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KR102203918B1 - 락트산 탈수소효소 형질전환체를 이용하는 c1 화합물로부터 락테이트의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

락트산 탈수소효소 형질전환체를 이용하는 c1 화합물로부터 락테이트의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR102203918B1
KR102203918B1 KR1020157036026A KR20157036026A KR102203918B1 KR 102203918 B1 KR102203918 B1 KR 102203918B1 KR 1020157036026 A KR1020157036026 A KR 1020157036026A KR 20157036026 A KR20157036026 A KR 20157036026A KR 102203918 B1 KR102203918 B1 KR 102203918B1
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조슈아 실버맨
르네 엠. 사빌
성원 이
드류 디. 레짓스키
솔 엠. 레스닉
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칼리스타, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 락테이트 및 관련된 조성물의 생산에 유용한 비천연 유래 c1 미생물유기체뿐만 아니라 생물학적인 락트산 생산방법을 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 개시내용은 c1 기질로부터 락테이트를 생산하는데 유용한 비천연 유래 메탄영양체 박테리아를 제공한다.

Description

락트산 탈수소효소 형질전환체를 이용하는 C1 화합물로부터 락테이트의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF LACTATE FROM C1 COMPOUNDS USING LACTATE DEHYDROGENASE TRANSFORMANTS}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e))에 따라 2013년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/836,609호 및 2014년 1월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/928,390호의 유익을 주장하며, 이들 기초출원은 둘 다 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록에 대한 언급
파일명 200206_414WO_SEQUENCE_LISTING.txt로서 EFS-Web을 통해 컴퓨터 판독 가능한 형태(computer readable form: CRF)로 37 C.F.R. § 1.821에 따라 본 명세서에 동시에 전자적으로 제출된 "서열목록"은 본 명세서에 참고로 포함된다. 서열목록의 전자적 복제물은 2014년 6월 17일자에 생성되었고, 디스크 상의 용량은 222킬로바이트이다.
화학적으로 또는 생물학적으로 생산될 수 있는 락트산은 화장료 산업에서의 용도로부터 식품 산업, 약제학적 산업 및 화학적 산업에서의 용도까지의 범위에 있는 널리 사용되는 화학적 화합물이다. 락트산은 2개의 반응성 작용기, 즉, 카복실기 및 하이드록실기를 포함하기 때문에, 이는 잠재적으로 유용한 화학물질, 예컨대 프로필렌 옥사이드, 아세트알데하이드, 아크릴산, 프로판산, 2,3-펜탄다이온 및 락타이드로의 다양한 화학적 전환을 겪을 수 있다(Varadarajan and Miller, Biotechnol. Progr . 15:845, 1999). 최근에, 석유 화학 자원에 대해 더 지속 가능한 대안을 제공하는 바이오플라스틱의 제조에서 사용되는 재생 가능한 원료인 폴리락트산(polylactic acid: PLA)을 생산하기 위한 락트산의 사용과 관련하여 관심이 증가되었다. 광학적으로 순수한 락트산은 중축합, 해중합 및 고리 열림 중합의 일련의 반응을 통해 고분자량 PLA로 중합될 수 있다(
Figure 112015124715965-pct00001
and Stolt, Prog . Polym . Sci . 27:1123, 2002). 얻어진 PLA 중합체는 방호복, 식품 포장, 제초 필름, 쓰레기 봉투, 강성 용기, 수축성 포장재 및 짧은 보관수명 트레이를 비롯한 넓은 범위의 적용분야에서 다양한 용도를 가진다(Drumright et al., Adv . Mater. 12:1841, 2000; Vink et al., Polym. Degrad. Stabil. 80:403, 2003).
생물학적 락테이트 생산에 현재 사용되는 탄수화물 공급원료는 상대적으로 비싸다. 메탄과 같은 다른 공급원료는 다량으로 저렴하게 입수가능하다. 메탄의 전환은 상대적으로 더 저비용의 락트산 생산에 대한 경로를 나타낸다. 그러나, 이를 달성하는 실행 방법은 아직 개발되지 않았다.
일 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase: LDH)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 박테리아를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, C1 대사 미생물유기체는 메탄영양체이다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, C1 대사 미생물유기체는 탄소 공급원료를 락테이트로 전환시킬 수 있고, 탄소 공급원료는 메탄, 이산화탄소, 일산화탄소, 천연가스 및 합성 가스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, C1 대사 미생물유기체는 효모가 아니다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1개 세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다.
도 1은 72시간 성장 후의 OD600에 비해 이종성 락트산 탈수소효소(ldh) 핵산을 발현시키는 특정 재조합체 메틸로코커스 캡슐라투스 배스(Methylococcus capsulatus Bath)에 대한 락트산 생산 수준을 도시한 도면;
도 2는 다양한 탄소 공급원의 δ13C 분포를 도시한 도면;
도 3은 복제 개시 단백질(trfA) 및 프로모터(Pbla), 복제기점(oriV), 전달 기점(oriT), 다중 클로닝 부위(MCS), 카나마이신 내성 유전자(KanR) 및 프로모터(KanR_프로모터) 및 이콜라이(E. coli)에 대한 복제기점(pUC_Ori_rc)을 암호화하는 서열을 포함하는 본 발명의 벡터 pMS3을 도시한 도면.
본 개시내용은 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체, 및 관련된 조성물 및 탄소 공급원료로부터의 락테이트의 생합성 방법을 제공한다. 전형적으로, 탄소 공급원료는 C1 기질을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소(LDH)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 박테리아를 제공한다. 본 발명은 또한 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, C1 대사 미생물유기체는 메탄영양체이다. 구체적 실시형태에서, 본 개시내용은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, C1 대사 미생물유기체는 탄소 공급원료를 락테이트로 전환시킬 수 있다. 전형적으로, 탄소 공급원료는 메탄, 이산화탄소, 일산화탄소, 합성 가스 및 천연가스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 추가로 제공하되, C1 대사 미생물유기체는 효모가 아니다. 또한 추가 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다. 추가 실시형태에서, 본 발명은 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 제공하되, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다.
본 개시내용을 더 상세하게 제시하기에 앞서, 본 명세서에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것은 이의 이해에 도움을 줄 수 있다. 추가적인 정의는 본 개시내용 전체적으로 제시된다.
본 설명에서, 본 명세서의 임의의 범위의 개시내용은 범위 내에서 임의의 수의 개시내용 및 범위 내의 임의의 수(종점을 포함함)에 의해 형성된 임의의 범위의 개시내용이 되는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 구체화된 물질들 또는 단계들에 대해 또는 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것에 대해 청구범위를 제한한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단수 용어는 열거된 구성성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안의 "또는"의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다", "가지다" 및 "포함하다"는 달리 구체적으로 제외되지 않는 다른 구성요소의 존재를 배제하지 않는다.
폴리펩타이드와 관련하여 사용될 때, 용어 "락트산 탈수소효소" 및 "LDH"는 본 명세서에서 락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용되며, 즉, 피루브산의 락테이트로의 환원을 촉매할 수 있다. 일부 실시형태에서, 락트산 탈수소효소는 파이루브산의 L-락테이트로의 환원을 촉매하는 L-락트산 탈수소효소이다(EC 1.1.1.27). 다른 실시형태에서, 락트산 탈수소효소는 피루브산의 D-락테이트로의 환원을 촉매하는 D-락트산 탈수소효소이다(EC 1.1.1.28).
용어 "탄소 공급원료"는 본 명세서에서 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 화합물(들), 예를 들어, C1 기질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "C1 기질"은 탄소-탄소 결합이 없는 분자를 함유하는 임의의 탄소를 지칭한다. C1 기질은 천연가스, 비전통 천연가스(unconventional natural gas), 합성 가스에서 발견될 수 있고, 예를 들어, 메탄, 메탄올, 폼알데하이드, 폼산(포메이트), 일산화탄소, 이산화탄소, 메틸화된 아민(예를 들어, 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민 등), 메틸화된 티올, 메틸 할로겐(예를 들어, 브로모메탄, 클로로메탄, 요오도메탄, 다이클로로메탄 등), 사이아나이드 등과 같은 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메탄"은 실온 및 압력에서 무색 및 무취인 화학식 CH4인 가장 간단한 (C1) 알칸 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "천연가스"는 메탄을 함유하는 천연 유래 지하의 가스 혼합물을 지칭한다. 천연가스는 전통 공정(예를 들어, 시추, 수공법(waterflooding))에 의해 다공성 저장소로부터 접근될 수 있다. 주로 메탄으로 구성되지만, 천연가스는 또한 다른 경질의 알칸 가스(예를 들어, 에탄, 프로판, 부탄, 펜탄), 이산화탄소, 질소, 황화수소 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "비전통 천연가스"는 본 명세서에서 수압파쇄법, 수평 시추 또는 방향성 시추와 같은 비전통 방법에 의해 접근되어야 하는 저 투과성에 의한 형성에 의해 생산된 천연 유래 가스 혼합물을 지칭한다. 예시적인 비전통 천연가스 침착물은 사암 또는 탄산염에서 형성된 치밀가스(tight gas sand), 석탄 침착물에서 형성되고 석탄 입자에 흡착된 탄층 메탄, 결이 고운 혈암(shale rock)에서 형성되고 점토 입자에 흡착되거나 또는 작은 기공 또는 미세천공 내에 보유된 셰일 가스, 해양 및 영구 동토 하와 같은 장소에서 저온 및 고압에서 형성된 천연가스와 물의 결정질 조합물인 메탄 수화물을 포함한다. 비전통 천연가스는 전통 천연가스에 비해 잠재적으로 더 고수준의 에탄, 프로판, 부탄, CO2, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 것을 포함하는, 더 가변적인 조성물을 갖는 경향이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "합성 기체" 또는 "합성 가스"는 주로 일산화탄소(CO) 및 수소(H2)를 함유하는 합성으로 생산된 가스 혼합물을 지칭한다. 합성 가스는, 예를 들어, 천연가스 또는 액체 탄화수소의 수증기 변성에 의해, 또는 석탄, 바이오매스 또는 폐기물의 가스화에 의해 생산될 수 있다. 합성 가스는 CO 및 H2에 비해 더 소량으로 메탄, CO2, H2S 및 다른 기체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "C1 대사 미생물유기체"는 에너지 공급원으로서 C1 기질인 바이오매스를 사용하는(즉, 대사하는) 능력을 갖는 임의의 미생물유기체를 지칭하며, 에너지 및 바이오매스에 대한 다른 탄소 기질(예컨대, 당 및 복합 탄수화물)을 사용할 수도 있고 사용하지 않을 수도 있다. C1 대사 미생물유기체는 박테리아(예컨대, 메탄영양체 및 메틸영양체) 및 효모를 포함한다. 특정 실시형태에서, C1 대사 미생물유기체는 광합성 미생물유기체, 예컨대, 조류를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, C1 대사 미생물유기체는 에너지 공급원으로서 C1 기질을 필요로 한다는 것을 의미하는 "절대 C1 대사 미생물유기체"일 것이다. 추가 실시형태에서, C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체)는 C1 기질(즉, 에너지 공급원으로서 C1 기질을 이용함)의 존재 하에 배양될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메탄영양체", "메탄영양체 박테리아" 또는 "메탄영양체 박테리아"는 본 명세서에서 메탄을 이용할 수 있는 메틸영양체 박테리아를 상호호환적으로 지칭한다. 예를 들어, 천연가스로부터의 메탄은 탄소 및 성장을 위한 에너지 공급원으로서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "메탄영양체 박테리아"는 탄소 및 에너지 공급원에 대해 (예를 들어, 천연가스로부터의) 메탄을 단지 이용할 수 있는 "절대 메탄영양체 박테리아" 및 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄에 추가적으로 아세트산염, 피루브산염, 숙신산염, 말산염 또는 에탄올과 같은 다탄소 기질을 자연적으로 이용할 수 있는 "통성(facultative) 메탄영양체 박테리아"를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸영양체" 또는 "메틸영양체 박테리아"는 1-탄소 화합물(즉, 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 화합물)을 이용할 수 있는 임의의 박테리아를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 메틸영양체 박테리아는 메탄영양체일 수 있다. 예를 들어, "메탄영양체 박테리아"는 탄소 및 에너지의 주요 공급원으로서 메탄을 이용하는 능력을 갖는 임의의 메틸영양체 박테리아를 지칭할 수 있다. 예시적인 메탄영양체 박테리아는 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium) 또는 메타노모나스(Methanomonas)를 포함한다. 특정 다른 실시형태에서, 메틸영양체 박테리아는 에너지 생산을 위한 C1 기질의 용도로 제한되는 박테리아를 지칭하는 "절대 메틸영양체 박테리아"이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주"는 관심 대상의 폴리펩타이드(예를 들어, 락트산 탈수소효소)를 생산하기 위해 외인성 핵산에 의해 유전자 변형될 수 있는 세포 또는 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체)를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 선택적으로 외인성 핵산(예를 들어, 결실된 피루브산 탈카복시효소)에 의해 암호화된 외인성 LDH와 관련되거나 또는 관련되지 않은 목적으로 하는 특성을 부여하는 다른 유전자 변형을 이미 가지거나 혹은 다른 유전자 변형을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 생산될 락테이트 생산물의 이용을 최소화하거나 또는 감소시키거나, 숙주 세포 성장 저해제의 생산을 최소화하거나 또는 감소시키거나, 고성장을 제공하거나, 오염물질 또는 특정 배양 조건의 내인성(예를 들어, 산 내인성, 살생물제 내성)을 제공하거나, 추가적인 탄소 물질을 대사하는 능력을 부여하거나 또는 추가로 바람직한 생성물 또는 중간체를 합성하는 능력을 부여하는 유전자 변형을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자" 및 "핵산"은 뉴클레오타이드의 공유적으로 연결된 서브유닛을 포함하는 중합체 화합물을 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 핵산의 합성 생산은 핵산을 재생하는 화학적 및 생물학적 방법을 포함한다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA), 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 이들 둘 다 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 반합성 DNA 등을 포함한다. 용어 "LDH 핵산" 및 "LDH-암호화 핵산"은 LDH 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합체" 또는 "비-자연적" (또는 "비천연 유래")은 적어도 하나의 유전자 변용(alteration)을 포함하거나 또는 외인성 핵산의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물유기체, 세포, 핵산 또는 벡터를 상호호환적으로 지칭하거나, 또는 이러한 변용 또는 변형이 유전 공학처리에 의해 도입되거나 유도되는 내인성 핵산 또는 유전자의 발현이 제어되도록 변용된 세포를 지칭한다. 유전자 변용은 단백질 또는 효소를 암호화하는 발현가능한 핵산을 도입하는 변형, 또는 다른 핵산 첨가, 결실, 치환 또는 고전적 균주 진화 또는 당업계에 공지된 관련된 분자적 진화에 의해 달성된 세포의 유전자 물질 또는 변형의 다른 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, 암호 영역(및 이의 기능성 단편) 및 비암호 조절 영역에서의 변형을 포함하며, 이때 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변용시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질전환시키는"은 핵산(예를 들어, 외인성 또는 이종성 핵산)의 숙주 세포 내로의 도입을 지칭한다. 형질전환된 숙주 세포는 외인성 또는 이종성 핵산을 염색체 밖으로 운반하거나 또는 염색체 내로 통합할 수 있다. 숙주 세포 게놈 및 자기-복제 벡터 내로의 도입은 일반적으로 형질전환된 핵산 분자의 유전적으로 안정한 유전을 초래한다. 형질전환된 핵산을 함유하는 숙주 세포는 "재조합체" 또는 "비천연 유래" 또는 "유전 공학처리된" 또는 "형질전환된" 또는 "유전자이식" 세포(예를 들어, 박테리아)로서 상호호환적으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체"는 LDH-암호화 외인성 핵산 없이 대응하는 C1 대사 미생물유기체를 지칭한다.
핵산, 폴리펩타이드, 화합물 또는 활성과 관련하여 사용될 때, 용어 "내인성" 또는 "천연"은 야생형 숙주 세포에서 존재하는 핵산, 폴리펩타이드, 화합물 또는 활성을 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 세포와 관련하여 사용될 때, 용어 "천연"은 야생형 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "이종성" 또는 "외인성" 핵산, 작제물 또는 서열은 숙주 세포에 대해 천연이 아닌 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분, 또는 변용 또는 돌연변이된 숙주 세포에 대해 천연인 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분 또는 유사한 조건 하에서 천연 발현 수준에 비해 변용된 발현을 지니는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 추가로, 용어 "이종성" 및 "외인성"은 숙주 세포에 대해 내인성이 발견되거나, 또는 숙주 세포에 대해 천연이 아니라 숙주 세포 내로 도입된 핵산 분자에 의해 암호화된, 상이하거나 또는 변용된 생물학적 활성을 지칭할 수 있다.
둘 이상의 핵산 서열 또는 둘 이상의 아미노산 서열 간의 "백분율 동일성"은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성% = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이며, 갭의 수 및 둘 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 고려한다. 그들이 서열의 해당 쌍에 대해 가능한 가장 높은 유사성 스코어에 도달하기 위해 정해진 매개변수, 즉, 정해진 아미노산 치환 매트릭스, 갭 존재 페널티(또한 갭 개방 페널티로 칭해짐) 및 갭 연장 페널티를 이용하여 정렬될 때 두 서열은 최적으로 정렬된다.
둘 이상의 서열 간의 동일성 백분율의 결정을 위한 "최적의 정렬"은 BLAST 알고리즘과 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행된다(예를 들어, 문헌[Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403, 1990]; 또한 월드 와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 BLASTN 참조). 아미노산 서열에 대해, BLOSUM62 매트릭스(Henikoff and Henikoff (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89(22):10916-10919)는 BLASTP와 같은 아미노산 서열 정렬 알고리즘에서 디폴트 스코어링 치환 매트릭스로서 사용된다. 갭 존재 페널티는 정렬된 서열 중 하나에서 단일 아미노산 갭의 도입을 위해 부과되며, 갭 연장 페널티는 갭 내의 각각의 잔기 위치에 대해 부과된다. 아미노산 서열의 최적의 정렬은 다음의 정렬 매개변수로 BLASTP를 이용하여 수행된다: BLOSUM62 스코어링 매트릭스, 갭 존재 페널티=11, 및 갭 연장 페널티=1. 핵산 서열의 최적의 정렬을 위해, BLASTN은 다음의 정렬 매개변수로 사용된다: 매칭/미스매칭 스코어 = 1/-3, 및 갭 존재 페널티=5, 및 갭 연장 페널티=2. 정렬이 시작되고 끝나는(예를 들어, 정렬 창) 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 의해, 그리고 선택적으로 가장 높은 가능한 유사성 스코어를 달성하기 위해 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭 또는 다중 갭의 삽입에 의해 유사성 스코어가 정해진다.
"보존적 치환"은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환으로서 당업계에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 1997년 3월 13일 공개된 WO 97/09433호, 10 페이지; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8] 참조).
본 명세서에서 사용되는 "과발현된"은 핵산 또는 단백질에 관해 사용될 때 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성의 증가를 지칭한다. 증가된 발현 또는 활성은 야생형(비유전자 공학처리됨) 대조군 또는 기준 미생물유기체 수준 초과로 증가될 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성을 포함한다. 핵산 또는 단백질은 그것이 정상적으로는 발현되지 않거나 또는 활성이 아닌 경우, 미생물유기체에서 발현 또는 활성이라면 과발현된다. 핵산 또는 단백질은 발현 또는 활성이 야생형 대조군 또는 기준 미생물유기체에서보다 재조합 미생물유기체에서 더 길게 연장되거나 또는 존재한다면, 과발현된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "저해하다" 또는 "저해된"은 대조군, 내인성 또는 기준 분자에 비해 표적 유전자의 발현에서의 또는 표적 분자의 활성에서의 직접적 또는 간접적인 변용, 감소, 하향 조절, 제거 또는 결실을 지칭하되, 변용, 감소, 하향조절 또는 제거는 통계적으로, 생물학적으로, 산업적으로 또는 임상적으로 유의하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는 화학적 또는 생물학적 수단에 의한(예를 들어, 효소에 의한 또는 효소 없이) 화합물의 변형을 지칭하는데, 변형된 화합물은 모 화합물과 구조적으로 유사하고 (실제로 또는 이론적으로) 모 화합물로부터 유도가능하다. 유도체는 모 화합물에 비해 더 친수성이거나 또는 변용된 반응성을 갖는 것과 같이 모 화합물과 상이한 화학적, 생물학적 또는 물리적 특성을 가질 수 있다. 유도체화(즉, 변형)는 분자 내에서 하나 이상의 모이어티의 치환(예를 들어, 작용기의 변화)을 수반할 수 있다. 예를 들어, 수소는 플루오린 또는 염소와 같은 할로겐으로 치환될 수 있거나, 또는 하이드록실기(-OH)는 카복실산 모이어티(-COOH)로 대체될 수 있다. 다른 예시적 유도체화는 중합, 글라이코실화, 알킬화, 아실화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 에스터화 및 아미드화를 포함한다.
용어 "유도체"는 또한 모든 용매화물, 예를 들어, 수화물 또는 부가물(예를 들어, 알코올에 의한 부가물), 활성 대사산물 및 모 화합물의 염을 지칭한다. 염의 유형은 화합물 내 모이어티의 특성에 의존한다. 예를 들어, 산성기, 예컨대 카복실산기는 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염(예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 또한 생리학적으로 용인되는 4차 암모늄 이온 및 암모니아와의 산부가 염 및 생리적으로 용인가능한 유기 아민, 예를 들어, 트라이에틸아민, 에탄올아민 또는 트라이-(2-하이드록시에틸)아민)을 형성할 수 있다. 염기성 기는, 예를 들어, 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산과의, 또는 유기 카복실산 또는 설폰산, 예컨대 아세트산, 시트르산, 락트산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 메탄설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과의 산 부가 염을 형성할 수 있다. 염기성 질소 원자에 추가로 염기성기 및 산성기, 예를 들어 카복실기를 동시에 함유하는 화합물은 양쪽성이온으로서 존재할 수 있다. 염은 당업자에게 공지된 관례적 방법에 의해, 예를 들어 용매 또는 희석제 중에서 무기 또는 유기산 또는 염기와 화합물을 합함으로써, 또는 양이온 교환 또는 음이온 교환에 의해 다른 염으로부터 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "락테이트"는 락트산 염, 락트산 이온, 락트산 에스터, 락트산 용매화물 및/또는 락트산의 올리고머 또는 락트산 에스터와 같은 모든 유도체 형태를 포함하는, 모든 락트산 형태를 지칭한다.
용어 "발현 제어 서열"은 조작 가능하게(operatively) 연결된 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서를 의미한다.
용어 "작동가능하게(operably) 연결된"은 본 명세서에서 제어 서열이 암호화된 LDH의 발현에 영향을 미치도록 외인성 LDH-암호화 핵산에 대한 위치에 적절하게 위치되는 배치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대응하는 모 락트산 탈수소효소"는 LDH 서열 변이체의 아미노산 서열에 기반한 천연 유래 락트산 탈수소효소 또는 달리 공지된 락트산 탈수소효소를 지칭한다.
C 1 대사 미생물유기체 - 숙주 세포
본 발명의 비-천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 목적으로 하는 숙주 세포 내로 목적으로 하는 외인성 LDH-암호화 핵산을 도입함으로써 제조된다. 유전자 변형될 C1 대사 미생물유기체는 자연적 균주, 적합화된 균주(예를 들어, 모 균주에 비해 감소된 락테이트 이용, 개선된 성장 속도 또는 증가된 총 바이오매스 수율을 지니는 균주를 선택하는 발효를 수행하는 것) 또는 알칸 또는 알켄이 락테이트로 전환되도록, 증가된 성장 속도 또는 이들의 임의의 조합을 갖도록 이미 재조합 변형될 수 있다. 특정 바람직한 실시형태에서, C1 대사 미생물유기체는 광합성 미생물유기체, 예컨대 조류 또는 식물이 아니다. 종종, 본 발명의 C1 대사 미생물유기체는 효모가 아니며, 전형적으로는 진균이 아니다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 C1 대사 미생물유기체는 광합성 미생물유기체, 또는 진균이 아니다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 C1 대사 미생물유기체는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로필루스(Methylophilus), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 히포미크로비움(Hyphomicrobium), 잔토박터(Xanthobacter), 바실러스, 파라코커스(Paracoccus), 노카르디아(Nocardia), 아르토박터(Arthrobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)속 중 하나 이상으로부터 유전자 변형된 세포인 원핵생물 또는 박테리아이다.
추가 실시형태에서, C1 대사 박테리아는 메탄영양체 또는 메틸영양체이다. 구체적 실시형태에서, 본 발명의 C1 대사 미생물유기체는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스 또는 메틸로셀라(Methylocella) 속 중 하나 이상으로부터 유전자 변형된 세포인 메탄영양체이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 C1 대사 미생물유기체는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 메틸로박테리움 라디오톨러런스(Methylobacterium radiotolerans), 메틸로박테리움 포퓰리(Methylobacterium populi), 메틸로박테리움 클로로메타니쿰(Methylobacterium chloromethanicum) 또는 메틸로박테리움 노둘라리스(Methylobacterium nodularis) 종 중 하나 이상으로부터 유전자 변형된 세포인 메틸영양체이다.
일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄을 사용하는 능력을 갖는 유전자 변형된 메탄영양체 박테리아이다. 메탄영양체 박테리아는 그들의 탄소 동화 경로 및 내부막 구조에 기반하여 3개 군으로 분류된다: I형(감마 프로테오박테리아), II형(알파 프로테오박테리아) 및 X형(감마 프로테오박테리아). 일부 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 유전자 변형된 I형 메탄영양체이다. 특정 구체적 실시형태에서, 본 발명이 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 유전자 변형된 II형 메탄영양체이다. I형 메탄영양체는 탄소 동화를 위해 리불로스 모노포스페이트(RuMP)를 사용하는 반면, II형 메탄영양체는 세린 경로를 사용한다. 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 유전자 변형된 X형 메탄영양체일 수 있다. X형 메탄영양체는 RuMP 경로를 사용할 뿐만 아니라 세린 경로의 낮은 수준의 효소를 발현시킨다.
본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 유전자 변형된 통성 메탄영양체 또는 유전자 변형된 절대 메탄영양체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 C1 대사 미생물유기체는 하나 이상의 속 및/또는 종으로부터 유전자 변형된 세포인 통성 메탄영양체일 수 있다: 메틸로셀라, 메틸로시스티스, 및 메틸로캅사(Methylocapsa)(예를 들어, 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸로셀라 팔루스트리스(Methylocella palustris), 메틸로셀라 툰드라(Methylocella tundrae), 메틸로시스티스 달토나(Methylocystis daltona) 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라(Methylocystis bryophila), 및 메틸로캅사 아우레아(Methylocapsa aurea) KYG), 메틸로박테리움 오가노필룸(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886), 메틸리비움 페트롤에필룸(Methylibium petroleiphilum), 또는 이들의 고성장 변이체. 예시적인 절대 메탄영양체 박테리아는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스, 메틸로모나스 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트라이코스포리움(Methylosinus trichosporium) OB3b(NRRL B-11, 196), 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스(Methylomicrobium buryatense) 5G(분류 ID: 675511, Syst. Appl. Microbiol . 24(2):166-76 (July 2001)), 메틸로시너스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus)(NRRL B-11, 198), 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica)(NRRL B-11, 199), 메틸로모나스 알부스(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(Methylobacter capsulatus)(NRRL B-11,201), 메틸로모나스 플라겔라타 종(Methylomonas flagellata sp) AJ-3670(FERM P-2400), 메틸아시디피움 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum), 메틸아시디필리움 푸마리오리쿰(Methylacidiphilum fumariolicum), 메틸로아시다 캄차트켄시스(Methyloacida kamchatkensis), 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum) 또는 이의 고성장 변이체를 포함한다.
또한 추가 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 하나 이상의 속으로부터 유전자 변형된 세포인 합성 가스 대사 박테리아이다: 클로스트리디움(Clostridium), 무렐라(Moorella), 파이로코커스(Pyrococcus), 유박테리움(Eubacterium), 데설포박테리움(Desulfobacterium), 카복시도써무스(Carboxydothermus), 아세토게늄(Acetogenium), 아세토박테리움(Acetobacterium), 아세토나에로븀(Acetoanaerobium), 뷰티리박테리움(Butyribaceterium) 또는 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus). 구체적 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 하나 이상의 종으로부터의 합성 가스 대사 박테리아이다: 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 리웅다리(Clostridium ljungdahli), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxydivorans), 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium Methylotrophicum), 클로스트리디움 우디(Clostridium woodii), 클로스트리디움 네오프로파놀로겐(Clostridium neopropanologen) 또는 이들의 조합.
특정 다른 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 하나 이상의 속으로부터 유전자 변형된 세포인 효모와 같은 진핵생물이다: 칸디다(Candida), 야로이야(Yarrowia), 한세뉼라(Hansenula), 피키아(Pichia), 토룰롭시스(Torulopsis) 또는 로도토룰라(Rhodotorula).
발현 시스템 및 벡터; 형질전환 방법
본 명세서에 기재된 임의의 재조합체 C1 대사 미생물유기체는 새로운 락트산 탈수소효소 또는 향상된 락트산 탈수소효소 활성을 지니는 숙주를 제공하기 위해 적어도 하나의 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하도록 형질전환될 수 있거나 또는 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법을 이용하여 내인성 유전자 기능을 제거하거나 또는 실질적으로 감소시키도록 유전자 변형될 수 있다.
C1 대사 미생물유기체에서 이종성 핵산의 발현에 유용한 다수의 발현 시스템 및 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산 분자는 발현 제어 서열, 예를 들어 프로모터에 조작적으로 연결된다.
본 발명의 실행에서의 사용에 적합한 프로모터는 사용되는 숙주 세포에 대해 구성적, 누설(leaky) 또는 유도성이고 천연 또는 비천연일 수 있다. 예시적인 프로모터는 피루브산 탈카복시효소(PDC) 프로모터, 데옥시-자일룰로스 인산염 신타제 프로모터, 메탄올 탈수소효소 프로모터(MDH)(예를 들어, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스로부터의 mxaF 유전자의 상류 유전자간 영역 내 프로모터(등록번호 MCA0779) 또는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스로부터의 MDH 프로모터(문헌[Springer et al., FEMS Microbiol . Lett . 160:119 (1998)] 참조), 헥술로스 6-인산염 신타제 프로모터, 리보솜리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라제 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 프로모터, 포스포엔올피루브산 카복실라제 프로모터, T5 프로모터, Trc 프로모터, PHA 합성을 위한 프로모터(Foellner et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 40:284, 1993), 피루브산 탈카복시효소 프로모터(Tokuhiro et al., Appl . Biochem . Biotechnol . 131:795, 2006), lac 오페론 Plac 프로모터(Toyama et al., Microbiol . 143:595, 1997), 혼성 프로모터, 예컨대 Ptrc(Brosius et al., Gene 27:161, 1984), 메틸영양체에서 천연 플라스미드로부터 동정된 프로모터(EP 296484), 메탄영양체 등을 포함한다.
추가적으로, 외인성 핵산 분자의 고발현을 위한 적합한 상동성 또는 이종성 프로모터가 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,098,005호는 메탄 또는 메탄올의 존재 하에 C1 대사 박테리아에서 이종성 암호 핵산의 고발현을 위한 프로모터의 사용을 기재한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 락테이트 생합성 효소를 암호화하는 외인성 핵산의 조절된 발현은 비천연 유래 메탄영양체 박테리아의 성장 속도를 최적화하는데 바람직할 수 있고, 다양한 탄소 공급원 조건에서 박테리아 성장을 개선시킬 수 있다. 이는 유도성 프로모터 시스템의 사용을 통해 달성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 암호화 LDH는 유도성 프로모터에 조작 가능하게 연결된다. 본 발명의 실행에서 사용되는 유도성 프로모터 시스템은 당업계에 공지된 것을 포함하고, 테트라사이클린 유도성 프로모터 시스템; IPTG/lac 오페론 유도성 프로모터 시스템, 열 충격 유도성 프로모터 시스템; 금속-반응성 프로모터 시스템; 질산염 유도성 프로모터 시스템; 광 유도성 프로모터 시스템; 엑디손 유도성 프로모터 시스템, 메틸영양체 및 메탄영양체 박테리아에서 사용을 위해 기재된 유도성/조절가능한 시스템(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제2010/0221813호) 등을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체, 메틸영양체)는 (1) lacO 작동자 서열에 측접한 프로모터에 조작 가능하게 연결된 LDH를 암호화하는 외인성 핵산, 및 (2) 구성적 프로모터(예를 들어, 헥술로스-6-인산염 신타제 프로모터)에 조작 가능하게 연결된 lacI 리프레서 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. LacI 리프레서 단백질이 LDH 또는 다른 프로모터에 측접하는 lacO 작동자 서열에 결합될 때 유도가 개시되어 전사를 방지한다. IPTG는 LacI 리프레서에 결합되고, 그것을 lacO 서열로부터 방출시켜, 전사를 허용한다. 유도성 프로모터 시스템을 이용함으로써, 락테이트 합성은 유도물질(inducer)의 첨가에 의해 제어될 수 있다.
본 발명의 실행에서 사용되는 발현 시스템 및 발현 벡터는 유전자 구성요소, 예를 들어, 번역 개시 및 전사 종결 부위에 대한 하나 이상의 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호 세그먼트 등을 선택적으로 함유한다.
본 발명의 실행에서 사용되는 발현 시스템 및 벡터는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의해 통합을 용이하게 하는 유전자 구성요소를 추가로 함유할 수 있다. 상동성 재조합에 의해 통합을 용이하게 하는 유전자 구성요소는 목적으로 하는 숙주 세포의 게놈 서열에서 표적화된 통합 부위에 대해 서열 상동성을 가진다. 비상동성 재조합에 의해 통합을 용이하게 하는 유전자 구성요소 또는 기법은 제한효소 매개-통합(REMI)(문헌[Manivasakam et al., Mol . Cell Biol . (1998) 18(3):1736-1745], 본 명세서에 참고로 포함됨), 트랜스포존-매개 통합, 및 당업계에 잘 공지된 다른 구성요소 및 방법을 포함한다.
미생물 유기체에서 외인성 또는 이종성 핵산의 발현을 위한 재조합체 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]에 기재된 것을 발견할 수 있다.
특정 실시형태에서, 락트산 탈수소효소의 발현 강도 및 시간은 락테이트 생산을 개선시키기 위해 당업계에 공지된 방법을 이용하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 발현 수준을 조절하기 위해 다양한 프로모터 강도 또는 핵산 복제수가 사용될 수 있다. 다른 예에서, 발현 시간은 유도성 프로모터 시스템 또는 다시스트론성 오페론을 이용함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, LDH의 발현은 성장기 및 배양의 정지기 동안 혹은 정지기 동안만 일어날 수 있다. 다른 예에서, LDH는 관심 대상의 다른 유전자와 함께 순서화된 공동발현을 겪을 수 있다.
외인성 LDH-암호화 핵산의 숙주 세포 내로의 도입은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, C1 대사 박테리아의 전기천공법은, 예를 들어, 문헌[Toyama et al., FEMS Microbiol. Lett. 166:1, 1998; Kim and Wood, Appl. Microbiol. Biotechnol . 48:105, 1997; Yoshida et al., Biotechnol . Lett . 23:787, 2001], 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0026005호에 이미 기재되었다.
공여체 및 수용체 세포의 직접 접촉을 수반하는 특정 유형의 형질전환을 지칭하는 박테리아 컨쥬게이션은 C1 대사 미생물유기체 내로 핵산의 전달을 위해 더 빈번하게 사용된다. 박테리아 컨쥬게이션은 서로 밀접하게 "공여체"와 "수용체" 세포를 함께 혼합하는 단계를 수반한다. 컨쥬게이션은 새로 합성된 공여체 핵산 분자의 수용체 세포 내로의 비방향성 전달과 함께 공여체와 수용체 박테리아 간의 세포질 연결의 형성에 의해 일어난다. 컨쥬게이션 반응에서 수용체는 공여체 박테리아로부터 수평 전달을 통해 핵산을 수용할 수 있는 임의의 세포이다. 컨쥬게이션 반응에서 공여체는 접합성(conjugative) 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 이동성 플라스미드를 함유하는 박테리아이다. 공여체 플라스미드의 물리적 전달은 자기-전염성 플라스미드를 통해 또는 "헬퍼" 플라스미드의 도움으로 일어날 수 있다. C1 대사 박테리아를 수반하는 컨쥬게이션은 문헌[Stolyar et al., Mikrobiologiya 64:686, 1995; Motoyama et al., Appl. Micro. Biotech. 42:67, 1994; Lloyd et al., Arch. Microbiol . 171:364, 1999]; 국제 특허 출원 공개 WO　02/18617호; 및 문헌[Ali et al., Microbiol. 152:2931, 2006]에서 이전에 기재되었다.
C1 대사 박테리아에서 이종성 핵산의 발현은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,818,424호, 미국 특허 출원 공개 제2003/0003528호). 메틸영양체 박테리아의 뮤 트랜스포존 기반 형질전환은 기재되었다(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol . 91:857, 2011). 메틸로박테리움에서 숙주 유전자의 삽입 불활성화가 없는 이종성 핵산의 단일 및 다중 발현을 위한 미니-Tn7 트랜스포존 시스템이 기재되었다(미국 특허 출원 공개 제2008/0026005호).
C1 대사 미생물유기체에 대한 추가적인 유전자 변형은 본 명세서에 기재된 바와 같이 바람직할 수 있으며, 공지된 방법을 사용하여 부여될 수 있다. 예를 들어, C1 대사 박테리아에서 내인성 유전자 기능을 불활성화, 넉아웃 또는 결실시키기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. C1 대사 박테리아의 성장을 늦춤에 있어서 작제물 결실/삽입 돌연변이체에 자살 벡터를 이용하는 대립유전자 교환은 또한, 예를 들어, 문헌[Toyama and Lidstrom, Microbiol. 144:183, 1998; Stolyar et al., Microbiol. 145:1235, 1999; Ali et al., Microbiol . 152:2931, 2006; Van Dien et al., Microbiol . 149:601, 2003]에 기재되었다.
C 1 대사 미생물유기체 - 재조합체
본 명세서에 상기 기재한 바와 같이, 본 개시내용의 C1 대사 미생물유기체는 관심 대상의 락트산 탈수소효소(들)를 발현 또는 과발현시키는 외인성 핵산을 포함하도록 재조합 변형되어 락테이트를 생산하는데 유용한 재조합 미생물유기체를 생성한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 락트산 탈수소효소(LDH)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 메탄영양체 박테리아를 제공하되, 메탄영양체 박테리아는 탄소 공급원료를 락테이트로 전환시킬 수 있다. 전형적으로, 탄소 공급원료는 메탄이다.
본 발명의 실행에서 사용되는 외인성 핵산은 천연 유래 또는 달리 공지된 락트산 탈수소효소, 또는 이러한 대응하는 모 락트산 탈수소효소의 서열- 또는 절단-변이체를 암호화할 수 있다. 이러한 암호화된 락트산 탈수소효소 변이체는 개선된 용해도, 발현, 안정성, 촉매 활성, 전환율 또는 이들의 임의의 조합물을 나타낼 수 있거나, 또는 공지된 락트산 탈수소효소 서열, 및 본 명세서에 기재된 락트산 탈수소효소 서열의 보존적으로 변형된 변이체일 수 있다.
본 발명의 실행에서 사용하는데 적합한 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산은 LDH를 암호화하는 야생형 핵산 서열뿐만 아니라 이의 변이체를 포함한다. 용어 "핵산 변이체"는 본 명세서에서 하나 이상의 치환, 첨가, 결실, 삽입을 함유할 수 있거나, 또는 기준 핵산의 단편(들)이거나 이들을 포함할 수 있는 핵산을 지칭한다. 기준 핵산은 특정 LDH 효소(예를 들어, LdhA)를 암호화하는 선택된 야생형(모 핵산)을 지칭한다. 유전자 암호에서의 가외성(redundancy)에 기인하여, 핵산 변이체는 아미노산 서열에 영향을 미칠 수도 있고, 또는 영향을 미치지 않을 수도 있다.
전형적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 내로 도입될 외인성 LDH-암호화 핵산은 숙주 내로 도입 전에 코돈 최적화되어 단백질 발현이 효과적이거나 또는 향상된다는 것을 보장한다. 코돈 최적화는 비자연적 DNA 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 변용시키는 일 없이 숙주의 전형적인 코돈 선호도(codon usage)를 반영하기 위한 형질전환 전의 핵산 내 코돈 또는 핵산의 암호 영역의 변용을 지칭한다. 이종성 숙주에서 최적의 핵산 발현을 위한 코돈 최적화 방법은 이전에 기재되었다(예를 들어, 문헌[Welch et al., PLoS One 4:e7002, 2009; Gustafsson et al., Trends Biotechnol. 22:346, 2004; Wu et al., Nucl. Acids Res. 35:D76, 2007; Villalobos et al., BMC Bioinformatics 7:285, 2006; 미국 특허 공개 제2011/0111413호 및 제2008/0292918호; 이들의 개시내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).
핵산 변이체는 대응하는 모 LDH 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 보존적 치환을 포함하는 LDH 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 보존적 치환은 폴리펩타이드에서 자연적으로 생길 수 있거나(예를 들어, 천연 유래 유전자 변이체) 또는 폴리펩타이드가 재조합적으로 생성될 때 도입될 수 있다.
본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 LDH를 암호화하는 적합한 외인성 핵산은 다른 유기체로부터 LDH를 암호화하는 핵산(즉, 숙주 C1 미생물유기체에 대해 천연이 아닌 락트산 탈수소효소 및/또는 락트산 탈수소효소 암호화 핵산)을 포함한다. 이러한 외인성 핵산은 당업계에 공지된 임의의 다수의 LDH 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가로, 다수의 이들 유기체, 예를 들어, 박테리아, 식물, 효모, 진균 및 동물로부터 단리되고 클로닝된 대응하는 LDH 암호화 핵산은 본 발명의 실행에서 사용에 적합할 수 있다. 수백의 유기체에 대해 이용가능한 완전한 게놈 서열에 의해, 예를 들어, 상동체, 오솔로그, 파라로그 등을 포함하는 관련된 또는 멀리 떨어진 종에서 락트산 탈수소효소를 암호화하는 핵산의 동정은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이들은 공지된 방법을 이용하여 목적으로 하는 C1 대사 미생물유기체로부터 최적의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 외인성 핵산 분자는 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 악티노닉스 주바투스(Acinonyx jubatus), 아르킬로처스 콜루브리스(Archilochus colubris), 바실러스 안트라시스(Bacillus Anthracis), 바실러스 칼돌리티쿠스(Bacillus caldolyticus), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(Q9p4b6)(또한 게오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)로서 알려짐, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테리오이데스 펙티노필루스(Bacteroides pectinophilus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 보스 타우루스(Bos taurus), 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris), 카니스 루푸스(Canis lupus), 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 에쿠스 페루스(Equus ferus), 펠리스 카투스(Felis catus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces maxxianus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 코리니포미스종 토르쿠엔스(Lactobacillus coryniformis sp. torquens), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)(아종 불가리쿠스를 포함), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 존슨니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 플란타움(Lactobaillus plantaum), 락토바실러스 람노서스(락토바실러스 람노서스), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 마르티(Lysteria marthii), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 오릭토라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus), 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 타에니오피기아 구타타, 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 루미노코커스 토르쿠엔스(Ruminococcus torques), 스타필로코커스 시미아에(Staphylococcus simiae), 스타필로코커스 비툴리누스(Staphylococcus vitulinus), 스타필로코커스 렌투스(Staphylococcus lentus), 마크로코커스 카세올리티쿠스(Macrococcus caseolyticus), 바실러스 투린지엔시스 혈청형 콘쿠키안(konkukian) 균주 97-27, 바실러스 투린지엔시스 혈청형 치넨시스(chinensis) CT-43, 바실러스 마이코이데스(mycoides) 등으로부터의 D- 또는 L-LDH를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 외인성 핵산은 D-락트산 탈수소효소를 암호화한다. 다수의 D-락트산 탈수소효소의 서열은 당업계에 공지되어 있다. D-락트산 탈수소효소를 암호화하는 본 발명의 실행에서 사용되는 예시적인 외인성 핵산은 락토바실러스 델브루에키, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 존슨니, 류코노스톡 메센테로이데스(예를 들어, 일본 특허 제2002-136263A호 및 미국 특허 제2007/0105202호(서열번호 2) 참조, 이들 둘 다 본 명세서에 참고로 포함됨); 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)(예를 들어, WO 2003/102201호, 본 명세서에 참고로 포함됨)로부터의 D-LDH를 암호화하는 것을 포함한다. 전형적으로, 외인성 LDH-암호화 핵산은 사용된 특이적 숙주 세포로부터의 최적의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 경우에, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 서열번호 64 및 66, 또는 이들의 N- 또는 C-말단이 절단된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 기준("모 LDH") 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82‰, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95‰, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 D-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하되, 암호화된 LDH는 D-LDH 활성을 포함하거나, 또는 이러한 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 D-락테이트(예를 들어, 실시예 1의 방법을 이용하고 상기 방법의 엔지플루오(EnzyFluo)(상표명) L-락테이트 분석 키트를 대신해서 엔지플루오(상표명) D-락테이트 분석 키트(카탈로그 번호 EFDLC-100, 캘리포니아주 94545에 소재한 바이오어세이 시스템즈(BioAssay Systems))로 결정한 바와 같음)을 생산한다. 일부 실시형태에서, 암호화된 D-LDH는 모 LDH에 비해 D-LDH 활성의 적어도 50%를 보유한다. 전형적으로, 이러한 D-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는, 적어도 1 세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 해당의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 서열번호 65 및 67, 또는 이들의 N- 또는 C-말단이 절단된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 D-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 외인성 핵산은 서열번호 64 또는 서열번호 66에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 D-LDH를 암호화한다.
다른 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 D-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하되, 외인성 핵산은 서열번호 64 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성인 핵산 서열을 갖되, 암호화된 LDH는 D-LDH 활성을 포함하거나, 또는 이러한 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 D-락테이트(예를 들어, 실시예 1의 방법을 이용하고 상기 방법의 엔지플루오(상표명) L-락테이트 분석 키트를 대신해서 엔지플루오(상표명) D-락테이트 분석 키트(카탈로그 번호 EFDLC-100, 캘리포니아주 94545에 소재한 바이오어세이 시스템즈)로 결정한 바와 같음)을 생산한다. 일부 실시형태에서, 암호화된 D-LDH는 모 LDH에 비해 D-LDH 활성의 적어도 50%를 보유한다. 전형적으로, 이러한 D-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다.
특정 실시형태에서, 외인성 핵산은 서열번호 64 또는 서열번호 66에 대응하는 서열을 가진다. 특정의 이들 실시형태에서, 이러한 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다.
추가 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 예시적인 L-LDH 핵산은 등록번호 AEEL01000014.1(영역 176996 내지 177985)(스트렙토코커스 보비스), NC_010080.1(영역 957682 내지 958608)(락토바실러스 헬베티쿠스), BC 146210.1(보스 타우루스), AB776697.1(페디오코커스 악시딜락티시), EF152288.1(리조푸스 오리자에), NC_013198.1(영역 619708 내지 620646)(락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)), NC_010610.1(영역 417799 내지 418740)(락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)), NC_008054.1(영역 99905 내지 100828)(락토바실러스 델브루에키), NC_002662.1(영역 1369224 내지 1370201)(락토코커스 락티스) 및 NC_004668.1(영역 231275 내지 232258)(엔테로코커스 파에칼리스)에 대응하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 실행에서 사용되는 외인성 핵산은 L-LDH의 임의의 다음의 예시적 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있다: 등록 번호 EFM27433.1(스트렙토코커스 보비스), YP_001577351.1(락토바실러스 헬베티쿠스), AAI46211.1(보스 타우루스), BAM76361.1(페디오코커스 악시딜락티시), ABL84845.1(리조푸스 오리자에), YP_003170352.1(락토바실러스 람노서스), YP_001843164.1(락토바실러스 퍼멘텀), YP_618317.1(락토바실러스 델브루에키), NP_267487.1(락토코커스 락티스), NP_814049.1(엔테로코커스 파에칼리스); 서열번호 52(스타필로코커스 시미아에 CCM 7213), 53(스타필로코커스 비툴리누스 F1028), 54(스타필로코커스 렌투스 F1142), 55(마크로코커스 카세올리티쿠스 JCSC5402), 56 (바실러스 투린지엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27), 57(바실러스 투린지엔시스 혈청형 치넨시스 CT-43) 및 58(바실러스 마이코이데스 DSM 2048).
일부 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 이들의 N- 및 C-말단이 절단된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%), 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%), 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 및 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하되, 암호화된 LDH는 L-LDH 활성을 포함하거나, 또는 이러한 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 L-락테이트(예를 들어, 실시예 1의 방법을 이용하여 결정된 바와 같음)을 생산한다. 일부 실시형태에서, 암호화된 L-LDH는 모 LDH에 비해 L-LDH 활성의 적어도 50%를 보유한다. 전형적으로, 이러한 L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는, 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다.
일부 실시형태에서, 기준 아미노산 서열은 서열번호 2, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 48로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 기준 아미노산 서열은 서열번호 34, 16 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 외인성 핵산은 서열번호 2(스트렙토코커스 파스테우리아누스 LDH), 4(락토바실러스 헬베티쿠스 LDH), 6(보스 타우루스 LDH 변이체), 8(루미노코커스 토르쿠엔스 LDH), 10(리조푸스 오리자에 LDH), 12(엔테로코커스 파에칼리스 LDH), 14(락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) LDH), 16(바실러스 메가테리움 LDH), 18(타에니오피기아 구타타 LDH), 20(락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LDH), 22(락토바실러스 아시도필루스 LDH), 24(스타필로코커스 아우레우스 LDH), 26(바실러스 칼돌리티쿠스 LDH), 28(악티노마이세스 비스코서스 LDH), 30(바실러스 안트라시스 LDH), 32(박테리오이데스 펙티노필루스 LDH), 34(리스테리아 마르티(Listeria marthii) LDH), 36(바실러스 서브틸리스 LDH), 38(엔테로코커스 파에시움 LDH), 40(바실러스 투린지엔시스 LDH), 42(게오바실러스 스테아로써모필루스 LDH), 44(데이노코커스 라디오두란스 LDH), 46(플라스모듐 오발레 LDH 변이체), 48(써무스 써모필루스 LDH), 53(스타필로코커스 시미아에 CCM 7213), 54(스타필로코커스 비툴리누스 F1028), 55(스타필로코커스 렌투스 F1142), 56(마크로코커스 카세올리티쿠스 JCSC5402), 57(바실러스 투린지엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27), 58(바실러스 투린지엔시스 혈청형 치넨시스 CT-43), 59(바실러스 마이코이데스 DSM 2048) 및 이들의 N- 및 C-말단이 절단된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 L-LDH를 암호화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산은 서열번호 2, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 L-LDH를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 외인성 핵산은 서열번호 34, 16 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 L-LDH를 암호화한다.
다른 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하되, 외인성 핵산은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 및 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 핵산 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성인 핵산 서열을 가지되, 암호화된 LDH는 L-LDH 활성을 포함하거나, 또는 이러한 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 L-락테이트를 생산한다(예를 들어, 실시예 1의 방법을 이용하여 결정된 바와 같음). 일부 실시형태에서, 암호화된 L-LDH는 모 LDH에 비해 L-LDH 활성의 적어도 50%를 보유한다. 전형적으로, 이러한 L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는, 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 더 많은 락테이트를 생산할 수 있다.
특정 실시형태에서, 기준 핵산 서열은 서열번호 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 및 47로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 외인성 핵산은 서열번호 33, 15 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 핵산 서열을 암호화한다. L-LDH를 암호화하는 예시적인 외인성 핵산은 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 및 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산은 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 및 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체적 실시형태에서, L-LDH를 암호화하는 외인성 핵산은 서열번호 33, 15 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
전형적으로, 본 명세서에 기재된 암호화된 LDH의 절단 변이체는 약 1 내지 약 6개의 아미노산 잔기에 의해 N-말단이 절단된(또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 잔기, 또는 약 1 내지 약 4개의 아미노산 잔기, 또는 약 1 내지 약 3개의 아미노산 잔기, 또는 약 1 내지 약 2개의 아미노산 잔기, 또는 1개의 아미노산 잔기에 의해 N-말단이 절단된), 및/또는 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기(또는 약 1 내지 약 25, 약 20, 약 15, 약 10 또는 약 5개의 아미노산 잔기)에 의해 C-말단이 절단된 대응하는 기준(즉, 이의 모 또는 서열 변이체) LDH를 암호화한다.
본 명세서에 기재된 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체의 특정 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1세트의 배양 조건 하에 C1 기질(예를 들어, 메탄)의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 적어도 약 1.5배 이상 락테이트를 생산할 수 있다. 다른 실시형태에서, 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 적어도 1세트의 배양 조건 하에서 C1 기질(예를 들어, 메탄)의 존재 하에 배양될 때, 대응하는 기준 C1 대사 미생물유기체에 비해 락테이트를 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 500배, 적어도 약 1000배 및 약 15,000배까지 또는 약 20,000배 초과까지 더 많이 생산할 수 있다.
LDH 변이체를 암호화하는 외인성 핵산을 생산하는 방법은 상기 주목한 참고문헌에 기재한 계통발생 기반 방법을 이용하여 설계될 수 있다(미국 특허 제 8,005,620호; Gustafsson; Welch et al.; Villalobos et al.; Minshull et al.). 이들 방법에 의해 생성된 각각의 LDH 변이체는 적어도 50% 활성(바람직하게는 100% 이상의 활성)을 보유할 것이며, 기준 또는 모 야생형 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성, 또는 100% 동일성인 폴리펩타이드 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 암호화된 LDH 변이체는 기준 또는 모 야생형 효소에 비해 사전 결정된 위치에서 적어도 1개의 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상 또는 20, 25 또는 30개 치환)을 포함할 것이며, 단, 변이체는 락트산 탈수소효소 활성(예를 들어, L- 또는 D-락트산 탈수소효소 활성 또는 L- 또는 D-락테이트 생산)을 보유한다. D- 및 L-락트산 탈수소효소 활성을 결정하기 위한 예시적 분석은 본 명세서에 기재된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 2 이상의 핵산을 포함하며, 각각은 락트산 탈수소효소를 암호화하되, 핵산의 서열 및/또는 LDH의 서열은 동일 또는 상이할 수 있다. 특정 실시형태에서, LDH 암호화 핵산의 다중 복제물은 동일한 LDH 또는 상이한 LDH 암호화 핵산의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 복제물일 수 있는 숙주 세포 내로 도입된다. 2 이상의 외인성 핵산 분자가 숙주 C1 대사 미생물유기체 내로 도입될 때, 2 이상의 외인성 핵산 분자는 별개의 벡터 상에서 단일 핵산 분자로서(예를 들어, 단일 벡터 상에서) 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체 내로 통합되는 것으로 이해되며, 각각의 이들 실시형태는 2 이상의 외인성 핵산 분자를 고려할 것이다. 예를 들어, 1개 이상의 이종성 또는 외인성 핵산 분자는 숙주 세포 내로, 예를 들어, 별개의 핵산 분자로서, 다시스트론성 핵산 분자로서, 융합 단백질을 암호화하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이들의 임의의 조합에 도입될 수 있고, 여전히 하나 이상의 이종성 또는 외인성 핵산으로서 고려된다.
특정 실시형태에서, 외인성 핵산은 컨쥬게이션, 형질전환, 형질감염, 전기천공법 등에 의해 숙주 세포 내로 도입되되, 첨가된 분자는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있거나 또는 염색체밖 유전자 물질로서(예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자기-복제 벡터로서) 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체는 추가적인 유전자 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 이종성 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서)는 천연 유전자 또는 핵산이 천연에서 또는 배양물에서 정상적으로 발현되는 방법과 상이한 방법으로 천연 유전자 또는 핵산의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 피루브산 탈카복시효소, 메틸글라이옥살 신타제, LDH(예를 들어, 호기성 LDH, D-LDH), 글라이코겐 신타제, 포스포글루코뮤타제, 또는 이들의 임의의 조합을 감소 또는 저해하여 락테이트 생산, 락테이트 수율 또는 둘 다를 증가시키기 위한 것과 같은 다른 유전자 변형이 생성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비 자연적 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 비-자연적 메탄영양체 박테리아)는 피루브산 탈카복시효소 활성이 최소 내지 검출가능하지 않도록 결실 또는 돌연변이된 내인성 피루브산 탈카복시효소 유전자를 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비-자연적 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 비-자연적 메탄영양체 박테리아)는 메틸글라이옥살 우회 경로가 메틸글라이옥살(독성 부산물)의 축적을 최소화하기 위해 최소 내지 검출가능하지 않은 활성을 갖도록 메틸글라이옥살 신타제 또는 다른 메틸글라이옥살 우회 경로 효소를 암호화하는 결실 또는 돌연변이된 내인성 핵산을 가질 것이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 LDH를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비-자연적 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 비-자연적 메탄영양체 박테리아)는 D-락테이트와 L-락테이트의 라세미 혼합물의 합성을 최소화하거나 또는 회피하기 위해 결실 또는 돌연변이된 내인성 D-LDH를 가질 것이되, 비-자연적 C1 대사 미생물유기체는 L-락테이트를 생산한다. 특정 실시형태에서, 비-자연적 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 비-자연적 메탄영양체 박테리아)는 LDH를 암호화하는 외인성 핵산 분자의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 복제물에 의해 형질전환된다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 LDH를 암호화하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 비-자연적 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 비-자연적 메탄영양체 박테리아)는 내인성 LDH의 정상 발현 수준에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8배 이상으로 LDH를 과발현시킨다.
본 발명의 비-천연 유래 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체, 메틸영양체)는 또한 변이체 락테이트 생합성 경로 또는 효소를 포함하도록 공학처리될 수 있다. 락테이트 합성의 변형은 경로의 하나 이상의 개개 단계들에서 일어날 수 있거나 또는 전체적으로 새로운 경로를 수반한다. 특정 실시형태에서, 특정 락테이트 경로 반응은 변이체 또는 대안의 락테이트 효소에 의해 촉매되는데, 피루브산 탈카복시효소 활성, 알코올 탈수소효소 활성, 하나 이상의 메틸글라이옥살 우회 경로 효소, D-LDH, 글라이코겐 신타제, 포스포글루코뮤타제, 또는 이들의 임의의 조합을 저해하거나 또는 넉아웃시키는 것과 조합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 2 이상의 공급원으로부터 유래된 핵산에 의한 혼성 경로는 락테이트 생산, 수율 또는 둘 다를 향상시키기 위해 사용된다.
메탄영양체 박테리아에서 내인성 유전자 기능을 저해, 불활성화, 넉아웃 또는 결실시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 표적화된 유전자 붕괴는 외인성 핵산이 전사를 붕괴시키기 위해 구조적 유전자 내로 삽입되는 경우 유전자 하향조절을 위한 효과적인 방법이다. 붕괴될 표적 숙주 유전자의 일부에 대해 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 서열에 측접하는 외인성 삽입 DNA(예를 들어, 유전자 마커)를 포함하는 유전자 카세트는 숙주 메탄영양체 박테리아 내로 도입된다. 외인성 DNA는 천연 DNA 복제 메커니즘을 통해 표적 숙주 유전자를 붕괴시킨다. 메탄영양체 박테리아를 포함하는 C1 대사 미생물유기체 중의 결실/삽입 돌연변이체를 구성하기 위한 대립유전자 교환은, 예를 들어, 문헌[Toyama and Lidstrom, Microbiol . 144:183, 1998; Stolyar et al., Microbiol . 145:1235, 1999; Ali et al., Microbiol. 152:2931, 2006; Van Dien et al., Microbiol. 149:601, 2003; Martin and Murrell, FEMS Microbiol . Lett . 127:243, 2006. Culture Methods ]에 기재되어 있다.
락테이트의 생산방법
본 명세서에서 락테이트를 생산하는데 충분한 조건 하에서 탄소 공급원료의 존재 하에 락트산 탈수소효소를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체, 메틸영양체)를 배양시키는 단계를 포함하는, 락테이트의 생산방법이 제공된다. 전형적으로, 탄소 공급원료는 메탄, 메탄올, 합성 가스 및 천연가스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 전형적으로는, 탄소 공급원료는 메탄 및 천연가스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 메탄영양체 박테리아 배양물의 성장 및 유지 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 명세서에 기재된 비천연 유래 메탄영양체 박테리아의 다양한 실시형태는 L-락트산 및 이의 염 및 에스터와 같은 락테이트를 생산하는 방법에서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 락테이트는 구체적 세포 성장 단계(예를 들어, 유도기, 대수기, 정지기 또는 사멸기) 동안 생산된다. 공급원료로부터의 탄소는 C1 대사 미생물유기체의 성장 및 유지에 대해서보다 락테이트로 전환되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체, 메틸영양체)는 낮은 내지 중간의 세포 밀도(OD600)로 배양되고, 이어서, 락테이트의 생산이 개시된다. 일부 실시형태에서, 락테이트가 생산되는 한편, C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체 박테리아)는 더 이상 분할되지 않거나 매우 느리게 분할된다. 일부 실시형태에서, 락테이트는 정지기 동안만 생성된다. 일부 실시형태에서, 락테이트는 대수기 및 정지기 동안 생성된다.
본 명세서에 제공되는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체, 메틸영양체)에 의해 생산되는 락테이트를 포함하는 발효기 조성물은 생물학적 발효 공정과 관련된 다른 유기 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 발효의 생물학적 부산물은 알코올, 에폭사이드, 알데하이드, 케톤, 에스터 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 발효기 조성물은 다음의 알코올 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 메탄올, 에탄올, 뷰탄올 또는 프로판올. 다른 화합물, 예컨대 H2O, CO, CO2, CO N2, H2, O2 및 이용되지 않은 탄소 공급원료, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판 및 부탄은 발효기 오프가스 내에 존재할 수 있다.
락테이트를 생산하는데 충분한 조건은 약 25℃ 내지 약 50℃ 범위의 온도에서 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 온도는 약 37℃ 내지 약 50℃의 범위이며, 약 37℃ 내지 약 45℃의 범위일 수 있다. 락테이트를 생산하는데 충분한 다른 조건은 약 6 내지 약 9의 범위의 그리고 종종 약 7 내지 약 8의 범위에서 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 배양시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체, 메틸영양체)는 배양물의 약 0.001g/ℓ 내지 배양물의 약 500g/ℓ에서 락테이트를 생산한다. 일부 실시형태에서, 생산된 락테이트의 양은 배양물의 약 1g/ℓ 내지 배양물의 약 100g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 생산된 락테이트의 양은 약 0.001g/ℓ, 0.01g/ℓ, 0.025g/ℓ, 0.05g/ℓ, 0.1g/ℓ, 0.15g/ℓ, 0.2g/ℓ, 0.25g/ℓ, 0.3g/ℓ, 0.4g/ℓ, 0.5g/ℓ, 0.6g/ℓ, 0.7g/ℓ, 0.8g/ℓ, 0.9g/ℓ, 1g/ℓ, 2.5g/ℓ, 5g/ℓ, 7.5g/ℓ, 10g/ℓ, 12.5g/ℓ, 15g/ℓ, 20g/ℓ, 25g/ℓ, 30g/ℓ, 35g/ℓ, 40g/ℓ, 45g/ℓ, 50g/ℓ, 60g/ℓ, 70g/ℓ, 80g/ℓ, 90g/ℓ, 100g/ℓ, 125g/ℓ, 150g/ℓ, 175g/ℓ, 200g/ℓ, 225g/ℓ, 250g/ℓ, 275g/ℓ, 300g/ℓ, 325g/ℓ, 350g/ℓ, 375g/ℓ, 400g/ℓ, 425g/ℓ, 450g/ℓ, 475g/ℓ 또는 500g/ℓ이다.
특정 실시형태에서, 락테이트는 실질적으로 정제된 액체이다. 정제 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 순도는 칼럼 크로마토그래피, HPLC 또는 GC-MS 분석과 같은 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 락테이트는 적어도 20중량%, 25중량%, 30중량%, 35중량%, 40중량%, 45중량%, 50중량%, 55중량%, 60중량%, 65중량%, 70중량%, 75중량%, 80중량%, 85중량%, 90중량%, 95중량% 또는 99중량% 순도를 가진다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 락테이트 회수 단계 후에 남아있는 기체상의 적어도 일부는 발효 시스템으로 다시 재순환된다.
본 명세서에 기재된 재조합체 메탄영양체 박테리아에 대해 다양한 배양 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 메탄영양체 박테리아는 회분식 배양(batch culture) 또는 연속적 배양 방법에 의해 성장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양물은 제어되는 배양 장치, 예컨대 발효기, 생물반응기, 중공섬유 막 생물반응기 등에서 성장된다.
고전적 회분식 배양 방법은 배지 조성이 배양의 시작 시 설정되고, 배양 공정 동안 외부 변용을 받지 않는 폐쇄된 시스템이다. 따라서, 배양 공정의 시작 시, 배지는 목적으로 하는 C1 대사 미생물유기체(예를 들어, 메탄영양체)로 접종되고, 시스템에 임의의 것을 첨가하는 일 없이 성장 또는 대사 활성이 일어나게 된다. 그러나, 전형적으로, "회분식" 배양은 탄소 공급원의 첨가에 대한 회분식이며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하는 시도가 종종 있다. 회분식 시스템에서, 시스템의 대사산물 및 바이오매스 조성은 배양이 종결되는 시간까지 지속적으로 변한다. 회분식 배양 내에서, 세포는 정적 유도기 내지 고성장의 대수기 그리고 최종적으로 성장속도가 감소되거나 또는 중단되는 정지기를 통해 조정된다. 처리되지 않는다면, 정지기의 세포는 종국적으로 사멸될 것이다. 대수기의 세포는 종종 일부 시스템에서 최종 생성물 또는 중간체의 벌크 생성을 초래한다. 정지기 또는 증식 후 단계가 종종 다른 시스템에서 얻어질 수 있다.
유가식(Fed-Batch) 시스템은 표준 회분식 시스템에 대한 변형이다. 유가배양 공정은 배양이 진행됨에 따라 기질이 증분으로 첨가되는 변형을 이용한 전형적인 회분식 시스템을 포함한다. 유가식 시스템은 분해대사산물 억제가 세포의 대사를 저해하는 경향이 있을 때, 그리고 배지 내에서 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템의 실제 기질 농도 측정은 어려우며, 따라서, 측정가능한 인자, 예컨대 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐가스의 부분압의 변화를 기준으로 추정된다. 회분식 및 유가 배양 방법은 통상적이며, 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227, 1992] 참조).
연속 배양은 정해진 배양 배지가 생물반응기에 연속적으로 첨가되고 동일한 양의 조건화된 배지가 가공을 위해 동시에 제거되는 경우 "개방" 시스템이다. 연속 배양은 일반적으로 세포가 주로 대수기 성장을 하는 일정한 높은 액상 밀도에서 세포를 유지한다. 대안적으로, 연속 배양은 탄소 및 영양분이 연속적으로 첨가되는 고정된 세포에 의해 실행될 수 있으며, 가치있는 생성물, 부산물 및 폐생성물은 세포 덩어리로부터 계속해서 제거된다. 세포 고정은 천연 및/또는 합성 물질로 구성된 넓은 범위의 고체 지지체를 이용하여 수행될 수 있다.
연속적 또는 반연속적 배양은 세포 성장 또는 최종 산물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 하나의 방법은 탄소 공급원 또는 질소 수준과 같은 제한된 영양분을 제한된 비율로 유지하고 모든 다른 매개변수가 조절되게 할 것이다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자는 지속적으로 변용될 수 있는 반면, 매질 혼탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속적 시스템은 정상상태 성장 조건을 유지하기 위해 노력하며, 따라서 배지가 회수됨에 기인하는 세포 손실은 배양에서 세포 성장 속도에 대해 균형이 맞춰져야 한다. 연속적 배양 공정뿐만 아니라 생성물 형성 속도를 최대화하기 위한 기법을 위해 영양분 및 성장 인자를 조절하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 다양한 방법은 문헌[Brock, 상기 참조]에 의해 상술된다.
액상 생물반응기(예를 들어, 교반 탱크, 충전층, 하나의 액상, 2개의 액상, 중공섬유 막)는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 비천연 유래 미생물유기체 및 생체촉매의 성장을 위해 사용될 수 있다.
기체상 생물반응기를 이용함으로써, 생물 생성을 위한 기질은 액체로부터보다는 비천연 유래 미생물유기체, 세포 용해물 또는 이들의 무세포 분획에 의한 기체로부터 흡수된다. 미생물유기체에 의한 기체상 생물반응기의 용도는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제2,793,096호; 제4,999,302호; 제5,585,266호; 제5,079,168호; 및 제6,143,556호; 미국 법정 발명 등록 H1430; 미국 특허 출원 공개 번호2003/0032170호; 문헌[Emerging Technologies in Hazardous Waste Management III, 1993, eds. Tedder and Pohland, pp. 411-428], 이들 모두 본 명세서에 참고로 포함됨). 예시적인 기체상 생물반응기는 단일 경로 시스템, 폐쇄 루프 펌핑 시스템, 및 유동층 반응기를 포함한다. 기체상 생물반응기를 이용함으로써, 메탄 또는 다른 기체 기질은, 예를 들어, 모노옥시게나제 활성을 이용하여 폴리펩타이드에 의한 생체전환에 대해 용이하게 이용가능하다. 특정 실시형태에서, 기체를 락테이트 조성물로 전환시키는 방법은 기체상 생물반응기에서 수행된다. 추가 실시형태에서, 기체를 락테이트 조성물로 전환시키는 방법은 유동층 반응기에서 수행된다. 유동층 반응기에서, 유체(즉, 기체 또는 액체)는 미생물유기체가 부착 및 성장할 수 있는 입자층 담체, 보통 모래, 과립-활성탄 또는 규조토를 통해 위쪽으로 통과된다. 유동 속도는 입자층 및 부착된 미생물유기체가 현탁되게(즉, 층 유동화) 한다. 입자층 담체에 부착된 미생물유기체는 유체 내에서 자유롭게 순환해서 미생물유기체에 유체 내 기질의 효과적인 질량 전달 및 증가된 미생물 성장을 가능하게 한다. 예시적인 유동층 반응기는 플러그-유동 반응기 및 완전히 혼합된 반응기를 포함한다. 미생물 생물막을 이용한 유동층 반응기의 용도는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Pfluger et al., Bioresource Technol. 102:9919, 2011; Fennell et al., Biotechnol, Bioengin. 40:1218, 1992; Ruggeri et al., Water Sci. Technol . 29:347, 1994]; 미국 특허 제4,032,407호; 제4,009,098호; 제4,009,105호; 및 제3,846,289호, 이들 모두 본 명세서에 참고로 포함됨).
본 개시내용에 기재된 메탄영양체 박테리아는 성장을 도울 수 있는 이종성 비-메탄영양체 미생물유기체(들)에 의해 단리된 순수 배양물로서 성장될 수 있고, 또는 메탄영양체 박테리아의 하나 이상의 상이한 균주 또는 종과 조합되어 혼합된 배양물을 생성할 수 있다.
대안의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 고체 매트릭스 상에, 내에 또는 뒤에 고정되는 본 발명의 재조합체 C1 대사 미생물유기체 또는 이의 세포 용해물을 사용한다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 비천연 유래 C1 미생물유기체, 세포 용해물 또는 이의 무세포 추출물은 실질적으로 비수성 상태(예를 들어, 동결건조)이다. 재조합체 미생물유기체, 세포 용해물 또는 이의 무세포 분획은 생물반응기 상에, 내에 또는 뒤에 일시적으로 또는 영구적으로 부착된다. 영양분, 기질 및 다른 필요한 인자는 고체 매트릭스에 공급되며, 따라서, 세포는 목적으로 하는 반응을 촉매할 수 있다. 재조합체 미생물유기체는 고체 매트릭스(예를 들어, 생물막)의 표면 상에서 성장할 수 있다. 재조합체 미생물유기체, 세포 용해물 또는 이들로부터 유래된 무세포 분획은 세포 성장이 없는 표면 상에 또는 고체 매트릭스 내에 또는 살아있지 않은 상태로 부착될 수 있다. 미생물유기체에 대한 예시적인 고체 매트릭스 지지체는 폴리프로필렌 고리, 세라믹 바이오-링(bio-ring), 세라믹 새들(saddle), 섬유 지지체(예를 들어, 막), 다공성 유리 비드, 중합체 비드, 차콜, 활성탄, 건조 실리카겔, 미립자 알루미나, 오타와 모래, 점토, 폴리우레탄 세포 지지 시트 및 유동층 입자 담체(예를 들어, 모래, 과립-활성탄, 규조토, 알긴산칼륨 겔 비드)를 포함한다.
명세서에 기재된 조성물 및 본 방법을 이용하여 생산된 락테이트는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 다른 고가치 생성물로 추가로 가공될 수 있다. 예를 들어, 회수 또는 정제 후에, 락테이트는 바이오 플라스틱과 같은 다양한 용도를 위해 변하거나 또는 유도체화될 수 있다.
본 발명은 락테이트 및 이의 조성물 및 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 포함하는 유용한 생성물을 추가로 제공한다. 본 발명의 조성물은 고체(예를 들어, 분말) 또는 액체(예를 들어, 용액, 에멀전, 현탁액 등)의 형태일 수 있고, 본 발명의 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체, 물, 염, 산, 염기, 완충제 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성성분과 조합하여 락테이트를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법을 이용하여 생산된 락테이트 및 이의 조성물은 석유화학으로부터 생산된 락테이트와 구별될 수 있거나 또는 탄소 핑거 프린팅에 의해 비-메탄영양체 박테리아로부터 생합성된 락테이트와 구별될 수 있다. 배경기술의 방법에 의해, 안정한 동위원소 측정 및 물질균형 접근은 메탄의 전반적인 공급원 및 싱크(sink)를 평가하기 위해 널리 사용된다(문헌[Whiticar and Faber, Org. Geochem. 10:759, 1986; Whiticar, Org . Geochem . 16: 531, 1990]). 메탄의 미생물 산화에 의해 야기되는 탄소 동위원소 단편화 정도의 측정은 잔여 메탄의 동위원소 서명(즉, 안정한 동위원소 13C:12C의 비)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 호기성 메탄영양체는 특이적 효소인 메탄 모노옥시게나제(MMO)를 통해 메탄을 동화시킬 수 있다. 메탄영양체는 메탄을 메탄올로 전환시키고, 후속적으로 폼알데하이드로 전환시킨다. 폼알데하이드는 추가로 CO2로 산화되어 환원당량(NADH)의 형태로 세포에 에너지를 제공하거나, 또는 광합성 유기체 내 탄소 동화 경로와 직접적으로 유사한 RuMP 또는 세린 주기 중 하나를 통해 바이오매스에 포함될 수 있다(Hanson and Hanson, Microbiol. Rev. 60:439, 1996). 더 구체적으로는, I형 메탄영양체는 바이오매스 합성을 위해 RuMP 경로를 이용하며, 바이오매스를 CH4로부터 완전하게 생성하는 반면, II형 메탄영양체는 CH4로부터 세포 탄소의 50 내지 70% 그리고 CO2로부터 30 내지 50%를 동화시키는 세린 경로를 이용한다(Hanson and Hanson, 1996). 탄소 동위원소 조성물을 측정하기 위한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Templeton et al. (Geochim . Cosmochim . Acta 70:1739, 2006)]에 제공된다. 락테이트의 13C/12C 안정 탄소 동위원소 비는 (δ13C 값(천분율, ‰))로 보고되며, 사용되는 C1 기질의 공급원 및 순도에 따라서 변한다(예를 들어, 도 2 참조).
예를 들어, 석유로부터 유래된 락테이트는 약 -22‰ 내지 약 -24‰의 δ13C 분포를 가질 것이다. 옥수수-유래 글루코스로부터 주로 생합성된 락테이트(δ13C-10.73‰)는 약 -14.66‰ 내지 -14.85‰의 δ13C를 가진다. 재생 가능한 탄소 공급원으로부터 생합성된 락테이트는 석유로부터 유래된 락트산보다 더 적은 음의 δ13C 값을 갖는 것으로 예상된다. 그러나, 천연가스로부터의 메탄의 δ13C 분포는 대부분의 탄소 공급원과 다른데, 원유보다 더 많은 음의 δ13C 분포를 지닌다. 메탄영양체 박테리아는 12C를 이용하고 과량의 메탄 조건 하에서 13C의 흡수를 감소시켜 δ13C 값의 추가적인 음의 이동을 초래하는 선호도를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 메탄영양체 박테리아에 의해 생산된 락테이트는 δ13C 분포가 원유 또는 재생 가능한 탄소 공급원으로부터의 락트산보다 더 음이며, 약 -30‰ 내지 약 -70‰의 범위에 있다.
특정 실시형태에서, 락테이트 조성물(즉, 락테이트를 포함하는 조성물) 및 그에 함유된 락테이트는 δ13C 분포가 약 -30‰, -40‰ 또는 -50‰ 미만이다. 특정 실시형태에서, 락테이트 조성물 및 그에 함유된 락테이트는 δ13C 분포가 약 -30‰ 내지 약 -40‰, 또는 약 -40‰ 내지 약 -50‰이다. 추가 실시형태에서, 락테이트 조성물 및 그에 함유된 락테이트는 δ13C이 -30‰ 미만, -31‰ 미만, -32‰ 미만, -33‰ 미만, -34‰ 미만, -35‰ 미만, -36‰ 미만, -37‰ 미만, -38‰ 미만, -39‰ 미만, -40‰ 미만, -41‰ 미만, -42‰ 미만, -43‰ 미만, -44‰ 미만, -45‰ 미만, -46‰ 미만, -47‰ 미만, -48‰ 미만, -49‰ 미만, -50‰ 미만, -51‰ 미만, -52‰ 미만, -53‰ 미만, -54‰ 미만, -55‰ 미만, -56‰ 미만, -57‰ 미만, -58‰ 미만, -59‰ 미만, -60‰ 미만, -61‰ 미만, -62‰ 미만, -63‰ 미만, -64‰ 미만, -65‰ 미만, -66‰ 미만, -67‰ 미만, -68‰ 미만, -69‰ 미만 또는 -70‰ 미만이다. 구체적 실시형태에서, 이러한 실시형태에서 락테이트는 유리산(즉, 락트산, CH3CH(OH)COOH)일 수 있되, 이러한 유리산은 본 명세서에 상기 기재한 바와 같은 δ13C를 가진다. 다른 실시형태에서, 락테이트는 하나 이상의 CH3C(OH)C(O)-기(염 또는 에스터의 경우와 같음) 또는 하나 이상의 CH3C(O-)C(O)-) 기(특정 에스터, 올리고머 및 무수물의 경우와 같음)를 함유하는 염, 무수물, 올리고머 또는 에스터일 수 있는데, 이때 락테이트 기의 탄소 원자는 본 명세서에 기재한 바와 같은 δ13C를 가진다.
본 발명의 실시형태는 다음을 포함한다:
1. 락트산 탈수소효소(LDH)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체로서, 상기 C1 대사 미생물유기체는 탄소 공급원료를 락테이트로 전환시킬 수 있는, C1 대사 미생물유기체.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 핵산 분자는 악티노마이세스 비스코서스, 악티노닉스 주바투스, 아르킬로처스 콜루브리스, 바실러스 안트라시스, 바실러스 칼돌리티쿠스, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 스테아로써모필루스(Q9p4b6)(또한 게오바실러스 스테아로써모필루스로서 알려짐), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 투린지엔시스, 박테리오이데스 펙티노필루스, 비피도박테리움 롱검, 보스 타우루스, 카니스 파밀리아리스, 카니스 루푸스, 데이노코커스 라디오두란스, 엔테로코커스 파에칼리스, 엔테로코커스 파에시움, 에쿠스 페루스, 펠리스 카투스, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 코리니포미스종 토르쿠엔스, 락토바실러스 델브루에키(아종 불가리쿠스를 포함함), 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 존슨니, 락토바실러스 펜토서스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토코커스 락티스, 리스테리아 모노사이토게네스, 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 오발레, 써무스 써모필루스, 무스 무스쿨루스, 오릭토라구스 쿠니쿨루스, 페디오코커스 악시딜락티시, 타에니오피기아 구타타, 라투스 노르베기쿠스, 리조푸스 오리자에, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 보비스로부터 유래된 것인, C1 대사 미생물유기체.
3. 실시형태 1에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 외인성 핵산 서열은 상기 메탄영양체 박테리아에서 발현을 위해 코돈 최적화된 것인, C1 대사 미생물유기체.
4. 실시형태 1에 있어서, 상기 외인성 핵산 분자는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 60, 61, 62, 63 또는 12 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는, C1 대사 미생물유기체.
5. 실시형태 1에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 외인성 핵산은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 임의의 하나에 제시된 서열을 갖는, C1 대사 미생물유기체.
6. 실시형태 1에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 외인성 핵산은 발현 제어 서열에 조작 가능하게 연결된, C1 대사 미생물유기체.
7. 실시형태 6에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 피루브산 탈카복시효소 프로모터, 메탄올 탈수소효소 프로모터, 헥술로스 6-인산염 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 프로모터, 포스포엔올피루브산 카복실라제 프로모터, T5 프로모터 또는 Trc 프로모터로부터 선택된 프로모터인, C1 대사 미생물유기체.
8. 실시형태 1에 있어서, 상기 미생물유기체는 최소의, 검출가능하지 않은 또는 넉아웃된 내인성 피루브산 탈카복시효소 활성을 갖는, C1 대사 미생물유기체.
9. 실시형태 1에 있어서, 상기 미생물유기체는 최소로 활성이거나 또는 넉아웃된 하나 이상의 내인성 메틸글라이옥살 우회 경로 효소를 갖는, C1 대사 미생물유기체.
10. 실시형태 1에 있어서, 상기 미생물유기체는 최소의, 검출가능하지 않은 또는 넉아웃된 내인성 알코올 탈수소효소 활성을 갖는, C1 대사 미생물유기체.
11. 실시형태 1에 있어서, 상기 미생물유기체는 내인성 피루브산 탈카복시효소, 알코올 탈수소효소, 메틸글라이옥살 신타제 또는 이들의 임의의 조합에 대해 감소된 또는 넉아웃된 활성을 갖는, C1 대사 미생물유기체.
12. 실시형태 1에 있어서, 상기 미생물유기체는 약 1㎎/ℓ 내지 약 500g/ℓ의 락테이트를 생산할 수 있는, C1 대사 미생물유기체.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 C1 대사 미생물유기체는 메탄영양체인, C1 대사 미생물유기체.
14. 실시형태 13에 있어서, 상기 메탄영양체는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로셀라 또는 메틸로캅사인, C1 대사 미생물유기체.
15. 실시형태 13에 있어서, 상기 메탄영양체는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주, 메틸로모나스 메타니카 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b(NRRL B-11, 196), 메틸로시너스 스포리움 (NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11, 198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11, 200), 메틸로박터 캡슐라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 메틸로캅사아우레아 KYG, 메틸아시디필리움 인페르노룸, 메틸아시디필리움 푸마리오리쿰, 메틸로아시다 캄차트켄시스, 메틸리비움 페트롤에필룸 또는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸인, C1 대사 미생물유기체.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 탄소 공급원료는 메탄, 메탄올, 합성 가스, 천연가스 또는 비전통 천연가스인, C1 대사 미생물유기체.
17. 락테이트의 생산방법으로서, 락테이트를 생산하기에 충분한 조건 하에서 탄소 공급원료의 존재 하에 LDH를 암호화하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체를 배양시키는 단계를 포함하는, 락테이트의 생산방법.
18. 실시형태 17에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 핵산 분자는 악티노마이세스 비스코서스, 악티노닉스 주바투스, 아르킬로처스 콜루브리스, 바실러스 안트라시스, 바실러스 칼돌리티쿠스, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 스테아로써모필루스(Q9p4b6)(또한 게오바실러스 스테아로써모필루스로서 공지됨), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 투린지엔시스, 박테리오이데스 펙티노필루스, 비피도박테리움 롱검, 보스 타우루스, 카니스 파밀리아리스, 카니스 루푸스, 데이노코커스 라디오두란스, 엔테로코커스 파에칼리스, 엔테로코커스 파에시움, 에쿠스 페루스, 펠리스 카투스, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 코리니포미스종 토르쿠엔스, 락토바실러스 델브루에키(아종 불가리쿠스를 포함), 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 존슨니, 락토바실러스 펜토서스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토코커스 락티스, 리스테리아 모노사이토게네스, 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 오발레, 써무스 써모필루스, 무스 무스쿨루스, 오릭토라구스 쿠니쿨루스, 페디오코커스 악시딜락티시, 타에니오피기아 구타타, 라투스 노르베기쿠스, 리조푸스 오리자에, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 보비스로부터 유래된, 락테이트의 생산방법.
19. 실시형태 17에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 외인성 핵산 서열은 메탄영양체 박테리움에서 발현을 위해 코돈 최적화된, 락테이트의 생산방법.
20. 실시형태 17에 있어서, 상기 외인성 핵산 분자는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 60, 61, 62, 63 또는 12 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는, 락테이트의 생산방법.
21. 실시형태 17에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 외인성 핵산은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 임의의 하나에 제시된 서열을 갖는, 락테이트의 생산방법.
22. 실시형태 17에 있어서, 상기 LDH를 암호화하는 외인성 핵산은 발현 제어 서열에 조작 가능하게 연결된, 락테이트의 생산방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 피루브산 탈카복시효소 프로모터, 메탄올 탈수소효소 프로모터, 헥술로스 6-인산염 신타제 프로모터, 리보솜 단백질 S16 프로모터, 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 프로모터, 세린-글라이옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 프로모터, 포스포엔올피루브산 카복실라제 프로모터, T5 프로모터 또는 Trc 프로모터인, 락테이트의 생산방법.
24. 실시형태 17에 있어서, 상기 미생물유기체는 최소의, 검출가능하지 않은 또는 넉아웃된 내인성 피루브산 탈카복시효소 활성을 갖는, 락테이트의 생산방법.
25. 실시형태 17에 있어서, 상기 미생물유기체는 최소로 활성이거나 또는 넉아웃된 하나 이상의 내인성 메틸글라이옥살 우회 경로 효소를 갖는, 락테이트의 생산방법.
26. 실시형태 17에 있어서, 상기 미생물유기체는 최소의, 검출가능하지 않은 또는 넉아웃된 내인성 알코올 탈수소효소 활성을 갖는, 락테이트의 생산방법.
27. 실시형태 17에 있어서, 상기 미생물유기체는 내인성 피루브산 탈카복시효소, 알코올 탈수소효소, 메틸글라이옥살 신타제 또는 이들의 임의의 조합에 대해 감소된 또는 넉아웃된 활성을 갖는, 락테이트의 생산방법.
28. 실시형태 17에 있어서, 상기 미생물유기체는 약 1㎎/ℓ 내지 약 500g/ℓ의 락테이트를 생산할 수 있는, 락테이트의 생산방법.
29. 실시형태 17 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 C1 대사 미생물유기체는 메탄영양체인, 락테이트의 생산방법.
30. 실시형태 29에 있어서, 상기 메탄영양체는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로셀라 또는 메틸로캅사인, 락테이트의 생산방법.
31. 실시형태 29에 있어서, 상기 메탄영양체는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주, 메틸로모나스 메타니카 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b(NRRL B-11, 196), 메틸로시너스 스포리움(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11, 198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11, 200), 메틸로박터 캡슐라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 메틸로캅사아우레아 KYG, 메틸아시디필리움 인페르노룸, 메틸아시디필리움 푸마리오리쿰, 메틸로아시다 캄차트켄시스, 메틸리비움 페트롤에필룸 또는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸인, 락테이트의 생산방법.
32. 실시형태 17 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 탄소 공급원료는 메탄, 메탄올, 합성 가스, 천연가스 또는 비전통 천연가스인, 락테이트의 생산방법.
33. 락테이트 조성물로서, 상기 락테이트의 δ13C는 약 -30‰ 미만인, 락테이트 조성물.
34. 실시형태 33에 있어서, 상기 락테이트의 상기 δ13C는 약 -70‰ 내지 약 -30‰의 범위인, 락테이트 조성물.
35. 실시형태 33에 있어서, 상기 락테이트의 상기 δ13C는 약 -60‰ 내지 약 -40‰의 범위인, 락테이트 조성물.
36. 실시형태 33 내지 35에 있어서, 상기 락테이트 조성물은 락트산 탈수소효소(LDH)를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비천연 유래 C1 대사 미생물유기체에 의해 생산되는, 락테이트 조성물.
37. 실시형태 36에 있어서, 상기 C1 대사 미생물유기체는 메탄영양체인, 락테이트 조성물.
38. 실시형태 37에 있어서, 상기 메탄영양체는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로셀라 또는 메틸로캅사인, 락테이트 조성물.
39. 실시형태 37에 있어서, 상기 메탄영양체는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주, 메틸로모나스 메타니카 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포리움(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 메틸로캅사아우레아 KYG, 메틸아시디필리움 인페르노룸 메틸아시디필리움 푸마리오리쿰, 메틸로아시다 캄차트켄시스, 메틸리비움 페트롤에필룸 또는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸인, 락테이트 조성물.
본 발명의 앞서 언급한 그리고 다른 양태는 다음의 비제한적 실시예와 관련하여 더 양호하게 이해될 수 있다.
실시예
실시예 1
락테이트 생산을 위해 공학처리된 C1 대사 미생물유기체
I. 락테이트 생산을 위해 공학처리된 메틸로코커스 캡슐라투스 배스.
숙주 세포(메틸로코커스 캡슐라투스 배스)를 외인성 L-락트산 탈수소효소(ldh) 핵산을 갖도록 공학처리하여 C1 기질(메탄)로부터 L-락테이트를 생산하게 했다. 락트산 탈수소효소를 암호화하는 핵산 서열을 메틸로코커스 캡슐라투스 배스에 대해 코돈 최적화시키고, 합성하였다. 이들 코돈 최적화된 핵산은 다음의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 및 45에 대한 서열에 대응한다. 그들은 다음의 LDH, 각각, 서열번호 2(스트렙토코커스 파스테우리아누스), 4(락토바실러스 헬베티쿠스), 6(보스 타우루스), 8(페디오코커스 악시딜락티시), 10(리조푸스 오리자에), 12(엔테로코커스 파에칼리스), 14(락토바실러스 카세이), 16(바실러스 메가테리움), 18(타에니오피기아 구타타), 20(락토바실러스 플란타룸), 22(락토바실러스 아시도필루스), 24(스타필로코커스 아우레우스), 26(바실러스 칼돌리티쿠스), 28(악티노마이세스 비스코서스), 30(바실러스 안트라시스), 32(루미노코커스 토르쿠엔스), 34(리스테리아 마르티), 36(바실러스 서브틸리스), 38(엔테로코커스 파에시움), 40(바실러스 투린지엔시스), 42(게오바실러스 스테아로써모필루스), 44(데이노코커스 라디오두란스), 46(플라스모듐 오발레(변이체)) 및 48(써무스 써모필루스)을 암호화한다. LDH 핵산은 리보솜 결합 부위를 지니는 메탄올 탈수소효소(MDH) 프로모터(서열번호 49, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스로부터의 메탄올 탈수소효소 단백질로부터의 추정적 프로모터, 거대 서브유닛 n229(MCA0779))(벡터 pMS3x1)인 프로모터 시스템 하류의 또는 대안적으로 2개의 상이한 돌연변이된 리보솜 결합 부위(벡터 pMS3x2 및 pMS3x3) 중 하나를 지니는 동일한 벡터에서 또는 IPTG-유도성(LacIq) 프로모터 시스템(천연 리보솜 결합 부위(벡터 pMS3z1)를 지님) 내 MDH 프로모터의 하류에서 또는 대안적으로 2개의 상이한 돌연변이된 리보솜 결합 부위 중 하나가 돌연변이된 리보솜 결합 부위(벡터 pMS3z2 및 pMS3z3)를 지니는 동일한 벡터에서, 플라스미드 pMS3 내로 클로닝시켰다(도 3에 도시함). RK2 플라스미드(문헌[Schmidhauser, et al., J. Bacteriol . 164(1):446-55 (1985)], 본 명세서에 참고로 포함됨)로부터 유래된 pMS3은 복제 개시 단백질(trfA) 및 프로모터(Pbla), 복제기점(oriV), 전달 기점(oriT), 및 카나마이신 내성 유전자 및 프로모터(KanR 프로모터)를 암호화하는 서열을 함유하는 최소 플라스미드이다. 벡터를 알리(Ali)와 뮤렐(Murrell)(Microbiology 155:761, 2009)에 의해 보고된 방법에 기반한 접합 교배를 통해 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 내로 도입하였다.
벡터를 우선 표준 전기천공법을 이용하여 이콜라이(E. coli) S17-1에 형질전환시켰다. 형질전환을 30㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB-한천 상의 카나마이신-내성 콜로니의 선택에 의해 확인하였다. 공여체 플라스미드의 서열을 서열화(즉, 서열분석(sequencing))를 통해 확인하였다. 형질전환시킨 콜로니를 30㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 접종하고 나서, 37℃에서 밤새 진탕시켰다. 밤새 배양물의 분취액(예를 들어, 100㎕)을 사용하여 30㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 새로운 LB 배지를 접종하고, 이어서, 0.45 내지 0.6(중간-대수기 성장)의 광학 밀도(OD600)에 대해 성장시켰다. 이어서, OD 1.6인 이런 제2 배양물의 분취액(예를 들어, OD600 0.5인 배양물 3㎖)을 원심분리를 통해 펠렛화시키고, 원심분리 및 재현탁을 통해 멸균 MM-W1로 3회 세척하였다. 이어서 밤새 배양물의 10㎖ 분취액을 멸균 47㎜ 나이트로셀룰로스 필터(0.2㎜ 기공 크기) 상에서 수집하였다. 이콜라이 공여체 세포를 50㎖ 멸균 NSM 배지를 이용하여 필터 상에서 세척하여 잔여 배지 및 항생제를 제거하였다.
동시에, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스(NCIMB 11132) 수용체 균주 샘플을 20 내지 50㎖ MM-W1 배지를 함유하는 100㎖ 혈청 보틀 내로 접종시켰다. 보틀을 뷰틸 고무 마개로 밀봉하고 나서, 권축시키고, 이어서, 40 내지 60㎖의 메탄을 밀봉 보틀 내로 도입하였다. OD600이 대략 0.3에 도달될 때까지 보틀을 42℃ 인큐베이터 내에서 계속해서 진탕시켰다. 이어서, 대략 5㎖의 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 배양물을 원심분리를 통해 펠렛화시키고 나서, 이콜라이 공여체 세포와 혼합하였다. 이 혼합물을 0.5% 효모 추출물을 함유하는 MM-W1 한천 플레이트 상에 위치시키고 나서, 메탄과 공기의 1:1 혼합물의 존재 하에 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 세포를 0.5㎖ 멸균(MM-W1) 배지 중에서 재현탁시키고 나서, 분취액(100㎕)을 7.5㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 MM-W1 한천 플레이트 상에서 펼쳤다.
메탄과 공기의 1:1 혼합물을 함유하는 밀봉 챔버 내에서 플레이트를 인큐베이션시키고 나서, 42℃에서 유지하였다(메틸로코커스 캡슐라투스 배스). 전형적으로 5 내지 8일 후에 콜로니가 형성될 때까지 혼합물을 대략 2일마다 보충하였다. 카나마이신을 함유하는 NSM 플레이트 상에 콜로니를 도말하여 카나마이신 내성을 확인할 뿐만 아니라 잔여 이콜라이 공여체 세포로부터 형질전환된 메탄영양체 세포를 추가로 단리시켰다.
ldh 발현 또는 LDH 기능의 존재를 (1) PCR 및 서열화 및/또는 (2) 락테이트의 존재에 대한 분석에 의해 확인하였다. 예를 들어, 전달 콜로니를 확인하기 위해 물질을 98℃에서 비등시키고 나서, 표준 조건(1분 동안 98℃; 10초 동안 98℃, 30초 동안 55℃, 및 1분 동안 72℃에서 30주기; 10분 동안 72℃)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 선택적으로, 추가 대조군으로서, 1㎕의 각각의 단리된 플라스미드를 이콜라이 XL1-블루(Blue) MRF'Kan(캘리포니아주 라호이아에 소재한 스트라타겐(Stratagene))에 다시 형질전환시킬 수 있고, 플라스미드를 단리시켜 제한 엔도뉴클레아제 분해를 확인할 수 있다.
재조합체 메틸로코커스 캡슐라투스 배스를 밀봉 챔버에 함유된 MM-W1 배지를 함유하는 24-웰 플레이트 내 42℃에서 배양시켰다. 헤드스페이스 조성을 메탄:공기 1:1 용적으로 조절하였다. 보틀을 200 내지 250rpm의 속도로 진탕시켰다. 대안적으로, 배양물을 1:1(v/v) 메탄:공기 가스 혼합물을 함유하는 기밀 챔버 내에서 1.5% w/v 한천을 이용하여 고형화시킨 MM-W1-배지 플레이트 상에서 유지하였다. 플레이트를 42℃에서 챔버 내에서 뒤집어서 인큐베이션시켰다.
C 1 기질(CH 4 )로부터의 락테이트 생산
벡터 단독(즉, 외인성 LDH 암호화 핵산 및 프로모터가 없는 음성 대조군) 또는 외인성 LDH 핵산 및 프로모터 시스템을 함유하는 벡터를 지니는 형질전환시킨 메틸로코커스 캡슐라투스 배스를 사용하여 7.5㎍/㎖ 카나마이신을 갖는 24웰 플레이트의 2.5㎖ MM-W1 배지/웰을 접종하였다. 사용한 배지 MM-W1의 조성물은 다음과 같았다: 0.8mM MgSO4 * 7H2O, 10mM NaNO3, 0.14mM CaCl2, 1.2mM NaHCO3, 2.35mM KH2PO4, 3.4mM K2HPO4, 20.7μM Na2MoO4 * 2H2O, 1μM CuSO4 * 5H2O, 10μM FeIII-Na-EDTA, 및 1㎖/ℓ의 미량 금속 용액(리터 당 500㎎ FeSO4 * 7H2O, 400㎎ ZnSO4 * 7H2O, 20㎎ MnCl2 * 7H2O, 50㎎ CoCl2 * 6H2O, 10㎎ NiCl2 * 6H2O, 15㎎ H3BO3, 250㎎ EDTA를 함유). 배지를 고압멸균시키고 냉각시킨 후에, 인산염, 중탄산염 및 FeIII-Na-EDTA를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉 챔버 내에 위치시키고, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스에 대한 탄소 공급원으로서 메탄과 공기의 1:1 혼합물을 이용하여 헤드스페이스를 플러슁시키고, 플레이트를 밀봉하고 나서, 이어서 24시간 사전 배양을 위해 42 내지 45℃에서 인큐베이션 동안 200 내지 250rpm의 속도로 연속적으로 진탕시켰다. 이어서, 2.5㎖ 새로운 MM-W1 및 카나마이신을 함유하는 새로운 24 웰 플레이트를 사전 배양물 0.25㎖로 접종시키고 나서, 42 내지 45℃에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. IPTG-유도성(LacIq) 프로모터 시스템에서 MDH 프로모터를 함유하는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주를 0.1 내지 10mM IPTG의 존재 하에 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 채취하고 나서, 형광을 측정하기 전 2시간 동안 키트 시약과 함께 상청액을 인큐베이션시킨 것을 제외하고 상청액을 제조업자의 설명서에 따라 엔지플루오(EnzyFluo)(상표명) L-락테이트 분석 키트(캘리포니아주 94545 헤이워드에 소재한 바이오어세이 시스템즈(BioAssay Systems), 카탈로그 번호 EFLLC-100)를 이용하여 분석하였다. 메탄은 세포에 제공된 유일한 탄소 공급원이기 때문에, 생산된 모든 락테이트는 메탄으로부터 유래되어야 한다.
결과
표 1의 결과는 락트산 탈수소효소를 암호화하는 다양한 외인성 핵산을 이용하는 락테이트의 생산을 입증한다. 락테이트가 LDH의 구성적 발현 하에 생산되는 특정 경우에, 재조합체 메틸로코커스 캡슐라투스 배스는 높은 락테이트 대 OD600 비를 나타내었다(도 1 참조).
Figure 112015124715965-pct00002
Figure 112015124715965-pct00003
표 1의 각각의 서열에 대해, 가장 높게 검출된 값을 다음의 척도에 따라 열거한다: + 3 내지 100μM, ++ 100 내지 1000μM, +++ >1000μM. 양의 LDH 활성을 갖는 재조합체 세포를 지정하기 위한 하한(3μM)을 기능적 LDH 핵산(즉, 음성 대조군 균주)을 운반하는 것으로 알려져 있지 않은 균주로부터의 분석 배경보다 3배 더 높은 농도의 락테이트로 설정하였다(즉, 음성 대조군 균주). 몇몇 경우에, LDH 활성(즉, 락테이트 생산)은 특정 프로모터, 또는 보스 타우루스(서열번호 5), 락토바실러스 헬베티쿠스(서열번호 3) 또는 플라스모듐 오발레(서열번호 45)로부터의 LDH를 암호화하는 핵산을 이용하여 상기 표에 열거한 핵산에 대해 이 역치 초과로 검출되지 않았다. 구성적 프로모터의 제어 하에 외인성 LDH 핵산을 숙주 균주(즉, 바실러스 안트라시스 LDH를 암호화하는 핵산(n:29), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringensis) LDH(서열번호 39) 및 데이노코커스 라디오두란스 LDH(서열번호 43)) 내로 컨쥬게이션시킨 3가지 경우에, 콜로니는 관찰되지 않았지만, 그러나, 동일한 외인성 LDH 핵산을 유도성 프로모터의 제어 하에 두었을 때 콜로니는 형성되지 않았는데, 이는 세포 상에서 락테이트의 잠재적인 독성 효과를 나타낸다. 임의의 이론으로 구속되는 것을 바라지는 않지만, 고독성의 락테이트에 기인하여, LDH 활성은 LDH 핵산을 돌연변이시키거나 또는 달리 불활성화시키기 위해 발현 세포 상에서 높은 선택적 압력을 유도하는 것으로 믿어진다. 따라서, 역치 초과의 활성 결여는 LDH 핵산의 돌연변이 또는 플라스미드의 손실을 포함하는 다수의 인자에 의해 야기될 수 있으며(검출 역치 미만으로 동정되는 몇몇 클론에서 관찰됨), 해당 경우에 LDH 기능의 존재 또는 부재에 대한 결정적 증거를 제공하지 않는다.
II. 락테이트 생산을 위해 공학처리된 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b 및 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G.
숙주 세포(메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b 및 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G)를 외인성 락트산 탈수소효소(ldh) 핵산을 갖도록 공학처리하여 C1 기질(메탄)로부터 L-락테이트를 생산하게 하였다. 상기 I 부분으로부터의 외인성 LDH 암호화 핵산 분자를 알리(Ali)와 뮤렐(Murrell)(Microbiology 155:761, 2009)에 의해 보고된 방법에 기반하여 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b 또는 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G 내로 컨쥬게이션을 위해 프로모터 시스템 하류의 발현 벡터 pMS10(상이한 공급원으로부터의 카나마이신 내성 유전자를 지니는 플라스미드와 동등한 PMS3) 내로 개개로 클로닝시켰다. 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b의 형질전환에 대해, 프로모터는 Ob3b 프로모터 sga(세린-글라이콕실레이트 트랜스아미나제)(서열번호 50)였다. 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G의 형질전환에 대해, 프로모터는 메틸로모나스 16a moxF(메탄올 탈수소효소) 프로모터(서열번호 51) 또는 메틸로모나스 16a hps(헥술로스-6-인산염 합성효소) 프로모터(서열번호 52) 중 하나였다.
간략하게, 관심 대상의 하나 이상의 핵산(예를 들어, ldh)을 함유하고 카나마이신 내성을 암호화하는 동원가능한(mobilizable) 플라스미드를 표준 전기천공법을 이용하여 이콜라이 S17-1에 우선 형질전환시켰다. 30㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB-한천 상에서 카나마이신-내성 콜로니의 선택에 의해 형질전환을 확인하였다. 형질전환된 콜로니를 30㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 내로 접종하고 나서, OD600이 1.0에 도달될 때까지 37℃에서 진탕시켰다. 이어서, 배양물의 1.0㎖ 분취액을 멸균 에펜도르프관(1.6㎖ 크기)에서 수집하였다. 이콜라이 공여체 세포를 2x1.0㎖ 멸균 MM-W1(OB3b) 또는 NMS(5G) 배지로 세척하여 잔여 배지 및 항생제를 제거하였다.
동시에, 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b(NCIMB 11131) 또는 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G(워싱턴 유니버시티의 메리 리드스트롬 박사(Dr. Mary Lidstrom)로부터 얻음) 수용체 균주를 20 내지 50㎖ MM-W1(OB3b) 또는 NMS(5G) 배지를 함유하는 100㎖ 혈청 보틀 내로 접종시켰다. 이어서, 보틀의 헤드스페이스를 산소와 메탄의 1:1 혼합물로 플러슁하고, 보틀을 뷰틸 고무 마개로 밀봉하고 나서, 권축시켰다. OD600이 대략 0.5에 도달될 때까지 보틀을 30℃ 인큐베이터 내에서 계속해서 진탕시켰다. 이어서, OB3b 또는 5G 세포를 원심분리에 의해 수집하고 나서, 50㎖의 멸균 MM-W1 또는 NMS 배지로 세척하였다. 세척한 세포를 멸균 MM-W1 또는 NMS 배지에서 OD600 1.0로 재현탁시키고 나서, 분취액을 수용체:공여체 2:1에서 공여체 이콜라이와 혼합하였다. 세포 혼합물을 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 세포 펠렛을 0.5% 효모 추출물을 함유하는 MM-W1 또는 NMS 한천 플레이트 상에서 스팟팅하고 나서, 메탄과 공기의 1:1 혼합물의 존재 하에 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 48시간 후에, 세포를 1.0㎖ 멸균 배지에서 재현탁시키고 나서, 분취액(100㎕)을 4 내지 7.5㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 MM-W1 또는 NMS 한천 플레이트 상에 펼쳤다.
플레이트를 메탄과 공기의 1:1 혼합물을 함유하는 밀봉 챔버에서 인큐베이션시키고 나서, 30℃에서 유지하였다. 전형적으로 7 내지 14일 후에 콜로니가 형성될 때까지 가스 혼합물을 2일마다 보충하였다. 콜로니를 카나마이신을 함유하는 MM-W1 또는 NMS 플레이트 상에 도말시켜 카나마이신 내성을 확인할 뿐만 아니라 잔여 이콜라이 공여체 세포로부터 형질전환된 메탄영양체 세포를 추가로 단리시켰다.
ldh 발현 또는 LDH 기능의 존재를 (1) PCR 및 서열화, (2) 웨스턴 블롯 분석, 및 (3) 락테이트의 존재에 대한 분석 중 하나 이상에 의해 확인하였다. 예를 들어, 전달을 확인하기 위해, 플라스미드 DNA를 단리시키고 나서, 표준 조건(5분 동안 95℃; 30초 동안 95℃, 30초 동안 60℃ 및 1분 동안 72℃의 25주기; 10분 동안 72℃) 및 ldh 핵산에 대한 내부 및 외부에 결합되도록 특이적으로 설계된 프라이머 세트를 이용하여 표준 완충제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs))와 함께 원태그 2x 마스터 믹스(OneTaq 2x Master Mix)를 이용하는 PCR을 실시하였다. 클로닝된 ldh 핵산(들)을 함유하는 본래의 플라스미드 DNA를 PCR을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
재조합 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b 또는 뷰리아텐스 5G를 4 내지 7.5㎍/㎖ 카나마이신 배지를 함유하는 MM-W1 또는 NMS를 함유하는 혈청 보틀 내에서 30℃에서 배양시켰다. 헤드스페이스 조성을 메탄:공기 1:1 용적으로 조절하였다. 보틀을 200 내지 250rpm의 속도로 진탕시켰다. 대안적으로, 1:1(v/v) 메탄:공기 가스 혼합물을 함유하는 기밀 챔버 내에서 성장시킨 1.5% w/v 한천으로 고형화시킨 MM-W1 또는 NMS 배지 상에서 배양물을 유지시켰다. 플레이트를 30℃에서 챔버 내에서 뒤집어서 인큐베이션시켰다.
C 1 기질(CH 4 )로부터 락테이트의 생산
벡터 단독으로 또는 ldh 핵산을 함유하는 벡터와 함께 형질전환시킨 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b 또는 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G를 사용하여 5㎍/㎖ 카나마이신을 갖는 볼치(Balch) 관(벨코 글래스(Bellco Glass)) 내 2.0㎖ MM-W1 또는 NMS 배지를 접종하였다. 사용한 배지 MM-W1의 조성은 다음과 같았다: 0.8mM MgSO4 * 7H2O, 10mM NaNO3, 0.14mM CaCl2, 1.2mM NaHCO3, 2.35mM KH2PO4, 3.4mM K2HPO4, 20.7μM Na2MoO4 * 2H2O, 1μM CuSO4 * 5H2O, 10μM FeIII-Na-EDTA 및 1㎖/ℓ의 미량 금속 용액(리터 당 500㎎ FeSO4 * 7H2O, 400㎎ ZnSO4 * 7H2O, 20㎎ MnCl2 * 7H2O, 50㎎ CoCl2 * 6H2O, 10㎎ NiCl2 * 6H2O, 15㎎ H3BO3, 250㎎ EDTA를 함유). 배지를 고압멸균시키고 냉각시킨 후에, 인산염, 중탄산염 및 FeIII-Na-EDTA를 첨가하였다. 사용한 NMS 배지의 조성은 다음과 같다: 1.00g/ℓ MgSO4 * 7H2O, 0.02g/ℓ CaCl2*6H2O, 1.00g/ℓ KNO3, 15g/ℓ NaCl, 20㎖ 인산염 완충제(5.44g/ℓ KH2PO4, 14.34g/ℓ Na2HPO4 *12 H2O), 50㎖ 탄산염 완충제(45㎖의 1M NaHCO3 + 5㎖ 1M Na2CO3), 2㎖ 미량 원소 용액(0.5g/ℓ Na2-EDTA, 1.0g/ℓ FeSO4*7H2O, 0.75g/ℓ Fe-EDTA, 0.8g/ℓ ZnSO4*7H2O, 0.005g/ℓ MnCl2*4H2O, 0.03g/ℓ H3BO3, 0.05g/ℓ CoCl2*6H2O, 0.4g/ℓ Cu-EDTA, 0.6g/ℓ CuCl2*2H2O, 0.002g/ℓ NiCl2*6H2O, 0.05g/ℓ Na2MoO2*2H2O)(Ojala, D. S., et al., Methods in Enzymology , Vol. 495, pp. 99-118). 용액을 실온으로 냉각시킨 후에 멸균 인산염 및 탄산염 완충제를 첨가하였다. 플레이트 헤드스페이스를 균주에 대한 탄소 공급원으로서 산소와 메탄의 1:1 혼합물로 플러슁하고 나서, 관을 뷰틸 고무 마개로 밀봉시키고 나서, 권축시키고, 이어서, 30℃에서 72시간 동안의 인큐베이션 동안 200 내지 250rpm의 속도에서 계속해서 진탕시켰다. 세포를 원심분리에 의해 채취하고 나서, 형광을 측정하기 전 2시간 동안 키트 시약과 함께 상청액을 인큐베이션시킨 것을 제외하고 상청액을 제조업자의 설명서에 따라 엔지플루오(상표명) L-락테이트 분석 키트(캘리포니아주 94545 헤이워드에 소재한 바이오어세이 시스템즈), 카탈로그 번호 EFLLC-100)를 이용하여 분석하였다. 결과를 각각의 대응하는 배양물에 대한 OD600 값에 대해 정규화시켰다. 메탄은 세포에 제공된 유일한 탄소 공급원이기 때문에, 생산된 모든 락테이트는 메탄으로부터 유래되어야 한다.
결과
외인성 L-락트산 탈수소효소 핵산을 도입하고 발현시킴으로써 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b 및 메틸로마이크로븀 뷰리아텐스 5G를 변용시켜 L-락테이트를 생산하였다. 다양한 외인성 락테이트 탈수소효소 핵산을 메탄영양체 내에서 작용하는 발현 벡터 내 구성적 프로모터에 조작 가능하게 연결시켰다.
락테이트가 생산된 모든 경우에, 배양물의 OD600은 0.31 내지 0.71의 범위에 있고, 모든 재조합체 균주는 낮지만, 검출가능한 수준(기능성 LDH 핵산을 운반하는 것으로 알려지지 않은 균주보다 3배 초과로 더 높은 농도의 락테이트 1 내지 20μM)의 락테이트를 생산하였다.
실시예 2
C1 대사 미생물유기체로부터 유래된 생성물 내 안정한 탄소 동위원소 분포
메틸로코커스 캡슐라투스 배스의 공학처리된 균주에 의해 생산된 메탄-유래 락트산을 아이소프라임100(IsoPrime100) IRMS(영국 치들에 소재한 아이소프라임(Isoprime))과 결합된 CHNOS 원소 분석기(배리오 아이소토프 큐브(vario ISOTOPE cube), 독일 하나우에 소재한 엘레멘터(Elementar))를 이용하는 원소 분석기/연속적 유동 동위원소 비 질량분석법을 통해 탄소 함량(건조 중량%) 및 탄소(13C) 안정 동위원소비에 대해 분석하였다. 발효기 또는 혈청 보틀 내에서 배양시킨 메탄영양체 바이오매스의 샘플을 원심분리시키고 나서, 탈이온수 중에서 재현탁시키고, 0.2 내지 2㎎ 탄소(약 0.5 내지 5㎎ 건조 세포 중량)에 대응하는 용적을 5 x 9㎜ 주석 캡슐(캘리포니아주 발렌시아에 소재한 코스테크 어날리티컬 테크놀로지즈 인코포레이티드(Costech Analytical Technologies, Inc.))에 옮기고 나서, 80℃에서 적어도 24시간 동안 건조시켰다. 상이한 LDH를 암호화하는 LDH-암호화 핵산 서열을 발현시키는 공학처리된 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 배양물로부터 회수된 락트산의 샘플(대략 0.3 내지 1㎎)을 탈이온수 중에서 재현탁시키고 나서, 5 x 9㎜ 주석 캡슐에 옮기고, 80℃에서 적어도 24시간 동안 건조시켰다. 적어도 0.1㎎ 탄소를 함유하는 표준은 신뢰가능한 δ13C 값을 제공하였다.
동위원소비는 "델타" 표기법(‰)으로 표현하되, 백만 편차 기준에 대해 표준의 동위원소 조성에 대한 물질의 동위원소 조성은 δ13C(또는 δ15N) = (R샘플 / R표준 -1) x 1,000로 주어지며, 여기서 R은 무거운 동위원소 형태 대 가벼운 동위원소 형태의 분자비이다. 탄소에 대한 표준은 비엔나 피 디 벨렘나이트(Vienna Pee Dee Belemnite)(V-PDB)이고 질소에 대한 표준은 공기이다. NIST(미국 표준 기술 연구소(National Institute of Standards and Technology))는 SRM(표준 기준 물질) 1547호, 즉, 복숭아 잎을 제안하였고, 교정 표준으로서 사용하였다. 모든 동위원소 분석을 버클리에 소재한 캘리포니아 유니버시티의 안정한 동위원소 생물지구화학 센터(Center for Stable Isotope Biogeochemistry)에서 수행하였다. C 및 N 동위원소 분석에 대한 장기간 외부 정밀성은 각각 0.10‰ 및 0.15‰이다.
4개의 상이한 LDH 핵산의 구성적 발현에 대해 구성한 별개의 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주(표 2 참조)를 15㎍/㎖ 카나마이신을 이용하여 수정한 130㎖의 한정 배지 MMS1.0을 함유하는 0.5ℓ 혈청 보틀 내 메탄 상에서 성장시켰다. 균주를 메탄과 공기의 1:1(v/v) 혼합물을 공급한 동일 배지 내에서 성장시킨 혈청 보틀 회분식 배양물(7% v/v)로부터 접종하였다. 배지 MMS1.0의 조성은 다음과 같았다: 0.8mM MgSO4 * 7H2O, 30mM NaNO3, 0.14mM CaCl2, 1.2mM NaHCO3, 2.35mM KH2PO4, 3.4mM K2HPO4, 20.7μM Na2MoO4 * 2H2O, 6μM CuSO4 * 5H2O, 10mM FeIII-Na-EDTA 및 1㎖/ℓ의 미량 금속 용액(ℓ 당: 500㎎ FeSO4 * 7H2O, 400㎎ ZnSO4 * 7H2O, 20㎎ MnCl2 * 7H2O, 50㎎ CoCl2 * 6H2O, 10㎎ NiCl2 * 6H2O, 15㎎ H3BO3, 250㎎ EDTA를 함유). 배지를 고압멸균시키고 냉각시킨 후에, 인산염, 중탄산염 및 FeIII-Na-EDTA를 첨가하였다. 배지의 최종 pH는 7.0±0.1였다. 혈청 보틀을 2회 중복해서 접종하고 나서, 고무 슬리브 마개로 밀봉하고, 0.45㎛ 필터 및 멸균 27G 니들을 통해 주사기를 통해 첨가한 60㎖ 메탄 가스(99% 순도; 2.0 등급, 캘리포니아주 산 카를로스에 소재한 얼라이언스 가스(Alliance Gas)에 의해 공급된 프렉스(Praxair))로 주입하였다. 배양물을 250rpm에서 회전 진탕하면서 42℃에서 인큐베이션시키고, 1㎖ 샘플을 회수함으로써 대략 12 내지 24시간 간격으로 성장을 측정하여 OD600을 결정하였다. 부-샘플(sub-sample)(0.5㎖)을 원심분리에 의해 정화시키고 나서, 무세포 상청액을 상기 기재한 바와 같이 L-락테이트에 대해 분석하였다. 샘플링 후에, 보틀을 통기시키고, 헤드스페이스를 60㎖의 메탄 및 60 내지 120㎖의 농축 산소(적어도 85% 순도)로 대체하였다. 약 72시간에, 최종 샘플을 제거하고 나서, 남아있는 배양물 용적을 원심분리에 의해 정화시키고(8,000rpm, 10분), 그들의 pH를 결정하고(pH 6.7 내지 6.9), 생성물 회수 및 분석을 위한 작업까지 상청액을 -20℃에서 저장하였다.
균주 샘플 설명
균주 ID 서열번호
(벡터)		 LDH 공급원
1 27
(pMS3x3)		 악티노마이세스 비스코서스
3 33
(pMS3x3)		 리스테리아 마르티
4 21
(pMS3x3)		 락토바실러스 아시도필루스
5 29
(pMS3x2)		 바실러스 안트라시스
락트산을 액체-액체 추출에 의해 각각의 이들 배양물로부터 회수하고 나서, 후속적으로 산성화된 상청액으로부터의 물질을 L-락트산 함량, 상대적 락트산 조성에 대해 그리고 안정한 탄소 동위원소 분포에 대해 분석하였다(δ13C 값; 표 3 참조). 상이한 LDH를 암호화하는 LDH-암호화 핵산 서열을 발현시키는 공학처리된 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주의 메탄-성장 배양물로부터의 상청액을 원심분리에 의해 정제하고 나서, 진한 HCl을 이용하여 pH 2로 조절하고, 동일한 용적의 에틸 아세테이트(피셔, HPLC-등급)를 이용하여 2회 추출하였다. 각각의 샘플로부터의 에틸 아세테이트 분획을 합하고 나서, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이어서, 40℃에서 회전 증발에 의해 감압 하에 농축건조시켰다. 잔사를 에틸아세테이트 중에 용해시키고 나서, 부샘플을 GC-MS에 의해 L-락트산 함량(엔지플루오(상표명) L-락테이트 분석 키트, 카탈로그 번호 EFLLC-100; 캘리포니아주 94545에 소재한 바이오어세이 시스템즈) 및 락트산 조성에 대해 분석하였다.
기체 크로마토그래피-질량 스펙트럼을 제브론(Zebron) ZB-5HT(p/n 7HG-G015-11; 캘리포니아주 토런스에 소재한 페노메넥스(Phenomenex)) 및 질량 선택적 검출기를 구비한 애질런트(Agilent) 6890 GC 상에서 수행하였다. 초기 칼럼 온도는 50℃였고, 분 당 20℃ 내지 320℃의 속도로 증가되며, 5분 동안 유지되었다. 주입구 및 전달선(transfer line)의 온도는 250℃였고, 헬륨을 운반기체로서 사용하였다. 액체-액체 추출에 의해 회수한 L-락테이트를 함유하는 샘플을 다음과 같은 분석(1.0㎕ 주입) 전에 BSTFA를 이용하여 유도체화하였다: 붕규산 중의 락테이트-함유 추출물(0.3 내지 1㎎ L-락테이트를 함유)을 건조시키기 위해, GC-바이알에 400㎕ N,O-비스(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아마이드(BSTFA), 400㎕ 아세토나이트릴 및 100㎕ 톨루엔을 첨가하였다. 기준으로서 유사한 방법으로 블랭크 샘플을 준비하였다. 유도체화 용매를 지니는 샘플 바이알을 50℃에서 열차단을 이용하여 1시간 동안 가열하였다. 최종 유도체화한 샘플을 상기 약술한 조건을 이용하여 GC-MS에 의해 분석하였다. 크로마토그램을 통합하고 나서, 개개 피크를 시간 및 면적 계수에 대해 로그표현하였다. 샘플 크로마토그램을 블랭크 크로마토그램과 겹쳐서 블랭크와 샘플 둘 다에 대해 공통된 피크를 결정하였고, 따라서, 그들을 이후의 상대적 정량화 평가로부터 제거할 수 있었다. 크로마토그램에서 각각의 남아있는 피크의 질량 스펙트럼을 잠정적 동정을 위한 질량 스펙트럼 데이터베이스에 대해 검토하였다. 이어서, 분석물 및 피크 면적의 최종 면적을 사용하여 락트산에 대한 상대적 농도를 모든 분석물에 비교하여 결정하였다. 이 단계를 위해, 모든 분석물은 동등한 총 존재비 계수(본질적으로 동등한 반응 인자)를 갖는 것으로 추정하였다. 결과는 락트산의 상대적 함량이 개개 샘플에 따라서 55 내지 80%였다는 것을 나타내었다(표 3 참조).
메틸로코커스 캡슐라투스 내 상이한 락트산 탈수소효소에 의해 생산된 L-락트산에 대한 안정한 탄소 동위원소 분포
균주 ID 번호 LDH(또는 락테이트) 공급원 LA 순도
(%)		 분석한 탄소 질량(㎎)
Figure 112015124715965-pct00004
 δ13C L-락트산
1 악티노마이세스 비스코서스 70.1 0.24 -46.82
3 리스테리아 마르티 73.6 0.25 -42.74
3 리스테리아 마르티 80.6 0.35 -54.55
4 락토바실러스 아시도필루스 55.8 0.27 -50.61
4 락토바실러스 아시도필루스 55.4 0.27 -50.62
5 바실러스 안트라시스 71.3 0.29 -45.44
5 바실러스 안트라시스 73.7 0.38 -48.93
대조군:
L-락트산나트륨 알드리치(Aldrich) 71718 >98 0.98 -10.60
락트산나트륨 알드리치 71718 >98 0.87 -10.59
L-락트산칼슘 5수화물 알드리치 C8356 >98 0.96 -12.16
L-락트산칼슘 5수화물 알드리치 C8356 >98 0.90 -12.09
* 락트산의 순도를 본문에 기재된 바와 같이 GC-MS에 의해 결정하였다.
† 분석한 탄소 질량을 CHNOS 원소 분석기의 결과로부터 보고한다.
본 발명의 구체적 실시형태를 예시하고 기재하였지만, 상기 기재한 다양한 실시형태는 추가 실시형태를 제공하기 위해 조합할 수 있고, 그 안에서 다양한 변화가 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
미국 특허 출원 제61/836,609호 및 미국 특허 출원 제61/928,390호를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 언급하는 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다. 또한 추가 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하는 것이 필요하다면, 실시형태의 양태는 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변화는 상기 상술한 설명에 비추어 실시형태로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용하는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태에 대한 청구를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 청구범위가 자격을 부여하는 동등물의 완전한 범위와 마찬가지로 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Calysta, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF LACTATE FROM C1 COMPOUNDS USING LACTATE DEHYDROGENASE TRANSFORMANTS <130> WO/2014/205146 <140> PCT/US2014/043053 <141> 2014-06-18 <150> US 61/836,609 <151> 2013-06-18 <150> US 61/928,390 <151> 2014-01-16 <160> 67 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct (Streptococcus bovis LDH) <220> <221> CDS <222> (1)..(987) <400> 1 atg acc gcg acc aag cag cac aaa aaa gtt atc ctg gtt gga gat ggg 48 Met Thr Ala Thr Lys Gln His Lys Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 gcc gtg ggc tcg tcg tat gcg ttc gcc ctc gtc aac cag ggc ata gcc 96 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Val Asn Gln Gly Ile Ala 20 25 30 cag gaa ctg ggc atc atc gag atc ccg cag ttg ttc gac aaa gcc gtc 144 Gln Glu Leu Gly Ile Ile Glu Ile Pro Gln Leu Phe Asp Lys Ala Val 35 40 45 ggt gac gcc gag gac ctc agc cac gct ctt gcc ttc acc agc cct aaa 192 Gly Asp Ala Glu Asp Leu Ser His Ala Leu Ala Phe Thr Ser Pro Lys 50 55 60 aag atc tac gcg gca aag tac gag gat tgc gcc gac gcg gac ctg gta 240 Lys Ile Tyr Ala Ala Lys Tyr Glu Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Val 65 70 75 80 gtg atc acc gcc gga gcg ccc cag aag ccc ggt gaa acg cgc ctg gac 288 Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp 85 90 95 ctg gtc ggg aag aac ttg gct atc aat aag tca att gtc acc gaa gtg 336 Leu Val Gly Lys Asn Leu Ala Ile Asn Lys Ser Ile Val Thr Glu Val 100 105 110 gtc aag tcg ggg ttc aac ggc att ttc ctc gtg gcc gcg aat cca gtg 384 Val Lys Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val 115 120 125 gac gtg ctg aca tac agc acc tgg aag ttc tcc ggc ttc ccg aag gaa 432 Asp Val Leu Thr Tyr Ser Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Glu 130 135 140 cgg gtc atc ggt agc ggc acg agc ctg gac tcg gcc agg ttt cgg caa 480 Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Gln 145 150 155 160 gcc ctg gcg gag aag ctg gat gtc gat gcc cgc tcc gtc cac gca tac 528 Ala Leu Ala Glu Lys Leu Asp Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr 165 170 175 atc atg ggc gag cat ggc gac tcg gag ttc gcc gtg tgg agc cat gcg 576 Ile Met Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Val Trp Ser His Ala 180 185 190 aat gtc gct ggg gtg aat ctg gag aac tat ctg aaa gac gtc cag aac 624 Asn Val Ala Gly Val Asn Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Asp Val Gln Asn 195 200 205 gtg aac gaa gcg gaa ctc gtg gag ctg ttc gag ggc gtc cgt gat gcg 672 Val Asn Glu Ala Glu Leu Val Glu Leu Phe Glu Gly Val Arg Asp Ala 210 215 220 gcg tat tcc atc atc aac aaa aag ggc gcc act ttc tac ggc atc gcc 720 Ala Tyr Ser Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala 225 230 235 240 gtg gcg ctc gcc cgg atc acg aag gcc att ttg aac gat gaa aac gcc 768 Val Ala Leu Ala Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala 245 250 255 gtc ctg ccg ctg tcc gtg ttc cag gaa ggg cag tat ccg ggt gtg acc 816 Val Leu Pro Leu Ser Val Phe Gln Glu Gly Gln Tyr Pro Gly Val Thr 260 265 270 gac tgc tac atc ggc cag ccc gcc atc gtc gga gcc cat ggc atc gta 864 Asp Cys Tyr Ile Gly Gln Pro Ala Ile Val Gly Ala His Gly Ile Val 275 280 285 cgc ccc gtc aac atc ccg ctc aac gac gcg gag cag caa aag atg gaa 912 Arg Pro Val Asn Ile Pro Leu Asn Asp Ala Glu Gln Gln Lys Met Glu 290 295 300 gca tct gca aaa gaa ctg aag gcc atc atc gac gaa gcc ttc tcc aaa 960 Ala Ser Ala Lys Glu Leu Lys Ala Ile Ile Asp Glu Ala Phe Ser Lys 305 310 315 320 gaa gag ttt gcc agt gcg gcg aag taa 987 Glu Glu Phe Ala Ser Ala Ala Lys 325 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Thr Ala Thr Lys Gln His Lys Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Val Asn Gln Gly Ile Ala 20 25 30 Gln Glu Leu Gly Ile Ile Glu Ile Pro Gln Leu Phe Asp Lys Ala Val 35 40 45 Gly Asp Ala Glu Asp Leu Ser His Ala Leu Ala Phe Thr Ser Pro Lys 50 55 60 Lys Ile Tyr Ala Ala Lys Tyr Glu Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Val 65 70 75 80 Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp 85 90 95 Leu Val Gly Lys Asn Leu Ala Ile Asn Lys Ser Ile Val Thr Glu Val 100 105 110 Val Lys Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val 115 120 125 Asp Val Leu Thr Tyr Ser Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Glu 130 135 140 Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Gln 145 150 155 160 Ala Leu Ala Glu Lys Leu Asp Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr 165 170 175 Ile Met Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Val Trp Ser His Ala 180 185 190 Asn Val Ala Gly Val Asn Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Asp Val Gln Asn 195 200 205 Val Asn Glu Ala Glu Leu Val Glu Leu Phe Glu Gly Val Arg Asp Ala 210 215 220 Ala Tyr Ser Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala 225 230 235 240 Val Ala Leu Ala Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala 245 250 255 Val Leu Pro Leu Ser Val Phe Gln Glu Gly Gln Tyr Pro Gly Val Thr 260 265 270 Asp Cys Tyr Ile Gly Gln Pro Ala Ile Val Gly Ala His Gly Ile Val 275 280 285 Arg Pro Val Asn Ile Pro Leu Asn Asp Ala Glu Gln Gln Lys Met Glu 290 295 300 Ala Ser Ala Lys Glu Leu Lys Ala Ile Ile Asp Glu Ala Phe Ser Lys 305 310 315 320 Glu Glu Phe Ala Ser Ala Ala Lys 325 <210> 3 <211> 924 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct (Lactobacillus helveticus LDH) <220> <221> CDS <222> (1)..(924) <400> 3 atg tct agg aaa gtg ttt ctt gtg ggt gat ggt gcg gtg ggg tca acg 48 Met Ser Arg Lys Val Phe Leu Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Ser Thr 1 5 10 15 ttt gcg aac gat ttg ttg cag aat gcg aaa gtg gac gag ctc gcc atc 96 Phe Ala Asn Asp Leu Leu Gln Asn Ala Lys Val Asp Glu Leu Ala Ile 20 25 30 ttc gag gtc gcc aag gat cgg ccg gta ggc gac gcg atg gac ctg gaa 144 Phe Glu Val Ala Lys Asp Arg Pro Val Gly Asp Ala Met Asp Leu Glu 35 40 45 gat atc acc ccc ttc atg ggc cag acg gat atc cac ccg gca gac tac 192 Asp Ile Thr Pro Phe Met Gly Gln Thr Asp Ile His Pro Ala Asp Tyr 50 55 60 tcg gac gcg aaa gac gcc gac gtg tgc gtc atc gct gcg ggt gtg ccc 240 Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Val Cys Val Ile Ala Ala Gly Val Pro 65 70 75 80 cgc aag ccc ggt gaa aca cgg ctc gac ctg gtc gcg aaa aac gtc aag 288 Arg Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val Ala Lys Asn Val Lys 85 90 95 ata ctg aag tcc atc gtg cag ccg gtc gtg gaa tcc ggc ttc aaa ggc 336 Ile Leu Lys Ser Ile Val Gln Pro Val Val Glu Ser Gly Phe Lys Gly 100 105 110 gtg ttc gtt gtg tcg gcg aac ccg gtc gac att ctg acc acc ctc acg 384 Val Phe Val Val Ser Ala Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Thr Leu Thr 115 120 125 cag aag ttg agt ggc ttc ccg aag aac cgc gtg atc gga acc ggc acc 432 Gln Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly Thr Gly Thr 130 135 140 agc ctg gat tcg atg cgt ctg cgc gtg gag ctc gcc aag aaa ctg aac 480 Ser Leu Asp Ser Met Arg Leu Arg Val Glu Leu Ala Lys Lys Leu Asn 145 150 155 160 gtt ccc gtc gct aag gtc aat agc atg gtc ctc gga gaa cac ggc gac 528 Val Pro Val Ala Lys Val Asn Ser Met Val Leu Gly Glu His Gly Asp 165 170 175 acg tcg ttc gag aat ttc gac gag agc acc gtg gac ggc aag ccg ctg 576 Thr Ser Phe Glu Asn Phe Asp Glu Ser Thr Val Asp Gly Lys Pro Leu 180 185 190 cgc gac tac gcc gag atc aac gac gat gtc ctg agc gag atc gaa acc 624 Arg Asp Tyr Ala Glu Ile Asn Asp Asp Val Leu Ser Glu Ile Glu Thr 195 200 205 gac gtc cga aag aaa ggc gag aag atc atc gcc aaa aag ggc gcc acg 672 Asp Val Arg Lys Lys Gly Glu Lys Ile Ile Ala Lys Lys Gly Ala Thr 210 215 220 ttc tat ggg gtc gcc atg atg ctg acc cag atc gta tcc gcc att ctg 720 Phe Tyr Gly Val Ala Met Met Leu Thr Gln Ile Val Ser Ala Ile Leu 225 230 235 240 gac aat cgg tcc atc tgc ctg ccg ctg agc gcc cct atc aac ggc gaa 768 Asp Asn Arg Ser Ile Cys Leu Pro Leu Ser Ala Pro Ile Asn Gly Glu 245 250 255 tat ggc atc aag cat gac ctc tac ctg ggc acc cca gcc gtg atc aac 816 Tyr Gly Ile Lys His Asp Leu Tyr Leu Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn 260 265 270 ggg gaa ggg atc gaa cag gtc atc gag act aag ctg tcg gat gcc gaa 864 Gly Glu Gly Ile Glu Gln Val Ile Glu Thr Lys Leu Ser Asp Ala Glu 275 280 285 aag gcc aag atg att aac tcc gca gat aag atg caa gaa gtc ctg ggc 912 Lys Ala Lys Met Ile Asn Ser Ala Asp Lys Met Gln Glu Val Leu Gly 290 295 300 gga atc gag taa 924 Gly Ile Glu 305 <210> 4 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Ser Arg Lys Val Phe Leu Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ala Asn Asp Leu Leu Gln Asn Ala Lys Val Asp Glu Leu Ala Ile 20 25 30 Phe Glu Val Ala Lys Asp Arg Pro Val Gly Asp Ala Met Asp Leu Glu 35 40 45 Asp Ile Thr Pro Phe Met Gly Gln Thr Asp Ile His Pro Ala Asp Tyr 50 55 60 Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Val Cys Val Ile Ala Ala Gly Val Pro 65 70 75 80 Arg Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val Ala Lys Asn Val Lys 85 90 95 Ile Leu Lys Ser Ile Val Gln Pro Val Val Glu Ser Gly Phe Lys Gly 100 105 110 Val Phe Val Val Ser Ala Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Thr Leu Thr 115 120 125 Gln Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly Thr Gly Thr 130 135 140 Ser Leu Asp Ser Met Arg Leu Arg Val Glu Leu Ala Lys Lys Leu Asn 145 150 155 160 Val Pro Val Ala Lys Val Asn Ser Met Val Leu Gly Glu His Gly Asp 165 170 175 Thr Ser Phe Glu Asn Phe Asp Glu Ser Thr Val Asp Gly Lys Pro Leu 180 185 190 Arg Asp Tyr Ala Glu Ile Asn Asp Asp Val Leu Ser Glu Ile Glu Thr 195 200 205 Asp Val Arg Lys Lys Gly Glu Lys Ile Ile Ala Lys Lys Gly Ala Thr 210 215 220 Phe Tyr Gly Val Ala Met Met Leu Thr Gln Ile Val Ser Ala Ile Leu 225 230 235 240 Asp Asn Arg Ser Ile Cys Leu Pro Leu Ser Ala Pro Ile Asn Gly Glu 245 250 255 Tyr Gly Ile Lys His Asp Leu Tyr Leu Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn 260 265 270 Gly Glu Gly Ile Glu Gln Val Ile Glu Thr Lys Leu Ser Asp Ala Glu 275 280 285 Lys Ala Lys Met Ile Asn Ser Ala Asp Lys Met Gln Glu Val Leu Gly 290 295 300 Gly Ile Glu 305 <210> 5 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct (Bos taurus LDH variant) <220> <221> CDS <222> (1)..(1002) <400> 5 atg gcg act ctc aaa gat cag ctc ata cag aac ttg ctt aaa gaa gaa 48 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 cat gtg ccc cag aac aag atc acc atc gtg ggt gtg ggc gcc gtt ggg 96 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 atg gcc tgc gcg atc agc atc ctg atg aaa gat ctc gcc gac gaa gtc 144 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 gca ctg gtt gac gtg atg gaa gat aag ctc aag ggt aat gaa atg atg 192 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Asn Glu Met Met 50 55 60 gac ctc cag cat ggg tca ctg ttc ctg cga acc cca aag att gtc tcc 240 Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser 65 70 75 80 gga aag gac tac aac gtc acc gcc aac agc cgg ctg gtg atc atc acg 288 Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr 85 90 95 gct ggg gca cgc caa cag gaa ggc gag tcg agg ctg aac ctc gtc cag 336 Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln 100 105 110 cgc aat gtc aac atc ttt aag ttc atc atc ccg aac atc gtg aag tac 384 Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr 115 120 125 tcc ccg aac tgc aag ctg ttg gtt gtg tcg aat ccc gtg gat atc ctg 432 Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu 130 135 140 acg tac gtc gcc tgg aag att tcg ggc ttc ccc aag aac cgg gta atc 480 Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile 145 150 155 160 ggc agc ggc tgt aac ctg gat agc gcg cgt ttc cgc tac ctg atg ggc 528 Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly 165 170 175 gag cgc ttg gga gtc cac ccg ctg agc tgc cac ggg tgg atc ctc ggt 576 Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly 180 185 190 gag cat ggc gac tcc tcg gtg cct gtc tgg tct ggc gtc aat gta gcc 624 Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala 195 200 205 ggc gtc agt ctg aag aat ctg cac ccc gag ctg ggc acc gac gcc gac 672 Gly Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp 210 215 220 aaa gag cag tgg aaa gcc gtc cac aag caa gtg gtg gac tcg gcg tat 720 Lys Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr 225 230 235 240 gaa gtc atc aag ctg aag ggc tat acc agt tgg gcg atc ggc ctg agc 768 Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser 245 250 255 gtg gcc gac ctg gcg gag tcc att atg aag aac ctt cgg cgc gtc cac 816 Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His 260 265 270 ccg atc tcg acc atg atc aaa ggc ctc tac ggg atc aaa gaa gat gtg 864 Pro Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val 275 280 285 ttc ctc tcc gtc ccg tgc atc ttg ggc cag aac gga atc tcc gac gtc 912 Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val 290 295 300 gtg aag gtc aca ctg acg cat gaa gaa gaa gcg tgc ctg aag aag tcg 960 Val Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser 305 310 315 320 gcc gac acc ctg tgg ggc atc cag aaa gaa cta cag ttc taa 1002 Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 6 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Asn Glu Met Met 50 55 60 Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser 65 70 75 80 Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr 85 90 95 Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln 100 105 110 Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr 115 120 125 Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu 130 135 140 Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile 145 150 155 160 Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly 165 170 175 Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly 180 185 190 Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala 195 200 205 Gly Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp 210 215 220 Lys Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr 225 230 235 240 Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser 245 250 255 Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His 260 265 270 Pro Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val 275 280 285 Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val 290 295 300 Val Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser 305 310 315 320 Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 7 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct (Pediococcus acidilactici LDH) <220> <221> CDS <222> (1)..(258) <400> 7 atg tct aat att caa aat cat caa aaa gtt gtc ctc gtc ggt gac ggt 48 Met Ser Asn Ile Gln Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 gcc gta ggt tct agt tac gca ttc gcg atg gca caa caa gga atc gct 96 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 gaa gaa ttc gtc att gtc gac gtt gtt aag gat cgt aca gtt ggg gac 144 Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Val Gly Asp 35 40 45 gca ttg gac ctt gaa gat gct act cca ttc aca gct cca aag aac atc 192 Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Thr Pro Phe Thr Ala Pro Lys Asn Ile 50 55 60 tac tct ggt gaa tac tca gac tgc aag gat gct gac tta gtt gtt atc 240 Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 aca gct ggc gca cca caa aa 260 Thr Ala Gly Ala Pro Gln 85 <210> 8 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Met Ser Asn Ile Gln Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Val Gly Asp 35 40 45 Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Thr Pro Phe Thr Ala Pro Lys Asn Ile 50 55 60 Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ala Pro Gln 85 <210> 9 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct (Rhizopus oryzae LDH) <220> <221> CDS <222> (1)..(963) <400> 9 atg gta tta cac agc aaa gtc gca ata gtc gga gcg gga gca gtt ggc 48 Met Val Leu His Ser Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Ala Val Gly 1 5 10 15 gca tct aca gca tac gcg ttg atg ttc aag aac atc tgc acg gaa att 96 Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Leu Met Phe Lys Asn Ile Cys Thr Glu Ile 20 25 30 atc gtg gtc gac gtg aac ccc gat atc gtg cag gcc cag gtg ctg gac 144 Ile Val Val Asp Val Asn Pro Asp Ile Val Gln Ala Gln Val Leu Asp 35 40 45 ctg gcc gat gcc gct agc atc tcc cac act cct atc agg gcg gga tcg 192 Leu Ala Asp Ala Ala Ser Ile Ser His Thr Pro Ile Arg Ala Gly Ser 50 55 60 gtc gaa gaa gcc ggg cag gcc gat atc gtt gtg ata acc gcg ggt gcc 240 Val Glu Glu Ala Gly Gln Ala Asp Ile Val Val Ile Thr Ala Gly Ala 65 70 75 80 aag cag cgc gag ggc gag ccg cgc acc aag ctg atc gaa cgg aat tac 288 Lys Gln Arg Glu Gly Glu Pro Arg Thr Lys Leu Ile Glu Arg Asn Tyr 85 90 95 cgg gtc ctg cag agc atc atc ggc ggc atg cag ccc atc cgt cca gac 336 Arg Val Leu Gln Ser Ile Ile Gly Gly Met Gln Pro Ile Arg Pro Asp 100 105 110 gcc gtg atc ctc gtg gtc gct aac ccg gtc gac att ctg acc cat atc 384 Ala Val Ile Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr His Ile 115 120 125 gct aag acc ctc tcc ggc ctg ccg ccc aac caa gtg atc ggc tcg ggt 432 Ala Lys Thr Leu Ser Gly Leu Pro Pro Asn Gln Val Ile Gly Ser Gly 130 135 140 acc tac ctg gac acg acg cgc ctg cgc gtg cac ctc ggc gac gtg ttc 480 Thr Tyr Leu Asp Thr Thr Arg Leu Arg Val His Leu Gly Asp Val Phe 145 150 155 160 gac gtc aac ccg cag agc atc cac gcg ttc gtg ctg ggc gag cac ggc 528 Asp Val Asn Pro Gln Ser Ile His Ala Phe Val Leu Gly Glu His Gly 165 170 175 gac tcg caa atg atc gcg tgg gaa gcc gcg tcg atc ggc ggt cag ccc 576 Asp Ser Gln Met Ile Ala Trp Glu Ala Ala Ser Ile Gly Gly Gln Pro 180 185 190 ctc acg agc ttc ccg gag ttc gcg aag ctg gac aag acc gcc atc tca 624 Leu Thr Ser Phe Pro Glu Phe Ala Lys Leu Asp Lys Thr Ala Ile Ser 195 200 205 aag gcc atc tcc ggc aag gcc atg gaa atc att cgg ttg aaa ggc gcc 672 Lys Ala Ile Ser Gly Lys Ala Met Glu Ile Ile Arg Leu Lys Gly Ala 210 215 220 acc ttc tac ggg atc ggg gcg tgt gcc gcc gat ctg gtg cat acc atc 720 Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Cys Ala Ala Asp Leu 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acg gca cgc ttc cgc ttc ctg ttg 480 Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Phe Leu Leu 145 150 155 160 ggc gag tac ttc tcg gtc gcc cct cag aac gtc cat gcc tac atc atc 528 Gly Glu Tyr Phe Ser Val Ala Pro Gln Asn Val His Ala Tyr Ile Ile 165 170 175 ggc gag cac ggc gat acc gaa ctg cca gtg tgg tcg cag gcc tat atc 576 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser Gln Ala Tyr Ile 180 185 190 ggc gtc atg ccc atc cgc aaa ctg gtg gag tcg aag ggc gaa gaa gcc 624 Gly Val Met Pro Ile Arg Lys Leu Val Glu Ser Lys Gly Glu Glu Ala 195 200 205 cag aaa gac ctg gaa cgc atc ttc gtc aat gtg cgc gat gca gcg tac 672 Gln Lys Asp Leu Glu Arg Ile Phe Val Asn Val Arg Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 cag atc att gaa aag aaa ggg gcc acc tat tac ggg atc gcg atg ggc 720 Gln Ile Ile Glu Lys Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala Met Gly 225 230 235 240 ctc gcc cgt gtc act cgg gcg atc ctc cac aac gag aac gcc atc ttg 768 Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Ile Leu His Asn Glu Asn Ala Ile Leu 245 250 255 acc gtc agc gcc 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cgg ctg gac ctg ttg gag aag aac gcg gac atc ttc 288 Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Leu Glu Lys Asn Ala Asp Ile Phe 85 90 95 cgc gag ctc gtc ccc cag atc acc cgt gcg gct ccc gac gcg gtc ttg 336 Arg Glu Leu Val Pro Gln Ile Thr Arg Ala Ala Pro Asp Ala Val Leu 100 105 110 ctc gtg acc agc aac cct gtc gat ctg ttg acc gac ctg gcc act cag 384 Leu Val Thr Ser Asn Pro Val Asp Leu Leu Thr Asp Leu Ala Thr Gln 115 120 125 ctg gca ccc ggc cag ccg gtg ata ggc tcc ggc acg gtc ctc gac tct 432 Leu Ala Pro Gly Gln Pro Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser 130 135 140 gcc cgg ttc cga cat ctg atg gcc caa cac gcc ggg gtc gac gga acc 480 Ala Arg Phe Arg His Leu Met Ala Gln His Ala Gly Val Asp Gly Thr 145 150 155 160 cat gca cac ggt tat gtg ctg ggc gag cac ggc gat tcc gaa gtg ctg 528 His Ala His Gly Tyr Val Leu Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Val Leu 165 170 175 gcc tgg tcg tcc gcc atg gtg gcc ggc atg cca gtg gcg gac ttc atg 576 Ala Trp Ser Ser Ala Met Val Ala Gly Met Pro Val Ala Asp Phe Met 180 185 190 cag gcc 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Methylosinus trichosporium OB3b promoter region for sga <400> 50 ttttttgaga ccacgcggcc cgacgcgcaa ggaagctttc gggcgcgcgc gcgtccggcg 60 aagacaactc gaaccgatga gctcgaaggg agccctagac aggaggtaaa aatg 114 <210> 51 <211> 707 <212> DNA <213> Methylmonas sp. 16a maxF promoter <400> 51 gcgccgtatg ctttcgaatc cgccaagacc gggcatggat aaatccatga ccaccacatc 60 gggcaattgc tttgaataga gttggcaagc ggtctcgcca cgatcggctt catagatctc 120 gccgatacga tccgacagcg atagataggt cttgtagccg gtacgaacca cggcgtgatc 180 atctaccaat aaaacgctga ttttactcgc cactggaaaa tttcctcctc aggtcgtcaa 240 gggataaaga tatgggacaa gtccagtctg atgccaggcg gacttggtgt gccttttttt 300 atgatgacgc tttatccgtg cttaaaccat gggagctttt cccgtttcca atttcgatcc 360 ttggcgagat aggaatattt ccgtgcatga ttgcgtcgat ttcacatcga tttcatggat 420 tgttccgtaa cgttagccag cccggcttct ataacatttg cgccagcgtg gcctggtggt 480 cggtaacccg tgatgcggtt atgatcaaca aagctggttt tcaacgacta attctgatct 540 tcaggtcgcg cctcacttat agcgataaaa atcctggagg aaacatgcaa caactcgatt 600 tgcgcatagt cgggaaaacc gcggccttgt tggctggtgg ccttctgagc gtggcgcaac 660 ccgcatcggc gaacaaggag ctggaacagc tcggaggatt taaaatg 707 <210> 52 <211> 281 <212> DNA <213> Methylmonas sp. 16a hps promoter <400> 52 cagatagtaa gcgctaagga ttggggtgcg tcgccggtcg cggcggcgct cctcgacggc 60 agagttggtg ccaggttggc ggatgattga tgccgaatat tacgcgacca attctcgagg 120 caaatgaact gtgagctact gagttgcagg cattgacagc catcccattt ctatcataca 180 gttacggacg catcacgagt aggtgataag cctagcagat tgcggcagtt ggcaaaatca 240 gctattacta ataattaaaa actttcggag cacatcaaat g 281 <210> 53 <211> 317 <212> PRT <213> Staphylococcus simiae <400> 53 Met Asn Gln Phe Lys Gly Asn Lys Val Val Leu Ile Gly Asn Gly Ala 1 5 10 15 Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Leu Val Asn Gln Ser Ile Val Asp 20 25 30 Glu Leu Val Ile Ile Asp Leu Asp Thr Glu Lys Val Lys Gly Asp Val 35 40 45 Met Asp Leu Lys His Ala Thr Pro Tyr Ser Pro Thr Thr Val Arg Val 50 55 60 Lys Ala Gly Glu Tyr Ser Asp Cys His Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp 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280 285 Leu Ala Lys Met Arg Ala Ser Ala Ala Thr Ile Lys Ala Thr Leu Asp 290 295 300 Ser Leu Gly 305 <210> 63 <211> 325 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 63 Met Ala Asp Lys Gln Arg Lys Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly Ala 1 5 10 15 Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Val Asn Gln Gly Ile Ala Gln 20 25 30 Glu Leu Gly Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Lys Thr Gln Gly Asp Ala 35 40 45 Glu Asp Leu Ser His Ala Leu Ala Phe Thr Ser Pro Lys Lys Ile Tyr 50 55 60 Ser Ala Asp Tyr Ser Asp Ala Ser Asp Ala Asp Leu Val Val Leu Thr 65 70 75 80 Ser Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val Glu 85 90 95 Lys Asn Leu Arg Ile Thr Lys Asp Val Val Thr Lys Ile Val Ala Ser 100 105 110 Gly Phe Lys Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile Leu 115 120 125 Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Val 130 135 140 Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln Ala Leu Ala 145 150 155 160 Glu Lys Val Asp Val Asp Ala Arg Ser Ile His Ala Tyr Ile Met Gly 165 170 175 Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Val Trp Ser His Ala Asn Val Ala 180 185 190 Gly Val Lys Leu Glu Gln Trp Phe Gln Glu Asn Asp Tyr Leu Asn Glu 195 200 205 Ala Glu Ile Val Glu Leu Phe Glu Ser Val Arg Asp Ala Ala Tyr Ser 210 215 220 Ile Ile Ala Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Val Ala Val Ala Leu 225 230 235 240 Ala Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu His Ala Val Leu Pro 245 250 255 Val Ser Val Phe Gln Asp Gly Gln Tyr Gly Val Ser Asp Cys Tyr Leu 260 265 270 Gly Gln Pro Ala Val Val Gly Ala Glu Gly Val Val Asn Pro Ile His 275 280 285 Ile Pro Leu Asn Asp Ala Glu Met Gln Lys Met Glu Ala Ser Gly Ala 290 295 300 Gln Leu Lys Ala Ile Ile Asp Glu Ala Phe Ala Lys Glu Glu Phe Ala 305 310 315 320 Ser Ala Val Lys Asn 325 <210> 64 <211> 1014 <212> DNA <213> Lactobacillus helveticus LDH <220> <221> CDS <222> (1)..(1014) <400> 64 atg aca aag gtt ttt gct tac gct att cga aaa gac gaa gaa cca ttc 48 Met Thr Lys Val Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Lys Asp Glu Glu Pro Phe 1 5 10 15 ttg aat gaa tgg aag gaa gct cac aag gat atc gat gtt gat tac act 96 Leu Asn Glu Trp Lys Glu Ala His Lys Asp Ile Asp Val Asp Tyr Thr 20 25 30 gat aaa ctt ttg act cct gaa act gct aag cta gct aag ggt gct gac 144 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Lys Gly Ala Asp 35 40 45 ggt gtt gtt gtt tac caa caa tta gac tac act gca gat act ctt caa 192 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Asp Thr Leu Gln 50 55 60 gct tta gca gac gct ggc gta act aag atg tca tta cgt aac gtt ggt 240 Ala Leu Ala Asp Ala Gly Val Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 65 70 75 80 gtt gac aac att gat atg gac aag gct aag gaa tta ggt ttc caa att 288 Val Asp Asn Ile Asp Met Asp Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 85 90 95 acc aat gtt cct gtt tac tca cca aac gct att gct gaa cat gct gct 336 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 100 105 110 att cag gct gca cgt gta tta cgt caa gac aag cgc atg gac gaa aag 384 Ile Gln Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Asp Lys Arg Met Asp Glu Lys 115 120 125 atg gct aaa cgt gac tta cgt tgg gca cca act atc ggc cgt gaa gtt 432 Met Ala Lys Arg Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 130 135 140 cgt gac caa gtt gtc ggt gtt gtt ggt act ggt cac att ggt caa gta 480 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 145 150 155 160 ttt atg cgt att atg gaa ggt ttc ggt gca aag gtt att gct tac gat 528 Phe Met Arg Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 165 170 175 atc ttc aag aac cca gaa ctt gaa aag aag ggt tac tac gtt gac tca 576 Ile Phe Lys Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 180 185 190 ctt gac gac ttg tac aag caa gct gat gta att tca ctt cac gta cca 624 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 195 200 205 gat gtt cca gct aac gtt cac atg atc aac gac aag tca atc gct gaa 672 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Glu 210 215 220 atg aaa gac ggc gtt gta att gta aac tgc tca cgt ggt cga ctt gtt 720 Met Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Arg Leu Val 225 230 235 240 gac act gac gct gta atc cgt ggt ttg gac tca ggc aag atc ttc ggc 768 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Phe Gly 245 250 255 ttc gtt atg gat act tac gaa gac gaa gtt ggt gta ttt aac aag gat 816 Phe Val Met Asp Thr Tyr Glu Asp Glu Val Gly Val Phe Asn Lys Asp 260 265 270 tgg gaa ggt aaa gaa ttc cca gac aag cgt ttg gca gac tta att gat 864 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Lys Arg Leu Ala Asp Leu Ile Asp 275 280 285 cgt cca aac gta ttg gta act cca cac acc gcc ttc tac act act cac 912 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 290 295 300 gct gta cgt aac atg gtt gtt aag gca ttc aac aac aac ttg aag tta 960 Ala Val Arg Asn Met Val Val Lys Ala Phe Asn Asn Asn Leu Lys Leu 305 310 315 320 atc aac ggc gaa aag cca gat tct cca gtt gct ttg aac aag aac aag 1008 Ile Asn Gly Glu Lys Pro Asp Ser Pro Val Ala Leu Asn Lys Asn Lys 325 330 335 ttt taa 1014 Phe <210> 65 <211> 337 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus LDH <400> 65 Met Thr Lys Val Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Lys Asp Glu Glu Pro Phe 1 5 10 15 Leu Asn Glu Trp Lys Glu Ala His Lys Asp Ile Asp Val Asp Tyr Thr 20 25 30 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Lys Gly Ala Asp 35 40 45 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Asp Thr Leu Gln 50 55 60 Ala Leu Ala Asp Ala Gly Val Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 65 70 75 80 Val Asp Asn Ile Asp Met Asp Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 85 90 95 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 100 105 110 Ile Gln Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Asp Lys Arg Met Asp Glu Lys 115 120 125 Met Ala Lys Arg Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 130 135 140 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 145 150 155 160 Phe Met Arg Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 165 170 175 Ile Phe Lys Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 180 185 190 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 195 200 205 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Glu 210 215 220 Met Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Arg Leu Val 225 230 235 240 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Phe Gly 245 250 255 Phe Val Met Asp Thr Tyr Glu Asp Glu Val Gly Val Phe Asn Lys Asp 260 265 270 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Lys Arg Leu Ala Asp Leu Ile Asp 275 280 285 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 290 295 300 Ala Val Arg Asn Met Val Val Lys Ala Phe Asn Asn Asn Leu Lys Leu 305 310 315 320 Ile Asn Gly Glu Lys Pro Asp Ser Pro Val Ala Leu Asn Lys Asn Lys 325 330 335 Phe <210> 66 <211> 996 <212> DNA <213> Leuconostoc mesenteroides LDH <220> <221> CDS <222> (1)..(996) <400> 66 atg aag att ttt gct tac ggc att cgt gat gat gaa aag cca tca ctt 48 Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu 1 5 10 15 gaa gaa tgg aaa gcg gct aac cca gag att gaa gtg gac tac aca caa 96 Glu Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Glu Ile Glu Val Asp Tyr Thr Gln 20 25 30 gag cta ttg aca cct gaa aca gtt aag ttg gct gag gga tca gat tca 144 Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Val Lys Leu Ala Glu Gly Ser Asp Ser 35 40 45 gct gtt gtt tac caa caa ctg gac tat aca cgt gaa aca ttg aca gct 192 Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala 50 55 60 tta gct aac gtt ggt ggt act aac ttg tca ttg cgt aac gtt ggt aca 240 Leu Ala Asn Val Gly Gly Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr 65 70 75 80 gat aac att gat ttt gat gca gca cgt gaa ttt aac ttt aac att tca 288 Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser 85 90 95 aat gtt cct gtt tat tca cca aat gct att gca gaa cac tca atg att 336 Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile 100 105 110 caa tta tct cgt ttg cta cgt cgc acg aaa gca ttg gat gcc aaa att 384 Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile 115 120 125 gct aag cac gac ttg cgc tgg gca cca aca att gga cgt gaa atg cgt 432 Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg 130 135 140 atg caa aca gtt ggt gtt att ggt aca ggc cat att ggc cgt gtt gct 480 Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala 145 150 155 160 att aac att ttg aaa ggc ttt ggg gca aag gtt att gct tat gat aag 528 Ile Asn Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Lys 165 170 175 tac cca aat gct gaa ttg caa gca gaa ggt ttg tac gtt gac aca tta 576 Tyr Pro Asn Ala Glu Leu Gln Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu 180 185 190 gac gaa tta tat gca caa gct gat gca att tca ttg tat gtt cct ggt 624 Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Ile Ser Leu Tyr Val Pro Gly 195 200 205 gtg cct gaa aac cat cat cta atc aat gca gag gct att gct aag atg 672 Val Pro Glu Asn His His Leu Ile Asn Ala Glu Ala Ile Ala Lys Met 210 215 220 aat gat ggc gtg gtt atc atg aat gct gcg cgt ggt aat ttg atg gac 720 Asn Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Met Asp 225 230 235 240 att gat gct att att gat ggt ttg aat tct ggt aag att tca gac ttc 768 Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe 245 250 255 ggt atg gac gtt tat gaa aat gaa gtt ggc ttg ttc aat gaa gat tgg 816 Gly Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp 260 265 270 tct ggt aaa gaa ttc cca gat gct aag att gct gac ttg att tca cgc 864 Ser Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ser Arg 275 280 285 gaa aat gta ttg gtt acg cca cat acg gct ttc tat aca act aaa gct 912 Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala 290 295 300 gtt cta gaa atg gtt cac caa tca ttt gat gca gca gtt gct ttc gcc 960 Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala 305 310 315 320 aaa ggt gag aag cca gct att gct gtt gaa tat taa 996 Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ile Ala Val Glu Tyr 325 330 <210> 67 <211> 331 <212> PRT <213> Leuconostoc mesenteroides LDH <400> 67 Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu 1 5 10 15 Glu Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Glu Ile Glu Val Asp Tyr Thr Gln 20 25 30 Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Val Lys Leu Ala Glu Gly Ser Asp Ser 35 40 45 Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala 50 55 60 Leu Ala Asn Val Gly Gly Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr 65 70 75 80 Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser 85 90 95 Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile 100 105 110 Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile 115 120 125 Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg 130 135 140 Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala 145 150 155 160 Ile Asn Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Lys 165 170 175 Tyr Pro Asn Ala Glu Leu Gln Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu 180 185 190 Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Ile Ser Leu Tyr Val Pro Gly 195 200 205 Val Pro Glu Asn His His Leu Ile Asn Ala Glu Ala Ile Ala Lys Met 210 215 220 Asn Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Met Asp 225 230 235 240 Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe 245 250 255 Gly Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp 260 265 270 Ser Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ser Arg 275 280 285 Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala 290 295 300 Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala 305 310 315 320 Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ile Ala Val Glu Tyr 325 330

Claims (35)

  1. 락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase: LDH)를 암호화하는 이종성 핵산을 포함하는 메탄영양체 박테리아로서, 상기 메탄영양체 박테리아는 메탄을 락테이트로 전환할 수 있는 것인, 메탄영양체 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메탄은 천연가스에 함유되어 있는, 메탄영양체 박테리아.
  3. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아는 I형 메탄영양체, II형 메탄영양체 및 X형 메탄영양체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 메탄영양체 박테리아.
  4. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아는 통성(facultative) 메탄영양체 인, 메탄영양체 박테리아.
  5. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아는 절대(obligate) 메탄영양체인, 메탄영양체 박테리아.
  6. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아는 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메타노모나스(Methanomonas), 메틸로셀라(Methylocella), 메틸아시디필리움(Methylacidiphilum), 메틸로아시다(Methyloacida), 메틸리비움(Methylibium) 및 메틸로캅사(Methylocapsa)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 메탄영양체 박테리아.
  7. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주(Methylococcus capsulatus Bath strain), 메틸로모나스 메타니카 16a(Methylomonas methanica 16a), 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b), 메틸로시너스 스포리움(Methylosinus sporium), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus), 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica), 메틸로모나스 알부스(Methylomonas albus), 메틸로박터 캡슐라투스(Methylobacter capsulatus), 메틸로박테리움 오가노필룸(Methylobacterium organophilum), 메틸로모나스종(Methylomonas sp) AJ-3670, 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸로셀라 팔루스트리스(Methylocella palustris), 메틸로셀라 툰드라(Methylocella tundrae), 메틸로시스티스 달토나(Methylocystis daltona) 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라(Methylocystis bryophila), 메틸로캅사아우레아(Methylocapsa aurea) KYG, 메틸아시디필리움 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum), 메틸아시디필리움 푸마리오리쿰(Methylacidiphilum fumariolicum), 메틸로아시다 캄차트켄시스(Methyloacida kamchatkensis), 메틸리비움 페트롤에필룸(Methylibium petroleiphilum) 및 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 메탄영양체 박테리아.
  8. 제1항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주 또는 메틸로시너스 트라이코스포리움 OB3b인, 메탄영양체 박테리아.
  9. 제1항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 서열번호 34, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 53, 54, 55, 56, 57 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 락트산 탈수소효소를 암호화하는, 메탄영양체 박테리아.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 서열번호 34, 16 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 락트산 탈수소효소를 암호화하는, 메탄영양체 박테리아.
  11. 제1항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 서열번호 33, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45 및 47로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 메탄영양체 박테리아.
  12. 제1항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 리스테리아 마르티(Listeria marthii), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 악티노닉스 주바투스(Acinonyx jubatus), 아르킬로처스 콜루브리스(Archilochus colubris), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 칼돌리티쿠스(Bacillus caldolyticus), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 게오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테리오이데스 펙티노필루스(Bacteroides pectinophilus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces maxxianus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 코리니포미스 종 토르쿠엔스(Lactobacillus coryniformis sp. torquens), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)(아종 불가리쿠스(bulgaricus)를 포함), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 존슨니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 오릭토라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus), 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 타에니오피기아 구타타(Taeniopygia guttata), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 루미노코커스 토르쿠엔스(Ruminococcus torques), 스타필로코커스 시미아에(Staphylococcus simiae), 스타필로코커스 비툴리누스(Staphylococcus vitulinus), 스타필로코커스 렌투스(Staphylococcus lentus), 마크로코커스 카세올리티쿠스(Macrococcus caseolyticus), 바실러스 투린지엔시스 혈청형 콘쿠키안(konkukian) 균주 97-27, 바실러스 투린지엔시스 혈청형 치넨시스(chinensis) CT-43 및 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터의 LDH를 암호화하는, 메탄영양체 박테리아.
  13. 제1항에 있어서, LDH를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 상기 메탄영양체 박테리아에서 발현을 위해 코돈 최적화된, 메탄영양체 박테리아.
  14. 제1항에 있어서, 상기 락트산 탈수소효소를 암호화하는 이종성 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 메탄영양체 박테리아.
  15. 제1항에 있어서, 상기 락트산 탈수소효소는 L-락트산 탈수소효소인, 메탄영양체 박테리아.
  16. 제1항에 있어서, 상기 락트산 탈수소효소는 D-락트산 탈수소효소인, 메탄영양체 박테리아.
  17. 락테이트를 생산하기에 충분한 조건 하에서 메탄을 포함하는 탄소 공급원료의 존재 하에 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 메탄영양체 박테리아를 배양시키는 단계를 포함하는, 락테이트의 생산방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 탄소 공급원료는 천연가스인, 락테이트의 생산방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 락테이트를 생산하는데 충분한 조건은 완충제를 포함하는 발효 배지에서 메탄영양체 박테리아를 배양시키는 단계를 포함하는, 락테이트의 생산방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 메탄영양체 박테리아로부터 락테이트를 분리시키는 단계를 더 포함하는, 락테이트의 생산방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 락테이트를 정제하는 단계를 더 포함하는, 락테이트의 생산방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 락테이트는 L-락테이트인, 락테이트의 생산방법.
  23. 하나 이상의 CH3C(OH)C(O)- 기를 가지며, 제17항의 방법을 사용하여 생산되는 락테이트 화합물로서, 상기 CH3C(OH)C(O)- 기(들)의 δ13C는 약 -30‰ 미만인, 락테이트 화합물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 CH3C(OH)C(O)-기(들)의 δ13C는 약 -70‰ 내지 약 -30‰의 범위에 있는, 락테이트 화합물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 CH3C(OH)C(O)-기(들)의 δ13C는 약 -60‰ 내지 약 -40‰의 범위에 있는, 락테이트 화합물.
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