KR102268893B1

KR102268893B1 - 림노트릭스 속 knua002 균주를 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102268893B1
Application number: KR1020200005746A
Authority: KR
Inventors: 윤호성; 김언경; 김예리; 도정미
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-06-24
Anticipated expiration: 2040-01-16

Abstract

본 발명은 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주는 시스플라틴에 의해 축적된 세포 내 활성산소를 효과적으로 제거함으로써 청각 유모 세포를 보호할 수 있으며 이로 인해 난청 치료 또는 완화 효과가 있다.

Description

림노트릭스 속 KNUA002 균주를 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating hearing loss comprising Limnothrix sp. KNUA002 strain}

본 발명은 림노트릭스 속 KNUA002 균주를 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

귀는 귓바퀴와 외이도까지를 외이로 분류하고, 고막과 이소골은 중이, 그리고 달팽이관과 청신경을 내이로 분류한다. 소리는 음향학적 에너지로서 귓바퀴와 외이도를 통해 전달되어 고막을 진동시키게 된다. 고막의 진동은 기계적인 에너지로 고막에 붙어있는 3개의 작은 뼈로 이루어진 이소골로 전달된다. 이소골의 마지막 뼈인 등골은 달팽이관에 연결되어, 달팽이관 내의 림프액으로 에너지를 전달시키게 된다. 전달된 에너지는 림프액에 파동을 일으키고 이러한 파동에 의해 달팽이관 내에 있는 유모세포가 자극받게 된다. 유모세포의 움직임으로 이온변화가 일어나면서 유모세포에 붙어있는 청신경으로 신경전달물질이 전달되고, 소리에너지는 청신경에서 전기적인 에너지 형태로 뇌까지 전달되게 된다.

외이와 중이는 소리를 전달하는 기관으로서 염증 같은 질병에 감염되었을 때 대부분 치료나 수술로써 회복될 수 있고, 그로 인한 청력손실 역시 치료 후에 개선될 수 있다. 이러한 난청을 전음성 난청(conductive hearing loss)이라 한다.

한편, 소리를 감지하는 기관인 달팽이관과 전기적 에너지로 소리를 전달하는 청신경, 그리고 소리의 변별, 이해 등 종합적인 역할을 하는 청각을 담당하는 뇌에 문제가 생겨 발생하는 난청을 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)이라 한다. 대부분의 청력손실은 현재까지 예방 외에 치료방법이 없는 감각신경성 난청에 해당하며, 일단 난청이 발병되면 보청기 등의 보조수단을 이용하거나 아니면 기계적 장치를 체내에 이식하는 방법으로 듣는데 도움을 받고 있다. 감각신경성 난청의 원인으로는 소음, 약물, 노화, 외상, 대사성질병, 바이러스 등이 있다. 이 중 최근 눈에 띄게 증가하는 인자는 소음과 노화로 인한 난청이다. 전세계적인 추세인 사회의 고령화는 노인성 난청을 증가시키고 있고, 소음환경에서 일하는 근로자나 군인 같은 직업적 소음성 난청뿐만 아니라 문화 및 여가생활에 의한 소음성 난청도 증가하고 있다.

최근 난청의 예방 및 치료에 효과적인 물질을 찾기 위한 연구로서, 항산화제, N-메틸-D-아스파테이트 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 길항제, 세포사멸 억제제, 성장인자 등에 대한 전임상 연구가 보고되고 있으나, 임상실험으로 진행하기에는 한계가 있음을 나타났다. 또한, 현재까지 소음성 난청의 예방 및 치료와 관련하여 승인된 약물은 없으며, 학계에 보고된 바로는 전임상 단계에서의 연구와 임상 단계에서의 Mg, NAC (N-acetylcysteine, NAC) 그리고 엡셀렌(Ebselen)의 약물만이 보고되고 있다. 더욱이, 인체에 독성 또는 위험성이 없이 사용할 수 있는 천연물 내지 천연 소재를 이용한 난청 치료제에 대해서는 개발된 약물을 거의 찾아볼 수 없는 실정이다.

한국공개특허 제10-2010-0052556호

따라서 본 발명의 목적은 난청에 대한 치료 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 난청에 대한 치료 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 난청은 전음성 난청(conductive hearing loss) 또는 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 난청은 소음성 난청, 노인성 난청, 돌발성 난청, 당뇨병으로 인한 청신경병증, 이독성 난청, 외상성 난청 및 바이러스성 난청으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주는 시스플라틴에 의해 축적된 세포 내 활성산소를 효과적으로 제거함으로써 청각 유모 세포를 보호할 수 있으며 이로인해 난청 치료 또는 완화 효과가 있다.

도 1은 시스플라틴 처리 HEI-OC1 세포에서 세포 생존 능력에 대한 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 처리의 영향을 확인한 결과이다.
도 2는 시스플라틴 처리 HEI-OC1 세포의 세포주기 정지 및 세포 사멸에 미치는 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주의 영향을 확인한 결과이다.
도 3은 시스플라틴 처리된 세포에서 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주의 ROS 소거능을 확인한 결과이다.
도 4는 시스플라틴에 의한 Bax 매개 세포사멸에 대한 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주의 영향을 확인한 결과이다.

본 발명자들은 안전성이 우수한 천연 소재를 대상으로 난청을 예방하거나 치료할 수 있는 물질들을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주에서 난청을 효과적으로 예방 및 치료하여 난청의 예방, 개선 및 치료에 현저한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 난청에 대한 치료 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 제공한다.

본 발명서에서 “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

미생물 자원은 석유, 물 등과 달리 재생산할 수 있다는 점에서 지속가능한 자원으로 활용할 수 있는 이점이 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 균주를 배양하여 배양액을 원심분리한 다음, 멸균된 생리식염수로 세척한 후 용매, 예컨대 멸균유에 분산시키고 동결건조하여 동결건조분말 형태로 제조하여 사용될 수 있다.

상기 균주의 파쇄물이란, 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.

상기 균주의 배양물이란, 배양물의 형태를 불문하고 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 일부 또는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고, 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물은 시스플라틴에 의해 축적된 세포 내 활성산소를 효과적으로 제거함으로써 청각 유모 세포를 보호할 수 있으며 이로인해 난청 치료 또는 완화에 효과적이다.

본 발명에서 "난청(hearing loss)"이란 청각이 저하 또는 상실된 모든 상태를 의미하며, 전음성 난청(conductive hearing loss) 및 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)을 포함한다. 일실시양태에 따르면 상기 난청은 소음, 약물, 노화, 외상, 바이러스 등의 다양한 원인에 의해 발생하는 감각신경성 난청일 수 있다. 또한, 상기 난청은 소음성 난청, 노인성 난청, 돌발성 난청, 당뇨병으로 인한 청신경병증, 이독성 난청, 외상성 난청, 바이러스성 난청을 포함할 수 있다.

본 발명의 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 유효성분으로 함유하는 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 80 중량%로 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물이 경구용 고형 제제로 제제화된 경우 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토즈, 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물이 경구용 액상 제제화된 경우 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물이 비경구용 제제화된 경우 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 국한되지 않는다.

본 발명은 또한 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 난청의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 추출물, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 μm), 14호 (1410 μm) 및 45호 (350 μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0 %이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하일 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 균주를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

실험재료 및 실험방법

<1-1> 신균주인 림노트릭스 속( Limnothrix sp.) KNUA002 균주의 분리

본 발명자들은 2009년 9월에 대청호에서 찾은 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주를 분리하였으며, 림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 균주의 분자생물학적 동정을 위해 당업계에서 사용되고 있는 18S rRNA의 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 림노트릭스(Limnothrix) 속에 속하는 균주인 것으로 나타났다.

본 발명자들은 상기 동정한 균주가 종래 존재하지 않은 새로운 염기서열을 갖는 신균주임을 확인하였으며, 2019년 07월 09일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 13879BP를 부여받았다. 이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP”로 명명하였다.

<1-2> Limnothrix 속 KNUA002 균주의 배양 조건

본 발명자들은 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주를 분리 배양하여 BG-11 배지에 5 % (v / v)의 농도로 접종하고 25 ℃에서 10 일간 100μmol m^-2s^-1 의 빛을 조사하며 16 h / 8 h의 명암주기 및 160 rpm으로 진탕배양하였다. 배양은 미세조류가 대수기에 도달 할 때까지 유지시켰다.

<1-3> Limnothrix 속 KNUA002 균주 추출물 제조방법

100 mL의 배양액을 3220 g에서 15 분간 원심 분리하여 세포 펠릿을 얻었다. 본 발명자들은 50 mM 염화나트륨과 2 mM 아지드화나트륨(sodium azide)을 함유한 4 mL의 20 mM 아세테이트 버퍼(acetate buffer)에 펠렛을 현탁시켰다.

펠렛으로부터 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물을 추출하기 위하여, 펠렛을 -20 ℃에서 냉동시키고 실온(RT)에서 해동시키는 과정을 4 회 반복하였다. 그런 다음 추출물을 3220 g에서 15 분 동안 원심 분리하여 상등액을 균주 추출물로 이용하였다.

<1-4> 세포 배양 및 생존력 분석

본 발명자들은 10 % 태아 소 혈청(Hyclone)과 항생제가 들지 않은 50 units/mL IFN-γ를 함유한 Dulbecco's modified Eagle'배지 (Hyclone, Logan, UT, USA)의 허용 조건 (33 ℃, 10 % CO₂) 하에서 16 시간 동안 HEI-OC1 마우스 청각 세포를 배양 하였다. 모든 in vitro 실험에서 본 발명자들은 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물로부터 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 또는 20 μg / mL 농도로 세포를 전처리하여 96- 웰 플레이트에 7 x 10³ 세포 / 웰을 시딩했다. Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물을 1 시간 동안 처리하고, 달리 명시하지 않는 한, 30μM 시스플라틴으로 세포를 30 시간 동안 처리하였다. 본 발명자들은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 세포 생존력을 측정했다. 시스플라틴 처리 후 0.5 mg / mL의 MTT 용액을 배양 배지에 첨가하고 10 % CO₂로 33 ℃에서 2 시간 동안 배양 하였다. 본 발명자들은 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 550 nm에서 각 웰의 광학 밀도를 측정했다.

<1-5> 세포주기 분석

시스플라틴 처리 후, HEI-OC1 세포를 트립신 처리하고, 그 수를 세고, 원심 분리하였으며, 70 % 에탄올에 고정시켰다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고 원심분리 하였다.

본 발명자들은 RNase A (0.2 mg / mL)와 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; 10 μg / mL)의 용액에 원심 분리된 펠렛을 재현탁하고 4 ℃에서 30 분 동안 배양했다. 본 발명자들은 BD FACS Aria III 유동 세포 계측기 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 세포주기 분포 (샘플 당 10,000 개의 사건)를 결정했다.

<1-6> DNA 단편의 검출

본 발명자들은 TUNEL 기법을 기반으로 한 in situ 세포 사멸 검출 키트 (Roche Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하여 세포 사멸을 분석했다.

24- 웰 배양 플레이트에서 3 x 10⁴ 세포 / 웰을 배양하고 시스플라틴으로 30 시간 동안 처리 하였다. RT에서 15 분 동안 4 % 파라포름알데히드(PFA)에 세포를 고정시키고, 세척하고, 새로 준비된 0.1 % Triton X-100 및 0.1 % 구연산 나트륨 수용액으로 4 ℃에서 5 분간 투과시켰다. TUNEL 반응 혼합물 (50 μL)을 시료에 첨가하고 37 ℃에서 60 분 동안 빛으로부터 보호하여 배양 하였다. 5 분 동안 PBS로 3 번 샘플을 세척한 후, 5 분 동안 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색 하였다. 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 표본을 시각화하였다.

<1-7> 세포 내 ROS 생산의 측정

본 발명자들은 HEI-OC1 세포를 16 시간 동안 배양한 다음 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물을 전처리 하거나 하지 않고 24 시간 동안 30 μM 시스플라틴으로 처리하였으며, DCFH-DA(Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.

1 개의 PBS로 세포를 두 번 씻고 10 μM DCFH-DA로 33 ℃와 10 % CO₂에서 5 분간 배양했다. 본 발명자들은 BD FACS Aria III 유동 세포 계측기 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 유동 세포 계측법 분석 (샘플 당 10,000 개의 사건)을 수행하였다.

<1-8> 단백질 준비

본 발명자들은 HEI-OC1 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고, Protease Inhibitor Cocktail Set 1 (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)을 포함하는 100μL의 Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buer (Elpis Biotech, Daejeon, Korea)를 정지시켰다. 현탁액을 미리 냉각시킨 1.5 mL 튜브에 넣고 15 분간 얼음 배양하고 12,660 g을 4 ℃ 30 분간 원심분리한 후 1 분간 교반하였다. 생성된 상층액을 흡인하고 그것을 얼음 위에서 신선한 튜브에 넣고 펠릿을 버렸다.

<1-9> 웨스턴블롯 분석

본 발명자들은 HEI-OC1 세포 추출물을 12 % SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다. 분리된 단백질을 니트로 셀룰로오스 막으로 전이시켜, 5 % 탈지유를 함유한 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 137 mM NaCl 및 0.01 % Tween-20 (TBS-T)의 용액으로 1시간동안 멤브레인을 막았으며, RT 1 차 항체 (1 : 100 - 1 : 2000 희석)로 멤브레인을 프로빙 하였다. 다음으로, TBS-T로 멤브레인을 5 분씩 3 회 세척하고 2 차 항체 (1 : 2000 희석액)로 배양 하였다. 일련의 세척 후 향상된 화학 발광 검출 시스템을 사용하여 멤브레인을 개발하였다. 1차 항체는 Cell Signaling (Danvers, MA, USA)의 토끼 항 -Bax 및 항 -caspase-3 항체 및 Abcam의 토끼 항-Bcl-2 (Cambridge, MA, UK)을 사용하였다. 2 차 항체는 염소 항-토끼-IgG-HRP (Cell Signaling)을 사용하였다.

<실시예 2>

Limnothrix 속 균주 추출물의 HEI-OC1 세포에서 시스플라틴 유도된 세포 사멸 완화 효과

본 발명자들은 시스플라틴 처리된 세포에서 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물의 보호적 효과를 확인하기 전에 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 또는 20 μg / mL 농도의 상기 추출물을 단독으로 처리한 세포에서 세포 독성을 확인하였다.

그 결과, Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물은 고농도에서 세포 생존력을 감소시켰지만 5 μg / mL의 농도까지 세포 독성을 일으키지 않았음을 알 수 있었다(도 1A 참조).

다음으로 본 발명자들은 0.1 - 20 μg / mL 농도의 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물로 전처리를 하거나 하지 않고 시스플라틴 처리 후 세포 생존률을 측정했다.

그 결과, 시스플라틴을 단독으로 처리한 군은 시스플라틴을 처리하지 않은 대조군 보다 세포의 세포 생존율을 약 40 %로 낮추었지만 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물 1μg / mL 또는 2μg / mL로 전처리하면 시스플라틴 처리 후 세포 생존력이 대조군의 약 62 % 정도로 세포 생존율을 회복했음을 알 수 있었다(도 1B 참조).

Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물이 시스플라틴으로 유도된 세포 사멸을 보호하는지 여부를 확인하기 위하여, 시스플라틴으로 처리한 세포에서 세포주기 단계와 세포 사멸 경로의 활성화를 결정하였다. 시스플라틴은 핵을 입력하고 DNA와 결합함으로써 세포주기를 정지시킨다. 시스플라틴 처리 후 세포주기의 sub-G0 / G1 단계에서 세포의 비율이 증가하였음을 알 수 있었다(도 2A 참조). 시스플라틴 단독 요법 후 세포의 약 15 %가 G0 / G1 이하의 단계에 있었다. 그러나 1μg / mL Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물로 전처리하면 시스플라틴 처리 후 sub-G0 / G1 분율이 약 7 %로 감소했다(도 2B 참조).

이러한 결과는 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물이 시스플라틴에 의한 세포주기 정지로부터 세포를 방어한다는 것을 나타낸다. DNA 단편화는 DNA 분자의 N 말단을 노출시키고 형광 물질이 단편화된 말단에 결합하도록 허용하면서 세포 사멸 동안 발생한다. caspase-3의 발현은 비슷한 패턴의 시스플라틴 처리로 caspase-3의 발현을 대폭 증가 시켰는데, 이는 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물로 전처리함으로써 거의 완전히 역전되었다(도 2C 참조). 말단 deoxynucleotidyl transferase dUp nick-end labeling (TUNEL) 분석에서 시스플라틴 단독으로 강한 형광 신호가 나타났으며, 이는 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물로 전처리함으로써 실질적으로 약화되었다(도 2D 참조). 카스파제 -3 분석 및 TUNEL 분석의 결과는 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물이 시스플라틴이 유도한 세포사멸로부터 HEI-OC1 세포를 보호하는 능력을 갖는 것으로 나타났다.

따라서, 상기의 결과들로 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물이 ROS로 유발된 미토콘드리아 손상을 줄임으로써 시스플라틴 유도성 독성에 대한 HEI-OC1 세포를 보호함을 알 수 있었다.

<실시예 3>

Limnothrix 속 균주 추출물의 HEI-OC1 세포의 세포 내 ROS 감소 효과

본 발명자들은 시스플라틴 유도 세포사멸(apoptosis)의 주요 결정 인자인 세포 내 ROS 수준에 대한 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물의 효과를 조사했다.

형광 염료 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) 분석에서 시스플라틴 처리만으로 대조 세포와 비교하여 약 30 %의 형광활성화세포분류기(FACS)의 형광 강도가 증가하는 반면, 시스플라틴 단독으로 처리한 세포와 비교하여 본 발명의 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물을 전처리한 군에서는 약 20% 정도의 형광활성화세포분류기(FACS)의 형광 강도가 감소하였다(도 3A, B 참조).

이러한 결과는 세포 내 ROS의 축적이 시스플라틴 유도된 세포 사멸에 역할을하고, 본 발명의 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물이 ROS 축적으로부터 세포를 보호한다는 것을 시사한다.

<실시예 4>

Limnothrix 속 균주 추출물의 시스플라틴 유도된 ROS 축적에 의해 유발된 Bax 및 Bcl-2 단백질 수준의 변화 조절 효과

미토콘드리아에서 ROS와 관련된 주요 세포사멸(apoptosis) 관련 단백질은 pro-apoptotic Bax와 anti-apoptotic Bcl-2이다. 시스플라틴 처리만으로 HEI-OC1 세포에서 대조군과 비교하였을 때 Bax 발현을 증가 시켰고, 대조군과 비교하였을 때 Bcl-2 발현은 감소하였다.

반면 본 발명의 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물로 전처리하였을 때에는 상기 두 단백질 모두 대조군과 비슷한 발현 수준을 유지하였음을 알 수 있었다(도 4A, B 참조).

Bax는 세포질에 존재하며 미토콘드리아막 간 공간으로 이동하여 산화 스트레스에 반응하여 사이토크롬 c(cytochrome c)를 방출함으로써 세포 사멸을 유도한다.

Bcl-2는 세포 사멸을 억제하고 Bax 활성을 억제함으로써 세포 생존을 촉진한다. 시스플라틴에 의해 유도된 세포 내 ROS의 축적은 Bax를 활성화시키고 미토콘드리아 기능의 세포를 박탈함으로써 세포 사멸을 일으킨다.

본 발명의 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물은 ROS 농도를 감소시켜 세포를 보호함으로써 Bax 경로를 억제함을 알 수 있었다(도 4C 참조).

청각 유모 세포(cochlear hair cells)에서 세포사멸 경로를 활성화시킴으로써 미토콘드리아 ROS 생산이 난청에서 핵심적인 역할을한다는 증거가 증가하고 있다. Bcl-2는 카스파제 신호 전달의 상류 조절자이며 바깥 쪽 미토콘드리아 막에 위치하고 있고 미토콘드리아에서의 사이토크롬 c(cytochrome c) 방출을 억제하여 카스파제와 세포 사멸 경로의 활성화를 방지한다. 과도한 소음 또는 이독성 약물에 노출된 후 과도한 ROS 누적은 Bcl-2의 하향 조절을 유도한다.

따라서 본 발명자들은 산화적 스트레스가 Bcl-2 활성화를 차단하여 청각 유모 세포(cochlear hair cells)에서 세포 사멸 경로의 활성화를 유도한다고 가정했다. 그 가설과 일치하여, 본 발명의 결과는 HE-OC1 세포에서 Bcl-2의 수준을 증가시킴으로써 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물의 전처리가 전구 세포사멸 단백질(pro-apototic protein)인 Bax의 수준을 감소 시킨다는 것을 보여 주었다.

유사하게, 본 발명의 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물은 oxalate 독성에 노출된 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포에서 미토콘드리아 막 잠재력의 손실과 ATP 생산 증가를 감소시켰다.

상기의 결과들로 본 발명은 Limnothrix 속 KNUA002 KCTC 13879BP 균주 추출물에 난청을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있음을 실험으로써 규명하였다는 점에 기술적 특징이 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13879BP

20190709

Claims

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림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 KCTC 13879BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 난청은 전음성 난청(conductive hearing loss) 또는 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)인 것을 특징으로 하는, 난청의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 난청은 소음성 난청, 노인성 난청, 돌발성 난청, 당뇨병으로 인한 청신경병증, 이독성 난청, 외상성 난청 및 바이러스성 난청으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 난청의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
림노트릭스 속(Limnothrix sp.) KNUA002 KCTC 13879BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제5항에 있어서,
상기 난청은 전음성 난청(conductive hearing loss) 또는 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)인 것을 특징으로 하는, 난청의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제5항에 있어서,
상기 난청은 소음성 난청, 노인성 난청, 돌발성 난청, 당뇨병으로 인한 청신경병증, 이독성 난청, 외상성 난청 및 바이러스성 난청으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 난청의 예방 또는 개선용 식품 조성물.