KR102170282B1 - α,ω-디올류 생산하는 재조합 미생물 및 α,ω-디올류의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 α,ω-디올류 합성방법 및 이를 이용한 재조합 미생물은 높은 합성 효율을 가지며, 부가적인 환경 오염의 문제를 일으키지 않는 장점이 있다. 또한, 출발물질의 사슬길이를 통해서 α,ω-디올의 사슬 길이를 조절할 수 있어, 중쇄 내지 장쇄의 α,ω-디올을 쉽게 합성할 수 있으므로, 폴리우레탄 또는 폴리에스테르의 원료 생산에 매우 효과적이며, 지방산을 출발물질로 이용할 수 있어, α,ω-디올의 합성 단가를 낮추는 비용절감 효과도 갖는다.

Description

α,ω-디올류 생산하는 재조합 미생물 및 α,ω-디올류의 생산방법{RECOMBINANT MICROORGANISM PRODUCING α,ω-DIOLS AND PRODUCING METHOD FOR α,ω-DIOLS}

본 발명은 α,ω-디올류를 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 α,ω-디올류를 합성하도록 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 배양하여 α,ω-디올류를 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 몇 년 동안 폴리머 산업에서 석유 기반 제품을 대체하기 위해 재생 가능한 원료에서 추출한 원료의 이용과 이의 바이오 공정의 개발이 급속히 증가했다[1-3]. 이것은 미래의 석유 자원 부족에 대한 우려뿐만 아니라 녹색 생산을 고려한 것이다[4,5]. 화학촉매반응(catalysis)과 비교하여 생촉매반응(biocatalysis)은 고효율, 증가된 안정성, 높은 수준의 선택성(regio-, chemo-, 및 enantio-) 및 안전한 반응 조건과 같은 수많은 이점을 갖는다[6, 7]. α,ω-디올은 폴리에스테르 및 폴리우레탄의 제조를 위한 모노머로 사용된다[1,2]. 현재, 산업 규모의 제조는 단쇄 디올 생합성에만 국한되어 있고, 중쇄와 장쇄의 α,ω-디올(C₈-C₁₆)에 대한 연구는 미흡한 실정이다[8,9]. α,ω-디올( >C₁₂)의 미생물 합성은 원래 칸디 다(Candida) 속의 몇몇 효모 종에서 보고되었다. 알칸(alkane)을 이용한 α,ω-디올(C₅-C₁₂) 합성에 대해서 대장균(Escherichia coli)에서 아시네토박터 속 OC4(Acinetobacter sp. OC4) 유래의 시토크롬 P450(CYP5153A)을 사용하는 미생물 합성이 추가로 보고되었는데, 최대 수득물은 1,8-옥탄디올(722mg/L)이었다 [10,13]. 알칸으로부터 α,ω-디올을 생산하는 능력은 마이크로박테리움 메리눔(Mycobacterium merinum) 유래의 CYP153A16 및 폴라로모나스 속 JS666 균주(Polaromonas sp. JS666)의 CYP153A34의 in vitro 생촉매(biocatalytic) 반응에서도 보고되었다. CYP153A16은 C₈-C₁₂ α,ω-디올을 생산하였고, CYP153A34는 C₈-C₉ α,ω-디올을 각각 생산하였다. 그러나 α,ω-디올의 전체 수율은 1mM 기질로부터 3~12%에 불과했다. 유전공학적으로 조작된 P450BM3을 사용하여 대장균에서 α,ω-디올 생산을 위한 재생 가능한 중쇄 지방 알콜을 사용하는 보고서가 한 건 있었다[9]. 중쇄와 장쇄 α,ω-디올의 미생물 합성은 낮은 생산량, 낮은 생산성, 사용된 효소의 기질 범위가 좁은 것과 같은 주요 문제를 안고 있다[9,13,15]. 몇몇 준비 규모(preparative scale)의 반응이 보고되어 있지만[13], α,ω-디올의 미생물 합성의 어려움을 극복하기 위한 새로운 방법이 강하게 요구된다.

식물성 오일 유도체(예: 유리 지방산)는 가장 중요한 재생 가능한 자원 중 하나이다[1,2]. 그러나, 친환경 공정에 좋은 출발 물질로 작용할 수 있는 유리 지방산(free fatty acid, FFA)으로부터 α,ω-디올의 생산을 포함하는 디올을 고효율로 합성하는 방법에 대한 연구는 아직도 미흡한 실정이다.

구체적으로 국제 특허 공개번호 WO2013-116029에서는 시클로도데카논의 산화로부터 생산된 라우릴 락톤의 환원에 의하여 1,12-도데칸디올 만을 생산하는 방법을 개시하고 있으나, 화학적 합성방법으로 환경적인 수반하고, 출발물질로 지방산을 사용하는 방법에 대한 언급이 전혀 없고, 다양한 길이의 α,ω-디올을 합성할 수 있는 방법을 제시하지 못한다.

또한, 비특허 문헌인 Scheps , D. 등(2011)에는 알칸 화합물로부터 시토크롬 p450 효소를 이용하여 α,ω-디올을 생산하는 공정이 개시되어 있으나, 지방산을 출발물질로 사용하는 방법에 대한 언급이 없고, 상기 방법에 의한 생성물이 매우 낮은 문제가 여전히 존재한다(Scheps, D. et al, Organic & Biomolecular Chemistry 2011, 9, 6727-6733)

따라서, 고수율의 환경적인 문제를 많이 일으키지 않으면서도, 가격적인 면에서 효율적인 α,ω-디올의 생산방법에 대한 연구는 여전히 요구되고 있다.

국제특허공보 WO2013-116029

상기한 본 기술분야의 필요성을 충족하기 위해서, 본 발명은 유리 지방산(free fatty acid, FFA)을 기질로하여 중쇄 또는 장쇄의 α,ω-디올류 화합물을 생산하는, 고효율의 순차적 생촉매 합성방법을 제공한다.

본 발명자들은 일 양태로, CYP153A 모노옥시게나제를 사용하여 지방산으로부터 말단 수산화 지방산을 생성하고, 카르복실산 환원효소(CAR)를 통해 상기 지방산의 말단 수산화기를 알데하이드로 전환한 다음 대장균 내인성 알데하이드 환원효소(ALR)를 통해 다른 일 말단의 수소를 환원시켜, 유리 지방산(FFA)으로부터 중쇄 또는 장쇄의 α,ω-디올을 생산하는 방법을 구축하였으며, 상기 합성을 위해 모노옥시게나제를 발현하는 재조합 미생물;과 카르복실산 환원효소 및 알데하이드 환원효소를 발현하는 재조합 미생물을 구축하였고, 본 발명의 재조합 미생물을 이용한 생합성 방법에 의하는 경우 비용은 절감하면서, 고효율로 α,ω-디올을 생산할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 일 실시예를 통해 오메가-위치에 대한 예외적인 레지오선택성(regioselectivity, >95%)을 갖는 생촉매인 Marinobacter aquaeolei(MaqCYP153A33)의 CYP153A33을 사용하여 유리지방산의 수산화(hydroxylation)를 수행하였고, ω-수산화 유리지방산의 카르복실산 작용기를 이에 상응하는 알데하이드기로 선택적으로 환원시키는데 Mycobacterium marinum의 카르복실산 환원효소(MmCAR)를 사용하였으며, 대장균(E. coli) 세포를 이용하여 내인성 알데하이드 환원 효소(ALR)를 통해 ω-수산화 지방 알데하이드에서 α,ω-디올로 효율적으로 전환시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 (a) 상기 중 수산화 지방산을 기질로 포함하는 배지에서, 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 포스포판테티에닐 전이효소(phosphopantetheinyl transferase; PPTase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 배양하여 α,ω-디올을 생산하는 것;을 포함하는 α,ω-디올의 생산방법을 제공한다.

상기 (a)를 수행하기 전에, 기질로서 지방산을 포함하는 배지에서, 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자; 푸티다레독신 환원효소 CamA(Putidaredoxin reductase CamA)를 코딩하는 유전자; 및 푸티다레독신 환원효소 CamB(Putidaredoxin reductase CamB)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 배양하여 수산화 지방산을 생산하는 것; 을 더 포함할 수 있다.

상기 재조합 미생물 배양은 pH 6.0 내지 pH 9.0에서 수행될 수 있다.

상기 배지 내 수산화 지방산의 농도는 40mM 이하일 수 있다.

상기 (a)의 재조합 미생물은 포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase; GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리포스페이트 키나아제 2(polyphosphate kinase 2; PPK2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 것을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 일 양태로, 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자; 푸티다레독신 환원효소 CamA(Putidaredoxin reductase CamA)를 코딩하는 유전자; 및 푸티다레독신 환원효소 CamB(Putidaredoxin reductase CamB)를 코딩하는 유전자를 포함하는 기질로서 지방산으로부터 수산화 지방산을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 또 다른 일 양태로, 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 포스포판테티에닐 전이효소(Sfp)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 기질로서 수산화 지방산으로부터 α,ω-디올 생산능을 갖는 재조합 미생물을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터에 포함되며, 상기 발현벡터는 pET24ma, pETduet1 및 pQE-80L로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 α,ω-디올 합성을 위한 재조합 미생물은 높은 합성 효율을 가지며, 부가적인 환경 오염의 문제를 일으키지 않는 장점이 있다. 또한, 출발물질의 사슬길이를 통해서 α,ω-디올의 사슬 길이를 조절할 수 있어, 중쇄 내지 장쇄의 α,ω-디올을 쉽게 합성할 수 있으므로, 폴리우레탄 또는 폴리에스테르의 원료로서 α,ω-디올을 생산하는데 매우 효과적이며, 지방산을 출발물질로 이용할 수 있어, α,ω-디올의 합성 단가를 낮추는 비용절감 효과도 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유리 지방산(FFA)으로부터 중쇄 또는 장쇄 α,ω-디올(C₈-C₁₆)의 생합성에 대한 개략도이다: 를 보여줍니다. w-OHFAs, ω-수산화 지방산(w-hydroxy fatty acids); ω-OHFAlds, ω-수산화 지방 알데하이드(w-hydroxy fatty aldehydes).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 α,ω-디올의 in vivo 생합성 결과를 보여주는 그래프이다. MmCAR 및 Sfp를 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용하여 α,ω-디올의 생합성을 확인하였고, 반응 조건은 다음과 같다: 기질; 10mM ω-OHFA(C₈-C₁₆), 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코스(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5), 세포 OD₆₀₀; 30.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 α,ω-디올의 in vivo 생합성 결과를 보여주는 그래프이다. MmCAR 및 Sfp를 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용하여 α,ω-디올의 생합성을 확인하였고, 반응 조건은 다음과 같다: 기질; 30mM ω-OHDDA, 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코스(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀; 30.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 MaqCYP153A33, CamA 및 CamB를 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용하여 w-OHFAs의 in vivo 합성 결과를 보여주는 그래프이다. 반응 조건: 기질; 10mM 유리지방산(FFA)(C₈-C₁₆), 부피; 250mL 플라스크에 50mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코스(w/v)를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀: 30. ω-OHOA, ω-히드록시 옥 탄산; ω-OHDA, ω-히드록시데칸산; ω-OHDDA, ω-히드록시도데칸산; ω-OHTDA, ω-히드록시 테트라데칸산; ω-OHHDA, ω-히드록시 헥사데칸산.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 MmCAR 및 Sfp를 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용하여 α,ω-디올의 in vivo 합성 결과를 보여주는 그래프이다. 반응 조건: 기질; 3mM 생체 내 변환된(biotransformed) ω-OHFA(C₈-C₁₆), 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코스(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀: 30.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 MmCAR 및 Sfp를 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용하여 α,ω-디올의 in vivo 합성 결과를 보여주는 그래프이다. 반응 조건: 기질; 7mM 생체 내 변환된 ω-OHDDA, 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코스(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀; 30.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 시스템의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 MmCAR(~ 128kDa) 및 Sfp(~ 27.26kDa)를 발현하는 재조합 대장균의 SDS PAGE 분석 결과이다: C, 대조군(control); M, Marker; TC, 총 세포(total cells); IP, 불용성 단백질(insoluble protein); SP, 가용성 단백질(soluble protein). 단백질 발현은 30℃, 200rpm에서 0.1mM IPTG를 사용하여 수행.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 활성 MmCAR에 대한 Sfp의 효과를 보여준다. 반응 조건: Sfp를 갖거나/갖지 않는 MmCAR을 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포. 기질; 10mM 벤조산, 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코즈(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀; 30. 대조군 균주는 빈 벡터 pET24ma 및 pETDuet-1 플라스미드(CAR 및 sfp 유전자 없음)를 발현.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제안하는 벤질 알콜 및 지방 알콜(C₈-C₁₆)의 생합성을 위한 반응식이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 MmCAR 및 Sfp를 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용한 지방 알콜의 in vivo 합성 결과를 보여주는 그래프이다. 반응 조건: 기질; 10mM 벤조산 및 C₈-C₁₆ 유리지방산(FFA), 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코즈(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀; 30.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3)을 사용하여 대장균 내인성 ALR에 의한 알콜의 생산 결과를 보여주는 그래프이다. 반응 조건: 기질; 10mM 벤즈 알데하이드 및 라우릭 알데하이드, 부피; 100mL 플라스크의 10ml, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코즈(w/v)를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 7.5); 세포 OD₆₀₀; 30.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 MmCAR, Sfp 및 내인성 ALR을 발현하는 대장균 BW25113(ΔfadD, DE3) 세포를 사용하여 CAR의 최적 활성에 대한 pH의 영향을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. 반응 조건: 기질; 30mM ω-ODDA, 부피; 100mL 플라스크에 10mL, 온도; 30℃, 완충액; 1% 글루코즈(w/v) 및 10mM MgCl₂를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH: 6.5-805); 세포 OD₆₀₀; 30.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 코돈 최적화된 sfp의 염기 서열을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 코돈 최적화된 PPK2의 염기 서열을 나타낸다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자; 푸티다레독신 환원효소 CamA(Putidaredoxin reductase CamA)를 코딩하는 유전자; 및 푸티다레독신 환원효소 CamB(Putidaredoxin reductase CamB)를 코딩하는 유전자를 포함하는 기질로서 지방산으로부터 수산화 지방산을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공한다. 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물은 지방산을 기질로 이용하여, 생합성 경로를 통해 수산화 지방산을 생산할 수 있다.

이러한 측면에서 본 발명은 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 기질로서 지방산을 포함하는 배지에서 배양하여 수산화 지방산을 생산하는 것을 포함하는 수산화 지방산 생산방법을 제공한다. 상기 수산화 지방산 생산방법은 디올류의 일 구성으로 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 수산화 지방산 생산하는 단계를 포함하는 α,ω-디올의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "지방산(Fatty acid, FA)"은 1개의 카르복시기를 가지는 탄화수소 화합물을 의미한다. 또한, 용어 "수산화 지방산(OHFA)"은 1개의 카르복시기를 가지는 탄화수소의 사슬에서 1개의 수소가 수산화기(hydroxy, -OH)로 치환된 화합물을 의미한다. 본 발명의 생합성 과정에서 탄화수소는 반응에 이용되지 않기 때문에, 탄소수의 길이가 제한되지 않으나, 재조합 미생물의 기질 이용능 등을 고려할 때, 중쇄 내지 단쇄의 지방산일 수 있다. 보다 구체적으로, C₆ 내지 C₁₈ 또는 C₈ 내지 C₁₆의 지방산이 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 C₁₂의 지방산을 이용하는 경우, 최종 목적 산물인 디올 화합물의 생산 효율이 가장 우수함을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 "디올 또는 디올류"는 두 개의 수산화기(-OH)를 포함하는 화합물을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 양 말단에 두 개의 수산화기를 포함하는 α,ω-디올을 최종 목적 산물로 한다.

본 발명에서 미생물은 형질전환을 통해서 지방산 또는 수산화 지방산을 기질로 이용하는 생합성 시스템을 구축할 수 있는 것이라면, 그 종류에 관계없이 포함될 수 있고, 일 예로 효모, 박테리아 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 E. coli BW25113(ΔfadD, DE3)를 형질전환하여 재조합 미생물을 구축하였다.

본 발명에서 모노옥시게나아제는 시토크롬 P450 산화효소 또는 시토크롬 P450(CYP)이라고도 하며, 산소를 기질에 도입하는 반응을 촉매하는 산소화효소를 의미하는 것이다. 본 발명에서는 지방산을 기질로 사용하여 말단에 수산화기를 도입시키는 역할을 한다.

본 발명에서 사용되는 모노옥시게나아제는 기질에 산소를 도입하는 반응을 촉매하는 것으로, 발현 벡터에 포함되어 재조합 미생물 내에서 발현될 수 있다면, 그 종류에 상관없이 이용될 수 있으므로, 그 종류 또는 서열에 제한되지 않는다. 바람직하게는 지방산 기질의 말단, ω위치를 수산화시키는 CYP153A 패밀리에 속하는 모노옥시게나아제를 이용할 수 있다. CYP153A 모노옥시제나아제는 본 발명의 기술분야에 있어서, 다양한 레퍼런스 참조하여 이용할 수 있다.

일 예로, 상기 모노옥시게나아제는 ω위치에 대해 예외적인 위치-선택성(> 95%)을 통해서 넓은 기질 범위를 갖는 MaqCYP153A33를 이용할 수 있다.

본 발명의 모노옥시게나아제는 NAD(P)H에서 P450 활성 부위로 전자를 운반하기 위해서, 산화/환원 파트너를 추가로 포함한다. 상기 산화/환원 파트너는 일 예로, 푸티다레독신 리덕타제(Putidaredoxin reductase; CamA, EC 1.18.1.5)와 푸티다레독신(putidaredoxin; CamB, UniProt: P00259)을 이용할 수 있다(CamAB 시스템).

본 발명의 일 실시예에서, 모노옥시게나아제로서 MaqCYP153A33를 포함하는 발현벡터와 산화환원 파트너로서 슈도모나스 푸티다(Psedomonas putida) ATCC 17453의 CamAB 시스템을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 이용해서, 지방산을 기질로 포함하는 배지에서 배양하였을 때, ω-수산화 지방산이 잘 생산되었음을 확인하였다(도 4).

본 발명의 다른 일 양태로, α,ω-디올 생산능을 갖는 재조합 미생물에 관한 것으로, 상기 재조합 미생물은 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 포스포판테티에닐 전이효소(Sfp)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터에 포함되며, 상기 발현벡터는 pET24ma, pETduet1 및 pQE-80L로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명에서 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)는 기질의 카르복실기에서 산소를 제거하여 환원시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 본 발명에서는 수산화 지방산을 수산화 지방 알데하이드로 전환시키는 역할을 한다.

상기 카르복실환원효소는 그 종류에 한정되지 않으나, 바람직하게는 마이코박테리움 속의 미생물 유래의 효소를 사용할 수 있다. 일 예로 마이코박테리리움 마리넘(Mycobacterium marinum), 마이코박테리리움 셀로나에(Mycobacterium chelonae) 또는 마이코박테리움 아브세서스(Mycobacterium abscessus) 유래의 효소를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAR를 이용해서 수산화 지방산이 수산화 알데하이드 화합물로 전환됨을 확인하였다[17].

본 발명의 CAR는 포스포판테티에닐 전이효소(phosphopantetheinyl transferase, PPTase)를 사용하여 포스포판테티에닐화(phosphopantetheinylation)를 통한 번역 후(posttranslational) 활성화를 거쳐야 하므로[17,20-22], 상기 재조합 미생물은 포스포판테티에닐 전이효소(PPTase)를 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본 발명의 포스포판테티에닐 전이효소는 그 기능이 밝혀진 것이라면, 종류에 한정되지 않고, 본 발명에 포함될 수 있으나, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 PPTase일 수 있다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 PPTase는 Sfp로도 지칭될 수 있다. 더욱 바람직하게는 대장균에 맞게 코돈 최적화된 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 CAR와 PPTase를 동시에 발현하는 재조합 미생물로부터 기질로 수산화 지방산을 사용하여 수산화 지방 알데하이드가 효과적으로 생산되었고, 추가적인 반응을 통해서 말단 디올이 생산됨을 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 CAR를 포함하는 재조합 미생물은 보조인자로 사용되는 NAD(P)H 또는 ATP를 소비하므로, 보조인자의 지속적인 공급을 위해서, 소비된 보조인자를 회복시키는 것이, CAR 반응에서 매우 중요하다. 따라서, 본 발명의 재조합 미생물은 보조인자 재생 시스템으로서, 포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase; GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리포스페이트 키나아제 2(polyphosphate kinase 2; PPK2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 것을 더 포함할 수 있다. 상기 보조인자 재생 시스템을 추가로 포함하는 경우, 합성 효율을 종래의 방법과 비교해서, 약 66배 정도 향상시킬 수 있다.

상기 GDH 또는 PPK2를 코딩하는 유전자는 미생물에 형질전환 될 수 있는 것이라면, 그 종류에 관계없이 이용될 수 있다. 일 예로, 대장균에서 발현되기 위해 코돈 최적화된 서열번호 5의 GDH 또는 서열번호 4의 PPK2일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 ARP의 재생을 위해서 MmCAR 및 Sfp 동시-발현되는 재조합 미생물에 Arthrobacter aurecens의 PPK2를 삽입; 또는 Bacillus subtilis의 GDH를 삽입하여 동시 발현시킴으로써 디올류 화합물의 생합성 과정 동안 보조인자가 지속적으로 공급될 수 있음을 확인하였고, 이 경우, 보조인자 발현 시스템을 갖지 않는 미생물과 비교해서 약 66배 이상의 향상된 합성 효율을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에서 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR, EC 1.1.1.2)는 알코올의 탈수소에 의한 알데히드(또는 케톤) 형성을 가역적으로 촉매하면서, NAD＋/NADH 또는 NADP＋/NADPH를 조효소로 사용하는 NAD(P)-의존성 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서는 기질에 포함된 수산화(hydroxyl)기를 알데하이드기로 산화시켜 옥소(oxo)화합물을 생성하는 역할과, 탈아민된 아미노제공기의 알데히드(또는 케톤)기를 알코올기로 다시 전환시키면서 조효소를 재생산하는 역할을 한다. 즉, 본 발명의 알데하이드 환원효소는 기질로서 수산화 지방산의 에스터 화합물을 이에 상응하는 옥소 화합물로 전환시키는 촉매작용을 하는 효소를 의미한다.

본 발명에서 상기 알데하이드 환원효소는 외인성 효소 및 내인성을 모두 포함한다. 바람직하게는 미생물에 포함된 내인성 알데하이드 환원효소를 이용함으로써 재조합 미생물을 구축하는 과정을 단순화 시킬 수 있다는 장점이 있다.

일 예로, 내인성 알데하이드 환원효소 유전자에 의해 코딩되는 효소일 수 있는데, 재조합 대장균을 통한 생합성을 수행하면서, 대장균의 내인성 알데하이드 환원효소를 이용하더라도 충분한 전환 효율을 가짐을 본 발명의 일 실시예에서 확인하였다.

다른 예로, 상기 알데하이드 환원효소는 미생물의 종류 및 구성하는 벡터 시스템, 배양 조건 등에 따라서 외인성 효소, 즉 외부의 유전자에 의한 효소 일 수 있다. 예를 들어, 시네코시스티스 속 PCC 6714 ID 90(Synechocystis sp. PCC 6714 ID 90), 레인헤이메라 투오수엔시스(Rheinheimera tuosuensis), 프로테로박테리아 박테리움 ST_bin16(Proteobacteria bacterium ST_bin16), 니트로소모나스 올리고트로파(Nitrosomonas oligotropha), 히드로제노필라레스 박테리움 17-62-8(Hydrogenophilales bacterium 17-62-8), 레인헤이메라 메소필라(Rheinheimera mesophila), 티오바실러스 데니트리피칸스(Thiobacillus denitrificans), 설푸리페룰라 속 AH1(Sulfuriferula sp . AH1), 레인헤이메라 속 SA1(Rheinheimera sp. SA1), 레인헤이메라 페르루시다(Rheinheimera perlucida), 레인헤이메라 속 A13L(Rheinheimera sp. A13L), 데설푸로모나스 속 DDH964(Desulfuromonas sp. DDH964), 할로티오바실러스 속 24-54-40(Halothiobacillus sp. 24-54-40), 감마프로테오박테리아 박테리움 HGW-Gammaproteobacteria-15(Gammaproteobacteria bacterium HGW-Gammaproteobacteria-15), 할로티오바실러스 속 20-53-49(Halothiobacillus sp. 20-53-49), 림노트릭스 로세아(Limnothrix rosea), 알테로모나다세아 박테리움 XY-R5(Alteromonadaceae bacterium XY-R5), 탈라소탈레아 크라쏘스트레아 (Thalassotalea crassostreae), 니트로소모나스 유트로파(Nitrosomonas eutropha), 레인헤이메라 파시피카(Rheinheimera pacifica), 니트로소모나스 속 AL212(Nitrosomonas sp. AL212), 아르수키박테리움 익켄세(Arsukibacterium ikkense) 또는 알테로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii) 유래의 NAD(P)-의존성 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 일 수 있다.

본 발명의 알데하이드 환원효소는 NAD＋/NADH 또는 NADP＋/NADPH를 조효소로 사용하면서, 알코올의 탈수소에 의한 알데히드(또는 케톤) 형성을 가역적으로 촉매할 수 있다면, 그 유래 또는 아미노산 서열의 특성 등과 관계없이 본 발명에 이용될 수 있기 때문에, 구체적인 서열 또는 종류에 한정되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 α,ω-디올의 생산방법을 제공하며, 상기 생산방법은 (a) 상기 중 수산화 지방산을 기질로 포함하는 배지에서, 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 포스포판테티에닐 전이효소(Sfp)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 배양하여 α,ω-디올을 생산하는 것을 포함한다.

또한, 출발물질을 지방산으로 이용하는 경우, 이로부터 수산화 지방산을 생산하기 위해서, 상기 (a)단계의 수행 전에, 기질로서 지방산을 포함하는 배지에서, 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자; 푸티다레독신 환원효소 CamA(Putidaredoxin reductase CamA)를 코딩하는 유전자; 및 푸티다레독신 환원효소 CamB(Putidaredoxin reductase CamB)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 배양하여 수산화 지방산을 생산하는 것; 을 더 포함할 수 있다.

상기 재조합 미생물 배양은 pH 6.0 내지 pH 9.0에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 pH 6.5 초과 내지 pH 8.5 미만에서 수행될 수 있고, 가장 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 MmCAR이 구축된 재조합 미생물을 pH 6.5, 7.5 및 8.5 각각에서 배양한 경우, pH 7.5에서 최적 활성을 가짐을 실험적으로 확인하였다. 특히, 상기 pH 조건에서는 다른 pH와 비교해서 2배 이상의 생산 활성을 가짐을 확인하였다.

본 발명의 배양을 수행할 때, 배지에서 기질의 농도는 40mM 이하일 수 있다. 배지 내 기질의 농도가 상기 범위가 상기 범위를 초과하는 경우 미생물에 대하여 독성을 작용할 수 있어, 오히려 생산 효율이 낮아지는 문제가 있다.

본 발명은 산업적으로 폴리아마이드, 폴리에스테르 및 폴리우레탄의 합성에서 중요한 구성요소인 중쇄에서 장쇄의 α,ω-디올의 생합성 방법 및 이에 이용되는 재조합 미생물에 관한 것으로, 종래 화학적 합성방법에만 의존하던 α,ω-디올을 친환경적이고, 비용 절감되는 방법으로 합성할 수 있다는 점에서, 큰 의미를 갖는다.

이하, 상기 서술한 내용을 바탕으로, 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 한정하려는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

준비예 . 시약 및 실험 방법

1. 화학 물질

지방산(fatty acid), ω-수산화 지방산(-hydroxy fatty acid), 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 이소프로필-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG, isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, 5-ALA), N,O-비스(트리메틸실릴)-트리플루오로아세트아미드(N,O-Bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide, BSTFA), 소듐 포스페이트 결정(sodium polyphosphate crystal)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 지방 알코올(Fatty alcohol) 및 α,ω-디올은 도쿄 화학 공업(도쿄, 일본)으로부터 입수하였다. 클로로포름은 준세이(일본)로부터 수득하였다. 박테리아 한천, LB(Luria bertani) 배지 및 TB(terrific broth) 배지는 BD Difco(Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다. 이 발명의 실험에서는 모두 분석 등급의 화학 물질만 사용하였다.

2. 플라스미드 구축 및 유전자 조작

모든 박테리아 균주, 플라스미드 벡터 및 본 발명의 실시예에서 사용된 맞춤 설계된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타내었다. Mycobacterium marinum ATCC^® BAA535^TM의 게놈 DNA는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 수득하였다. M. marinum 카르복실산 환원효소(CAR, UniProt: B2HN69)를 코딩하는 유전자를 PCR 서모사이클러(thermocycler)(Veriti 96-Well Thermal Cycler, AB Applied Biosystems, CA, USA)로 게놈 DNA로부터 증폭시켰고, pETDuet-1 제1 다중 클로닝 사이트(MCS1)에 클로닝하였다. 바실러스 서브틸리스 유래의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(phosphopantetheinyl transferase)인 Sfp(GI: P39135)와 Arthrobacter aurescens 유래의 폴리포스페이트 키나아제 2인 PPK2(GI: ABM08865.1) 유전자는 화학적으로 합성되었고, 대장균에 대한 코돈 최적화가 Cosmo Genetech(Cosmo Genetech, Seoul, Korea)에 의해 수행되었다. PPK2와 바실러스 서브틸리스의 포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase, GDH) 유전자를 CAR와 별도로 pETDuet-1 벡터의 제2 다중 클로닝 부위(MCS2)에 클로닝하였다. Sfp는 pET24ma 벡터에 클로닝되었다. 클로닝을 위한 모든 DNA 조작은 표준 프로토콜에 따라 수행되었으며[26], E. coli DH5α는 클로닝을 목적으로 사용되었다. 본 발명에서 사용된 모든 프라이머는 Cosmo Genetech로부터 구입하였으며, 표 1에 나타내었다.

	설명	레퍼런스
플라스미드
pET24ma	P15A ori lacI T7 프로모터, KmR	참고 [25]
pCYP153A33	MaqCYP153A33를 코딩하기 위한 pET24ma	참고 [25]
pETDuet-1	pBR322 ori lacI T7 프로모터, AmpR	Novagen
pCamAB	CamA 및 CamB를 코딩하는 pETDuet-1	참고 [25]
pMmCAR	MmCAR를 코딩하는 pETDuet-1	본 발명
pCAR-GDH	MmCAR 및 GDH를 코딩하는 pETDuet-1	본 발명
pCAR-PK2	MmCAR 및 PPK2를 코딩하는 pETDuet-1	본 발명
pSFP	Sfp를 코딩하는 pET24ma	본 발명
E. coli 균주
DH5a	F-, endA1, glnV44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96 deoR, supE44, Φ80dlacZ△M15 Δ(lacZYA--argF)-U169, hsdR17(rK -mK +), λ-	참고 [27]
BW25113(DE3)	rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1 λ(DE3)	참고 [25]
DL	BW25113(DE3)ΔfadD	참고 [25]
A33AB	pCYP153A33 및 pCamAB를 포함하는 DL	참고 [25]
CAR	pCAR를 포함하는 DL	본 발명
CS	pCAR 및 pSFP를 포함하는 DL	본 발명
CSG	pCAR-GDH 및 pSFP를 포함하는 DL	본 발명
CSK	pCAR-PK2 및 pSFP를 포함하는 DL	본 발명
PCR	Sequence(5'-3')
CAR_F(Bam HI)	ATTA GGATCC CATGTCGCCAATCACGCGTG	pETDuet1으로 클로닝
CAR_R(Hindd III)	TAAT AAGCTT GAGCAGGCCGAGTAGGCG
SFP_F(Nde I)	ATTA CATATG AAAATCTACGGCATCTAC	pET24ma로 클로닝
SFP_R(Xho I)	TAAT CTCGAG TTACAGCAGTTCTTCATA
PPK2_F(Nde I)	AAGGAGATATA CATATG CCGATGGTTGCTGCAG	pETDuet1으로 클로닝
PPK2_R(Kpn I)	TTACCAGACTCGAG GGTACC TTAAGATTCAACAACCAGAGC
GDH_F(NdeI)	AAGGAGATATA CATATG TATCCGGATTTAAAAGGA	pETDuet1으로 클로닝
GDH_R(Kpn I)	TTACCAGACTCGAG GGTACC TTAACCGCGGCCTGCCTGGAA

3. 단백질 발현 및 생체 내 변형( biotransformation )

이전에 보고된 대장균 BW25113(DE3) ΔfadD 균주[25]는 지방산 분해 β-산화 경로가 차단된 생체 내 변형 연구에 사용되었다. 재조합 균주는 플라스미드 DNA를 형질 전환의 표준 열충격 형질전환법을 통해 숙주 균주에 도입함으로써 얻어졌으며 형질전환체는 항생제 내성을 통해 선택되었다[26]. 균주는 37℃에서 배양되었다. 각각의 플라스미드 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 한천 플레이트로부터의 신선한 콜로니를 취하여, 10㎖의 루리아-베르타니(LB) 배지(50㎍/mL (pCYP153A33 및 pSFP)의 카나마이신 및/또는 100㎍/㎖ (pCamAB, pMmCAR, pCAR-PPK2 및 pCAR-GDH)의 암피실린 함유)로 37℃에서 밤새 배양하였다. 하룻밤 동안 전 배양된 세포를 더 큰 부피의 발현 플라스크에 접종하고, IPTG 유도에 대해 세포 농도가 600nm(OD₆₀₀)의 0.6 내지 0.8의 광학 밀도에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. MaqCYP153A33 및 CamAB 단백질 발현은 3L 플라스크에서 Terrific-Broth(TB) 1L로 진행하였는데, 0.01mM IPTG, 헴 전구체(heme precursor)로서 0.5mM 5-ALA 및 0.1mM FeSO₄를 첨가하여 30℃에서 16시간 동안 유도하였다. PPK2/GDH 및 SFP을 갖거나/갖지 않는 MmCAR 단백질 발현은 3L 플라스크에서 1L의 LB 배지로 진행하였는데, 유도는 0.1mM IPTG를 20℃에서 16 시간 동안 첨가하여 수행하였다.

발현 후, 세포를 수확하고(4000rpm, 20분, 4℃), PBS로 세척하고, 1%(w/v) 글루코스를 갖는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)에 재현탁 하였다. 각각의 기질(DMSO 중 스탁, 최종 농도 5%(v/v) 또는 비-정제된 ω-OHFAs를 함유하는 무세포 반응혼합물)을 첨가하여 잔류 세포 반응(0.3 g_CDW/mL)을 개시하였다. 반응물을 30℃ 및 200rpm에서 배양하였다. MmCAR의 전체-세포 반응에서, 기질을 첨가하는 동안 10mM MgCl₂를 첨가하였다. 매 6시간 마다, 반응 혼합물의 pH를 pH 미터기로 측정하고, 5M KOH를 이용해서 pH 7.5로 조정하였다. 50μL의 80%(w/v) 글루코스를 첨가하였다.

4. 가스 크로마토그래피에 의한 화합물 분석

정량 분석은 AOC-20i 시리즈 자동 시료 주입기(Shimadzu Scientific Instruments, Kyoto 604-8511, Japan)가 장착된 불꽃 이온화 검출기(GC/FID)가 함께 있는 가스크로마토그래피 장치(GC 2010 플러스 시리즈)를 사용하여 수행되었다. 2μL의 시료는 분할 모드(분할 비 20:1)로 주입되었고, 비극성 모세관컬럼(5% 페닐 메틸 실록산 모세관 30m x 320μm i.d., 0.25μm 필름 두께, HP-5)을 사용하여 분석했다. 지방산 분석을 위한 오븐 온도 프로그램은 다음과 같다: 50℃에서 1 분간, 10℃/min에서 250℃로 증가시키고, 10 분간 유지. 유입온도는 250℃이고 검출기 온도는 280℃였다. 캐리어 가스(He)의 유속은 1mL/min, FID에서의 H₂, 공기, 및 He의 유속은 각각 45mL/min, 400mL/min, 20mL/min 이었다. 초기 오븐 온도는 90℃였고, 다음 15℃/min에서 250℃로 증가시켜, 5분 동안 유지시켰다. 각 피크는 GC 크로마토그램을 어센틱 참조(authentic reference)와 비교하여 확인되었다. 기질의 추출 전에 시료에 내부 표준 물질을 첨가하였다.

표 2에 가스크로마토그래피(무극성 모세관 컬럼-5% 페닐 메틸 실록산 모세관, HP-5)에 의한 기질 및 생성물의 체류 시간을 나타내었다.

기질/생성물	Retention time [min]
	C 8	C 10	C 12	C 14	C 16
* 지방산	10.91	13.50	15.90	18.05	20.03
* ω-수산화 지방산	15.52	17.60	19.64	21.40	22.70
** 지방 알코올	8.05	11.03	13.75	16.15	18.35
** 지방 알데하이드	-	-	12.75	-	-
** α,ω-디올	12.09	14.70	17.06	19.23	21.20
** 벤조산	10.70
** 벤질 알코올	7.48
** 벤즈알데하이드	6.34
- : 미검출 * BSTFA로 유도체화됨 ** BSTFA로 유도체화되지 않음

시험예 1. MmCAR 반응 시스템 구축

CAR는 포스포판테티에닐 전이효소(phosphopantetheinyl transferase, PPTase)를 사용하여 포스포판테티에닐화(phosphopantetheinylation)를 통한 번역 후(posttranslational) 활성화를 거쳐야 한다[17,20-22]. 따라서, MmCAR는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래 PPTase인 Sfp와 함께 발현되었다(도 7). SDS-PAGE 분석을 통해 가용성 형태의 MmCAR 및 Sfp의 동시 발현을 확인하였고(도 8), 공동 발현하는 Sfp를 갖거나/갖지 않는 MmCAR 세포를 이용한 전-세포(0.3 g_CDW/mL) 반응이 1%(w/v) 글루코오스와 10mM MgCl₂를 갖는 인산 칼슘 완충액(100mM, pH 7.5)에서 30℃, 200rpm으로 수행되었다.

공동 발현된 세포는 9.2mM의 벤질 알콜을 생산하는 반면, MmCAR 만 발현 된 세포는 0.5mM을 합성하였다(도 9). 두 경우 모두에서 벤질 알데하이드는 무시할 정도의 양만 검출되었다(데이터는 표시되지 않음).

이러한 결과는, 도 10에 나타낸 바와 같이, Sfp가 MmCAR의 활성화에 중추적인 역할을 하며, 내인성 ALR의 활성은 알콜을 생성하기에 충분하다는 것을 명확하게 보여준다.

MmCAR-Sfp 동시-발현 세포는 다양한 유리지방산을 이용해서 추가로 연구되었다. 10mM 옥탄산(C₈), 데칸산(C₁₀), 도데칸산(C₁₂), 테트라데칸산(C₁₄) 및 헥사데칸산(C₁₆)을 사용하여 전-세포(0.3g_CDW/mL) 반응을 수행하였다. 생성된 1-옥탄올, 1-데칸올, 1-도데칸올, 1-테트라데칸올 및 1-헥사데칸올의 양은 각각 1.8; 9.8; 9.9; 1.6 및 0.6mM 이었다(도 11). 또한, GC 분석에서 반응 과정 중에 알데하이드가 축적되지 않았으므로, 내인성 ALR이 알데하이드를 알코올로 환원하기에 충분하다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 알데하이드 대응물로의 유리지방산의 카르복실산 작용기의 감소 및 ALR에 의한 알코올로의 알데하이드의 동시 감소에 의해 설명될 수 있다(도 10).

알데하이드의 ALR-매개 감소를 확인하기 위해, E. coli BW25113(ΔfadD, DE3) 숙주세포를 사용하여 별도의 반응을 수행하였다. 10mM 도데칸알(dodecanal) 및 벤즈알데하이드의 1-도데칸올 및 벤질 알코올 각각으로의 완전한 전환이 6시간 내에 달성되었고, 이는 E. coli BW25113(ΔfadD, DE3) 숙주세포를 사용하는 내인성 ALR의 촉매 효율을 암시한다 (도 12).

시험예 2. ω-OHFA로부터 α,ω-디올의 생산

MmCAR에 의한 다양한 알코올의 성공적인 in vivo 합성 후, 본 연구의 최종 목표, 즉 중쇄 내지 장쇄의 α,ω-디올 생합성,을 달성하기 위해, 다양한 말단 수산화 지방산(ω-OHFA, C₈-C₁₆)을 사용하여 다양한 생체 촉매 반응을 수행하였다. 반응조건은 유리지방산의 지방 알코올로의 MmCAR-촉매작용에 의한 생체전환에 사용된 것과 동일하였다.

그 결과는, 도 2에 나타낸 바와 같이, ω-수산화 옥탄산(ω-OHOA), ω-수산화 데칸산(ω-OHDA), ω-수산화 도데칸산(ω-OHDDA), ω-수산화 헥사데칸산(ω-OHHDA) 각각에 대해 초기 α,ω-디올 생체전환 비율은 0.26, 0.29, 0.28 및 0.04 mM/g_CDW/h 였다. ω-OHDA(C₁₀)에 대한 초기 전-세포 반응속도가 약간 높았지만, 24시간 반응에서 ω-OHDDA로부터 1,12-도데칸디올을 생산할 때 최적의 생산성이 관찰되었다(도 2). 10mM의 기질로부터, 1,12-도데칸디올에서 가장 높은 생산 수율(9.7mM)을 보였으나, 1,16-헥사데칸디올은 3.01mM 만 생산되었다.

재생 가능한 유리 지방산 중에서, 도데칸산은 가장 저렴하고 풍부한 기질 중 하나이며, 1,12-도데칸디올은 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리카보네이트 및 에폭시 수지의 생산에 산업적으로 중요한 단량체이다[13]. 흥미롭게도, 본 발명에서 1,12-도데칸디올의 생산성은 다른 α,ω-디올의 생산성보다 비교적 높았다. 따라서 ω-OHDDA를 기질로 사용한 추가 최적화 실험을 수행하였다.

시험예 3. 1,12-도데칸디올 생산성 향상을 위한 최적화 시험

3-1. pH 최적화

MmCAR을 사용하여 ω-OHDD의 1,12-도데칸디올로의 생체 내 전환에 대한 pH의 영향을 확인하기 위해서, 세 가지 pH 조건(pH 6.5, 7.5 및 8.5)에서 전-세포(whole-cell) 반응을 수행했다. 기질 농도는 30mM로 증가시켰다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 최적 활성은 pH 7.5에서 측정되었고, 24 시간 동안 19.5mM의 생성물이 형성되었다. 그러나, pH 6.5와 8.5에서는 각각 7.4mM 및 9.7mM의 생성물만 합성되었다.

3-2. 보조인자(Cofactor) 재생(regeneration)

니코틴 아미드 보조인자(NADPH)와 ATP의 재생은 소비된 보조인자를 회복시키는 CAR 반응에서 매우 중요하다. ATP 재생을 위해 PPK2를 포함하여 여러 가지 효소 반응이 보고되었는데, 주로 폴리포스페이트-의존성 인산화를 촉매하는 것이다[21]. MmCAR 및 Sfp와 동시-발현된 Arthrobacter aurecens의 PPK2를 사용하여 전-세포 반응을 수행하였고, 상기한 조건에서 2mM 폴립(polyp)을 수가로 사용하였다[21]. 24시간 반응에서, 1,12-도데칸디올의 생산량은 22.5mM(4.6 g/L)였다(도 3).

MmCAR-촉매 반응에서 NADPH의 재생을 위해, Bacillus subtilis의 GDH를 동시 발현시켰고, 따라서 전-세포 생체 내 변형 과정에서 보조인자의 지속적인 공급이 보장되었다[24]. 24시간 반응 후, 30mM의 기질로부터 24.7mM(5.0g/L)의 1,12-도데칸디올이 생성되었다(도 3). 이러한 결과는 종래 Fujii et al.에 보고된 것(79 mg/L)과 비교하여 실질적으로 66배의 개선된 1,12-도데칸디올의 합성을 보여준다. 도한, 이러한 실험 결과는 CAR, Sfp 및 GDH를 발현하는 전-세포 촉매에 의해 ω-OHFAs의 카르복실산 작용기가 알데하이드 작용기로 환원되고, 이는 대장균 내인성 ALR에 의해 알코올로 추가로 환원됨을 분명하게 보여주었다.

시험예 4. 유리지방산에서 α,ω-디올의 생산

4-1. CYP153A 모노옥시게나제에 의한 다양한 ω-OHFA(C ₈ -C ₁₆ )의 생산

디올의 합성에서 유리지방산의 유용성을 연구하기 위해, MaqCYP153A33-CamAB 시스템을 사용하여 다양한 유리지방산(C₈-C₁₆)을 ω-OHFA로 합성하는데 사용하였다. 전-세포 반응은 MaqCYP153A33-CamAB 동시-발현 세포(0.3g_CDW/mL)를 사용하여 1%(w/v) 글루코스를 갖는 인산 칼륨 완충액(100mM, pH 7.5)에서 30℃ 및 200rpm으로 수행되었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, MaqCYP153A33의 24시간 반응으로 유리지방산(FFA) 10mM로부터 각각 3.3mM의 ω-OHOA, 6.3mM의 ω-OHDA, 8.2mM의 ω-OHDDA, 4.7mM의 ω-OHTDA 및 3.7mM의 ω-OHHDA이 합성되었다. 상기 ω-OHFA는 MmCAR과 ALR의 순차적 반응에 의해서 α,ω-디올로 전환되었다.

4-2. 생체 내 전환된 ω-OHFA를 사용한 α,ω-디올의 생산

ω-OHFA의 생산량이 3.3 내지 8.2mM 범위였으므로, 이전 반응에서 생체 전환되고 비-정제된 3mM의 ω-OHFA(C₈-C₁₆) 각각을 이용해서 MmCAR 와 MmCAR-GDH 시스템에서 α,ω-디올을 합성하였다. 전-세포 반응의 조건은 MmCAR에 대한 Mg^{2 +} 보조인자 이외에, MaqCYP153A33 및 MmCAR-ALR과 동일하게 수행하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, GDH를 갖지 않는 MmCAR 시스템에서 생체 내 전환된 1,8-옥탄디올, 1,10-데칸디올, 1,12-도데칸디올, 1,14-테트라데칸디올, 및 1,16-헥사데칸디올은 각각 69, 75, 96, 60, 40% 였다(CAR 및 Sfp). 그러나, MmCAR-GDH 시스템에서 전환율은 각각 15, 12, 4, 8 및 10%씩 증가하였다(CAR, Sfp, 및 GDH).

마지막으로, 본 발명의 순차적인 생물 촉매 공정의 유용성을 확인하기 위해, 3개의 시스템 모두에서 생체 내 변형된 ω-OHDDA를 기질로 사용하여 1,12-도데칸디올을 생산하는 연구를 진행하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, MaqCYP153A33 반응으로부터 ω-OHDDA(8.2mM)의 낮은 생산성으로 인해, 7mM의 생체 내 변형된 ω-OHDDA 만이 MmCAR과 관련된 연속적인 전-세포 반응에 사용되었다. 그럼에도 불구하고, MmCAR-GDH 시스템에서 15시간 반응으로 가장 높은 생체 전환율(96%)이 달성되었고, 1.4g/L가 합성되었다.

[참고문헌]

1. Kawaguchi, H.; Ogino, C.; Kondo, A. Microbial conversion of biomass into bio-based polymers. Bioresource Technology 2017, 245, 1664-1673.

2. Lligadas, G.; Ronda, J.C.; Gali

, M.; C

diz, V. Oleic and undecylenic acids as renewable feedstocks in the synthesis of polyols and polyurethanes. Polymers 2010, 2, 440.

3. Gandini, A. Polymers from renewable resources: A challenge for the future of macromolecular materials. Macromolecules 2008, 41, 9491-9504.

4. Lligadas, G.; Ronda, J.C.; Gali

, M.; C

diz, V. Renewable polymeric materials from vegetable oils: A perspective. Materials Today 2013, 16, 337-343.

5. Sharma, V.; Kundu, P.P. Condensation polymers from natural oils. Progress in Polymer Science 2008, 33, 1199-1215.

6. Madhavan, A.; Sindhu, R.; Binod, P.; Sukumaran, R.K.; Pandey, A. Strategies for design of improved biocatalysts for industrial applications. Bioresource Technology 2017, 245, 1304-1313.

7. Wang, M.; Si, T.; Zhao, H. Biocatalyst development by directed evolution. Bioresource Technology 2012, 115, 117-125.

8. Jiang, Y.; Liu, W.; Zou, H.; Cheng, T.; Tian, N.; Xian, M. Microbial production of short chain diols. Microbial Cell Factories 2014, 13, 165.

9. Zheng, Y.; Li, L.; Liu, Q.; Zhang, H.; Cao, Y.; Xian, M.; Liu, H. High-specificity synthesis of novel monomers by remodeled alcohol hydroxylase. BMC Biotechnology 2016, 16, 61.

10. Fujii, T.; Narikawa, T.; Sumisa, F.; Arisawa, A.; Takeda, K.; Kato, J. Production of α,ω-alkanediols using escherichia coli expressing a cytochrome p450 from acinetobacter sp. Oc4. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2006, 70, 1379-1385.

11. Scheller, U.; Zimmer, T.; Becher, D.; Schauer, F.; Schunck, W.-H. Oxygenation cascade in conversion of n-alkanes to α,ω-dioic acids catalyzed by cytochrome p450 52a3. Journal of Biological Chemistry 1998, 273, 32528-32534.

12. Shiio, I.; Uchio, R. Microbial production of long-chain dicarboxylic acids from n-alkanes. Agricultural and Biological Chemistry 1971, 35, 2033-2042.

13. Schaffer, S.; Haas, T. Biocatalytic and fermentative production of α,ω-bifunctional polymer precursors. Organic Process Research & Development 2014, 18, 752-766.

14. Scheps, D.; Honda Malca, S.; Hoffmann, H.; Nestl, B.M.; Hauer, B. Regioselective [small omega]-hydroxylation of medium-chain n-alkanes and primary alcohols by cyp153 enzymes from mycobacterium marinum and polaromonas sp. Strain js666. Organic & Biomolecular Chemistry 2011, 9, 6727-6733.

15. Sabra, W.; Groeger, C.; Zeng, A.-P. Microbial cell factories for diol production. In Bioreactor engineering research and industrial applications i: Cell factories, Ye, Q.; Bao, J.; Zhong, J.-J., Eds. Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg, 2016; pp 165-197.

16. Honda Malca, S.; Scheps, D.; Kuhnel, L.; Venegas-Venegas, E.; Seifert, A.; Nestl, B.M.; Hauer, B. Bacterial cyp153a monooxygenases for the synthesis of omega-hydroxylated fatty acids. Chemical Communications 2012, 48, 5115-5117.

17. Akhtar, M.K.; Turner, N.J.; Jones, P.R. Carboxylic acid reductase is a versatile enzyme for the conversion of fatty acids into fuels and chemical commodities. Proc Natl Acad Sci U S A 2013, 110, 87-92.

18. Fatma, Z.; Jawed, K.; Mattam, A.J.; Yazdani, S.S. Identification of long chain specific aldehyde reductase and its use in enhanced fatty alcohol production in e. Coli. Metabolic Engineering 2016, 37, 35-45.

19. Rodriguez, G.M.; Atsumi, S. Toward aldehyde and alkane production by removing aldehyde reductase activity in escherichia coli. Metabolic engineering 2014, 25, 227-237.

20. Finnigan, W.; Thomas, A.; Cromar, H.; Gough, B.; Snajdrova, R.; Adams, J.P.; Littlechild, J.A.; Harmer, N.J. Characterization of carboxylic acid reductases as enzymes in the toolbox for synthetic chemistry. ChemCatChem 2017, 9, 1005-1017.

21. Khusnutdinova, A.N.; Flick, R.; Popovic, A.; Brown, G.; Tchigvintsev, A.; Nocek, B.; Correia, K.; Joo, J.C.; Mahadevan, R.; Yakunin, A.F. Exploring bacterial carboxylate reductases for the reduction of bifunctional carboxylic acids. Biotechnology Journal 2017, 1600751-n/a.

22. Venkitasubramanian, P.; Daniels, L.; Rosazza, J.P. Reduction of carboxylic acids by nocardia aldehyde oxidoreductase requires a phosphopantetheinylated enzyme. J Biol Chem 2007, 282, 478-485.

23. Lundemo, M.T.; Notonier, S.; Striedner, G.; Hauer, B.; Woodley, J.M. Process limitations of a whole-cell p450 catalyzed reaction using a cyp153a-cpr fusion construct expressed in escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology 2016, 100, 1197-1208.

24. Jeon, H.; Durairaj, P.; Lee, D.; Ahsan, M.M.; Yun, H. Improved nadph regeneration for fungal cytochrome p450 monooxygenase by co-expressing bacterial glucose dehydrogenase in resting-cell biotransformation of recombinant yeast. Journal of microbiology and biotechnology 2016, 26, 2076-2086.

25. Jung, E.; Park, B.G.; Ahsan, M.M.; Kim, J.; Yun, H.; Choi, K.-Y.; Kim, B.-G. Production of ω-hydroxy palmitic acid using cyp153a35 and comparison of cytochrome p450 electron transfer system in vivo. Applied Microbiology and Biotechnology 2016, 100, 10375-10384.

26. Sambrook, J. Molecular cloning : A laboratory manual / joseph sambrook, david w. Russell. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y, 2001.

27. Hanahan, D. Studies on transformation of escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology 1983, 166, 557-580.

SEQUENCE LISTING <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> RECOMBINANT MICROORGANISM PRODUCING α,ω-DIOLS AND PRODUCING METHOD FOR α,ω-DIOLS <130> 2018-I001/P18U10C0055 <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1174 <212> PRT <213> Mycobacterium marinum <220> <221> misc_feature <223> carboxylic acid reductase <400> 1 Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala 20 25 30 Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile 35 40 45 Glu Thr Val Met Thr Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Ala Gln Arg 50 55 60 Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg 65 70 75 80 Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg 85 90 95 Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro 100 105 110 Gly Asp Arg Val Cys Leu Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr 115 120 125 Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln 130 135 140 Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln 145 150 155 160 Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu 165 170 175 Leu Ala Leu Ser Gly Gln Thr Ala Thr Arg Val Leu Val Phe Asp His 180 185 190 His Arg Gln Val Asp Ala His Arg Ala Ala Val Glu Ser Ala Arg Glu 195 200 205 Arg Leu Ala Gly Ser Ala Val Val Glu Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala 210 215 220 Arg Gly Asp Val Pro Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Thr 225 230 235 240 Asp Val Ser Asp Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser 245 250 255 Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr 260 265 270 Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile 275 280 285 Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Gln Ile Leu 290 295 300 Tyr Gly Thr Leu Cys Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser 305 310 315 320 Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu 325 330 335 Leu Thr Phe Val Pro Arg Val Trp Asp Met Val Phe Asp Glu Phe Gln 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550 555 560 Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln 565 570 575 Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp 580 585 590 Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr 595 600 605 Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu 610 615 620 Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu 625 630 635 640 Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr 645 650 655 Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val 660 665 670 Gln Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala 675 680 685 Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro 690 695 700 Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp 705 710 715 720 Tyr Val Glu Ala Ala Arg Lys Pro Gly Ser Ser Arg Pro Thr Phe Ala 725 730 735 Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly 740 745 750 Asp Leu Ser Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Ala Thr Leu Ala Glu Ala 755 760 765 Pro Arg Leu Pro Ala Ala Asn Thr Gln Val Arg Thr Val Leu Leu Thr 770 775 780 Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu 785 790 795 800 Arg Met Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Cys Leu Val Arg Ala Lys 805 810 815 Ser Asp Thr Glu Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly 820 825 830 Asp Pro Glu Leu Leu Ala His Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp His Leu 835 840 845 Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asp Leu Gly Leu Asp Arg 850 855 860 Gln Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Leu Ile Val Asp Pro 865 870 875 880 Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro 885 890 895 Asn Ala Leu Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys 900 905 910 Ile Lys Pro Tyr Ser Tyr Thr Ser Thr Ile Gly Val Ala Asp Gln Ile 915 920 925 Pro Pro Ser Ala Phe Thr Glu Asp Ala Asp Ile Arg Val Ile Ser Ala 930 935 940 Thr Arg Ala Val Asp Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Ser Lys 945 950 955 960 Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu 965 970 975 Pro Val Ala Val Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Trp 980 985 990 Ala Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Met Phe Thr Arg Met Ile Leu Ser 995 1000 1005 Leu Ala Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Asp Gly Ala Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val 1025 1030 1035 Glu Phe Ile Ala Glu Ala Ile Ser Thr Leu Gly Ala Gln Ser Gln 1040 1045 1050 Asp Gly Phe His Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly 1055 1060 1065 Ile Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp Trp Leu Asn Glu Ser Gly Cys 1070 1075 1080 Pro Ile Gln Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Asp Trp Leu Gln Arg Phe 1085 1090 1095 Glu Thr Ala Leu Arg Ala Leu Pro Asp Arg Gln Arg His Ser Ser 1100 1105 1110 Leu Leu Pro Leu Leu His Asn Tyr Arg Gln Pro Glu Arg Pro Val 1115 1120 1125 Arg Gly Ser Ile Ala Pro Thr Asp Arg Phe Arg Ala Ala Val Gln 1130 1135 1140 Glu Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp Ile Pro His Val Gly Ala 1145 1150 1155 Pro Ile Ile Val Lys Tyr Val Ser Asp Leu Arg Leu Leu Gly Leu 1160 1165 1170 Leu <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Marinobacter aquaeolei <220> <221> misc_feature <223> MaqCYP153A33, oxygenase <400> 2 Met Pro Thr Leu Pro Arg Thr Phe Asp Asp Ile Gln Ser Arg Leu Ile 1 5 10 15 Asn Ala Thr Ser Arg Val Val Pro Met Gln Arg Gln Ile Gln Gly Leu 20 25 30 Lys Phe Leu Met Ser Ala Lys Arg Lys Thr Phe Gly Pro Arg Arg Pro 35 40 45 Met Pro Glu Phe Val Glu Thr Pro Ile Pro Asp Val Asn Thr Leu Ala 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Asp Val Ser Asn Pro Phe Leu Tyr Arg Gln Gly Gln 65 70 75 80 Trp Arg Ala Tyr Phe Lys Arg Leu Arg Asp Glu Ala Pro Val His Tyr 85 90 95 Gln Lys Asn Ser Pro Phe Gly Pro Phe Trp Ser Val Thr Arg Phe Glu 100 105 110 Asp Ile Leu Phe Val Asp Lys Ser His Asp Leu Phe Ser Ala Glu Pro 115 120 125 Gln Ile Ile Leu Gly Asp Pro Pro Glu Gly Leu Ser Val Glu Met Phe 130 135 140 Ile Ala Met Asp Pro Pro Lys His Asp Val Gln Arg Ser Ser Val Gln 145 150 155 160 Gly Val Val Ala Pro Lys Asn Leu Lys Glu Met Glu Gly Leu Ile Arg 165 170 175 Ser Arg Thr Gly Asp Val Leu Asp Ser Leu Pro Thr Asp Lys Pro Phe 180 185 190 Asn Trp Val Pro Ala Val Ser Lys Glu Leu Thr Gly Arg Met Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Leu Asp Phe Pro Tyr Glu Glu Arg His Lys Leu Val Glu Trp 210 215 220 Ser Asp Arg Met Ala Gly Ala Ala Ser Ala Thr Gly Gly Glu Phe Ala 225 230 235 240 Asp Glu Asn Ala Met Phe Asp Asp Ala Ala Asp Met Ala Arg Ser Phe 245 250 255 Ser Arg Leu Trp Arg Asp Lys Glu Ala Arg Arg Ala Ala Gly Glu Glu 260 265 270 Pro Gly Phe Asp Leu Ile Ser Leu Leu Gln Ser Asn Lys Glu Thr Lys 275 280 285 Asp Leu Ile Asn Arg Pro Met Glu Phe Ile Gly Asn Leu Thr Leu Leu 290 295 300 Ile Val Gly Gly Asn Asp Thr Thr Arg Asn Ser Met Ser Gly Gly Leu 305 310 315 320 Val Ala Met Asn Glu Phe Pro Arg Glu Phe Glu Lys Leu Lys Ala Lys 325 330 335 Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Val Ser Glu Ile Ile Arg Trp Gln Thr 340 345 350 Pro Leu Ala Tyr Met Arg Arg Ile Ala Lys Gln Asp Val Glu Leu Gly 355 360 365 Gly Gln Thr Ile Lys Lys Gly Asp Arg Val Val Met Trp Tyr Ala Ser 370 375 380 Gly Asn Arg Asp Glu Arg Lys Phe Asp Asn Pro Asp Gln Phe Ile Ile 385 390 395 400 Asp Arg Lys Asp Ala Arg Asn His Met Ser Phe Gly Tyr Gly Val His 405 410 415 Arg Cys Met Gly Asn Arg Leu Ala Glu Leu Gln Leu Arg Ile Leu Trp 420 425 430 Glu Glu Ile Leu Lys Arg Phe Asp Asn Ile Glu Val Val Glu Glu Pro 435 440 445 Glu Arg Val Gln Ser Asn Phe Val Arg Gly Tyr Ser Arg Leu Met Val 450 455 460 Lys Leu Thr Pro Asn Ser 465 470 <210> 3 <211> 672 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> misc_feature <223> phosphopantetheinyl transferase <400> 3 atgaagatct acggtatcta catggaccgc cctctgtctc aagaggagaa cgagcgtttc 60 atgactttca tctccccaga gaagcgtgac cgttgtcgtc gtttctacca taaggaagac 120 gcacatcgta ctctgctggg tgatgtactg gtacgttctg ttatcagccg tcaataccag 180 ctggacaaaa gcgacatccg tttctctacc caggaatacg gtaaaccgtg tatccctgac 240 ctgccagatg cacacttcaa tatctcccac tctggtcgct gggttatcgg tcgctgcgat 300 tctcagccga ttggcattga tatcgaaaaa accaaaccga tctctctgga aatcgctaaa 360 cgcttcttct ccaaaaccga atacagcgac ctgctggcta aagacaaaga cgaacagacc 420 gactacttct atcacctgtg gagcatgaaa 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attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480 agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540 attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600 gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660 ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720 ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780 ggttaa 786

Claims (15)

1. (a) 수산화 지방산을 기질로 포함하는 배지에서, 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 포스포판테티에닐 전이효소(phosphopantetheinyl transferase; PPTase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
   포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase; GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리포스페이트 키나아제 2(polyphosphate kinase 2; PPK2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 배양하여 α,ω-디올을 생산하는 것을 포함하는 α,ω-디올의 생산방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a)를 수행하기 전에, 기질로서 지방산을 포함하는 배지에서, 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자; 푸티다레독신 환원효소 CamA(Putidaredoxin reductase CamA)를 코딩하는 유전자; 및 푸티다레독신 환원효소 CamB(Putidaredoxin reductase CamB)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 배양하여 수산화 지방산을 생산하는 것; 을 더 포함하는 α,ω-디올의 생산방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 재조합 미생물 배양은 pH 6.0 내지 pH 9.0에서 수행되는 것인, α,ω-디올의 생산방법.
4. 제1항에 있어서,
   배지 내 수산화 지방산의 농도는 40mM 이하인, α,ω-디올의 생산방법.
5. 알데하이드 환원효소(aldehyde reductase; ALR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카르복실산 환원효소(carboxylic acid reductase; CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 포스포판테티에닐 전이효소(phosphopantetheinyl transferase; PPTase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
   포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase; GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리포스페이트 키나아제 2(polyphosphate kinase 2; PPK2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 기질로서 수산화 지방산으로부터 α,ω-디올 생산능을 갖는 재조합 미생물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터에 포함되며, 상기 발현벡터는 pET24ma, pETduet1 및 pQE-80L로 이루어진 군에서 선택된 것인, 재조합 미생물.
7. 제5항에 있어서,
   상기 미생물은 카르복실산 환원효소(CAR);와 포도당 탈수소효소(GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리포스페이트 키나아제 2(PPK2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현 벡터; 및
   포스포판테티에닐 전이효소(PPTase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현 벡터를 포함하는 것인 재조합 미생물.
8. 제5항에 있어서,
   상기 카르복실산 환원효소(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 CAR 효소를 코딩하는 것인, 재조합 미생물.
9. 제5항에 있어서,
   포스포판테티에닐 전이효소(PPTase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열로 이루어지는 것인, 재조합 미생물.
10. 제5항에 있어서,
    상기 알데하이드 환원효소를 코딩하는 유전자는 내인성 유전자인 재조합 미생물.
11. 제5항에 있어서,
    상기 포도당 탈수소효소(GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 서열로 이루어지고; 폴리포스페이트 키나아제 2(PPK2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열로 이루어지는 것인 재조합 미생물.
    
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