KR102279689B1 - 프라이머 다이머 형성을 감소시키고 증폭 효율을 증가시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머 형성 및 비특이적 증폭 산물의 생성을 효과적으로 억제할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 대한민국 특허청에 2016년 12월 29일에 출원된 대한민국 특허 출원 제2016-0182955호의 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
기술분야
본 발명은 프라이머 다이머 형성을 감소시키고 증폭 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
핵산 증폭은 분자 생물학에서 광범위한 방법을 위한 필수적인 과정으로서, 다양한 증폭 방법이 제시되었다. 예를 들어, Miller, H. I. 등(WO 89/06700)은, 프로모터/프라이머 서열을 타겟 단일가닥 DNA("ssDNA")에 혼성화시킨 다음, 상기 서열의 많은 RNA 카피를 전사하는 과정을 포함하는 핵산 서열 증폭 방법을 개시하고 있다. 다른 공지의 핵산 증폭 방법들은 전사-기반 증폭 시스템을 포함한다(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); 및 Gingeras T.R. et al., WO 88/10315).
중합효소 연쇄반응(이하,"PCR"로 지칭함)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형으로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki 등, (1985) Science 230, 1350-1354).
PCR-기반 기술들은 타겟 DNA 서열의 증폭뿐만 아니라 생물학 및 의학 연구 분야에서 과학적 응용 또는 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 역전사 효소 PCR(RT-PCR), 분별 디스플레이 PCR(DD-PCR), PCR에 의한 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), 임의적 프라이밍 PCR(AP-PCR), 멀티플렉스 PCR, SNP 지놈 타이핑, 및 PCR-기반 지놈 분석이 있다(McPherson and Moller, 2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY).
상기 PCR-기반 기술들은 타겟 핵산 분자의 증폭을 수반하므로, 타겟 서열만을 정확히 그리고 효율적으로 증폭하는 것이 요구된다. 이를 위하여, 적절한 서열 및 길이의 프라이머를 선택하고, 사용하는 성분(예컨대, DNA 중합효소, dNTPs, Mg 이온 및 버퍼)의 유형 및 함량 및 반응 온도/시간을 적절히 조절하여 증폭 반응을 실시하는 것이 필요하다. 하지만, 일부 경우, 최적의 반응 조건을 선택하기 어려우며, 선택된 반응 조건 하에서도 만족할 만한 증폭 효율이 달성되지 않을 수 있다. 보다 효율적인 증폭을 위하여 다양한 방법이 개발되었다.
한편, 프라이머 다이머의 형성에 의해 증폭 효율의 감소가 유발될 수 있다. 이와 관련하여, Lebedev at al은 초기 반응에서 저온 조건 하에 발생하는 프라이머의 비특이적인 혼성화를 방지하기 위해, 프라이머의 3' 말단 포스포디에스테르 연결 또는 두 번째 포스포디에스테르 연결에 4-옥소-1-펜틸(OXP) 포스포트리에스테르(PTE) 기가 도입된 프라이머를 사용함으로써 특이도 및 증폭 효율을 개선하는 방법을 개시하고 있다(참조: Lebedev at al., Nucleic Acids Res 2008;36:e131).
프라이머는 타겟 분자에 특이적으로 혼성화하여 그의 증폭을 개시하기 때문에 증폭 반응의 특이도 및 효율에 유의한 영향을 미친다. 특히, 다수의 프라이머를 사용하는 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머의 중요성은 더 강조된다.
전형적으로, 프라이머 다이머 형성을 최소화하기 위해 프라이머가 혼성화되는 부위를 변경하거나 프라이머의 서열 또는 길이를 조절하는 방법이 사용되어 왔으나, 멀티플렉스 증폭 반응에 사용되는 프라이머 디자인에 적용하기에는 한계가 있다. 따라서, 프라이머 다이머 형성을 효과적으로 억제하는 새로운 방법이 여전히 필요하며, 이러한 방법은 단독으로 또는 상기 기재된 공지된 방법과 조합하여 보다 경제적이고 간편한 방식으로 증폭 효율을 개선할 것이다.
본 출원 전반에, 다수의 특허 및 인용문헌이 참조되고 그 인용이 괄호에 제공되어 있다. 이들 특허 및 인용문헌의 개시내용은 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술분야를 보다 상세하게 기술하기 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
본 발명자들은 멀티플렉스 증폭 반응, 특히 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서, 프라이머 다이머 형성을 효과적으로 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 멀티플렉스 증폭 반응에서 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)를 함유하는 프라이머(들)의 사용이 프라이머 다이머 형성을 억제시키고, 이로써 증폭 효율을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머 형성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 방법에 사용하기 위하여 프로세서가 프라이머 쌍을 디자인하도록 구성된 명령을 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부된 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법을 제공한다:
(a) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍을 제조하는 단계; 상기 각각의 프라이머 쌍은 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 최소 1개의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하며, 나머지는 UBP의 5’-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위에 위치하고, 상기 최소 3개의 프라이머 쌍을 사용한 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성하며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이고;
(b) 상기 최소 3개의 프라이머 쌍을 사용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 2 사이클을 포함하는 멀티플렉스 증폭 반응을 실시하는 단계; 상기 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성한다.
본 발명자들은 멀티플렉스 증폭 반응, 특히 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서, 프라이머 다이머 형성을 효과적으로 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 멀티플렉스 증폭 반응에서 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)를 함유하는 프라이머(들)의 사용이 프라이머 다이머 형성을 억제시키고, 이로써 증폭 효율을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
종래의 핵산 증폭 반응에서, 프라이머 다이머와 같은 비특이적 부산물이 프라이머간 혼성화에 의해 우연히 생성될 수 있다. 본 발명은 비특이적 부산물 중에서 프라이머 다이머를 억제하는 것에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "프라이머 다이머(primer dimer)"는 2개의 프라이머의 상호혼성화(inter-hybridization)에 의해 또는 단일 프라이머의 내부혼성화(intra-hybridization; self-hybridization)에 의해 형성된 혼성화물(hybrid)을 지칭한다. 특히, 프라이머 다이머는 동일하거나 상이한 타겟 핵산 분자에 혼성화하는 프라이머의 쌍에 의해 형성되는 혼성화물을 포함한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은 프라이머 다이머는 2개의 프라이머의 혼성화물 자체뿐만 아니라 혼성화물을 구성하는 1개 또는 2개의 프라이머 가닥이 연장된 연장 산물을 포함한다.
프라이머 다이머의 각각의 프라이머 가닥이 연장되거나 연장되지 않는지 여부에 따라, 프라이머 다이머는 3개의 카테고리로 분류될 수 있다: (i) 비연장가능한 프라이머 다이머; (ii) 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머; 및 (iii) 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(도 2 참조).
본원에 사용된 바와 같은 비연장가능한 프라이머 다이머는 혼성화 후 2개의 프라이머 가닥이 핵산 중합효소에 의해 연장되지 않는 것을 지칭한다(도 2의 상부 열 참조). 본원에 사용된 바와 같이 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머는 혼성화 후 2개의 프라이머 가닥 중 하나가 핵산 중합효소에 의해 연장되는 것을 지칭한다(도 2의 중간 열 참조). 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머는 혼성화 후 2개의 프라이머 가닥이 핵산 중합효소에 의해 연장되는 것을 지칭한다(도 2의 하부 열 참조).
본 발명자들의 실험에 따르면, 비연장가능한 프라이머 다이머 또는 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성은 타겟 핵산 분자의 증폭에 유의한 영향을 미치지 않는 반면, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성은 핵산 증폭 반응에서 프라이머가 타겟 핵산 분자에 혼성화하는 것을 방해한다. 또한, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 증폭은 타겟 핵산 증폭 반응에 사용될 효소, dNTP 등의 낭비를 유발하고 프라이머와의 결합에 대해 타겟 핵산 분자와 경쟁하는 비특이적 증폭 산물을 증가시켜, 정상적인 핵산 증폭 반응의 효율의 악화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 원하지 않는 형성 및 증폭을 억제하여 타겟 증폭 효율을 개선하는 것에 초점을 맞춘다.
본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a):
최소 3개의
프라이머
쌍의 제조
본 발명에 따르면, 우선 증폭할 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 결정한다.
본 발명의 방법은 다양한 멀티플렉스 증폭 반응에 적용될 수 있지만, 본 발명의 방법의 특징 및 장점은 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 증폭 반응에서 명확해질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "타겟 핵산 분자", "타겟 분자" 또는 "타겟 핵산"은 최종적으로 증폭 또는 검출될 핵산 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "타겟 핵산 분자" 또는 "핵산 분자"는 각각 "타겟 핵산 서열" 또는 "핵산 서열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 타겟 핵산 분자는 이중 가닥뿐만 아니라 단일 가닥을 포함한다. 타겟 핵산 분자는 시료 내에 처음부터 존재하는 핵산 서열뿐만 아니라, 반응에서 새롭게 생성된 핵산 서열을 포함한다.
타겟 핵산 분자는 임의의 DNA(gDNA 및 cDNA), RNA 분자 및 이들의 혼성화물(키메라 핵산)을 포함할 수 있다. 상기 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태일 수 있다. 출발 물질로서 핵산이 이중 가닥인 경우, 이중 가닥을 단일 가닥 또는 부분적인 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하는 방법은, 가열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80-105℃의 온도로 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 의해 제공된다.
타겟 핵산 서열은 임의의 자연발생 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 타겟 핵산 분자는 또한 재조합에 의해 생성되었거나 생성될 수 있거나 화학적으로 합성되었거나 합성될 수 있는 임의의 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 핵산 서열은 자연에서 발견되거나 발견되지 않을 수 있다.
타겟 핵산 분자는 주어진 시점에 공지된 서열 또는 주어진 시점에 이용가능한 서열을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 대신에 현재 또는 미래의 어느 시점에 이용가능하거나 공지될 수 있는 서열을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 타겟 핵산 분자는 본 발명의 방법을 실시할 시점에 공지되거나 공지되지 않을 수 있다. 공지되지 않은 타겟 핵산의 경우, 그의 서열은 본 발명의 방법을 실시하기 전에 종래의 시퀀싱 방법 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
타겟 분자가 타겟 핵산 분자인 경우, 샘플은 당업계에 공지된 핵산 추출 과정을 거칠 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)). 핵산 추출 과정은 샘플의 유형에 따라 달라질 수 있다. 또한, 추출된 핵산이 RNA인 경우, cDNA를 합성하기 위한 역전사 과정이 추가로 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)"는 서열이 유사한 연속적인 DNA 세그먼트 중에서 특정 위치에서의 DNA 서열 내의 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적인 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 염색체의 임의의 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 변이 또는 다형 대립유전자 변이를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 변이, 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 예시적인 뉴클레오타이드 변이는 인간 지놈 내의 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 핵산 서열 내의 특정 위치에서의 임의의 변이를 포함한다. 즉, 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 핵산 서열 내의 특정 위치에서의 자연형 및 그의 임의의 변이형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "증폭될 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 결정하는 것"은 어떤 핵산 서열이 증폭될지 결정하는 과정, 즉 다수의 핵산 분자 중에서 증폭될 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 선택하는 과정을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 증폭될 타겟 핵산 분자는 최소 3개의 타겟 핵산 분자, 최소 4개의 타겟 핵산 분자, 최소 5개의 타겟 핵산 분자, 최소 6개의 타겟 핵산 분자, 최소 7개의 타겟 핵산 분자, 또는 최소 8개의 타겟 핵산 분자이다. 예를 들어, 증폭될 타겟 핵산 분자는 3-20, 3-18, 3-15, 3-12, 3-10, 3-8, 3-5, 4-20, 4-18, 4-15, 4-12, 4-10, 4-8, 4-5, 5-20, 5-18, 5-15, 5-12, 5-10 또는 5-8개의 타겟 핵산 분자이다.
본 발명의 일 구현예에서, 최소 3개의 프라이머 쌍, 최소 4개의 프라이머 쌍, 최소 5개의 프라이머 쌍, 최소 6개의 프라이머 쌍, 최소 7개의 프라이머 쌍, 또는 최소 8개의 프라이머 쌍이 각각 최소 3개의 타겟 핵산 분자, 최소 4개의 타겟 핵산 분자, 최소 5개의 타겟 핵산 분자, 최소 6개의 타겟 핵산 분자, 최소 7개의 타겟 핵산 분자 또는 최소 8개의 타겟 핵산 분자를 증폭하는데 사용된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 증폭되고 검출될 타겟 핵산 분자의 수는 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머 쌍의 수와 동일하다.
본 발명에 따르면, 최소 3개의 프라이머 쌍이 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위해 제조되며, 각각의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용되는 최소 3개의 프라이머 쌍은 3개의 프라이머 쌍, 4개의 프라이머 쌍, 5개의 프라이머 쌍 등이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH에 놓여질 때 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 바람직하게는, 프라이머는 단일 가닥의 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에서 사용되는 프라이머는 자연발생(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 프라이머는 또한 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 많은 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 달라질 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산을 병치(apposition)시키는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 용어 "실질적으로 상보적(substantially complementary)" 및 "완전히 상보적(perfectly complementary)"인 것을 포괄하며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "혼성화"는 상보적인 단일 가닥의 핵산들로부터 이중 가닥의 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매치되거나 일부 미스매치를 가지고 실질적으로 매치된 2개의 핵산 가닥 사이에서 발생할 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
용어"어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 이들 용어들은 상호교환적으로 사용될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "프라이머 쌍", "프라이머의 쌍", "1개의 프라이머 쌍" 및 "한 가지 유형의 프라이머 쌍"은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 쌍을 포함한다. 프라이머 쌍은 하나의 타겟 핵산 분자에 대한 증폭 반응에 사용될 수 있다.
또한, 본원에 언급된 바와 같은 복수의 프라이머 쌍, 예를 들어, (최소) 2개의 프라이머 쌍, (최소) 3개의 프라이머 쌍, (최소) 4개의 프라이머 쌍 등은 프라이머 쌍의 수가 복수이며 프라이머 쌍이 서로 상이하다는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "최소 3개의 프라이머 쌍"은 프라이머 쌍의 수가 최소 3개이며 프라이머 쌍이 서로 상이하다는 것을 의미한다.
표현 "프라이머 쌍이 서로 상이하다"는 것은 (i) 프라이머 쌍이 서로 실질적으로 상이하다, 또는 (ii) 프라이머 쌍이 서로 완전히 상이하다는 의미를 포괄할 수 있다.
표현 "프라이머 쌍이 서로 실질적으로 상이하다"는 것은 하나의 프라이머 쌍의 정방향 프라이머가 다른 프라이머 쌍의 정방향 프라이머와 상이하다는 것, 또는 하나의 프라이머 쌍의 역방향 프라이머가 다른 프라이머 쌍의 역방향 프라이머와 상이하다는 것을 의미한다.
표현 "프라이머 쌍이 서로 완전히 상이하다"는 것은 하나의 프라이머 쌍의 정방향 프라이머가 다른 프라이머 상의 정방향 프라이머와 상이하고 하나의 프라이머의 역방향 프라이머가 다른 프라이머 쌍의 역방향 프라이머와 상이하다는 것을 의미한다.
본 발명의 방법은 일반적으로 서로 완전히 상이한 최소 3개의 프라이머 쌍을 사용하지만, 서로 실질적으로 상이한 최소 3개의 프라이머 쌍의 사용을 배제하지 않는다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 쌍은 서로 완전히 상이하다.
2개의 상이한 프라이머 쌍은 "2개의 프라이머 쌍"으로 표현될 수 있고, 3개의 상이한 프라이머 쌍은 "3개의 프라이머 쌍"으로 표현될 수 있다.
또한, 표현 "프라이머가 서로 상이하다"는 것은 프라이머가 길이가 상이하거나, 프라이머가 하나의 서열로 표시되지 않거나 프라이머가 내부에 5개 이하의 축퇴성 염기를 포함하는 하나의 서열로 표시되지 않는 것을 의미한다.
예를 들어, 보존 영역 내에 일부 변이를 갖는 핵산을 증폭하기 위하여 프라이머를 특정 부위에 축퇴성 염기를 포함하도록 설계하는 경우, 상기 프라이머는 동일한 프라이머, 즉 단일 프라이머로 고려되는데, 이들은 동일한 길이의 서열을 갖고 5개 이하의 축퇴성 염기를 포함하는 하나의 서열로 표시되기 때문이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 용어 "단일 또는 하나의 프라이머"는 특정 길이를 가지며 하나의 서열로 표시되거나 5개 이하, 특히 4개 이하, 더욱 특히 3개 이하의 축퇴성 염기를 포함하는 서열로 표시되는 프라이머이다.
핵산 염기에 대한 IUB 축퇴성 코드가 본원에 사용된다. 이 코드에서, R은 퓨린 염기 A 또는 G를 의미하고; Y는 피리미딘 염기 C 또는 T를 의미하며; M은 아미노 염기 A 또는 C를 의미하고; K는 케토 염기 G 또는 T를 의미하며; S는 더 강한 수소 결합 파트너 C 또는 G를 의미하고; W는 더 약한 수소 결합 파트너 A 또는 T를 의미하며; H는 A, T 또는 C를 의미하고; B는 G, T 또는 C를 의미하며; D는 G, A 또는 T를 의미하고; V는 G, A 또는 C를 의미하며; N은 A, C, G 또는 T를 의미한다.
본 발명에서, 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 사용되는, 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 최소 3개의 프라이머 쌍은 복수의 프라이머를 포함한다. 일반적으로, 프라이머의 총 수는 프라이머 쌍의 총 수의 2배이다. 그러나, 프라이머 쌍 사이에 하나 이상의 동일한 프라이머가 존재하는 경우, 프라이머의 총 수는 프라이머 쌍의 총 수의 2배 미만일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 3개의 프라이머 쌍은 4, 5, 또는 6개의 프라이머를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 5개의 프라이머 쌍은 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 프라이머를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 7개의 프라이머 쌍은 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 프라이머를 포함한다.
통상적으로, 데옥시이노신 또는 이노신과 같은 유니버설 염기는 4개의 표준 뉴클레오타이드 염기 각각과 비차별적으로 쌍을 형성하는 능력 때문에 '축퇴성 염기'로서 널리 이용되어 왔다. 특히, 이노신을 함유하는 프라이머는 타겟 코돈의 높은 비율의 축퇴성을 보상하며 전체 프라이머 축퇴성뿐만 아니라 잘못된 프라이밍 및 비타겟 유전자 증폭을 실질적으로 감소시킬 수 있다(Kilpatrick, D. R. et al., 1996. J. Clin. Microbiol. 34:2990-2996; Rossolini. G. M. et al., 1994. Mol. Cell. Probes 8:91-98). 그러나, 본 발명에서와 같이 이노신과 같은 유니버설 염기(들)를 프라이머의 코어 영역에 포함시켜 멀티플렉스 증폭 반응에서 다이머 형성을 억제하는 시도는 없었다.
본 발명의 방법은 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)를 포함하는 프라이머를 이용하여 프라이머 다이머, 특히 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성을 감소시키고 타겟 증폭 효율을 개선한다. 본 발명에 따르면, 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 프라이머 내에 정교하게 배치하는 것은 상응하는 종래 프라이머(즉, 유니버설 염기 뉴클레오타이드 대신에 타겟에 상보적인 자연발생 염기를 포함하는 프라이머)의 특성(예컨대, 상보적 서열에의 특이적 결합 및 중합효소에 의한 연장)은 유지하면서 프라이머 다이머의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 의해 제시된 전략에 따라 제조된 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(Universal Base Primer: UBP)로 불린다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "유니버설 염기 프라이머(Universal Base Primer: UBP)"는 프라이머 내의 최소 하나의 뉴클레오타이드가 자연발생 염기(A, C, G 또는 T(U)) 대신에 유니버설 염기를 함유하는 프라이머를 의미한다. 본 발명에서, UBP는 프라이머 다이머 형성에 대한 억제제로서 작용한다. 특히, 유니버설 염기 중 데옥시이노신 또는 이노신을 포함하는 프라이머는 이노신 프라이머(Inosine Primer; IPm)로 지칭된다. 반면, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "종래 프라이머"는 자연발생 뉴클레오타이드(A, C, G 또는 T(U))만으로 구성된 흔히 사용되는 프라이머를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 프라이머는 내부에서 합성되거나 프라이머를 합성하는 제3자에 의해 합성될 수 있다.
본 발명에 따라 프라이머 내에 유니버설 염기(들)를 포함시키는 것은 최소 3개의 프라이머 쌍에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머 형성을 억제하고 증폭 효율을 증가시키는데 기여한다.
핵산 증폭 과정의 경우, 프라이머 다이머는 프라이머의 일부 서열 간의 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 유니버설 염기와 자연발생 염기 사이의 결합 강도는 2개의 상보적인 자연발생 염기 사이의 결합 강도보다 상대적으로 더 낮으므로, 최소 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 적절한 위치, 즉 프라이머의 코어 영역에 포함시키는 것은 프라이머 다이머의 Tm을 낮추고 프라이머 다이머의 형성을 억제할 것이다.
본 발명에 따르면, UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 구현예에서, UBP는 1-2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는다.
용어 "유니버설 염기 뉴클레오타이드"는 자연발생 염기 대신에 유니버설 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 용어는 "유니버설 뉴클레오타이드", "유니버설 염기-함유 뉴클레오타이드", "유니버설 염기-포함 뉴클레오타이드" 등과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
UBP 내에 최소 4개의 유니버설 염기를 포함시키는 것은 유니버설 염기 뉴클레오타이드의 높은 비율로 인해 타겟과 프라이머 간의 혼성화 효율을 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 3개 이하, 특히 2개 이하의 유니버설 염기 뉴클레오타이드의 포함시키는 것이 타겟과 프라이머 간의 안정적인 혼성화를 유지하는데 적절하다.
본 발명에 따르면, UBP는 1-3개의 유니버설 염기를 가지며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코어 영역"은 프라이머 다이머 형성, 특히 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 형성의 억제를 달성하기 위해 UBP 내에 1개 또는 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 위치시키기 위한 최적 위치 범위를 의미한다. 즉, 코어 영역은 1개 또는 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드가 최대 효과를 발휘하기 위해 위치하는 UBP 내의 특정 영역을 의미한다.
프라이머 다이머, 특히 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 구성하는 2개의 프라이머 가닥은 연장 반응 동안 소비되어 타겟 핵산 분자를 증폭하는데 사용될 수 없다. 본 발명자들은 1개 또는 2개의 프라이머 가닥의 코어 영역에 하나 이상의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 위치시킴으로써 3'-말단 부분이 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성에 참여할 가능성을 최소화할 수 있음을 발견하였다.
본 발명자들의 실험 결과에 따르면, 타겟 핵산 분자의 증폭은 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성에 의해 크게 영향을 받는 것으로 확인되었다. 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머는 일반적으로 두 프라이머 가닥의 3'-말단 부분 사이의 혼성화에 의해 생성되므로, 1개 또는 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 3'-말단 부분에 위치시키는 것이 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성을 억제하는데 바람직한 것으로 밝혀졌다.
본 발명에서, UBP 내의 코어 영역의 정확한 위치는 타겟 증폭 및 프라이머 다이머 형성의 측면에서 결정되었다. 즉, UBP 내의 코어 영역의 정확한 위치는 타겟 핵산 분자의 증폭에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 프라이머 다이머의 형성을 억제하는데 중요한 영역을 확인함으로써 결정되었다.
본 발명의 방법에 따르면, UBP 내의 코어 영역은 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타드 내지 6번째 뉴클레오타이드의 범위이다.
일반적으로, 프라이머의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 또는 두 번째 뉴클레오타이드는 프라이머의 연장에 유의한 영향을 미친다. 예를 들어, 프라이머의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 또는 두 번째 뉴클레오타이드가 타겟 핵산 분자의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적이지 않은 경우, 프라이머의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 또는 두 번째 뉴클레오타이드가 타겟 핵산 분자의 상응하는 뉴클레오타이드에 혼성화하지 않고 상기 3'-말단은 연장되지 않을 것이며, 이는 결국 타겟 증폭 효율을 크게 감소시킬 수 있다. 유사하게, 본 발명의 UBP의 경우, 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 UBP의 3'-말단에 있는 첫 번째 위치 또는 두 번째 위치에 위치시키는 것은 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 또는 두 번째 뉴클레오타이드가 타겟 핵산 분자의 상응하는 뉴클레오타이드에 결합하는 것을 감소시켜 타겟 증폭 효율을 낮춘다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 증폭 효율에 비추어 볼 때, 유니버설 뉴클레오타이드가 위치하는 코어 영역은 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 그 이상의 뉴클레오타이드(예컨대, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째 이상의 뉴클레오타이드)이다.
한편, 타겟 증폭에 대한 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 효과는 프라이머 다이머 내의 상보적(오버랩) 뉴클레오타이드의 수에 따라 달라진다. 본 발명자들의 실험 결과는 내부에 4개의 상보적인 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머 다이머(4개의 오버랩 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머)는 타겟 증폭에 유의한 영향을 미치지 않는 반면, 내부에 5개의 상보적인 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머 다이머(5개의 오버랩 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머)는 타겟의 유형에 따라 타겟 증폭에 영향을 미칠 수 있으며; 내부에 6개의 상보적인 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머 다이머(6개의 오버랩 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머)는 타겟 증폭에 유의한 영향을 미친다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 타겟 증폭에 크게 영향을 미치는 다이머 유형인 내부에 6개의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 다이머 프라이머의 형성을 억제하기 위해, 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 6번째 뉴클레오타이드 이하에 위치할 수 있다.
본 발명에 따르면, 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 UBP의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 또는 두 번째 뉴클레오타이드에 위치시키는 것이 타겟 증폭 효율을 감소시키기 때문에 바람직하다. 반면, 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 세 번째 뉴클레오타이드에 위치시키는 것은 각 프라이머 가닥의 3'-말단에 있는 3개 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머의 형성을 억제할 수 있고; 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 네 번째 뉴클레오타이드에 위치시키는 것은 각각의 프라이머 가닥의 3'-말단에 있는 4개 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머의 형성을 억제할 수 있으며; 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 다섯 번째 뉴클레오타이드에 위치시키는 것은 각각의 프라이머 가닥의 3'-말단에 있는 5개 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머의 형성을 억제할 수 있고; 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 여섯 번째 뉴클레오타이드에 위치시키는 것은 각각의 프라이머 가닥의 3'-말단에 있는 6개 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머의 형성을 억제할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 2개의 프라이머 가닥이 혼성화하는 것을 방지할 수 있고, 따라서 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성을 방지할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 내부에 4개 이하의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머의 형성은 타겟 증폭 효율에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것에 유의해야 한다. 예를 들어, 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드에 위치시키는 것은 각 프라이머 가닥의 3'-말단에 있는 2개의 상보적인 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머 다이머의 형성을 억제하지 않지만, 상기 프라이머 다이머의 형성은 타겟 증폭 효율에 영향을 미치지 않는다. 대신에, 상기와 같이 위치한 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 UBP는 내부에 3개 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 다이머의 형성을 억제할 수 있어서 본 발명의 목적을 달성하는데 적합하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 코어 영역은 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드, 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드, 3번째 뉴클레오타이드 내지 4번째 뉴클레오타이드, 4번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드, 4번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드, 5번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드, 특히 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드의 범위이다.
코어 영역의 정의 및 유니버설 염기 뉴클레오타이드의 위치와 관련하여, 프라이머의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드는 3'-말단에 있는 뉴클레오타이드, 즉 3' 최종(ultimate) 뉴클레오타이드(3'-말단 뉴클레오타이드)를 의미한다. 순차적으로, UBP의 3'-말단에 있는 두 번째 뉴클레오타이드는 마지막으로부터 두 번째 위치에 있는 뉴클레오타이드, 즉 3' 끝에서 두 번째(penultimate) 뉴클레오타이드를 의미하고, UBP의 3'-말단에 있는 세 번째 뉴클레오타이드는 마지막으로부터 세 번째 위치에 있는 뉴클레오타이드, 즉 3' 끝에서 세 번째(antepenultimate) 뉴클레오타이드를 의미하며, UBP의 3'-말단에 있는 네 번째 뉴클레오타이드는 마지막으로부터 네 번째 위치에 있는 뉴클레오타이드, 즉 3' 끝에서 네 번째(preantepenultimate) 뉴클레오타이드를 의미하고, UBP의 3'-말단에 있는 다섯 번째 뉴클레오타이드는 마지막으로부터 다섯 번째 위치에 있는 뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 위치의 설명은 프라이머의 5'-말단에 동일하게 적용된다.
일 예에서, 하기 서열 5'-AGNNNNNNNNNNNNNCT-3' (A: 아데닌, G: 구아닌, N: 임의의 뉴클레오타이드, C: 시토신; T: 티민)을 갖는 프라이머를 가정하면, "A"는 프라이머의 5'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드에 해당하고, "G"는 프라이머의 5'-말단에 있는 두 번째 뉴클레오타이드에 해당하며, "C"는 프라이머의 3'-말단에 있는 두 번째 뉴클레오타이드에 해당하고, "T"는 프라이머의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드에 해당한다.
또 다른 예에서, 하기 서열 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGAA-3'(A: 아데닌, G: 구아닌)을 갖는 프라이머를 가정하면, 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역은 "GGGGG" 이다.
본 발명에 따르면, 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이다. 이것은 UBP 내의 유니버설 염기 뉴클레오타이드가 서로 바로 인접하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 1개 또는 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치할 수 있다.
본 발명에 따르면, 표현 "유니버설 염기 뉴클레오타이드가 UBP에서 비연속적이다"는 것은 표현 "유니버설 염기 뉴클레오타이드가 UBP에서 서로 이격되어 위치한다"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 표현 "유니버설 염기 뉴클레오타이드가 UBP에서 서로 이격되어 위치한다"는 것은 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드 사이에 다른 뉴클레오타드(들)가 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들어, "유니버설 염기 뉴클레오타이드가 UBP에서 서로 2개의 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다"는 것은 상기 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드 사이에 2개의 다른 뉴클레오타이드가 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 서로 최소 1, 2, 3, 5, 8, 10, 12, 15 및 20 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
본 발명의 일 구현예에서, 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 서로 1-10 뉴클레오타이드, 예를 들어 UBP에서 서로 1-8 뉴클레오타이드, 1-6 뉴클레오타이드, 1-4 뉴클레오타이드, 2-10 뉴클레오타이드, 2-8 뉴클레오타이드, 2-6 뉴클레오타이드, 2-4 뉴클레오타이드, 3-10 뉴클레오타이드, 3-8 뉴클레오타이드, 3-6 뉴클레오타이드, 또는 3-4 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
본 발명에 따르면, 코어 영역에 존재하는 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)을 제외한 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)은, 존재하는 경우, UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드 범위의 영역에 위치한다.
코어 영역의 한계가 달라질 수 있다는 것을 고려할 때, 나머지(다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들))는 코어 영역, UBP의 5'-말단에 있는 3개의 연속적인 뉴클레오타이드, UBP의 3'-말단에 있는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 제외한 영역에 위치할 수 있다. 즉, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드부터 코어 영역의 5'마지막 뉴클레오타이드에 바로 인접한 뉴클레오타이드(옆의 뉴클레오타이드)까지의 범위의 영역에 위치한다.
코어 영역에 위치하지 않는 나머지 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)의 위치는 다음과 같이 결정된다:
(i) 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)를 UBP의 3'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 위치 또는 두 번째 뉴클레오타이드 위치에 위치시키는 것은 타겟 증폭을 유의하게 방해하고;
(ii) 유니버설 염기 뉴클레오타이드(들)를 UBP의 5'-말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 위치(5' ultimate nucleotide), 두 번째 뉴클레오타이드 위치(5' penultimate nucleotide) 또는 세 번째 뉴클레오타이드 위치(5' antepenultimate nucleotide)에 위치시키는 것은, 상기 위치에서의 혼성화에 의해 형성된 프라이머 다이머가 짧은 연장으로 인해 타겟 증폭에 크게 영향을 미치지 않기 때문에 타겟 증폭을 개선하는데 충분치 않다.
종합하면, 나머지는 코어 영역, UBP의 5'-말단에 있는 3개의 연속적인 뉴클레오타이드, UBP의 3'-말단에 있는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 제외한 영역에 위치한다.
본 발명에 따르면, 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드 범위의 영역에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 6번째 뉴클레오타이드 범위의 영역에 위치한다.
UBP 내의 유니버설 염기의 수에 따라, UBP 내의 1 내지 3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드의 위치는 다음과 같이 기술될 수 있다:
(i) UBP가 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 경우:
유니버설 염기는 코어 영역에 위치한다.
(ii) UBP가 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 경우:
일 구현예에서, 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치한다.
대안적인 구현예에서, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치하고, 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역, UBP의 5'-말단에 있는 3개의 연속적인 뉴클레오타이드, 및 UBP의 3'-말단에 있는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 제외한 영역에 위치한다. 코어 영역이 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드의 범위인 경우, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치한다. 코어 영역이 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드 범위인 경우, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 6번째 뉴클레오타이드 범위의 영역에 위치한다.
(iii) UBP가 3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 경우:
일 구현예에서, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치하고, 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역, UBP의 5'-말단에 있는 3개의 연속적인 뉴클레오타이드, UBP의 3'-말단에 있는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 제외한 영역에 위치한다.
대안적인 구현예에서, 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치하고, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역, UBP의 5'-말단에 있는 3개의 연속적인 뉴클레오타이드, UBP의 3'-말단에 있는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 제외한 영역에 위치한다.
UBP가 2개 또는 3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 구현예는 다음과 같이 상세히 설명된다:
(i) UBP가 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 경우:
일 구현예에서, 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치한다.
또 다른 구현예에서, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역에 위치하고, 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역의 5' 마지막 뉴클레오타이드로부터 5' 방향으로 5, 10 이상의 뉴클레오타이드 이내에 위치한다. 예를 들어, 코어 영역이 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위인 경우, 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 3'-말단에 있는 11번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 12번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 13번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 14번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 15번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 또는 16번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드에 위치한다. 이 경우, UBP의 3' 부분이 또 다른 프라이머와 혼성화할 가능성이 더 감소될 수 있다.
대안적인 구현예에 따르면, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역에 위치하고, 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 5' 부분 또는 3' 부분에 위치하며, 상기 5' 부분 및 3' 부분은 UBP의 뉴클레오타이드 길이를 이등분함으로써 결정될 수 있다.
유니버설 염기 뉴클레오타이드의 위치에 대한 한정과 관련하여, 본 발명의 일 구현예는 UBP의 전체 뉴클레오타이드 길이를 이등분하는 것을 이용한다. UBP의 총 길이가 짝수인 경우, UBP는 균등하게 이등분되는 반면, UBP의 총 길이가 홀수인 경우 UBP는 균등하게 이등분되지 않는다. UBP가 균등하게 이등분되지 않는 경우, 하나의 뉴클레오타이드의 추가 또는 제거가 사용될 수 있다. 즉, 5'-말단에 있는 임의의 뉴클레오타이드를 제거하거나 5'-말단에 임의의 가상의 뉴클레오타이드를 추가함으로써 UBP는 정확하게 이등분될 수 있다. 임의의 뉴클레오타이드의 추가 또는 제거는 단지 UBP의 정확한 이등분을 위한 것이므로, 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 추가되거나 제거된 뉴클레오타이드에 위치하는 것으로 해석되지 않는다. 대안적으로, UBP는 3'-말단에 있는 임의의 뉴클레오타이드를 제거하거나 3'-말단에 임의의 가상의 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 이등분될 수 있다.
(ii) UBP가 3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖는 경우:
일 구현예에 따르면, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 코어 영역에 위치하고, 2개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역의 5' 마지막 뉴클레오타이드로부터 5' 방향으로 5, 10 이상의 뉴클레오타이드 이내에 위치한다. 예를 들어, UBP의 3'-말단에 있는 11번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 12번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 13번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 14번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 15번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드, 또는 16번째 뉴클레오타이드 내지 7번째 뉴클레오타이드.
대안적인 구현예에 따르면, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역에 위치하고, 또 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역의 5' 마지막 뉴클레오타이드로부터 5' 방향으로 5, 10 이상의 뉴클레오타이드 이내에 위치하며, 상기 5' 부분 및 3' 부분은 하나의 뉴클레오타이드를 추가 또는 제거하거나 추가 또는 제거하지 않고 뉴클레오타이드 길이를 이등분함으로써 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역에 위치하고, 또 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 5' 부분, 중간 부분 또는 3' 부분에 위치하고, 상기 3개의 부분는 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드를 추가 또는 제거하거나 추가 또는 제거하지 않고 UBP의 뉴클레오타이드 길이를 삼등분함으로써 결정되며, 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 상기 또 다른 뉴클레오타이드와 동일하거나 상이한 부분에 위치한다. 예를 들어, 1개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 코어 영역에 위치하고, 또 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 5' 부분에 위치하며, 다른 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP의 중간 부분에 위치한다.
상기 기재된 바와 같은 유니버설 염기의 위치는 예시적인 것으로 의도되며, 유니버설 염기 뉴클레오타이드의 다른 위치가 당업자에 의해 고려될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 위치시키는 것은 최소 3개의 프라이머 쌍을 사용한 멀티플렉스 증폭 반응이 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성할 수 있게 한다.
특히, 상기 기재된 바와 같이 UBP의 5' 부분에 유니버설 염기를 위치시키는 것은 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성을 억제하고, 그 결과 중합효소 및 dNTP와 같은 PCR 반응의 성분의 소모를 방지할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, UBP 중 최소 하나는 축퇴성 염기를 포함하지 않는다. 일 구현예에 따르면, 멀티플렉스 증폭 반응에 사용되는 UBP 중 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12개는 축퇴성 염기를 포함하지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 멀티플렉스 증폭 반응에 사용되는 UBP 중 최소 50%, 60% 또는 70%는 축퇴성 염기를 포함하지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, UBP가 축퇴성 염기를 갖는 경우, 축퇴성 염기의 수는 1개를 초과하지 않는다. 또 다른 구현예에 따르면, 모든 UBP는 축퇴성 염기를 포함하지 않는다. 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 본원의 프라이머에 포함시키는 것은 축퇴성 염기를 사용할 필요성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 프라이머 쌍 중에서 최소 1개의 프라이머 쌍, 최소 2개의 프라이머 쌍, 최소 3개의 프라이머 쌍, 최소 4개의 프라이머 쌍 또는 최소 5개의 프라이머 쌍에서의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두는 UBP이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 각 프라이머 쌍에서의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나 또는 둘 모두는 UBP이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 사용된 프라이머의 총 수의 최소 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 UBP이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 프라이머는 모두 유니버설 염기 프라이머이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 3개의 프라이머 쌍은 최소 2개의 UBP를 포함한다. 구체적으로, 본원에 사용된 최소 3개의 프라이머 쌍은 최소 3개, 최소 4개, 최소 5개, 또는 최소 6개의 UBP를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 4개의 프라이머 쌍은 최소 3개의 UBP를 포함한다. 구체적으로, 본원에 사용된 최소 4개의 프라이머 쌍은 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개 또는 최소 8개의 UBP를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 5개의 프라이머 쌍은 최소 3개의 UBP를 포함한다. 구체적으로, 본원에 사용된 최소 5개의 프라이머 쌍은 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개, 최소 8개, 최소 9개 또는 최소 10개의 UBP를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본원에 사용된 최소 7개의 프라이머 쌍은 최소 4개의 UBP를 포함한다. 구체적으로, 본원에 사용된 최소 7개의 프라이머 쌍은 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개, 최소 8개, 최소 9개, 최소 10개, 최소 11개, 최소 12개, 최소 13개 또는 최소 14개의 UBP를 포함한다.
본 발명에 사용된 프라이머의 길이는 프라이머 합성의 편의성 및 비용, 및 증폭 반응의 정확성 및 민감성과 같은 몇 가지 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 프라이머의 길이는, 비제한적으로, 최소 12개 뉴클레오타이드, 최소 15개 뉴클레오타이드, 최소 18개 뉴클레오타이드, 최소 20개 뉴클레오타이드, 최소 22개 뉴클레오타이드, 최소 24개 뉴클레오타이드, 최대 60개 뉴클레오타이드, 최대 50개 뉴클레오타이드, 최대 40 뉴클레오타이드, 최대 35 뉴클레오타이드, 최대 30 뉴클레오타이드, 또는 최대 25 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 프라이머의 길이는 12-60, 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-25, 15-60, 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-25, 20-60, 20-50, 20-40, 20-35, 20-30, 20-25, 22-60, 22-50, 22-40, 22-35, 22-30, 22-25, 24-60, 24-50, 24-40, 24-35, 또는 24-30개 뉴클레오타이드, 구체적으로 20-30개 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유니버설 염기는 데옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-데옥시이노신, 2-아자-2'-데옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 데옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 데옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 데옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 데옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르폴리노-5-니트로인돌, 모르폴리노-네불라린, 모르폴리노-이노신, 모르폴리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르폴리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-O-메톡시에틸 이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 구체적으로, 상기 유니버설 염기는 데옥시이노신, 이노신, 또는 이의 조합이다.
단계 (b):
최소 3개의 프라이머 쌍을 이용한 멀티플렉스 증폭 반응
그 다음, 단계 (a)의 최소 3개의 프라이머 쌍을 이용하여 멀티플렉스 증폭 반응을 실시하며, 상기 반응은 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 2 사이클을 포함한다.
단계 (b)에서, 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머의 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성한다.
본 발명의 멀티플렉스 증폭 반응은 밀폐된 단일 용기에서 실시된다.
타겟 핵산 분자의 멀티플렉스 증폭은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관여 핵산 증폭 방법에 의해 실시될 수 있으며, 이는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction (LCR))(미국특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification (SDA)) (Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993)), 전사 매개 증폭(transcription-mediated amplification)(Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification(NASBA))(Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991)), 롤링서클 증폭(rolling circle amplification, RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999); Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) 및 Q-beta 레플리카제(Q-Beta Replicase)(Lizardi et al., BiolTechnology 6:1197 (1988))를 포함한다.
본 발명의 멀티플렉스 증폭 반응은 실시간 PCR 방법에 따라 실시할 수 있다(참조: 미국 특허 5,210,015, 5,538,848 및 6,326,145). 용어 "멀티플렉스 증폭"은 단일 중합효소 반응 혼합물 내의 멀티플렉스 DNA 타겟을 동시에 증폭하는 것을 의미한다.
멀티플렉스 증폭용 타겟 핵산 분자는 DNA(gDNA 또는 cDNA), RNA 분자 및 이들의 혼성체(키메라 핵산)를 포함할 수 있다. 서열은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 출발 물질로서 핵산이 이중 가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥 형태로, 또는 부분적인 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하는 방법은, 가열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80-105℃의 온도로 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 의해 제공된다.
mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 어닐링 단계 전에 역전사 단계가 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계를 위해, mRNA에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머, 랜덤 헥사머, 또는 타겟 핵산 분자의 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMP로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한, dTMP 중 하나 이상은 다른 dNMP로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응 조건을 주의깊게 선택함으로써 개별적인 RNase H 절단 단계를 생략할 수 있다.
본 발명에 사용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중 가닥 구조를 형성한다. 이러한 이중 가닥 구조를 형성하는데 적합한 핵산 혼성화 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 기재되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus , Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis , Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus ( Pfu ), Pyrococcus woesei , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 이들 효소의 대부분은 박테리아 자체로부터 분리될 수 있거나 상업적으로 이용가능하다. 또한, 본 발명에 사용되는 중합효소는 상기 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자를 높은 수준으로 발현하는 세포로부터 수득될 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공할 수 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 상기 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 같은 dNTP는 소망하는 증폭 정도를 달성하는 양으로 반응 혼합물에 제공될 것이 요구된다.
증폭 반응에 사용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 멀티플렉스 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응으로 실시될 수 있다.
본 발명에서, 어닐링 또는 혼성화는 타겟 핵산 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격 조건은 서열-의존적이며 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서의 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 어닐링은 50℃ 이상에서 실시한다.
본 발명의 방법에서의 증폭 반응은, UBP가 유니버설 염기를 함유함에도 불구하고, 프라이머 다이머 형성을 방지하기 위해 상대적으로 높은 어닐링 온도에서 실시될 수 있다. 단계 (b)의 멀티플렉스 증폭 반응에서, 프라이머 어닐링은 50℃ 이상, 52℃ 이상, 55℃ 이상 또는 57℃ 이상에서 실시한다. 구체적으로, 단계 (b)의 멀티플렉스 증폭 반응에서, 프라이머 어닐링은 85℃ 이하, 80℃ 이하, 75℃ 이하, 70℃ 이하, 65℃ 이하 및 60℃ 이하에서 실시하며, 예컨대 50-85℃, 50-80℃, 50-75℃, 52-75℃, 55-75℃, 50-70℃, 52-70℃, 55-70℃, 50-60℃, 52-60℃, 55-60℃ 또는 57-60℃에서 실시한다.
유니버설 염기 프라이머를 사용하는 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응은 각각의 타겟 핵산 분자의 존재를 검출하기 위한 추가적인 최소 3개의 프로브의 존재 하에서 실시된다. 상기 최소 3개의 프로브 각각은 상응하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 서열을 갖고, 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 사이에 위치한다. 본 발명의 UBP(들)를 사용한 멀티플렉스 증폭 반응에서 프로브의 사용은 타겟 핵산 분자의 검출 특이성을 보다 높일 수 있다. 프로브의 사용은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 상기 방법의 예로는 TaqManTM 프로브 방법(미국특허 제5,210,015호), 분자 비콘 방법(Tyagi 등, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), CPT(Duck P, 등. Biotechniques, 9:142-148(1990)), LNA 방법(미국특허 제6,977,295호), 플렉서(Plexor) 방법(Sherrill CB, 등, Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), HybeaconsTM(D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363-374 및 미국특허 제7,348,141호), 이중표지된 자가-퀀칭된 프로브(Dual-labeled, self-quenched probe; 미국특허 제5,876,930호), 혼성화 프로브(Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818) 및 CER 방법(WO 2011/037306)을 들 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 최소 3개의 프로브는 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 프로브는 표지를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 분자의 존재에 따라, 프로브는 다운스트림 반응(예컨대, PTOCE 반응)을 매개할 수 있다.
본 발명의 방법은 종래의 프라이머를 사용한 증폭 반응과 비교하여 감소된 프라이머 다이머의 형성을 나타낸다.
구체적으로, 감소된 프라이머 다이머의 형성은 프라이머 다이머의 형성에 의해 수반된 시그널의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, Ct 값의 변화, 최대 RFU의 변화, 시그널의 변화율이 감소된 프라이머 다이머의 형성을 평가하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 감소된 프라이머 다이머의 형성은 타겟 핵산 분자의 부재하에 본 발명의 UBP를 사용하는 반응과 타겟 핵산 분자의 부재하에 자연발생 뉴클레오타이드로 구성된 종래의 프라이머를 사용하는 반응 사이의 Ct 값을 비교함으로써 평가될 수 있다. 상기 비교를 위해, 유니버설 염기 뉴클레오타이드 대신에, 타겟 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드에 상보적인 자연 발생 뉴클레오타이드를 함유하는 종래의 프라이머가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 분자의 부재하에 UBP를 함유하는 프라이머 쌍을 사용한 반응으로부터 수득된 Ct 값(즉, 프라이머 다이머의 Ct 값)은 타겟 핵산 분자의 부재하에 종래의 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 사용한 것과 비교하여 1 이상 증가한다. 타겟 핵산 분자의 부재하에 UBP를 함유하는 프라이머 쌍을 사용한 반응으로부터 수득된 Ct 값은 타겟 핵산 분자의 부재하에 종래의 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 사용한 것과 비교하여 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6 이상, 예컨대 3 내지 20, 5 내지 15, 또는 8 내지 12 증가한다.
용어 "프라이머 다이머의 Ct 값"은 임의의 주형의 부재하에 PCR 반응 혼합물을 사용하는 증폭 반응에 의해 수득된 프라이머 다이머의 증폭 곡선으로부터 계산된 Ct 값을 의미한다. 따라서, 프라이머 다이머의 Ct 값의 증가는 프라이머 다이머의 형성이 억제 또는 감소된 것을 나타낸다.
Ct 값을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(참조: Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)).
프라이머 다이머 형성의 억제 또는 감소가 매우 효과적인 경우, 프라이머 다이머의 낮은 증폭으로 인해 프라이머 다이머의 증폭 곡선에서 Ct 값이 수득되지 않을 수 있다. 이 경우, 프라이머 다이머의 Ct 값은 1 이상 증가한 것으로 간주된다.
본 발명의 방법은 UBP 대신에 종래의 프라이머를 사용하는 타겟 증폭 반응과 비교하여 증가된 타겟 증폭 효율을 나타낸다. 증가된 타겟 증폭 효율은 자연발생 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머를 사용하여 타겟 핵산 분자를 증폭시켜 수득되는 시그널 및 유니버설 염기 프라이머를 사용하여 타겟 핵산 분자를 증폭시켜 수득되는 시그널 간의 차이(예를 들어, Ct 값의 변화, 최대 RFU의 변화, 시그널의 변화율 등)를 비교함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭 효율"은 증폭 반응의 효율을 나타낼 수 있는 한 임의의 값을 포함한다.
증폭 효율은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 계산될 수 있다.
일 구현예에서, 증폭 효율은 희석 열의 선형 회귀 기울기에 기초하여 증폭 속도를 계산하고 하기 방정식에 기초하여 증폭 효율을 계산함으로써 추정될 수 있다(Higuchi et al., 1993; Rasmussen, 2001):
식 1
E = 10-1/기울기
상기 식에서, E는 증폭 효율을 나타내고, 기울기(slope)는 타겟의 초기 카피 수에 대해 Ct 값을 플롯팅한 표준 곡선의 기울기를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 증폭 효율은 당업계에 공지된 임의의 프로그램에 의해 추정될 수 있다. 예를 들어, 증폭 효율은 정량적 RT-PCR(qPCR) 데이터 분석용 LinRegPCR(버전 2017.1)에 의해 계산될 수 있다.
LinRegPCR을 증폭 효율을 수득하는데 사용하는 경우, 원시(즉, 베이스라인 수정되지 않은) PCR 데이터를 분석에 사용한다. 베이스라인 수정은 초기 사이클의 선택에 기초한 베이스라인 추세를 이용하여 실시된다. 각 개별 샘플에 대한 PCR 효율은 LinRegPCR을 사용하여 로그-선형기 내의 베이스라인 수정된 데이터 지점의 서브세트에 대해 피팅된 회귀선의 기울기로부터 도출된다. 상기 프로그램은 전형적으로 개별 선형 윈도우(window-of-linearity)를 사용하지만, 일부 샘플의 경우, 개별 선형 윈도우의 상한 및 하한이 설정될 수 있다.
상기 방법 중 하나에 의해 수득된 UBP를 사용한 반응의 효율은 종래의 프라이머를 사용한 반응의 효율과 비교될 수 있다. UBP를 사용한 반응의 효율은 종래의 프라이머를 사용한 반응 대비 증가율로서 표현될 수 있다. 상기 증가율은 하기 식에 의해 계산될 수 있다:
식 2
효율의 증가율(%) = [UBP를 사용한 반응의 효율 / 종래의 프라이머를 사용한 반응의 효율]-1]*100
본 발명의 일 구현예에 따르면, 멀티플렉스 증폭 반응에서 UBP를 사용하여 타겟 핵산 분자를 증폭시키는 것은 자연발생 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머를 사용한 것과 비교하여 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 이상의 효율의 증가율을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 각 반응의 증폭 효율은 LinRegPCR에 의해 계산되며, UBP를 사용한 반응의 효율의 증가율은 종래의 프라이머를 사용한 반응과 비교하여 계산된다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머 형성을 감소시키는 방법을 제공한다:
(a) 증폭될 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 결정하는 단계;
(b) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 상기 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(c) 상기 최소 3개의 프라이머 쌍 중 최소 1개의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머 내의 1-3개의 뉴클레오타이드를 유니버설 염기 뉴클레오타이드로 치환하여 유니버설 염기 프라이머(UBP)를 제조하는 단계; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드로의 치환은 프라이머 다이머 형성을 억제하고; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 가지며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하여, 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이며;
(d) 상기 최소 3개의 프라이머 쌍을 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 2 사이클을 포함하는 멀티플렉스 증폭 반응을 실시하는 단계; 상기 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 코어 영역은 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드 범위이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 최소 하나의 프라이머 쌍에서 2개의 프라이머는 UBP이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 각각의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 UBP이다.
본 발명의 일 구현예에서, 사용된 프라이머의 총 수의 최소 50%는 UBP이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 UBP 중 최소 하나는 축퇴성 염기를 포함하지 않는 다.
본 발명의 일 구현예에서, 최소 5개의 프라이머 쌍이 최소 5개의 타겟 핵산 분자를 증폭하는데 사용된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 어닐링은 50℃ 이상에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 최소 하나의 UBP 대신에 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 자연 발생 뉴클레오타이드(A, C, G 또는 T(U))를 함유하는 프라이머(들)를 사용한 것보다 최소 3% 높은 타겟 증폭 효율을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 분자의 부재하에 UBP를 함유하는 프라이머 쌍을 사용한 반응으로부터 수득된 Ct 값은 상기 타겟 핵산 분자의 부재하에 종래의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 사용한 것과 비교하여 1 이상 증가된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 멀티플렉스 증폭 반응은 상기 타겟 핵산 분자의 존재를 결정하기 위해 최소 3개의 추가의 프로브의 존재하에 실시되며; 상기 최소 3개의 프로브 각각은 증폭될 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 사이에 위치한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 최소 3개의 프로브는 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 데옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-데옥시이노신, 2-아자-2'-데옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 데옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 데옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 데옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 데옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르폴리노-5-니트로인돌, 모르폴리노-네불라린, 모르폴리노-이노신, 모르폴리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르폴리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-O-메톡시에틸 이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 데옥시이노신, 이노신, 또는 이의 조합을 포함한다.
본 발명의 제2 양태인 "멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머 형성을 감소시키는 방법"은 상술한 제1 양태의 응용이다. 따라서, 이들 사이에 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍; 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 최소 하나의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하며, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이며;
(b) 핵산 중합 효소.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 제 1 항의 방법의 실시에서 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 키트의 용도를 제공한다:
(a) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍; 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 최소 하나의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하며, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이며;
(b) 핵산 중합 효소.
본 발명의 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 키트 또는 키트의 용도는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 것으로서, 이들 사이의 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 양성 및 음성 대조군 반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 특정 반응에 사용되는 시약의 최적양은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 구획 내에 상술한 성분들을 포함한다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 하기를 수행하도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 제공한다:
각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍을 디자인하는 것; 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 최소 하나의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이다.
저장 매체는 본 발명의 방법을 컴퓨터에서 실시하기 위한 것이므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
상기 기재된 본 발명의 방법은 프로세서, 예컨대 독립형 컴퓨터, 네트워크에 연결된 컴퓨터 또는 실시간 PCR 기기와 같은 데이터 수집 장치 내의 프로세서에서 실행된다.
컴퓨터 해독가능한 기록매체의 유형은 CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 휴대용 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 기록매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버와 같은 다양한 기록매체를 포함한다.
본 발명을 실행하는 프로세서를 구현하는 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 휴대용 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD와 같은 어떠한 소프트웨어 기록매체 상으로 제공될 수 있지만, 다운로드 가능하고 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM이나 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하기 위한 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전송에 이용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 멀티플렉스 핵산 증폭 반응에서의 다이머 형성의 억제
본 발명의 방법은 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 비특이적 증폭 산물, 특히 프라이머 다이머의 형성을 효과적인 방식으로 억제한다.
(b) 핵산 증폭 효율의 향상
프라이머 다이머, 특히 완전히 연장된 프라이머 다이머의 형성은 프라이머가 타겟의 증폭에 참여하는 것을 방지한다. 또한, 증폭이 진행됨에 따라, 프라이머 다이머에 의해 생성된 비타겟 증폭 산물은 타겟 핵산 분자에 경쟁적으로 결합하고 프라이머를 포함하는 증폭 성분을 소비하여, 타겟의 증폭 효율을 감소시킨다. 본 발명의 방법은 이러한 다이머 형성을 초기 사이클에서 억제하여 핵산 증폭 효율을 향상시킨다.
(c) 저농도 타겟에 대한 민감도 향상
타겟 핵산 분자가 샘플 내에 초기에 소량으로 존재하는 경우, 타겟 핵산 분자가 프라이머 쌍보다 더 낮은 증폭량으로 인해 검출되지 않을 수 있다. 그러나 본 발명의 방법에 의해 다이머 형성이 감소되는 경우, 타겟 핵산 분자가 소량으로 존재하더라로 타겟 핵산을 검출할 수 있으므로, 민감도를 개선할 수 있다.
(d) 개선된 증폭 효율로 멀티플렉스 핵산 증폭을 위한 프라이머 세트의 용이한 구성
프라이머 간의 다이머 형성을 억제하고 증폭 효율을 개선하기 위해 프라이머의 혼성화 부위 및 프라이머의 서열 및 길이를 반복적으로 조절하는 것은 상당히 시간 소모적이고 비효율적이다. 특히, 복수의 프라이머를 사용한 멀티플렉스 증폭 반응의 경우, 하나의 프라이머의 서열 또는 길이의 변경은 다른 프라이머와의 다이머 형성 가능성을 고려하여 수행되어야 한다. 이러한 이유 때문에, 멀티플렉스 증폭 반응에서 다이머 형성을 감소시키고 증폭 효율을 증가시키는 쪽으로 전체 프라이머를 조절하는 것은 어렵다.
반면, 본 발명의 방법은 프라이머의 혼성화 부위를 바꾸거나 프라이머의 서열 또는 길이를 변경하지 않고 다이머 형성을 억제할 수 있으므로, 멀티플렉스 증폭 반응을 위해 다이머 형성이 억제된 프라이머 세트를 구성하는데 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 유니버설 염기 프라이머(UBP)의 개략적인 구조를 나타낸다. UBP는 양 말단에 유니버설 염기가 없는 2개의 영역 및 코어 영역을 포함하는 유니버설 염기 영역을 포함한다.
도 2는 멀티플렉스 증폭 반응에서 우연히 생성될 수 있는 프라이머 다이머의 3가지 유형을 나타낸다: 비연장가능한 프라미어 다이머(상부 열); 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(중간 열); 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(하부 열).
도 3은 비연장가능한 프라이머 다이머 쌍을 형성하기 위한 프라이머 세트 #1-3(상부 좌측) 및 #11-13(상부 우측), 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #4-6(중간 좌측) 및 #14-16(중간 우측), 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #7-10(하부 좌측) 및 #17-20(하부 우측)을 각각 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4는 UP 대조군 프라이머 세트 및 NG 대조군 프라이머 세트(첫 번째 열); 비연장가능한 프라이머 다이머 쌍을 형성하기 위한 프라이머 세트 #21-23 및 #31-33(2번째 열), 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #24-26 및 #34-36(3번째 열), 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #27-30 및 #37-40(4번째 열)을 각각 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자(UP 및 NG) 에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 5A는 프라이머 세트 #9(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #9A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #9B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #9C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #9D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #9E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #9F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #9G(4번째 열, 우측)를 각각 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 5B는 프라이머 세트 #19(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #19A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #19B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #19C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #19D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #19E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #19F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #19G(4번째 열, 우측)을 각각 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 6A는 프라이머 세트 #29(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #29A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #29B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #29C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #29D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #29E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #29F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #29G(4번째 열, 우측)를 각각 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자 UP에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 비교를 위해, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3)가 없는 프라이머 세트 #29 및 #29A-#29G를 사용하여 증폭 곡선을 수득하였다. 도면에서, 프라이머 세트 #29 및 #29A-#29G에 대한 결과가 "-O-"로 표시되어 있으며; 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3)가 없는 프라이머 세트에 대한 결과가 "-X-"로 표시되어 있다.
도 6B는 프라이머 세트 #39(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #39A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #39B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #39C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #39D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #39E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #39F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #39G(4번째 열, 우측)를 각각 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자 NG에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 비교를 위해, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(NG-C-3)가 없는 프라이머 세트 #39 및 #39A-#39G를 사용하여 증폭 곡선을 수득하였다. 도면에서, 프라이머 세트 #39 및 #39A-#39G에 대한 결과가 "-O-"로 표시되어 있으며; 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(NG-C-3)가 없는 프라이머 세트에 대한 결과가 "-X-"로 표시되어 있다.
도 7은 종래의 프라이머 혼합물(-O-), 제1 UBP 혼합물(-△-) 및 제2 UBP 혼합물(-□-)을 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 8은 10 pg(-O-), 1 pg(-Δ-), 0.1 pg(-□-) 및 NTC (-X-)의 농도의 타겟 핵산 분자의 존재하에 종래의 프라이머 혼합물(좌측 컬럼), 제1 UBP 혼합물(중간 컬럼) 및 제2 UBP 혼합물(우측 컬럼)을 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자 UU, MG, NG 및 CT에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 2는 멀티플렉스 증폭 반응에서 우연히 생성될 수 있는 프라이머 다이머의 3가지 유형을 나타낸다: 비연장가능한 프라미어 다이머(상부 열); 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(중간 열); 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(하부 열).
도 3은 비연장가능한 프라이머 다이머 쌍을 형성하기 위한 프라이머 세트 #1-3(상부 좌측) 및 #11-13(상부 우측), 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #4-6(중간 좌측) 및 #14-16(중간 우측), 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #7-10(하부 좌측) 및 #17-20(하부 우측)을 각각 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4는 UP 대조군 프라이머 세트 및 NG 대조군 프라이머 세트(첫 번째 열); 비연장가능한 프라이머 다이머 쌍을 형성하기 위한 프라이머 세트 #21-23 및 #31-33(2번째 열), 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #24-26 및 #34-36(3번째 열), 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #27-30 및 #37-40(4번째 열)을 각각 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자(UP 및 NG) 에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 5A는 프라이머 세트 #9(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #9A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #9B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #9C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #9D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #9E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #9F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #9G(4번째 열, 우측)를 각각 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 5B는 프라이머 세트 #19(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #19A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #19B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #19C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #19D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #19E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #19F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #19G(4번째 열, 우측)을 각각 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 6A는 프라이머 세트 #29(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #29A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #29B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #29C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #29D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #29E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #29F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #29G(4번째 열, 우측)를 각각 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자 UP에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 비교를 위해, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3)가 없는 프라이머 세트 #29 및 #29A-#29G를 사용하여 증폭 곡선을 수득하였다. 도면에서, 프라이머 세트 #29 및 #29A-#29G에 대한 결과가 "-O-"로 표시되어 있으며; 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3)가 없는 프라이머 세트에 대한 결과가 "-X-"로 표시되어 있다.
도 6B는 프라이머 세트 #39(1번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #39A(1번째 열, 우측), 프라이머 세트 #39B(2번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #39C(2번째 열, 우측), 프라이머 세트 #39D(3번째 열, 좌측), 프라이머 세트 #39E(3번째 열, 우측), 프라이머 세트 #39F(4번째 열, 좌측), 및 프라이머 세트 #39G(4번째 열, 우측)를 각각 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자 NG에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 비교를 위해, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(NG-C-3)가 없는 프라이머 세트 #39 및 #39A-#39G를 사용하여 증폭 곡선을 수득하였다. 도면에서, 프라이머 세트 #39 및 #39A-#39G에 대한 결과가 "-O-"로 표시되어 있으며; 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(NG-C-3)가 없는 프라이머 세트에 대한 결과가 "-X-"로 표시되어 있다.
도 7은 종래의 프라이머 혼합물(-O-), 제1 UBP 혼합물(-△-) 및 제2 UBP 혼합물(-□-)을 사용하여 수득된, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 8은 10 pg(-O-), 1 pg(-Δ-), 0.1 pg(-□-) 및 NTC (-X-)의 농도의 타겟 핵산 분자의 존재하에 종래의 프라이머 혼합물(좌측 컬럼), 제1 UBP 혼합물(중간 컬럼) 및 제2 UBP 혼합물(우측 컬럼)을 사용하여 수득된, 타겟 핵산 분자 UU, MG, NG 및 CT에 대한 증폭 곡선을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1:
다이머
증폭 및
타겟
증폭에 영향을 미치는
다이머의
유형의 확인
본 발명자들은 다이머 증폭 및 타겟 증폭에 대한 프라이머 다이머의 유형 및 프라이머 다이머 내의 상보적 뉴클레오타이드의 길이의 영향을 조사하였다.
<1-1>
다이머
증폭을 촉진하는
프라이머
다이머
유형
멀티플렉스 증폭 반응에서 우연히 생성될 수 있는 프라이머 다이머는 각각의 프라이머 가닥이 연장되는지 여부에 따라 3가지 유형으로 분류될 수 있다: (i) 비연장가능한 프라이머 다이머; (ii) 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머; 및 (iii) 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(도 2 참조).
첫째, 비연장가능한 프라이머 다이머는 혼성화 후 2개의 프라이머 가닥이 핵산 중합효소에 의해 연장되지 않는 것을 포함한다. 이러한 유형은 2개의 프라이머의 5' 부분 간의 혼성화에 의해 형성될 수 있다(도 2의 상부 열 참조). 둘째, 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머는 혼성화 후 2개의 프라이머 가닥 중 하나가 핵산 중합 효소에 의해 연장되는 것을 포함한다. 이러한 유형은 하나의 프라이머의 3' 부분과 또 다른 프라이머의 중간 부분 간의 혼성화에 의해 형성될 수 있다(도 2의 중간 열 참조). 셋째, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머는 혼성화 후 2개의 프라이머 가닥이 핵산 중합효소에 의해 연장되는 것을 포함한다. 이러한 유형은 2개의 프라이머의 3' 부분 간의 혼성화에 의해 형성될 수 있다(도 2의 하부 열 참조).
상기 3가지 유형의 프라이머 다이머의 형성을 모사하기 위해, 타겟 핵산 서열인 Ureaplasma parvum(UP) 및 Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA에 혼성화하기 위한 종래의 프라이머(UP-R1, 서열번호: 1; NG-F4, 서열번호: 12)를 제조하였다. 그리고 나서, 종래의 프라이머와 비연장가능한 프라이머 다이머, 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 중 하나를 형성할 수 있는 추가의 프라이머를 제조하였다. 다이머 형성을 위한 프라이머는 UP-R1(서열번호: 1) 및 NG-F4(서열번호: 12)에 대한 다양한 길이의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖도록 설계하였다.
구체적으로, UP-R1 또는 NG-F4와 비연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 3개의 프라이머(UP에 대해 각각 UP-N-1, UP-N-2 및 UP-N-3; NG에 대해 각각 NG-N-1, NG-N-2 및 NG-N-3)를 이들이 종래의 프라이머에 대한 주형으로서 작동가능한 돌출(protruding) 뉴클레오타이드를 갖지 않도록 제조하였고, 이들의 3'-말단을 연장을 방지하기 위해 블록킹하였다. 이들은 종래의 프라이머에 대해 11, 13, 또는 15개의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖도록 제조하였다.
또한, UP-R1 또는 NG-F4와 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위해 3개의 프라이머(UP에 대해 각각 UP-P-1, UP-P-2 및 UP-P-3; NG에 대해 각각 NG-P-1, NG-P-2 및 NG-P-3)를 이들이 종래의 프라이머에 대한 주형으로서 작동하는 뉴클레오타이드를 제공하도록 제조하였고, 이들의 3'-말단을 연장을 방지하기 위해 블록킹하였다. 특히, 이들은 종래의 프라이머의 3'-부분에 상보적인 5, 7, 또는 9개의 3' 부분을 갖도록 제조하였다.
또한, UP-R1 또는 NG-F4와 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위해 4개의 프라이머(UP에 대해 각각 UP-C-1, UP-C-2, UP-C-3 및 UP-C-4; NG에 대해 각각 NG-C-1, NG-C-2, NG-C-3 및 NG-C-4)를 이들이 3' 부분에 종래의 프라이머의 3' 부분에 상보적인 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드를 갖도록 제조하였다.
그 결과, 각각 UP-R1 및 NG-F4 중 하나와 상기 기재된 다이머 형성을 위한 프라이머 중 하나를 포함하는 프라이머 세트 #1 내지 #20을 3가지 유형의 프라이머 다이머의 형성을 위해 제조하였다.
본 실시예에 사용된 프라이머의 서열이 각각 표 1 및 표 2에 제공되어 있다.
| 프라이머 다이머 유형 | 세트 이름 (오버랩) |
프라이머 이름 |
서열 | 서열 번호 |
| 비연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #1 (11 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 |
| UP-N-1 | 5'-AGCTGATATTG[C3 spacer]-3' | 2 | ||
| 프라이머 세트 #2 (13 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-N-2 | 5'-AGCTGATATTGTT[C3 spacer]-3' | 3 | ||
| 프라이머 세트 #3 (15 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-N-3 | 5'-AGCTGATATTGTTGC[C3 spacer]-3' | 4 | ||
| 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #4 (5 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 |
| UP-P-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTG[C3spacer]-3' | 5 | ||
| 프라이머 세트 #5 (7 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-P-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGAT[C3spacer]-3' | 6 | ||
| 프라이머 세트 #6 (9 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-P-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGATAT[C3spacer]-3' | 7 | ||
| 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #7 (4 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 |
| UP-C-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCT-3' | 8 | ||
| 프라이머 세트 #8 (5 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-C-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTG-3' | 9 | ||
| 프라이머 세트 #9 (6 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | ||
| 프라이머 세트 #10 (7 mer) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-C-4 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGAT-3' | 11 |
(밑줄 친 글자는 UP-R1에 대한 상보적 서열을 가리킨다)
| 프라이머 다이머 유형 | 세트 이름 (오버랩) |
프라이머 이름 |
서열 | 서열 번호 |
| 비연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #11 (11 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-N-1 | 5'-AGTCGAAAAAC[C3 spacer]-3' | 13 | ||
| 프라이머 세트 #12 (13 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-N-2 | 5'-AGTCGAAAAACAA[C3 spacer]-3' | 14 | ||
| 프라이머 세트 #13 (15 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-N-3 | 5'-AGTCGAAAAACAACT[C3 spacer]-3' | 15 | ||
| 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #14 (5 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-P-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCG[C3spacer]-3' | 16 | ||
| 프라이머 세트 #15 (7 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-P-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGAA[C3spacer]-3' | 17 | ||
| 프라이머 세트 #16 (9 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-P-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGAAAA[C3spacer]-3' | 18 | ||
| 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #17 (4 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-C-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTC-3' | 19 | ||
| 프라이머 세트 #18 (5 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-C-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCG-3' | 20 | ||
| 프라이머 세트#19 (6 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | ||
| 프라이머 세트 #20 (7 mer) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-C-4 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGAA-3' | 22 |
(밑줄 친 글자는 NG-F4에 대한 상보적 서열을 가리킨다)
본 실시예에서는, 인터컬레이팅 염료인 SYBR® Green I(Invitrogen, USA)을 이용한 실시간 PCR을 사용하여 임의의 타겟 핵산 서열의 부재하에 프라이머 다이머 형성을 검출하였다. 프라이머 다이머가 형성되고 증폭되는 경우, 불활성화된 SYBR® Green I이 프라이머 다이머 내로 혼입된 다음 활성화되어 형광을 낸다. 증폭 곡선은 프라이머 다이머 내의 상기 활성화된 염료로부터의 시그널을 측정함으로써 수득될 수 있다. 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 프라이머 다이머 증폭에 사용하였다.
실시간 PCR을 각각의 프라이머 세트(3 pmole의 프라이머(서열번호: 1 및 12) 중 하나 및 10 pmole의 프라이머(서열번호: 2-11 및 13-22) 중 하나), 2 μl의 SYBR® Green I, 및 5 μl의 4X 마스터 믹스[final, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 최종 부피 20 μl로 수행하였다. 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에서 50℃에서 5분 동안 두고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 57℃에서 실시하였다.
상기 실험으로부터 수득된 증폭 곡선이 도 3에 나타나 있다.
도 3에서 보는 바와 같이, 비연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #1-3 및 #11-13(도 3의 상부 열 참조) 및 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #4-6 및 #14-16(도 3의 중간 열 참조)의 경우 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선이 관찰되지 않았다.
반면, 두-연장 가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 세트 #7-10 및 #17-20의 경우 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선이 관찰되었다(도 3의 하부 열 참조). 특히, 프라이머 다이머 내의 상보적 서열의 길이가 길수록 더 이른 다이머 증폭을 야기하였다.
이들 결과는 3가지 유형의 프라이머 다이머 중 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머가 다이머 증폭을 촉진한다는 것과 프라이머 다이머 내의 4-7개의 상보적인 뉴클레오타이드의 길이가 다이머 형성의 원인이라는 것을 보여준다.
<1-2>
타겟
증폭에 영향을 미치는
프라이머
다이머
유형
타겟 증폭에 영향을 미치는, 즉 타겟 증폭을 억제하는 프라이머 다이머의 유형을 조사하였다.
타겟 핵산 서열을 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(UP의 경우 서열번호: 23 및 1; NG의 경우 서열번호: 12 및 24)를 먼저 제조하였다. 그리고 나서, 정방향 및 역방향 프라이머 중 하나와 각각의 유형의 프라이머 다이머를 형성할 수 있는 추가의 프라이머(서열번호: 2-11)를 제조하였다. 이후, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 상기 추가의 프라이머 중 하나와 조합하여 다양한 프라이머 세트 #21-40을 수득하였다. 각각의 유형의 프라이머 다이머를 형성할 수 있는 추가의 프라이머가 없는 프라이머 세트를 대조군으로서 사용하였다.
본 실시예에 사용된 프라이머 세트가 표 3 및 4에 제공되어 있다.
| 프라이머 다이머 유형 | 세트 이름 (오버랩) |
프라이머 이름 |
서열 | 서열 번호 |
| 프라이머 다이머 없음 | UP 대조군 프라이머 세트 | UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| 비연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #21 (11 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-N-1 | 5'-AGCTGATATTG[C3 spacer]-3' | 2 | ||
| 프라이머 세트 #22 (13 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-N-2 | 5'-AGCTGATATTGTT[C3 spacer]-3' | 3 | ||
| 프라이머 세트 #23 (15 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-N-3 | 5'-AGCTGATATTGTTGC[C3 spacer]-3' | 4 | ||
| 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #24 (5 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-P-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTG[C3spacer]-3' | 5 | ||
| 프라이머 세트 #25 (7 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-P-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGAT[C3spacer]-3' | 6 | ||
| 프라이머 세트 #26 (9 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-P-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGATAT[C3spacer]-3' | 7 | ||
| 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #27 (4 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-C-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCT-3' | 8 | ||
| 프라이머 세트 #28 (5 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-C-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTG-3' | 9 | ||
| 프라이머 세트 #29 (6 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | ||
| 프라이머 세트 #30 (7 mer) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 | |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | ||
| UP-C-4 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGAT-3' | 11 |
(밑줄 친 글자는 UP-R1에 디한 상보적인 서열을 나타낸다)
| 프라이머 다이머 유형 | 세트 이름 (오버랩) |
프라이머 이름 |
서열 | 서열 번호 |
| 프라이머 다이머 없음 | NG 대조군 프라이머 세트 | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| 비연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #31 (11 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-N-1 | 5'-AGTCGAAAAAC[C3 spacer]-3' | 13 | ||
| 프라이머 세트 #32 (13 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-N-2 | 5'-AGTCGAAAAACAA[C3 spacer]-3' | 14 | ||
| 프라이머 세트 #33 (15 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-N-3 | 5'-AGTCGAAAAACAACT[C3 spacer]-3' | 15 | ||
| 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #34 (5 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-P-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCG[C3spacer]-3' | 16 | ||
| 프라이머 세트 #35 (7 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-P-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGAA[C3spacer]-3' | 17 | ||
| 프라이머 세트 #36 (9 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-P-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGAAAA[C3spacer]-3' | 18 | ||
| 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 프라이머 세트 #37 (4 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-C-1 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTC-3' | 19 | ||
| 프라이머 세트 #38 (5 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-C-2 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCG-3' | 20 | ||
| 프라이머 세트 #39 (6 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | ||
| 프라이머 세트 #40 (7 mer) | NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 | |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | ||
| NG-C-4 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGAA-3' | 22 |
(밑줄 친 글자는 NG-F4에 대한 상보적인 서열을 나타낸다)
본 실시예에서, TaqMan 프로브를 시그널 발생 수단으로서 타겟 증폭을 검출하는데 사용하였다. 타겟 핵산이 존재하는 경우, TaqMan 프로브는 절단되고 표지된 단편이 방출된다. 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 TaqMan 프로브를 그의 5'-말단에 형광 리포터 분자와 그의 3'-말단에 퀀처 분자로 표지하였다(서열번호: 25 및 26). 증폭 곡선은 상기 표지된 단편으로부터의 시그널을 측정함으로써 수득될 수 있다.
본 실시예에 추가적으로 사용된 프로브의 서열이 하기 표 5에 제공되어 있다.
| 이름 | 서열 | 서열번호 |
| UP-P1 | 5'-[FAM]CCCAGCTATTGCACATGGTGTTGAT[BHQ-1]-3' | 25 |
| NG-P2 | 5'-[CAL Fluor Red 610]TGTACGGCTCCGTTGTGGCGGT[BHQ-2]-3' | 26 |
(BHQ: 블랙 홀 퀀처)
(FAM 및 CAL Fluor Red 610: 형광 리포터 분자)
실시간 PCR을 각각의 프라이머 세트(3 pmole의 정방향 프라이머 및 3 pmole의 역방향 프라이머 및 10 pmole의 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머), 3 pmole의 TaqMan 프로브, 타겟 핵산 서열(0.1 pg의 UP 또는 0.1 pg의 NG) 및 5 μl의 4X 마스터 믹스[final, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 최종 부피 20 μl로 수행하였다. 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에서 50℃에서 5분 동안 둔고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 95℃에서 실시하였다.
상기 실험으로부터 수득된 증폭 곡선이 도 4에 나타나 있다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 비연장가능한 프라이머 다이머(프라이머 세트 #21-23 및 #31-33; 2번째 열) 및 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(프라이머 세트 #23-26 및 #34-36; 3번째 열)는 타겟 핵산 분자의 증폭에 유의하게 영향을 미치지 않은 반면, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(프라이머 세트 #27-30 및 #37-40; 4번째 열)은 대조군 프라이머 세트를 사용한 것과 비교하여 타겟 핵산 분자의 증폭에 유의하게 영향을 미친다.
타겟 증폭에 대한 프라이머 다이머의 영향을 더 잘 이해하기 위해, △CT 값을 하기와 같이 계산하였다:
△CT = [프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머를 갖는 반응에서의 CT] - [프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머 다이머가 없는 반응에서의 CT]
상기 CT 값은 역치 500을 적용하여 수득하였고; 1.0보다 큰 △CT 값은 타겟 핵산 분자의 증폭이 프라이머 다이머에 의해 억제된다는 것을 나타내는 것으로 간주되었다.
계산된 △CT 값이 하기 표 6에 제공되어 있다.
| 다이머-유형 | 프라이머 다이머 내의 상보적인 서열의 길이(mer) | UP | NG | ||
| CT | △CT | CT | △CT | ||
| 프라이머 다이머 없음 | - | 38.69 | - | 38.56 | - |
| 비연장가능한 프라이머 다이머 | 11 | 38.25 | -0.44 | 37.67 | -0.89 |
| 13 | 39.02 | 0.33 | 37.84 | -0.72 | |
| 15 | 38.48 | -0.21 | 38.67 | 0.11 | |
| 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 5 | 37.46 | -1.23 | 38.78 | 0.22 |
| 7 | 38.18 | -0.51 | 38.02 | -0.54 | |
| 9 | 38.1 | -0.59 | 38.01 | -0.55 | |
| 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머 | 4 | 37.63 | -1.06 | 39.04 | 0.48 |
| 5 | 41.14 | 2.45 | 38.64 | 0.08 | |
| 6 | N/A | N/A | 46.97 | 8.41 | |
| 7 | N/A | N/A | N/A | N/A | |
표 6에 나타낸 바와 같이, 비연장가능한 프라이머 다이머 및 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머는 1.0 이하의 △CT 값을 야기하였고, 이는 비연장가능한 프라이머 다이머 및 일-가닥 연장가능한 프라이머 다이머가 타겟 증폭에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
반면, 최소 6-머의 상보적 서열을 갖는 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머(UP 및 NG 모두의 경우)는 1.0을 초과하는 △CT 값을 야기하였고, 이는 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머, 특히 다이머 내에 최소 6개의 상보적 뉴클레오타이드를 갖는 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머가 타겟 증폭을 방해한다는 것을 나타낸다.
실시예 <1-1> 및 <1-2>의 결과로부터, 내부에 5개 이하의 상보적 뉴클레오타이드를 갖는 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성은 다이머 증폭을 촉진하지만 타겟 증폭을 유의하게 억제하지 않으며; 내부에 6개 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 형성은 다이머 증폭을 촉진할뿐만 아니라 타겟 증폭을 억제하는 것으로 결론내릴 것이다.
따라서, 그의 3'-말단 부분에 6개 이상의 상보적 뉴클레오타이드를 갖는 연장가능한 프라이머 다이머로 인한 타겟 증폭의 억제를 방지하기 위해, 프라이머의 3'-말단에 있는 6번째 또는 그 미만의 뉴클레오타이드(5번째, 4번째, 3번째 등)에 유니버설 염기(예컨대, 데옥시이노신)를 배치하는 것이 효과적일 것으로 추정되었다.
실시예
2:
다이머
증폭 및
타겟
증폭에 대한 다양한 위치에
유니버설 염기
뉴클레오타이드를
갖는 UBP의 영향의 평가
<2-1>
다이머
형성에 대한 다양한 위치에
데옥시이노신을
갖는
UBP의
영향
본 실시예에서는, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머의 증폭에 대한 다양한 위치에 유니버설 염기를 갖는 UBP의 영향을 종래의 프라이머와 비교하였다.
본 실험을 위해, 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하는 것으로 확인된 2개의 종래의 프라이머 쌍 중 하나((i) 프라이머 세트 #9에서 UP-R1(서열번호: 1; 프라이머 세트 #19에서 NG-F4(서열번호: 12))를 변형하여 다양한 UBP를 제조하였다. 구체적으로, UBP를 그의 3'-말단의 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째 및 8번째 위치에 있는 자연발생 뉴클레오타이드를 데옥시이노신으로 치환하여 그의 3'-말단의 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째 및 8번째 위치에 하나의 데옥시이노신을 함유하도록 제조하였다.
2개의 종래의 프라이머 쌍 중 하나(UP-C-3(서열번호: 10) 또는 NG-C-3(서열번호: 23))를 UBP 중 하나와 조합하여 다양한 프라이머 세트(프라이머 세트 #9A-9G 및 19A-19G로 지칭됨)를 수득하였다.
본원에 사용된 프라이머 세트가 하기 표 7에 제공되어 있다.
| 프라이머 세트 | 프라이머 이름 | 서열 | 서열번호 |
| 프라이머 세트 #9 (Conventional) |
UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9A (UBP) |
UP-IR-2 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGIT-3' | 27 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9B (UBP) |
UP-IR-3 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAICT-3' | 28 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9C (UBP) |
UP-IR-4 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCIGCT-3' | 29 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9D (UBP) |
UP-IR-5 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATIAGCT-3' | 30 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9E (UBP) |
UP-IR-6 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATAICAGCT-3' | 31 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9F (UBP) |
UP-IR-7 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATITCAGCT-3' | 32 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #9G (UBP) |
UP-IR-8 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAAIATCAGCT-3' | 33 |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #19 (Conventional) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #19A (UBP) |
NG-IF-2 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGAIT-3' | 34 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #19B (UBP) |
NG-IF-3 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGICT-3' | 35 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #19C (UBP) |
NG-IF-4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCIACT-3' | 36 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 19D (UBP) |
NG-IF-5 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTIGACT-3' | 37 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #19E (UBP) |
NG-IF-6 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTICGACT-3' | 38 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #19F (UBP) |
NG-IF-7 | 5'-GCGGACAGTTGTTTITCGACT-3' | 39 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #19G (UBP) |
NG-IF-8 | 5'-GCGGACAGTTGTTITTCGACT-3' | 40 |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 |
(UP-C-3에서 밑줄 친 글자는 UP-R1에 대한 상보적인 서열을 나타내며; NG-C-3에서 밑줄 친 글자는 NG-F4에 대한 상보적인 서열을 나타낸다)
실시간 PCR을 각각의 프라이머 세트(3 pmole의 종래의 프라이머 UP-R1(서열번호: 2) 및 UBP(서열번호: 27-33) 중 하나 및 10 pmole의 UP-C-3(서열번호: 10), 또는 3 pmole의 종래의 프라이머 NG-F4(서열번호: 13) 또는 UBP(서열번호: 34-40) 중 하나 및 10 pmole의 NG-C-3(서열번호: 21)), 2 μl의 SYBR® Green I, 및 5 μl의 4X 마스터 믹스[final, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 최종 부피 20 μl로 수행하였다. 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에서 50℃에서 5분 동안 두고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 57℃에서 실시하였다.
상기 수득된 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선이 도 5A 및 5B에 나타나 있다.
도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선은 프라이머 세트 #9A-9E 및 #19A-19E(2번째, 3번째, 4번째, 5번째 및 6번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)의 경우 관찰되거나 생성되지 않은 반면, 프라이머 다이머에 대한 증폭 곡선은 프라이머 세트 #19F 및 #19G(7번째 및 8번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)의 경우 관찰되었다.
프라이머 다이머 형성의 억제에 대한 UBP의 영향을 더 잘 이해하기 위해, △CT 값을 하기와 같이 계산하였다:
△CT = [UBP 함유 프라이머 세트에 대한 CT] - [종래의 프라이머 세트에 대한 CT]
상기 CT 값은 역치 500을 적용하여 수득하였고; 1.0보다 큰 △CT 값은 다이머 증폭이 UBP에 의해 억제된다는 것을 나타내는 것으로 간주되었다.
계산된 △CT 값이 하기 표 8에 제공되어 있다.
| 프라이머 세트 | UP | 프라이머 세트 | NG | ||
| CT | △CT | CT | △CT | ||
| 프라이머 세트 #9 (종래) |
29.98 | - | 프라이머 세트 #19 (종래) |
29.09 | - |
| 프라이머 세트 #9A (UBP; 2번째) |
N/A | N/A | 프라이머 세트 #19A (UBP; 2번째) |
N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #9B (UBP; 3번째) |
34.34 | 4.36 | 프라이머 세트 #19B (UBP; 3번째) |
38.41 | 9.32 |
| 프라이머 세트 #9C (UBP; 4번째) |
47.22 | 17.24 | 프라이머 세트 #19C (UBP; 4번째) |
34.51 | 5.42 |
| 프라이머 세트 #9D (UBP; 5번째) |
N/A | N/A | 프라이머 세트 #19D (UBP; 5번째) |
N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #9E (UBP; 6번째) |
N/A | N/A | 프라이머 세트 #19E (UBP; 6번째) |
N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #9F (UBP; 7번째) |
30.70 | 0.72 | 프라이머 세트 #19F (UBP; 7번째) |
26.55 | -2.54 |
| 프라이머 세트 #9G (UBP; 8번째) |
29.86 | -0.12 | 프라이머 세트 #19G (UBP; 8번째) |
28.06 | -1.03 |
(N/A: 적용가능하지 않음)
(괄호 안의 숫자는 프라이머 내의 데옥시이노신의 위치를 의미함)
표 8에 나타낸 바와 같이, 다이머 증폭은 프라이머 세트 #9A-9E 및 #19A-19E(2번째, 3번째, 4번째, 5번째 및 6번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)의 경우 억제되었지만, 프라이머 세트 #9F, #9G, #19F 및 #19G(7번째 및 8번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)의 경우 억제되지 않았다.
이 결과는 그의 3'-말단의 2번째 내지 6번째 위치에 데옥시이노신을 함유하는 UBP가 다이머 증폭을 방지하는데 효과적이라는 것을 입증한다.
<2-2>
타겟
증폭에 대한 다양한 위치에서
데옥시이노신을
갖는
UBP의
영향
본 실시예에서는, 다양한 위치에 유니버설 염기를 갖는 UBP가 타겟 증폭에 미치는 영향을 종래의 프라이머와 비교하였다.
본 실험을 위해, 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 2개의 종래의 프라이머(UP의 경우 프라이머 세트 #29 또는 NG의 경우 프라이머 세트 #39) 및 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 하나의 프라이머를 먼저 제조하였다. 그 다음, 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 2개의 종래의 프라이머 중 하나를 변형하여 다양한 UBP를 제조하였다. UBP는 실시예 <2-1>에서와 같이 다양한 위치에 데옥시이노신을 함유하도록 제조하였다.
그 결과, 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 종래의 프라이머 및 UBP를 두-가닥 연장 가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머와 조합하여 다양한 프라이머 세트를 수득하였다.
TaqMan 실시간 프로브(서열번호: 25 및 26)을 증폭의 검출에 추가로 사용하였다.
사용된 프라이머 세트가 하기 표 9에 제공되어 있다.
| 프라이머 세트 | 프라이머 이름 | 서열 | 서열번호 |
| 프라이머 세트 #29 (종래) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-R1 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGCT-3' | 1 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29A (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-2 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAGIT-3' | 27 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29B (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-3 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAICT-3' | 28 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29C (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-4 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCIGCT-3' | 29 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29D (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-5 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATIAGCT-3' | 30 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29E (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-6 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATAICAGCT-3' | 31 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29F (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-7 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATITCAGCT-3' | 32 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #29G (UBP) |
UP-F1 | 5'-GCACAATTTGGATCATTAAAAGGT-3' | 23 |
| UP-IR-8 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAAIATCAGCT-3' | 33 | |
| UP-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGCTGA-3' | 10 | |
| 프라이머 세트 #39 (종래) |
NG-F4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGACT-3' | 12 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39A (UBP) |
NG-IF-2 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGAIT-3' | 34 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39B (UBP) |
NG-IF-3 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCGICT-3' | 35 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39C (UBP) |
NG-IF-4 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTCIACT-3' | 36 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39D (UBP) |
NG-IF-5 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTTIGACT-3' | 37 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39E (UBP) |
NG-IF-6 | 5'-GCGGACAGTTGTTTTICGACT-3' | 38 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39F (UBP) |
NG-IF-7 | 5'-GCGGACAGTTGTTTITCGACT-3' | 39 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 | |
| 프라이머 세트 #39G (UBP) |
NG-IF-8 | 5'-GCGGACAGTTGTTITTCGACT-3' | 40 |
| NG-R2 | 5'-GTCGTATCCGCATCCGTCAA-3' | 24 | |
| NG-C-3 | 5'-TTGGCTTGGCTTGGCTTAGTCGA-3' | 21 |
(UP-C-3에서의 밑줄 친 글자는 UP-R1에 대한 상보적인 서열을 가리키고; NG-C-3에서의 밀줄 친 글자는 NG-F4에 대한 상보적인 서열을 가리킨다)
구체적으로, 실시간 PCR을 각각의 프라이머 세트(UP-타겟 증폭을 위한 3 pmole의 종래의 정방향 프라이머 UP-F1(서열번호: 23) 및 3 pmole의 종래의 역방향 프라이머 UP-R1(서열번호: 1) 및 UBP(서열번호: 27-33) 중 하나, 및 10 pmole의 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(서열번호: 10), 또는 NG-타겟 증폭을 위한 3 pmole의 종래의 역방향 프라이머 NG-R2(서열번호: 14) 및 3 pmole의 종래의 정방향 프라이머 NG-F4(서열번호: 13) 및 UBP(서열번호: 34-40) 중 하나, 및 10 pmole의 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(서열번호: 21)), 타겟 핵산 서열(0.1 pg의 UP 또는 0.1 pg의 NG), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스[final, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 최종 부피 20 μl로 수행하였다. 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에서 50℃에서 5분 동안 두고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 95℃에서 실시하였다.
비교를 위해, 실시간 PCR을 두-가닥 연장가능한 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3(서열번호: 10) 또는 NG-C-3(서열번호: 21))가 없는 프라이머 세트를 이용하여 수행하였다.
각각의 프라이머 세트로부터 수득된 증폭 곡선이 도 6A 및 6B에 나타나 있다. 도면에서, "-X-"는 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3 또는 NG-C-3)이 없는 프라이머 세트에 대한 결과를 나타내고; "-O-"는 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머(UP-C-3 또는 NG-C-3)를 갖는 프라이머 세트에 대한 결과를 나타낸다. 역치 값 150 및 400을 적용하여 각각 UP 및 NG의 CT 값을 계산한 다음, △CT 값을 하기와 같이 계산하였다:
△CT = [프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 존재하에 반응에서의 CT] - [프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 부재하에 반응에서의 CT]
계산된 △CT 값이 하기 표 10 및 11에 제공되어 있다.
| 프라이머 세트 | UP | ||
| CT | △CT | ||
| UP-C-3의 부재 | UP-C-3의 존재 | ||
| 프라이머 세트 #29 (종래) |
38.55 | N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #29A (UBP; 2nd) | N/A | N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #29B (UBP; 3rd) | 37.6 | 38.3 | 0.7 |
| 프라이머 세트 #29C (UBP; 4th) | 38.18 | 38.6 | 0.42 |
| 프라이머 세트 #29D (UBP; 5th) | 38.62 | 38.64 | 0.02 |
| 프라이머 세트 #29E (UBP; 6th) |
38.69 | 38.02 | -0.67 |
| 프라이머 세트 #29F (UBP; 7th) | 38.87 | N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #29G (UBP; 8th) | 39.03 | N/A | N/A |
| 프라이머 세트 | NG | ||
| CT | △CT | ||
| NG-C-3의 부재 | NG-C-3의 존재 | ||
| 프라이머 세트 #39 (종래) |
38.55 | 48.43 | 9.88 |
| 프라이머 세트 #39A (UBP; 2nd) | 45.3 | 46.7 | 1.4 |
| 프라이머 세트 #39B (UBP; 3rd) | 37.79 | 38.7 | 0.91 |
| 프라이머 세트 #39C (UBP; 4th) | 38.15 | 38.21 | 0.06 |
| 프라이머 세트 #39D (UBP; 5th) | 38.52 | 38.8 | 0.28 |
| 프라이머 세트 #39E (UBP; 6th) |
38.02 | 38.17 | 0.15 |
| 프라이머 세트 #39F (UBP; 7th) | 38.59 | N/A | N/A |
| 프라이머 세트 #39G (UBP; 8th) | 38.13 | N/A | N/A |
프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 부재하에 증폭 곡선의 검출 및 1.0 이하의 △CT 값은 타겟 핵산 서열이 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 존재에 관계없이 성공적으로 증폭된다는 것을 나타낸다.
표 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 프라이머 세트 #29 및 #39는 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 부재하에 UP 및 NG 모두를 증폭할 수 있었지만, 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 존재하에 UP 및 NG를 증폭할 수 없었다.
한편, 프라이머 세트 #29A 및 #39A(각각 2번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)는 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 부재하에도 UP 및 NG를 증폭할 수 없었으나; 프라이머 세트 #29B-29E 및 39B-39E(각각 3번째, 4번째, 5번째, 또는 6번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)는 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 존재 또는 부재하에 UP 및 NG를 증폭할 수 있었고; 프라이머 세트 #29F-29G 및 #39F-39G(각각 7번째 또는 8번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP 포함)는 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 부재하에 UP 및 NG를 성공적으로 증폭하였으나, 프라이머 다이머를 형성하기 위한 프라이머의 존재하에 UP 및 NG를 증폭할 수 없었다.
상기 결과는 내부의 3'-말단의 3번째 내지 6번째 위치에 데옥시이노신을 갖는 UBP가 타겟 증폭에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
종합하면, 내부의 3'-말단으로부터 3번째 내지 6번째 위치에 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 함유하는 UBP의 사용이 프라이머 다이머 형성을 억제함으로써 타겟 증폭을 개선할 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
3:
UBP의
효과의 검증
본 발명자들은 프라이머 내의 3'-말단으로부터 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드에 유니버설 염기를 함유하는 본 발명의 UBP가 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머의 형성을 실제적으로 억제하는지 검증하였다.
<3-1>
프라이머
다이머
형성을
억제하는데 있어서
UBP의
유용성
본 실험을 위해, 3가지 상이한 유형의 프라이머 혼합물을 하기와 같이 제조하였다: (i) 종래의 프라이머 혼합물; (ii) 제1 UBP 혼합물; 및 (iii) 제2 UBP 혼합물.
상기 프라이머 혼합물 (i)-(iii) 각각은 4개의 타겟 핵산 서열인 Ureaplasma urealyticum(UU), Mycoplasma genitalium(MG), Neisseria gonorrhoeae(NG), 및 Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA을 증폭하기 위한 4개의 프라이머 쌍으로 구성되었고, 각각의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하였다.
구체적으로, 종래의 프라이머 혼합물은 서열 내에 데옥시이노신을 함유하지 않은 8개의 종래의 프라이머로 구성되었고, 대조군으로서 사용되었다. 제1 UBP 혼합물은 4개의 정방향 UBP(1개의 데옥시이노신 함유) 및 4개의 역방향 종래의 프라이머로 구성되었고, 제2 UBP 혼합물은 4개의 정방향 UBP(2개의 데옥시이노신 함유) 및 4개의 역방향 종래의 프라이머로 구성되었다. UBP는 종래의 프라이머 내의 1개 또는 2개의 자연 염기를 데옥시이노신으로 치환함으로써 제조되었다.
종래의 프라임 혼합물, 제1 UBP 프라이머 혼합물, 및 제2 UBP 프라이머 혼합물 내의 프라이머의 서열이 하기 표 12에 제공되어 있다.
| 유형 | 이름 | 서열 | 서열번호 |
| 종래의 프라이머 혼합물 |
UU-F1 | 5'-GCATATGATGAAGCACACAACAAAATGG-3' | 41 |
| UU-R1 | 5'-GCTTTGGCTGATGATTGCGTAG-3' | 42 | |
| MG-F1 | 5'-AAAACCCACGGAAATGATGAGA-3' | 43 | |
| MG-R1 | 5'-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTG-3' | 44 | |
| NG-F1 | 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGC-3' | 45 | |
| NG-R1 | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' | 46 | |
| CT-F1 | 5'-TTATTCATCCGAATGGATAAAGCGTGA-3' | 47 | |
| CT-R1 | 5'-AACAATGAATCCTGAGCAAAGG-3' | 48 | |
| 제1 UBP 혼합물 | UU-F2 | 5'-GCATATGATGAAGCACACAACAAAAIGG-3' | 49 |
| UU-R1 | 5'-GCTTTGGCTGATGATTGCGTAG-3' | 42 | |
| MG-F2 | 5'-AAAACCCACGGAAATGAIGAGA-3' | 50 | |
| MG-R1 | 5'-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTG-3' | 44 | |
| NG-F2 | 5'-TACGCCTGCTACTTTCICGC-3' | 51 | |
| NG-R1 | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' | 46 | |
| CT-F2 | 5'-TTATTCATCCGAATGGATAAAGCGIGA-3' | 52 | |
| CT-R1 | 5'-AACAATGAATCCTGAGCAAAGG-3' | 48 | |
| 제2 UBP 혼합물 | UU-F3 | 5'-GCATATGATGAAICACACAACAAAAIGG-3' | 53 |
| UU-R1 | 5'-GCTTTGGCTGATGATTGCGTAG-3' | 42 | |
| MG-F3 | 5'-AAAACCCACIGAAATGAIGAGA-3' | 54 | |
| MG-R1 | 5'-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTG-3' | 44 | |
| NG-F3 | 5'-TACGCCTGCIACTTTCICGC-3' | 55 | |
| NG-R1 | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3' | 46 | |
| CT-F3 | 5'-TTATTCATCCGAAIGGATAAAGCGIGA-3' | 56 | |
| CT-R1 | 5'-AACAATGAATCCTGAGCAAAGG-3' | 48 |
(I: 데옥시이노신)
구체적으로, 실시간 PCR 반응을 종래의 프라이머 혼합물(서열번호: 41-48), 제1 UBP 혼합물(서열번호: 49, 42, 50, 44, 51, 46, 52 및 48) 또는 제2 UBP 프라이머(서열번호: 53, 42, 54, 44, 55, 46, 56 및 48) 내의 각각의 프라이머 3 pmole, 2 μl의 SYBR® Green I, 및 5 μl의 4X 마스터 믹스[final, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 최종 부피 20 μl로 수행하였다. 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에서 50℃에서 5분 동안 두고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 57℃에서 실시하였다.
상기 실험으로부터 수득된 증폭 곡선이 도 7에 나타나 있다. 이후, 다이머 증폭 정도를 평가하기 위해, 역치 값 500을 적용하여 사이클 역치(CT) 값을 계산하였다.
그 결과, 제1 UBP 혼합물, 제2 UBP 혼합물에 대한 CT 값(즉, 각각 40.36 및 41.2)은 종래의 프라이머 혼합물에 대한 CT 값(즉, 22.71)보다 높은 것으로 나타났다.
상기 결과는 본 발명의 UBP, 특히 프라이머 내의 3'-말단으로부터 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드에 유니버설 염기를 함유하는 본 발명의 UBP의 사용이 멀티플렉스 증폭 반응에서 종래의 프라이머와 비교하여 다이머 형성 및 증폭을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
<3-2>
타겟
증폭을
증가시키는데 있어서
UBP의
유용성
본 실시예에서는, TaqMan 프로브를 시그널 발생 수단으로서 적용하여 다중 타겟 증폭을 검출하였다.
본 실시예에 추가적으로 사용된 프로브의 서열이 하기 표 13에 제공되어 있다.
| 이름 | 서열 | 서열번호 |
| UU-P1 | 5'-[FAM]CACTTCACCAGATACATAACCCCCGCC[BHQ-1]-3' | 56 |
| MG-P1 | 5'-[CAL Fluor Orange 560]ACACCTCTTGCTGTTCTTGAAAGAACTC[BHQ-1]-3' | 57 |
| NG-P1 | 5'-[CAL Fluor Red 610]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' | 58 |
| CT-P1 | 5'-[Quasar 705]CATTGTAAAGATATGGTCTGCTTCGACCG[BHQ-3]-3' | 59 |
(BHQ: 블랙 홀 퀀처)
(FAM, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 610, 및 Quasar 705: 형광 리포터 분자)
구체적으로, 실시간 PCR 반응을 종래의 프라이머 혼합물(서열번호: 41-48), 제1 UBP 혼합물(서열번호: 49, 42, 50, 44, 51, 46, 52 및 48) 또는 제2 UBP 프라이머(서열번호: 53, 42, 54, 44, 55, 46, 56 및 48) 내의 각각의 프라이머 3 pmole, 3 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호: 56-59), 4개의 타겟 핵산 서열(0(NTC)), 0.1, 1 또는 10 pg의 각각의 지놈 DNA), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스[final, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 최종 부피 20 μl로 수행하였다. 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에서 50℃에서 5분 동안 두고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 95℃에서 실시하였다.
상기 실험으로부터 수득된 증폭 곡선이 도 8에 나타나 있다. 도 8에서 보는 바와 같이, 종래의 프라이머 혼합물은 다양한 농도의 4개의 타겟 핵산 서열 대부분을 증폭할 수 없었다. 반면, 제1 UBP 혼합물 및 제2 UBP 혼합물 모두는 모든 타겟 핵산 서열을 증폭할 수 있었다.
이후, 사용된 프라이머 혼합물 간의 타겟 증폭 효율을 비교하기 위해, 역치 값 150, 100, 400, 및 500을 각각 적용하여 UU, MG, NG 및 CT의 CT 값을 계산하였다.
결과가 하기 표 14에 제공되어 있다.
| 타겟 | CT | |||
| 종래의 프라이머 혼합물 |
제1 UBP 혼합물 |
제2 UBP 혼합물 |
||
| UU | 10 pg | 37.01 | 33.35 | 33.2 |
| 1 pg | N/A | 37.22 | 37.99 | |
| 0.1 pg | N/A | 40.58 | 41.18 | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | |
| MG | 10 pg | N/A | 30.75 | 31.76 |
| 1 pg | N/A | 34.2 | 35.02 | |
| 0.1 pg | N/A | 38.74 | 39.53 | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | |
| NG | 10 pg | 30.37 | 30.09 | 30.13 |
| 1 pg | 35.74 | 33.89 | 33.53 | |
| 0.1 pg | 49.48 | 37.04 | 37.11 | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | |
| CT | 10 pg | 34.81 | 31.57 | 31.55 |
| 1 pg | N/A | 35.86 | 35.41 | |
| 0.1 pg | N/A | 39.19 | 39.84 | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | |
N/A: 적용가능하지 않음
NTC: 주형 대조군 없음
표 14에 나타낸 바와 같이, 종래의 프라이머 혼합물은 다양한 농도의 12개의 타겟 핵산 서열 중에서 몇 개의 타겟 핵산 서열, 즉 10 pg의 UU, 10 pg, 1 pg 및 0,1 pg의 NG, 및 10 pg의 CT를 유의하게 증폭할 수 있었다. 반면, 각각 본 발명의 UBP를 함유하는 제1 UBP 혼합물 및 제2 UBP 혼합물은 12개의 타겟 핵산 서열을 모두 유의하게 증폭할 수 있었다.
본 발명의 방법이 타겟 증폭 효율에 미치는 영향을 추가로 평가하기 위해, 정량적 RT-PCR(qPCR) 데이터의 분석을 위한 종래의 프로그램인 LinRegPCR(버전 2017.1)을 사용하여 증폭 효율을 계산하였다.
상기 프로그램은 입력 원시 데이터를 사용하여 증폭 효율을 계산하고 이를 출력한다(출력된 증폭 효율은 퍼센트 기준으로 변환될 수 있음). 본 실시예에서, 종래의 프라이머 혼합물, 제1 UBP 혼합물 및 제2 UBP 혼합물 중 하나를 사용한 각각의 반응에 대한 증폭 효율을 상기 프로그램에 의해 수득한 다음, 제1 UBP 혼합물 또는 제2 UBP 혼합물의 효율의 증가율을 하기와 같이 계산하였다.
식 2
증폭 증가율(%) = [(UBP를 사용한 반응의 효율 / 종래의 프라이머를 사용한 반응의 효율)-1] * 100
결과가 하기 표 15에 제공되어 있다.
| 주형 | 효율 (%) | 증가율 (%) | |||||
| 종래의 프라이머 혼합물 | 제1 UBP 혼합물 |
제2 UBP 혼합물 |
종래의 프라이머 혼합물 | 제1 UBP 혼합물 |
제2 UBP 혼합물 |
||
| UU | 10 pg | 60.7% (1.214) |
87.0% (1.739) |
86.1% (1.721) |
0% | +43.2% | +41.8% |
| 1 pg | N/A | 106.5% (2.129) |
90.6% (1.812) |
0% | >>100% | >>100% | |
| 0.1 pg | N/A | 74.8% (1.495) |
64.6% (1.292) |
0% | >>100% | >>100% | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | 0% | N/A | N/A | |
| MG | 10 pg | N/A | 82.7% (1.653) |
83.5% (1.670) |
0% | >>100% | >>100% |
| 1 pg | N/A | 86.3% (1.726) |
86.5% (1.729) |
0% | >>100% | >>100% | |
| 0.1 pg | N/A | 75.3% (1.505) |
70.4% (1.407) |
0% | >>100% | >>100% | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | 0% | N/A | N/A | |
| NG | 10 pg | 101.5% (2.030) |
104.8% (2.096) |
110.5% (2.210) |
0% | +3.3% | +8.9% |
| 1 pg | 78.1% (1.561) |
98.7% (1.974) |
97.8% (1.956) |
0% | +26.5% | +25.3% | |
| 0.1 pg | 59.3% (1.185) |
90.9% (1.817) |
94.8% (1.895) |
0% | +53.3% | +59.9% | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | 0% | N/A | N/A | |
| CT | 10 pg | 81.8% (1.635) |
91.4% (1.828) |
92.5% (1.850*) |
0% | +11.8% | +13.1% |
| 1 pg | N/A | 85.5% (1.709) |
87.0% (1.740) |
0% | >>100% | >>100% | |
| 0.1 pg | N/A | 71.1% (1.422) |
98.5% (1.969) |
0% | >>100% | >>100% | |
| NTC | N/A | N/A | N/A | 0% | N/A | N/A | |
표 15에 나타낸 바와 같이, 제1 UBP 혼합물 및 제2 UBP 혼합물을 사용한 반응 중 일부는 종래의 프라이머 혼합물보다 두드러진 효율의 증가율을 나타내었는데("증가율" 컬럼에서 ">>100%"로 표시됨), 종래의 프라이머 혼합물을 사용한 반응의 경우 증폭 효율이 결정되지 않았으나 제1 UBP 혼합물 및 제2 UBP 혼합물을 사용한 반응의 경우 결정되었기 때문이다.
또한, 제1 UBP 혼합물 및 제2 UBP 혼합물을 사용한 반응 중 일부는 종래의 프라이머 혼합물을 사용한 반응과 비교하여 3.3%-59.9%의 효율의 증가율을 나타내었다.
상기 결과는 본 발명의 UBP, 특히 프라이머 내의 3'-말단으로부터 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드에 유니버설 염기를 함유하는 본 발명의 UBP의 사용이 멀티플렉스 증폭 반응에서 종래의 프라이머와 비교하여 타겟 증폭 효율을 개선시킬 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<400> 1
ggttctcaag caacaatatc agct 24
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-N-1
<400> 2
agctgatatt g 11
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-N-2
<400> 3
agctgatatt gtt 13
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-N-3
<400> 4
agctgatatt gttgc 15
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-P-1
<400> 5
ttggcttggc ttggcttagc tg 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-P-2
<400> 6
ttggcttggc ttggcttagc tgat 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-P-3
<400> 7
ttggcttggc ttggcttagc tgatat 26
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-C-1
<400> 8
ttggcttggc ttggcttagc t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-C-2
<400> 9
ttggcttggc ttggcttagc tg 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-C-3
<400> 10
ttggcttggc ttggcttagc tga 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-C-4
<400> 11
ttggcttggc ttggcttagc tgat 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-F4
<400> 12
gcggacagtt gtttttcgac t 21
<210> 13
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-N-1
<400> 13
agtcgaaaaa c 11
<210> 14
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-N-2
<400> 14
agtcgaaaaa caa 13
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-N-3
<400> 15
agtcgaaaaa caact 15
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-P-1
<400> 16
ttggcttggc ttggcttagt cg 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-P-2
<400> 17
ttggcttggc ttggcttagt cgaa 24
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-P-3
<400> 18
ttggcttggc ttggcttagt cgaaaa 26
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-C-1
<400> 19
ttggcttggc ttggcttagt c 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-C-2
<400> 20
ttggcttggc ttggcttagt cg 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-C-3
<400> 21
ttggcttggc ttggcttagt cga 23
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-C-4
<400> 22
ttggcttggc ttggcttagt cgaa 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-F1
<400> 23
gcacaatttg gatcattaaa aggt 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-R2
<400> 24
gtcgtatccg catccgtcaa 20
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-P1
<400> 25
cccagctatt gcacatggtg ttgat 25
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-P2
<400> 26
tgtacggctc cgttgtggcg gt 22
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)
<223> n is deoxyinosine
<400> 27
ggttctcaag caacaatatc agnt 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)
<223> n is deoxyinosine
<400> 28
ggttctcaag caacaatatc anct 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> n is deoxyinosine
<400> 29
ggttctcaag caacaatatc ngct 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)
<223> n is deoxyinosine
<400> 30
ggttctcaag caacaatatn agct 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-6
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n is deoxyinosine
<400> 31
ggttctcaag caacaatanc agct 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-7
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n is deoxyinosine
<400> 32
ggttctcaag caacaatntc agct 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UP-IR-8
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n is deoxyinosine
<400> 33
ggttctcaag caacaanatc agct 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)
<223> n is deoxyinosine
<400> 34
gcggacagtt gtttttcgan t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n is deoxyinosine
<400> 35
gcggacagtt gtttttcgnc t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n is deoxyinosine
<400> 36
gcggacagtt gtttttcnac t 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n is deoxyinosine
<400> 37
gcggacagtt gtttttngac t 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-6
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> n is deoxyinosine
<400> 38
gcggacagtt gttttncgac t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-7
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n is deoxyinosine
<400> 39
gcggacagtt gtttntcgac t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-IF-8
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n is deoxyinosine
<400> 40
gcggacagtt gttnttcgac t 21
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UU-F1
<400> 41
gcatatgatg aagcacacaa caaaatgg 28
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UU-R1
<400> 42
gctttggctg atgattgcgt ag 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: MG-F1
<400> 43
aaaacccacg gaaatgatga ga 22
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: MG-R1
<400> 44
ctcgttaatt tacctattcc attttg 26
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-F1
<400> 45
tacgcctgct actttcacgc 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-R1
<400> 46
caatggatcg gtatcactcg c 21
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CT-F1
<400> 47
ttattcatcc gaatggataa agcgtga 27
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CT-R1
<400> 48
aacaatgaat cctgagcaaa gg 22
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UU-F2
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)
<223> n is deoxyinosine
<400> 49
gcatatgatg aagcacacaa caaaangg 28
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: MG-F2
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n is deoxyinosine
<400> 50
aaaacccacg gaaatganga ga 22
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-F2
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n is deoxyinosine
<400> 51
tacgcctgct actttcncgc 20
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CT-F2
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)
<223> n is deoxyinosine
<400> 52
ttattcatcc gaatggataa agcgnga 27
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: UU-F3
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> n is deoxyinosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)
<223> n is deoxyinosine
<400> 53
gcatatgatg aancacacaa caaaangg 28
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: MG-F3
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n is deoxyinosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n is deoxyinosine
<400> 54
aaaacccacn gaaatganga ga 22
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-F3
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n is deoxyinosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n is deoxyinosine
<400> 55
tacgcctgcn actttcncgc 20
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CT-F3
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n is deoxyinosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)
<223> n is deoxyinosine
<400> 56
ttattcatcc gaanggataa agcgnga 27
Claims (31)
- 다음의 단계를 포함하는, 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법:
(a) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍을 제조하는 단계; 상기 각각의 프라이머 쌍은 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 최소 3개의 프라이머 쌍에서 최소 50%의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하며, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위에 위치하고, 상기 최소 3개의 프라이머 쌍을 사용한 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성하며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이고;
(b) 상기 최소 3개의 프라이머 쌍을 사용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 2 사이클을 포함하는 멀티플렉스 증폭 반응을 실시하는 단계; 상기 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성한다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 코어 영역은 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드 범위이고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 6번째 뉴클레오타이드의 범위에 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 최소 하나의 프라이머 쌍에서 2개의 프라이머는 UBP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 각각의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 UBP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 UBP 중 최소 하나는 축퇴성 염기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 최소 5개의 프라이머 쌍이 최소 5개의 타겟 핵산 분자를 증폭하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 어닐링은 50℃ 이상에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 최소 하나의 UBP 대신에 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 자연 발생 뉴클레오타이드(A, C, G 또는 T(U))를 함유하는 프라이머(들)를 사용한 것보다 최소 3% 높은 타겟 증폭 효율을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 타겟 핵산 분자의 부재하에 UBP를 함유하는 프라이머 쌍을 사용한 반응으로부터 수득된 Ct 값은 타겟 핵산 분자의 부재하에 종래의 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 사용한 것과 비교하여 1 이상 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 증폭 반응은 상기 타겟 핵산 분자의 존재를 검출하기 위해 최소 3개의 추가의 프로브의 존재하에 실시되며; 상기 최소 3개의 프로브 각각은 증폭될 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 최소 3개의 프로브는 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 데옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-데옥시이노신, 2-아자-2'-데옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 데옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 데옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 데옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 데옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르폴리노-5-니트로인돌, 모르폴리노-네불라린, 모르폴리노-이노신, 모르폴리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르폴리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-O-메톡시에틸 이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 다음의 단계를 포함하는 최소 3개의 타겟 핵산 분자에 대한 멀티플렉스 증폭 반응에서 프라이머 다이머 형성을 감소시키는 방법:
(a) 증폭될 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 결정하는 단계;
(b) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 상기 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(c) 상기 최소 3개의 프라이머 쌍에서 최소 50%의 프라이머 내의 1-3개의 뉴클레오타이드를 유니버설 염기 뉴클레오타이드로 치환하여 유니버설 염기 프라이머(UBP)를 제조하는 단계; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드로의 치환은 프라이머 다이머 형성을 억제하고; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 가지며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하여, 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이며;
(d) 상기 최소 3개의 프라이머 쌍을 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 2 사이클을 포함하는 멀티플렉스 증폭 반응을 실시하는 단계; 상기 멀티플렉스 증폭 반응은 감소된 프라이머 다이머 형성으로 타겟 핵산 분자의 증폭 산물을 생성한다.
- 제 15 항에 있어서, 상기 코어 영역은 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 5번째 뉴클레오타이드 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 최소 하나의 프라이머 쌍에서 2개의 프라이머는 UBP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 각각의 프라이머 쌍에서 1개 또는 2개의 프라이머는 UBP인 것을 특징으로 하는 방법.
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- 다음을 포함하는, 멀티플렉스 증폭 반응에서 감소된 프라이머 다이머 형성으로 최소 3개의 타겟 핵산 분자를 증폭하기 위한 키트:
(a) 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍; 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 최소 3개의 프라이머 쌍에서 최소 50%의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하며, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이며;
(b) 핵산 중합 효소.
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- 하기를 수행하도록 구성된 명령을 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체:
각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 최소 3개의 프라이머 쌍을 디자인하는 것; 각각의 프라이머는 해당하는 타겟 핵산 분자에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 최소 3개의 프라이머 쌍에서 최소 50%의 프라이머는 유니버설 염기 프라이머(UBP)이며; 상기 UBP는 1-3개의 유니버설 염기 뉴클레오타이드를 갖고; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드 중 1개 또는 2개는 UBP의 3'-말단에 있는 3번째 뉴클레오타이드 내지 6번째 뉴클레오타이드 범위의 코어 영역에 위치하고, 나머지는 UBP의 5'-말단에 있는 4번째 뉴클레오타이드 내지 UBP의 3'-말단에 있는 7번째 뉴클레오타이드의 범위의 영역에 위치하며; 상기 유니버설 염기 뉴클레오타이드는 UBP에서 비연속적이다.
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