물 오일 및 천연 추출물을 함유하는 피부 외용제에 관한 것으로, 구체적으로 파인 오일을 아미노 알코올과 효소 반응을 통해 세라마이드와 유사한 피부 보습 및 피부장벽 강화 효과를 가지면서 유화 안정제로 작용할 수 있는 피부 외용제에 관한 것이다. 나아가, 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물과 혼합하여 항균 및 항염 용도로 활용할 수 있다. 나아가, 본 발명의 피부 외용제는 복수의 유효성분을 포함함으로써, 피부 열감 개선 및 쿨링 효과를 나타냄과 동시에 체내 독소 배출 효과를 기대할 수 있다.

Description

천연 오일 및 천연 추출물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING NATURAL OILS AND NATURAL EXTRACTS}

본 발명은 식물 오일 및 천연 추출물을 함유하는 피부 외용제에 관한 것으로, 구체적으로 파인 오일을 아미노 알코올과 효소 반응을 통해 세라마이드와 유사한 피부 보습 및 피부장벽 강화 효과를 가지면서 유화 안정제로 작용할 수 있는 피부 외용제에 관한 것이다. 나아가, 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물과 혼합하여 항균 및 항염 용도로 활용할 수 있다.

피부는 신체의 외부를 덮고 있는 하나의 막으로 여러 가지 외부의 자극, 장해, 건조 등의 환경요소로부터 신체를 보호해 주는 다양한 생리적 기능을 수행하여 내부 장기와 그 밖의 체내 기관을 보호 조절하는 역할을 한다.

그러나, 피부는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적 기능이 저하되어 신진 대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되게 된다. 또한 광 또는 열에 반복적인 노출로 인해 피부의 외양 또는 기능이 변하게 되는데, 이로 인해 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스 등은 피부의 정상 기능 저하, 멜라닌 침착에 의한 기미, 주근깨 등의 생성 및 피부 노화현상을 촉진하여 피부를 손상시키게 된다.

이러한 피부노화 및 손상을 방지하여 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻어진 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화시켜 피부 신진대사를 촉진하여 피부 건강을 유지하고자 하는 노력이 계속되고 있으며, 이에 따른 화장품, 피부 외용제 등이 개발되고 있다.

그러나, 이들 물질은 피부 적용시 자극, 홍반, 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부 기능 개선 효과를 기대기 어려웠다. 따라서, 기존의 피부 외용제 조성물 보다 생체에 안전하고 효과가 높은 새로운 피부 외용제 조성물의 개발이 요구되고 있다.

한국 등록특허 제 10-1523631호

본 발명의 목적은 파인(Pinus sylvestris) 발효 오일, 할미꽃(Pulsatilla koreana NAKAI.) 식물세포 또는 부정근 배양 추출물 및 후박나무(Machilus thunbergii) 껍질 추출물을 포함하는 항균 또는 항염용 피부 외용제를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 피부 외용제 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면은 파인발효 오일, 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물을 포함하는 항균 또는 항염용 피부 외용제에 관한 것이다.

식물성 오일은 식물의 과실 또는 종자로부터 압착법과 증류법 등으로 얻어지는 오일을 지칭하는 것으로서, 각종 불포화 지방산을 다량 함유하고 있어 피부의 유연감 향상, 피부 보호장벽 강화 효과를 가지며, 또한 피부보습 및 영양제공 효과를 가진다. 또한 식물성 오일 내에 함유되어있는 유리 지방산, 특히 팔미틱 애씨드, 라우릭 애씨드, 리시놀레익 애씨드, 리놀레닉 애씨드 등은 강한 항염 효과를 가진다고 알려져 있다.

본 발명에서는 식물성 오일 중 천연 아로마 오일로 알려진 파인 오일을 아미노 알코올과 혼합한 뒤 효소로 반응시킬 경우, 상기 파인발효 오일은 유화안정제의 작용뿐만 아니라 피부가 건조해지는 것을 막고 보습 및 피부 장벽 강화 유지에 우수한 효과가 있음을 규명하였다.

구체적으로 상기 아미노 알코올은 1급 또는 2급 아미노기와, 1개 이상의 히드록시기를 가지는 것으로서, 1-아미노-2-프로판올, 2-아미노-1-프로판올, 3-아미노-1-프로판올, 2-(메틸아미노)에탄올, 1-아미노-2-부탄올, 3-아미노부탄-1,2-디올, 2-아미노-1-부탄올, 3-아미노-1-부탄올, 4-아미노-1-부탄올, 1-아미노-2-메틸-2-프로판올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 2-(에틸아미노)에탄올, 2-아미노-3-메틸-1-부탄올, 1-아미노-2-펜탄올, 2-아미노-1-펜탄올, 5-아미노-1-펜탄올, 2-(프로필아미노)에탄올, 1-아미노-2-헥산올, 2-아미노-1-헥산올, 6-아미노-1-헥산올, 디에탄올아민, 3-아미노-1,2-프로판디올, 2-아미노-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-에틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올(Trisamine), 2,3,4,5,6-펜타히드록시헥실아민(Dglucamine), N-메틸-2,3,4,5,6-펜타히드록시헥실아민(N-methyl-D-glucamine), N-에틸-2,3,4,5,6-펜타히드록시 헥실아민(N-ethyl-D-glucamine), N-프로필-2,3,4,5,6-펜타히드록시헥실아민(N-propyl-D-glucamine), N-부틸-2,3,4,5,6-펜타히드록시헥실아민(N-butyl-D-glucamine), N-펜틸-2,3,4,5,6-펜타히드록시헥실아민(N-pentyl-Dglucamine) 또는 N-헥실-2,3,4,5,6-펜타히드록시헥실아민(N-hexyl-D-glucamine) 등 제한없이 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 아미노 알코올은 3-아미노부탄-1,2-디올일 수 있다.

상기 효소는 리파아제일 수 있으며, 보다 구체적으로 리포자임 TL IM (Lipozyme TL IM) 또는 리포자임 RM IM (Lipozyme RM IM)일 수 있다.

또한, 상기 피부 외용제는 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물을 포함할 수 있으며 상기 할미꽃 식물세포 배양물은 할미꽃 식물체의 일부, 예컨대, 줄기, 또는 잎의 전체 또는 일부를 잘라 유도 배지에서 배양을 통해 수득될 수 있다.

상기 배양 유도는 식물조직배양에 관한 것으로, 살아있는 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식시킬 수 있다. 상기 식물조직배양은 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용하는 것으로 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 기반으로 한다.

즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 상기 분화전능성은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존하기 위해 요구된다. 모식물체로부터 분리된 식물 조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성뿐만 아니라 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

상기 "식물 세포 배양물"은 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 의미한다. 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 구성되며, 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함할 수 있다.

상기 식물 세포 배양물은 할미꽃의 줄기, 잎 등의 어느 부위로부터 유도된 것이든 무방하나, 일 구체예로, 할미꽃의 줄기와 잎의 조직 일부, 또는 할미꽃 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 식물세포일 수 있고, 할미꽃의 일부 조직을 분리하여 옥신 및 사이토키닌의 함량을 조절한 배지에서 형성된 식물세포 일 수 있다. 부정근 배양의 경우는 식물 세포 배양 과정과 동일하게 진행되나, 다만, 부정근이 유도될 수 있도록 식물 호르몬의 조합을 달리할 수 있다.

상기 피부 외용제는 일랑일랑꽃 오일, 자몽껍질 오일, 알로에베라잎 추출물 및 초피나무열매 추출물을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 “추출물”은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분이 전이된 용매를 지칭하는 것으로, 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질이라면, 추출 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 물이나 유기용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출한 것, 천연물의 특정 성분, 예컨대 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물은 상기 나노클로롭시스 오세아니카를 건조 후 분말화하거나, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득할 수 있다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있고, 구체적으로 60 내지 90% 농도(v/v)의 에탄올에 의해 추출될 수 있다.

상기 원료에 포함된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출 비율이 상이해질 수 있으며, 상기 에탄올은 천연 원료의 생리 활성 물질 추출에 있어서 선택성이 뛰어나므로 상기 에탄올 추출에 의해 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있다. 물과 에탄올은 극성이 상이하고 각 극성에 따라 추출되는 유효성분이 달라질 수 있으므로 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있도록 상기 에탄올의 농도를 적절히 제어할 수 있다. 이 때, 상기 에탄올의 농도가 60% 미만이면 피부 개선 효과를 나타내는 유효성분이 충분하게 추출되지 않을 수 있고, 90% 초과이면 적정한 수율이 구현되지 않을 수 있다.

상기 추출물은 추출 원료를 물로 수세한 후 건조 및 분쇄하여, 원료 중량의 8 내지 12배에 달하는 부피의 용매로 약 1 내지 24시간 동안 환류 순환 추출, 가압 추출, 초음파 추출 등 통상적인 방법으로 추출 및 여과하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 감압 증류 또는 동결 건조 등과 같은 추가적인 공정에 의해 분말 상태로 수득할 수 있다.

상기 추출물은 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추출물은 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 상기 파인발효 오일 및 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 10.0 중량%를 각각 포함할 수 있다. 상기 파인발효 오일 및 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물의 함량이 0.5 중량% 미만인 경우 피부 개선 효과가 적절히 구현되지 않을 수 있고, 10.0중량% 초과인 경우 제품화에 요구되는 기타 성분의 비중이 감소하여 제품 본연의 상품성이 저하되거나, 비용 효율이 저하될 수 있다.

상기 조성물은 상기 일랑일랑꽃 오일, 자몽껍질 오일, 알로에베라잎 추출물, 초피나무열매 추출물 0.1 내지 5 중량부를 포함할 수 있다. 상기 추출물의 혼합 비율의 편차가 큰 경우 각 추출물의 유효성분에서 유래한 피부 개선 효과가 적절하게 구현되지 않을 수 있으므로, 작업 환경 및 최종 산물의 품질을 고려하여 혼합비율을 적절하게 제어할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 a) 파인 오일 및 아미노 알코올을 혼합하고 리파아제를 반응시켜 파인발효 오일을 제조하는 단계; b) 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물을 포함하는 식물 복합 추출물 제조 단계; 및 c) 상기 a) 단계의 파인발효 오일 및 b) 단계의 식물 복합 추출물을 혼합하는 단계;를 포함하는 피부 외용제 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로 상기 리파아제는 리포자임 TL IM (Lipozyme TL IM) 또는 리포자임 RM IM (Lipozyme RM IM)인 것일 수 있다.

상기 피부 외용제는 항균 또는 항염 용도일 수 있다.

본 발명의 파인 발효 오일은 유화안정제로 작용할 뿐만 아니라, 세라마이드를 대체하여 피부 보습 유지 및 장벽 강화 효과를 가질 수 있다.

즉, 하나의 유효성분으로 복수의 활성성분 및 부형제 역할을 대신할 수 있는 바, 다성분 혼합에 따른 피부 부작용 발생 위험은 줄이면서 피부 개선 효과는 높일 수 있으며, 한편 화장품 내 배합 성분의 가짓수를 줄일 수 있어 제조 가격 측면에서 경제적일 수 있다.

또한 본 발명의 피부 외용제는 파인발효 오일에 할미꽃 식물세포 배양 추출물 및 천연 오일 조합하여 우수한 항균 및 항염 효과를 가지는 바 기능성 화장품으로서 다양한 활용이 가능하다.

나아가, 본 발명의 피부 외용제는 복수의 유효성분을 포함함으로써, 피부 열감 개선 및 쿨링 효과를 나타냄과 동시에 체내 독소 배출 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

준비예 1. 파인발효 오일의 제조

파인(Pinus sylvestris) 잎 및 가지에서 추출한 오일을 1 : 1로 혼합시킨 뒤, 3-아미노부탄-1,2-디올(Sigma, MW=105.14) 21 g을 유리반응기에 넣고 용매로 삼차 뷰틸 알코올(tert-Butyl alcohol) 100 ml를 투입하였다. 여기에 효소 리보자임 TL IM(Lipozyme TL IM)을 3.0 g 투입한 후, 55℃에서 흔들어 섞으면서 24시간 반응시켰다. 반응 후 TLC 확인시험을 통하여 오일 부분의 스폿이 완전히 사라지는 것을 확인하고, 반응액의 효소를 100 메쉬(Mesh) 체로 거른 후 정제수 1,000 ml를 가하였다. 50℃에서 30분 교반 후 10℃ 이하에서 4시간 정치하였다. 수층을 분리하고 세척공정을 2회 추가 실시하고, 잔류물을 60℃ 진공에서 증류 제거하여 파인 오일과 3-아미노부탄-1,2-디올의 발효 생성물을 수득하였다.

준비예 2. 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물의 제조

인터넷에서 수득한 할미꽃 씨앗을 70%(v/v) 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 소독액(30% 락스+Tween20)으로 20분 소독하였다. 멸균수로 3회 수세하여 발아시킨 후, 할미꽃 식물체의 잎을 칼로 상처를 내어 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린(6-Benzylaminopurine), 0.3 mg/L 2,4-D, 3% 수크로즈(Sucrose) 및 한천(agar) 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대배양은 2주 간격으로 수행하였다.

또한, 할미꽃 식물세포로부터 부정근을 유도하기 위하여 MS 기본배지에 수크로즈 30 g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0 g/L을 첨가하였고, 생장조절물질 인돌-3-뷰티르산(indole-3-butyric acid, IBA) 0.5 mg/L을 첨가하여 25±2℃의 배양실에서 4주간 배양하였다. 유도된 부정근의 정단부를 약 1 cm 절단하여 0.5 mg/L의 IBA, 수크로즈 50 g/L을 첨가한 액체배지(1/2 MS 배지)에 접종하고, 25℃의 배양실에서 4주간 배양하였다. 수확한 부정근은 스테인리스 채로 걸러 배지를 분리해내고 수분을 제거한 후 60℃로 2일간 건조하여 실험에 사용하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 이후 할미꽃 식물세포를 MS배지에 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린(6-Benzylaminopurine) 0.3 mg/L 2,4-D가 함유된 배지에서 배양하였다. 할미꽃 부정근은 IBA 0.5mg/L, 수크로즈 50 g/L가 함유된 1/2 MS 배지에서 25℃, 습도 70% 조건으로 5주간 배양하였다.

배양 후 할미꽃 식물세포 및 부정근 배양물을 수확하여 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 할미꽃 식물세포 및 부정근 배양물 분말 100 g을 1 L의 정제수와 혼합한 후 90 내지 120℃에서 48시간 동안 열수 추출하였다. 250메쉬 및 0.5 μm 필터로 추출물을 여과한 후 30℃에서 감압 농축하고, 동결 건조하여 고형분을 수득하였다.

준비예 3. 할미꽃, 후박나무껍질, 알로에베라잎 및 초피나무열매 추출물의 제조

할미꽃, 후박나무껍질, 알로에베라잎 및 초피나무열매를 각각 수세한 후 상온에서 완전히 건조시키고 분쇄하여 분쇄물을 각각 100 g씩 수득하였다. 각 분쇄물 100 g에 대해 각각 10배 부피의 에탄올 수용액(70% 질량농도)를 용매로 하여 70℃의 온도에서 12시간 동안 침적 추출하였다. 추출물을 250메쉬 및 0.5 μm필터로 여과한 후 잔여 원료에 대해 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 상기 추출물을 30℃에서 감압 농축하고, 동결 건조하여 고형분을 수득하였다.

실시예 및 비교예

수득한 오일 및 추출물의 피부 개선 효과를 검증하고자 하기 표 1과 같이 시료를 혼합하여 실시예 및 비교예를 설정하였다.

[함량(중량부)]

구분	실시예			비교예
구분	1	2	3	1	2	3
파인발효 오일	30	30	30	-	30	-
파인오일	-	-	-	30	-	30
할미꽃 식물세포 배양 추출물	30	-	30	30	-	-
할미꽃 부정근 배양 추출물	-	30	-	-	-	-
할미꽃 추출물	-	-	-	-	30	-
후박나무껍질 추출물	20	20	20	20	20	-
알로에베라잎 추출물	-	-	2.5	-	-	-
초피나무 열매 추출물	-	-	2.5	-	-	-
일랑일랑꽃 오일	-	-	2.5	-	-	2.5
자몽껍질 오일	-	-	2.5	-	-	2.5

실험예 1. 항균 효능 확인

1-1. 여드름균에 대한 페이퍼 디스크(paper disc) 항균 시험

상기 실시예 및 비교예를 70% 에탄올로 농도별 (0.25%, 0.5%, 1%)로 희석하여 농도별 여드름균에 대한 항균 시험을 진행하였다. 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium Acnes; P. acnes) 10 ml를 액체 배지 (GAM Broth, Gifu Anaerobic Medium Broth)에 접종하고 37℃에서 24시간씩 3회 계대배양하여 항균 활성 시험 균주로 사용하였다. 상기 균주가 배양된 액체 배지에 paper disc를 떨어뜨린 후 상기 실험 용액을 상기 paper disc에 20 μl씩 적하하였다. 그 후 37℃에서 72시간 배양하고 disc 주변에 생성된 균의 생육저해환 (clear zone) 직경을 측정하여 항균 활성을 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이때, 상기 혼합물들의 항균 활성을 비교 및 대조하기 위하여 양성대조군으로 페녹시에탄올(phenoxy ethanol)을 사용하였다.

구분	생육저해환 크기 (cm)
구분	0.25%	0.5%	1%
실시예 1	1.0	1.4	1.8
실시예 2	1.0	1.4	2.0
실시예 3	1.1	1.5	2.1
비교예 1	0.9	1.2	1.9
비교예 2	0.8	1.2	1.7
비교예 3	0.6	1.0	1.6
페녹시에탄올	0.7	1.1	1.6

그 결과, 파인발효 오일, 할미꽃 식물세포 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물을 모두 포함하는 실시예 1 내지 3의 조성물이 여드름균 P. acenes에 대하여 양성대조군 대비 우수한 항균 활성을 보이는 것을 확인하였다. 1-2. 여드름균에 대한 최소저해농도 측정

상기 실시예의 여드름균에 대한 항균 활성 확인을 위해 추가로 여드름균에 대한 최소저해농도(minimal inhibitory concentration, MIC) 측정 시험을 진행하였다. 균주는 그람 양성균 Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC6538P), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis, ATCC12228) 및 그람 음성균 Escherichia coli (E. coli, ATCC8739), Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa, ATCC9027)를 사용하였다. 각각의 균주는 영양배지(nutrient broth) 용액을 제조하여 멸균한 후 각각의 배양된 균주를 영양배지 용액 10 ml에 접종하고, 진탕 배양기(shaking incubator)에서 24시간 배양하여 항균 실험을 위한 균주를 준비하였다. 실시예 및 비교예를 0.01 내지 1 중량%가 되도록 배지에 첨가하여 제조한 후 제균하여 약 1×10⁸ CFU/ml가 되도록 S. aureus, S. epidermidis, E. coli 및 Ps. aeruginosa를 접종한 후 호기 조건하에서 37℃, 24시간 배양하였으며, 실험 용액을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하였다. 배양이 끝난 배지 용액에 대해서 각 균주의 증식 유무를 확인하기 위하여 무균공간에서 시료를 약 1 ml씩 취하여 멸균된 큐벳에 분주하고 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 증식을 확인하였고, 대조군과 비교하여 각각의 균주에 대하여 낮은 증식도를 보인 최소 농도를 측정하여 이를 최소저해농도로 하였다. 최소저해농도 (중량%) 측정에 대한 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

시험 균주	최소저해농도 (중량%)
	실시예			비교예			대조군
	1	2	3	1	2	3	대조군
S. aureus	0.16	0.12	0.07	0.32	>100	0.55	0.91
S. epidermidis	0.10	0.08	0.08	0.25	0.27	>100	0.87
E. coli	0.21	0.25	0.20	0.50	0.60	0.59	1.34
Ps. aeruginosa	0.15	0.12	0.13	0.24	0.29	>100	1.10

그 결과, 파인발효 오일, 할미꽃 식물세포 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물을 모두 포함하는 실시예 1 내지 3에서 전반적으로 우수한 항균 효과가 있음을 확인하였으며, 특히 할미꽃 식물세포 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물 조합에 따라 파인발효 오일의 항균 효과가 현저히 향상됨을 알 수 있었다.

실험예 2. 항염 효능 확인

RAW 264.7세포를 48 웰(well) 플레이트에 1.0 Х 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18 시간 동안 배양하였다. 10 % fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM으로 교환하고 시료를 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액을 회수하고 Mouse IL-6(Cat. No.M6000B) kit 내의 실험방법을 따라 진행 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 표 4는 각 시료들의 Interleukin 6(IL-6) 생성량을 측정한 결과이다.

시료		IL-6 production (%)	SD (%)
LPS(-)	Con.	5.04	0.199
LPS(+)	0	100.00	0.754
비교예 2	25 μg/ml	109.05	2.951
	50 μg/ml	97.70	0.781
	100 μg/ml	87.40	0.559
실시예 1	25 μg/ml	97.42	0.698
	50 μg/ml	90.07	0.976
	100 μg/ml	81.22	0.840
실시예 2	25 μg/ml	97.70	1.191
	50 μg/ml	87.40	0.022
	100 μg/ml	80.23	0.839
실시예 3	100 μg/ml	79.88	0.793

그 결과, LPS 자극으로 인해 과량으로 생성된 IL-6 생성량을 비교하면, 실시예 1 내지 3이 비교예 2보다 IL-6의 생성량이 낮은 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. 피부 보습 ?? 건조 개선 효과 확인

피부 보습 효능을 평가하기 위하여 만 30세 내지 50세의 성인 남녀 20명을 대상으로 상박부 좌우 2×2 cm²씩 4 구획으로 나누고, 실시예 1, 3 및 비교예 1의 수딩젤을 도포 개시 전과 도포 후 120분, 240분 경과한 시점에 항온, 항습 조건 (24℃, 상대습도 40%)에서 피부에 존재하는 수분량을 측정하는 수분측정기인 코니오미터 (corneometer, Courage+Khazaka electronic GmbH)를 이용하여 피부 수분량을 각 5회씩 측정하였으며, 평균값을 구하였다. 인체적용시험을 위한 수딩젤 제형의 성분은 하기 표 5에 기재하였다.

시험 개시 직전에 측정한 코니오미터 값을 기준으로 하여 도포 후 일정 시간 경과했을 때 측정값의 증가분을 백분율(%)로 표시하였다.

수딩젤
원료명	%(W/W)
원료명	실시예 1	실시예 3	비교예 1
글리세린	8.0	8.0	8.0
프로필렌글라이콜	0.3	0.3	0.3
글리세릴아크릴레이트/아크릴릭애씨드코폴리머	0.4	0.4	0.4
알로에베라잎 추출물	-	0.1	-
초피나무열매 추출물	-	0.1	-
할미꽃 부정근 배양 추출물	1.2	1.2	1.2
어스니어 추출물	-	0.1	-
마치현 추출물	-	0.1	-
후박나무껍질 추출물	0.8	0.8	0.8
프로폴리스	0.3	0.3	0.3
카보머	0.3	0.3	0.3
알지닌	0.3	0.3	0.3
소듐 하이알루로네이트	0.5	0.5	0.5
일랑일랑꽃 오일	-	0.1	-
자몽껍질오일	-	0.1	-
페퍼민트오일	0.05	0.05	0.05
파인발효 오일	1.2	1.2	-
파인오일	-	-	1.2
정제수	To 100	To 100	To 100

구분	경피 수분 증가율 (%)
구분	도포 후 120분	도포 후 240분
실시예 1 수딩젤	26.4	24.5
실시예 3 수딩젤	27.3	25.7
비교예 1 수딩젤	24.5	23.9

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 3은 비교예 1에 비해 경피 수분 증가율이 높으며, 도포 후 수분 유지 효과에 현저한 효과가 있음을 확인하였다. 이는 파인 오일의 지방산과 효소를 반응시킴으로써 세라마이드와 유사한 피부 건조 방지 및 피부 보습 효과를 가짐을 시사한다.

실험예 4. 유화 안정 효능 확인

실시예에 대한 유화 안정성을 확인하기 위하여 상기 표 5의 실시예 1 및 비교예 1의 수딩젤을 상온과 고온(45℃)에서 6개월간 보관하고 관찰하여 그 결과를 표 7에 나타내었다.

구분	3개월 후		6개월 후
구분	상온	45℃	상온	45℃
실시예 1 수딩젤	안정	안정	안정	안정
비교예 1 수딩젤	안정	약간분리	안정	약간분리

상기 표 7에 나타난 바와 같이 파인 오일을 아미노 알코올 및 리파아제 효소와 반응시킨 생성물을 함유함으로써 상온 및 고온 조건에서 비교예 1 보다 유화 안정성이 개선되었음을 확인하였다. 전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

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a) 파인(Pinus sylvestris) 잎 및 가지에서 각각 추출한 오일을 1 : 1의 중량비로 혼합한 오일 및 3-아미노부탄-1,2-디올(3-aminobutane-1,2-diol)을 혼합하고 리파아제인 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM)를 반응시켜 파인발효 오일을 제조하는 단계;
b) 할미꽃 식물세포 또는 부정근 배양 추출물 및 후박나무껍질 추출물을 포함하는 식물 복합 추출물을 제조하는 단계; 및
c) 상기 a) 단계의 파인발효 오일 및 b) 단계의 식물 복합 추출물을 혼합하는 단계;를
포함하는, 항균 및 항염용 피부 외용제 제조방법.
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제3항에 있어서,
상기 피부 외용제는 일랑일랑꽃 오일, 자몽껍질 오일, 알로에베라잎 추출물 및 초피나무열매 추출물을 추가로 더 포함하는, 피부 외용제 제조방법.