KR102197002B1

KR102197002B1 - 후코이단 나노 입자를 합성하는 방법 및 이의 후코이단 나노 입자

Info

Publication number: KR102197002B1
Application number: KR1020190003154A
Authority: KR
Inventors: 유정수; 흉풍투; 이웅희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2020-12-30
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: KR20190086389A

Abstract

본 발명은 후코이단 수용액에 전자빔을 조사하여, 후코이단의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는, 가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

후코이단 나노 입자를 합성하는 방법 및 이의 후코이단 나노 입자{MANUFACTURING METHOD OF FUCOIDAN NANOPARTICLE AND FUCOIDAN NANOPARTICLE}

본 발명은 가교제 없이 생체적합성을 가지며, 순수한 후코이단 가교체인 나노 입자를 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 나노 입자, 그리고 이러한 나노 입자의 활용에 관한 것이다.

후코이단은 황산기와 다당류가 결합된 분자량 200,000의 성분으로 다시마, 미역, 모즈쿠, 톳 같은 갈조류에 함유되어 있는 생체고분자로서 인체에 대한 독성이 매우 낮아 현재 건강보조식품으로 널리 활용되고 있다.

최근 들어 후코이단이 P-셀렉틴(P-selectin)에 선택적인 결합을 하는 것이 알려지면서 종양 진단제 및 치료제로서의 활용 가능성에 대한 연구가 높아지고 있다.

그러나 P-셀렉틴(P-selectin)의 성능을 유지하면서, 생체에서 사용가능하고, 생체적합한 순수한 후코이단의 수화겔과 같은 나노입자는 이의 조영제로서의 사용 및 생체 내에 사용에 필수적일 것인데, 통상 수화겔은 고분자 물질에 가교제 및/또는 경화제 등의 화학물질을 첨가하여 가교하는 방법으로 제조되어 왔다. 그러나 상기 가교반응에 사용되는 가교제 및/또는 경화제 자체가 생체에 유해하므로 이러한 가교제 및/또는 경화제를 사용하여 제조된 수화겔이 생체에 사용되는 경우에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 문제가 있을 것이고, 또한, 가교제 및/또는 경화제가 사용되는 경우에는 수화겔 제조 후에 수화겔 내의 잔류 가교제 및/또는 경화제를 제거하여야 하므로 제조공정이 복잡할 뿐만 아니라 비용이 상승되는 문제가 있을 것이다.

한국 공개특허공보 제10-2017-0087427호(2017.07.28)

이에 본 발명은 상기한 종래의 문제점 및 필요를 인식하고, 생체적합하면서 순수한 후코이단 나노입자 또는 나노겔을 제조하는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 별도의 가교제 없고, 유기용매가 아닌 수용액 상에서 후코이단 가교 나노 입자 형성할 수 있는 방법을 제공하며, 이렇게 가교된 후코이단 나노 입자가 P-셀렉틴에 대한 선택적 결합 특성을 가질 수 있음을 목적으로 한다.

또한, 나노 입자의 크기를 제어할 수 있는 방법을 제공한다.

일 측면으로서, 본 발명은 후코이단 수용액에 전자빔을 조사하여, 후코이단의 분자간 가교결합(inter-molecular cross-linking) 또는 분자내 가교결합(가교결합(intramolecular cross-linking)을 형성함을 포함하는, 가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법을 제공한다.

후코이단 수용액에 전자빔 만으로 유기용매 및 가교제 없이 후코이단 가교체를 제조하는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 나노입자란 크기가 수 내지 수백 나노미터(nm, 10억분의 1미터인 물질)인 입자를 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 나노입자는 입자의 크기가 1 내지 700nm인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 나노입자란 나노겔 또는 나노하이드로겔도 포함하는 개념으로, 이하에서 나노입자, 나노겔 또는 나노하이드로겔은 모두 본 발명에 따른 나노입자를 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명의 상기 후코이단 수용액은 산성에서 중성임을 특징으로 한다. 산성 수용액을 위해 후코이단 수용액에 산을 첨가할 수 있다. 바람직하게 HClO₄일 수 있다. 이하에서 자세히 설명되고 입증되는 바와 같이, 후코이단 수용액을 산성으로 하거나, 후코이단 수용액에 산이 첨가되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비해, 높은 나노입자 합성 효율이 증대됨을 새롭게 제공한다. 또한 pH의 조절 및 산 화합물을 첨가 농도의 조절로 예기치 않게 나노 입자의 크기를 제어할 수 있음을 제공한다.

상기 전자빔을 조사한 이후, 동결 건조단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 후코이단 나노 입자의 크기가 전자빔의 조사 선량 및/또는 후코이단 수용액의 pH를 조절하여 제어될 수 있음을 제공한다.

특히, 상기 전자빔의 조사선량을 늘려 상기 후코이단 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 하며, 상기 수용액의 pH를 낮춰 상기 후코이단 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 한다. 또한, 상기 수용액은 상기 후코이단이 5%(w/v) 이하일 때, 나노 입자의 크기가 pH 또는 조사 선량에 더 잘 제어됨을 새롭게 제공한다.

본 발명은 상기 수용액에 후코이단 농도는 2%(w/v)이하이고, 상기 수용액에 0.3%(w/v) 내지 0.5%(w/v) 농도의 HClO₄를 포함하며, 상기 전자빔의 강도는 1 내지 200 kGy임을 특징으로 하여, 300 nm 이하의 나노 입자를 생성함을 제공한다.

다른 측면으로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 후코이단의 분자간 또는 분자내 가교결합된 나노 입자를 제공한다. 상기 나노 입자의 크기는 100 nm 내지 600 nm 임을 특징으로 하며, 상기 나노 입자는 구형임을 특징으로 한다. 상기 나노 입자는 팽윤 특성을 가지는 하이드로젤임을 특징으로 한다. 특히, 본 발명의 방법으로 후코이단을 가교 결합시킴에도, P-셀렉틴 선택성을 가짐을 특징으로 한다. 또한 상기 나노 입자는 종양 선택성, 특히 흑색종 선택성을 가지며, 상기 나노 입자는 20배 이상의 종양 대 근육비 및 10배 이상의 종양대 혈액비를 가짐을 특징으로 한다.

또 다른 측면으로서, 본 발명은 방사성 동위원소, 유기 형광물질, 무기물질인 양자점, 자기공명영상 조영제, 컴퓨터단층촬영 조영제, 양전자단층촬영 조영제, 초음파 조영제, 형광 조영제 및 상형변환물질로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표지 물질로 표지된 후코이단 나노 입자를 포함하는 P-셀렉틴 또는 종양 선택성 조영제 및 치료제를 제공한다.

특히, 상기 나노 입자에 접합된 리간드 화합물 및 상기 리간드 화합물에 배위결합된 방사성 동위원소를 포함하는 P-셀렉틴 또는 종양 선택성 조영제 및 치료제를 제공한다. 상기 리간드 화합물은 NODA-GA-NH₂,DOTA-GA, DOTA, TETA 및 NOTA 중 적어도 어느 하나일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ³⁸K, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ¹²⁴I, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ¹⁷⁷Lu, ²⁰¹Tl, ^117mSn, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁹⁰Y, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, 및 ²¹¹At 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 한다.

본 발명은 순수한 후코이단 나노 입자를 가교제 및 유기용매 없이 수용액 상에서 제조할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 재현성 있게 수십나노미터에서 수백나노미터 사이즈의 후코이단 나노입자를 균일하게 대량 합성할 수 있다. 또한, 방사성 표지를 통해 합성된 후코이단 나노입자의 종양진단 조영제로서의 효과를 제공한다. 독성이 강한 가교제를 사용하지 않아 합성된 나노입자의 향후 임상적용시 독성 문제를 근본적으로 해결할 수 있다.

도 1은 후코이단 고분자가 전자빔에 의해 가교되어 후코이단 입자가 형성됨을 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명의 전자빔 조사 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 입자를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 입자의 ¹H-NMR 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 후코이단 나노 입자의 생성 효율을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 후코이단 및 산의 농도와 전자빔 선량에 따른 나노입자의 크기를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1의 후코이단의 크기 분포를 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1의 샘플 중 높은 합성 수율을 보여주는 특정 조건(Fucoidan 0.5% with 0.3% HClO4 at 200kGy)의 후코이단 나노입자의 DLS 분석 결과를 보여준다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 후코이단 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 후코이단 나노 입자의 SEM 사진이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 후코이단 나노 입자의 하이드로젤 특성을 보여주는 실험 결과 사진이다.
도 12는 본 발명의 실시예 2의 후코이단 나노입자에 이중기능킬레이트인 NODA-GA-NH₂를 접합하여 킬레이트 화합물을 제조하는 과정과 Cu-64로 표지하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 13은 본 발명의 실시예 2의 후코이단 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물이 Radio-TLC를 사용하여 방사화학적 순도를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 2의 후코이단 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 PBS(Phosphate Buffer Saline)와 혈청(Fetal Bovine Serum)을 이용한 시간별 radio-TLC의 분석 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예 2의 후코이단 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 정상 마우스에서의 생체분포확인 실험의 결과이다.
도 16은 본 발명의 실시예 2의 후코이단 나노 입자 P-셀렉틴 성능 평가 결과이다.
도 17은 본 발명의 실시예2의 후코이단 나노 입자의 주사 후 PET 영상을 확인하며 장기들에 대한 분포 및 배출에 대하여 확인한 사진이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

후코이단을 물에 혼합하여 후코이단 수용액을 제조하였고, 상기 후코이단 수용액에 전자빔을 조사하여 후코이단 나노입자를 용액 내에 생성시켰으며, 상기 수용액으로부터 후코이단을 분리하였다.

다음과 같은 서로 다른 해조류로부터 추출된 3 종류의 후코이단을 사용하였고, 상기 수용액 내의 후코이단 농도를 예를 들어 0.5 %(w/v) 내지 10 %(w/v)으로 다양하게 하여 실험하였다. 수용액의 pH를 달리하여 실험하였다.

Fucoidan-1: Undaria pinnatifida로부터 추출된 후코이단,

Fucoidan-2: Fucus vesiculosus로부터 추출된 중국산 후코이단,

Fucoidan-3: Fucus vesiculosus로부터 추출된 호주산 후코이단

다양한 후코이단의 농도 및 종류에 따른 다양한 샘플 수용액, pH 농도에 따른 다양한 샘플 수용액을 도 2와 같은 플레이트에 담았다.

상기 플레이트들은 임의의 속도로 이동될 수 있는 컨베이어 위에서 이동되도록 구성된다. 상기 플레이트 위에 선형 전자빔 가속기가 설치되고, 전자빔을 플레이트 내의 수용액으로 조사되도록 구성된다. 컨베이어 밸트에 의한 플레이트의 이동속도와 선형 전자빔 가속기의 전자빔의 방출량을 제어하여, 전자빔의 선량은 1kGy 내지 200 kGy에서 다양하게 실험하였다.

수용액으로부터 생성된 나노입자를 분리하기 위해 투석 및 동결건조를 수행하여 후코이단 나노입자를 대량으로 합성하였고, 도 3의 사진처럼 동결건조 과정 이후 파우더 형태로 샘플을 얻을 수 있었다.

나노입자의 ¹ H-NMR 분석

실시예 1로부터 수득된 입자에 대해 ¹H-NMR 분석을 수행하였다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, 전자빔 조사 전과는 다르게 전자빔 조사 이후, 새로운 피크(Peak)가 관찰됨을 확인할 수 있었다.

이와 같이 분광학적으로 전자빔 조사 이전의 다당류와는 다르게 화학적인 반응이 이루어졌음을 확인할 수 있었고, 이는 전자빔 조사에 의한 가교결합으로 유발되었을 것으로 본다.

나노입자의 광학 분석

합성된 후코이단 나노입자는 DLS를 통해 나노입자의 크기를 측정할 뿐만 아니라 투과전자현미경(TEM)을 통해 실제로 합성된 나노입자의 형태학적 모양을 직접 확인해보는 연구를 진행하였다.

각 나노입자를 Carbon이 코팅된 구리 Grid 위에 2~3 방울 정도 떨어뜨리고, 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)를 사용해서 염색 과정을 거친 후 충분한 시간을 두고 수분을 완전히 건조한 후에 TEM을 이용해 분석하였다.

염색이 잘 되어 보다 진한 검정색을 띄고 있는 나노입자의 모습을 확인해볼 수 있었고, 대부분 둥근 구형의 모습을 띄고 있으며 입자의 크기는 DLS에서의 결과와 일치함을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

동일한 나노입자를 사용해서 주사전자현미경(SEM)을 이용해 분석을 반복해서 진행해보았고, TEM에서의 결과와 마찬가지로 둥근 구형의 입자의 모양을 확인할 수 있었다(도 10).

전자빔에 의한 후코이단의 나노입자 합성 비율

본 발명의 실시예 1에서의 방법을 사용하여, 수용액 샘플 903개에 서로 다른 조건에서 전자빔을 조사하여 나노입자의 합성여부를 확인하였다. 337개의 샘플에서 나노입자의 합성 확인되었다. 전자빔 조사를 이용한 나노입자 합성 성공 비율은 약 37%였다. 도 5가 참조된다.

후코이단의 종류 나노 입자 합성 비교

후코이단의 종류에 따른 샘플에 대해 나노입자 생성율을 확인하였다. Fucoidan-1 과 3을 사용하였을 때 가장 나노입자가 잘 만들어지는 결과를 확인할 수 있었다.

후코이단 용액의 pH에 대한 실험

산의 첨가 여부 및 pH 정도에 따른 샘플에 대해 나노입자 생성율을 확인하였다. 산성인 샘플은 그렇지 않은 샘플에 비해 높은 나노입자 수득율을 보였다. 후코이단 수용에의 산의 첨가 또는 후코이단 수용액을 산성화 함은 전자빔에 따른 나노입자 생성시 예기치 않은 높은 수율을 보임을 확인할 수 있었다.

후코이단 및 산의 농도와 전자빔 선량에 따른 나노입자의 크기

0.5%(w/v) 농도의 후코이단 수용액 샘플에 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 및 0.5%(w/v)의 수용액 내 산의 농도로 산이 첨가된 샘플에 대해 입자 크기를 확인하였다. 나노입자의 크기는 DLS(dynamic light scattering system)를 측정하였다. 도 6a에서 확인되는 바와 같이, 0.1%(w/v)의 산을 첨가한 결과와는 다르게 0.3%(w/v)와 0.5%(w/v)의 산을 첨가한 결과에서 산의 농도가 증가함에 따라 입자의 크기가 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 3kGy, 5kGy, 50kGy, 100kGy, 150kGy 및 200kGy로 전자빔 선량을 달리하여 실험하였고, 전자빔의 선량이 증가할수록 입자의 크기가 감소됨을 확인할 수 있었다.

1%(w/v) 농도의 후코이단 수용액 샘플에 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 및 0.5%(w/v)의 수용액 내 산의 농도로 산이 첨가된 샘플에 대해 입자 크기를 확인하였다. 그 결과는 도 6b와 같았다. 이 실험에서도 동일하게 산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 후코이단 나노입자 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인해볼 수 있었고, 또한 전자빔의 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인해볼 수 있었다.

2%(w/v) 농도의 후코이단 수용액 샘플에 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 및 0.5%(w/v)의 수용액 내 산의 농도로 산이 첨가된 샘플에 대해 입자 크기를 확인하였다. 그 결과는 도 6c와 같았다. 이 실험에서도 산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 입자의 크기가 감소하는 동일한 경향성을 확인하였고, 또한 전자빔의 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인해볼 수 있었다.

5%(w/v) 농도의 후코이단 수용액 샘플에 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 및 0.5%(w/v)의 수용액 내 산의 농도로 산이 첨가된 샘플에 대해 입자 크기를 확인하였다. 그 결과는 도 6d와 같았다. 이 실험에서도 산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 입자의 크기가 감소하는 동일한 경향성을 확인하였고, 또한 전자빔의 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인해볼 수 있었다. 그러나, 낮은 농도의 후코이단을 이용한 실험에서만큼 큰 영향을 주지 못함을 확인하였다.

10%(w/v) 농도의 후코이단 수용액 샘플에 0.1%(w/v), 0.3%(w/v), 및 0.5%(w/v)의 수용액 내 산의 농도로 산이 첨가된 샘플에 대해 입자 크기를 확인하였다. 그 결과는 도 6e와 같았다. 이 실험에서도 산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 입자의 크기가 감소하는 동일한 경향성을 확인하였고, 또한 전자빔의 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인해볼 수 있었다. 그러나, 낮은 농도의 후코이단을 이용한 실험에서만큼 큰 영향을 주지 못함을 확인하였다.

이와 같은 결과를 바탕으로 낮은 농도(5%(w/v) 이하)의 후코이단과 함께 첨가되는 산(HClO₄)의 농도가 증가함에 따라 또한 전자빔 조사의 세기가 증가함에 따라 전자빔을 통해 가교반응이 더욱 발생되어서 입자의 크기가 더 작아지는 경향성을 확인할 수 있었다.

이와 같이 후코이단을 사용하여 다양한 조건에서 전자빔을 조사하며 후코이단 나노입자를 합성해본 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 100 nm에 근접한 입자의 크기를 보여주는 샘플이 가장 많았으나 200 nm에 해당하는 조금 더 큰 크기를 보이는 샘플뿐만 아니라 600 nm의 큰 크기를 보이는 나노입자까지 합성됨으로써 매우 넓은 사이즈 스펙트럼까지 선별적으로 조절할 수 있었다.

샘플 중 높은 합성 수율을 보여주는 특정 조건(Fucoidan 0.5% with 0.3% HClO₄ at 200kGy)의 후코이단 나노입자를 합성하였고, DLS를 이용하여 크기는 90.4 nm임을 확인할 수 있었고, 합성 수율은 30.9%임을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

후코이단 나노 입자의 하이드로젤 특성

합성된 나노입자가 실질적으로 물을 잘 머금는(Swelling) 하이드로젤의 특징을 지니고 있는지를 확인하는 실험을 진행해보았고, 대조군으로는 순수한 물과 전자빔을 조사하지 않은 후코이단을 사용하여 실험을 진행하였다.

동일한 양의 후코이단 나노입자와 대조군을 각각 500의 물에 녹인 후, 분리막을 가진 원심여과기를 사용하여 원심분리를 진행하여 각각의 튜브 바닥에 떨어진 물의 양을 확인해보았고, 그 차이가 잘 보이도록하기 위하여 튜브 아래로 떨어진 물을 초록색의 잉크로 염색시킨 후 사진을 찍었다.

그 결과를 확인해보았을 때, 전자빔을 조사하여 얻어진 나노입자 샘플에서 원심분리 과정 이후 튜브 바닥으로 떨어지는 물의 양이 보다 적고, 상층액부분에 더 많은 용액이 남겨져 있음을 확인할 수 있었다. 도 11은 이의 결과를 보여주는 사진으로, 즉, 도 11을 참조하면 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 후코이단 나노 입자가 하이드로젤 특성을 나타냄을 확인할 수 있다. EB는 전자빔의 약어이며, 중간의 No EB는 전자빔의 처리가 없는 대조군의 결과이다. EB는 본 발명의 나노입자 결과로서 전자빔의 처리가 있는 결과이다.

이와 같은 결과를 통하여 전자빔 조사를 통해 합성된 후코이단 나노입자가 대조군보다 물을 잘 머금으며 하이드로젤로서의 특징을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

이중기능킬레이트인 NODA-GA-NH₂를 사용해서 실시예 1에서 제조된 후코이단에 접합하는 실험을 진행하였다.

도 12a에서 참조되는 바와 같이, 후코이단 나노입자를 피리딘(Pyridine)에 녹여준 후 토실 클로라이드(Tosyl chloride)를 한 방울씩 천천히 떨어뜨려주며 밤새 반응을 진행하였다. 이 후, NODA-GA-NH₂를 추가한 후 높은 열을 가해주며 하루정도 반응을 진행한 후, NODA-GA-NH₂와 접합반응이 이루어진 후코이단 나노입자를 원심여과기로 추출하였다. 동결건조 과정을 통하여 순수한 갈색 파우더 형태의 NODA-GA가 접합된 후코이단 나노입자를 얻었다.

다음에, 도 12b에서 참조되는 바와 같이, Cu-64를 이용한 방사성 표지를 진행해보았고 pH가 6.8인 버퍼에 NODA-GA-후코이단 나노입자를 넣고 적정 온도 및 시간에서 ⁶⁴CuCl₂와 반응한 후, 원심여과기를 통하여 Cu-64가 표지된 후코이단 나노입자를 정제해서 얻는 과정을 거친 후 Radio-TLC를 사용하여 방사화학적 순도를 확인하였다. 그 결과 도 13에서 보는 바와 같이, 방사화학적 순도가 98%로 Cu-64와 우수하게 표지 반응이 이루어짐을 확인할 수 있었다.

방사 표지된 나노입자의 안정성 분석

방사 표지된 나노입자의 안정성의 경우, 방사선분해(Radiolysis)를 확인해보는 방식으로 실험을 진행하였고 PBS(Phosphate Buffer Saline)와 혈청(Fetal Bovine Serum)을 이용하여 시간별로 radio-TLC로 분석하며 나노입자의 안정성을 확인해보았다. 그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이, 1시간과 4시간까지 높은 안정성을 보여줌을 확인할 수 있었고, 24시간에 대한 결과에서도 동일하게 95% 이상의 뛰어난 안정성을 보였기에 마우스 내에서도 충분히 그 안정성을 유지할 수 있을 것으로 예측해볼 수 있다.

정상 마우스에서 생체분포확인 실험

Cu-64와 표지 반응이 이루어진 나노입자를 사용하여 정상 마우스에서 생체분포확인 실험을 진행하며 장기들에 대한 분포 및 체외로 배출 경로를 확인하였다.

합성된 나노입자를 종양 조영제 개발 연구에 활용할 계획으로 나노입자가 충분히 종양을 타겟팅할 수 있는 시간을 두고 실험을 진행하였고, 그에 따라 나노입자를 주사한 후 24시간 후에 각 장기에 대한 분포를 확인하는 방법으로 실험하였다. 후코이단 나노입자를 합성하는데 사용된 전자빔 에너지의 세기가 10kGy, 100kGy, 200kGy로 차이가 나는 각각의 나노입자에 대하여 장기들에 대한 분포 및 체외로 배출 경로에서 차이가 나타나는지를 확인해보는 연구를 진행하였다.

도 15a에서 확인되는 바와 같이, 그 결과 전체적인 장기에 섭취되는 경향은 거의 동일하게 유지되는 것을 확인할 수 있었지만, 나노입자를 합성하는데 사용된 전자빔의 에너지의 세기가 증가함에 따라 마우스 체내에 더 높은 방사능량이 남아있음을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과는 각각의 나노입자의 크기는 100 nm 범위내로 큰 변화가 없기에 입자의 크기 차이로 인해 발생된 것이라고는 생각해볼 수 없을 듯하고, 전자빔 조사 에너지의 세기가 증가함에 따라 합성된 나노입자 내의 가교결합이 증가함에 따라 나타난 결과로 예측된다.

후코이단 나노입자의 경우 총 3 종류의 후코이단을 사용해서 나노입자 합성을 진행하였는데, 서로 다른 종류의 후코이단(Fucoidan-1, Fucoidan-3)을 동일한 전자빔 에너지 조사 조건을 사용해서 나노입자를 합성하였고 이를 동일한 방법을 통하여 Cu-64로 표지한 후, 각각을 정상 마우스에 주사하여 장기들에 대한 분포 및 체외로 배출 경로를 확인하였다.

그 결과 도 15b에서 확인되는 바와 같이 비록 전자빔 조사 조건은 동일하나 사용한 후코이단의 종류에 따라 간, 신장, 비장에 대한 섭취 정도가 큰 차이가 발생함을 확인해 볼 수 있었다.

합성된 나노입자의 크기는 각각 80, 98 nm로 큰 차이가 없기에 입자의 크기 차이로 인해 발생된 것이라고는 생각해볼 수 없을 듯하며, 후코이단의 종류의 차이에 따라 체내의 분포 및 섭취정도에 큰 영향을 주는 것을 확인해볼 수 있다.

후코이단의 종양 선택성 분석

후코이단이 P-셀렉틴에 선택적인 결합을 하는 것이 알려지면서 종양 진단제 및 치료제로서의 활용할 수 있기에 P-셀렉틴을 발현하는 종양모델(흑색종/B16F10)을 준비하였고, 6-8 mm로 적절한 크기로 종양이 자랐을 때 종양모델에 대한 생체분포확인 실험을 진행하였다.

나노입자를 주사한 후 24 시간 후에 각 장기에 대한 분포를 확인하는 방법으로 실험하였고, 그 결과 도 16에서 확인되는 바와 같이, 간과 신장에 대해서 8-9 %ID/g로 가장 높은 섭취를 보여주었으나 종양에 대해서도 3 %ID/g 이상의 높은 섭취를 보여주었고, 종양 대 근육비(Tumor to muscle ratio)는 20배, 종양 대 혈액비(Tumor to blood ratio)는 10.4배로 우수하게 종양을 진단할 수 있음을 확인하였다.

도 17은 본 발명의 실시예2의 후코이단 나노젤의 주사 후 PET 영상을 확인하며 장기들에 대한 분포 및 배출에 대하여 확인한 영상 사진이다. 주사 후 1시간 뒤 영상 초반에는 심장 및 경동맥 부분의 높은 신호를 확인하며 푸코이단 나노젤이 다른 다당류 나노젤과는 다르게 체내에서 오랫동안 유지됨을 확인할 수 있었고, 방광에서의 높은 신호는 체내에서 신장을 통하여 소변으로 나노젤이 빠르게 배출됨을 확인할 수 있었다.

주사 뒤 24시간 뒤에는 오른쪽 대퇴부 위에 위치한 종양에 특이적으로 간보다도 더 높은 신호를 나타내며 푸코이단 나노젤의 우수한 종양 타겟팅을 확인할 수 있었다.

Claims

후코이단 수용액에 전자빔을 조사하여, 후코이단의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법에 있어서,
상기 수용액의 pH를 산성으로 조절하여, 상기 후코이단 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 후코이단 함유 용액에 HClO₄를 추가로 포함하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 전자빔의 조사선량을 변경하여 후코이단 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 전자빔의 조사선량을 늘려 상기 후코이단 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 수용액의 pH를 낮춰 상기 후코이단 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 수용액은 상기 후코이단이 5%(w/v) 이하 포함을 특징으로 하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 수용액에 후코이단 농도는 2%(w/v)이하이고,
상기 수용액에 0.3%(w/v) 내지 0.5%(w/v) 농도의 HClO₄를 포함하며,
상기 전자빔의 강도는 1 내지 200 kGy임을 특징으로 하여, 300 nm 이하의 나노 입자를 생성함을 포함하는,
가교된 후코이단 나노 입자를 제조하는 방법.
제1항에 의해 제조된 후코이단의 분자간 또는 분자내 가교결합된 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 구형의 60 nm 내지 300 nm 임을 특징으로 하는, 후코이단 나노 입자.
제10항에 있어서,
상기 나노 입자는 종양 선택성을 가짐을 특징으로 하는,
후코이단 나노 입자.
제10항에 있어서,
상기 나노 입자는 흑색종 선택성을 가짐을 특징으로 하는,
후코이단 나노 입자.
방사성 동위원소, 유기 형광물질, 무기물질인 양자점, 자기공명영상 조영제, 컴퓨터단층촬영 조영제, 양전자단층촬영 조영제, 초음파 조영제, 형광 조영제 및 상형변환물질로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표지 물질로 표지된 제10항 내지 12항 중 어느 한 항의 후코이단 나노 입자를 포함하는 조영제.
제13항에 있어서,
상기 나노 입자에 접합된 킬레이트 화합물; 및
상기 리간드 화합물에 배위결합된 방사성 동위 원소를 포함하는,
조영제.
제14항에 있어서,
상기 리간드 화합물은 NODA-GA-NH₂,DOTA-GA, DOTA, TETA 및 NOTA 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는,
조영제.
제13항에 있어서,
상기 방사성 동위 원소는 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ³⁸K, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ¹²⁴I, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ¹⁷⁷Lu, ²⁰¹Tl, ^117mSn, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁹⁰Y, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, 및 ²¹¹At 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는,
조영제.