KR102230517B1 - 충치 억제 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스를 포함하는 조성물 - Google Patents
충치 억제 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인체 및 다양한 발효식품 유래 락토바실러스 살리바리우스 및 락토바실러스 루테리를 포함하는 충치균 또는 치주염균 억제용 항균 조성물, 치아 우식증 또는 치주질환 예방, 치료, 개선용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 또는 포르리로모나스 진지발린스 억제 활성이 뛰어나며, 내담즙성 및 자가 응집능이 뛰어나 프로바이오틱스에 적합하므로, 충치 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약품, 식품, 의약외품 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 인체 및 다양한 발효식품 유래 락토바실러스 살리바리우스를 포함하는 충치균 또는 치주염균 억제용 항균 조성물, 치아 우식증 또는 치주질환 예방, 치료, 개선용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
유산균은 특별한 생리활성능력을 가지고 있으며, 일반적으로 안전한 균주 (GRAS, generally regarded as safe bacteria)로 취급되고 있다. 유산균은 다양한 발효식품의 생산에 사용하고 있을 뿐만 아니라, 기능성과 프로바이오틱스 특성을 가지는 유제품과 발효과채 제품에 널리 사용되고 있다. 최근에는 화학보조제를 대체하는 천연보조제에 대한 소비자의 수요가 증가함에 따라 그 대안방안으로 부각되고 있다. 프로바이오틱스는 숙주동물의 건강에 매우 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물로, 장내 미생물의 균형을 개선하고 영양분의 흡수를 증진시킨다. 또한, 프로바이오틱스는 장내환경에서 병원성미생물의 항균작용을 나타내는 특성을 가지고 있다. 프로바이오틱스에는 다양한 미생물이 포함되지만, 락토바실러스(Lactobacillus) 속과 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속이 가장 많은 분포를 차지하고 있다. 특히, 락토바실러스(Lactobacillus) 속은 일반적으로 유제품, 육류, 과채 및 시리얼 제품의 발효공정에 사용되고 있다.
한편, 사람의 구강에는 400종류 이상의 세균이 번식하고 있으며, 그 균수는 100억 개에 달하고 타액에는 108∼109 CFU/㎖ 수준의 균이 존재하는 것으로 알려져 있다. 치아는 미세한 구멍이 다수개 천공되어 있어서 충치를 일으키는 세균이 천공된 구멍으로 들어가 치아를 병들게 하는데 이것이 충치이다. 이러한 충치는 치아에서 가장 흔히 볼 수 있는 대표적인 질환의 하나로 치아우식증이라고도 한다. 충치는 구강 내 음식물이 내산성 연쇄상구균과 유산균에 의해 부패되고 산에 의해 치아의 성분이 파괴되는 감염성 세균성 질환으로, 치석 (plaque)내 미생물과 음식물의 상호작용으로 발생되는 다인성 질환이다. 미생물 중에서 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 가 치석의 주요 원인균이며, 이 미생물은 치면의 피막에 부착한 후 생성하는 클루코실트랜스퍼라아제 (glucosyltransferase, GTase)에 의하여 음식물 중의 수크로오즈로부터 불용성 글루칸을 합성한다. 합성된 글루칸은 치면에서 증식하는 미생물 간의 결합을 증가시키며, 치면에 부착한 S. mutans는 당질 대사과정에서 젖산 등의 유기산을 생성하여 치아의 에나멜질을 탈회 (decalcification) 시켜 충치를 유발하는 것으로 알려져 있다. 우리나라에서는 영구 치아의 충치 이환율이 약 80%에 이르고, 한 사람이 평균 2-3개의 충치를 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
종래의 치아우식증 또는 치주질환 예방 방법으로는 칫솔질과 적절한 식이 요법을 통해 당분의 섭취를 줄이거나 자일리톨을 이용하여 충치균 또는 치주질환 유발균에 의한 산의 생성을 방지하는 방법 등이 있으나, 이러한 방법만으로는 충치 유발균 또는 치주질환 유발균의 사멸을 통한 근본적인 충치 예방효과를 얻지 못하고 있는 실정이다.
따라서 인체에 무해한 인체 또는 식품 유래의 유산균을 이용하여 인체에 무해하고 섭취가 용이하며, 충치 유발균 또는 치주질환 유발균의 생육을 직접적으로 억제하는 새로운 충치 예방 방법에 대한 필요성이 있다.
치아우식 유발 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus 에 대한 유산균의 생장억제 효과 및 요구르트의 Probiotics 효능(Kor J Oral Maxillofac Pathol 2009;33(3):167-174)
이에 본 발명자들은 인체 및 식품 유래의 유산균 중 충치 예방에 효과가 있는 유산균에 대하여 연구하던 중, 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)가 충치 유발균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및 치주염균인 포르리로모나스 진지발린스에 대한 항균 효과가 뛰어나며, 내담즙성 및 자가 응집능이 뛰어나 프로바이오틱스로 유용함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는 충치균 또는 치주염균 억제용 항균 조성물 및 이를 이용한 치아우식증 또는 치주질환 예방, 치료, 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 치아 우식증 및 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 치아 우식증 및 치주질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 치아 우식증 및 치주질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및 포르리로모나스 진지발린스 억제 활성이 뛰어나며, 내담즙성 및 자가 응집능이 뛰어나 프로바이오틱스에 적합하므로, 치아 우식증 또는 치주질환 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약품, 식품, 의약외품 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주의 배양액 (Cell mixture), 무세포 상등액 (CFS mixture) 의 S. mutans 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주의 자가 응집능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 락토바실러스 살리바리우스 MG242, 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주의 혼합 CFS, 세포 혼합 배양액 및 CFS와 세포 혼합 배양액의 S. mutans 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주의 자가 응집능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 락토바실러스 살리바리우스 MG242, 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주의 혼합 CFS, 세포 혼합 배양액 및 CFS와 세포 혼합 배양액의 S. mutans 억제 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및/또는 포르리로모나스 진지발린스 억제 활성이 뛰어나며, 내담즙성 및 자가 응집능이 뛰어나다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어, "락토바실러스"는 자연계에 널리 분포하는 당류를 발효하여 에너지를 획득하여 다량의 유산을 생성하는 세균으로 형태적으로는 그람 양성 무포자 간균으로 다형성을 나타낸다. 본 발명에 따른 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및/또는 포르리로모나스 진지발린스 억제 활성이 뛰어나며, 내산성, 내담즙성 및 자가 응집능이 뛰어난 락토바실러스 살리바리우스 MG4293 및 락토바실러스 살리바리우스 MG4527 균주는 각각 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 13727BP 및 KCTC 13728BP 를 부여받았다.
또한 본 발명의 조성물은 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및/또는 포르리로모나스 진지발린스 억제 활성, 내산성, 내담즙성 및 자가 응집능을 갖는 또다른 균주인 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함할 수 있으며, 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 는 각각 한국생명공학연구원에 기탁하여 KCTC 18554P 및 KCTC 13729BP를 부여받았다.
본 발명에 있어, 상기 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527 및 락토바실러스 루테리 MG505 균주는 대표적인 충치 세균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및 포르리로모나스 진지발린스 모두에 대하여 우수한 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527 및 락토바실러스 루테리 MG505 균주는 강산 조건인 pH 2 내지 4, 더욱 바람직하게는 위산 환경인 pH2 에서 매우 높은 생존율을 유지할 수 있다.
또한 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주는 장내 환경과 유사한 담즙염에 대하여 내담즙성을 갖고, 0.1 내지 1.5% 담즙염, 0.3 내지 1% 의 담즙염, 바람직하게는 1% 의 담즙염에서도 우수한 내성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주는 우수한 자가응집능(autoaggregation ability)을 나타내어 장의 연축운동에 의한 프로바이오틱스의 제거를 방지할 수 있으며, 특히 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527 균주는 매우 우수한 자가응집능을 나타낼 수 있다.
또한 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는 치아 우식증 또는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물은 유효성분으로서 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함할 수 있으며, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293 균주 (기탁번호: KCTC 13727BP), 락토바실러스 살리바리우스 MG4527 균주 (기탁번호: KCTC 13728BP) 및 락토바실러스 루테리 MG505 (기탁번호: KCTC 13523BP) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 더 포함 할 수 있다.
약학적 조성물의 경우, 상기 균주들은 약학적 조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01~95 중량부로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1~80 중량부로 포함하는 것이다. 그 함량이 0.01 중량부 미만일 경우에는 복용 효율성이 떨어질 수 있으며, 95 중량부를 초과할 경우에는 제형화에 어려움이 있을 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 MG242, 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 및 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주는 충치 유발 세균 및 치주염균에 대하여 우수한 항균 활성을 갖고, 내산성, 내담즙성, 자가 응집력이 우수하므로, 충치 균 및 치주염균에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 가진 조성물 자체로서 직접적으로 사용 가능함은 물론이고, 보조제로서 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 락토바실러스 살리바리우스 MG242, 락토바실러스 루테리 MG505, 락토바실러스 살리바리우스 MG4293, 락토바실러스 살리바리우스 MG4527, 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
치아우식증 및 치주질환은 모두 세균 감염성 질환으로 치아우식증은 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 스트렙토코커스 상퀴니스(S. sanguinis), 스트렙토코커스 소브리누스(S. sobrinus), 스트렙토코커스 라티(S. ratti), 스트렙토코커스 크리세티(S. criceti), 스트렙토코커스 안지노수스(S. anginosus) 또는 스트렙토코커스 고도니(S. gordonii) 와 같은 균에 의해서, 치주질환은 치주염을 유발하는 세균인 포피로모나스 긴지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프리보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 악티노바실러스 악티티노미세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 푸소박테리움 누클리아툼(Fusobacterium nucleatum) 등에 의해서 유발될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 대표적인 치아 우식증 및 치주질환 유발균을 효과적으로 억제할 수 있으므로 치아우식증 또는 치주질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적이다.
따라서 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란, 예컨대 충치 유발 및 치주염 유발 세균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 및 포르리로모나스 진지발린스의 생육을 억제하여 이로 인해 발생할 수 있는 치아 우식증 또는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘하기에 충분한 양을 말한다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1~10,000㎎/㎏/day, 바람직하게는 1~200㎎/㎏/day의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독으로 사용될 수 있으나, 통상의 기술자의 선택에 따라 통상적으로 치아우식증 또는 치주질환의 치료 증강 효과가 있는 적절한 기타 치료 방법(예컨대, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제 이용 방법 등)과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 치아 우식증 또는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하여 치아 우식증 또는 치주질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "치료"란, 본 발명에 따른 조성물을 치아 우식증 또는 치주질환 의심 개체에 투여하여 치아 우식증 또는 치주질환 관련 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체"란, 치아 우식증 또는 치주질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물에서, 상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미이고, 상기 식품 조성물은 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임 식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에서 "건강기능식품"이란 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체 방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 질병의 예방 또는 건강의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있는 것을 말한다.
본 발명에 따른 균주를 건강기능식품으로 사용하는 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 이는 필요에 따라 선택하여 적절하게 사용될 수 있다. 또한, 첨가되는 균주들은 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 이 경우 혼합양은 그 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 균주가 사용될 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 라면, 기타 면류, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 각종 스프, 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 과자류, 피자, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 또는 비타민 복합제 등이 있다. 특히, 본 발명에 따른 균주는 소화관 내에서의 위산 또는 담즙염에 대한 생존력, 세포내 부착력 및 충치균 또는 치주염균에 대한 억제 효과가 우수하므로, 다양한 건강기능식품으로 제조하기 적합하다. 본 발명의 균주가 포함될 수 있는 발효유 건강기능식품으로는 예컨대, 요구르트, 칼피스, 치즈, 버터 등을 들 수 있고, 발효 제품으로는 두부, 된장, 청국장, 젤리, 김치 등을 들 수 있다. 상기 발효유 또는 발효제품은 통상적인 제조방법에서 균주만을 본 발명에 따른 균주로 대체함으로써 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 균주는 통상의 기술자의 선택에 따라 통상적으로 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합할 수 있다. 상기 공지의 첨가제에는 본 발명에 따른 균주와 함께 사용할 수 있는 다른 미생물도 포함된다.
또한 본 발명의 균주는 치아 우식증 또는 치주질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 균주를 의약외품으로 사용할 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명이 의약외품 조성물로 사용되는 경우, 구강 조성물인 치약류, 구강청결제류, 구강세정제류 구강 스프레이류 등의 제형으로 제조하여 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 사용한 균주의 분리 및 사용 시료의 제조
인체 및 식품 유래 유산균인 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius ) MG242, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) MG505, 락토바실러스 루테리(L. reuteri ) MG4224, L. salivarius MG4265, L. salivarius MG4293, L. salivarius MG4525, L. salivarius MG4526, L. salivarius MG4527, L. salivarius MG5183, L. reuteri MG5149, L. salivarius MG5207 및 L. salivarius MG5212 를 이용하여 실험을 수행하였다. Lactobacilli MRS (Difco, MI, USA) 배지를 사용하여 유산균주를 37℃에서 정치배양하였으며, 유산균주를 MRS 액체배지에 24시간 정치배양한 배양액을 원심분리 (4,000 × g, 4℃, 5분)한 후, 0.22 μm 필터를 이용하여 얻어진 제균된 상등액 (CFS, cell free supernatant)을 실험에 사용하였다. 항균 활성을 측정하기 위하여 한국미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양 받은 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) KCTC3065와 포르리로모나스 진지발린스 (Porphyromonas gingivalis) KCTC5352 표준균주를 사용하였다. S. mutans는 BHI(Difco, MI, USA)배지를 사용하여 배양하였으며, P. gingivalis는 sheep blood 배지에 접종하여 37℃에서 혐기적으로 정치배양하였다.
실시예
2.
S.
mutans
및
P.
gingivalis
에 대한 항균 효과 확인
상기 실시예 1의 Lactobacillus reuteri 3종과 Lactobacillus salivarius 9종을 이용하여 paper disc diffusion assay 방법을 통해 S. mutans 와 P. gingivalis에 대한 항균 활성을 확인하였다. 충치 유발세균을 각각의 액체 배양배지에 24시간 전 배양한 후, 새로운 고체 배양배지에 McFarland 0.5로 현탁하여 도말하였다. 도말한 고체 배양배지에 15시간 동안 MRS 배지에서 배양한 유산균주의 배양액을 10 μL씩 spot하여 37℃에서 배양한 후, 저해환을 확인하였으며, 저해환에 따른 항균 효과 확인 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 L. reuteri 와 L. salivarius 가 S. mutans 와 P. gingivalis 에 대한 억제활성을 나타내는 것은 아님을 확인하였고, 충치균 및 치주염균 모두에 억제효과를 보인 균주로 MG242, MG505, MG4265, MG4293, MG4526, MG4527, MG5183, MG5207, MG5212 균주 총 9종을 확인하였다.
S. mutans와 P. gingivalis에 저해환을 보인 유산균주를 이용하여 추가적으로 S. mutans에 대한 무세포 상등액과 배양액에 대한 항균효과를 확인하였다. 배양여액를 통한 항균실험은 유산균주의 제균된 상등액인 무세포 상등액 (CFS)을 BHI 액체배지에 10% 첨가한 후, S. mutans를 105 CFU/mL 되도록 접종하여 수행하였다. 혼합배양을 통한 항균실험은 유산균주와 S. mutans를 혼합배지 (MRS 액체배지와 BHI 액체배지를 1:1 (v/v)로 혼합)에 균의 농도가 최종적으로 105 CFU/mL 되도록 각각 접종하여 수행하였다. 각 항균효과 확인 실험은 8시간 동안 37℃에서 혐기적으로 정치배양 후, erythromycin (0.3 μL/mL)를 도포한 BHI 고체배지에 도말하여 S. mutans의 생균수를 확인하는 방식으로 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, Lactobacillus salivarius MG242, L. reuteri MG505, L. salivarius MG4293, L. salivarius MG4527, L. salivarius MG5183 5종은 무세포 상등액과 배양액을 접종하였을 때에도 S. mutans 에 높은 활성을 보임을 확인하였다. 상기와 같이 우수한 활성을 나타내는 균주들을 한국생명공학원에 기탁하였으며, Lactobacillus salivarius MG242 기탁번호: KCTC 18554P, L. reuteri MG505 기탁번호: KCTC 13523BP, L. salivarius MG4293 기탁번호: KCTC 13727BP, L. salivarius MG4527 기탁번호: KCTC 13728BP, L. salivarius MG5183 기탁번호: KCTC 13729BP 로 기탁번호를 부여받았다.
실시예
3.
선별 균주의
내산성
및
내담즙성
확인
유산균이 프로바이오틱스로 이용되기 위해서는 안전성과 안정성을 갖춰야 한다. 특히 유산균을 경구로 투여하는 경우, 위액과 각종 효소가 존재하는 위를 통과하고, 담즙이 존재하는 십이지장을 거쳐 최종 목적 부위인 장에 도달해야 기능적인 효과를 나타낼 수 있으므로, 유산균의 내산성 및 내담즙성은 프로바이오틱스로 활용하기 위한 중요한 지표이다. 따라서 상기 실시예 2에서 선별된 유산균주 5종이 장내 환경과 같은 산성 및 담즙염에 대해서 내산성 및 내담즙성을 가져 생균력을 유지하는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로 유산균주를 18시간 동안 배양한 후, 원심분리 (4,000 × g, 4℃, 5분)하여 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7)에 2회 세척하였고, OD600 1.0으로 조정하여 각각 산성과 담즙염에 대한 내성 실험에 사용하였다. 산성에 대한 내성을 확인하기 위하여 유산균 희석액 1 mL를 9 mL PBS (pH 2와 7)에 첨가 후 진탕한 뒤 37℃에서 3시간 배양한 후 생균수를 확인하였다. 담즙염 내성은 0~1% oxgall (Difco, MI, USA)을 포함한 MRS 배지에 유산균 희석액을 1% 접종하고 37℃에 24시간 배양한 후 생균수를 확인하는 방법을 통해 확인하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
표 2에 나타낸 바와 같이 산성에 대한 내성 실험의 결과, 위액 환경에 해당하는 pH 2에서 모든 균주가 102 CFU/mL 이상의 생균수를 나타냈으며, MG505 (5.86 log CFU/mL) 가 가장 높은 생균수를 보이는 것을 확인하였다. 체내 위액의 pH는 대략 3.0으로 유지되며, 일반적으로 미생물이 위를 통과하는 시간은 3시간이기에 pH 3에서 3시간 이상 생균수를 유지하면 산성에 높은 내성을 보이는 것으로 판단할 수 있다. 프로바이오틱스로 사용되는 여러 균주들이 pH 2에서 일반적으로 104 CFU/mL 이하의 생균수를 보이는 것으로 알려져 있으며, 본 연구에서 선별된 유산균주의 경우 특히 MG505, MG4293, MG4527 이 산성에 대해 우수한 내성능력을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다.
또한 통상 담즙염에 대한 내성을 확인하기 위한 0.3% 의 담즙염 농도에서 종래 유산균들이 4 log CFU/mL 이하로 담즙염에 민감한 것과 달리, 본원 발명의 5종의 균주는 이보다 높은 1% 담즙염 농도에서도 평균 8.01 log CFU/mL의 매우 높은 생균수를 보여, 담즙염에 대해 매우 우수한 내성을 보이는 것을 확인할 수 있다.
실시예
4. 선별된
유산균주의
자가응집능
확인
장내 세포 내 부착능력을 간접적으로 확인하기 위하여 자가 응집력 (autoaggregation) 을 확인하는 실험을 수행하였다. MRS 배지에 유산균을 전 배양한 배양액을 OD600 1.0으로 조정하여 새로운 5 mL MRS 배지에 1% 접종한 뒤, 18시간 배양하여 실험에 사용하였다. 배양한 유산균은 원심분리 (4,000 × g, 4℃, 5분)한 후, PBS에 2번 세척하였고, OD600 1.0으로 조정하여 균주 현탁액 5 mL을 10초간 진탕한 뒤 5시간 동안 방치하면서 자가 응집능을 확인하였다. 실험 시작 직후 (A0)와 5시간 후 (A), 각각 0.1 mL의 상등액을 취해 0.9 mL PBS와 혼합한 뒤 600 nm에서 흡광도를 측정 (A0, A)하였고, 다음 계산식에 따라 자가 응집능을 계산하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
자가 응집능 (%) = (A0A) / A0 × 100
도 2에 나타낸 바와 같이, MG4293, MG4527 균주가 각각 74.14 ± 2.18%, 65.78 ± 1.39%로 가장 높은 자가응집 능력을 보였으며, 선별된 5 균주에 대한 자가응집능의 평균은 61.64%였다. 유산균의 in vitro 상의 자가응집능은 in vivo 상의 부착능과도 연관되어 있는 것으로 보고되어 있으므로, 본원 발명의 5종의 균주들은 모두 자가응집능 및 부착능이 우수함을 확인하였다.
실시예
5 혼합 균주의
S.
mutans
에 대한 항균 효과 확인
Lactobacillus salivarius MG242, L. reuteri MG505, L. salivarius MG4293, L. salivarius MG4527, L. salivarius MG5183 5종 혼합 균주의 무세포 상등액 (CFS, cell free supernatant)을 및 배양액을 이용하여 S. mutans 에 대한 항균 효과를 확인하였다.
무세포 상등액 (CFS) 은 상기 균주들을 MRS 액체 배지에서 24시간 정치배양 한 후, 배양액을 4,000 × g, 4℃, 5분 조건으로 원심분리하는 단계, 이를 0.22 μm 필터로 여과하는 단계를 거쳐 제조하였다. 또한 혼합 배양액 (cell mixture) 의 항균 효과를 확인하기 위하여 5종 균주 (105 CFU/mL) 각각의 배양액 5ml 를 혼합하여 혼합 배양액을 제조하였다. 혼합 균주의 항균 효과 확인을 위하여 실험에 사용한 실험군은 하기와 같다.
실험군 1 (혼합 무세포 상등액): 5종 균주의 무세포 상등액을 각각 동일 부피비로 혼합
실험군 2 (혼합 배양액): 5종 균주 각각의 세포 배양액을 동일 부피비로 혼합
실험군 3 (무세포 상등액 및 배양액 혼합): 5종 균주 각각의 무세포 상등액 및 세포 배양액을 동일 부피비로 혼합
상기 5종 혼합 균주의 혼합 무세포 상등액 또는 혼합 배양액과 S. mutans 를 혼합 배지 (MRS 액체배지와 BHI 액체배지를 1:1 (v/v)로 혼합)에 균의 농도가 최종적으로 105 CFU/mL 되도록 각각 접종하였다. 항균 효과 확인을 위해서 37℃에서 8시간동안 혐기적으로 배양한 후, 에리스로마이신 0.3 μL/mL를 도포한 BHI 고체배지에 도말하여 S. mutans 를 계수하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 미처리 대조군 대비 혼합 무세포 상등액, 혼합 배양액 및 이들의 혼합물을 처리한 실험군 모두에서 대조군 대비 효과적인 S. mutans 억제 효과를 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본원 발명의 Lactobacillus salivarius MG242, L. reuteri MG505, L. salivarius MG4293, L. salivarius MG4527, L. salivarius MG5183 5종 균주가 모두 S. mutans 에 대한 우수한 항균효과를 나타내며, 특히 이들 균주의 혼합 배양액을 이용하는 경우 우수한 항균 효과를 나타냄을 확인하였다.
Claims (9)
- 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하고,
상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 pH 2 내지 pH 4 에서 내산성 및 0.1 내지 1.5% (w/v) 담즙염에 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 하는, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 충치균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 인, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 치주염균은 포르피로모나스 진지발린스 (Porphyromonas gingivalis)인, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 자가응집능 (autoaggregation ability)을 가지는 것을 특징으로 하는, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 충치균 및 치주염균 억제용 항균 조성물.
- 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하고,
상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 pH 2 내지 pH 4 에서 내산성 및 0.1 내지 1.5% (w/v) 담즙염에 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 하는, 치아 우식증 및 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하고,
상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 pH 2 내지 pH 4 에서 내산성 및 0.1 내지 1.5% (w/v) 담즙염에 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 하는, 치아 우식증 및 치주질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP), 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하고,
상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주 (기탁번호: KCTC 18554P) 또는 락토바실러스 살리바리우스 MG5183 균주 (기탁번호: KCTC 13729BP)는 pH 2 내지 pH 4 에서 내산성 및 0.1 내지 1.5% (w/v) 담즙염에 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 하는, 치아 우식증 및 치주질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
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