KR102221041B1 - 신증후군 및 관련 병태의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시는 폴리펩타이드 및, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 미세 변화 질환 및 막성 신증과 연관되는 것과 같은 신증후군, 및 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨 및 부종뿐 아니라 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신염 또는 원발성 사구체 질환과 같은 신증후군과 관련된 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로 단백뇨 및 본원에 논의되는 다른 질병 상태를 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 대상으로의 치료적 전달을 포함한다.

Description

신증후군 및 관련 병태의 치료 방법{METHODS FOR TREATMENT OF NEPHROTIC SYNDROME AND RELATED CONDITIONS}

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2013년 3월 15일자 출원된 미국 출원 제13/841,240호(계류중)의 계속출원이다. 미국 출원 제13/841,240호는 2012년 2월 2일자 출원된 미국 출원 제13/364,962호(계류중)의 일부-계속출원이다. 미국 출원 제13/364,962호는 2011년 6월 6일자 출원된 국제 출원 PCT/US11/39255(포기)의 계속이다. 국제 출원 PCT/US11/39255는 우선권으로서 2010년 6월 5일자 출원된 미국 출원 제61/351,866호(만료)를 인용한다. 미국 출원 제13/364,962호는 우선권으로서 2011년 2월 2일자 출원된 미국 출원 제61/438,854호(만료)를 인용한다. 미국 출원 제13/841,240호는 전체로서 본원에 참조로 도입된다.

연방 지원 연구에 대한 진술

본원에 기술된 연구를 위한 자금은 적어도 부분적으로 미국 국립보건원(NIH) 승인 번호 R01DK077073 및 R01DK090035에 의해 제공되었고, 미국 정부는 본 발명에 일부 권리를 갖는다.

본 개시는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨 및 부종과 같은 신증후군 및 관련 병태의 치료 및 예방을 위한 방법에 관한 것이다.

신증후군(nephrotic syndrome, NS)은 뇨 중의 단백질 손실(단백뇨), 고지혈증(고콜레스테롤혈증 및 고중성지방혈증), 및 부종을 말하는 일반적인 용어이다. 신증후군은 족세포와 같은 신장 세포의 병리에서 변화를 포함한다. 단백뇨는 뇨 중 과다한 혈청 단백질의 존재로서 정의된다. 단백뇨의 특정 형태인 알부민뇨는 알부민이 뇨 중에 존재하는 병리적 상태이다.

족세포(podocytes)(또는 내장 상피 세포)는 신장의 사구체 모세혈관 루프의 외층에 있는 세포이다. 뇨를 형성하는 첫 번째 단계로서 사구체는 혈액을 여과하여, 단백질과 같은 큰 분자를 되돌려보내고 물, 염 및 당과 같은 작은 분자를 통과시킨다. 족세포의 긴 돌출부 또는 "족 돌기(foot processes)"는 모세혈관 주위를 감싸고 사구체 기저막에 얹혀있게 된다. 족 돌기는 세극막이라고 부르는 다공성 구조에 의해 연결된다. 사구체 모세혈관 루프의 가장 안쪽 층은 창이 있는 내피 세포로 만들어진다. 신증후군이 있는 신장은 사구체 모세혈관 루프에 혈액 단백질 누출을 야기하는 이상이 있어 단백뇨가 생긴다.

단백질이 뇨 중으로 손실될 때는, 혈장 농도가 저하되어 물이 신체의 다른 영역으로 이동하게 되는데, 이는 부종으로 알려진 부기를 야기한다. 부종은 보통 발과 다리에서, 배 또는 복부에서(복수), 그리고 눈 주위에서 관찰되지만, 어디에서도, 특히 중력에 반응하여 일어날 수 있다. 또한, 신체에 체류되는 이러한 과잉의 액체로 인해, 사람들은 종종 체중이 증가하고, 피로를 경험하며 덜 자주 배뇨하는 것을 발견할 수 있다.

미세 변화 질환(minimal change disease, MCD), 국소 분절 사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS), 막성 신증(membranous nephropathy, MN)(막성 사구체신염(membranous glomerulonephritis, MGN)으로도 호칭됨), 및 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis, MPGN)을 포함하는 많은 병태가 신증후군으로서 분류된다. 수 년간 병리학자들은 광학 현미경 하에서 표본을 볼 때 MCD 조직에서 어떠한 변화도 발견하지 못하여, 미세 변화 질환이라는 이름이 붙었다. 전자 현미경의 출현으로, 현재 이 질환의 특징으로 알려진 변화에는 족세포 족 돌기의 확산 손실, 족세포 족 돌기의 공포 형성, 및 내장 상피 세포에서 미세융모의 성장이 포함된다. 당뇨병성 신증은 신증후군의 가장 통상적인 원인이다.

고중성지방혈증은 리포단백질 리파제(LPL)와 같은 중성지방을 분해하는 효소 활성에서의 변화로 인해 일어날 수 있다(2-4). 안지오포이에틴-유사 4(Angptl4)와 같이 신증후군 및 단백뇨의 병인학에 관련된 어떤 단백질은 LPL의 활성을 저해한다.

신증후군의 분자적 기초는 알려져 있지 않다. Angptl4의 증가된 농도가 MCD, MN/MGN, 및 MPGN과 같은 신증후군에서 주목되었지만, Angptl4의 증가된 순환 농도는 신증후군에서 단백뇨의 원인과 관련되지 않았다. 그러나, 이에 제한되지 않는 예를 들어, MCD, FSGS, MN/MGN, 및 MPGN과 같은 신증후군, 그리고 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨와 같은 관련 병태에서 Angptl4의 역할은 이전에 보고되지 않았다. 더욱이, 신증후군에서 단백뇨와 글루코코르티코이드 감수성의 연계 및 신증후군의 두 핵심 성분인 단백뇨와 고중성지방혈증 사이의 관련은 아직 확립되지 않았다. 단백뇨를 감소시키도록 디자인된 요법은 질병 기전의 연구를 더욱 복잡하게 한다. 예를 들어, MCD에서 단백뇨를 치료하기 위해 사용되는 글루코코르티코이드는 독립적으로 혈장 중성지방 농도를 증가시키고(5), 혈장 중성지방 농도의 정상화는 MCD와 같은 신증후군의 어떤 형태에서 글루코코르티코이드에 대한 단백뇨의 반응에 뒤처진다(6).

본 개시는 Angptl4의 증가된 순환 농도가 신증후군의 중증도 및, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨와 같은 이와 연계되는 병태를 감소시키는 것을 보여준다. 결과적으로, 본 개시는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증과 같은 신증후군을 치료 및/또는 예방하는 방법뿐 아니라, 단백뇨 및 부종을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 신증후군과 연계되는 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로, 단백뇨 및 부종을 감소시키기 위한 방법을 제공한다.

제1 양태에서, 본 개시는 신증후군의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 또는 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 MSGS를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 신증후군을 치료한다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 신증후군을 치료한다.

제2 양태에서, 본 개시는 MCD의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 MCD를 치료한다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 MCD를 치료한다.

제3 양태에서, 본 개시는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 및 부종과 같은 하나 이상의 신증후군의 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 하나 이상의 신증후군의 증상을 경감시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 하나 이상의 신증후군의 증상을 경감시킨다.

제4 양태에서, 본 개시는 대상에서 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상은 신증후군이 있다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 대상은 단백뇨를 특징으로 하는 장애가 있다. 다른 구현예에서, 대상은 당뇨병의 병태가 있다. 추가의 구현예에서, 단백뇨는 FSGS에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 단백뇨를 감소시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 단백뇨를 감소시킨다.

제5 양태에서, 본 개시는 대상에서 부종을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상은 신증후군이 있다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 특정 구현예에서, 부종은 알부민과 같은 혈장 단백질의 감소된 순환 농도에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 투여를 통한 단백뇨의 감소는 단백뇨를 감소시키고, 혈장 단백질 농도를 올리고, 이에 의해 부종을 감소시킬 것이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 부종을 감소시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 부종을 감소시킨다.

제6 양태에서, 본 개시는 대상에서 고콜레스테롤혈증 및/또는 고중성지방혈증을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상은 신증후군이 있다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 고콜레스테롤혈증 및/또는 고중성지방혈증을 감소시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 고콜레스테롤혈증 및/또는 고중성지방혈증을 감소시킨다.

제7 양태에서, 본 개시는 당뇨병의 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 전술한 병태를 치료한다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 전술한 병태를 치료한다.

제8 양태에서, 본 개시는 제1 내지 제6 양태의 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 조성물은 하나 이상의 Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다.

다음 논의에서 어떤 물품 및 방법은 배경 및 소개 목적으로 기술될 것이다. 본원에 포함되는 어떤 것도 선행 기술의 "인정"으로서 해석되지 않는다. 출원인은, 적절하다면, 본원에 언급되는 물품 및 방법이 적용 가능한 법령의 조항 하에서 선행 기술을 구성하지 않는다는 것을 입증할 권리를 명확히 유보한다.

신증후군을 조사하는 동안, 족세포로부터 분비된 Angptl4가 단백뇨를 유도하는 것이 주목되었다. 보다 중요하게는, 본원에 기술되는 바와 같이, 순환하는 Angptl4가 형질전환된 동물 모델에서 단백뇨를 감소시켰다. Angptl4의 증가된 농도가 MCD 및 MN과 같은 신증후군에서 주목되었지만, Angptl4의 증가된 순환 농도는 신증후군의 야기와 연계되지 않았다.

증가된 Angptl4 농도가 신증후군을 치료하고 연계된 단백뇨를 감소시키는 것으로 보이는 한편, 순환에서 증가된 Angptl4는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, LPL의 저해를 통해 고지혈증(고중성지방혈증)을 유도하는 것으로 관찰되었다. 부정적인 결과인 고지혈증 없이 증가된 순환 Angptl4 농도의 혜택을 제공하는 것이 유리할 것이다. 이러한 접근은 본원에 개시되는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 사용하여 가능하다.

안지오포이에틴-유사 단백질은 종양 전이 및 고중성지방혈증의 전개에 연계되고, 안지오포이에틴과는 기능적으로 구분된다. Angptl4는 PPAR(8) 및 PPAR(9) 표적 유전자로, 간 및 지방 조직에서 고도로 발현되고 백색 지방 조직 및 간에서 단식에 의해 강력하게 유도되고, 정상산소(normoxic) 조건 하에서 혈관 내피 세포의 세포사멸 생존 인자이다(10). Angptl4는 LPL의 강력한 저해제로(11), 정맥내 주사 또는 아데노바이러스-중개된 발현에 따라 유의성 있는 고중성지방혈증을 유도한다(12, 13). 다른 연구에서는 심근세포 및 골격근에서 Angptl4의 더 낮은 발현, 그리고 전(whole) 신장에서 낮은 수준의 발현을 노던 블롯 분석으로 보여주었다(8). 최근의 ANGPTL4 유전자의 집단 기반의 연구에서는 인간에서 중성지방 농도에 영향을 미치는 변종을 밝히고 있다(14, 15).

본 개시는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, MCD, FSGS, MN, MPGN 및 당뇨병성 신증과 같은 신증후군에서 관찰되는 단백뇨의 감소에서 순환 Angptl4의 결정적인 역할을 보여준다.

정의

본원에서 사용되는 용어 "예방(prevention)", "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)", "억제(suppression)", "억제하다(suppress)" 및 "억제하는(suppressing)"은 질환 또는 병태의 증상, 양태, 또는 특성의 시작 전에 이러한 증상, 양태, 또는 특성을 방지 또는 감소시키기 위해 개시되는 행동 방침(화합물 또는 약제학적 조성물의 투여와 같은)을 말한다. 이러한 예방 및 억제는 절대적으로 유용할 필요는 없다.

본원에서 사용되는 용어 "치료(treatment)", "치료하다(treat)" 및 "치료하는(treating)"은 질환 또는 병태의 증상, 양태, 또는 특성의 시작 후에 이러한 증상, 양태, 또는 특성을 제거 또는 감소시키기 위해 개시되는 행동 방침(화합물 또는 약제학적 조성물의 투여와 같은)을 말한다. 이러한 치료는 절대적으로 유용할 필요는 없다.

본원에서 사용되는 용어 "치료를 필요로 하는(in need of treatment)"은 환자가 요구하거나 치료로 혜택을 받을 것이라는 의료진에 의한 판단을 말한다. 이 판단은 의료진의 전문지식 영역 내에 있지만, 본 개시의 방법 또는 화합물에 의해 치료 가능한 질환 또는 병태의 결과로서 환자가 병에 걸리거나 병에 걸릴 것이라는 지식을 포함하는 다양한 인자에 근거하여 내려진다.

본원에서 사용되는 용어 "예방을 필요로 하는(in need of prevention)"은 환자가 요구하거나 예방으로 혜택을 받을 것이라는 의료진에 의한 판단을 말한다. 이 판단은 의료진의 전문지식 영역 내에 있지만, 본 개시의 방법 또는 화합물에 의해 예방 가능한 질환 또는 병태의 결과로서 환자가 병에 걸릴 것이거나 병에 걸릴 수 있다는 지식을 포함하는 다양한 인자에 근거하여 내려진다.

본원에서 사용되는 용어 "개인의(individual)", "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"는 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 또는 영장류와 같은 포유류를 포함하는 임의의 동물, 및 인간을 말한다. 이 용어는 남성 또는 여성 또는 양쪽을 특정하거나, 남성 또는 여성을 제외시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 질환 또는 병태의 임의 증상, 양태, 또는 특성에 임의의 검출 가능한 긍정적인 효과를 줄 수 있는, 단독 또는 약제학적 조성물의 일부로서의 화합물의 양을 말한다. 이러한 효과는 절대적으로 이익이 될 필요는 없다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체와 관련될 때, 이 용어 "치료적으로 유효한 양"은 대상에서 단백뇨를 감소시키는 데 충분한 이러한 폴리펩타이드의 양을 말한다.

"약제학적으로 허용 가능한 유도체(pharmaceutically acceptable derivative)"라는 용어는, 대상에 투여시, 야생형 Angptl4의 기능을 (직접적으로나 간접적으로) 제공할 수 있는 본 개시의 Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체의 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염, 에스테르, 에스테르의 염, 용매화물 또는 다른 유도체를 의미하고; 어떤 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 감소된 LPL 저해 활성 또는 절단에 대한 저항성을 보여준다. 특히 선호되는 유도체는 이러한 폴리펩타이드가 대상에게 투여되었을 때 본 개시의 Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체의 생체이용률을 증가(예를 들어, 경구적으로 투여된 화합물이 혈액으로 더 용이하게 흡수되도록 허용함으로써), 주어진 생물학적 구획으로 이러한 폴리펩타이드의 전달을 증진, 주사에 의한 투여를 허용하도록 용해성을 증가, 대사를 변경 또는 배출 속도를 변경시키는 것이다. 하나의 구현예에서, 유도체는 전구약물이다.

"약제학적으로 허용 가능한 염(pharmaceutically acceptable salt(s))"이라는 용어는, 달리 지시하지 않는 한, 본 개시의 Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 그룹의 염을 포함한다.

"약(about)" 및 "대략(approximately)"이라는 용어는 일반적으로 측정의 성질 또는 정확성을 고려하여 측정된 양에 대한 허용 가능한 정도의 오차 또는 변화를 의미할 것이다. 전형적인 예시적 오차 또는 변화의 정도는 주어진 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 생물학적 시스템에서, "약(about)"이라는 용어는 허용 가능한 오차의 표준 편차, 바람직하게는 주어진 값의 2-배 이하를 말한다. 본원에 주어지는 수치는 달리 명시하지 않는 한 근사치로, 명시되지 않을 때 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"이라는 용어가 추론될 수 있음을 의미한다.

치료 및 예방의 방법

본 개시는 신증후군의 치료 및/또는 예방의 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로 MCD, FSGS, 및/또는 사구체간질 손상을 갖는 병태(당뇨병과 같은)의 치료 및/또는 예방의 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로 당뇨병의 병태의 치료 및/또는 예방의 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 개시는 추가로, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 및 부종과 같은 신증후군의 하나 이상의 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 개시는 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 개시는 부종을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로 하나 이상의 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 성질은 아래에 더 구체적으로 기술된다.

하나의 구현예에서, 본 개시의 교시는 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에서 신증후군의 치료 및/또는 예방을 제공한다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, 및 MPGN을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 신증후군을 치료한다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 신증후군을 치료한다. 이러한 방법은, 이러한 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

대안의 구현예에서, 본 개시의 교시는 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에서 MCD의 치료 및/또는 예방을 제공한다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 MCD를 치료한다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 MCD를 치료한다. 이러한 방법은, 이러한 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 개시의 교시는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 및 부종과 같은 신증후군의 하나 이상의 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN, 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 신증후군의 하나 이상의 증상을 경감시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 신증후군의 하나 이상의 증상을 경감시킨다. 이러한 방법은, 이러한 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 개시의 교시는 대상에서 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상은 신증후군이 있다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 단백뇨를 감소시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 단백뇨를 감소시킨다. 이러한 방법은, 이러한 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 개시의 교시는 대상에서 부종을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상은 신증후군이 있다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, MPGN 및 당뇨병성 신증을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 특정 구현예에서, 부종은 알부민과 같은 혈장 단백질의 감소된 순환 농도에 의해 야기된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 투여를 통한 단백뇨의 감소는 단백뇨를 감소시키고, 혈장 단백질 농도를 올리고, 이에 의해 부종을 감소시킬 것이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 부종을 감소시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 부종을 감소시킨다. 이러한 방법은, 이러한 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 개시의 교시는 대상에서 고콜레스테롤혈증 및/또는 고중성지방혈증을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상은 신증후군이 있다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD, FSGS, MN/MGN, 및 MPGN을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 FSGS에 의해 야기된다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 고콜레스테롤혈증 및/또는 고중성지방혈증을 감소시킨다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 고콜레스테롤혈증 및/또는 고중성지방혈증을 감소시킨다. 이러한 방법은, 이러한 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 개시의 교시는 당뇨병의 병태에 의해 야기되는 신증후군을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 본 방법은 대상에게 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 또는 10의 서열을 포함한다. 대안으로서, 아미노산 서열은 야생형 Angptl4와 유사한 활성을 갖는 임의의 전술한 서열의 단편이다. 추가의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 본원에 기술되는 유도체이고, 감소된 LPL 저해 활성을 갖도록, 절단에 저항성이 되도록, 또는 전술한 것의 조합으로 변경된다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는, 하나의 구현예에서 시알릴화된다. 이러한 유도체는 본원에 기술되는 임의의 Angptl4 폴리펩타이드를 기반으로 할 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체는 치료적으로 유효한 용량으로, 단독으로, 약제학적 조성물의 일부로서 또는 제2 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 투여는 Angptl4 기능을 제공함으로써 전술한 병태를 치료한다. 대안의 구현예에서, 이러한 투여는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 감소된 LPL 저해를 나타내거나 절단에 저항성인 Angptl4 기능과 같은 변경된 Angptl4 기능을 제공함으로써 전술한 병태를 치료한다.

Angptl4 폴리펩타이드 또는 유도체를 투여하는 일부 구현예는 혈액으로 이 폴리펩타이드를 전달하는 투여의 형태를 포함한다. 하나의 실시예에서, 이 폴리펩타이드는 정맥내 투여된다. 적절한 제형을 고려하면, 이러한 투여는 경구로, 피하로 또는 해당 분야에 알려진 다른 수단에 의해 수행될 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 유도체는 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데; 이 양은 일반적으로 화합물의 질량과 대상의 질량 비율의 어떤 범위 내일 것이다. 본 방법의 일부 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 약 0.005-150,000 ㎍/kg, 0.5-15,000 ㎍/kg, 5-1500 ㎍/kg, 또는 50-150 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 따라서, 전형적인 70 kg 인간 성인에서, 이 용량은 0.0035-11,000 mg, 0.035-1100 mg, 0.35-110 mg, 또는 3.5-11 mg일 수 있다. 투여는 정기적인 계획으로 일어날 수 있다. 본 방법의 일부 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 14 일 당 약 1 회 투여된다. 다른 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 1 개월 당 약 2 회 투여된다. 또 다른 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 1 개월 당 약 1 회 내지 1 개월 당 약 2 회 투여된다. 추가의 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 주어진 시간 당 1 회 투여된다: 1 일, 2 일, 3 일, 1 주일, 10 일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 및 1 개월.

스크리닝 방법

본 개시는 또한 신증후군 또는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 또는 부종과 같은 이와 연계되는 병태를 치료 또는 예방하는 데 유효한 화합물을 확인하는 방법과 관련된다. 하나의 구현예에서, 신증후군은 MCD 또는 MN을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 MCD를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 신증후군은 FSGS를 특징으로 한다. 추가의 구현예에서, 신증후군은 당뇨병의 병태에 의해 야기된다. 하나의 구현예에서, 당뇨병의 병태는 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환이다. 이러한 화합물은 약제학적 조성물에 포함되는 활성 성분으로서 또는 단독 투여를 위해 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 방법은, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Angptl4와 같은 폴리펩타이드가 신증후군의 병인에 연계되는 수준을 결정하는 단계를 포함한다.

일반적으로, 이러한 스크리닝 방법은, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Angptl4와 같은 신증후군의 병인에 연계되는 폴리펩타이드를 발현하는 분석 시스템(아래에 더 구체적으로 기술되는 바와 같은)을 제공하고, 이 분석 시스템으로 시험될 시험 화합물을 도입하고, 그리고 이 폴리펩타이드의 수준에 대한 이 시험 화합물의 효과 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법은 이 폴리펩타이드의 시알릴화의 수준에 영향을 주는 후보 또는 시험 화합물 또는 물질(폴리펩타이드, 기능성 핵산, 탄수화물, 항체, 작은 분자 또는 다른 분자)의 확인을 포함한다. 이러한 화합물은 확인된 화합물의 활성을 결정하기 위한 적절한 시스템(이에 제한되지 않는 예를 들어, 본원에 기술되는 동물 모델 시스템과 같은)에서 추가로 시험받을 수 있다.

후보 화합물은, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Angptl4와 같이 신증후군의 병인에 연계되는 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 이용하는 분석과 같은(그러나, 이에 제한되지 않음) 다양한 분석을 사용하거나 분리된 폴리펩타이드를 갖는 분석에서 확인된다. 다양한 분석은 이러한 폴리펩타이드의 다양한 변종(예를 들어, 전체-길이, 생물학적으로 활성인 단편, 또는 원하는 폴리펩타이드의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 단백질)을 이용할 수 있다. 더욱이, 이러한 폴리펩타이드는 임의의 적절한 포유류 종(예를 들어, 인간, 래트 또는 뮤린)으로부터 유래될 수 있으며; 특정 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 인간으로부터 유래된다.

이 분석이 전체 세포의 사용을 포함하는 경우, 이 세포는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Angptl4와 같은 신증후군의 병인에 연계되는 폴리펩타이드를 천연적으로 발현하거나, 또는 이를 발현하도록 변경될 수 있다. 후자의 경우, 세포는 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스로 세포를 감염시키는 것과 같은 통상적인 분자 생물학 기술을 통해 원하는 폴리펩타이드를 발현하도록 변경될 수 있다. 이 세포는 또한 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열로 형질감염된 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 위에서, 이러한 폴리펩타이드의 적어도 일부를 포함하는 융합 단백질 또는 단편, 전체 길이 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 예시적인 분석 시스템은 본 명세서에 기술된다.

다양한 스크리닝 분석이 본원에 논의되는 병태 및 질병 상태의 증상에 대한 시험 화합물의 효과 측정을 수반하는 생체내 분석과 조합될 수 있다. 이러한 구현예에서, 이 화합물은 신증후군 또는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨 또는 부종과 같은 이에 관련된 병태와 연계되는 변수에 영향을 주는지를 결정하도록 평가될 수 있다. 이러한 변수는 1) 신증후군 및 관련된 병태의 병인에 연계되는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Angptl4와 같은 폴리펩타이드의 농도를 결정하는 것,그리고 2) 전체, 또는 특정 성분과 관련된 단백질 분비의 수준을 결정하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구현예에서, 이러한 스크리닝 분석은, 예를 들어, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Angptl4와 같은 폴리펩타이드의 농도를 결정하고 시험 화합물의 부재시와 비교하여 이의 존재시 이러한 폴리펩타이드의 농도에 있어서의 차이를 검출하는 것에 의해 수행될 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 생체외, 생체내 또는 생체 밖(ex vivo)일 수 있고 세포 배양 기반(전체 세포 또는 용해물을 가지고) 또는 동물 모델에 기반을 둘 수 있다. 본 개시의 임의의 분석이 전술한 방법에 사용될 수 있다.

스크리인 방법에 사용하기 위한 적절한 시험 화합물은 통상적인 화합물 라이브러리와 같은 임의의 적절한 원천으로부터 얻어질 수 있다. 시험 화합물은 또한 다음을 포함하는 해당 분야에 알려진 조합 라이브러리 방법에서 임의의 많은 접근법을 사용하여 얻어질 수 있다: 생물학적 라이브러리, 공간적으로 주소 지정 가능한 병렬 고체 상 또는 용액 상 라이브러리, 디콘볼루션(deconvolution)을 요하는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용한 합성 라이브러리 방법. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리에 제한되는 한편, 다른 4 가지 접근법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용 가능하다. 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 해당 분야에서 발견될 수 있다. 화합물의 라이브러리는 용액에서, 또는 비드, 박테리아, 포자, 플라스미드 또는 파아지에 제시될 수 있다.

본 개시는 또한 본 개시의 임의의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공하는데, 이는 본원에 개시되거나 달리 본 개시의 방법을 실시하는 데 유용한 임의의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있다.

Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 작성 및 선택

안지오포이에틴-관련 단백질 4는 인간에서 ANGPTL4 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드이다. 이 유전자는 안지오포이에틴/안지오포이에틴-유사 유전자 패밀리의 구성원이고, N-말단 신호 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 1-22), 이중 코일 영역(coiled-coil domain)(서열번호 1의 아미노산 잔기 23-170), 링커 영역(서열번호 1의 아미노산 잔기 171-185) 및 피브리노겐 C-말단 영역(서열번호 1의 아미노산 잔기 186-406)을 갖는 글리코실화된, 분비된 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 내피 세포에서 저산소 조건 하에 유도되고 퍼옥시좀 증식 활성체의 표적이다. 코딩된 단백질은 포도당 항상성, 지질 대사, 그리고 인슐린 감수성 조절에 직접적으로 연계되는 혈청 호르몬이고, 또한 혈관 내피 세포의 세포사멸 생존 인자로서 작용한다. 다른 동형을 코딩하는 선택적으로 이어진(spliced) 전사 변종이 기술되어 있다. 이 유전자는 이전에 ANGPTL2로 언급되었지만 ANGPTL4로 다시 명명되었다.

Angptl4는 LPL 이량체 분자를 분해함으로써 LPL을 저해한다. Angptl4는 명백히 혈장 중성지방(TG) 클리어런스의 강력한 저해제로서 설정되어, 혈장 TG 농도의 증가를 야기한다. 최근의 증거는, 감소된 LPL 저해를 시사하는 감소된 중성지방 농도를 부여하는 어떤 돌연변이로, Angptl4 폴리펩타이드 서열에서의 변화가 중성지방에 대한 효과에 영향을 준다는 것을 지적한다(33 및 34, 각각 Angptl4 변종의 교시에 대한 참조로서 도입됨). 더욱이, Angptl4 폴리펩타이드는 올리고머 형태로 존재한다는 것과 올리고머화는 LPL 활성의 저해에 요구된다는 것이 보고되었다. 일단 세포로부터 분비되면, 올리고머 형태는 절단 부위(서열번호 1 및 3의 R₁₆₁RKR₁₆₄)에서 절단되어 모노머 C-말단 형태 및 올리고머 N-말단 형태를 제공한다(34). Angptl4 펩타이드의 N-말단 잔기 1-187은 LPL을 저해하기에 충분하다는 것이 발견되었다(33).

인간, 래트 및 마우스의 아미노산 및 cDNA 서열은 도 5에 제공되고 서열번호 1-8로 지정된다. 본 개시는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 치료 및 예방의 방법과 같은 본원에 개시된 방법에서 Angptl4 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 유도체의 용도를 예상한다. 본원에서 정의되듯이, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 서열번호 1 또는 3에 나타낸 인간 폴리펩타이드 또는 서열번호 5 또는 7에 나타낸 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 결정된 바와 같은 하나 이상의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 Angptl4 폴리펩타이드를 말한다.

Angptl4 유도체의 일부 구현예는, 본원에 기술되듯이 하나 이상의 치환을 갖는, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7 중 임의의 둘 이상의 사이에서 공통 서열인 코어 구조를 포함한다. Angptl4 유도체의 한 구현예는 서열번호 1 및 3(인간 Angptl4의 두 버전) 사이의 공통 서열을 포함하는데; 이 공통 서열은 다음을 포함한다:

A―B―C

여기에서, A는 서열번호 26과 적어도 80% 상동성이고, B는 0-38 잔기의 올리고펩타이드이고(선택적 연결 영역), 그리고 C는 서열번호 27과 적어도 80% 상동성이다. A의 서열번호 26에 대한, 그리고 C의 서열번호 27에 대한 상동성 수준은 물론 80% 보다 높을 수 있다. 이 상동성 수준은 80-100%로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 및 100%일 수 있다. 올리고펩타이드 B의 서열은 임의의 서열일 수 있다. 올리고펩타이드 B의 일부 구현예는 서열번호 1의 184-222 위치와 적어도 50% 상동성이다. 이러한 구현예에서, 상동성의 수준은 예시적인 목적인 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 및 100%를 포함하는 50-100% 범위의 임의의 점으로부터 선택될 수 있다.

Angptl4 유도체의 다른 구현예는 서열번호 1, 3, 5 및 7(인간 변종, 래트 및 마우스) 모두의 사이에서 공통 서열을 포함하는데; 이 공통 서열은 다음을 포함한다:

V―W―X―Y―Z

여기에서, V는 서열번호 23에 대하여 적어도 80% 상동성을 갖고, W는 0-5 잔기의 올리고펩타이드이고, X는 서열번호 24에 대하여 적어도 80% 상동성을 갖고, Y는 0-38 잔기의 올리고펩타이드이고(선택적 연결 영역), 그리고 Z는 서열번호 25에 대하여 적어도 80% 상동성을 갖는다. V의 서열번호 23에 대한, X의 서열번호 24에 대한, 그리고 Z의 서열번호 25에 대한 상동성 수준은 80% 보다 높을 수 있다. 이 상동성 수준은 80-100%로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 및 100%일 수 있다. 올리고펩타이드 Y의 서열은 임의의 서열일 수 있다. 올리고펩타이드 B의 일부 구현예는 서열번호 1의 184-222 위치와 적어도 50% 상동성이다. 이러한 구현예에서, 상동성의 수준은 예시적인 목적인 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 및 100%를 포함하는 50-100% 범위의 임의의 점으로부터 선택될 수 있다.

이들 공통 서열은 서열번호 1의 39, 40, 46, 50, 및 53 위치에 상응하는 위치에서의 치환을 허용하는데, 이는 본 개시에서 교시된 바와 같이 LPL 저해 활성을 감소시키는 작용을 할 수 있다. 이들은 또한 서열번호 1의 63-66 위치에 상응하는 위치에서의 치환을 허용하는데, 이는 본 개시에서 교시된 바와 같이 절단에 대한 이 단백질의 저항성을 증가시키는 작용을 할 수 있다. 이들은 또한, 서열번호 1의 5, 67, 72, 77, 167, 174, 190, 230, 233, 237, 251, 266, 278, 291, 293, 296, 307, 308, 336, 338, 349, 361, 371, 및 384 위치에 상응하는 위치에서의 치환을 허용하는데, 이들은 UniProt(www.uniprot.org) 검색에 의해 알려진 천연적인 인간 변종의 위치로 밝혀졌다. Angptl14 유도체의 특정 구현예는 이들 위치에서의 다음 치환의 하나 이상을 포함한다: P5L, S67R, R72L, G77R, E167K, P174S, E190Q, E196K, R230C, G233R, F237V, P251T, T266M, R278Q, V291M, L293M, E296V, P307S, V308M, R336C, D338E, W349C, G361R, G361S, R371Q, 및 R384W. 천연적으로 존재하는 이러한 치환은 단백질의 기능을 보존하는 것으로 예상될 것이다.

하나의 구현예에서는, Angptl4 폴리펩타이드의 아미노산 잔기가 제거되고 다른 아미노산 잔기로 교체된다. 이 변종은 본원에서 기술되거나 해당 분야에 알려진 바와 같이 구축될 수 있다. 이렇게 구축된 변종은 활성을 스크리닝하기 위한 본원에 기술되는 방법 및 분석을 사용하여 평가될 수 있다.

본원에서 사용될 때, 아미노산을 언급하기 위해 사용되는 한 글자는 다음 의미를 갖는다:

하나의 구현예에서, 변종은 LPL을 저해하는 능력을 저하시키거나 절단에 저항성이 되는, Angptl4 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서의 변경을 포함한다. 이 변경은 이 영역에서 하나 이상의 잔기의 교체, 결실 및/또는 치환일 수 있다. 이러한 변경은 해당 분야에 기술되어 있다(이러한 교시를 위해 참조로 도입되는 참고문헌 33 및 34 참조). 하나의 구현예에서, 이러한 변경은 서열번호 1에 대하여 잔기 1-187, 서열번호 3의 잔기 1-182, 서열번호 26의 잔기 1-182, 서열번호 23에서 임의의 잔기, 및 서열번호 24에서 잔기 1-79에서 일어난다.

Angptl4 유도체의 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 유도체는 서열번호 1의 위치 39-55(DEMNVLAHGLLQLGQGL)에서 인간의 야생형 서열과 다른데; 이 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 23, 및 26의 위치 39-55에 상응한다. 이 유도체의 추가 구현예는 DEMNVLAHGLLQLGQGL(서열번호 1의 위치 39-55)도 아니고 DKMNVLAHGLLQLGQGL(서열번호 28)도 아닌 위치 39-55에서의 서열을 포함한다. Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 추가 구현예는 V의 위치 39-40이 DE가 아니고, V의 위치 46이 H가 아니고, V의 위치 50이 Q가 아니고 V의 위치 53이 Q가 아니도록 위치 39, 40, 46, 50, 및 53에서 적어도 하나의 치환을 갖는다.

일부 구현예에서, 이러한 변경은 서열번호 1, 3, 5, 7, 23, 또는 26에 대하여 위치 40에서 일어난다. 하나의 구현예에서, 위치 40의 아미노산 잔기(야생형 Angptl4에서 음으로 하전된 글루탐산 잔기)가 중성 아미노산 또는 양으로 하전된 아미노산으로 교체된다. 특정 구현예에서, 변경은 E40K 치환이다. 다른 특정 구현예에서, 변경은 E40A 치환이다. E40K 및 E40A 치환은 Angptl4에 의한 LPL 저해를 감소시키지만, 이 폴리펩타이드의 발현, 분비, 프로세싱 및 다른 기능은 간섭하지 않는 것을 보여준다. 추가의 특정 구현예에서, 위치 40에서의 변경은 아래 표 1에 나타낸 것들로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 서열번호 1, 3, 5, 7, 23, 또는 26의 위치 39에서의 아미노산(야생형 Angptl4에서 음으로 하전된 아스파르트산 잔기)이 중성 또는 양으로 하전된 아미노산으로 교체된다. 하나의 구현예에서, 치환은 D39K 치환 또는 D39A 치환이다. 추가의 특정 구현예에서, 서열번호 1, 3, 5, 7, 23, 또는 26의 위치 39에서의 치환은 아래 표 1에 나타낸 것들로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 폴리펩타이드 변종은 위에 언급된 위치 40에서의 변경 중 하나, 위에 언급된 위치 39에서의 변경 중 하나 또는 전술한 것의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 D39K 치환 및 E40K 치환, D39A 치환 및 E40K 치환 또는 D39K 치환 및 E40A 치환을 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 이 폴리펩타이드 유도체의 위치 39-40의 서열은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: DK, KE, DA, 및 AE. 또 다른 구현예에서, 이 폴리펩타이드 유도체의 위치 39-40의 서열은 DE가 아니다.

표 1: 인간 Angptl4 단백질에서 D 39 및 E 40 의 변경
G	P	V	L	I	M	C	F	Y
W	H	R	Q	N	S	T

다른 구현예에서, 이 유도체는 이 폴리펩타이드의 절단에 책임이 있는 Angptl4 폴리펩타이드의 영역에서 하나 이상의 변경을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이 영역은 Angptl4의 R₁₆₁RKR₁₆₄ 영역(서열번호 1, 3, 5, 7, 및 26의 위치 161-164; 및 서열번호 24의 위치 63-66)이다. 이 변경은 이 영역에서 하나 이상의 잔기의 교체, 결실 및/또는 치환일 수 있다. R₁₆₁RKR₁₆₄ 영역은 Angptl4의 올리고머 형태의 절단에 책임이 있어, N-말단 서열의 올리고머와 C-말단 서열의 모노머를 방출하는 것으로 나타났다. 돌연변이된 절단 위치를 갖는 Angptl4 형태는 야생형 폴리펩타이드보다 순환에서 더 높은 수준으로 축적되는 것으로 나타났다. 더욱이, Angptl4 폴리펩타이드의 절단을 방지하는 것은 본 개시에서 효과적인 것으로 관찰된 Angptl4의 올리고머 형태를 안정화시킨다. 하나의 구현예에서, R₁₆₁RKR₁₆₄ 영역의 4 개 아미노산 잔기 모두는, 이 서열이 RRKR가 아니도록 변경되고; 대안적인 구현예에서는, R₁₆₁RKR₁₆₄ 영역의 임의의 1, 2 또는 3 아미노산 잔기가 변경된다. 추가의 구현예에서, 위치 161, 162 또는 164에서의 아르기닌 잔기는 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린 또는 세린으로 치환되고, 위치 163에서 리신 잔기는 글리신, 알라닌, 발린 또는 세린으로 치환된다. 특정 구현예에서, R₁₆₁RKR₁₆₄ 서열은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열로 교체된다: GAAG(서열번호 29), GSGS(서열번호 80), GVVA(서열번호 49), SGGG(서열번호 87), 및 VAVA(서열번호 90). 추가의 특정 구현예에서, R₁₆₁RKR₁₆₄ 서열은 AAVV로 교체된다. 서열번호 1 또는 3의 전체 R₁₆₁RKR₁₆₄ 영역의 교체를 위한 예시적인 아미노산 서열은 아래 표 2에 제공된다.

표 2: Angptl4 단백질 또는 유도체에서 161RRKR164의 변경
서열번호		서열번호		서열번호		서열번호		서열번호		서열번호		서열번호
29	GAAG	38	GAAV	47	GAVV	56	GVVV	65	GAAA	74	AVVV	83	SGSG
30	GAGA	39	GAVA	48	GVAV	57	VGVV	66	AGAA	75	VAVV	84	SGGS
31	GGAA	40	GVAA	49	GVVA	58	VVVG	67	AAAG	76	VVVV	85	SSGG
32	AGGA	41	AGVA	50	AGVV	59	VVGV	68	AAGA	77	SSSS	86	GSGG
33	AGAG	42	AGAV	51	AVVG	60	VAVG	69	AAVV	78	GGGG	87	SGGG
34	AAGG	43	AAVG	52	AVGV	61	VVGA	70	AAVA	79	AAAA	88	GGSG
35	VGAA	44	AAGV	53	VGAV	62	VVAG	71	AAAV	80	GSGS	89	GGGS
36	VAAG	45	AVAG	54	VGVA	63	VVVA	72	AVAA	81	GSSG	90	VAVA
37	VAGA	46	AVGA	55	VAGV	64	VVAV	73	VAAA	82	GGSS

추가의 구현예에서, R₁₆₁RKR₁₆₄ 서열에서 하나 이상의 아미노산은, Angptl4가 절단에 저항성이 되도록, Angplt4를 절단할 수 있는 효소의 공통 결합 부위를 제거하기 위해 변경된다. 하나의 구현예에서, 이 효소는 프로단백질 전환효소이고 공통 결합 부위는 RXKR, RXRR, RR 또는 KR로, 여기에서 X는 임의의 아미노산이다. 이러한 변경을 만드는 데 있어서, 하나 이상의 아미노산은 결실되거나 글리신, 알라닌, 발린 또는 세린으로, 또는 본원에서 논의되는 임의의 다른 치환으로 치환될 수 있다.

다른 추가의 구현예에서, 변종은 이 폴리펩타이드의 올리고머화에 책임이 있는 Angptl4 폴리펩타이드의 영역에서 하나 이상의 변경을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이 영역은 Angptl4의 C₇₆ 및/또는 C₈₀ 영역이다. C₇₆ 및/또는 C₈₀ 영역은 Angptl4 폴리펩타이드의 올리고머화에 연계되는 것으로 나타났다(34, 이 참고문헌은 이러한 교시를 위해 본원에 참조로 도입된다). 이 변경은 이 영역에서 하나 이상의 잔기의 교체, 결실 및/또는 치환일 수 있다. 특정 구현예에서, 위치 76 및 80에서 단지 하나의 시스테인 잔기가 치환되고; 대안적인 구현예에서는, 위치 76 및 80에서 두 시스테인 잔기가 둘 다 치환된다. 하나의 구현예에서, 위치 76 및 80에서 적어도 하나의 시스테인 잔기가 독립적으로 알라닌 또는 세린으로 치환되고; 다른 구현예에서는 시스테인 잔기 둘 다 알라닌 또는 세린으로 치환된다.

추가의 구현예에서, 변종은 Angptl4의 R₁₆₁RKR₁₆₄ 영역에서 Angptl4 폴리펩타이드 올리고머의 절단을 저해하는 하나 이상의 변경 및 Angptl4에 의한 LPL 활성 저해를 감소시키는 위치 40에서의 변경을 포함한다. 본원에서 논의되는 임의의 변경이 포함된다.

하나의 구현예에서, 본 개시는 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 갖는 Angptl4 폴리펩타이드 변종을 제공한다. 서열번호 9는 도 4에 나타내는데, 각각 X₃₉, X₄₀, X₇₆, X_{80 ,} X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄로 표시되는 위치 39, 40, 76, 80 및 161-164에서의 치환을 제외하고는, 서열번호 1로부터의 Angptl4의 야생형 서열을 포함한다. 서열번호 10은 도 4에 나타내는데, 각각 X₃₉, X₄₀, X₇₆, X_{80 ,} X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄로 표시되는 위치 39, 40, 76, 80 및 161-164에서의 치환을 제외하고는, 서열번호 3으로부터의 Angptl4의 야생형 서열을 포함한다.

서열번호 9 및 10에서, X₃₉는 A, G, P, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, R, Q, N, S, T 또는 K일 수 있다. 하나의 구현예에서, X₃₉는 중성 또는 양으로 하전된 아미노산이다. 추가의 구현예에서, X₃₉는 A 또는 K일 수 있다. 다른 추가의 구현예에서, X₃₉는 D일 수 있다.

서열번호 9 및 10에서, X₄₀은 A, G, P, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, R, Q, N, S, T 또는 K일 수 있다. 하나의 구현예에서, X₄₀은 중성 또는 양으로 하전된 아미노산이다. 추가의 구현예에서, X₄₀은 A 또는 K일 수 있다. 다른 추가의 구현예에서, X₄₀은 E일 수 있다. 또 다른 추가의 구현예에서, X₃₉가 D가 아닐 때 X₄₀은 E일 수 있고 X₄₀이 E가 아닐 때 X₃₉는 D일 수 있다.

서열번호 9 및 10에서, X₇₆ 및 X₈₀ 중 적어도 하나는 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, X₇₆ 및 X₈₀는 독립적으로 A 또는 S 또는 C이다. 하나의 구현예에서, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S일 수 있고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이다. 추가의 구현예에서, X₇₆ 및 X₈₀은 둘 다 독립적으로 A 또는 S일 수 있다. 다른 추가의 구현예에서, X₇₆ 및 X₈₀는 둘 다 C일 수 있다.

서열번호 9 및 10에서, X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 적어도 하나는 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 4 개 모두가 치환되고; 대안적인 구현예에서, X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 1, 2 또는 3 개가 치환된다. 추가의 구현예에서, X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 독립적으로 D, R, K, G, A, V 또는 S이다. 다른 추가의 구현예에서, 4 개 모두는 표 2에 인용된 조합으로 치환된다.

본 개시는 임의 형태의 전술한 조합을 예상한다. 추가로, 서열번호 9 및 10에서 지정된 잔기는 표 3에서 지정된 보존적 아미노산 치환으로, 또는 +/- 1 이하의 수치 지수(hydropathic index)에서의 차이를 갖는 잔기로, 또는 +/- 1 이하의 친수성 값에서의 차이를 갖는 잔기로 치환될 수 있다.

하나의 구현예에서, X₃₉은 D이고, X₄₀은 A 또는 K이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄은 독립적으로 D, R, K, G, A, V 또는 S로 치환되는데, 단 선택적으로 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 적어도 하나는 서열번호 1 또는 3에서 발견되지 않는 아미노산이다. 다른 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 A 또는 K이고, X₇₆ 및 X₈₀는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 표 2에 나타낸 조합으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 A 또는 K이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 GSGS 또는 GAAG이다.

추가의 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 A 또는 K이고, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S이고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 는 독립적으로 D, R, K, G, A, V 또는 S로 치환되는데, 단 선택적으로 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 적어도 하나는 서열번호 1 또는 3에서 발견되지 않는 아미노산이다. 추가의 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 A 또는 K이고, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S이고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 표 2에 나타낸 조합으로부터 선택된다. 다른 추가의 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 A 또는 K이고, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S이고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 GSGS 또는 GAAG이다.

하나의 구현예에서, X₃₉는 A 또는 K이고, X₄₀은 E이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 독립적으로 D, R, K, G, A, V 또는 S로 치환되는데, 단 선택적으로 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 적어도 하나는 서열번호 1 또는 3에서 발견되지 않는 아미노산이다. 다른 구현예에서, X₃₉는 A 또는 K이고, X₄₀은 E이고, X₇₆ 및 X₈₀는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 표 2에 나타낸 조합으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, X₃₉는 A 또는 K이고, X₄₀은 E이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄은 GSGS 또는 GAAG이다.

하나의 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 K이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 독립적으로 D, R, K, G, A, V 또는 S로 치환되는데, 단 선택적으로 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 적어도 하나는 서열번호 1 또는 3에서 발견되지 않는 아미노산이다. 다른 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 K이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄은 표 2에 나타낸 조합으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 K이고, X₇₆ 및 X₈₀은 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄은 GSGS 또는 GAAG이다.

하나의 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 K이고, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S이고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄는 독립적으로 D, R, K, G, A, V 또는 S로 치환되는데, 단 선택적으로 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄ 중 적어도 하나는 서열번호 1 또는 3에서 발견되지 않는 아미노산이다. 다른 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 K이고, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S이고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄은 표 2에 나타낸 조합으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, X₃₉는 D이고, X₄₀은 K이고, X₇₆ 및 X₈₀ 중 하나는 A 또는 S이고 X₇₆ 및 X₈₀ 중 다른 하나는 C이고 X₁₆₁, X₁₆₂, X₁₆₃ 및 X₁₆₄은 GSGS 또는 GAAG이다.

하나의 구현예에서, Angptl4 유도체는 Angplt4의 단편을 기반으로 한다. 적절한 단편은 야생형 Angplt4의 활성을 유지하는 임의의 단편 또는 100 이상의 보존적 아미노산의 임의의 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이러한 단편은 서열번호 1의 아미노산 1-187 또는 서열번호 3의 아미노산 1-182를 기반으로 한다. 이러한 단편은 앞서의 문단에서 기술된 아미노산 치환을 가질 수 있다.

Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 야생형 Angptl4 폴리펩타이드 활성과 비교하여 유사하거나 증가된(하나의 구현예에서, 50% 이상) 활성을 가질 수 있고; 대안적으로, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 야생형 Angptl4 폴리펩타이드 활성과 비교하여 감소된(하나의 구현예에서, 50% 미만) 활성을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 감소된 LPL 저해 능력을 갖고 절단에 대하여 증가된 저항성을 보여준다.

원하는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 생성하기 위해, 해당 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이 결실, 부가 및 치환이 선택될 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 치환은 용인될 것으로 예상된다. 또한, 특정의 결실, 삽입 및 치환은 어떤 Angptl4 폴리펩타이드 활성에 긍정적 또는 부정적으로 영향을 주지만 다른 Angptl4 폴리펩타이드 활성에는 영향을 주지 않을 수 있다.

이의 조합을 포함하는 서열번호 1 또는 3 또는 5 또는 7의 임의의 아미노산 서열에 대한 보존적 변경(및 코딩 뉴클레오타이드에 대한 상응하는 변경)은, LPL 저해 활성과 같은 원치 않는 특성은 최소화하면서, 천연적으로 존재하는 Angptl4 폴리펩타이드의 것과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 생산할 것이다. 대조적으로, Angptl4 폴리펩타이드의 기능적 및/또는 화학적 특성에서의 실질적인 변경은, 이의 조합을 포함하는 서열번호 1 또는 3 또는 5 또는 7의 임의의 아미노산 서열에서, 치환 영역에서 분자 골격의 구조를 유지하는 데 대한 효과에 상당한 차이가 있는 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다.

예를 들어, "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 하전에 대하여 거의 또는 아무 영향이 없도록 천연적 아미노산 잔기를 비천연적 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 폴리펩타이드에서 임의의 천연적 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있다.

보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서의 합성에 의하기보다 화학적 펩타이트 합성에 의해 전형적으로 도입되는 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 포함한다. 이들은 펩티도미메틱(peptidomimetics) 및 다른 반전되거나 뒤집힌 형태의 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에 기술되는 핵산 및 폴리펩타이드 분자가 재조합 수단에 의해 생산될 뿐 아니라 화학적으로 합성될 수 있다는 것은 해당 분야의 당업자에 의해 인정될 것이다.

천연적으로 존재하는 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기반으로 분류될 수 있다: 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) 중성의 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: His, Lys, Arg; 5) 사슬 배향에 영항을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비-보존적 치환은 이들 계열의 하나의 구성원을 다른 계열의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 이렇게 치환된 잔기는 비-인간 Angptl4 폴리펩타이드 오소로그(orthologs)와 상동성인 Angptl4 폴리펩타이드 유도체의 영역으로, 또는 이 분자의 비-상동성 영역으로 도입될 수 있다.

이러한 변경을 만드는 데 있어서, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성 및 전하 특성에 기초하여 수치 지수(hydropathic index)가 할당되는데, 이들은 다음과 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질에서 상호적인 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 아미노산 수치 지수(hydropathic index)의 중요성은 해당 분야에서 이해된다(Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131, 1982). 어떤 아미노산이 유사한 수치 지수(hydropathic index) 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되고 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있다는 것이 알려져 있다.

수치 지수(hydropathic index)를 기반으로 하는 변경을 만드는 데 있어서, 수치 지수(hydropathic indices)가 +/- 2 이내인 아미노산의 치환이 사용될 수 있으며; 대안적인 구현예에서, 수치 지수(hydropathic indices)는 +/- 1이고; 다른 대안적인 구현예에서, 수치 지수(hydropathic indices)는 +/- 0.5 이내이다.

친수성에 기초하여 유사한 아미노산의 치환이 효과적으로 만들어질 수 있다는 것도 해당 분야에서 이해되고 있다. 인접 아미노산의 친수성에 의해 통제되는 폴리펩타이드의 가장 큰 국소적 평균 친수성은 단백질의 생물학적 특성과 상관된다.

다음 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0.+-.1); 글루타메이트 (+3.0.+-.1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5.+-.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

유사한 친수성 값을 기반으로 변경을 만드는 데 있어서, 친수성 값이 +/- 2 이내인 아미노산의 치환이 사용될 수 있으며; 대안적인 구현예에서, 친수성 값은 +/- 1이고; 다른 대안적인 구현예에서, 친수성 값은 +/- 0.5 이내이다.

요망되는 아미노산 치환(보존적이거나 비-보존적)은 이러한 치환이 요망될 때 해당 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 Angptl4 폴리펩타이드의 중요한 잔기를 확인하기 위해, 또는 Angptl4 폴리펩타이드 활성을 증가 또는 감소시키기 위해 특정 결합 표적에 대한 Angptl4 폴리펩타이드의 친화성을 증가 또는 감소시키도록 사용될 수 있다.

예시적인 아미노산 치환은 표 3에 나타낸다.

표 3: 아미노산 치환
원래의 아미노산	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn	Glu	Glu
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser, Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
Glu	Asp	Asp
Gly	Pro, Ala	Ala
His	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신	Leu
Leu	Ile, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신	Ile
Lys	Arg, 1,4-디아미노부티르산, Gln, Asn	Arg
Met	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro	Ala, Gly	Gly
Ser	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr, Phe	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 노르류신	Leu

당업자는 공지의 기술을 사용하여, 이의 조합을 포함하는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 10, 및 23-27 중 임의의 것으로 나타낸 폴리펩타이드의 적절한 변종을 결정할 수 있다. 활성을 파괴하지 않고 변경될 수 있는 분자의 적절한 영역을 확인하기 위해, 해당 분야의 당업자는 활성에 중요하다고 믿어지지 않는 구역을 목표로 할 수 있다. 예를 들어, 동종 또는 다른 종으로부터 유사한 활성을 갖는 유사한 폴리펩타이드가 알려질 때, 해당 분야의 당업자는 Angptl4 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 이러한 유사 폴리펩타이드와 비교할 수 있다. 이러한 비교로, 유사한 폴리펩타이드 사이에 보존되는 분자의 부분 및 잔기를 확인할 수 있다. 이러한 유사 폴리펩타이드와 비교하여 보존되지 않은 Angptl4 폴리펩타이드의 구역에서의 변경은 Angptl4 폴리펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 덜 부정적으로 영향을 줄 것임이 인정될 것이다. 해당 분야의 당업자는 또한 비교적 보존된 영역에서조차 활성을 유지하면서 화학적으로 유사한 아미노산으로 천연적으로 존재하는 잔기를 치환(보존적 아미노산 잔기 치환)할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 구역에서조차 생물학적 활성을 파괴하지 않거나 폴리펩타이드 구조에 부정적으로 영향을 주지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있다.

또한, 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩타이드에서 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 고려하여, 유사한 폴리펩타이드에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 Angptl4 폴리펩타이드에서의 아미노산 잔기의 중요성을 예상할 수 있다. 해당 분야의 당업자는 이렇게 예상된 Angptl4 폴리펩타이드의 중요한 아미노산 잔기에 대하여 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

해당 분야의 당업자는 또한 유사한 폴리펩타이드에서 그 구조와 관련된 아미노산 서열 및 3-차원 구조를 분석할 수 있다. 이 정보를 고려하여, 해당 분야의 당업자는 그 3 차원 구조에 대하여 Angptl4 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 정렬을 예상할 수 있다. 이러한 잔기는 다른 분자와 중요한 상호작용에 연계될 수 있으므로, 해당 분야의 당업자는 단백질의 표면에 있을 것으로 예상되는 아미노산 잔기에 라디칼 변경을 주지 않도록 선택할 수 있다. 더욱이, 해당 분야의 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에서 단일의 아미노산 치환을 포함하는 시험용 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 만들어낼 수 있다. 다음에 이 유도체는 해당 분야의 당업자에게 알려지고 본원에 개시되는 활성 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 유도체는 적절한 치환에 관한 정보를 모으는 데 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 대한 변경이 파괴되거나, 원치 않게 감소되거나, 부적절한 활성을 야기한다는 것을 발견한다면, 이러한 변경을 갖는 유도체는 회피될 것이다. 즉, 이러한 일상적인 실험으로부터 수집된 정보를 기반으로, 해당 분야의 당업자는 추가의 치환이 단독으로, 또는 다른 돌연변이와 조합하여 회피되어야 하는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

많은 과학적 발표가 아미노산 서열의 분석으로부터 2차 구조의 예상에 기여하고 있다(Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245, 1974; Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222, 1974; Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148, 1978; Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276, 1979; and Chou et al., Biophys. J., 26:367-384, 1979 참조). 또한, 컴퓨터 프로그램이 현재 폴리펩타이드의 2차 구조 예측을 보조하는 데 이용 가능하다. 예로는 Jameson-Wolf 분석에 기반을 둔 프로그램(Jameson et al., Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186, 1998; and Wolf et al., Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191; 1988), PepPlot.RTM. 프로그램(Brutlag et al., CABS, 6:237-245, 1990; and Weinberger et al., Science, 228:740-742, 1985), 및 단백질 4차 구조 예측을 위한 다른 새로운 프로그램(Fetrow. et al., Biotechnology, 11:479-483, 1993)이 있다.

또한, 컴퓨터 프로그램이 현재 2차 구조 예측을 보조하는 데 이용 가능하다. 2차 구조를 예측하는 하나의 방법은 상동성 모델링에 기반을 둔다. 예를 들어, 30% 보다 큰 서열 동일성, 또는 40% 보다 큰 유사성을 갖는 2 개의 폴리펩타이드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 위상관계를 갖는다. 단백질 구조 데이터 베이스(PDB)의 최근의 성장은 폴리펩타이드 또는 단백질 구조 내 접힘의 잠재적 수를 포함하여 2차 구조의 증가된 예측성을 제공한다(Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247, 1999 참조).

2차 구조 예측의 추가적 방법은 "쓰레딩(threading)"(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87, 1997; Suppl et al., Structure, 4(1):15-9, 1996), "프로파일 분석(profile analysis)"(Bowie et al., Science, 253:164-170, 1991; Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159, 1990; and Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358, 1987), 및 "진화적 연결(evolutionary linkage)"(Home, supra, and Brenner, supra 참조)을 포함한다.

본원에서 논의되는 임의의 폴리펩타이드 형태는 또한 이 폴리펩타이드의 확인 또는 정제에 유용한 서열을 포함할 수 있으며; 이러한 서열의 예는 C-말단 V5 태그이다. 이는 또한, 본원에 기술되는 폴리펩타이드를 포함하여, 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(이에 제한되지 않는 예를 들어, cDNA 서열과 같은)을 포함한다.

조성물

본 개시의 유용한 조성물은, 본 개시의 치료 및 예방 방법에 유용한 본 개시의 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며; 유용한 조성물은 또한 본 개시의 치료 및 예방 방법에 유용한 본 개시의 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 개시된 조성물은 하나 이상의 이러한 화합물을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예 및 제형화 방법은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20^th Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer, editor)에서 발견될 수 있다. 투여에 적절한 약제학적으로 허용 가능한 조성물을 형성하기 위해, 이러한 조성물은 치료적으로 유효한 양의 화합물을 포함할 것이다.

본 개시의 약제학적 조성물은 본 개시의 치료 및 예방 방법에 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 본원에 개시되는 치료 및 예방 방법에 유효하도록 치료적으로 유효한 양의 화합물(들)을 전달하기에 충분한 양으로 대상에게 투여된다. 치료적으로 유효한 양은, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 대상의 병태, 체중, 성별 및 연령과 같은 다양한 인자에 따라 변화할 수 있다. 약제학적 조성물은 해당 분야에 알려진 임의의 방법으로 대상에게 제공될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 피하, 정맥내, 국소, 피부표면, 경구, 골내, 및 근육내를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 조성물은 대상에게 단 1 회 또는 대상에게 1 회보다 많이 투여될 수 있다. 또한, 조성물이 대상에게 1 회보다 많이 투여될 때, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 1 일 당 1 회, 1 주 당 1 회 또는 1 개월 당 1 회와 같은 다양한 요법이 사용될 수 있다. 치료적으로 유효한 양 및 적절한 투여 요법은, 임의의 잠재적인 부작용을 최소화하면서 최적의 활성을 얻기 위한 일상적인 시험에 의해 확인될 수 있다. 또한, 다른 약제와의 공동-투여 또는 순차적 투여가 요망될 수 있다.

치료적으로 유효한 양은 화합물의 질량과 대상의 질량 사이 비율의 범위일 수 있다. 조성물의 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 양은 약 0.005-150,000 ㎍/kg, 0.5-15,000 ㎍/kg, 5-1500 ㎍/kg, 또는 50-150 ㎍/kg이다. 따라서, 전형적인 70 kg 인간 성인에서, 치료적으로 유효한 양은 0.0035-11,000 mg, 0.035-1100 mg, 0.35-110 mg, 또는 3.5-11 mg일 수 있다. 투여는 규칙적인 계획에 따라 실시될 수 있다.

본 개시의 조성물은 정맥내 투여와 같이 전신적으로, 또는 피하 주사에 의하거나 파스타제 또는 크림제의 적용에 의해 국소적으로 투여될 수 있다. Angptl4 폴리펩타이드 또는 유도체를 포함하는 조성물의 일부 구현예에서, 약제는 이 폴리펩타이드를 혈액으로 전달하기에 적절할 것이다. 이러한 적절한 종류의 약제는 정맥내 제형, 근육내 제형, 경피 파스타제 또는 크림제, 경피 패치제, 좌제, 및 폴리펩타이드를 소화로부터 보호하는 경구용 제형을 포함한다.

하나의 구현예에서, 본 개시의 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 변종을 코딩하는, 적절한 플라스미드 또는 벡터의 형태일 수 있는 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은, 해당 분야에서 알려진 적절한 방법(예를 들어, 전기천공)에 의해 대상으로부터 얻어질 수 있는 세포로 도입된다. 하나의 구현예에서, 이 세포는 지방 세포이다. 이 세포는 Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체의 발현을 위해 분석될 수 있다(하나의 구현예에서, 폴리펩타이드의 발현은 본원에서 논의되는 바와 같이 폴리펩타이드 상의 태그의 존재에 의해 결정될 수 있다). Angptl4 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유도체를 발현하는 세포는 다음에 대상으로 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이 세포는 피하 주사에 의해 대상에게 투여되는데; 본원에서 논의되는 것들을 포함하여, 다른 투여 방법도 사용될 수 있다. 다음에, 이 세포는 Angptl4 폴리펩타이드 또는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 발현하고, 이는 순환으로 들어간다.

본 개시의 조성물은 화합물(들)의 용해성, 반감기, 흡수 등을 개선하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 개시의 조성물은 원치 않는 부작용을 경감시키고/시키거나 화합물(들)의 독성을 감소시키는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 물질의 예는, 이에 제한되지 않는 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20^th Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer, editor)와 같은 다양한 교재에 기술되어 있다.

본 개시의 조성물은 투여를 위한 매우 다양한 제형으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이 조성물은, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 정제, 캡슐, 사쉐(sachets), 로젠지(lozenges), 트로키제(troches), 필(pills), 산제, 과립제, 엘릭서제, 틴크제, 액제, 현탁액, 엘릭서제, 시럽제, 연고제, 크림제, 파스타제, 유액, 또는 정맥내 투여 또는 주사용 액제와 같은 형태로 투여될 수 있다. 다른 제형에는 패치 기전 또는 연고를 통한 경피 투여가 포함된다. 전술한 임의의 것은 지효성 방출 및/또는 지속성 방출 제형을 제공하도록 변경될 수 있다.

본 개시에서, 약제학적 조성물은 비히클, 보조제, 계면활성제, 현탁화제, 유화제, 불활성 충전제, 희석제, 부형제, 습윤제, 결합제, 윤활제, 완충제, 붕해제 및 담체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 약제학적으로 허용 가능한 담체뿐 아니라, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 착색제 및 풍미제와 같은 부속 물질(본원에서는 담체로서 총칭)을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 활성 화합물에 대하여 화학적으로 불활성이고 사용 조건 하에서 유해한 부작용이나 독성을 갖지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 폴리머 및 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 성질은 이용되는 특정 제형 및 조성물의 다른 특성에 따라 다를 수 있다.

예를 들어, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 정제, 캡슐제, 사쉐(sachets), 로젠지(lozenges), 트로키제(troches), 필(pills), 산제, 또는 과립제와 같은 고형으로 경구 투여를 위해 화합물(들)은, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 불활성 충전제, 적절한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 부속 물질과 같은 경구용 비-독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 적절한 결합제는 전분, 젤라틴, 포도당이나 베타-락토스와 같은 천연 당, 옥수수 감미료, 아카시아, 트라가칸타 또는 알긴산나트륨과 같은 천연 및 합성 검, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제형에 사용되는 윤활제는 올레산 나트륨, 스테아린산 나트륨, 스테아린산 마그네슘, 안식향산 나트륨, 아세트산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 붕해제는 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 잔탄검 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 정제 형태는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 유당, 자당, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미세결정형 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 구아검, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 탈크, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 아연, 스테아린산뿐 아니라 본원에 기술되는 다른 담체. 로젠지 형태는 활성 성분을 풍미제, 보통 자당 및 아카시아 또는 트라가칸타 내에 포함할 뿐 아니라, 활성 성분을 젤라틴 및 글리세린, 또는 자당 및 아카시아와 같은 불활성 기재에 포함하는 사탕형 알약(pastilles), 활성 성분에 추가하여 해당 분야에 알려져 있는 담체를 포함하는 겔 및 유제를 포함할 수 있다.

이에 제한되지 않는 예를 들어, 틴크제, 액제, 현탁액제, 엘릭서제, 시럽제와 같은 경구용 액제 형태에서는, 본 개시의 핵산 분자가 물, 식염수 또는 알코올과 같은 희석제에 용해될 수 있다. 또한, 경구용 액체 형태는 합성 및 천연 검, 예를 들어, 트라가칸타, 아카시아, 메틸 셀룰로스 등과 같은 적절히 풍미를 가한 현탁 또는 분산 물질을 포함할 수 있다. 더욱이, 원하거나 필요할 때, 적절한 착색제 또는 다른 부속 물질도 혼합물에 도입될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 분산제에는 글리세린 등이 포함된다.

비경구 투여에 적절한 제형은 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액을 포함하는데, 이는 항-산화제, 완충제, 정균제, 및 제형을 환자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 그리고 현탁화제, 용해제, 점증제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 본 화합물(들)은 물, 식염수, 덱스트로스 및 관련 당 수용액, 에탄올, 이소프로판올, 또는 헥사데실 알코올과 같은 알코올, 프로필렌 글리콜 또는 폴리(에틸렌글리콜) 400과 같은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜, 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올과 같은 글리세롤 케탈, 에테르, 오일, 지방산, 지방산 에스테르 또는 글리세라이드, 또는 아세틸화된 지방산 글리세라이드를, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 비누, 오일 또는 세제와 같은 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 펙틴, 카보머, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 또는 카복시메틸 셀룰로스와 같은 현탁화제, 또는 유화제 및 다른 약제학적 보조제 없이 또는 이를 함께 포함하는 멸균 액체 또는 액체의 혼합물과 같은 생리적으로 허용 가능한 희석제 내에서 투여될 수 있다.

비경구용 제형에 사용될 수 있는 오일은 석유, 동물성 오일, 식물성 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 오일의 특정 예로는 낙화생유, 대두유, 참깨유, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 바셀린 및 광유가 포함된다. 비경구용 제형에 사용하기에 적절한 지방산은 소르비탄 모노올리에이트와 같은 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 및 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜, 올레산, 스테아린산 및 이소스테아린산의 축합에 의해 형성되는 소수성 기재를 갖는 에틸렌 옥사이드의 고분자량 부가물을 포함한다. 에틸 올리에이트 및 이소프로필 미리스테이트는 적절한 지방산 에스테르의 예이다. 비경구용 제형에 사용하기 적절한 비누는 지방 알칼리 금속, 암모늄, 및 트리에탄올아민 염을 포함하고, 적절한 세제에는 (a) 예를 들어, 디메틸디알킬암모늄 할라이드, 및 알킬피리듐 할라이드와 같은 양이온성 세제, (b) 예를 들어, 알킬, 아릴, 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르, 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포숙시네이트와 같은 음이온성 세제, (c) 예를 들어, 지방 아민 옥사이드, 지방산 알칸올아마이드, 및 폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌 공중합체와 같은 비이온성 세제, (d) 예를 들어, 알킬베타-아미노프로피오네이트, 및 2-알킬이미다졸린 4급 암모늄염과 같은 양쪽성 세제, 및 (e) 이의 혼합물이 포함된다.

적절한 보존제 및 완충제가 이러한 제형에 사용될 수 있다. 주사 부위에서의 자극을 최소화 또는 제거하기 위해, 이러한 조성물은 약 12 내지 약 17의 친수성-친유성 평형(HLB)을 갖는 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 제형에서 계면활성제의 양은 약 5 중량% 내지 약 15 중량% 범위이다.

이에 제한되지 않는 예를 들어, 연고제, 크림제, 파스타제, 유제와 같은, 본 개시의 핵산 분자를 포함하는 국소용 제형은, 알코올 용액, 국소용 클렌저, 클렌징 크림, 스킨 겔, 스킨 로션, 그리고 크림 또는 겔 제형의 샴푸를 형성하기 위해, 예를 들어, 알코올, 알로에 베라 겔, 알란토인, 글리세린, 비타민 A 및 E 오일, 광유, PPG2 미리스틸 프로피오네이트 등과 같이 해당 분야에 잘 알려진 다양한 담체 물질과 혼합될 수 있다. 피부 박리제의 포함 또는 피부 연마 제제도 사용될 수 있다. 이러한 국소용 제제는 경피 전달을 위해 패치, 붕대 또는 드레싱으로 적용될 수 있고, 또는 상처 또는 피부 손상 부위에 직접 전달을 위해 붕대 또는 드레싱으로 적용될 수 있다.

본 개시의 화합물(들)은 또한, 소형 단일박막의 소포, 대형 단일박막의 소포 및 다중박막의 소포와 같은 리포좀 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 이러한 리포좀은 또한 특정 세포 타입 또는 일군의 세포 타입으로 리포좀의 직접적인 전달을 위해 단클론 항체를 포함할 수 있다.

본 개시의 화합물(들)은 또한 표적화 가능한 약물 담체로서 가용성 폴리머와 결합될 수 있다. 이러한 폴리머에는 폴리비닐-피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메타크릴-아마이드페놀, 폴리하이드록시에틸아스파르트아마이드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌-옥사이드폴리리신이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 화합물은 약물의 제어된 전달을 달성하는 데 유용한 생분해성 폴리머 계열, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리입실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로-피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 가교 또는 양친매성 하이드로겔의 블록 공중합체와 결합될 수 있다.

도 1은 aP2-Angptl4 TG 래트의 개발 및 특성화를 보여준다.
도 1a는 200 ㎍ 인간 혈장의 2D 겔 분석을 보여주고(n = 4 환자/군, 수확된 대표적 블롯을 보여줌), 차도가 있는 MCD 환자(즉, 비단백뇨 환자)와 비교하여 미세 변화 질환(MCD) 재발 환자 및 막성 신증(MN) 환자에서 증가된 순환 농도의 Angptl4의 존재를 입증한다(화살표 표시).
도 1b는 Angptl4의 지방 조직 특이적 과발현에 대한 형질전환(TG) 래트 모델(aP2-Angplt4 TG)을 보여준다.
도 1c는 aP2-Angptl4 TG 래트에서 Angptl4 mRNA의 조직 특이적 과발현(n = 3 래트/군)을 보여준다. WAT는 백색 지방 조직, BAT는 갈색 지방 조직. *** P < 0.001.
도 1d는 200 ㎍ 혈장의 2D 겔 전기영동에 이어서, Angptl4의 웨스턴 블롯을 보여주고, 이형접합 aP2-Angptl4 TG 래트가 야생형 래트보다 더 높은 순환 Angptl4 농도를 갖는 것을 입증한다(3 개월령, n = 3 블롯/군).
도 1e는 200 ㎍ 혈장의 2D 겔 전기영동에 이어서, 항-V5 및 항-Angptl4 항체의 웨스턴 블롯을 보여주고, aP2-Angptl4 TG 래트의 혈장에서 지방 조직 분비된 V5-태그된 Angptl4의 존재를 입증한다.
도 1f는 aP2-Angptl4 TG 래트 혈장으로부터의 항-N-말단 Angptl4 면역침강물의 2D 겔 전기영동에 이어서, 렉틴 SNA I 및 항-Angptl4 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 보여주고, aP2-Angptl4에서 순환하는 시알릴화된 Angptl4의 존재를 확인한다.
도 1g는 3 개월령 이형접합 aP2-Angptl4 TG 래트(n = 3 래트/군)로부터의 PAS 염색된 절편을 보여주고, 정상적인 사구체 형태학을 입증한다(배율 400x).
도 1h는 3 개월령 이형접합 aP2-Angptl4 TG 래트에서 형질전환 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 항-V5 항체를 갖는 면역금 EM을 보여주고, aP2-Angptl4 TG 래트에서 내피 표면 위의 금 입자를 선택적으로 입증한다(화살표 표시).
도 2는 증가된 순환 농도의 Angptl4와 단백뇨/알부민뇨의 관계를 보여준다.
도 2a는 다른 인간 및 실험적 질환 병태에서 뇨 단백질 분비의 평가(3 ㎍/레인, MCD 차도 제외)를 GelCode 청색 염색된 SDS PAGE에 의해 보여주고, aP2-Angptl4 TG 래트에서 유의성 있는 단백뇨의 부재를 입증한다(*로 표시된 레인, 화살표는 약 70 kDa에서 온전한 알부민을 보여준다).
도 2b는 ELISA에 의한 알부민뇨의 평가를 보여주고, 이형접합 암컷 aP2-Angptl4 TG 래트는 야생형 한배 새끼보다 더 낮은 알부민뇨를 갖는 것을 밝힌다(n = 6 래트/군).
도 2c는 ELISA에 의한 알부민뇨의 평가를 보여주고, 이형접합 수컷 aP2-Angptl4 TG 래트는 야생형 한배 새끼보다 더 낮은 알부민뇨를 갖는 것을 밝힌다(n = 6 래트/군).
도 2d는 야생형 및 aP2-Angptl4 TG 래트에서 신증후군 모델인 퓨로마이신 신증(PAN)의 유도를 보여주고, 야생형 한배 새끼와 비교하여 aP2-Angptl4 TG 래트에서 더 낮은 단백뇨를 입증한다(n = 8 래트/군). 상응하는 대조군과 비교하여, * P < 0.05, ** P < 0.01.
도 2e는 재조합 Angptl4가 배양된 사구체 내피 세포(GEnCs)에 대한 보호 효과를 갖는 것을 보여준다. 상응하는 대조군과 비교하여, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 2f는 6 일에 PAN과 같은 질병 모델의 야생형 래트에서 Angptl4의 상향조절은 사구체에서만인 한편, 지방 조직에서의 Angptl4의 상향조절은 단백뇨와 사구체 Angptl4 발현이 감소 중인 10 일에 주목된 것을 보여준다(n = 3 래트 / 샘플). 상응하는 대조군과 비교하여, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 2g는 기초선 및 aP2-Angptl4 TG 래트에서 PAN의 유도 이후 Angptl4의 증가된 순환 농도가 야생형 래트와 비교하여 증가된 혈장 중성지방 농도를 야기하는 것을 보여준다. 상응하는 대조군과 비교하여, * P < 0.05.
도 2h는 기초선 및 aP2-Angptl4 TG 래트에서 PAN의 유도 이후 Angptl4의 증가된 순환 농도가 야생형 래트와 비교하여 감소된 포스트-헤파린 리포단백질 리파제(LPL) 활성을 야기하는 것을 보여준다. 상응하는 대조군과 비교하여, * P < 0.05.
도 3은 Taqman 실시간 PCR에 사용된 프라이머와 프로브를 보여준다(서열 번호 11-22).
도 4는 재조합 Angptl4가 인간 사구체 질환의 동물 모델에서 단백뇨를 감소시키는 것을 보여준다. 도 4(a)는 사구체간질 손상의 단기간 모델인 Thy1.1 신염에서 단백뇨의 감소를 보여준다. Thy1.1 신염은 수컷 Wistar 래트에서 유도하였다(n=4 래트/군). 기초선 단백뇨(1 일)의 평가 후, Angptl4 안정적 또는 대조군 세포주로부터의 농축된 상등액 단백질을 복막내로 2 연속일(1 & 2 일, 화살표)에 버팔로 Mna 래트(n=4 래트/군)에 주사한 후 단백뇨를 평가하였다. 단백뇨는 Angptl4 처리된 래트에서 계속 더 낮았고, 5 일에는 통계적으로 유의성이 있었다. * P<0.05; ** P<0.01. 모든 값은 평균±SE. 도 4(b)는 사구체간질 손상의 단기간 모델인 Thy1.1 신염에서 단백뇨의 감소를 보여준다. Thy1.1 신염은 수컷 Wistar 래트에서 유도하였다(n=4 래트/군). 단백뇨(1 일)의 유도를 확인한 후, Angptl4 안정적 또는 대조군 세포주로부터의 농축된 상등액 단백질을 정맥내로 2 연속일(1 & 2 일, 화살표)에 주사한 후 단백뇨를 평가하였다. 단백뇨는 Angptl4 처리된 래트에서 계속 더 낮았고, 5 일에는 통계적으로 유의성이 있었다. * P<0.05; ** P<0.01. 모든 값은 평균±SE.
도 5는 다양한 종으로부터의 Angptl4의 아미노산 및 cDNA 서열을 보여준다. 서열번호 1 및 2는 인간으로부터의 아미노산 및 cDNA 서열을 보여주고(단백질 변종 1 동형 a, 긴 형태; 위치 40 및 161-164에서 밑줄친 아미노산 서열); 서열번호 3 및 4는 인간으로부터의 아미노산 및 cDNA 서열을 보여주고(단백질 변종 3 동형 b, 짧은 형태; 위치 40 및 161-164에서 밑줄친 아미노산 서열); 서열번호 5 및 6은 래트로부터의 아미노산 및 cDNA 서열을 보여주고; 서열번호 7 및 8은 마우스로부터의 아미노산 및 cDNA를 보여주고; 밑줄은 정방향 서열 프라이머이다. 굵은 글씨체는 역방향 서열 프라이머이다. 서열번호 9는 일반적인 형태로 관심의 대상인 서열을 갖는 인간 단백질 변종 유도체이다. 서열번호 10은 일반적인 형태로 관심의 대상인 서열을 갖는 인간 단백질 변종 3 유도체이다.
도 6은 증가된 순환 Angptl4 농도가 신증후군에서 고중성지방혈증의 발생에 요구되는 것을 보여준다. (a) 원발성 사구체 질환에 기인하는 신증후군 환자에서 혈장 Angptl4 농도의 ELISA. 분석된 환자의 수는 괄호에 나타낸다. (b) 모두 신증후군의 래트 모델인 수동적 Heymann 신염(PHN, 막성 신증의 모델), 버팔로 Mna(B. Mna, 자발적으로 국소 분절 사구체 경화증을 발생) 및 정맥내 단일 용량 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드 신증(PAN, 미세 변화 질환의 모델)에서 신증-전 및 신증 단계의 혈장 Angptl4 농도의 ELISA. PHN(c 내지 e), 버팔로 Mna 래트(f 내지 h), 및 PAN 래트(i 내지 k)에서 단백뇨, 고중성지방혈증 및 LPL 활성. (l, m) 증가된 순환 Angptl4 농도를 갖는 지방 조직 특이적 Angptl4 과발현 래트(aP2-Angptl4) 및 이식유전자 발현된 Angptl4가 순환에 들어오지 않는 3 개월령 족세포 특이적 Angptl4 과발현 래트(NPHS2-Angptl4)에서 혈장 중성지방 농도 및 LPL 활성, (n) γ2-NTS를 사용한 신증후군의 유도 48 시간 후 Angptl4 -/- 및 +/+ 마우스에서 혈장 중성지방 농도. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
도 7은 신증후군에서 순환 Angptl4의 원천을 보여준다: (a) 수동적 Heymann 신염(PHN), (b) 버팔로 Mna 래트 및 (c) 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드 신증(PAN)에서 대조군과 비교한 다-기관 Angptl4 mRNA 발현. (d) 경증의 PAN 유도 전 및 후 단백뇨 NPHS2-Angptl4 형질전환 래트에서 순환 Angptl4 농도를 보여주는 혈장의 대표적 2-차원 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯. (e) d에서 2-차원 겔의 농도측정 분석. (f) 순환에서 V5-태그된 이식유전자 발현 Angptl4의 존재를 보여주기 위한 PAN이 있는 NPHS2-Angptl4 형질전환 래트로부터의 혈장의 2-차원 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯. (g 및 h) 야생형 Sprague Dawley, aP2-Angptl4 및 NPHS2-Angptl4 형질전환 래트에서 PAN의 유도 6 일 후 혈장 중성지방 농도(g) 및 리포단백질 리파제(LPL) 활성(h). 빈 막대는 여기에 비교를 위해 포함시킨 도 6(l) 및 6(m)으로부터의 데이터에 상응한다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 패널 g 및 h에서, 통계적 유의성은 형질전환 래트와 상응하는 야생형 대조군 사이의 차이를 위해 보여준다. PAN 유도 전 및 후 각 래트 타입에서 P<0.001. 패널 a 내지 c에서, 발현의 3-배 변화(수평선)는 유의성이 있는 것으로서 취급되었다.
도 8은 신증후군에서 Angptl4 및 LPL의 뇨 손실을 보여준다. (a) 정상Sprague Dawley (SD), PAN, PHN, 및 버팔로 Mna 래트로부터의 뇨의 대표적인 환원 웨스턴 블롯. 흑색 화살표는 Angptl4 밴드를 가리킨다. 알부민 블러쉬(blush)는 또한 PAN, PHN 및 버팔로 Mna 래트에서 65 내지 70 kDa 사이에 주목된다. (b) LPL의 뇨 손실을 평가하기 위해 염소 항 LPL 항체를 사용한 신증 래트로부터의 뇨의 비-환원 웨스턴 블롯(화살표). (c) 활성 LPL을 확인하기 위해 항-LPL 단클론 항체 5D2를 사용한 신증 래트 뇨의 비-환원 웨스턴 블롯(화살표). (d) PAN이 있는 Sprague Dawley 래트에서 LPL의 다-기관 mRNA 발현 프로파일. (e) aP2-Angptl4 형질전환 래트에서 LPL을 발현하는 주요 기관의 mRNA 발현 프로파일. 패널 d 및 e에서, 발현의 3-배 변화(수평선)는 유의성이 있는 것으로 취급되었다.
도 9는 단백뇨에 대한 순환 Angptl4의 효과를 보여준다. 적색 화살표는 항체 또는 재조합 단백질이, 적절하게는 주사된 시점을 나타낸다. (a) 야생형 Sprague Dawley 및 aP2-Angptl4 형질전환 래트에서 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드 신증(PAN)의 유도 후 단백뇨 (b) PAN이 있는 Sprague Dawley 래트에서 단백뇨에 대한, 항-Angptl4 Ab를 사용한 순환 Angptl4 고갈의 효과. (c) 재조합 래트 Angptl4 분비 안정적 세포주 또는 대조군 안정적 세포주로부터의 농축된 상등액의 주사 후 버팔로 Mna 래트에서의 단백뇨. (d) 사구체간질 손상의 모델인 중증의 항-Thy1.1 신염에서 단백뇨에 대한 위의 세포주로부터의 재조합 래트 Angptl4 또는 대조 단백질 주사의 효과. * P<0.05, ** P<0.01
도 10은 돌연변이 재조합 인간 Angptl4를 사용한 중성지방 및 단백뇨에 대한 Angptl4의 효과의 분리를 보여준다. (a) LPL 결합(아미노산 40, 및 인접 아미노산 39) 및 단백질 절단(아미노산 161 내지 164)에 중요한 부위에서 돌연변이를 보여주는 야생형 및 변종 인간 Angptl4 단백질의 도식적 표현. (b) 변종 단백질에서 감소된 절단과 온전한 단백질의 예상 크기를 입증하기 위해 마우스 항 V5 항체 및 대조 군 마우스 IgG를 사용한 재조합 태그된 단백질의 웨스턴 블롯(화살표). (c) 국소 분절 사구체 경화증(FSGS)의 모델인 버팔로 Mna 래트에 55 ㎍의 재조합 인간 단백질의 주사 후, 인간 Angptl4 ELISA 키트로부터 시약을 사용하여 OD 450으로 평가한 야생형 또는 변종 인간 Angptl4의 혈장 농도. (d) 버팔로 Mna 래트에서 단백뇨에 대한 야생형 및 변종 Angptl4의 효과. * P<0.05, 3 연구 그룹 모두가 개별적으로 대조군과 다른 것을 보여줌. (e) 버팔로 Mna 래트에서 혈장 중성지방 농도에 대한 야생형 및 변종 Angptl4의 효과. 기초선과 비교하여 야생형 값 * P<0.05. 야생형과 비교하여 6 시간 변종 값 # P<0.05.
도 11은 순환 Angptl4가 사구체 내피 αvβ5 인테그린과의 상호작용을 통해 단백뇨를 감소시키는 것을 보여준다. 적색 화살표는 항 β5 인테그린 항체 또는 면역-전 혈청이 주사된 시점을 나타낸다. (a) aP2-Angptl4 형질전환 래트로부터 사구체의 공초점 이미지는 지방 조직으로부터 분비된 Angptl4-V5(항-V5 항체, 적색)의 사구체 내피(항 폰 빌레브란트 인자 항체, 녹색)와의 공동-국재화를 입증한다. (b) 지방 조직 분비된 Angptl4-V5의 사구체 내피 세포 표면 결합을 보여주기 위해 항-V5 항체를 사용한 aP2-Angptl4 형질전환 래트로부터 사구체의 면역금 전자 현미경 사진. (c) 시알릴화된 Angptl4 단백질이 배양된 래트 사구체 내피 세포(GEnCs)를 산화적 손상으로부터 보호하는 한편, 저시알릴화된 Angptl4는 산화적 손상의 효과를 증가시킨다. (d) 정제된 αvβ5 인테그린과 시알릴화된 Angptl4 또는 대조군과의 생체외 상호작용. 선형 회귀 슬로프(흑색)가 겹쳐진다. (e) Angptl4 분비의 말초 단계 동안 단백뇨에 대한 내피 β5 인테그린 - 순환 Angptl4 상호작용의 보호 효과를 입증하기 위해 β5 인테그린 -/- 및 +/+ 마우스에서 γ2-신독성 혈청(NTS)을 사용한 신증후군의 유도 후 단백뇨의 발생. (f) PAN이 있는 Sprague Dawley 래트에서 피크 단백뇨로부터의 회복 중(Angptl4 분비의 말초 단계와 일치) 항 β5 인테그린 항체를 사용하여 내피 β5 인테그린 - Angptl4 상호작용을 차단한 효과. (g) PAN이 있는 aP2-Angptl4 형질전환 래트에서 피크 단백뇨로부터의 회복 중 항 β5 인테그린 항체를 사용하여 내피 β5 인테그린 - Angptl4 상호작용을 차단한 효과. (h) Angptl4의 결핍이 Angptl4 발현의 말초 단계 동안 피크 단백뇨로부터의 회복에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 Angptl4 -/- 및 +/+ 마우스에서 γ2-NTS를 사용한 신증후군의 유도. 사구체 단계의 발견은 본 발명자의 이전 발표 연구(실시예 4로부터의 참고문헌 6)와 일치한다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
도 12는 인간 혈장의 2-차원 겔 전기영동을 보여준다. (a) 막성 신증(MN), 국소 분절 사구체 경화증(FSGS) 및 미세 변화 질환(MCD)에서 증가된 순환 Angptl4 농도를 보여주기 위한 항-Angptl4 항체의 대표적 웨스턴 블롯의 수확된 이미지. Angptl4 스폿은 녹색 원 / 타원에 둘러싸인다. (b) 웨스턴 블롯에 상응하는 니트로셀룰로스 멤브레인의 폰소 레드 염색 이미지.
도 13 (a) γ2-NTS의 주사 48 시간 후 Angptl4 +/+ 및 Angptl4 -/- 마우스에서 알부민뇨는 도 6(n)에 상응한다. 이미지는 실시예 4로부터의 참고문헌 6의 온라인 부록으로부터 재생산된다. 연구 2 일에 보이는 유사한 결과는 도 6(h)에 보인다. (b) 도 2d에서 웨스턴 블롯에 사용된 니트로셀룰로스 멤브레인의 폰소 레드 염색 이미지. (c) 정상 염소 혈청을 사용한 도 3b로부터의 스트립 멤브레인의 과다 노출된 웨스턴 블롯. (d) 정상 마우스 IgG을 사용한 도 3c로부터의 스트립 멤브레인의 과다 노출된 웨스턴 블롯. (e) 재조합 인간 야생형 Angptl4, 인간 변종 Angptl4, 및 대조 단백질의 주사 후 12 시간 내지 17 일로부터 버팔로 Mna 래트에서 공복시 혈장 중성지방 농도. * P<0.05
도 14: (a) 도 11e에 나타낸 γ2-NTS 주사한 Itgb +/+ 및 -/- 마우스에서 Angptl4 발현의 말초 단계 동안 증가된 혈장 Angptl4 농도. (b) γ2-NTS의 주사 7 일 후, 도 11e에 나타낸 Itgb +/+ 마우스에서 Angptl4의 다기관 mRNA 발현 프로파일. (c) 도 11f에 나타낸 Sprague Dawley PAN 래트에서 혈장 Angptl4 농도. (d) 도 11f에 나타낸 Sprague Dawley PAN 래트에서 혈장 중성지방 농도. 패널 a, c 및 d에서 모든 비교는 0 일 값에 대한 것이다. * P<0.05
도 15는 신증후군에서 순환 Angptl4의 기원 및 생물학적 효과의 도식적 표현을 보여준다. 중간 내지 중증 단백뇨의 확립 후, 골격근, 지방 조직 및 심장은 Angptl4를 상향조절하고 순환으로 분비한다. 이 Angptl4의 일부는 사구체 내피 표면에서 αvβ5 인테그린과 결합하고 단백뇨를 감소시키는 한편, 일부는 활성 리포단백질 리파제(LPL)에 결합하고 이를 불활성 LPL로 전환시키는데, 이는 뇨로 손실된다. 감소된 LPL 중개의 중성지방 흡수는 고중성지방혈증을 야기한다. 순환 Angptl4 일부도 뇨 중에 손실된다. 미세 변화 질환(MCD)에서, 족세포 분비 저시알릴화된 Angptl4는 사구체 내에서 국소적 전-단백뇨 효과를 발휘하지만, 족세포 분비 시알릴화된 단백질은 사구체 내피에 결합하고 순환으로 누출되어 고중성지방혈증을 유도한다. 막성 신증(MN), 국소 분절 사구체 경화증(FSGS) 및 비-HIV 허탈성 사구체병증(CG)에서, 족세포는 상당량의 Angptl4가 순환으로 들어가는 데 기여하지 않는다.
도 16 (a) 인간 Angptl4 ELISA의 표준 곡선 (b) 설치류 Angptl4 ELISA의 표준 곡선 (c) 웨스턴 블롯에 의한 항-β5 인테그린 항체 8472A의 특성화. (d) 정맥내 주사 6 시간 후, 마젠타 겹침 패턴을 야기하는, 항-β5 인테그린 항체(적색, 당나귀 항 토끼 IgG를 사용하여 검출)의 사구체 내피(청색, 마우스 항-PECAM1 항체로 표지)와의 결합을 보여주는 래트 사구체의 공초점 이미지.
도 17은 인간 Angptl4의 4 가지 변종 형태에서의 아미노산 및 핵산 치환을 보여준다.
도 18은 변종 단백질에서 감소된 절단 및 온전한 단백질의 예상 크기를 나타내기 위해 마우스 항-V5 항체 및 대조군 마우스 IgG를 사용하여 태그된 도 17에 나타낸 재조합 단백질의 웨스턴 블롯(화살표).
도 19는 단백뇨 버팔로 Mna 래트에 단일 정맥내 주사 후 변종 8511에 대한 단백뇨 변화의 피크 수준을 보여준다.
도 20은 당뇨병성 신증 및 당뇨병성 신장 질환의 모델인 Zucker 당뇨병 비만 래트에 2 가지 변종 인간 Angptl4 단백질(15 ㎍) 주사 후 단백뇨 감소를 보여준다.
도 21은 Zucker 당뇨병 비만 래트에 주사(15 ㎍) 후 2 가지 변종 인간 Angptl4 단백질의 단백뇨 수준을 보여준다. 모든 * 값은 기초선 0 일 값에 대한 것이다.
도 22는 Zucker 당뇨병 비만 래트에서 2 가지 변종 형태의 인간 Angptl4 단백질(15 ㎍) 주사 후 혈장 중성지방 농도에 증가가 없음을 보여준다. 도 20-22에서: * P<0.05, ** P<0.01. # P<0.05.

실시예

다음 결과에서, 사용된 방법은 본 개시의 방법 부문 및 이에 인용된 참고문헌에서 명시된 방법들이다. 다음 결과의 일부는 Clement LC 등의 "Podocyte secreted Angiopoietin-like 4 mediates proteinuria in glucocorticoid-sensitive nephrotic syndrome," Nature Medicine, January 2011(이 문헌은 Angptl4 폴리펩타이드의 사용에 대하여 이에 포함되는 개시를 위한 참조로서 도입된다)에 기술되어 있다.

1. 신증후군 환자는 증가된 농도의 순환 Angptl4 를 갖는다

신증후군 환자는 증가된 순환 농도의 Angptl4 폴리펩타이드를 갖는다. MCD 및 MN으로 진단받은 환자(n = 4 환자/군) 및 MCD 재발 환자로부터의 200 ㎍ 인간 혈장을 2D 겔 전기영동으로 분석하고 항-Angptl4 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 만들었다(도 1a). 도 1a는 MCD 재발 및 MN 환자만이 증가된 농도의 Angptl4를 갖는 것을 보여준다(화살표로 표시). 이 형태의 Angptl4는 중성 pI 형태로 존재하고 모노머 및 올리고머로서 존재한다.

2. aP2 - Angptl4 TG 래트는 증가된 순환 농도의 Angptl4 를 갖는다

지방세포 특이적 Angptl4 과발현을 위한 형질전환 래트 모델을 개발하였고 도 1b에 나타낸다(aP2-Angptl4 TG). 정상적으로 Angptl4를 발현하는 기관에서 mRNA 발현의 분석으로, 갈색 지방 조직(BAT) 및 백색 지방 조직(WAT)에서 Angptl4가 검출되어, 발현의 특이성을 확인하였다(도 1c).

200 ㎍ 혈장의 2D 겔 전기영동에 이어서 항-Angptl4 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 야생형 래트보다 이형접합 aP2-Angptl4 TG 래트가 더 높은 순환 Angptl4 농도를 갖는 것을 밝혔다(도 1d)(3 개월령, n = 3 블롯/군). 도 1e는 200 ㎍ 혈장의 2D 겔 전기영동에 이어서 항-Angptl4 및 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯이 aP2-Angptl4 TG 래트의 혈장에서 지방 조직 분비된 V5-태그 Angptl4의 존재를 보여주는 것을 나타낸다. aP2-Angptl4 TG 래트 혈장으로부터 면역침강된 Angptl4의 2D 겔 전기영동(Angptl4의 N-말단에 대하여 특징적인 항체를 사용하여)에 이어서 항-Angptl4 또는 항-렉틴을 사용한 웨스턴 블롯. SNA I 항체는 순환에서 시알릴화된 Angptl4 폴리펩타이드의 존재를 밝혔다.

aP2-Angptl4 TG 래트는 광학(도 1g) 및 전자 현미경(도시하지 않음)에 의해 형태학적으로 정상인 사구체를 가졌으며, 사구체 Angptl4 발현은 변경되지 않았다. 이는 Angptl4의 족세포 특이적 발현과 대조적인 것으로, 이러한 발현은 1 내지 5 개월령 사이에 족돌기 소실의 점진적 진행을 포함하여 사구체 결함을 야기하였다(이러한 교시를 위해 본원에 참조로 도입되는 미국 가출원번호 제61/351,865호(2010년 6월 5일 출원) 참조).

3 개월령 이형접합 aP2-Angptl4 TG 수컷 래트에서 이식유전자 발현된 단백질을 특이적으로 검출하기 위해 항-V5 항체를 사용한 면역금 EM은 선택적으로 내피의 표면에서 검출을 보여, 순환 Angptl4 중간 및 고차 올리고머는 GBM으로 들어가지 않고 내피 표면에 수용체를 갖는 것을 나타낸다. Angptl4의 지방 조직 상향 조절은 단백뇨가 감소될 때 신증후군의 후기 단계에서 주목되므로, 순환 Angptl4의 효과는 인간 및 실험적 신증후군 둘 다와 관련된다.

3. 증가된 순환 농도의 Angptl4 와 단백뇨 및 알부민뇨의 관계

Angptl4의 순환 농도와, 알부민뇨를 포함하는 단백뇨 사이의 관계를 검사하기 위해, 단백뇨를 aP2-Angptl4 TG 래트에서 분석하였다. 도 2a는 aP2-Angptl4 TG가 뇨 단백질 분석에 의해 결정된 것과 같이 단백뇨를 나타내지 않는 것을 보여준다. 도 2a에서 뇨 단백질은 GelCode 청색 염색된 SDS PAGE로 분석하였다(3 ㎍/레인, MCD 차도 제외)(농도계 판독은 각 레인 아래 제공된다). 온전한 알부민 밴드는 70 kDa에서 관찰된다(화살표로 표시됨). 보이는 바와 같이, WT 래트, aP2-Angptl4 TG 래트 및 차도를 보이는 MCD 환자는 분석된 뇨 샘플에서 거의 또는 전혀 온전한 알부민을 보이지 않았는데, 여기에서 NPHS2-Angplt4 TG 래트(족세포 특이적 Angptl4 발현을 갖는 래트 형질전환 모델로 단백뇨가 있는 MCD가 발생된 것을 보여줌; 이러한 교시를 위해 본원에 참조로 도입된 미국 가출원 번호 제61/351,865호 (2010년 6월 5일 출원) 참조), MCD 재발, MN 재발 및 PAN 래트(신증후군의 래트 모델)는 알부민뇨의 표시인 강한 알부민 염색을 보여주었다. 도 2b는 암컷 이형접합 aP2-Angptl4 암컷 TG 래트가 WT 한배 새끼 대조군과 비교하여 감소된 알부민뇨를 갖는 것을 보여준다. 도 2c는 aP2-Angptl4 이형접합 수컷 TG 래트에서 동일한 결과를 보여준다. 도 2d는 aP2-Angptl4 TG 래트가 WT 한배 새끼와 비교하여 퓨로마이신 신증(PAN 모델; 신증후군의 래트 모델)에서 감소된 단백뇨를 나타낸 것을 보여준다. 위에 나타낸 바와 같이, aP2-Angptl4 TG 래트는 중성 등전점이거나 그 주위로 이동하는, 그리고 시알릴화된 더 높은 순환 Angptl4 농도를 갖는다. 이들 결과는 단백뇨 및 신증후군을 감소시키는 데 있어서 순환 Angptl4의 역할을 보여준다.

지방 조직 분비된 Angptl4의 내피 결합은 사구체 내피에 결합하므로, 실험은 이 래트 모델에서 더 낮은 기초선 알부민뇨 및 더 적은 PAN 유도된 단백뇨가 사구체 내피 보호에 의해 중개되는지 여부를 조사하기 위해 사구체 내피 세포(GEnCs)에 대한 재조합 Angptl4의 효과를 결정하도록 수행되었다. GEnCs는 과산화수소의 부가에 의한 산화적 손상을 받도록 하고 배양 배지에 넣어 대조군인 안정적 세포주 Angptl4-HEK293 세포주(높은 등전점(pI), 저시알릴화된 Angptl4를 분비) 또는 ManNAc와 함께 배양된 Angptl4-HEK293 세포주(중성 pI, 정상 시알릴화된 Angptl4)로부터 농축된 상등액(600 ㎍/웰)으로 배양되었다. 높은 pI 형태의 Angptl4는 MCD에서 족세포로부터 대량으로 분비되는 것이 주목되어야 한다. LDH의 방출은 세포 손상의 표지로서 평가되었다. 과산화수소 손상이 없는 대조군 세포는 상대적 점수 1이 주어졌다. 높은 pI Angptl4는 GEnC 손상을 증가시켰지만, 중성 pI Angptl4(대부분의 순환 Angptl4를 포함)는 모든 측정된 시점에서 유의성 있게 보호적이었다(n = 3 판독/조건).

PAN 6 일에 야생형 래트에서 Angptl4 상향조절은 사구체에서만이었지만, 지방 조직에서 상향 조절은 단백뇨 및 사구체 Angptl4 발현이 감소될 때인 10 일에 주목되었다(n = 3 래트/샘플)(도 2f). 따라서, 순환 Angptl4 농도의 증가는 신증후군 및 단백뇨 감소에서 순환 Angptl4의 보호 효과와 일치한다. 순환 Angptl4의 이 효과는 인간 및 실험적 MCD 둘 다에서 관련이 있는 것으로 보이는데, Angptl4의 지방 조직 상향조절은 단백뇨가 저하될 때 PAN의 이후 단계에서 주목되었기 때문이다. 또한, 기초선 및 aP2-Angptl4 TG 래트에서 PAN의 유도 이후 증가된 순환 Angptl4 농도는, 야생형 래트와 비교하여 증가된 혈장 중성지방 농도(도 2g) 및 감소된 포스트-헤파린 리포단백질 리파제 활성(도 2h)을 야기하였다.

Angptl4의 순환으로의 치료적 전달의 유효성을 입증하기 위해, 야생형 Angptl4 또는 대조 단백질을 FSGS의 모델인 버팔로/Mna 래트 또는 사구체간질 손상의 단기간 모델인 Thy1.1 신증이 유도된 Wistar 래트에 투여하였다(도 4a 및 b). 야생형 재조합 Angptl4 폴리펩타이드는 재조합 단백질을 수확함으로써 생성되었다. Angptl4-HEK293 안정적 또는 pcDNA3.1-HEK293 대조군 안정적 세포주를 15 cm 접시에서 융합(confluence)까지 성장시키고 따뜻한 PBS로 2 회 세척하여, 페놀 레드가 없고, 25 mM ManNAc가 존재하거나 없는 무혈청 DMEM에서 48 시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 상등액을 농축시켰다. 하나의 15 cm 접시로부터 농축된 상등액을 각각의 주사 시점에 사용하였다.

버팔로/Mna 래트는, 광학 현미경에서 국소 분절성 병변, 전자 현미경에서 족세포 족돌기의 소실 및 단백뇨를 포함하여, 인간 FSGS를 모방하는 병변을 대략 2 개월령에서 자발적으로 발생시킨다. 이 래트는 나이 들면서 단백뇨의 점진적 증가를 발생시킨다. 위의 연구에 사용된 래트는 수컷이고 5 개월령이었다. 항-Thy1.1 신증은 150 ㎍의 항-Thy1.1(Ox-7 하이브리도마) 또는 대조 IgG IV를 수컷 Wistar 래트의 다른 군(100-125 gm, n = 4 래트/군)으로 주사함으로써 유도되었다.

버팔로/Mna 래트 모델에서, 기초선 단백뇨의 평가는 0 일에 실시하였다. Angptl4 또는 대조 단백질은 복막내로 2 연속일(1 & 2 일, 화살표)에 버팔로 Mna 래트(n=4 래트/군)에 주사하였다. 단백뇨는 격일로 평가하였고, 기초선 값의 백분율로서 표현하였다. 단백뇨에서 유의성 있는 감소는 재조합 Angptl4 처리된 래트에서 주목되었다.

Thy1.1 신증 모델에서, 단백뇨는 1 일에 확인되었다. 래트는 재조합 Angptl4 또는 대조 단백질을 2 연속일(1 & 2 일, 화살표)에 정맥내 투여하였다. 다음에 단백뇨를 평가하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 단백뇨는 Angptl4 처리된 래트에서 내내 더 낮았으며, 5 일에는 통계적으로 유의성이 있었다.

이들 결과는 Angptl4의 순환으로의 치료적 전달이, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 미세 변화 질환, 국소 분절 사구체경화증, 막성 신증/막성 사구체신염, 막증식성 사구체신염과 같은 신증후군 또는 이에 제한되지 않는 예를 들어, 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증 또는 원발성 사구체 질환과 같은 당뇨병 병태의 효과적인 치료임을 보여준다. 또한, 이들 결과는 Angptl4의 순환으로의 치료적 전달이, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 단백뇨, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 및 부종과 같은 신증후군과 관련된 병태의 효과적인 치료임을 보여준다. 하나의 구현예에서, Angptl4 폴리펩타이드는 감소된 LPL 저해 활성, 절단에 대한 저항성을 갖는 유도체 또는 본원에 기술된 유도체이다. 이러한 유도체의 투여는, 증가된 혈장 중성지방 농도와 같은 LPL 활성의 저해와 연계된 부정적인 효과 없이 Angptl4 치료의 유익한 효과를 유지할 것이다.

실시예 1-3을 위한 방법

전체 길이 래트 Angptl4 의 클로닝 , 및 전체 길이 재조합 Angptl4 에 대한 항체의 생성

본 발명자의 이전 실험(7)으로부터의 전체 길이 래트 Angptl4 오픈 리딩 프레임 1218 bp에서 정지 코돈을 제외시키고, 진핵 세포 발현을 위해 pcDNA3.1/V5-HisB로, 그리고 원핵세포 발현을 위해 pET28a로 클로닝하였다. E. Coli 발현의 정제된 전체 길이 단백질을 토끼에서 다클론 항체를 만드는 데 사용하였으며(Proteintechgroup, Inc. Chicago IL USA), 이는 ELISA와 웨스턴 블롯으로 시험하였다. 항체 반응성 밴드를 GelCode 청색 염색 겔로부터 잘라내고, 트립신 분해하여 Angptl4 펩타이드 서열의 존재를 MALDI-TOF/TOF로 확인하였다. 항혈청의 일부를 항원에 대하여 친화성 정제하였다. 달리 명시하지 않는 한, 기술된 모든 연구는 이 항체를 사용하였다. 래트 Angptl4의 N-말단(신호 펩타이드를 제외한 아미노산 7-86)에 대한 추가의 다클론 항체를 토끼에서 유사하게 형성하였다.

인간 사구체 질환의 동물 모델에서 단백뇨의 유도

모든 동물 연구는 기관 IACUC에 의해 승인되었다. WT 래트에서 단백뇨 동물 모델(n = 4 래트/군)의 유도는 괄호 안의 이전 발표 문헌에 기술되어 있다: PAN(7), PHN(7), 글루코코르티코이드로 PAN(20), 비-HIV 허탈성 사구체병증(18), 신독성 혈청 유도된 이종 상 단백뇨(7). Anti-Thy1.1 신염은 200 mcg의 항-Thy1.1(Ox-7 하이브리도마) 또는 대조 IgG IV를 다른 군의 수컷 Wistar 래트(100-125 gm, n = 4 래트/군)에 주사하여 유도하고, 래트를 24 및 72 시간 후에 안락사시켰다.

다음 기술은 선행 문헌에 기술되어 있다: Taqman 실시간 PCR(26), 공초점 이미징(7), 원위치(in situ) 하이브리드 형성(27), 면역금 EM(26), 사구체 추출 및 웨스턴 블롯을 위한 처리(26), PEI 방법에 의한 전하의 평가(28). 알시안 블루 염색을 위해, 염색 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 2.5로 조정하고, 0.1% 뉴클리어 패스트 레드 용액을 대비염색으로 사용하였다. 사구체 기저막 알시안 블루 염색의 밀도측정(20 사구체/래트, 3 래트/군)은 Image-Pro 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc., Bethesda MD, USA)를 사용하여 평가하였다. 2D 겔 웨스턴 블롯의 밀도측정은 Gel-Pro 분석기 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 평가하였다. Taqman 실시간 PCR 프라이머 및 프로브는 도 3에 수록된다. 원위치 하이브리드 형성을 위해, 래트 Angptl4에 대한 디곡시게닌 표지 프로브는 ORF의 bp 1 내지 548을 포함하였다.

포스트 헤파린 LPL 활성에 대한 샘플을 얻기 위해, 래트를 안락사 15 분 전에 10 단위/100 gm 체중의 돼지 헤파린을 정맥내 주사하고, Roar Biomedical, Inc (New York NY)으로부터의 분석을 사용하여 활성을 측정하였다. 혈청 중성지방은 공복 상태에서 측정하였다.

Angptl4 -/- 마우스로 NTS 의 주사

Angptl4 -/- 마우스는 Eli Lily Corporation(Indianapolis IN USA)으로부터의 친절한 선물로서 Sander Kersten에게 제공되었다. 이 연구 프로토콜은 Wageningen University의 동물 연구 협회에 의해 승인되었다. 11 주령의 수컷 Angptl4 -/- 또는 +/+ 마우스(n = 4 마우스/군)에 1.5 mg γ2-NTS 또는 정상 양 혈청(Sigma Aldrich St. Louis MO USA)을 정맥내 주사하고, 스폿 뇨 샘플을 48 시간에 수집하고, 마우스를 72 시간에 안락사시킨 후 혈장은 생화학적 측정을 위해 수집하고 신장은 조직학적 분석을 위해 보존하였다. 뇨 알부민을 ELISA(Bethyl laboratories, Montgomery TX USA)로 평가하고 뇨 크레아티닌을 질량 분석법으로 측정하였다. 족돌기 소실을 평가하기 위해, 족돌기의 평균 폭을 첫 번째로 대조 처리된 Angptl4 +/+ 마우스에서 투과 전자 현미경으로 측정하였다(10 동일 간격 판독/루프, 3 루프/사구체, 3 사구체/신장, 3 신장/군). 소실은 평균 폭에서 2.5 배 넘는 증가로서 기술되었다. 전체 및 소실된 족돌기를 NTS 처리되거나 대조 처리된 Angptl4 -/- 마우스에서 계수하였다.

보관된 인간 샘플 연구

보관된 인간 신장 생검의 면역염색(n = 5 생검/조건)은 Instituto Nacional de Cardiologia, Mexico City에서 IRB 승인된 프로토콜을 통해 수득된 샘플에 수행되었다. 이 연구에 사용된 대조군 신장 생검은 성별 및 연령 일치 프로토콜 이식-전 생검이었다. 2D 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯을 위한 보관된 인간 혈청(n = 4 샘플/조건)은 이전에 발표된 연구(29)로부터 수득하였다.

형질전환 래트의 생성

aP2-Angptl4 TG 래트(지방 조직 특이적) 구성물을 5.4 Kb 마우스 aP2 프로모터 구성물(30)(Addgene Inc. Cambridge MA USA로부터 구입)을 포함하는 벡터에서 래트 Angptl4 cDNA(신호 서열을 포함)를 폴리A 테일의 바로 상향 NotI 부위에서 C-말단 V5 태그로 클로닝함으로써 생성하였다.

형질전환된 래트는 분해된 DNA 구성물을 수정된 Sprague Dawley 수정란에 현미주사하고(University of Michigan에서 수행), 가임신된 숙주 Sprague Dawley 암컷에 이식하고, 그리고 생성된 새끼를 일상적인 PCR 및 TaqMan 게놈 DNA 실시간 PCR 전략으로 구성물 특이적 대조 게놈 프로락틴 프라이머 및 프로프 조합을 사용하여 유전자형을 분석함으로써 생성하였다(도 3). 지방 조직 특이적 발현을 위한 3 시조(founder) 라인을 생성하였다. 4 세대에 걸쳐 안정적인 aP2-Angptl4 TG 래트 라인 375(3 복제)로부터의 데이터가 제시된다. 뇨 전체 단백질을 Bradford 방법을 사용하여 평가하고(Biorad laboratories, Hercules CA USA), 알부민뇨를 ELISA(Bethyl laboratories, Montgomery TX USA)로 평가하였다.

GEnC 생체외 연구

GEnC 연구를 위해, 배양한 래트 GEnCs(32)를 75% 융합까지 6 웰 플레이트에서 성장시키고(n = 3 웰/조건), 따뜻한 PBS, 200 μM H₂O₂를 600 ㎍/웰의 대조군 안정적 세포주 상등액, 또는 Angptl4-HEK293 안정적 세포주 상등액, 또는 ManNAc 처리된 Angptl4-HEK293 세포주로부터의 상등액과 함께 포함하는 무혈청 RPMI로 2 회 세척하였다. 24, 36 및 48 시간에 웰에서 샘플을 채취하였댜. LDH 분비는 세포독성 검출 키트(Roche Diagnostics, Mannheim Germany)를 사용하여 측정하였다. OD 492 값은 H₂O₂ 또는 안정적 세포주 상등액이 첨가되지 않은 웰로부터의 판독의 비율로서 표현되었다.

통계적 분석

3 이상의 군을 포함하는 유전자 발현 또는 단백뇨에 있어서의 차이 분석은 ANOVA에 의해 사후분석 시험으로 GraphPad InStat 소프트웨어, Version 3.05를 사용하여 수행되었다. 2 군의 비교를 위해, Microsoft Excel 2003에서 언페어드 스튜던트 t 테스트를 사용하였다.

4. 순환 안지오포이에틴 -유사-4는 신증후군에서 단백뇨를 고중성지방혈증과 연결시킨다

신증후군에서 단백뇨와 고지혈증(고중성지방혈증 및 고콜레스테롤혈증)에 대한 분자적 기반은 알려져 있지 않다. 이 연구에서, 당단백질 Angptl4의 증가된 혈장 농도는 막성 신증(MN), 국소 분절 사구체경화증(FSGS), 및 미세 변화 질환(MCD)에 기인하는 신증후군에서 단백뇨를 고중성지방혈증과 연결시키는 것으로 보인다. 순환 Angptl4는 중성에 가까운 등전점(pI)을 갖고, 중간 내지 중증의 단백뇨 발생 후 주로 골격근, 지방 조직 및 심장으로부터 분비되었다. MCD에서, 단백뇨를 유도하는 높은 pI Angptl4 및 중성 pI Angptl4의 추가적인 조기 족세포 발현은 이전에 보여주었다. 지방 조직 과발현 Angptl4 형질전환 래트(aP2-Angptl4) 및 재조합 Angptl4를 사용하여, 순환 Angptl4는 사구체 내피 αvβ5 인테그린에 결함함으로써 단백뇨를 감소시키는 한편, 또한 리포단백질 리파제(LPL) 중개의 중성지방 흡수를 차단함으로써 고중성지방혈증을 유도하는 것을 보여주었다. 고중성지방혈증이 신증 Angptl4 -/- 마우스에서는 존재하지 않았다. 신증 Angptl4 -/- 및 Itgb5 -/- 마우스, 그리고 항-β5 인테그린 항체를 주사받은 신증 래트는 피크 단백뇨로부터 지연된 회복을 가졌다. 더욱이, LPL 결합 부위에 돌연변이가 있는 재조합 인간 Angptl4는 혈장 중성지방 농도에 영향을 주지 않고 단백뇨를 감소시킬 수 있었다. 요약하면, 순환 Angptl4는 고중성지방혈증을 유도하면서 단백뇨를 감소시키고, 신증 범위 단백뇨에 대한 전신적 반응으로서 말초 기관으로부터 주로 생산된다.

배경

신증후군의 두 핵심적인 특징인 단백뇨와 고지혈증을 연결하는 분자적 경로는 알려져 있지 않다. 고지혈증은 고콜레스테롤혈증과 고중성지방혈증 두 요소를 갖는다 1. 과거에, 고콜레스테롤혈증은 단백뇨와 저알부민혈증에 대한 반응으로 리포단백질의 증가된 간에서의 합성의 결과로 보았다(2). 그러나, 단백뇨와 증가된 간에서의 리포단백질 합성 사이의 정확한 분자적 연계는 알려져 있지 않은 상태이다. 고중성지방혈증의 발생은 훨씬 덜 주목을 받았다. 혈장 중성지방 농도의 주된 결정 요인은 순환으로부터 중성지방의 조직 흡수를 조절하는 내피 결합된 리포단백질 리파제(LPL)의 활성이다(3). LPL이 결핍된 마우스는 매우 높은 중성지방 농도를 발생시키고 생후 곧 사망한다(4). 선행 연구에서는 mRNA가 아닌 LPL 단백질의 활성 및 발현이 신증후군에서 감소하는 것을 보여준다(5). LPL 단백질 활성 및 발현에서 이러한 감소의 분자적 기반, 또는 신증후군에서 단백뇨와의 관련성은 결정되지 않았다.

본 발명자 연구소로부터의 최근 연구는 미세 변화 질환(MCD)에서 순환 및 족세포에서의 Angptl4의 증가된 발현을 보여주었다(6, 7). 족세포-분비된 Angptl4의 생물학적 역할을 연구하기 위해, 두 가지 유형의 형질전환된 래트 모델이 생성되었다. 사구체 내에서 족세포로부터 Angptl4를 선택적으로 과발현하는 NPHS2-Angptl4 형질전환 래트는 순환 Angptl4 농도를 증가시키지 않고 대량의 알부민뇨를 발생시킨다. 대조적으로, 지방 조직으로부터 Angptl4를 선택적으로 과생산하고 분비하는 aP2-Angptl4 형질전환 래트는 높은 순환 Angptl4 농도를 발생시키지만 단백뇨는 아니다. 추가 연구에서는 족세포가 신증후군에서 두 가지 다른 형태의 Angptl4를 분비하는 것을 보여주었다: 저시알릴화된 높은 pI 형태 및 시알릴화된 중성 pI 형태. 시알릴산 전구체 N-아세틸-D-만노사민(ManNAc) 처리는 생체내에서 높은 pI Angptl4를 중성 pI Angptl4로 전환시키고, 알부민뇨/단백뇨를 유의성 있게 감소시킨다. 대조적으로, 정상 및 신증 래트 및 인간에서 순환 Angptl4는 거의 전적으로 시알릴화된 중성 pI Angptl4로 구성된다.

Angptl4는 LPL을 불활성화시킴으로써 LPL 활성을 차단하는 것으로 생각되는데(8), 이는 중성지방 흡수를 감소시키고 고중성지방혈증을 야기한다(9). 인간 ANGPTL4 유전자의 집단 기반의 서열 연구는 E40K 변종을 갖는 약 3%의 유럽 - 아메리카 집단에서 낮은 혈장 중성지방 농도를 밝히고 있다(10). 차후의 연구에서는 E40K 변종을 갖는 재조합 Angptl4는 생체외에서 LPL 활성을 저해할 수 없다는 것을 보여주었다(11). 순환 내의 Angptl4는 N-말단 단편(LPL 저해 영역 및 이중 코일 영역을 포함, 올리고머 형성) 및 C-말단 단편(피브리노겐-유사 영역, 모노머 유지)으로 절단되는 경향이 있고, 아미노산 161과 164 사이 Angptl4 절단 영역에 돌연변이 형성은 전체 길이 단백질의 안정성을 개선한다(11). 본 발명자는 잠재적인 치료적 유의성이 있는 돌연변이를 개발하기 위해 Angptl4의 이들 특성을 이용하였다.

본 연구에서는, 신증후군에서 순환 Angptl4의 생물학적 역할을 조사하였다. 본 발명자는 MN, FSGS 및 MCD에서 증가된 농도의 Angptl4 및 중성지방, 그리고 감소된 LPL 활성에 주목하였다. 또한, 신증후군이 있는 Angptl4 -/- 마우스는 고중성지방혈증을 발생시키지 않았다. 신증후군의 래트 모델에서, 중증의 단백뇨 이후 일차적으로 골격근, 지방 조직 및 심장 기원의 증가된 순환 Angptl4가 발생되었다. 실험적 MCD에서, 일부 순환 Angptl4는 또한 족세포 기원이었다. 증가된 순환 Angptl4는 형질전환 발현에 의하거나 재조합 단백질의 주사에 의해, 중성지방 농도를 증가시키고 LPL 활성을 감소시켰지만, 또한 사구체 내피 αvβ5 인테그린에 결합함으로써 신증 설치류에서 단백뇨를 감소시켰다. β5 인테그린의 부재, 또는 특이적 항체를 사용한 이의 생체내 차단, 또는 순환 Angptl4의 부재는 모두 피크 단백뇨로부터 회복을 보여주었다. 따라서 Angptl4는 단백뇨와 고중성지방혈증 사이의 첫 번째 직접적인 분자적 연계이다. 말초 Angptl4 분비는 일차적으로 신증후군에서 진행중인 단백뇨의 감소를 돕도록 자극되지만, 또한 LPL에 결합하고 고중성지방혈증을 유도하는 것으로 종결되는 것으로 보인다.

결과

신증후군에서 증가된 순환 Angptl4 농도는 고중성지방혈증의 발생을 결정한다:

정상적인 건강한 지원자와 비교할 때, MCD, 국소 분절성 사구체경화증(FSGS), 비-HIV 허탈성 사구체병증(CG), 및 막성 신증(MN)에 기인하는 신증후군이 있는 비처리 환자에서 유의성 있게 증가된 공복시 혈장 Angptl4 농도가 ELISA에 의해 주목되었다(도 6(a), 도 12). 증가된 혈장 Angptl4 농도가 신증후군에서 고중성지방혈증 및 LPL 활성과 상관될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 수동적 Heymann 신염(PHN, MN의 모델)(12, 13), 자발적으로 FSGS를 발생시키는 버팔로 Mna 래트(14,15), 및 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드 신증(PAN, MCD의 모델)(12)에서 혈장 Angptl4, 중성지방 및 포스트-헤파린 LPL 활성을 연구하였다(도 6(b)). 공복시 혈장 Angptl4는 이들 모델에서 중간 내지 중증의 단백뇨를 발생시키기 전이 아니라, 이후에 증가되었다. PHN 및 버팔로 Mna 래트에서, 혈장 Angptl4 농도가 증가하고 혈장 LPL 활성이 감소되었을 때 유의성 있는 고중성지방혈증이 주목되었다(도 6(c)-(h)). PAN에서, 고중성지방혈증은 단백뇨 내내 존재하였고, 단백뇨가 정상화된 후 지속되었고, LPL 활성의 감소와 잘 상관되었다(도 6(i)-(k)). 증가된 순환 Angptl4 농도를 발생시키지만 단백뇨는 발생시키지 않는⁶, aP2-Angptl4 형질전환 래트에서 지방 조직으로부터의 Angptl4 과발현은 또한 고중성지방혈증과 감소된 LPL 활성을 유도하였다(도 6(l) 및 (m)). 대조적으로, 족세포로부터 과발현된 Angptl4가 단백뇨를 야기하지만 순환으로 누설되지 않는 3 개월령의 NPHS2-Angptl4 형질전환 래트는 증가된 중성지방 농도 또는 감소된 LPL 활성을 발생시키지 않았다. 이들 과발현 연구는 Angptl4가 순환으로 들어가는 것이 고중성지방혈증의 발생에 요구됨을 시사한다. 신증후군에서 고중성지방혈증의 발생에 있어서 Angptl4의 상대적 중요성을 연구하기 위해, 중증의 이종 상 보체- 및 백혈구-의존성 단백뇨가 Angptl4 -/- 및 +/+ 마우스에서 γ2-신독성 혈청(NTS)을 사용하여 유도되었다(도 6(n)). Angptl4 +/+ 마우스와 비교할 때, 고중성지방혈증은 NTS 주사된 Angptl4 -/- 마우스에서는 없었지만, 이들 마우스는 유의성 있는 단백뇨를 나타내었다(도 13(a)). 이들 연구는 순환 Angptl4가 신증후군에서 고중성지방혈증의 중대한 중개자임을 보여준다.

신증후군에서 증가된 순환 Angptl4 의 기원

증가된 순환 Angptl4의 기원을 결정하기 위해, 본 출원인은 신증후군의 래트 모델에서 다-기관 Angptl4 mRNA 발현 프로파일을 수행하였다. 증가된 순환 Angptl4 농도(도 6(b)) 및 중증의 단백뇨(도 6(c))에 해당하는 PHN 9 일에(도 7(a)), 현저한 상향조절이 골격근, 백색 지방 조직(WAT), 갈색 지방 조직(BAT), 및 심장에서 주목되었다. 초기 5 일에 사구체 및 간에서 주목된 일시적인 약한 상향조절은 가라앉았다. 증가된 Angptl4 농도(도 6(b)) 및 중간 내지 중증의 단백뇨(도 6(f))가 있는 4.5 개월령 버팔로 Mna 래트(도 7(b))에서, 현저한 상향조절이 심장에서 주목되었다. Angptl4의 사구체 상향조절은 이 모델에서는 보이지 않는다. 신증후군의 자기-제한적 급성 모델인 PAN에서는, 증가된 순환 Angptl4 농도가 질환 내내 일어난다(도 6(b)). 단백뇨의 점증 단계 동안(6 및 10 일)(도 7(c)) 사구체/족세포 Angptl4의 현저한 상향조절은 이전에도 기술되었다(6). 이 "사구체" 단계의 Angptl4 상향조절(6 및 10 일)은 "말초" 단계(14 및 21 일)로 이어지는데, 이 동안은 사구체 상향조절이 없고, 현저한 상향조절은 골격근, WAT 및 BAT에서 주목되었다. NPHS2-Angptl4 형질전환 래트에서 족세포로부터 Angptl4의 단일유전자 과발현은 순환 Angptl4 농도를 증가시키지 않기 때문에, 래트 혈장의 2-차원 겔 웨스턴 블롯 연구는 경증의 PAN이 이들 래트에서 유도된 이후 "사구체" 단계 동안 수행되었다(도 7(d), 7(e), 13(b)). 유의성 있게 더 높은 Angptl4의 순환 농도는 야생형 PAN 래트보다 NPHS2-Angptl4 형질전환 PAN 래트에서 주목되었다. 이식유전자 발현된 단백질이 C-말단에서 V5-태그되므로, 이 순환 단백질은 항-V5 항체와 반응성이고(도 7(f)), 이에 의해, 족세포 기원이 확인된다. 증가된 순환하는 이식유전자 과발현된 Angptl4와 일치하여, aP2-Angptl4 및 NPHS2-Angptl4 형질전환 PAN 래트는 야생형 PAN 래트보다 더 높은 혈장 중성지방 및 더 낮은 LPL 활성을 가졌다(도 7(g) 및 (h)).

신 증후군에서 LPL 및 Angptl4 의 뇨 손실

정상적인 Sprague Dawley 래트와 달리, 신증 래트는 뇨 중에 Angptl4를 소실하여(도 8(a)), 이에 의해 순환 Angptl4 농도는 신증 상태에서 총 Angptl4 생산을 과소평가하도록 시사한다. 정상 래트는 순환으로부터 간 흡수에 의해 Angptl4 방출 LPL을 분해하지만(16), 추가의 손실이 신증후군에서의 뇨 중에 주목되었다(도 8(b), 도 13(c)에서 대조 혈청 블롯). 활성 LPL에 선택적으로 결합하는 단클론 항체인 5D2와의 반응성(도 8(c), 보충 도 7(d)에서 대조 혈청 블롯)은 활성 LPL 또한 중증의 단백뇨 동안 뇨 중에 소실되는 것을 시사한다. 또한, 신증 PAN 래트는 단백뇨가 크게 줄어들 때까지 LPL mRNA 발현을 증가시킬 수 없었다(도 8(d)). 비교에 의해, 비-단백뇨 aP2-Angptl4 형질전환 래트는 증가된 Angptl4 농도에 반응하여 골격근과 심장에서 LPL 발현을 상향조절할 수 있었다(도 8(e)). 이들 인자는 신증후군에서 Angptl4-중개의 고중성지방혈증의 유지 쪽으로 기여할 수 있다.

증가된 순환 Angptl4 는 단백뇨를 감소시킨다

aP2-Angptl4 형질전환 및 야생형 Sprague Dawley 래트에서 PAN의 유도는 형질전환 래트에서 유의성 있게 더 낮은 단백뇨를 밝혀(도 9(a)), 순환 Angptl4가 항-단백뇨 효과를 갖는 것을 시사한다. 이 항-단백뇨 효과가 순환 Angptl4에 의해 특이적으로 유도된 것인지 여부를 시험하기 위해, 이전에 특성화된 토끼 항-래트 Angptl4 항체(6)를 야생형 PAN 래트에 단백뇨의 개시 후 주사하여 순환 Angptl4 농도를 일부 고갈시켰으며, 증가된 단백뇨가 주목되었다(도 9(b)). 다음에, 재조합 시알릴화된 래트 Angptl4를 버팔로 Mna 래트(도 9(c)), 및 사구체간질 손상의 모델인 항-Thy1.1 신염이 있는 래트(도 9(d))에 정맥내 주사하였다. 두 경우 모두, 유의성 있는 단백뇨의 감소가 주목되었다.

감소된 LPL 불활성화를 갖는 인간 Angptl4 변종은 단백뇨를 감소시킨다

중성지방 흡수에 대한 Angptl4의 LPL 중개의 효과를 단백뇨에 대한 효과와 분리하기 위해, 2 부위에서 돌연변이를 갖는 인간 Angptl4의 pcDNA3.1 V5 His B 구성물을 생성하였다(도 10(a)). 한 세트의 돌연변이는 LPL에 대한 결합에 중요한 것으로 알려진 부위 또는 근처에 만들었다(아미노산 40 또는 39). 다른 세트의 돌연변이는 전체 길이 Angptl4의 절단에 연계된 것으로 알려진 영역에 만들었다(아미노산 161 내지 164).

다음에, HEK 293 기반의 안정적 세포주를 이들 변종과 야생형 플라스미드를 위해 발생시키고, 상등액을 포함하는 재조합 단백질을 무혈청 조건에서 수확하였다. Angptl4의 적절한 시알릴화를 확보하기 위해, ManNAc(N-아세틸-D-만노사민)을 배양 배지에 첨가하였다. 다음에 야생형 및 재조합 Angptl4를 항-V5 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 평가하였고, 적절한 크기에서 변종 단백질의 이동 및 감소된 절단이 주목되었다(도 10(b)). 동일한 양의 인간 재조합 Angptl4를 단백뇨 버팔로 Mna 래트에 단일 정맥내 주사 후, 변종 단백질에서 더 높은 피크 농도가 주목되었다(도 10(c)). 단백뇨의 유의성 있는 감소는 단일 주사 2 주 후에 야생형 및 변종 단백질에서 주목되었다(평균 ± 기초선의 백분율로서 바닥의 SE: 야생형 8525, 53.8 ± 6.3; 변종 8501, 35.9 ± 12.1; 변종 8515, 41.2 ± 7.2)(도 10(d)). 혈장 중성지방 농도는 주사 3 및 6 시간 후 기초선과 비교하여 야생형에서 유의성 있게 높았지만 변종 Angptl4 주사 래트에서는 그렇지 않았다(도 10(e)). 중성지방 농도는 6 시간에 야생형 단백질 주사 래트보다 변종 단백질에서 유의성 있게 더 낮았다. 12 시간과 17 일 사이의 공복시 중성지방 농도는 야생형과 변종 Angptl4 주사 래트 사이에 구분할 수 없었고 대조군과 유사하였다(도 13(e)).

순환 Angptl4 는 사구체 내피 αvβ5 인테그린과 결합함으로써 단백뇨를 감소시킨다:

항-V5 항체를 사용한 aP2-Angptl4 TG 래트 신장의 공초점 이미징은 지방 조직 분비된 Angptl4-V5가 사구체 내피와 공동국재화된 것을 보여주었다(도 11(a)). 면역금 EM을 사용하여, 이 Angptl4-V5는 사구체 내피 표면, 주로 내피 세포-사구체 기저막 접점의 영역에서 주목되었다(도 11(b)). 안정적 세포주로부터 분비된 재조합 래트 Angptl4를 사용하여, 본 발명자들은 신증 상태에서 순환 Angptl4를 모방하는 시알릴화된 Angptl4 단백질이 배양된 래트 사구체 내피 세포(GEnCs)를 산화적 손상으로부터 보호하는 한편, PAN 및 NPHS2-Angptl4 TG 래트에서 족세포-분비된 Angptl4의 약 절반을 포함하는 전-단백뇨 형태인 저시알릴화된 Angptl4는 산화적 손상의 효과를 증가시키는 것을 보여주었다(도 11(c)).

Angptl4은 최근 β5 인테그린에 결합하는 것으로 나타났기 때문에(17), 단백뇨에 대한 순환 Angptl4의 보호 효과가 사구체 내피에 존재하는 αvβ5 인테그린에 대한 결합을 통해 중개되는지 여부를 결정하였다. 이 단백질 : 단백질 상호작용은 재조합 래트 Angptl4 및 정제된 인간 αvβ5 인테그린으로 코팅된 플레이트를 사용하여 확인되었고, 강한 용량 의존적 결합(R² 0.996)이 주목되었다(도 11(d)). β5 인테그린 녹아웃(Itgb5 -/-) 및 야생형(Itgb5 +/+) 마우스에서 2-NTS를 사용한 신증후군의 유도는 회복 단계(5 및 7 일) 동안 녹아웃 마우스에서 훨씬 더 높은 수준의 단백뇨를 밝혔으며(도 11(e)), 이는 이 모델에서 골격근 및 지방 조직으로부터의 순환 Angptl4 생산의 말초 단계와 일치한다(보충 도 14(a) 및 (b)). 이는 피크 단백뇨(3 일 넘어서)로부터의 감소가 αvβ5 인테그린 결합에 의한 항-단백뇨 효과를 발휘하는 Angptl4 유사 순환 단백질의 존재에 의해 영향을 받았다는 것을 시사한다. αvβ5 인테그린 - Angptl4 상호작용을 차단하기 위해, 세포외 부분의 β5 인테그린에 대한 항체(항-β5 인테그린 항체) 또는 면역전 혈청을 야생형 (Sprague Dawley) 래트(도 11(f), 보충 도 14(c) 및 (d)) 및 aP2-Angptl4 형질전환 래트(도 11(g))에 피크 단백뇨로부터 회복 동안(10 일 넘어서, 순환 Angptl4 생산의 말초 단계에 상응함)에 PAN에서 주사하였다. 두 모델 다에서 회복의 유의성 있는 지연이 주목되었다. 최종적으로, 신증후군을 Angptl4 +/+ 및 Angptl4 -/- 마우스에서 유도하였고 피크 단백뇨(7 일)로부터의 회복에서 유의성 있는 지연이 순환 Angptl4 생산의 말초 단계 동안 주목되었으며, 이는 Angptl4 -/- 마우스에서는 없다(도 11(h)). 사구체 단계 동안 Angptl4 -/- 마우스에서 더 낮은 수준의 단백뇨는, 이 모델에서 몇 가지 단백뇨의 원인 중 하나로서 본 발명자가 이전에 발표한 족세포 분비 저시알릴화된 Angptl4에 대한 기술(6)과 일치한다.

추가 변종

4 가지 추가 변종 단백질이 연구되었다: 8496, 8506, 8511, 및 8520. 각각은 도 17에 나타낸 바와 같이 위치 39, 40, 또는 161-164에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. HEK 293 기반의 안정적 세포주가 개발되어 변종 단백질을 발현하도록 위에 기술된 바와 같이 배양되었다. 4 변종 단백질 모두는 항-V5 항체로 V-5 태그되고, 다음에 항-V5 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가되고, 적절한 크기에서 변종 단백질의 이동 및 감소된 절단이 주목되었다. 결과는 웨스턴 블롯을 통해 절단된 단백질의 양이 야생형과 비교하여 변종에서 유의성 있게 감소된 것을 보여준다(도 18). 동일한 양의 변종 8511 단백질을 단백뇨 버팔로 Mna 래트에 단일 정맥내 주사 후, 더 높은 피크 수준이 변종 8511에서 주목되었다(도 19). 적색 화살표는 재조합 단백질이 주사된 단일 시점을 나타낸다. 두 변종 인간 Angptl4 단백질(15 ㎍)을 Zucker 당뇨병 비만 래트(당뇨병성 신증 및 당뇨병성 신장 질환의 모델, n = 4 래트/군)에 주사하고, 이후 변종 단백질의 증가된 순환 농도(도 20)가 단백뇨의 감소와 함께(도 21) 주목되었으나, 혈장 중성지방 농도에서는 유의성 있는 증가가 없었다(도 22). * P<0.05, ** P<0.01. # P<0.05. 모든 * 값은 기초선 0 일 값에 대한 것이다.

논의

임의의 주어진 가상적인 모델에 의해 구애받지 않고, 이 연구는 순환 Angptl4가 신증후군에서 핵심적인 분자적 중개자임을 보여준다(도 15). 최초로, 이 증후군의 두 핵심 성분인 단백뇨와 고중성지방혈증이 어떻게 분자적 수준에서 연결되어 있는지 기술한다. 사구체는 다른 질환 사이에서 변화하는 기전에 의한 단백뇨 발생의 중심지이다. 단백뇨와 부종의 준-급성 개시와 공통적으로 연계되는 두 병태인 MN 및 FSGS의 동물 모델을 사용하여, 말초 기관, 특히 골격근, 지방 조직 및 심장이 Angptl4 발현을 상향조절함으로써 단백뇨 증가에 반응하는 것이 입증되었다. 순환 Angptl4는 이 단계에서 독점적으로 이들 말초 기관으로부터 유래되어, 두 가지 강력한 효과를 갖는다. 첫째로, 이는 사구체 내피에서 αvβ5 인테그린에 결합하고 단백뇨를 감소시키는데, 이에 의해 증가하는 순환 Angptl4의 1차 목적이 단백뇨를 감소시키기 위한 시도임을 시사한다. 둘째로, 그리고 아마도 증가하는 순환 Angptl4 농도의 의도하지 않은 결과는 LPL에의 결합(이의 생리적 기능), 감소된 중성지방 흡수 및 고중성지방혈증이다. 본원에서 논의되는 단백뇨와 고중성지방혈증 사이의 연계는 단백뇨의 1차적 병인과는 관련이 없고, 순환 Angptl4에 의한 이의 감소/변경과 관련되는 것을 명확히 하는 것이 중요하다. 인간 신증후군에서 단백뇨의 시작과 고중성지방혈증의 발생 사이의 지연은 Angptl4의 말초 생산에 의해서도 설명되는데, 이 반응을 발생시키기 위해서는 중간 내지 중증의 단백뇨(인간에서 적어도 3.5 그램/24 시간)가 요구되기 때문이다. 초기에, 이들 두 동물 모델에서 경증의 단백뇨는 말초 기관 Angptl4 반응, 증가된 혈장 Angptl4 또는 증가된 중성지방 농도와 연계되지 않았다. 말초 조직으로부터의 증가된 Angptl4 분비는 또한 공복에 대한 생리적 반응이므로(18), Angptl4의 증가된 말초 생산은 신증후군에서 과도한 뇨 단백질 손실을 억제하기 위해 신체에 의해 사용되는 공복-유사 반응의 일부일 가능성이 있다.

추가로 흥미 있는 교습은 MCD 모델인 PAN 래트로부터 알게 되는데, 여기에서는 부종과 단백뇨의 시작이 급성이다. 선행 연구(6)에서는 MCD에서 족세포가 두 가지 다른 형태의 Angptl4를 생산하는 것을 보여준다: 단백뇨를 유도하는 높은 pI, 저시알릴화된 형태, 그리고 순환 Angptl4와 동일한 중성의 pI 시알릴화된 형태. 다른 인자들 중에서도, 부적절한 시알산 기질은 MCD에서 족세포에 의한 높은 pI Angptl4의 생산에 주된 역할을 하고, 시알산 전구체인 N-아세틸-D-만노사민을 사용하여 높은 pI Angptl4를 중성 pI Angptl4로 생체내 전환시키는 것은 단백뇨를 감소시킨다. FSGS 및 MN과 달리, 저시알릴화된 Angptl4의 사구체 상향조절은 이 질병에서 단백뇨의 전개에 핵심적인 역할을 한다. 순환하는 시알릴화된 Angptl4는 그 원천이 초기 단계(즉, 사구체 단계)에서는 사구체이고 후기 단계에서는 골격근 및 지방 조직(즉, 말초 단계)으로 PAN 모델의 기간에 걸쳐 높게 유지된다. 이 논문에서 생체외 연구는, 산화적 스트레스의 세팅에서 내피 손상을 높은 pI Angptl4는 증가시키고, 중성 pI Angptl4는 감소시키는 것을 보여준다. 높은 pI Angptl4에 대한 추가 연구는 이 논문의 범위를 벗어나는 것이다. 이 논문에서 생체내 연구를 위해 사용된 모든 재조합 Angptl4는 중성 pI 시알릴화된 형태였다. MN 및 FSGS의 래트 모델에서와 같이, PAN 래트도 10 일 이후 단백뇨의 감소에 유의성 있게 기여하는 Angptl4 상향조절의 말초 단계를 발생시킨다.

모든 모델에서 단백뇨 감소에 대한 중요한 중개자는 사구체 내피의 Angptl4 - αvβ5 인테그린으로, 녹아웃 마우스에서 β5 인테그린 또는 Angptl4의 부재, 또는 β5 인테그린의 세포외 부분에 대해 유도된 항체를 사용한 이 상호작용의 차단은 단백뇨 저하의 속도를 감소시켰기 때문이다. PAN에서 Angptl4 생산의 말초 단계의 다른 효과는 단백뇨가 진정된 후에도 경증의 고중성지방혈증의 지속(21 일)이다. 유사한 잔류 고중성지방혈증이 이전에, MCD가 있는 어린이에서 병이 차도를 보인 후 기록되어 있다(19). 순환 Angptl4는 다른 사구체 세포 표면 분자와 상호작용할뿐 아니라 보호 효과를 발휘할 가능성이 있다. 사구체 내피 αvβ5 인테그린에 대한 Angptl4의 결합을 추적하는 두 가지 이유가 있다. 첫째로, 공초점 이미징 및 면역금 전자 현미경은 aP2-Angptl4 형질전환 래트에서 지방 조직으로부터 분비된 Angptl4-V5는 사구체에서 내피 세포에 특이적으로 결합하는 것을 보여주었다. 둘째로, αvβ5는 Angptl4와 상호작용하는 것으로 보이는 생체내 사구체 내피 세포에서 발현되는 유일한 인테그린이다. 다른 주요 사구체 내피 인테그린인 αvβ3는 Angptl4와 상호작용하지 않는다(17)(본 발명자에 의해 확인됨. 데이터는 나타내지 않음). 내피 αvβ5 인테그린에 대한 Angptl4 결합이 단백뇨를 감소시키는 정확한 기전은 후에 조사될 것이다. 추정되는 내피 - 족세포 피드백 루프가 영향을 받을 가능성이 있다.

추가로 흥미 있는 관찰은 단일 유전자 과발현 후 Angptl4가 순환으로 들어가는 것은 기관 의존성이라는 것이다. 과거(20)의 심장 특이적 Angptl4 과발현 형질전환 마우스와 유사하게, NPHS2-Angptl4 래트의 족세포에서 Angptl4의 단일유전자 과발현은 순환으로의 진입을 자동적으로 허용하지 않는다. 대조적으로, 지방 조직(aP2-Angptl4 형질전환 래트(6), aP2-Angptl4 형질전환 마우스(18))에서의 과발현은 순환 Angptl4 농도를 신뢰성 있게 증가시킨다. 족세포 분비 Angptl4의 순환으로의 진입은 Sprague Dawley 래트 PAN 사구체 단계 및 PAN이 있는 NPHS2-Angptl4 형질전환 래트에서 주목된 바와 같이, 사구체에서 생산되는 아직 미확인된 단백질과 같은 다른 것의 활성을 요구하는 듯하다. 이는 또한 인간 사구체 질환에도 잘 부합하는데, 여기에서는 복수의 유전자 및 단백질의 발현이 동시에 영향을 받는다. 따라서, 순환 Angptl4의 전신적 이용 가능성 및 효과는 질병 진행의 일부로서 복수의 기관에서 변경된 다른 유전자 / 단백질에 의해, 그리고 신증 상태에서 Angptl4 및 LPL의 뇨 손실에 의해 영향을 받는 듯하다.

순환 Angptl4의 항-단백뇨 효과는 많은 다른 형태의 사구체 질환의 치료를 위해 사용되는 글루코코르티코이드의 효능에서 이미 부분적인 역할을 할 수 있다. Angptl4 발현에 대한 글루코코르티코이드의 작용은 기관 의존성이다. 이들은 MCD에서 족세포의 Angptl4 발현을 감소시키는 한편(6), 마우스에서 Angptl4의 지방 조직 발현을 증가시키는 것을 보여준다(21). 추후의 연구에서 글루코코르티코이드가 지방 조직으로부터 순환으로 충분한 양의 Angptl4 분비를 유도하는지 여부, 이 효과가 생체내에서 용량 의존성인지 여부, 그리고 이것이 신증후군에서도 일어나는지 여부를 조사할 수 있을 것이다.

다른 가용성 단백질이 인간 사구체 질환의 병인에 연루된 것을 시사한다. 족세포로부터 분비되고 또한 순환 중에 존재하는 혈관 내피 성장 인자는 인간 혈전성 미소혈관증의 발생에 연루된 것을 보여주고, 내피 및 족세포 표면에서 발현되는 특이적 수용체를 통해 그 생물학적 효과를 발휘한다(22). 가용성 fms-유사 타이로신 키나제 1(23) 및 가용성 엔도글린(24)은 전-자간증에서 태반으로부터 과량으로 분비되는데, 사구체내피증의 병인에 연계된다. 그러나, 이들 단백질은 질병 병인에 연루된 것이고 질병에 대한 전신적 반응은 아니다. 가용성 유로키나제 수용체 suPAR는 최근 족세포 αvβ3 인테그린에 결합함으로써 1차적으로 발휘되는 전-단백뇨 효과를 갖는 것을 보여준다(25). 항-단백뇨 Angptl4 및 전-단백뇨 suPAR 사이의 공통 분모는 둘 다 순환 단백질과 사구체 인테그린의 상호작용이다. 동일 군에 의한 후속 연구는 suPAR 농도가 NPHS2 유전자에서 돌연변이를 갖는 FSGS 환자에서 또한 증가되는 것을 보여준다(26). 이는 NPHS2 돌연변이가 있는 이들 환자에서, suPAR의 증가는 사구체 질환에 대한 전신적 반응임을 시사할 것이다. 이 경우, SuPAR는 사구체 손상 또는 단백뇨에 대한 반응으로 증가되고 내재된 사구체 질환의 과정에 영향을 주는 강력한 효과를 갖는 Angptl4로 예시되는 순환 단백질 계열에 결합한다. 이 목록은 비-HIV 허탈성 사구체병증의 병인에 영향을 주는 추정상의 순환 단백질(27, 28)이 확인되면 가까운 미래에 늘어날 것이다.

최근, 인간 Angptl4의 돌연변이 형태가 혈장 중성지방 농도에 유의성 있는 영향을 주지 않으면서 단백뇨를 매우 유의성 있게 감소시킬 수 있고(대략 60%의 평균 피크 감소), 단일 정맥내 주사 후 적어도 2 주 동안 유효하다. 이들 재조합 단백질은 인간 사구체 질환에 대한 치료제로서 추가 개발 가능성이 있다. 요약하면, 순환 Angptl4는 신증후군의 중요한 생물학적 중개자이고, 단백뇨와 고중성지방혈증 사이에서 중대한 연결을 보여준다.

실시예 4를 위한 방법

인간 및 설치류 Angptl4 를 위한 ELISA

환자 및 대조 혈장 샘플로부터 인간 Angptl4를 측정하기 위한 샌드위치 ELISA를 R&D Systems(Minneapolis MN, USA)으로부터 구입하였다. 표준 곡선은 1.25 ng/mL 및 40 ng/mL 사이에서 교정되고, 0.98의 R² 값을 가졌다(보충 도 16(a)).

혈장에서 래트 및 마우스 Angptl4를 측정하기 위해, 새로운 ELISA 방법이 개발되었다. 양 항-래트 Angptl4 항체(5006B)를 아미노산 22 내지 101에 대하여 얻고, 양성 대조군으로서 이전에 발표된 토끼 항-래트 Angptl4 항체(6)를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 특이성을 특성화하였다. 활성은 또한 재조합 Angptl4를 사용하여 흡수되었고 웨스턴 블롯 및 면역형광에 의해 반응성의 손실이 기록되었다. 분석은 재조합 래트 Angptl4를 분비하는 이전에 발표된 HEK293 기반의 안정적 세포주로부터의 농축된 상등액을 사용하여 표준화하였다. 웰을 0.1 내지 0.5 mg 사이의 농축된 상등액으로 코팅하였다. 블로킹 및 세척 후, 10 ㎍의 양 항-래트 Angptl4 항체를 가한 다음, 세척, 16 ng/웰의 당나귀 항-양 Ig HRP(Jackson laboratories), 세척, 그리고 TMB 시스템 시약, 그리고 ELISA 플레이트 판독기에서 OD 450 nm로 측정하였다. 0.998의 R²를 갖는 선형 관계의 표준 곡선이 얻어졌다(도 16(b)). 설치류 혈장의 분석을 위해, 웰을 50 μL의 혈장으로 이중 코팅한 다음, 위에 상술한 단계를 실시하였다. 연구 샘플을 제외한 모든 시약을 포함하는 공시험 대조군 웰로부터의 판독을 얻고 연구 샘플의 판독으로부터 뺐다. 최소 4 샘플을 각 시점에서 측정하였다.

ELISA 분석에 사용된 인간 혈장 샘플은 UAB(PI Chugh), Instituto Nacional De Cardiologia, Mexico City (PI Avila-Casado)에서 수행된 IRB 허용 연구로부터, 그리고 이전에 발표된 연구(6)로부터 얻었다.

동물 연구

NPHS2-Angptl4 및 aP2-Angptl4 형질전환 래트의 생성 및 특성화는 이전에 발표되었다(6). 버팔로 Mna 래트는 Kyoto University, Kyoto Japan의 Dr. Masao Mitsuyama로부터 MTA를 통해 얻었다. 달리 명시하지 않는 한, 버팔로 Mna 래트에 대한 모든 비교는 연령과 성별이 일치하는 Sprague Dawley 및 Wistar 래트와 이루어졌다. 결과가 유사하였으므로, Sprague Dawley 래트와의 비교로부터 얻은 데이터만 제시된다. Itgb5 -/- 및 대조 129S1/SvImJ 마우스는 Jackson Laboratories(Bar Harbor ME USA)로부터 구입하였다. Angptl4 -/- 마우스는 Eli Lilly Corporation으로부터 Sander Kersten에게 제공되었다. Angptl4 -/- 마우스의 모든 연구는 Wageningen University의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 다른 모든 동물 연구는 University of Alabama at Birmingham의 Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.

단일 정맥내 용량 PAN(n = 4 래트 / 군), PHN (n = 4 래트 / 군) 및 항-Thy1.1 신염(n = 4 래트 / 군)의 유도는 이전에 기술되었다(12, 13). 전체 용량 PAN을 위해, 퓨로마이신 아미노뉴클레오타이드(Sigma Chemical Company, St. Louis MO USA) 15 mg/100 그램을 사용하였다. 경증의 PAN을 위해, 용량을 7.5 mg/100 그램으로 감소시켰다. 양 항-래트 신독성 혈청(NTS, Boston Medical Center의 David Salant로부터의 친절한 선물)의 γ2 분획을 사용한 보체- 및 백혈구-비의존성 신증후군(n = 4 마우스 / 군)의 유도는 이전에 기술되었다(29). 토끼 항-래트 Angptl4 항체(6)를 PAN 래트(n = 3 래트 / 군)로 주사하는 동물 연구를 위해, 500 μL의 항체 또는 면역전 혈청을 각 용량으로 주사하였다. 항체에 의한 순환 Angptl4의 고갈은 웨스턴 블롯으로 확인되었다. 래트 PAN 연구에서 용량 당 주사된 항-β5 인테그린 항체 또는 면역-전 혈청의 용량은 다음과 같다: Sprague Dawley 래트 PAN(250 μL; aP2-Angptl4 형질전환 래트 PAN(500 μL).

다기관 유전자 발현 연구를 위해, 기관 샘플을 안락사 직후 액체 질소에서 급속 냉동시켰다(3 래트 또는 마우스/기관 샘플, 집단). 백색 지방 조직을 복부로부터 얻고, 갈색 지방 조직은 견갑간 부위로부터, 골격근은 대퇴부로부터, 냉동 온전한 간 또는 샘플은 좌측 및 우측 간엽으로부터, 냉동된 온전한 심장, 그리고 냉동되고 사구체 분리를 위해 차후 사용되는 래트 신장을 얻었다. 마우스 실험에서, 신장은 다이나비드(dynabead)를 사용하여 안락사 직후 심장을 통해 관류하였고, 다음에 사구체 분리를 위해 사용하였다. 12 개의 cDNA 주형을 각 집단 기관으로부터 생성시켰고, 유전자 발현은 Taqman 실시간 PCR로 평가하였다.

재조합 래트 및 인간 Angptl4 의 주사

HEK293 세포 기반의 안정적 세포주로부터 시알릴화된 래트 Angptl4의 수확은 이전에 기술되었다(6). 농축된 HEK293 Angptl4 또는 래트 Angptl4를 포함하는 빈 pcDNA 3.1 V5 His 벡터 안정적 세포주 상등액(1.8 mg, 대략 200 mL의 배지로부터 유래)을 버팔로 Mna 래트(n = 4 래트 / 군) 및 Thy1.1 래트(n = 4 래트 / 군) 연구에서 용량 당 주사하였다. 재조합 인간 야생형 Angptl4, 변종 Angptl4 및 대조 단백질을 버팔로 Mna 래트(n = 3 래트 / 군)에 주사하는 연구를 위해, 농축된 상등액 중 55 ㎍의 재조합 단백질(ELISA로 정량), 또는 동일한 양의 대조군 안정적 세포주 상등액(단백질 분석으로 동량화)을 용량 당 사용하였다.

포스트 헤파린 LPL 활성

래트에 안락사 15 분 전 10 단위 / 100 g 체중의 돼지 헤파린을 정맥내 주사하고, Roar Biomedical, Inc(New York NY USA)으로부터의 분석을 사용하여 활성을 측정하였다(30). 혈청 중성지방은 자동분석기(일부 연구) 또는 Cayman Chemical Company(Ann Arbor MI USA)로부터의 키트를 사용하여 공복 상태에서 측정하였다.

다음 기술은 이전에 기술되어 있다: 대사 케이지에서 18 시간 뇨 수집, 단백뇨의 측정, 마우스 뇨 알부민 및 크레아티닌, 2D 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯, 공초점 이미징, 면역금 전자 현미경, 총 RNA의 추출, cDNA 주형의 생성(2 ㎍ 총 RNA / 주형), 실시간 PCR(6, 12, 13, 31). 실시간 PCR 연구에서, mRNA 발현의 3-배 변화는 유의성 있는 것으로 간주되고 선행 발표에서 본 발명자에 의해 입증되었다(13, 31). LPL을 위한 웨스턴 블롯은 염소 항-LPL 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA USA), 및 활성 이량체 LPL을 특이적으로 확인하는 5D2 단클론 항체(University of Washington의 John Brunzell로부터의 선물)를 사용하여 수행되었다(32). 2D 겔 웨스턴 블롯의 밀도측정은 Image Quant TL 7.0 소프트웨어(GE Healthcare, Waukesha WI USA)를 사용하여 수행되었다. 마우스 항-PECAM1 항체는 BD Pharmingen(San Diego CA USA)로부터 구입하였다. 사용된 모든 2차 항체는 Jackson ImmunoResearch laboratories(West Grove PA USA)로부터 구입하였고, 비-표적 종에 대한 최소 배경 반응성을 가졌다.

인간 Angptl4 변종 구성물 및 안정적 세포주의 개발

인간 Angptl4 클론은 PCR 기반의 돌연변이유발을 사용하여 변이시켰다. pcDNA 3.1 V5 His 벡터 내 야생형 및 변종 인간 Angptl4 클론을 사용하여 HEK 293 기반의 안정적 세포주를 이전에 기술된 바와 같이 개발하였다(6). 단백질 수확에 사용될 때, 무혈청 DMEM은 배지로 분비되는 재조합 단백질의 적절한 시알릴화를 확보하기 위해 시알산의 전구체인 25 mM N-아세틸-D-만노사민(ManNAc)을 포함하였다. 이전에 기술된 바와 같이(6) 단백질을 수확하고 상등액을 농축하였다. 재조합 인간 Angptl4는 ELISA를 사용하여 정량하였다.

내피 세포 연구

무혈청 조건에서 24 시간 동안 성장한 배양된 래트 GEnCs를 H₂O₂(200 μM) 유도된 스트레스를 받게 하고, Angptl4-HEK293 또는 대조-HEK293 안정적 세포주로부터의 농축된 상등액 동일 양과 공동-배양하였다. LDH 농도는 24, 48, 및 72 시간에 상등액에서 세포독성 키트(Roche Applied Science Indianapolis IN USA)를 사용하여 세포 손상의 척도로서 측정하였다.

αvβ5 인테그린 플레이트 분석

96 웰 플레이트를 5 ng 인간의 정제된 αvβ5 인테그린 / 웰로 코팅하고, 1% BSA를 갖는 TBST로 블로킹한 다음, 래트 Angptl4-V5를 분비하는 안정적 세포주로부터의 농축된 상등액의 증가하는 양과 함께 배양하였다. V5 태그는 항-V5 HRP 항체(Life Technologies, Grand Island NY USA, 1:2500)를 사용하여 검출하였고, TMB 퍼옥시다제 기질 및 용액(KPL, Inc., Gaithersburg MD USA)을 사용하여 반응을 전개시키고, Labsystems Multiscan MCC340(Thermo Fisher Scientific, Waltham MA USA)로 450 nm에서 판독하였다.

항-β5 인테그린 항체의 생성 및 특성화

융합 단백질은 토끼에서 2 개의 다클론 항체를 생성하기 위해 인간 β5 인테그린의 세포외 부분의 일부에 대하여 생성하였다(항체 8472A, 아미노산 35-460, 인테그린 베타 영역 포함; 항체 8472B, 아미노산 461 내지 719, 인테그린 베타 테일 포함). 재조합 인간 β5 인테그린에 대한 반응성을 흡수하기 전과 후에 두 항체를 웨스턴 블롯으로 특이성을 시험하였다. 파일럿 연구는 Sprague Dawley 래트(n = 3 래트 / 군)에서 PAN을 유도하고, 회복 단계 동안 2 용량의 각 항체를 정맥내 투여하여 β5 인테그린의 생체내 차단(즉, 단백뇨의 더 느린 회복)을 평가하도록 수행되었다. 8472A의 효능이 8472B보다 수 배 더 높기 때문에, 8472A(도 16(c))를 추가 연구에 사용하였다(n = 4 래트 / 군). 이 항체의 정맥내 투여 후, 사구체의 공초점 이미징은 사구체에서 내피로의 국재화를 보여주었다(도 16(d)).

통계적 분석

두 군 사이의 차이 분석은 Microsoft Excel 2010에서 언페어드 스튜던트 t 테스트를 사용하여 수행하였다. 3 이상의 군에서는, GraphPad InStat 소프트웨어, Version 3.10을 사용하여 ANOVA 사후 분석 시험이 사용되었다.

참고문헌( 실시예 4 제외)

1. Falk R, Jennette C, Nachman PH. Primary glomerular disease. In The Kidney, Brenner BM, editor, 6^th edition, 1263-1349 (2000).

2. Gutman, A. & Shafrir, E. Adipose tissue in experimental nephrotic syndrome. Am. J. Physiol. 205, 702-706 (1963).

3. Vaziri, N.D. Molecular mechanisms of lipid disorders in nephrotic syndrome. Kidney Int. 63, 1964-1976 (2003).

4. Shearer, G.C. & Kaysen GA. Endothelial bound lipoprotein lipase (LpL) depletion in hypoalbuminemia results from decreased endothelial binding, not decreased secretion. Kidney Int. 70, 647-653 (2006).

5. Reaven, E.P., Kolterman, O.G. & Reaven, G.M. Ultrastructural and physiological evidence for corticosteroid-induced alterations in hepatic production of very low density lipoprotein particles. J. Lipid Res. 15, 74-83 (1974).

6. Tsukamoto, Y., Kokubo, T., Horii, A., Moriya, R. & Kobayashi, Y. Lipoprotein derangement during steroid treatment in minimal-change nephrotic syndrome. Nephron 73, 606-612 (1996).

7. Liu, G., Clement, L., Kanwar, Y.S., Avila-Casado, C. & Chugh, S.S. ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephrotic syndrome. J. Biol. Chem. 281, 39681-39692 (2006).

8. Yoon, J.C. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma target gene encoding a novel angiopoietin-related protein associated with adipose differentiation. Mol. Cell. Biol. 20, 5343-5349 (2000).

9. Kersten , S.et al. Characterization of the fasting-induced adipose factor FIAF, a novel peroxisome proliferator-activated receptor target gene. J. Biol. Chem. 275, 28488-28493 (2000).

10. Kim, I. et al. Hepatic expression, synthesis and secretion of a novel fibrinogen/angiopoietin-related protein that prevents endothelial-cell apoptosis. Biochem. J. 346, 603-610 (2000).

11. Yoshida, K., Shimizugawa, T., Ono, M. & Furukawa, H. Angiopoietin-like protein 4 is a potent hyperlipidemia-inducing factor in mice and inhibitor of lipoprotein lipase. J. Lipid Res. 43, 1770-1772 (2002).

12. Ge , H., et al. Oligomerization and regulated proteolytic processing of angiopoietin-like protein 4. J. Biol . Chem. 279, 2038-2045 (2004).

13. Ge , H., Yang, G., Yu , X., Pourbahrami , T. & Li , C. Oligomerization state-dependent hyperlipidemic effect of angiopoietin-like protein 4. J. Lipid Res. 45, 2071-2079 (2004).

14. Romeo, S., et al. Population-based resequencing of ANGPTL4 uncovers variations that reduce triglycerides and increase HDL. Nat. Genet. 39, 513-516 (2007).

15. Romeo, S. et al. Rare loss-of-function mutations in ANGPTL family members contribute to plasma triglyceride levels in humans. J. Clin . Invest. 119:70-79 (2009).

16. Eremina, V., et al. VEGF inhibition and renal thrombotic microangiopathy. N. Engl . J. Med. 358, 1129-1136 (2008).

17. Davis, B., et al. Podocyte-specific expression of angiopoietin-2 causes proteinuria and apoptosis of glomerular endothelia. J. Am. Soc . Nephrol. 18, 2320-2329 (2007).

18. Avila-Casado, C., et al. Proteinuria in rats induced by serum from patients with collapsing glomerulopathy. Kidney Int. 66, 133-143 (2004).

19. Mandard , S., et al. The fasting-induced adipose factor/angiopoietin-like protein 4 is physically associated with lipoproteins and governs plasma lipid levels and adiposity. J. Biol. Chem. 281:934-944 (2006).

20. Clement, L., et al. Early changes in gene expression that influence the course of primary glomerular disease. Kidney Int. 72, 337-347 (2007).

21. Cazes , A. et al. Extracellular matrix-bound angiopoietin-like 4 inhibits endothelial cell adhesion, migration, and sprouting and alters actin cytoskeleton. Circ. Res. 99, 1207-1215 (2006).

22. Malicdan, M.C., Noguchi, S., Hayashi, Y.K., Nonaka, I. & Nishino, I. Prophylactic treatment with sialic acid metabolites precludes the development of the myopathic phenotype in the DMRV-hIBM mouse model. Nat. Med. 15, 690-695 (2009).

23. Galeano , B. et al. Mutation in the key enzyme of sialic acid biosynthesis causes severe glomerular proteinuria and is rescued by N-acetylmannosamine. J. Clin. Invest. 117, 1585-1594 (2007).

24. Ruge , T. et al.Lipoprotein lipase in the kidney: activity varies widely among animal species. Am. J. Physiol . Renal Physiol. 287, F1131-F1139 (2004).

25. Koliwad, S.K. et al. Angiopoietin-like 4 (ANGPTL4/FIAF) is a direct glucocorticoid receptor target and participates in glucocorticoid-regulated triglyceride metabolism. J. Biol. Chem. 284, 25593-25601 (2009).

26. Liu, G. at al. Neph1 and nephrin interaction in the slit diaphragm is an important determinant of glomerular permeability. J. Clin . Invest. 112, 209-221 (2003).

27. Dijkman, H.B.P.M., Mentzel, S., de Jong, A.S. & Assmann, K.J.M. RNA in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Biochemica 2, 23-27 (1995).

28. Isogai , S., Mogami , K., Shiina , N. & Yoshino , G. Initial ultrastructural changes in pore size and anionic sites of the glomerular basement membrane in streptozotocin-induced diabetic rats and their prevention by insulin treatment. Nephron. 83, 53-58 (1999).

29. Bakker, W.W. et al. Altered activity of plasma hemopexin in patients with minimal change disease in relapse. Pediatr . Nephrol. 20, 1410-1415 (2005).

30. Graves, R.A., Tontonoz, P., Platt, K.A., Ross, S.R. & Spiegelman, B.M. Identification of a fat cell enhancer: analysis of requirements for adipose tissue-specific gene expression. J. Cell Biochem. 49, 219-224 (1992).

31. Yoshida, K., Ono, M., Koishi , R. & Furukawa , H. Characterization of the 5' regulatory region of the mouse angiopoietin-like protein 4. Vet. Res. Commun. 28, 299-305 (2004).

32. Zeng, L. et al. HMG CoA reductase inhibition modulatesVEGF-induced endothelial cell hyperpermeability by preventing RhoA activation and myosin regulatory light chain phosphorylation. FASEB J. 19, 1845-1847 (2005).

33. Romeo, S. et al. Population-based resequencing of ANGPTL4 uncovers variations that reduce triglyceride and increase HDL. Nature Genetics, 39, 513-517 (2007).

34. Yin, Wu et al. Genetic variation in Angptl4 provides insight into protein processing and function, J.Biol.Chem., 284, 13213-13222 (2009).

참고문헌( 실시예 4)

1. Nachman, P. H, Jennette, J. C. & Falk, R. Primary glomerular disease. in The Kidney, 8^th edn. (ed. Brenner, B. M.) 987 - 1066 (Elsevier, Philadelphia, 2008).

2. Marsh, J.B. & Drabkin, D.L. Experimental reconstruction of metabolic pattern of lipid nephrosis: key role of hepatic protein synthesis in hyperlipemia. Metabolism 9, 946-955 (1960).

3. Vaziri N.D. Molecular mechanisms of lipid disorders in nephrotic syndrome. Kidney Int . 63, 1964-1976 (2003).

4. Weinstock, P.H. et al. Severe hypertriglyceridemia, reduced high density lipoprotein, and neonatal death in lipoprotein lipase knockout mice. Mild hypertriglyceridemia with impaired very low density lipoprotein clearance in heterozygotes. J. Clin. Invest. 96, 2555-2568 (1995).

5. Shearer, G.C. & Kaysen, G.A. Endothelial bound lipoprotein lipase (LpL) depletion in hypoalbuminemia results from decreased endothelial binding, not decreased secretion. Kidney Int. 70, 647-653 (2006)

6. Clement, L.C. et al. Podocyte secreted Angiopoietin-like-4 mediates proteinuria in glucocorticoid-sensitive nephrotic syndrome. Nat Med . 17, 117-122 (2011).

7. Chugh, S.S., Clement, L.C. & MaceC. New insights into human minimal change disease: Lessons from animal models. Am. J. Kid. Dis . 59, 284-292 (2012).

8. Yoshida, K., Shimizugawa, T., Ono, M. & Furukawa, H. Angiopoietin-like protein 4 is a potent hyperlipidemia-inducing factor in mice and inhibitor of lipoprotein lipase. J. Lipid Res. 43, 1770-1772 (2002).

9. Sukonina, V., Lookene, A., Olivecrona, T. & Olivecrona, G. Angiopoietin-like protein 4 converts lipoprotein lipase to inactive monomers and modulates lipase activity in adipose tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103, 17450-17455 (2006).

10. Romeo, S. et al. Population-based resequencing of ANGPTL4 uncovers variations that reduce triglycerides and increase HDL. Nat. Genet. 39, 513-516 (2007).

11. Yin, W. et al. Genetic variation in ANGPTL4 provides insights into protein processing and function. J. Biol . Chem . 284, 13213-13222 (2009).

12. Clement L. et al.Early changes in gene expression that influence the course of primary glomerular disease. Kidney Int. 72, 337-347 (2007).

13. Liu, G., Clement, L., Kanwar, Y.S., Avila-Casado, C. & Chugh, S.S. ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephrotic syndrome. J. Biol. Chem. 281, 39681-39692 (2006).

14. Nakamura, T. et al. Sclerotic lesions in the glomeruli of Buffalo/Mna rats. Nephron 43, 50-55 (1986).

15. Le Berre, L. et al. Extrarenal effects on the pathogenesis and relapse of idiopathic nephrotic syndrome in Buffalo/Mna rats. J. Clin . Invest. 109, 491-498 (2002).

16. Neuger, L. et al. Effects of heparin on the uptake of lipoprotein lipase in rat liver. BMC Physiol . 4, 13 (2004).

17. Zhu, P. et al.Angiopoietin-like 4 protein elevates the prosurvival intracellular O2(-):H2O2 ratio and confers anoikis resistance to tumors. Cancer Cell 19, 401-415 (2011).

18. Mandard, S. et al. The fasting-induced adipose factor/angiopoietin-like protein 4 is physically associated with lipoproteins and governs plasma lipid levels and adiposity. J. Biol. Chem. 281, 934-944 (2006).

19. Zilleruelo, G., Hsia, S.L., Freundlich, M., Gorman, H.M. & Strauss, J. Persistence of serum lipid abnormalities in children with idiopathic nephrotic syndrome. J. Pediatr. 104, 61-64 (1984).

20. Yu, X. et al.Inhibition of cardiac lipoprotein utilization by transgenic overexpression of Angptl4 in the heart. Proc . Natl . Acad . Sci . U S A. 102, 1767-1772 (2005).

21. Koliwad, S.K. et al.Angiopoietin-like 4 (ANGPTL4, fasting-induced adipose factor) is a direct glucocorticoid receptor target and participates in glucocorticoid-regulated triglyceride metabolism. J. Biol. Chem. 284, 25593-25601 (2009).

22. Eremina, V. et al. VEGF inhibition and renal thrombotic microangiopathy. N. Engl . J. Med . 358, 1129-1136 (2008).

23. Maynard, S.E., et al. Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. J Clin. Invest. 111, 649-658 (2003).

24. Venkatesha, S. et al. Soluble endoglin contributes to the pathogenesis of preeclampsia. Nat. Med . 12, 642-649 (2006).

25. Wei, C. et al.Circulating urokinase receptor as a cause of focal segmental glomerulosclerosis. Nat. Med. 17, 952-960 (2011).

26. Wei, C. et al. Circulating suPAR in Two Cohorts of Primary FSGS. J. Am. Soc . Nephrol . 23, 2051-2059 (2012).

27. Avila-Casado, C. et al. Proteinuria in rats induced by serum from patients with collapsing glomerulopathy. Kidney Int . 66, 133-143 (2004).

28. Chugh, S.S., & Clement, L.C. Telomerase at the center of collapsing glomerulopathy. Nat. Med . 18, 26-27 (2012).

29. Chugh, S. et al.Aminopeptidase A: A nephritogenic target antigen of nephrotoxic serum. Kidney Int . 59, 601-613 (2001).

30. Imamura, S. et al.A novel method for measuring human lipoprotein lipase and hepatic lipase activities in postheparin plasma. J. Lipid Res. 49, 1431-1437 (2008).

31. Liu, G., et al. Neph1 and nephrin interaction in the slit diaphragm is an important determinant of glomerular permeability. J. Clin . Invest. 112, 209-221 (2003).

32. Chang, S.F., Reich, B., Brunzell, J.D. & Will, H. Detailed characterization of the binding site of the lipoprotein lipase-specific monoclonal antibody 5D2. J. Lipid Res. 39, 2350-2359 (1998).

서열 목록에 대한 설명

서열번호 1 인간 Angptl4 폴리펩타이드의 변종 1 서열번호 2 인간 Angptl4의 변종 1의 cDNA 서열 서열번호 3 인간 Angptl4 폴리펩타이드의 변종 2 서열번호 4 인간 Angptl4의 변종 2의 cDNA 서열 서열번호 5 래트 Angptl4 폴리펩타이드 서열번호 6 래트 Angptl4 폴리펩타이드의 cDNA 서열 서열번호 7 마우스 Angptl4 폴리펩타이드 서열번호 8 마우스 Angptl4 폴리펩타이드의 cDNA 서열 서열번호 9 치환을 갖는 인간 Angptl4 폴리펩타이드의 변종 1 서열번호 10 치환을 갖는 인간 Angptl4 폴리펩타이드의 변종 2 서열번호 11-22 PCR 프라이머 및 프로브(본문 참조) 서열번호 23 치환을 갖는 N-말단 다종 공통 서열 서열번호 24 치환을 갖는 중앙 다종 공통 서열 서열번호 25 치환을 갖는 C-말단 다종 공통 서열 서열번호 26 치환을 갖는 N-말단 인간 공통 서열 서열번호 27 치환을 갖는 C-말단 인간 공통 서열 서열번호 28 인간 Angptl4 폴리펩타이드 DKMNVLAHGLLQLGQGL의 돌연변이종 서열번호 29-90 표 2로부터의 서열 서열번호 91 aP2-Angptl4 구성물의 증폭을 위한 역방향 프라이머 서열번호 92 aP2-Angptl4 구성물의 확인을 위한 프로프 서열번호 93 서열번호 80의 펩타이드를 코딩하는 cDNA 서열번호 94 서열번호 87의 펩타이드를 코딩하는 cDNA

SEQUENCE LISTING <110> The UAB Research Foundation Chugh, Sumant S. <120> METHODS FOR TREATMENT OF NEPHROTIC SYNDROME AND RELATED CONDITIONS <130> U2010-0044WO02 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe 180 185 190 Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly 195 200 205 Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp 210 215 220 Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro 225 230 235 240 Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp 245 250 255 Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg 260 265 270 Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln 275 280 285 Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu 290 295 300 Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg 325 330 335 Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly 340 345 350 Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro 355 360 365 Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg 370 375 380 Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met 385 390 395 400 Ala Ala Glu Ala Ala Ser 405 <210> 2 <211> 1967 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ataaaaaccg tcctcgggcg cggcggggag aagccgagct gagcggatcc tcacacgact 60 gtgatccgat tctttccagc ggcttctgca accaagcggg tcttaccccc ggtcctccgc 120 gtctccagtc ctcgcacctg gaaccccaac gtccccgaga gtccccgaat ccccgctccc 180 aggctaccta agaggatgag cggtgctccg acggccgggg cagccctgat gctctgcgcc 240 gccaccgccg tgctactgag cgctcagggc ggacccgtgc agtccaagtc gccgcgcttt 300 gcgtcctggg acgagatgaa tgtcctggcg cacggactcc tgcagctcgg ccaggggctg 360 cgcgaacacg cggagcgcac ccgcagtcag ctgagcgcgc tggagcggcg cctgagcgcg 420 tgcgggtccg cctgtcaggg aaccgagggg tccaccgacc tcccgttagc ccctgagagc 480 cgggtggacc ctgaggtcct tcacagcctg cagacacaac tcaaggctca gaacagcagg 540 atccagcaac tcttccacaa ggtggcccag cagcagcggc acctggagaa gcagcacctg 600 cgaattcagc atctgcaaag ccagtttggc ctcctggacc acaagcacct agaccatgag 660 gtggccaagc ctgcccgaag aaagaggctg cccgagatgg cccagccagt tgacccggct 720 cacaatgtca gccgcctgca ccggctgccc agggattgcc aggagctgtt ccaggttggg 780 gagaggcaga gtggactatt tgaaatccag cctcaggggt ctccgccatt tttggtgaac 840 tgcaagatga cctcagatgg aggctggaca gtaattcaga ggcgccacga tggctcagtg 900 gacttcaacc ggccctggga agcctacaag gcggggtttg gggatcccca cggcgagttc 960 tggctgggtc tggagaaggt gcatagcatc acgggggacc gcaacagccg cctggccgtg 1020 cagctgcggg actgggatgg caacgccgag ttgctgcagt tctccgtgca cctgggtggc 1080 gaggacacgg cctatagcct gcagctcact gcacccgtgg ccggccagct gggcgccacc 1140 accgtcccac ccagcggcct ctccgtaccc ttctccactt gggaccagga tcacgacctc 1200 cgcagggaca agaactgcgc caagagcctc tctggaggct ggtggtttgg cacctgcagc 1260 cattccaacc tcaacggcca gtacttccgc tccatcccac agcagcggca gaagcttaag 1320 aagggaatct tctggaagac ctggcggggc cgctactacc cgctgcaggc caccaccatg 1380 ttgatccagc ccatggcagc agaggcagcc tcctagcgtc ctggctgggc ctggtcccag 1440 gcccacgaaa gacggtgact cttggctctg cccgaggatg tggccgttcc ctgcctgggc 1500 aggggctcca aggaggggcc atctggaaac ttgtggacag agaagaagac cacgactgga 1560 gaagccccct ttctgagtgc aggggggctg catgcgttgc ctcctgagat cgaggctgca 1620 ggatatgctc agactctaga ggcgtggacc aaggggcatg gagcttcact ccttgctggc 1680 cagggagttg gggactcaga gggaccactt ggggccagcc agactggcct caatggcgga 1740 ctcagtcaca ttgactgacg gggaccaggg cttgtgtggg tcgagagcgc cctcatggtg 1800 ctggtgctgt tgtgtgtagg tcccctgggg acacaagcag gcgccaatgg tatctgggcg 1860 gagctcacag agttcttgga ataaaagcaa cctcagaaca cttaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1967 <210> 3 <211> 368 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His His Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg 180 185 190 His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala 195 200 205 Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val 210 215 220 His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly 245 250 255 Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly 260 265 270 Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe 275 280 285 Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala 290 295 300 Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn 305 310 315 320 Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys Leu 325 330 335 Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu 340 345 350 Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser 355 360 365 <210> 4 <211> 1853 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ataaaaaccg tcctcgggcg cggcggggag aagccgagct gagcggatcc tcacacgact 60 gtgatccgat tctttccagc ggcttctgca accaagcggg tcttaccccc ggtcctccgc 120 gtctccagtc ctcgcacctg gaaccccaac gtccccgaga gtccccgaat ccccgctccc 180 aggctaccta agaggatgag cggtgctccg acggccgggg cagccctgat gctctgcgcc 240 gccaccgccg tgctactgag cgctcagggc ggacccgtgc agtccaagtc gccgcgcttt 300 gcgtcctggg acgagatgaa tgtcctggcg cacggactcc tgcagctcgg ccaggggctg 360 cgcgaacacg cggagcgcac ccgcagtcag ctgagcgcgc tggagcggcg cctgagcgcg 420 tgcgggtccg cctgtcaggg aaccgagggg tccaccgacc tcccgttagc ccctgagagc 480 cgggtggacc ctgaggtcct tcacagcctg cagacacaac tcaaggctca gaacagcagg 540 atccagcaac tcttccacaa ggtggcccag cagcagcggc acctggagaa gcagcacctg 600 cgaattcagc atctgcaaag ccagtttggc ctcctggacc acaagcacct agaccatgag 660 gtggccaagc ctgcccgaag aaagaggctg cccgagatgg cccagccagt tgacccggct 720 cacaatgtca gccgcctgca ccatggaggc tggacagtaa ttcagaggcg ccacgatggc 780 tcagtggact tcaaccggcc ctgggaagcc tacaaggcgg ggtttgggga tccccacggc 840 gagttctggc tgggtctgga gaaggtgcat agcatcacgg gggaccgcaa cagccgcctg 900 gccgtgcagc tgcgggactg ggatggcaac gccgagttgc tgcagttctc cgtgcacctg 960 ggtggcgagg acacggccta tagcctgcag ctcactgcac ccgtggccgg ccagctgggc 1020 gccaccaccg tcccacccag cggcctctcc gtacccttct ccacttggga ccaggatcac 1080 gacctccgca gggacaagaa ctgcgccaag agcctctctg gaggctggtg gtttggcacc 1140 tgcagccatt ccaacctcaa cggccagtac ttccgctcca tcccacagca gcggcagaag 1200 cttaagaagg gaatcttctg gaagacctgg cggggccgct actacccgct gcaggccacc 1260 accatgttga tccagcccat ggcagcagag gcagcctcct agcgtcctgg ctgggcctgg 1320 tcccaggccc acgaaagacg gtgactcttg gctctgcccg aggatgtggc cgttccctgc 1380 ctgggcaggg gctccaagga ggggccatct ggaaacttgt ggacagagaa gaagaccacg 1440 actggagaag ccccctttct gagtgcaggg gggctgcatg cgttgcctcc tgagatcgag 1500 gctgcaggat atgctcagac tctagaggcg tggaccaagg ggcatggagc ttcactcctt 1560 gctggccagg gagttgggga ctcagaggga ccacttgggg ccagccagac tggcctcaat 1620 ggcggactca gtcacattga ctgacgggga ccagggcttg tgtgggtcga gagcgccctc 1680 atggtgctgg tgctgttgtg tgtaggtccc ctggggacac aagcaggcgc caatggtatc 1740 tgggcggagc tcacagagtt cttggaataa aagcaacctc agaacactta aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1853 <210> 5 <211> 405 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 50 55 60 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Pro Lys Gly Thr Asp Pro Lys Asp Arg Val Pro Glu Gly Gln 85 90 95 Ala Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn 100 105 110 Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr 115 120 125 Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp 130 135 140 Leu Leu Thr Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val Asp Lys Thr Ser Arg 145 150 155 160 Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met Ala Gln Leu Ile Gly Leu Thr Pro Asn 165 170 175 Ala Thr Arg Leu His Arg Pro Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln 180 185 190 Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile Gln Pro Leu Gly Ser 195 200 205 Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr 210 215 220 Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp Phe Asn Gln Ser Trp 225 230 235 240 Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln Gly Glu Phe Trp Leu 245 250 255 Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Gly Ser Gln Leu 260 265 270 Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala Lys Leu Leu Gln Phe 275 280 285 Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr 290 295 300 Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn Val Ser Pro Asn Gly 305 310 315 320 Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Gly 325 330 335 Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr 340 345 350 Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe His Ser Ile Pro Arg 355 360 365 Gln Arg Gln Gln Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Lys Gly 370 375 380 Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu Ile Gln Pro Met Glu 385 390 395 400 Ala Thr Ala Ala Ser 405 <210> 6 <211> 1218 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 6 atgcgctgcg ctccgaccgc aggcgctgct ctagtgctat gcgcagctac tgcggggctg 60 ctgagcgcgc aagggcgccc tgcacagccg gagccgccgc gcttcgcatc ctgggatgaa 120 atgaacttgc tggctcacgg gctgctgcag ctcggtcacg ggctgcggga acacgtggag 180 cgcacccgtg gacagctggg cgcgctggaa cgccgcatgg ctgcctgcgg taacgcttgt 240 caggggccca aggggacaga cccgaaggat agagtccccg aaggccaggc tcctgagact 300 ctgcagagtt tacagactca actcaaggct cagaacagca agatccagca actgttccag 360 aaggtagccc agcagcagag atacctatca aagcagaatc tgagaataca gaatcttcag 420 agccagattg acctcttgac ccccacacac ctagacaatg gggtagacaa gacttcgagg 480 ggaaagaggc ttcccaagat ggcccagctc attggcttga ctcccaacgc cacccgctta 540 cacaggcctc cccgggactg ccaggaactc tttcaagaag gggagcggca cagtggactt 600 ttccagatcc agcctctggg atctccacca tttttggtca actgtgagat gacttcagat 660 ggaggctgga cggtgattca gagacgcctg aacggctctg tggacttcaa tcagtcttgg 720 gaagcctaca aagatggctt cggagatccc caaggcgagt tctggctggg cctagagaag 780 atgcacagca tcacagggga ccgaggaagc cagttggctg tgcagctcca ggactgggat 840 ggcaatgcca aattgctcca atttcctatc catttggggg gtgaggacac agcctacagc 900 ctgcagctca ccgagcccac ggccaatgag ctgggtgcca ccaatgtttc ccccaatggc 960 ctttccctgc ccttctctac ctgggaccaa gaccacgacc tccgagggga ccttaactgt 1020 gccaagagcc tctctggtgg ctggtggttt ggcacctgca gccattccaa tctaaatgga 1080 caatacttcc actctattcc acggcaacgg cagcagcgta aaaaggggat cttctggaaa 1140 acatggaagg gccgctacta tccactacag gctaccaccc tgttgatcca gcccatggag 1200 gctacagcag cctcttag 1218 <210> 7 <211> 410 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 50 55 60 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg 85 90 95 Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln 100 105 110 Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala 115 120 125 Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu 130 135 140 Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val 145 150 155 160 Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met Thr Gln Leu Ile 165 170 175 Gly Leu Thr Pro Asn Ala Thr His Leu His Arg Pro Pro Arg Asp Cys 180 185 190 Gln Glu Leu Phe Gln Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile 195 200 205 Gln Pro Leu Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser 210 215 220 Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp 225 230 235 240 Phe Asn Gln Ser Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln 245 250 255 Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asn 260 265 270 Arg Gly Ser Gln Leu Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala 275 280 285 Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr 290 295 300 Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn 305 310 315 320 Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp 325 330 335 His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly 340 345 350 Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe 355 360 365 His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp 370 375 380 Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser 405 410 <210> 8 <211> 1869 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 acgggctcca gatcttcttc tgcaccagag caagtctaag tctgagccgg ctcccccaga 60 actccagctg ctgggtcttg aactcctgcg ttccggagtc ctagcgttgc tgcacccaag 120 gccaccccca gaatcatgcg ctgcgctccg acagcaggcg ctgccctggt gctatgcgcg 180 gctactgcgg ggcttttgag cgcgcaaggg cgccctgcac agccagagcc accgcgcttt 240 gcatcctggg acgagatgaa cttgctggct cacgggctgc tacagctcgg ccatgggctg 300 cgcgaacacg tggagcgcac ccgtgggcag ctgggcgcgc tggagcgccg catggctgcc 360 tgtggtaacg cttgtcaggg gcccaaggga aaagatgcac ccttcaaaga ctccgaggat 420 agagtccctg aaggccagac tcctgagact ctgcagagtt tgcagactca gctcaaggct 480 caaaacagca agatccagca attgttccag aaggtggccc agcagcagag atacctatca 540 aagcagaatc tgagaataca gaatcttcag agccagatag acctcttggc ccccacgcac 600 ctagacaatg gagtagacaa gacttcgagg ggaaagaggc ttcccaagat gacccagctc 660 attggcttga ctcccaacgc cacccactta cacaggccgc cccgggactg ccaggaactc 720 ttccaagaag gggagaggca cagtggactt ttccagatcc agcctctggg gtctccacca 780 tttttggtca actgtgagat gacttcagat ggaggctgga cagtgattca gagacgcctg 840 aacggctctg tggacttcaa ccagtcctgg gaagcctaca aggatggctt cggagatccc 900 caaggcgagt tctggctggg cctggaaaag atgcacagca tcacagggaa ccgaggaagc 960 caattggctg tgcagctcca ggactgggat ggcaatgcca aattgctcca atttcccatc 1020 catttggggg gtgaggacac agcctacagc ctgcagctca ctgagcccac ggccaatgag 1080 ctgggtgcca ccaatgtttc ccccaatggc ctttccctgc ccttctctac ttgggaccaa 1140 gaccatgacc tccgtgggga ccttaactgt gccaagagcc tctctggtgg ctggtggttt 1200 ggtacctgta gccattccaa tctcaatgga caatacttcc actctatccc acggcaacgg 1260 caggagcgta aaaagggtat cttctggaaa acatggaagg gccgctacta tcctctgcag 1320 gctaccaccc tgctgatcca gcccatggag gctacagcag cctcttagcc tcctcactgg 1380 agcctggttc caggcctaag aagacagtga ctttggttgt ggccctgaga tttggccatt 1440 ctctgctggg ggcaggagct ctaagtaggg ctatctgcgt cttgtggaca aagaagaagc 1500 ccgtaactgg agagactgga ggaccccttt tccgtgttgg ggtctgcaag cattgttgtc 1560 tgaaacagtc agagcaacag gaaacaaatg gcccagatcc agaaaacatg ggctcgaggg 1620 gcactgaata tcacttctcg cctaccagag aagttgggga tgcagaggga ccactacagt 1680 ccaactagct gggcccttaa tggcggactc agtcatattg actgactgga gacagggtgc 1740 caggagccct ggatacactc atggtgctgt tgtaggtgct gtggatgcac aggtgctaac 1800 tgtggttccc aggcacaact cacagcattc ttacaataaa aacaacctca gaacaaaaaa 1860 aaaaaaaaa 1869 <210> 9 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> x = A, K, E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> x = A, K, E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> x = C, A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> x = C, A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (163)..(163) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (164)..(164) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> misc_feature <222> (221)..(221) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Xaa Xaa Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Xaa Gly Ser Ala Xaa 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe 180 185 190 Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly 195 200 205 Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Xaa Gly Gly Trp 210 215 220 Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro 225 230 235 240 Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp 245 250 255 Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg 260 265 270 Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln 275 280 285 Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu 290 295 300 Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg 325 330 335 Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly 340 345 350 Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro 355 360 365 Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg 370 375 380 Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met 385 390 395 400 Ala Ala Glu Ala Ala Ser 405 <210> 10 <211> 368 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> x = A, K, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> x = A, K, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> x = C, A or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> x = S, A or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (163)..(163) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (164)..(164) <223> x = D, R, K, G, A, V or S <400> 10 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Xaa Xaa Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Xaa Gly Ser Ala Xaa 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His His Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg 180 185 190 His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala 195 200 205 Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val 210 215 220 His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly 245 250 255 Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly 260 265 270 Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe 275 280 285 Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala 290 295 300 Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn 305 310 315 320 Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys Leu 325 330 335 Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu 340 345 350 Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser 355 360 365 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 11 tctgggatct ccaccatttt tg 22 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 12 tcaccgtcca gcctccat 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 13 caactgtgag atgacttc 18 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 14 cgccacccgc ttacaca 17 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 15 cagaggctgg atctggaaaa gt 22 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 16 tgccaggaac tcttt 15 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 17 tacaggctac caccctgttg atc 23 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 18 aaccgcgggc cctctag 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 19 ccatggaggc tacagca 17 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 20 cttgaaggga ttgaaaagat aattagc 27 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 21 ccatgagtca gaaaagcatt gaac 24 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 22 aggtgagcat tttcctg 17 <210> 23 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (76)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Met Xaa Xaa Ala Xaa Thr Ala Gly Ala Ala Leu Xaa Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Xaa Leu Leu Ser Ala Gln Gly Xaa Pro Xaa Gln Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Glu His Xaa Glu Arg Thr Arg Xaa 50 55 60 Gln Leu Xaa Ala Leu Glu Arg Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Xaa 65 70 75 80 Gln Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa <210> 24 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (61)..(66) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (73)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Pro Glu Xaa Leu Xaa Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser 1 5 10 15 Xaa Ile Gln Gln Leu Phe Xaa Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Xaa Leu 20 25 30 Xaa Lys Gln Xaa Leu Arg Ile Gln Xaa Leu Gln Ser Gln Xaa Xaa Leu 35 40 45 Leu Xaa Xaa Xaa His Leu Asp Xaa Xaa Val Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Leu Pro Xaa Met Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Leu His Xaa 85 <210> 25 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (69)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(90) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (95)..(95) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (115)..(118) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (140)..(140) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (144)..(144) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (148)..(148) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (180)..(180) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(182) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Val Asp Xaa 1 5 10 15 Asn Xaa Xaa Trp Glu Ala Tyr Lys Xaa Gly Phe Gly Asp Xaa Xaa Gly 20 25 30 Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Xaa His Ser Ile Xaa Gly Xaa Arg 35 40 45 Xaa Ser Xaa Leu Ala Val Gln Leu Xaa Asp Trp Asp Gly Asn Ala Xaa 50 55 60 Leu Leu Gln Phe Xaa Xaa His Xaa Gly Gly Xaa Asp Thr Ala Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Leu Gly Ala Thr Xaa Val 85 90 95 Xaa Pro Xaa Gly Leu Ser Xaa Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His 100 105 110 Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Xaa 115 120 125 Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Xaa Gln Tyr Phe Xaa 130 135 140 Ser Ile Pro Xaa Gln Xaa Gln Xaa Xaa Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys 145 150 155 160 Thr Trp Xaa Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Xaa Leu Ile 165 170 175 Gln Pro Met Xaa Ala Xaa Ala Ala Ser 180 185 <210> 26 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(55) <223> Anti-LPL activity region <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(164) <223> Cleavage region <220> <221> misc_feature <222> (167)..(167) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (183)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Met Ser Gly Ala Xaa Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Xaa Ala Leu Glu Arg Xaa Leu Ser Ala Xaa Xaa Ser Ala Xaa 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Pro Xaa Met Ala Gln Pro Val Asp Xaa Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His Xaa 180 <210> 27 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (115)..(115) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (140)..(140) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 27 Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Xaa His Asp Xaa Ser Val Asp Xaa 1 5 10 15 Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Xaa His Gly 20 25 30 Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Xaa Gly Asp Arg 35 40 45 Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Xaa Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu 50 55 60 Leu Leu Gln Phe Ser Xaa His Xaa Gly Gly Xaa Asp Thr Ala Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Ala Xaa Xaa Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val 85 90 95 Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His 100 105 110 Asp Leu Xaa Arg Xaa Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Xaa 115 120 125 Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Xaa Gln Tyr Phe Arg 130 135 140 Ser Ile Pro Gln Gln Xaa Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys 145 150 155 160 Thr Trp Xaa Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile 165 170 175 Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser 180 185 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Lys Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly 1 5 10 15 Leu <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 29 Gly Ala Ala Gly 1 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 30 Gly Ala Gly Ala 1 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 31 Gly Gly Ala Ala 1 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 32 Ala Gly Gly Ala 1 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 33 Ala Gly Ala Gly 1 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 34 Ala Ala Gly Gly 1 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 35 Val Gly Ala Ala 1 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 36 Val Ala Ala Gly 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 37 Val Ala Gly Ala 1 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 38 Gly Ala Ala Val 1 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 39 Gly Ala Val Ala 1 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 40 Gly Val Ala Ala 1 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 41 Ala Gly Val Ala 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 42 Ala Gly Ala Val 1 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 43 Ala Ala Val Gly 1 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 44 Ala Ala Gly Val 1 <210> 45 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 45 Ala Val Ala Gly 1 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 46 Ala Val Gly Ala 1 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 47 Gly Ala Val Val 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 48 Gly Val Ala Val 1 <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 49 Gly Val Val Ala 1 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 50 Ala Gly Val Val 1 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 51 Ala Val Val Gly 1 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 52 Ala Val Gly Val 1 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 53 Val Gly Ala Val 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 54 Val Gly Val Ala 1 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 55 Val Ala Gly Val 1 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 56 Gly Val Val Val 1 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 57 Val Gly Val Val 1 <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 58 Val Val Val Gly 1 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 59 Val Val Gly Val 1 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 60 Val Ala Val Gly 1 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 61 Val Val Gly Ala 1 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 62 Val Val Ala Gly 1 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 63 Val Val Val Ala 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 64 Val Val Ala Val 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 65 Gly Ala Ala Ala 1 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 66 Ala Gly Ala Ala 1 <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 67 Ala Ala Ala Gly 1 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 68 Ala Ala Gly Ala 1 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 69 Ala Ala Val Val 1 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 70 Ala Ala Val Ala 1 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 71 Ala Ala Ala Val 1 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 72 Ala Val Ala Ala 1 <210> 73 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 73 Val Ala Ala Ala 1 <210> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 74 Ala Val Val Val 1 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 75 Val Ala Val Val 1 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 76 Val Val Val Val 1 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 77 Ser Ser Ser Ser 1 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 78 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 79 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 80 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 81 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 82 Gly Gly Ser Ser 1 <210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 83 Ser Gly Ser Gly 1 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 84 Ser Gly Gly Ser 1 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 85 Ser Ser Gly Gly 1 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 86 Gly Ser Gly Gly 1 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 87 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 88 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 89 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 89 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutations at postitions 161-164 <400> 90 Val Ala Val Ala 1 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 91 agggataggc ttaccttcga atg 23 <210> 92 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 92 cagcagcctc cc 12 <210> 93 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant Angptl4 8501 cDNA <400> 93 ccggatcagg atcact 16 <210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant Angptl4 8515 cDNA <400> 94 cctccggcgg cggcct 16

Claims (57)

1. 감소된 LPL 저해 활성 및 절단에 대한 증가된 저항성을 갖는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체로서,
   상기 Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 서열을 가지되,
   아미노산 위치 39-40 이 AE 이고 아미노산 위치 161-164 가 VAVA 이거나,
   아미노산 위치 39-40 이 DA 이고 아미노산 위치 161-164 가 GVVA 이거나, 또는
   아미노산 위치 39-40 이 DK 이고 아미노산 위치 161-164 가 GAAG인,
   Angptl4 폴리펩타이드 유도체.
2. 제1항에 있어서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 시알릴화되는 유도체.
3. 감소된 LPL 저해 활성 및 절단에 대한 증가된 저항성을 갖는 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 포함하는,
   단백뇨를 특징으로 하는 질병 상태 또는 신증후군을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
   상기 Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 서열을 가지되,
   아미노산 위치 39-40 이 AE 이고 아미노산 위치 161-164 가 VAVA 이거나,
   아미노산 위치 39-40 이 DA 이고 아미노산 위치 161-164 가 GVVA 이거나, 또는
   아미노산 위치 39-40 이 DK 이고 아미노산 위치 161-164 가 GAAG인,
   약제학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 신증후군은 미세 변화 질환(minimal change disease), 국소 분절 사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis), 막성 신증/막성 사구체신염(membranous nephropathy/membranous glomerulonephritis), 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis), 당뇨병의 병태, 당뇨병성 신증, 당뇨병, 홍반성 신증, 또는 원발성 사구체 질환와 관련되는 것인, 약제학적 조성물.
5. 제3항에 있어서, 신증후군은 부종, 고지혈증, 저단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 단백뇨로 이루어진 군에서 선택되는 증상을 나타내는 것인, 약제학적 조성물.
6. 제3항에 있어서, 정맥내 전달을 위해 제형화된 약제학적 조성물.
7. 제3항에 있어서, 경피 전달을 위해 제형화된 약제학적 조성물.
8. 제4항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더욱 포함하는, 약제학적 조성물.
9. 제3항에 있어서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체는 시알릴화되는, 약제학적 조성물.
10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Angptl4 폴리펩타이드 유도체가 0.035-1100 mg 포함된, 약제학적 조성물.
11. 제1항 또는 제2항의 Angptl4 폴리펩타이드 유도체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
12. 제11항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생체외 발현 시스템.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제

Images