KR102171320B1 - 기관점막 조직의 탈세포화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기관점막 조직의 탈세포화 방법 및 이를 통해 제조된 인공 기관 점막시트에 관한 것이다. 본 발명의 기관 점막 조직 탈세포화 방법은 기관 전체 조직을 동결 후 해동하여 연골이 제거된 기관 점막 조직만을 물리적으로 분리하고, 디소듐 카보네이트 (Disodium carbonate) 및 과산화수소를 포함하는 용액을 처리하여 빠른 시간 내에 기관 점막 조직의 세포를 제거하면서도 세포외 기질의 손상을 최소화할 수 있어 기관 부분 결손에 대한 재건 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 기관점막 조직의 탈세포화 방법 및 이를 통해 제조된 인공 기관 점막시트에 관한 것이다.
기관은 공기를 외부에서 체내로 유입시키는 입, 코와 산소 교환을 담당하는 폐를 연결해주는 환형태의 공기 통로로서, 연골 및 점막 조직 등으로 구성되어 있다. 기관 조직 중 점막은 위증층섬모세포 (pseudostratified ciliary columnar epithelium)으로 이루어져 있고, 하방에 점막하 구조를 가지고 있으며, 호흡기점막은 점액을 분비하여 가습효과를 이루며 섬모 운동을 통해 외부 침입 물질을 제거하고 면역 작용을 수행하는 역할을 한다.
기관 결손은 발병 원인에 따라 선천적 원인에 의한 전결손, 종양 및 외상에 의한 부분 결손으로 나뉘며, 기도 결손에 대한 치료는 발생원인과 환자의 나이 및 상태 등에 따라 다르지만 일반적으로 손상 부위의 크기, 특히 길이에 따라 결정된다. 기관 결손의 유형 중 전결손에 대한 치료는 기관 이식술 (Tracheal transplantation) 이외 치료법이 없어 기증자를 구하기가 어렵고 면역반응에 의한 기도 폐색 등의 발생으로 합병증, 사망율이 높은 문제점이 있다. 또한, 기관 부분 결손은 외상, 종양, 기관절개술 등에 의해 발생하며 현재까지는 단단 문합술이 최적의 치료법으로 알려져 있다. 그러나 이러한 치료법은 전체 기관 길이가 단축되어 경부 신전 시 봉합 부위 파열 등이 발생할 수 있어 수술 후 경부 고정술이 필요하며, 수술부위 긴장완화를 위해 기도 전체의 박리가 필요하여 후두신경이 손상될 가능성이 높은 문제점이 있다.
기관 결손에 대한 기존의 치료법의 문제점을 보완하기 위하여 탈세포화 생체재료를 이용한 결손 재건 연구가 활발히 진행되고 있다. 탈세포화 생체재료는 세포를 물리적, 화학적 방법을 통해 제거한 조직으로 면역 반응이 없어 면역 억제제 복용이 필요 없고 세포외기질 (extracellular matrix, ECM), 성장인자 보존을 통해 상처치유, 조직결손 복원능이 뛰어나 기존 장기이식을 대체할 재료로 다양한 연구가 진행 중이다. 탈세포화 생체재료로서 가장 상용화된 탈세포화 피부조직은 시트타입으로 다양한 제품이 개발되어 수술실 보관이 용이하고 재단이 간편하여 예기치 못한 결손에 즉각적 사용이 가능하여 임상에서 널리 사용 중이다. 그러나 점막부위결손의 재건에는 상용화된 탈세포화 점막조직이 없어 탈세포화 진피조직을 사용 중이나 조직의 특성이 달라 치료 적용에 한계가 있다.
기관 재건에 특이적인 탈세포화 생체재료로서 탈세포화된 사람의 기관에 줄기세포를 배양하여 이를 환자에게 이식하는 기관 전체 재건방법이 시도되었으나, 기관 내부 호흡기 점막재생에 실패하여 기도 폐색, 협착 등으로 사망하거나 면역 억제제를 복용하는 문제점이 보고되었다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 기관 결손 치료에 유용하게 활용될 수 있는 생체 이식 재료를 개발하고자 예의 노력한 결과, 기관 점막 조직만을 이용하는 신규한 탈세포화 방법을 개발하고, 상기 방법을 통해 제조된 점막시트가 생체 이식에 적합하고 재건 치료에 유용한 탈세포화 정도 및 세포외 기질을 함유하고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 기관점막 조직의 탈세포화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 탈세포화 방법에 따라 제조된 인공 기관 점막시트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 기관 점막 (tracheal mucosa) 조직의 탈세포화 방법이다.
구체적으로, 본 발명은
(a) 기관 점막 조직에 단백질 분해효소를 포함하는 용액을 처리하여 조직 내 세포간 연접을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 조직에 계면활성제를 포함하는 용액을 처리하여 조직 내 세포를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 세포가 제거된 조직에 디소듐 카보네이트 (Disodium carbonate) 및 과산화수소를 포함하는 용액을 처리하는 단계를 포함하는 기관 점막 조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
기관 조직은 연골 및 점막 조직으로 구성되어 있으며, 이들은 조직의 치밀도, 혈관 유무 및 세포의 종류 등에 따른 탈세포화 제제에 대한 반응도가 상이하여 기관 전체 조직을 이용하여 탈세포화를 수행하는 경우 세포의 제거가 불완전할 수 있으며 세포외 기질 (extracellular matrix)이 손상될 우려가 있다. 이에, 기관 점막 조직에 적합한 탈세포화 방법을 찾기 위해 처리 물질, 처리 순서, 농도, 온도, 시간 등의 각종 변수들을 변화시켜 실험을 수행하였으며, 본 발명의 탈세포화 방법은 빠른 시간 내에 기관점막 조직의 세포를 제거하면서도 세포외 기질의 손상을 최소화할 수 있다.
본 발명에 따른 기관 점막 조직의 탈세포화 방법은 (a) 기관 점막 조직에 단백질 분해효소를 포함하는 용액을 처리하여 조직 내 세포간 연접을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 (a) 단계의 기관 점막 조직은 용액 처리 전 기관 조직을 동결 후 해동하는 단계 수행한 것이 바람직하다.
본 발명에 있어 기관 점막 조직은 인간을 제외한 동물로부터 추출된 것일 수 있으며, 상기 동물은 포유류 또는 조류일 수 있다. 예를 들면, 포유류는 돼지, 소, 말 및 양 등 일 수 있으며, 조류는 닭, 오리, 거위 등일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 돼지로부터 추출된 기관 조직을 이용하였다. 상기 기관 점막의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어, 기관 점막 조직은 추출된 기관 전체 조직을 동결 후 해동하여 연골이 제거된 기관 점막 조직만을 물리적으로 분리하여 수득할 수 있다. 기관 조직 내 연골 및 점막은 조직의 치밀도, 혈관 유무 및 세포의 종류 등에 따른 탈세포화 제제에 대한 반응도가 상이하므로, 기관 점막 조직의 효율적인 탈세포화를 위해서는 기관 조직 내 연골을 제거할 필요가 있다. 기관 점막 조직만을 이용하여 탈세포화를 수행하는 본 발명은 종래의 기관 전체를 이용한 탈세포화 방법에 비해 기관 점막 조직의 특성을 더욱 유사하게 재현할 수 있는 장점이 있다.
상기 기관 조직의 동결은 -90 내지 -70℃, 바람직하게는 -85 내지 -75℃, 가장 바람직하게는 -80℃에서 48 내지 72 시간 동안 수행될 수 있으며, 해동은 15 내지 35℃, 바람직하게는 20 내지 30℃, 가장 바람직하게는 25℃에서 0.5 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 돼지로부터 추출한 기관 조직을 -80℃에서 동결하고 25℃에서 해동 후, 연골 조직을 물리적으로 제거하여 기관 점막 조직만을 분리하였다.
또한, 상기 수득한 기관 점막 조직을 탈세포화 공정을 수행할 수 있을 정도의 사이즈로 세분화시킬 수 있다. 상기 세분화시키는 방법에는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
상기 (a) 단계의 단백질 분해효소는 디스파제 (Dispase), 트립신 (Tripsin) 또는 이의 임의의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 트립신일 수 있다. 상기 (a) 단계에 있어 트립신을 처리하는 경우, 기관 점막 조직 내 세포간 연접의 효과적인 분리를 위해 EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)와의 혼합용액을 이용할 수 있다.
상기 (a) 단계는 30 내지 40℃에서 수행될 수 있으며, 상기 온도범위 내에서 수행되는 경우 기관 점막 조직 내 세포간 연접을 효율적으로 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 (a) 단계를 수행함에 있어, 30℃ 이하에서 수행되는 경우 단백질 분해효소의 활성이 저하되고, 점막조직의 변성을 유발할 수 있으며, 반대로 40℃ 이상에서 수행되는 경우 효소의 활성이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 (a) 단계를 통해 조직이 처리되면, 처리된 조직을 세척하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 조직의 세척을 위해 증류수 용액을 이용할 수 있으며, 상기 증류수에 처리된 조직을 투입한 상태에서 교반기를 이용하여 교반시키면서 세척을 진행할 수 있다. 세척이 진행되는 온도는 상기 (a) 단계와 상응하도록 30 내지 40℃에서 약 150 rpm의 교반 속도로 진행될 수 있다. 이러한 세척 단계는 동일한 조건으로 2회 이상에 걸쳐 수행될 수 있다.
본 발명의 (a) 단계는 상기 단백질 분해효소로 처리된 기관 점막 조직을 에탄올로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 에탄올 처리 단계는 2 내지 10℃에서 수행될 수 있으며, 과산화수소를 추가로 처리할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 트립신 및 EDTA 혼합용액을 처리하여 36.5℃에서 4시간 동안 150 rpm의 회전 속도로 회전하는 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 기관 점막 조직의 탈세포화 방법은 상기 (a) 단계의 조직에 계면활성제를 포함하는 용액을 처리하여 조직 내 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
계면활성제는 양친성을 갖는 물질로서 조직의 세포막과 핵막을 용해하여 세포를 제거하는 역할을 한다. 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 바람직하게는 Triton X-100 (트리톤 X-100)일 수 있다.
상기 (b) 단계는 20 내지 30℃에서 수행될 수 있으며, 상기 온도범위 내에서 수행되는 경우 기관 점막 조직 내 세포를 효율적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계는 Triton X-100이 포함된 용액을 처리하여 25℃에서 약 40시간 동안 150 rpm의 회전 속도로 회전하는 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 기관 점막 조직의 탈세포화 방법은 (c) 상기 (b) 단계의 세포가 제거된 조직에 디소듐 카보네이트 (Disodium carbonate) 및 과산화수소를 포함하는 용액을 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 탈세포화 방법에 있어, 상기 디소듐 카보네이트 (Disodium carbonate) 및 과산화수소를 포함하는 용액의 처리는 기관 점막 조직의 탈세포화 및 소독의 목적을 위해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 디소듐 카보네이트 및 과산화수소를 포함하는 용액은 디소듐 카보네이트 및 과산화수소가 1:1 내지 2의 부피비, 바람직하게는 2:3의 부피비로 혼합된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 디소듐 카보네이트 및 과산화수소를 2:3의 부피비로 포함하고, 시트르산 및 소듐 카보네이트를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 디소듐 카보네이트 및 과산화수소를 포함하는 용액은 이에 제한되지는 않으나 상업적으로 구입 가능한 과산계 소독제 또는 살균제 (peracid-based disinfectants, sterilizing agents)일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 2:3 부피비의 디소듐 카보네이트/과산화수소, 시트르산 및 소듐 카보네이트를 포함하는 Perasafe™ (Rely+On Perasafe; DuPont, Wilmington, DE, USA)를 처리하여 탈세포화를 수행하였다.
상기 디소듐 카보네이트 및 과산화수소를 포함하는 용액은 기관 조직의 탈세포화에 사용되어왔던 기존의 제제와 비교하여 기관 점막 조직에 대한 탈세포화가 탁월하며, 기관 점막 조직의 세포외기질 및 성장인자의 보존 정도가 우수한 특징을 갖는다. 또한, 저비용으로 탈세포화 및 소독 효과를 동시에 달성할 수 있는 효과가 있다.
상기 (c) 단계는 20 내지 30℃에서 수행될 수 있으며, 상기 온도범위 내에서 수행되는 경우 기관 점막 조직 내 세포를 효율적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (c) 단계는 Perasafe™을 처리하여 25℃에서 1시간 동안 150 rpm의 회전 속도로 회전하는 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 탈세포화 방법에 있어 각 모든 단계의 전후에는 각각 조직 세척 단계가 수행될 수 있으며, 상기 조직 세척에는 증류수 및 이에 항생제가 포함된 용액을 처리하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 탈세포화 방법으로 제조된 인공 기관 점막시트를 제공한다.
본 발명에 따른 인공 기관 점막시트는 생체 이식에 적합한 탈세포화 정도를 나타내면서도 세포외 기질의 손상이 최소화되어 기관 부분 결손의 치료를 위한 재건술에 용이하게 활용될 수 있다.
본 발명에 있어 기관 점막시트란, 기관 점막 조직과 유사한 특징을 가지며, 기관 결손의 재건 치료를 위해 활용되는 생체 스캐폴드 또는 지지체를 의미하는 용어로서 사용된다. 상기 시트는 기관 점막의 대체제로서 이식에 제공되는 세포층을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용어 “기관 점막시트”는 “인공 기관 점막시트”와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 기관 점막시트는, 기관이 손상, 결손된 환자에 대한 이식 재료 (기관 점막의 대체)로서 이용될 수 있다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용해 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하는 것이 바람직하다. 기관 점막의 이식이 필요한 기관 결손 환자에 적용 가능한 이식용 재료 (기관 점막형 시트)를 제공한다. 본 발명의 생체 조직 시트는, 기관 점막 등의 재생 (재건)에 사용될 수 있으며, 예를 들면, 본 발명의 생체 조직 시트를 기관의 결손부에 직접 이식할 수 있다.
상기 점막시트의 두께는 350 내지 550 ㎛ 일 수 있다.
본 발명의 인공 기관 점막시트의 제조를 위한 탈세포화 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 기관 점막 조직 탈세포화 방법은 기관 전체 조직을 동결 후 해동하여 연골이 제거된 기관 점막 조직만을 물리적으로 분리하고, 디소듐 카보네이트 (Disodium carbonate) 및 과산화수소를 포함하는 용액을 처리하여 빠른 시간 내에 기관 점막 조직의 세포를 제거하면서도 세포외 기질의 손상을 최소화할 수 있어 기관 부분 결손에 대한 재건 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 설계한 다섯 개의 탈세포화 프로토콜 및 그에 따른 대조군 (Native, 본래 조직) 및 실험군 (동결-해동만 거친 FT 그룹; 탈세포화 과정을 거친 wFTP, mFTD 및 mFTP 그룹) 분류를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 탈세포화 방법에 의해 제조된 돼지의 기관 점막시트를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트의 dsDNA 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트 중 mFTP 그룹의 H&E 염색 결과를 이용하여 시트 내 핵 포함 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트의 H&E 염색 결과를 이용하여 시트 내 핵 포함 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트의 프로테오글리칸 및 콜라겐 함량, 면역조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. Safranin O 염색에 있어서 파란색은 콜라겐을 의미하며, 그 외 염색 결과에서 짙은 갈색은 양성임을 의미한다 (Scale bar=100 μm).
도 7은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 백혈구 공통항원 CD45에 대한 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막 내 콜라겐 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 형태학적 특성을 관찰하기 위해 점막 조직 내강 및 단면을 SEM으로 분석한 결과를 나타낸 것이다 (Scale bar = 1 μm).
도 10 및 도 11은 본래 조직 및 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 세포 독성 및 생체적합성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 탈세포화 방법에 의해 제조된 돼지의 기관 점막시트를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트의 dsDNA 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트 중 mFTP 그룹의 H&E 염색 결과를 이용하여 시트 내 핵 포함 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트의 H&E 염색 결과를 이용하여 시트 내 핵 포함 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막시트의 프로테오글리칸 및 콜라겐 함량, 면역조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. Safranin O 염색에 있어서 파란색은 콜라겐을 의미하며, 그 외 염색 결과에서 짙은 갈색은 양성임을 의미한다 (Scale bar=100 μm).
도 7은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 백혈구 공통항원 CD45에 대한 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막 내 콜라겐 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 형태학적 특성을 관찰하기 위해 점막 조직 내강 및 단면을 SEM으로 분석한 결과를 나타낸 것이다 (Scale bar = 1 μm).
도 10 및 도 11은 본래 조직 및 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 세포 독성 및 생체적합성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험군 간의 dsDNA 무게, 콜라겐 함량, 세포 생존력 및 증식 결과의 차이를 확인하기 위해 Wilcoxon signed-rank test를 사용하였으며 p<0.05를 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 통계 분석에는 SPSS 소프트웨어 (v19; IBM Crop., Armonk, NY, USA)를 사용하였으며, 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
실시예
1. 기관 점막 조직의 준비
본 발명의 탈세포화 대상이 되는 기관 점막 조직을 준비하기 위하여, 육가공업체 (포크랜드, 천안)에서 후두 아래에서 기관 분기부 (carina) 전까지 15 ~ 20cm의 성돈의 기관 (trachea)을 얼음이 충전된 아이스박스에 보관된 상태로 구입하여 사용하였다.
상기 구입한 돼지 기관 조직을 1% Antibiotic-Antimycotic (Gibco, Grand Island, NY, USA) 25 μg/mL이 포함된 용액에 담그고 150 rpm으로 밤새교반하여 혈장, 잔해물 및 미생물을 제거하여 세척하였다.
그 다음, 기관 점막을 탈세포화 프로토콜에 따라 하기 다섯 개 그룹으로 나누었다. 기관 세척 후 연골 조직을 물리적으로 제거하여 수득한 기관 점막 조직을 Native 그룹으로 정의하였으며, Native 그룹을 제외한 모든 그룹의 기관은 -80℃에서 동결 후 25℃의 웜 배스에서 30분 동안 해동하는 과정을 거쳤다. 본 발명에서 사용한 탈세포화 프로토콜을 도 1에 나타내었다.
1. 기관 (trachea) 세척 후 연골로부터 분리된 기관 점막: Native
2. 동결 (Freezing)-해동 (Thawing) 후 연골로부터 분리된 기관 점막: FT
3. 동결-해동 후, 기관 점막 분리 전 Perasafe 기반 계면활성제-효소 포함 용액으로 탈세포화: wFTP
4. 동결-해동 후, 기관 점막 분리 후 DNase 기반 계면활성제-효소 포함 용액으로 탈세포화: mFTD
5. 동결-해동 후, 기관 점막 분리 후 Perasafe 기반 계면활성제-효소 포함 용액으로 탈세포화: mFTP
실시예
2. 기관 점막 조직의 탈세포화
2-1. 탈세포화 프로토콜 처리 순서 - FTP 그룹 (
wFTP
,
mFTP
)
탈세포화 단계에서 Perasafe 기반 계면활성제-효소 포함 용액을 사용한 wFTP 및 mFTP 그룹은 탈세포화 프로토콜 처리 순서를 제외하고는 동일한 방법으로 탈세포화를 진행하였다 (기관으로부터 기관 점막 분리 전 탈세포화 프로토콜을 적용: wFTP, 기관으로부터 기관 점막 분리 후 탈세포화 프로토콜을 적용: mFTP). 실시예 1에서 수득한 돼지의 기관 점막 조직을 증류수 내에 담그어 4℃에서 30분 동안 세척하였으며, 이를 2회 반복하였다. 상기 세척된 조직을 0.25% 트립신 및 0.05% EDTA (Gibco)가 포함된 혼합용액으로 36.5℃에서 4시간 동안 처리하고, 증류수로 30분 및 1시간씩 각각 2회 반복하여 세척하였다. 다음으로, 상기 조직에 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 25℃에서 하룻밤 동안 및 24시간씩 나누어 처리하고, 증류수로 30분 및 1시간씩 각각 2회 반복하여 세척하였다. 다음으로, Triton-X 100으로 처리된 조직을 Perasafe 기반 계면활성제-효소 포함 용액, 구체적으로 2:3 부피비의 디소듐 카보네이트 및 과산화수소, 시트르산 및 소듐 카보네이트를 포함하는 용액 (Perasafe™)으로 1시간 동안 처리하고 증류수로 30분 및 1시간씩 2회 세척하였다. 세척이 완료된 조직을 4℃에서 항생제인 1% Antibiotic-Antimycotic 용액이 포함된 PBS 상에 보관하였다. 상기 모든 과정은 25℃에서 150 rpm의 속도로 교반 하에 진행하였다 (VWR International, Pittsburgh, PA, USA).
2-2. 탈세포화 프로토콜 처리 용액 -
mFTD
그룹
mFTD 그룹은 탈세포화 단계에서 Perasafe 기반이 아닌 DNase 기반 계면활성제-효소 포함 용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2-1의 mFTP 그룹과 동일한 순서로 탈세포화를 진행하였다 (기관으로부터 기관 점막 분리 후 탈세포화 프로토콜을 적용). 실시예 1에서 수득한 돼지의 기관 점막 조직을 증류수 내에 담그어 4℃에서 30분 동안 세척하였으며, 이를 2회 반복하였다. 상기 세척된 조직을 0.25% 트립신 및 0.05% EDTA (Gibco)가 포함된 혼합용액으로 36.5℃에서 4시간 동안 처리하고, 증류수로 30분 및 1시간씩 각각 2회 반복하여 세척하였다. 다음으로, 상기 조직에 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 25℃에서 하룻밤 동안 및 24시간씩 나누어 처리하고, 증류수로 30분 및 1시간씩 각각 2회 반복하여 세척하였다. 상기 Triton X-100으로 처리한 조직을 DNase 기반 계면활성제-효소 포함 용액, 구체적으로 DNase I (100 U/mL, Sigma-Aldrich)로 37℃에서 6시간 동안 처리하고, 증류수로 30분 및 1시간씩 각각 2회 반복하여 세척하였다. 세척이 완료된 조직을 4℃에서 항생제인 1% Antibiotic-Antimycotic 용액이 포함된 PBS 상에 보관하였다. 상기 모든 과정은 25℃에서 150 rpm의 속도로 교반 하에 진행하였다 (VWR International, Pittsburgh, PA, USA).
실시예
3.
탈세포화된
기관
점막시트의
특성 확인
실시예 2의 탈세포화를 거친 기관 점막시트의 특성을 확인하였다.
먼저 상기 제조된 점막시트의 크기 및 두께를 측정한 결과, 그 길이는 9 ~ 10 cm, 너비는 2 ~ 3 cm 이였으며, 두께는 375 ~ 518.75 ㎛로 확인되었다. 상기 제조된 점막시트 중 기관으로부터 기관 점막 분리 후 탈세포화 프로토콜을 적용한 점막시트 (mFTP)를 도 2에 나타내었다.
3-1. DNA 정량화
본 발명에 따라 제조된 기관 점막시트의 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen)를 사용하여 분리하고, Quan-iT Picogreen dsDNA Assay kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 점막시트 내 총 DNA 함량을 분석하였다. 구체적으로, 실시예 2의 탈세포화된 기관 점막 조직 및 탈세포화 되지 않은 기관 점막 본래의 조직 (Native tissue)을 100 μl의 프로테이나아제 (proteinase) K로 65℃에서 밤새 분해하고, 제공된 완충액 및 미니-컬럼을 사용하여 DNA를 단리하였다. 그 다음 상기 단리된 DNA를 Quan-iT Picogreen dsDNA 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific) 및 마이크로플레이트 리더 (Synergy H1; Biotek, Vermont, USA)를 사용하여 520nm에서 형광 방출을 측정하여 정량화하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 탈세포화되지 않은 기관 점막 본래의 조직 내 DNA의 총 함량은 평균 3373.8 ng/mL 인 반면 (Native: 3996.8 ± 1810.2 ng/mg, FT: 2524.8 ± 568.1 ng/mg, p<0.01), 본 발명의 방법에 따라 탈세포화된 점막시트 내 DNA의 총 함량의 평균은 14.153 ng/mL, 그 범위는 1.329 ~ 31.704 ng/mL으로 본 발명의 탈세포화 방법에 따라 기관 점막 조직 내 DNA가 현저히 제거되었음을 확인하였으며, 이는 생체 이식용 스캐폴드의 탈세포화 적합성의 기준이 되는 50 ng/mL 이하 (Biomaterials, vol. 32, no. 12, pp. 3233-3243, 2011)에 부합되는 것이다. 특히, DNase 기반 계면활성제-효소 포함 용액과 비교하여 (mFTD) Perasafe 기반 계면활성제-효소 포함 용액의 탈세포화 효율이 현저히 높음을 확인하였으며 (wFTP, mFTP), 나아가 기관 동결-해동 후, 탈세포화 용액 처리 전 기관 점막을 분리한 mFTP 그룹에서 기관 점막 조직 내 dsDNA가 가장 현저히 제거되었음을 확인하였다.
3-2. 조직학적 분석
본 발명에 따라 제조된 기관 점막시트의 탈세포화 정도를 H&E 염색을 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 실시예 2에서 제조한 점막시트를 10% 포름알데하이드 용액 (Sigma-Aldrich) 으로 고정시키고 파라핀에 끼운 후 4μm 두께의 절편으로 절단하였다. 그 다음 상기 절편 슬라이드의 탈파라핀 및 탈수 후 H&E (hematoxylin and eosin) 및 Masson's trichrome으로 염색하고 염색된 절편을 광학현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 400배율에서 관찰하여 핵 염색 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 점막 조직 탈세포화 그룹인 wFTP, mFTD 또는 mFTP에서 핵이 염색되지 않음을 확인하였다.
또한, 조직 내 프로테오글리칸 및 콜라겐 함량을 측정하기 위해 safranin-O 염색을 수행하였다. 나아가, 면역조직학적 분석을 위해, 상기 절편 슬라이드의 탈파라핀 및 탈수 후 각 절편을 0.05% Triton X-100 (PBST; Sigma-Aldrich)을 포함하는 PBS로 세척하고, 37℃ 및 펩신 용액 (GBI Labs, Bothell, WA, USA) 내에서 20분 동안 배양한 뒤 PBST로 세 번 세척 하였다. 각 절편을 콜라겐 Ⅰ형, 콜라겐 IV형, 사이토케라틴 (cytokeratine) V, 피브로넥틴, 라미닌, 상피성장인자 (epidermal growth factor) 및 CD45 (leukocyte common antigen) (Origene, Rockville, MD, USA)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. PBST로 세척 후, 각 절편을 비오티닐화된 2차 항체 (GBI Labs)로 1시간 및 streptavidin-HRP (GBI Labs)로 1시간 동안 처리한 후 DAB 용액 (GBI Labs)을 사용하여 시각화하였다. 염색 후, 각 절편을 젤라틴 코팅 슬라이드에 마운팅하여 명시야 현미경 (Optinity KCS-31S; Korea Lab Tech, Seoul, Korea) 및 OptiView 3.7 software (Korea Lab Tech)를 사용하여 이미지를 얻었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, safranin-O 염색 결과를 통해 본 발명에 따른 탈세포화 방법에 따라 기관 점막 조직을 탈세포화 시킨 후에도 콜라겐 섬유가 남아있음을 확인하였다. 또한, 면역조직화학 염색 결과를 통해 콜라겐 Ⅰ형, 콜라겐 IV형, 사이토케라틴 V, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포외기질 (ECM)이 탈세포화된 세포막에도 모두 존재함을 확인하였다. 혈관내피성장인자 (VEGF)도 탈세포화된 부위에서 양성임을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 탈세포화 기관 점막의 백혈구 공통항원 CD45에 대한 염색 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, mFTP 그룹은 CD45 음성으로 나타나, FT 그룹 및 perasafe를 기관 점막 분리 이전에 처리한 wFTP 그룹과 비교하여 매우 낮은 항원성 (antigenicity)을 보임을 확인하였다.
3-3. 콜라겐 함량 분석
본 발명에 따라 제조된 기관 점막시트 내 세포외기질 함량을 측정하였다. 구체적으로, 실시예 2의 탈세포화된 기관 점막시트와 탈세포화 되지 않은 본래의 조직의 콜라겐 (collagen)을 Sircol Soluble Collagen Assay Kit (Biocolor, Cat. No S1000)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 함량을 측정하였다. 먼저 1mg의 동결건조 시료를 4℃에서 1주일 간 펩신 용액(0.5 M 아세트산 내 0.1 mg/mL 펩신) 1ml로 가수분해하였다. 중화시킨 후, 분리 및 농축 시약을 사용하여 콜라겐을 분리하고, 시료 100μL를 10mL 염료에 첨가하여 30분 동안 교반한 후 19,000g에서 10분간 원심분리하였다. 알칼리 시약을 사용하여 펠렛으로부터 염료를 방출시키고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 555nm에서의 흡광도를 측정하였다 (Synergy H1; Biotek, Vermont, USA). 0.3mL 당 5 μg to 100 μg 범위에서 키트와 함께 제공된 콜라겐 Ⅰ형을 포함하는 표준 그래프를 사용하여 절대값을 얻었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 탈세포화 방법에 따라 제조된 기관 점막 시트 내 콜라겐 함량은 탈세포화가 수행되지 않은 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않음을 확인하였다 (p>0.05). 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 탈세포화 방법은 세포의 성장 및 발달에 지지 역할을 하는 세포외 기질을 효과적으로 보존시킴을 확인하였다.
3-4. 전자현미경 분석
mFTP 그룹의 점막의 형태학적 특성을 관찰하기 위해 점막 조직 내강 및 단면을 SEM으로 분석하였다. 시료를 실온에서 2.5% 글루타르알데히드에서 하룻동안 고정시키고, 증류수로 세척 후 100% 에탄올을 사용하여 탈수시켰다. 상기 시료를 platinum sputter-coater (208HR; Cressington Scientific Instruments, Watford, UK)로 코팅한 후 알루미늄 스터브 (stub)에 마운팅하였다. 필드-방사주사 전자 현미경 (FE-SEM; JSM-6700F; JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 이미지를 얻었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, mFTP 그룹의 점막 조직 내강은 매끄러운 표면을 보인 반면, 단면은 섬유상의, 다공성 구조를 보여 세포 부착에 유리함을 확인하였다.
3-5. 세포독성, 세포적합성 분석
본래 조직 및 탈세포화 조직의 세포 독성을 확인하기 위해, 공극 크기가 3μm인 Transwell inserts (Corning, Corning, NY, USA)를 사용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포 (tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSCs)와 막을 공동배양하였다. 구체적으로, TMSC를 하부 구획에, 기관 점막 조직을 상부 구획에 위치시켜 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) 내에서 배양하고, DMEM 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 1일, 2일, 3일차 TMSC 증식 정도를 EZ-Cytox cell viability assay kit(Daeil Lab Service, Seoul, Korea)으로 측정하고, 각 기관 점막 조직의 세포독성을 다음 수학식을 사용하여 계산하였다.
[수학식 1]
RGR (relative growth rate, 상대적 세포 성장) = (각 그룹의 평균 O.D) / (음성 대조군의 평균 O.D) × 100%
Butler CR, et al (Biomaterials 2017; 124:95-105)의 방법으로 세포적합성 (cytocompatibility) 평가를 수행하였다. 구체적으로, 본래 조직 및 탈세포화 조직을 biopsy punch (Ellis Instrument, Madison, NJ, USA)를 사용하여 5mm의 디스크로 절단하였다. 세포를 시딩하기 전에, 점막 조직은 내강면이 위를 향하도록 96-웰 플레이트에서 배양하고 DMEM 200 μL에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후, TMSC를 1 × 104개/웰로 시딩한 후 하룻밤 동안 두었다. 내강면이 위를 향하도록 유지한 채로 점막 조직을 새로운 플레이트에 이동시킨 뒤, EZ-Cytox cell viability assay kit를 사용하여 1일, 2일, 3일차 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, RGR을 통해 확인한 각 그룹의 세포 독성은 1일, 2일, 3일차 모두 본래 조직과 탈세포화 조직 간에 큰 차이가 없었다. 한편, 도 11에 나타낸 바와 같이, 1일, 2일, 3일차에 측정된 TMSC의 세포 생존력을 확인한 결과, 탈세포화 점막 조직이 본래 조직보다 높은 TMSC 증식률을 보이며 (p<0.01), 그 중 perasafe를 기관 점막 분리 이후에 처리한 mFTP 그룹이 현저히 높은 TMSC 증식률을 보임을 확인하였다.
실시예
4.
In
vivo
생체적합성 분석
본 발명에 따른 탈세포화 방법에 의해 제조된 기관 점막시트의 in vivo 생체적합성을 분석하였다. 모든 실험은 이화 의학 연구소 (Ewha Medical Research Institute)의 동물관리위원회 승인 하에 진행하였다. 20~25g의 C57BL/6 수컷 마우스 (Orient Bio, Seoul, Korea) 18마리를 SHAM (음성대조군), 본래 조직 (native mucosa) 및 탈세포화 기관 점막 조직 각각을 이식한 3그룹으로 나누었다. 탈세포화 기관 점막 조직으로는 동결 (Freezing)-해동 (Thawing) 후 연골로부터 분리된 기관 점막 (FT 그룹) 및 동결-해동 후, 기관 점막 분리 후 Perasafe 기반 계면활성제-효소 포함 용액으로 탈세포화한 기관 점막 (mFTP 그룹)을 사용하였다.
모든 동물들은 실험 전 적어도 7일 동안 명암주기 (12시간)에 두었으며, 사료와 물은 자유 급이 하였다. 3그룹 모두 등쪽 정중선에서 0.5cm 떨어진 위치에서 1cm 수직 절개하고, SHAM 그룹을 제외한 나머지 두 그룹은 양쪽으로 피하층을 박리하여 포켓 (pocket)을 만든 다음 지름 8mm의 탈수된 원형의 점막 조직을 삽입하였다. 3일, 2주, 5주 후 마우스를 희생시키고 점막을 회수하여 조직학적 분석을 수행하였다. 실험 동물의 관리 및 사용에 있어서 National Institute of Health(NIH)의 가이드 (Care and Use of Laboratory Animals) 및 이화 의학 연구소의 동물 실험 지침을 따랐다.
회수된 점막 조직을 4% 파라포름알데히드 용액 (Biosesang, Seong-nam, Korea)에 고정시킨 후 파라핀에 끼워 4μm 두께의 절편으로 절단하였다. 그 다음 상기 절편 슬라이드의 탈파라핀 및 탈수 후 H&E (hematoxylin and eosin)로 염색하고 본래 조직 및 이식되었던 점막 조직의 조직학적 점수를 하기 표 1와 같이 등급화하여 3일, 2주, 5주 후의 in vivo 생체적합성을 분석하였다.
| Score | 3 | 2 | 1 | 0 |
| Day 3 | ||||
| 세포침윤(Cellular infiltration, 40x) | >150 cells | 75-150 cells | 1-75 cells | 0 cells |
| 분해(Degradation) | No scaffold present | Some scaffold present | Mostly present | No degradation |
| 캡슐화(Encapsulation) | No encapsulation | Minimal encapsulation | Moderate encapsulation | Dense encapsulation |
| 염증성 세포 응집 (40x) | 0 cells | 1-75 cells | 75-150 cells | >150 cells |
| Day 14 | ||||
| 세포침윤(Cellular infiltration, 40x) | >150 cells | 75-150 cells | 1-75 cells | 0 cells |
| 연결조직(collective tissue organization) | Highly organized connective tissue present |
Moderately organized connective tissue present |
Unorganized connective tissue throughout disrupted original scaffold | Original scaffold intact |
| 분해(Degradation) | No scaffold present | Some scaffold present | Mostly present | No degradation |
| 캡슐화(Encapsulation) | No encapsulation | Minimal encapsulation | Moderate encapsulation | Dense encapsulation |
| 다핵거대세포(40x) | 0 cells | 1 cell | 2-5 cells | >5 cells |
| 혈관분포 (vascularity, 40x) |
>10 vessels | 6-10 vessels | 2-5 vessels | 0-1 vessel |
| Day 35 | ||||
| 연결조직(collective tissue organization) | Highly organized connective tissue present |
Moderately organized connective tissue present |
Unorganized connective tissue throughout disrupted original scaffold | Original scaffold intact |
| 분해(Degradation) | No scaffold present | Some scaffold present | Mostly present | No degradation |
| 캡슐화(Encapsulation) | No encapsulation | Minimal encapsulation | Moderate encapsulation | Dense encapsulation |
| 혈관분포 (vascularity, 40x) |
0 cells | 1 cell | 2-5 cells | >5 cells |
그 결과, 탈세포화 그룹 중 perasafe를 기관 점막 분리 이후에 처리한 mFTP 그룹이 14.5점, 얼렸다 녹인 FT 그룹이 21.5점으로 mFTP 그룹이 현저히 우수한 생체적합성을 나타냄을 확인하였다. 특히, 3일째에는 본래 조직 이식군에서 급성 염증 세포 응집이 더 많이 나타남을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 기관 점막을 탈세포화시키는 방법에 있어서, 기관 조직을 세척 후 연골 조직을 물리적으로 제거하여 기관 점막 조직을 수득하고, 상기 점막 조직을 -80℃에서 동결 및 25℃에서 해동한 뒤, 기관 점막 분리 후 디소듐 카보네이트 (Disodium carbonate) 및 과산화수소를 포함하는 Perasafe 기반 용액을 처리하여 탈세포화시킨 mFTP 그룹의 생체적합성이 가장 우수함을 확인하였다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 탈세포화 방법이 처리 물질과 처리 순서를 최적화함에 따라 빠른 시간 내에 기관 점막 조직의 세포를 제거하면서도 세포외 기질의 손상을 최소화할 수 있으며, 이로부터 제조된 인공 기관 점막시트가 기관 부분 결손에 대한 재건 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- (a) 기관(trachea) 세척 후, 동결한 후 해동하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 기관에서 물리적으로 연골을 제거하여 기관조직을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 조직에 단백질 분해효소를 포함하는 용액을 처리하여 조직 내 세포간 연접을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 조직에 디소듐 카보네이트(Disodium carbonate), 과산화수소, 시트르산 및 소듐 카보네이트를 포함하는 계면활성제 용액을 처리하여 탈세포화하는 단계;를 포함하는 기관 점막 조직의 탈세포화 방법. - 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 기관(trachea)은 돼지에서 추출된 것인, 기관 점막 조직의 탈세포화 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 단백질 분해 효소는 디스파제 (Dispase) 및 트립신 (Tripsin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 기관 점막 조직의 탈세포화 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 30 내지 40℃에서 수행되는 것인, 기관 점막 조직의 탈세포화 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 계면활성제 용액 처리 전, 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 처리하여 탈세포화하는 단계;를 더 포함하는, 기관 점막 조직의 탈세포화 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 계면활성제 용액의 디소듐 카보네이트 및 과산화수소는 1:1 내지 2의 부피비로 혼합된 것인, 기관 점막 조직의 탈세포화 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 20 내지 30℃에서 수행되는 것인, 기관 점막 조직의 탈세포화 방법.
- 제1항 내지 제2항, 제5항 내지 제8항, 제10항 중 선택되는 어느 한 항의 탈세포화 방법으로 제조된 인공 기관 점막시트.
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