KR102222953B1 - 난배양성 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 보충제 및 그를 포함하는 배지 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N-아세틸헥소사민, L-아스파르트산, L-시스테인 및 코발아민을 포함하는 혐기성 미생물의 고수율 배양용 배지 보충제, 이를 포함하는 혐기성 미생물의 고수율 배양용 배지 조성물 및 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 고수율 배양이 극도로 어려운 혐기성 미생물의 고농도 배양이 가능하고 비용대비 효율적이며, 특히 식품 및 의약품 용도에 사용하기에 적합한 난배양성 혐기성 미생물을 대량으로 배양할 수 있는 획기적인 방법을 제공할 수 있다.

Description

난배양성 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 보충제 및 그를 포함하는 배지 조성물{MEDIA SUPPLEMENT FOR HIGH YIELD INDUSTRIAL CULTURE OF FASTIDIOUS ANAEROBES AND CULTURE MEDIA COMPRISING THE SAME}

본 발명은 난배양성 혐기성 미생물을 고농도로 배양하기 위한 신규한 배지 보충제, 그를 포함하는 배지 조성물 및 그를 이용한 난배양성 혐기성 미생물의 고수율 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아커만시아 뮤시니필라를 포함한 난배양성 혐기성 미생물의 대량 생산이 가능하며 약품 및 식품 용도에 적합한 배지 보충제, 배지 조성물 및 배양 방법에 관한 것이다.

인간 마이크로바이옴(human microbiome)이란 인간의 몸에 공생하는 미생물 군집과 이러한 미생물 군집의 유전체를 의미하는 용어로, 마이크로바이옴이 인간의 건강과 긴밀한 상관관계가 있음이 밝혀지며 많은 관심을 끌고 있다.

무균 동물 모델(germ-free animal model), 차세대 염기서열 분석 (Next-Generation Sequencing, NGS), 다중 오믹스 분석(multi-omics analysis) 등 생명공학 분야의 연구 기법의 비약적 발전으로 인해 장내 미생물의 조성과 구조를 분석하는 것뿐만 아니라 마이크로바이옴의 기능과 질병과의 연관성을 연구할 수 있게 되었고 이에 따라 더 많은 연구 결과가 발표되고 있다. 마이크로바이옴 치료제 또는 파마바이오틱스 치료제(의료용 프로바이오틱스)가 효과적인 치료제가 없는 감염질환, 면역질환, 대사질환 등에 대한 대체 치료제가 될 수 있다는 점에서 최근 주목 받고 있다. 마이크로바이옴 치료제 또는 파마바이오틱스 치료제는 대량생산을 통해 실용화 가능해지면 다양한 난치성 질환에 유리하게 적용가능할 것으로 예상된다.

인간의 장 내부는 혐기 상태이므로, 마이크로바이옴을 구성하는 미생물들은 대부분 혐기성 미생물인데, 이들 대부분은 이용가능한 탄소원과 질소원이 매우 제한적이고, 게다가 산소에 극도로 민감한 절대혐기성이라는 생리적 특성으로 인해 산업화를 위한 고농도 및 대량 배양이 어려운 실정이다. 절대 혐기성 미생물의 배양은 극히 어렵고, 높은 바이오매스 수율을 얻는 것은 더 어렵다.

예를 들어, 대장의 점막층에 서식하고, 파마바이오틱스의 후보로 유망한 아커만시아 뮤시니필라는 일반적으로 배지에 탄소원과 질소원으로서 돼지의 위에서 추출된 뮤신(hog gastric mucin)을 첨가하여 배양할 수 있다 (Derrien et al., 2004). 또한 아커만시아 뮤시니필라 균주는 콜럼비아 브로스(CB) 및 뇌심장침출액 (BHI) 브로스 상에서 배양되기도 하는데, 이러한 배지들에는 모두 동물 유래 성분이 포함되고, 더욱이 대부분 뮤신 기반의 배지보다 배양성이 떨어져서, 뮤신 첨가 배지에 의해 획득될 수 있는 최종 광학밀도의 절반 정도의 최종 광학밀도로 증식시킬 수 있을 뿐이다.

동물-유래 성분들은 바이러스 또는 세균 기원의 오염물질을 함유하거나 또는 알레르겐, 항원 펩티드 또는 다른 바람직하지 못한 생성물을 함유할 수 있기 때문에, 인간에서 식품 또는 약제 용도를 위해 혐기성 미생물을 배양하기에 적합하지 않은 것으로 인식되고 있다. 최근까지의 상당한 노력에도 불구하고, 기존의 혐기성 미생물의 배양을 위한 배지들은 조성이 까다롭고 가격이 비싸며, 더욱이 고수율로 혐기성 미생물을 배양하지 못하여 특수 연구 목적 이외의 기타 산업적 용도로 이용되지 못하는 한계를 가지고 있다.

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KR 10-2018-0018524 A (2018.02.21. 공개)

본 발명은 상술한 종래 기술의 한계 내지 문제를 극복하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 마이크로바이옴 치료제 또는 파마바이오틱스로 이용될 혐기성 미생물들을 산업적으로 대량으로 배양할 때, 의약품, 식품, 또는 사료로 사용하기에 적합하도록 장기간에 걸쳐서 안정적으로 고수율로 제조할 수 있는 배지 보충제 및 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 난배양성 혐기성 미생물들을 높은 최종 광학밀도로 경제적으로 배양할 수 있는 배양방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양상은, N-아세틸헥소사민, L-아스파르트산, L-시스테인 및 코발아민을 포함하는 혐기성 미생물의 고수율 배양용 배지 보충제에 관한 것이다.

본 발명의 배지 보충제는 N-아세틸헥소사민 5 g/L, L-아스파르트산 8 g/L, L-시스테인 0.5 g/L 및 코발아민 0.0001 ~ 0.005 g/L를 포함할 수 있다.

상기 혐기성 미생물은 인간의 장내 절대-혐기성 미생물로서, 피칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 언에어로스티페스 카키 (Anaerostipes caccae), 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로즈뷰리아 이눌리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로즈뷰리아 호미니스(Roseburia hominis), 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)일 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 양상은,

식물 펩톤, 효모 추출물, 제2인산칼륨을 포함하는 배지 조성물로서,

탄소원으로서 프럭토스 및 락토스를 포함하고, 보충제로서 N-아세틸헥소사민, L-아스파르트산과 L-시스테인의 아미노산 혼합물 및 코발아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물 고수율 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 혐기성 미생물 고수율 배양용 배지 조성물은 프럭토스 2.5 g/L, 락토스 2.5 g/L, 식물 펩톤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 제2인산칼륨 2.5 g/L, N-아세틸헥소사민 5 g/L, L-아스파르트산 8 g/L, L-시스테인 0.5 g/L, 및 코발아민 0.0001 ~ 0.005 g/L를 함유할 수 있다.

상기 식물 펩톤은 소이 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 면 펩톤(cotton peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 누에콩 펩톤(broadbean peptone), 루핀 펩톤(lupin peptone), 및 감자 펩톤(potato peptone)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은, 상술한 배지 조성물에 혐기성 미생물을 접종하여 혐기성 조건 하에서 증식시키는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 고수율 배양방법에 관한 것이다.

상기 배양 단계는 pH 6.6 ~ 7.0, 배양온도 35 ~ 39℃, 교반속도 40 ~ 50 rpm, 질소포화도 80 ~ 90%, 수소포화도 0 ~ 5%, 이산화탄소포화도 5 ~ 20%의 조건에서 실시할 수 있다.

본 발명의 혐기성 미생물의 고수율 배양 방법에서는 배양된 혐기성 미생물이 평판계수법에 의해서 측정되는 생균수가 10¹⁰ CFU/mL 이상의 세포 밀도에 도달하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다양한 실시예에 의하면, 마이크로바이옴 치료제 또는 파마바이오틱스로 이용될 혐기성 미생물들을 산업적으로 대량으로 배양할 때, 의약품, 식품, 또는 사료로 사용하기에 적합하도록 안정적으로 고수율로 제조할 수 있다.

본 발명의 배지 보충제 및 배지 조성물에 의하면 파마바이오틱스 후보로 유력하지만, 산소에 극도로 민감하여 미량의 산소에도 사멸하여 대량 생산이 불가능했던 난배양성 균종인 아커만시아 뮤시니필라를 약품 또는 식품 용도에 적합하게 고농도로 배양할 수 있다.

본 발명의 배지 보충제 또는 배양 배지에서 고수율로 배양된 혐기성 미생물은 파마바이오틱스 의약품, 유산균 제제, 유가공품 및 생균제 등에 광범위하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 아커만시아 뮤시니필라 균주의 탄소 대사 과정을 도시한 모식도이다.
도 2는 아스파르트산으로부터 다양한 아미노산의 생합성 과정을 도시한 모식도이다.
도 3는 본 발명의 배지 보충제를 포함하는 배지에서 배양된 혐기성 미생물들의 균종별 세포의 형태를 도시한 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 아커만시아 뮤시니필라 균주를 배양한 배양기에서의 배양 시간에 따른 배지의 색 변화를 나타낸 사진이다.
도 5는 아커만시아 뮤시니필라의 현미경 관찰 및 특이적 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과를 통해 배양액의 순도 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 프럭토스가 첨가된 본 발명의 배지에서 배양 시간에 따른 아커만시아 뮤시니필라 균주의 성장곡선(A) 및 pH의 변화(B)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 말토스가 첨가된 본 발명의 배지에서 배양 시간에 따른 아커만시아 뮤시니필라 균주의 성장곡선(A) 및 pH의 변화(B)를 나타낸 그래프이다.
도 8은 프럭토스가 첨가된 본 발명의 배지에서 고순도 질소가스만을 이용하여 배양했을 때 배양 시간에 따른 아커만시아 뮤시니필라 균주의 성장곡선(A) 및 pH의 변화(B)를 나타낸 그래프이다.

이하에서 첨부 도면을 참조하여 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명에서 용어 "배지(media)" 또는 "배양 배지(culture media)"는 미생물 성장 또는 증식에 필요한 모든 영양소 및 필수 물리적 성장 파라미터를 함유하는 고체, 반고체 또는 액체 배지를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 경우에, 미생물의 "배양" 또는 "성장"이라는 용어는 미생물 유기체를 이의 성장에 도움이 되는 조건 하에서 소정의 배양 배지 중에서 번식시킴으로써 이를 증대시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 배지의 "보충제"는 원하는 혐기성 미생물의 성장, 증식 또는 다른 특징을 촉진하기 위한 선택된 구성 성분들로 구성되는 첨가물을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 경우에, 용어 "혐기성 미생물"은 산소에 민감하여 산소의 존재 하에서 성장하지 않는 미생물을 의미한다. 혐기성 미생물은 절대(strict or obligate) 혐기성 미생물 및 통성(facultative) 혐기성 미생물을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, 용어 "포함한다" 및 그의 변형은 이들 용어가 설명 및 청구범위에 나타나는 경우 제한적 의미를 갖지 않는다. 또한, 본 명세서에서, 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 등을 포함함).

본 발명의 하나의 양상은 N-아세틸헥소소사민, L-아스파르트산, L-시스테인 및 코발아민을 포함하는 혐기성 미생물의 고수율 배양용 배지 보충제에 관한 것이다. 상기 배지 보충제는 N-아세틸헥소코사민 5 g/L, L-아스파르트산 8 g/L, L-시스테인 0.5 g/L 및 코발아민 0.0001 g ~ 0.005 g/L를 포함할 수 있다.

본 발명의 배지 보충제는 주로 혐기성 미생물의 배양에 사용되는데, 이러한 혐기성 미생물은 인간의 장내 절대-혐기성 미생물(gastrointestinal strict-anaerobic microorganism)이다.

이러한 혐기성 미생물의 예로는 피칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii), 언에어로스티페스 카키(Anaerostipes caccae), 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 부티리시코커스 풀리케이코럼 (Butyricicoccus pullicaecorum), 로즈뷰리아 이눌리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로즈뷰리아 호미니스(Roseburiahominis), 또는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)을 들 수 있는데, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 혐기성 미생물의 고수율 배양용 배지 보충제는 N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamines)을 포함한다. N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamines)으로는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 또는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)을 포함할 수 있는데, 바람직하게는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 포함한다. 도 1은 아커만시아 뮤시니필라의 탄소 대사 과정을 도시한 모식도이다. 도 1을 참조하면, 아커만시아 뮤시니필라는 락토스를 갈락토스와 글루코스로 전환하는 효소인 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)와, 말토스를 글루코스로 전환하는 효소인 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)를 보유하고 있기 때문에 락토스, 말토스, 프럭토스와 같은 탄소원들은 모두 해당과정(glycolysis)을 거쳐 고에너지 분자인 ATP를 형성하는데 사용된다. 외부에서 공급되는 N-아세틸글루코사민(Glc-NAc)은 세포벽 합성 (peptidoglycan biosynthesis) 및 에너지 대사에 사용되며, N-아세틸글루코사민은 대사되면서 암모니아를 생성하는데, 암모니아는 세포질을 중화하고 질소원으로 공급하는 기능도 할 수 있다. N-아세틸글루코사민(Glc-NAc) 이외에 N-아세틸갈락토사민(Gal-NAc)이 더 추가될 수 있다.

상기 N-아세틸헥소사민은 약 2.5 ~ 5 g/L 범위의 양으로 포함될 수 있다.

아미노산은 세포 배양 배지 중에서 배양된 세포의 대사 기능을 유지시키는 데 중요하다. 혐기성 미생물의 고농도 배양 시에 양호한 증식을 지속시키기 위해서는 외부 단백질 공급원이 필수적이다. 본 발명자들은 다양한 아미노산들 가운데 아스파르트산과 시스테인의 조합이 혐기성 미생물에 대한 단백질 공급원 내지 질소원으로서 매우 효과적인 것을 확인하였다. 아미노산으로는 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 L-발린 등이 있으며, 아커만시아 뮤시니필라가 분해할 수 있는 뮤신은 세린, 트레오닌, 프롤린 및 시스테인이 풍부한 아미노산 서열 반복 구조의 특징을 가지고 있다. 하지만 본 발명에서는 이 아미노산들 중 아스파르트산과 시스테인의 추가로 아커만시아 뮤시니필라를 고수율로 증식시킬 수 있다. 아스파르트산과 시스테인은 D-형태 및 L-형태로 존재할 수 있다.

도 2는 아스파르트산으로부터 다양한 아미노산의 생합성 과정을 도시한 모식도이다. 도 2를 참조하면, 아스파르트산은 트레오닌 및 메티오닌 생합성의 중간체인 호모세린(homoserine)으로 전환될 수 있으며, 세린, 프롤린을 포함한 다양한 아미노산들이 아스파르트산으로부터 생합성 될 수 있다. 게다가 아스파르트산은 핵산(nucleic acid), 지방산(fatty acid)과 글루타치온(glutathione, 일부 세균에서 매우 중요한 항산화제)의 합성에 필요한 펜토오스 인산염(pentose phosphates)과 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드인산(NADPH)의 생성을 증가시켜 산성 스트레스에 대한 저항성을 개선시킬 수 있다. 또한 아스파르트산으로부터 리신(Lysine)과 트레오닌(Threoine)의 생합성은 일부 균종들의 증식에 도움이 되며, 아스파르트산의 섭취로 장내 마이크로바이오타의 다양성이 증가되기도 한다.

본 발명의 배지 보충제의 조성물은 아스파르트산과 시스테인을 각각 예를 들어 약 4 ~ 8 g/L와 약 0.5 ~ 1 g/L 범위의 양으로 포함할 수 있다.

본 발명의 배지 보충제는 코발아민(cobalamin), 즉 비타민 B12를 포함한다. 코발아민은 보조인자로서 세포에 의해 사용된다. 배양 배지가 뮤신을 함유하지 않을 경우, 혐기성 미생물이 고밀도로 성장하기 위해서는 상당량의 코발아민을 필요로 한다. 코발아민은 코발아민에 동등한 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 코발아민으로는 시아노코발아민, 메틸 코발아민, 아데노실 코발아민(adenosyl cobalamin), 히드록실 코발아민(hydroxyl cobalamin) 및 다른 기능적으로 동등한 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 배지 보충제는 코발아민을 약 0.0001 ~ 0.005 g/L 범위의 양으로 포함할 수 있다.

비타민으로는 비오틴, 콜린 클로라이드, 엽산, 미오이노시톨, 니아신아미드, 피리독신 HCl, D-판토텐산 (hemiCa), 리보플라빈, 티아민 HCl 등도 있지만, 코발아민을 배지에 첨가할 경우에 혐기성 미생물의 상대적 풍부도를 증가시키고, 다른 비타민을 추가하더라도 코발아민을 단독으로 첨가한 경우와 효과상 큰 차이가 나지 않는다. 아커만시아 뮤시니필라의 유전체 분석에서, ATCC BAA-835 균주와 EB-AMDK19 균주를 포함한 대부분의 균주는 비타민 B군 (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9)의 생합성 (biosynthesis)과 관련된 유전자는 확인되었지만, 비타민 B12의 생합성 관련 유전자는 보유하고 있지 않는 것으로 나타났다. 또한 아커만시아 뮤시니필라에서 코발아민은 숙시네이트로부터 프로피오네이트 합성에 중요한 조효소로 작용할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 본 발명의 배지 보충제를 포함하는 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 조성물을 준비하기 위한 기초 배지로는 대량 배양에 의한 산업적 생산을 목적으로 하는 경우에는 액체 배지가 바람직한데, 식물 펩톤, 효모 추출물, 제2 인산칼륨을 포함하는 배지일 수 있다.

본 발명의 혐기성 미생물 고수율 배양용 배지 조성물은 식물 펩톤, 효모 추출물, 제2인산칼륨을 포함하는 배지를 기초로 하고, 탄소원으로서 프럭토스 및 락토스를 포함하고, 보충제로서 N-아세틸헥소사민, L-아스파르트산과 L-시스테인의 아미노산 혼합물 및 코발아민을 포함한다.

본 발명의 배지 조성물은 혐기성 미생물, 구체적으로 절대-혐기성 미생물의 배양에 적합하다. 절대-혐기성 미생물의 비제한적인 예에는 피칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 언에어로스티페스 카키(Anaerostipes caccae), 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로즈뷰리아 이눌리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로즈뷰리아 호미니스(Roseburia hominis), 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)이 포함하지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 배지 조성물은 특히 아커만시아 속, 구체적으로 아커만시아 뮤시니필라를 산업적 규모로 고수율로 배양하기에 적합하다.

본 발명의 혐기성 미생물 고수율 배양용 배지 조성물은 식물 펩톤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 제2인산칼륨 2.5 g/L, 프럭토스 2.5 g/L, 락토스 2.5 g/L, N-아세틸헥소사민 5 g/L, L-아스파르트산 8 g/L, L-시스테인 0.5 g/L, 및 코발아민 0.0001 ~ 0.005 g/L를 함유할 수 있다.

본 발명의 혐기성 미생물 고수율 배양용 배지는 식물 펩톤을 포함할 수 있다. 식물 펩톤은 식물 단백질 가수분해물(hydrolysate)이다. 이는 임의의 식물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 식물 펩톤은 예를 들어, 소이 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 면 펩톤(cotton peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 누에콩 펩톤(broadbean peptone), 루핀 펩톤(lupin peptone), 및 감자 펩톤(potato peptone)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 식물 펩톤은 예를 들어, 약 15 ~ 20 g/L의 양으로 포함할 수 있다.

본 발명의 혐기성 미생물 고수율 배양용 배지는 효모 추출물을 포함한다. 효모 추출물을 첨가할 경우에 단백질 공급원의 증가가 비-동물 유래된 배지 상에서 혐기성 미생물의 증식을 더욱 증가시킬 수 있다. 효모 추출물은 효모 자가용해물 (autolysate), 한외여과된 효모 추출물 또는 합성 효모 추출물일 수 있다. 효모 추출물의 농도는 5 g/L 내지 10 g/L, 예컨대 약 10 g/L 일 수 있다.

본 발명의 배지는 포스페이트-함유 성분, 예컨대 Na₂HPO₄, K₂HPO₄ 또는 KH₂PO₄를 추가로 포함한다. 이러한 성분은 등장성 조건을 유지시키고, 삼투압 불균형을 막기 위해 세포 배양 배지에 첨가된다. 본 발명의 배지 조성물은 pH를 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 6.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 대략 pH 6.8 ± 1의 범위로 유지시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 조성물은 탄소원 및 에너지원으로 프럭토스와 락토스를 포함하고, 선택적으로 말토스를 추가로 포함할 수 있다. 프럭토스 또는 말토스의 농도는 2.5 g/L 내지 5.0 g/L, 예컨대 약 2.5 g/L일 수 있다.

탄소원으로 글루코스를 포함할 수도 있지만, 글루코스 첨가 시 미생물의 지수적 성장을 유도하지만 오래 지속되지는 않고, 글루코스가 갈락토스와 β(1→4)-글리코시드로 결합되어 있는 락토스를 분해하여 글루코스를 공급받을 수 있고 대사경로에서 N-아세틸글루코사민과 글루코스는 상호 전환이 가능하기 때문에 글루코스보다는 프럭토스와 락토스의 조합이 더 바람직하다.

본 발명에서 배양 배지는 다수의 구성성분들을 포함하는, "분말 배지 (powdered medium)", 또는 "농축 배지(concentrated medium)"로서 일반적으로 언급된 분말 또는 농축물의 형태로 제공되거나 액체 배지에 원하는 농도의 특정 구성성분들을 제공하기 위한 소정의 부피의 물과 결합될 수 있다. 이런 분말 배지 또는 농축 배지는 사용 전에, 적합한 물, 보통 멸균수에 용해될 수 있다.

본 발명에서 배지 또는 배지 조성물은 혐기성 미생물을 배양하기 위해 적합한 농도로 구성요소를 포함하는 최종 배지 및 희석을 위해 적합한 분말 또는 농축 배지 모두를 포함한다.

본 발명의 배양 배지는 혐기성 미생물의 배양을 위하여 선택적으로 환원제를 포함할 수 있다. 적합한 환원 시약은 배양 배지의 산화-환원 전위를 낮추고 용존산소를 제거(oxygen scavanger)함으로써 혐기성 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있다. 적합한 환원제는, 예를 들어 소듐 티오글리콜레이트, L-시스테인, 다이티오트레이톨, 다이티오에리트리톨, 황화나트륨(Na₂S) 및 이들의 조합을 포함하지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 배지의 혐기성은 질소(N₂), 수소(H₂), 및 이산화탄소(CO₂)가 100 : 0 : 0 내지 90 : 5 : 5의 부피비로 혼합된 혼합가스에 의한 배지 내 산소의 치환에 의하여 조성될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 배지 내의 기압은 0.1 내지 0.3 기압일 수 있으며, 바람직하게는 0.2 기압(0.02 MPa) 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 이상에서 설명한 본 발명의 배지 조성물에 혐기성 미생물을 접종하여 혐기성 조건 하에서 증식시키는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 고수율 배양방법에 관한 것이다.

미생물의 배양 조건은 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 바와 같이, 미생물의 성장 속도에 영향을 줄 수 있다. 본 발명에서 배양 단계는 pH 6.6 ~ 7.0, 배양온도 35 ~ 39℃, 교반속도 40 ~ 50 rpm, 질소포화도 80 ~ 90 %, 수소포화도 0 ~ 5%, 이산화탄소포화도 5 ~ 20%에서 실시할 수 있다.

본 발명에서 혐기성 미생물의 배양은, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 600 nm 파장에서 측정된 광학밀도(OD₆₀₀)에 의해 결정시 0.6 이상의 세포 밀도를 가질 때까지 수행되며, 이 때의 평판계수법에 의해서 측정되는 생균수 10¹⁰ CFU/mL 이상의 세포 밀도에 도달하도록 고농도로 배양할 수 있다.

혐기성 미생물의 고농도 배양을 위한 배양 온도는 35 ~ 39℃, 특히 36 ~ 38℃가 바람직하다. 배양 시, 미생물 군집 현탁액이 접종된 조성물을 교반할 수 있다. 예를 들어, 배양기의 분당 회전속도(rpm)는 40 rpm 내지 50 rpm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 혐기성 미생물의 생육 상태에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 일반적으로 20 ~ 100 시간, 특히 24 ~ 48 시간 정도가 적당하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 배지의 혐기성은 질소(N₂), 수소(H₂), 및 이산화탄소(CO₂)가 90 : 5 : 5 내지 80 : 0 : 20의 부피비로 혼합된 혼합가스에 의한 배지 내 산소의 치환에 의하여 조성될 수 있다. 혼합가스에 의한 배지 내 산소의 치환은 배지 부피 1 mL를 기준으로 30초 이상이 이루어지는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 2분일 수 있다.

아커만시아 뮤시니필라는 대사경로에서 ATP 합성에 수소이온이 사용되고, 혐기성 조건에서 수소(H₂)가 Ni-dependent hydrogenase에 의한 혐기성 호흡에 중요하다. 따라서 본 발명의 배지에서 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주의 고농도 배양을 위해서는 수소가 포함된 혼합가스 또는 물에 녹아 탄산과 수소이온을 발생할 수 있는 이산화탄소가 포함된 가스를 주입하는 것이 필요하다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 본 실시예에 언급된 모든 부 및 백분율은 중량 기준이고, 모든 온도는 섭씨온도로 표현된다.

또한 이하의 실시예에서 혐기성 미생물의 농도(바이오매스의 생성량)는 배양 기간 동안 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 배양액의 광학밀도를 측정하여 구하였다. ΔOD는 초기와 48시간(또는 72 시간) 배양 후의 흡광도의 차이로 산출하였다.

실시예

실시예 1: 배양 배지에서 뮤신 대체 성분 조성의 최적화

대두카제인소화액체배지(Tryptic Soy Broth, TSB)를 베이스로 뮤신을 대체할 수 있는 기질 및 성분들의 최적 조합을 탐색하였으며, 이를 위하여 표 1과 같이 각각의 준비된 배지에 0.1% v/v의 비율로 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 (KCTC 13761BP) 균주를 접종한 후 37°C, 혐기조건(90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂)에서 24 ~ 48시간 배양하며, 광학밀도(OD₆₀₀)의 변화를 측정하여, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	Mucin (g/L)	Glu (g/L)	GlcNAc (g/L)	Lac (g/L)	Thr (g/L)	Asp (g/L)	Vitamin 용액3	Growth (ΔOD600)*,†
PM1	-	4.5	5.5	-	4	-	-	0.133 ± 0.003
TSB2	-	2.5	-	-	-	-	-	0.030 ± 0.005
TSB	2.5	2.5	-	-	-	-	-	0.368 ± 0.005
TSB	-	5	5	-	4	-	-	0.289 ± 0.003
TSB	-	2.5	2.5	2.5	4	-	-	0.290 ± 0.003
TSB	-	2.5	2.5	2.5	-	2	-	0.291 ± 0.003
TSB	-	2.5	2.5	2.5	-	4	-	0.302 ± 0.005
TSB	-	2.5	2.5	2.5	-	6	-	0.310 ± 0.004
TSB	-	2.5	2.5	2.5	-	8	-	0.338 ± 0.004
TSB	-	2.5	2.5	2.5	-	16	-	0.257 ± 0.002
TSB	-	2.5	2.5	2.5	-	8	+	0.409 ± 0.006
1PM : 특허 배지는 16 g/L 대두-펩톤과10 g/L 효모 추출물을 아미노산 공급원으로 함유 2TSB(Tryptic Soy Broth) : TSB 배지는 17 g/L의 카제인 췌장 분해물, 3 g/L 대두의 papaic 분해물, 5 g/L NaCl, 2.5 g/L K2HPO4를 함유 3비타민 용액에는 0.02 mg/L 비오틴, 0.2 mg/L 니아신, 0.5 mg/L 피리독신, 0.1 mg/L 리보플라빈, 0.2 g/L 티아민, 0.1 g/L 시아노 코발라민, 0.1 g/L p-아미노 벤조산, 0.1 g/L 판토텐산을 포함 약어 : Glu, 포도당; GlcNAc, N-아세틸-D-글루코사민, Lac, 락토스; Thr, 트레오닌; Asp, 아스파르트 산

아커만시아 뮤시니필라 균주는 TSB 배지에서는 거의 증식이 되지 않았지만 뮤신을 대체할 수 있는 성분으로 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)과 트레오닌을 추가하면 배양이 가능한 것으로 나타났다. 그러나 트레오닌을 아스파르테이트(Aspartate)로 대체할 경우에 동일한 농도(4 g/L)에서 배양성이 개선되는 것으로 나타났으며, 최대 8 g/L 농도의 아스파르테이트를 첨가할 때까지 배양성이 증가하였다.

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, TSB를 기반으로 N-아세틸글루코사민, 락토스, 아스파르테이트와 비타민이 첨가된 배지에서 흡광도의 변화량은 0.4 수준으로 나타났으며, 이때의 생균수는 10⁹ CFU/mL로 측정되었고, 이와 비교하여 PM 배지에서 흡광도의 변화량은 0.1 수준이었고, 이때의 생균수는 10⁸ CFU/mL로 측정되어 10배 이상 차이를 보이는 것으로 나타났다.

이는 옥살로아세테이트/아스파르테이트 아미노산 계열이 리신, 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 이소류신으로 구성되며, 대사과정에서 아스파르테이트는 리신, 아스파라긴, 메티오닌 및 트레오닌으로 전환 될 수 있기 때문인 것으로 사료된다.

실시예 2: 서로 다른 탄소원을 갖는 배지의 배양성 비교

동물 유래 성분 또는 동물 유래 효소가 사용되어 제조된 성분을 배제하기 위해서, 식물펩톤과 효모 추출물을 기초로 하여, 본 발명의 배지 보충제의 혐기성 미생물 배양성을 시험하였다.

식물펩톤으로 소이펩톤과 효모 추출물은 각각 5, 10, 15, 20 g/L의 농도들을 서로 조합하여 테스트해본 결과, 20 g/L 농도의 소이펩톤과 10 g/L 농도의 효모추출물 조합에서 배양성이 가장 우수하였으며, pH 조절을 위하여 제2인산칼륨을 2.5 g/L의 농도로 첨가하여 기초 배지를 제조하였다.

혐기성 미생물인 아커만시아 뮤시니필라의 배양성에 영향을 미치는 탄소원을 조사하기 위해서 질소원 기초 배지에 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 다양한 탄소원을 첨가하고, 0.1% v/v의 비율로 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 (KCTC 13761BP) 균주를 접종한 후 37℃, 혐기조건(90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂)에서 24 ~ 48시간 배양한 후, 광학밀도(OD₆₀₀)의 변화를 측정하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

질소원 기초 배지에 보충제 첨가 (1 L 중에 아래의 성분 함유)
소이-펩톤	20.0 g
효모 추출물	10.0 g
제2인산칼륨	2.5 g
보충제(Supplement)
N-아세틸-D-글루코사민	5.0 g
D-락토스 모노하이드레이트	2.5 g
D-프럭토스	2.5 g
[프럭토스 대체제] 말토스 모노하이드레이트	2.5 g
L-아스파르트산	8.0 g
L-시스테인·염산 무수화물	0.5 g
시아노코발아민	0.1 mg

소이 펩톤 (g/L)	효모 추출물 (g/L)	Glu (g/L)	Fru (g/L)	Mal (g/L)	Lac (g/L)	GlcNAc (g/L)	Asp (g/L)	코발 아민 (mg/L)	Growth (ΔOD600)*,†
20	10	-	-	-	2.5	5	8	0.1	0.506 ± 0.003
20	10	2.5	-	-	2.5	5	8	0.1	0.509 ± 0.003
20	10	-	2.5	-	2.5	5	8	0.1	0.560 ± 0.005
20	10	-	-	2.5	2.5	5	8	0.1	0.527 ± 0.008
20	10	-	2.5	2.5	2.5	5	8	0.1	0.529 ± 0.008
†ΔOD는 초기와 48시간 배양 후의 흡광도의 차이로 산출하였다.

상기 표 3의 결과를 통해서 알 수 있는 바와 같이, 탄소원으로 락토스를 기본으로 하고, 여기에 N-아세틸글루코사민을 첨가하거나 N-아세틸글루코사민과 글루코스를 함께 첨가한 경우에 비해서, 프럭토스를 첨가하는 경우에 아커만시아 뮤시니필라 균주의 배양성이 훨씬 우수한 것으로 나타났다. 흡광도의 변화량(△OD)은 평균 0.5 ~ 0.6 수준으로 나타났고, 생균수는 약 10¹⁰ CFU/mL로 측정되어, 본 발명의 경우에 생균수를 기준으로 10 ~ 100배 증가되어 배양성이 현저하게 향상되었음을 확인하였다. 또한 글루코스 2분자가 β(1→4)-글리코시드로 결합되어 있는 말토스(Maltose)를 첨가하였을 때에도 배양성은 글루코스를 첨가하였을 때보다 개선되었다.

실시예 3: 배양성 개선에 중요한 비타민 B군의 선별

본 실시예에서는 아커만시아 뮤시니필라 균주의 배양 배지에 비타민 B군의 첨가를 통한 배양성 개선 여부를 확인하였다. 혐기성 미생물의 증식에 영향을 주는 특정 비타민을 선별하고자 비타민 B군에 속하는 모든 비타민을 각각 개별적으로 또는 B군 복합체 (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B10, B12)에 대하여 테스트를 진행하였다.

표 4와 같이 각각의 준비된 배지에 0.1% v/v의 비율로 아커만시아 뮤시니필라 균주를 접종한 후 37℃, 혐기조건(90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂)에서 24 ~ 48시간 배양하며, 광학밀도 (OD₆₀₀)의 변화를 측정하여, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

B1 (mg/L)	B2 (mg/L)	B3 (mg/L)	B5 (mg/L)	B6 (mg/L)	B7 (mg/L)	B9 (mg/L)	B10 (mg/L)	B12 (mg/L)	Growth (ΔOD600)*,†	P value‡
-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.331 ± 0.003	-
0.2	-	-	-	-	-	-	-	-	0.352 ± 0.003	0.0698
-	0.1	-	-	-	-	-	-	-	0.334 ± 0.009	0.9994
-	-	0.2	-	-	-	-	-	-	0.342 ± 0.018	0.9732
-	-	-	0.1	-	-	-	-	-	0.347 ± 0.005	0.4077
-	-	-	-	0.5	-	-	-	-	0.337 ± 0.014	0.9869
-	-	-	-	-	0.02	-	-	-	0.344 ± 0.008	0.3570
-	-	-	-	-	-	0.05	-	-	0.348 ± 0.013	0.7130
-	-	-	-	-	-	-	0.1	-	0.335 ± 0.009	0.9999
-	-	-	-	-	-	-	-	0.1	0.575 ± 0.018	0.0124
-	0.1	-	-	0.15	-	0.05	-	0.1	0.582 ± 0.020	0.0121
0.2	0.1	0.2	0.1	0.15	0.01	0.05	-	0.1	0.561 ± 0.014	0.0119
0.2	0.1	0.2	0.1	0.15	0.01	0.05	0.1	0.1	0.585 ± 0.010	0.0019
†ΔOD는 초기와 72시간 배양 후의 흡광도의 차이로 산출하였다.

표 4를 통해서 확인되는 바와 같이, 배지에 시아노코발아민(비타민 B12)이 포함된 경우 (B12, B2 + B6 + B9 + B12, B1 + B2 + B3 + B5 + B6 + B7 + B9 + B12, 또는 B1 + B2 + B3 + B5 + B6 + B7 + B9 + B10 + B12)에만 배양성이 증가되는 것으로 나타났으며, 비타민 B12를 단독으로 첨가한 것은 비타민 B군 복합체로 첨가했을 때와 비교하여 유의적인 차이는 없었다.

또한 코발아민의 최적농도를 찾기 위해서 코발아민의 농도를 변경해 가면서 배양한 후, 광학밀도 (OD₆₀₀)의 변화를 측정하여, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시아노코발아민 (mg/L)	Growth (ΔOD600)*,†	P value‡
-	0.326 ± 0.008	-
0.05	0.563 ± 0.012	<0.0001
0.1	0.576 ± 0.014	<0.0001
0.2	0.577 ± 0.008	<0.0001
0.5	0.575 ± 0.011	<0.0001
1	0.581 ± 0.003	<0.0001
5	0.571 ± 0.007	<0.0001
†ΔOD는 초기와 48시간 배양 후의 흡광도의 차이로 측정하였다.

상기 표 5의 결과를 통해서 알 수 있는 바와 같이, 배지에 첨가되는 비타민 B12의 최적 농도를 확인해본 결과, 0.1 mg/L 미만의 농도에서는 배양성이 점차 감소되는 것으로 나타났으며, 0.1 mg/L부터 5 mg/L 농도에서는 배양성이 유의적인 차이를 보이지 않아 0.1 mg/L의 농도가 가장 적합한 것으로 사료된다.

실시예 4: 배지 성분의 최적화

혐기성 미생물의 고농도 배양에 필요한 필수 구성 성분 및 최적의 조합을 탐색하기 위해서 아커만시아 뮤시니필라 균주를 다양한 성분 조합을 갖는 배지에 동일 조건에서 배양한 후 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

소이 펩톤 (g/L)	효모 추출물 (g/L)	뮤신 (g/L)	Fru (g/L)	Mal (g/L)	Lac (g/L)	GlcNAc (g/L)	Asp (g/L)	코발아민 (mg/L)	Growth (ΔOD600)*,†
20	10	2.5	-	-	-	-	-	-	0.148 ± 0.002
20	10	-	2.5	-	2.5	5	8	0.1	0.539 ± 0.004
20	10	-	5	-	2.5	5	8	0.1	0.533 ± 0.015
20	10	-	-	2.5	2.5	5	8	0.1	0.525 ± 0.011
20	10	-	-	5	2.5	5	8	0.1	0.512 ± 0.012
20	10	-	-	-	2.5	5	8	0.1	0.505 ± 0.005
20	10	-	2.5	-	-	5	8	0.1	0.428 ± 0.013
20	10	-	2.5	-	2.5	-	8	0.1	0.004 ± 0.001
20	10	-	2.5	-	2.5	5	-	0.1	0.324 ± 0.002
20	10	-	2.5	-	2.5	5	8	-	0.387 ± 0.006
20	-	-	2.5	-	2.5	5	8	0.1	0.533 ± 0.005
-	10	-	2.5	-	2.5	5	8	0.1	0.350 ± 0.008
20	10	-	-	-	-	5	-	-	0.242 ± 0.004
20	10	-	2.5	-	-	-	-	-	0.004 ± 0.001
20	10	-	-	-	2.5	-	-	-	0.002 ± 0.002
20	10	-	2.5	-	2.5	-	-	-	0.003 ± 0.002
20	10	-	2.5	-	-	5	-	-	0.231 ± 0.003
20	10	-	-	-	2.5	5	-	-	0.283 ± 0.004
20	10	-	2.5	-	2.5	5	-	-	0.261 ± 0.002
*배양 샘플의 광학밀도(O.D.)는 마이크로플레이트 리더로 λ=600 nm에서 측정하였다. †ΔOD는 초기와 48시간 배양 후의 흡광도 차이로 산출하였다.

본 발명의 배지에서 각 성분별 배양에 미치는 영향을 확인해본 결과, 상기의 조합들에서 단당류의 질소함유 유도체인 N-아세틸글루코사민은 아커만시아 뮤시니필라 배양에 가장 필수적인 성분으로 확인되었으며, N-아세틸글루코사민과 대사경로의 일부를 서로 공유하고 있는 탄소원인 프럭토스와 락토스는 고농도 배양을 위해서는 필요한 성분으로 나타났다. 주요 아미노산 공급원인 소이펩톤과, 아스파르테이트, 그리고 시아노코발아민의 조합은 배양성 개선에 중요한 성분으로 확인되었다.

말토스는 글루코스 또는 프럭토스를 대체 가능하였으며 배양 초반 증식 속도는 프럭토스나 글루코스에 비해 빠른 편이었고, 배양성에서도 큰 차이를 보이지 않았다. 하지만, 현재 말토스는 프럭토스나 글루코스에 비해 다소 고가이기에 산업용 배지로는 프럭토스가 가장 적합한 것으로 볼 수 있다. 결론적으로, 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 배지의 모든 구성 성분들은 아커만시아 뮤시니필라 균주의 고농도 배양을 위해 필요하며, 모든 성분들이 조합되었을 때 배양성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.

실시예 5: 본 발명의 배지에서 다양한 아커만시아 뮤시니필라 균주들의 배양성 확인

상기 표 2에 기재된 배지를 이용하고, 배양 균주의 종류를 하기 표 7에 기재된 바와 같이 달리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 0.1% v/v의 비율로 아커만시아 뮤시니필라 균주를 접종한 후 37℃, 혐기조건(90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂)에서 24 ~ 48시간 배양하며, 광학밀도(OD₆₀₀)의 변화를 측정하여, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

Test strains	Growth (ΔOD600)*,†
아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835T	0.548 ± 0.008
아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 (KCTC 13761BP)	0.540 ± 0.012
아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK27 (KCTC 13758BP)	0.535 ± 0.011
아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 (KCTC 13765BP)	0.548 ± 0.005

상기 표 7의 결과를 통해서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 배지를 이용하여 아커만시아 뮤시니필라 표준균주 (ATCC BAA-835^T) 및 서로 다른 아커만시아 뮤시니필라 균주들의 배양성을 확인한 결과, 모든 아커만시아 뮤시니필라 균주들에서 비슷한 배양 수준을 보였으며, 따라서 모든 아커만시아 뮤시니필라 균주의 고농도 배양배지로 활용 가능한 것을 확인할 수 있다.

실시예 6: 다양한 난배양성 절대 혐기성 미생물의 배양성 비교

배양 균주의 종류를 하기 표 8에 기재된 바와 같이 달리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 0.1% v/v의 비율로 피칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii), 언에어로스티페스 카키(Anaerostipes caccae), 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주를 접종한 후 37℃, 혐기조건 (90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂)에서 24 ~ 48시간 배양하며, 광학밀도 (OD₆₀₀)의 변화를 측정하여, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 대조를 위하여 배양성이 우수한 것으로 알려진 대조 배지에서도 배양하여 본 발명의 배지에서의 배양성과 비교하였다. 대조 배지로서 F. prausnitzii는 뇌심장침출 배지(Brain Heart Infusion, BHI)에 5 g/L 효모 추출물, 1 g/L 셀로비오스 및 1 g/L 말토스를 보충한 배지에서 동일한 조건에서 배양하였다. A. caccae는 TSB 배지에 5 g/L 효모 추출물을 보충한 배지에서 배양하였고, B. longum은 BL 브로스 배지에서 배양하였다.

혐기성 미생물	배양성 (ΔOD600)*,†
	대조 배지1	본 발명의 배지 (표 1의 성분 함유)
Faecalibacterium prausnitzii EB-FPDK11 (KCCM 12621P)	0.105 ± 0.002	0.307 ± 0.006
Anaerostipes caccae L1-92T	0.364 ± 0.003	0.463 ± 0.003
Bifidobacterium longum EB-BGYK18 (KCCM 12626P)	0.304 ± 0.003	0.333 ± 0.002
1 F. prausnitzii 대조 배지 : 뇌심장침출 배지(Brain Heart Infusion, BHI)에 5 g/L 효모 추출물, 1 g/L 셀로비오스 및 1 g/L 말토스 보충 A. caccae 배양 대조 배지 : TSB 배지에 5 g/L 효모 추출물 보충 B. longum 배양 대조 배지 : BL 브로스

상기 표 8의 결과를 통해서 확인되는 바와 같이, 피칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 언에어로스티페스 카키(Anaerostipes caccae)와 같은 난배양성 절대혐기성 미생물 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 배양 가능성을 시험해 본 결과, 배양성이 우수한 것으로 알려져 있는 대조 배지들과 비교하여, 본 발명의 배지가 배양성이 더 우수한 것을 확인하였다.

실시예 7: 대량배양을 위한 공정 조건 최적화 -배양 조건별 배양성 비교 분석

도 4에 도시한 바와 같은 혐기성 발효 시스템을 이용하여 3L-스케일에서 표 2의 배지에서 탄소원의 종류를 변경한 배지를 사용하여 하기 표 9의 조건으로 배양을 진행하였으며, 아커만시아 뮤시니필라 균주의 성장곡선(growth curve) 및 pH의 변화를 확인하였다. 또한 현미경 관찰을 통한 균수의 변화와 형태학적 변화를 확인하여 도 5에 나타내었으며, 평판계수법 (plate count method)을 이용하여 생균수를 측정하여 표 10에 나타내었다.

배양 온도	37±1℃
pH	6.8±0.2
가스 플로우 (100% N2 or 90% N2, 5% CO2, 5% H2)	0.2 liters/h
교반 속도	40 - 50 rpm
접종물	1% v/v
배양 용기 사이즈	3 L

구분	실시예1	실시예2	비교예3	비교예4
탄소원	프럭토스	말토스	프럭토스	프럭토스
배양기 가스 조성	90% N2, 5% CO2, 5% H2	90% N2, 5% CO2, 5% H2	100% N2	80% N2, 20% CO2
OD600 (ELISA)	0.798 ± 0.004	0.632 ± 0.011	0.105 ± 0.001	0.640 ± 0.005
생균수 (CFU/mL)	5.5 x 1010	5.1 x 1010	≥ 108	5 x 1010
1프럭토스가 포함된 본 발명의 배지 : 20 g/L 소이-펩톤, 10 g/L 효모 추출물, 2.5 g/L K2HPO4, 5 g/L GlcNAc, 2.5 g/L Lactose, 8 g/L Aspartic acid, 0.1 mg/L Cyanocobalamin 2.5 g/L Fructose; 2말토스가 포함된 본 발명의 배지; 20 g/L 소이-펩톤, 10 g/L 효모 추출물, 2.5 g/L K2HPO4, 5 g/L GlcNAc, 2.5 g/L Lactose, 8 g/L Aspartic acid, 0.1 mg/L Cyanocobalamin 2.5 g/L Maltose 3혼합가스 (90% N2, 5% CO2, 5% H2) 대신 고순도 질소가스 (100% N2) 사용 480% N2, 20% CO2로 구성된 혼합가스 사용

본 발명의 배지를 이용하여 혐기성 발효 시스템에서 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 배양한 결과, 지수증식기는 접종 후 5 ~ 25시간으로 나타났으며 pH의 변화도 9 ~ 18.5 시간에 급격하게 일어난 것으로 확인되었다. 24시간 배양을 기준으로 광학밀도 (OD₆₀₀)는 0.798 수준으로 나타났으며, 이때의 생균수는 5.5 x 10¹⁰ CFU/mL로 측정되었다(도 6 및 표 10 참조).

본 발명의 배지에서 프럭토스를 말토스로 대체하였을 시, 지수증식기는 접종 후 3.5 ~ 21시간으로 나타났으며 pH의 변화도 7 ~ 14 시간에 급격하게 일어난 것으로 확인되었다. 프럭토스를 이용하여 배양한 결과와 비교하면, 말토스가 포함된 본 발명의 배지에서는 유도기가 1.5시간 짧아지는 특징을 보였으며, 24시간 배양을 기준으로 흡광도는 0.632 수준으로 나타나 다소 낮아진 듯 보였으나 이때의 생균수는 5.1 x 10¹⁰ CFU/mL로 큰 차이를 보이지는 않았다 (도 7 및 표 9 참조).

프럭토스가 포함된 본 발명의 배지에서 혼합가스(90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂) 대신 보다 경제적이고 산업화에 적합한 수소를 포함하지 않는 가스{고순도 질소가스 (100% N₂) 또는 80% N₂와 20% CO₂로 구성된 혼합가스}를 이용하여 배양한 결과, 고순도 질소가스의 경우, 기존 배양 결과와 비교하여 배양성이 현저하게 떨어지는 것으로 나타났지만, 80% N₂와 20% CO₂로 구성된 가스에서는 배양성이 큰 차이를 보이지 않았다 (도 8 및 표 10 참조).

또한 상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 배지에서 모든 구성 성분들은 아커만시아 뮤시니필라 균주의 고농도 배양을 위해 필요하고, 추가적으로 수소 또는 이산화탄소를 포함하는 혼합가스의 주입이 필요한 것으로 확인되었다.

Claims (13)

1. 식물 펩톤, 효모 추출물, 제2인산칼륨을 포함하는 배지 조성물로서,
   탄소원으로서 프럭토스 및 락토스를 포함하고, 보충제로서 N-아세틸헥소사민, L-아스파르트산과 L-시스테인의 아미노산 혼합물 및 코발아민을 포함하고,
   피칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 언에어로스티페스 카캐 (Anaerostipes caccae), 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)로 구성되는 군에서 선택되는 혐기성 미생물을 배양하기 위한 혐기성 미생물 배양용 배지 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 식물 펩톤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 제2인산칼륨 2.5 g/L, 프럭토스 2.5 g/L, 락토스 2.5 g/L, N-아세틸헥소사민 5 g/L, L-아스파르트산 8 g/L, L-시스테인 0.5 g/L, 및 코발아민 0.0001 ~ 0.005 g/L를 함유하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물 배양용 배지 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 식물 펩톤은 소이 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 면 펩톤(cotton peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 누에콩 펩톤(broadbean peptone), 루핀 펩톤(lupin peptone), 및 감자 펩톤(potato peptone)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 혐기성 미생물 배양용 배지 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 탄소원으로서 프럭토스 대신에 말토스를 포함하거나 프럭토스에 더하여 말토스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물 배양용 배지 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 배지 조성물에 혐기성 미생물을 접종하여 혐기성 조건 하에서 증식시키는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 배양방법.
   
6. 제5항에 있어서, 배양 단계는 pH 6.5 ~ 7.0, 배양온도 35 ~ 39℃, 교반속도 40 ~ 50 rpm, 질소포화도 80 ~ 90%, 이산화탄소포화도 5 ~ 20% 및 수소포화도 0 ~ 5%로 실시하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 배양방법.
   
7. 제5항에 있어서, 배양된 혐기성 미생물이 평판계수법에 의해서 측정되는 생균수 10¹⁰ CFU/mL 이상의 세포 밀도에 도달하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 배양방법.
   
   
   
   
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