KR102152022B1 - 항산화능을 갖는 건강보조식품 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서목태 발효물, 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수를 함유하는 복합 조성물의 발효물을 포함하는 건강보조식품에 관한 것이다. 이를 통해, 본 발명은 암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 가지며, 간독성을 유발하지 않고, 면역능을 증진시킬 수 있는 건강보조식품을 제공하는 효과를 구현한다.

Description

항산화능을 갖는 건강보조식품 및 이의 제조 방법{FUNCTIONAL FOOD HAVING ANTIOXIDATIVE ACTIVITY AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 갖는 건강보조식품 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

암은 한국에서 34년째 사망원인의 1위를 차지하는 질병으로 종양(tumor) 중에서 성장속도가 빠르고 주변조직에 침윤(invasiveness)하며 전이(metastasis)의 특징을 가지는 악성종양(malignant tumor)을 의미한다. 암세포는 정상세포가 여러 가지 발암요인으로 돌연변이 된 세포로서 세포주기 조절의 교란에 의해 무제한 증식하는 불멸세포화(immortalization)화된 세포이다.

항암치료법에는 수술, 방사선 치료, 화학 항암제 치료, 면역요법, 표적치료 등이 있으나, 각각의 치료에는 부작용, 재발 및 합병증 등의 문제점이 있다. 어느 치료법을 사용하더라도 암세포와 암세포가 발생한 주변 부위의 신체 조직은 전이 방지를 위해 제거되기 때문에 인체 조직 손실에 따른 부작용이 수반되며, 이는 환자에게 큰 부담으로 작용한다.

최근 국내에서는 고칼로리, 고지방, 저섬유질 위주로 변화된 식생활로 인해 특히 대장암과 같은 소화기관계 암의 발병률이 높아지고 있다. 대장은 소화기관의 마지막 부위로 소화된 유기물로부터 수분과 전해질을 흡수하는 것을 주요한 기능으로 한다. 이러한 기능적 특성에 의해 대장암의 발병은 식생활과 밀접한 관계가 있으며, 섭취하는 식품을 개선하는 것이 발병률을 낮추는 효과적인 방법으로 이용될 수 있다.

이에 따라, 항암치료법에 의한 부작용을 저감하면서도 인체에 해가 없는 천연물을 건강보조식품으로 활용하여 예방적으로 사용이 가능하면서도, 항암 보조 효능을 갖는 양질의 영양 성분을 충분히 공급하고, 부작용 및 합병증을 최소화하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다.

본 발명의 하나의 목적은 암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 가지며, 간독성을 유발하지 않고, 면역능을 증진시킬 수 있는 건강보조식품 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예는 서목태 발효물, 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수를 함유하는 복합 조성물의 발효물을 포함하는 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 갖는 건강보조식품에 관한 것이다.

상기 복합 조성물은 서목태 발효물 10 중량% 내지 40 중량%, 유황 오리 추출물 4 중량% 내지 15 중량%, 마늘 추출물 2 중량% 내지 15 중량%, 유근피 추출물 2 중량% 내지 15 중량%, 금은화 추출물 0.5 중량% 내지 10 중량%, 포공영 추출물 0.5 중량% 내지 10 중량% 및 죽염수 10 중량% 내지 80 중량%를 함유할 수 있다.

상기 서목태 발효물은 서목태를 황국균(Aspergillus oryzae)에 의해 1차 발효한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 서목태에 황국균(Aspergillus oryzae)을 접종하여 서목태 발효물을 제조하는 1차 발효 단계; 상기 서목태 발효물에 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수를 첨가하여 복합 조성물을 제조하고, 상기 복합 조성물을 발효시키는 2차 발효 단계; 및 상기 2차 발효 단계 이후, 발효물을 3일 내지 180일간 숙성한 후, 여과 및 가열 살균하는 단계; 를 포함하는 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 갖는 건강보조식품의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 가지며, 간독성을 유발하지 않고, 면역능을 증진시킬 수 있는 건강보조식품 및 이의 제조 방법을 제공한다.

도 1은 실시예 1 및 비교예 2 내지 7의 SC₅₀값 산출 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 3의 체중 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 3의 사료 섭취량 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 3의 간과 신장의 장기 무게 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4의 종양 무게 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 4의 종양 부피 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 4의 종양 부피 변화 실측한 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 5의 세포주기 촉진인자 억제 검증 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 일 구현예는 서목태 발효물, 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수를 함유하는 복합 조성물의 발효물을 포함하는 건강보조식품에 관한 것이다.

이를 통해, 본 발명은 암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 가지며, 간독성을 유발하지 않고, 면역능을 증진시킬 수 있는 건강보조식품을 제공하는 효과를 구현한다.

특히, 본 발명의 건강보조식품은 인체 대장암 세포(human colon cacer)에 대해 우수한 증식 억제능을 구현할 수 있으며, 전체 성분의 복합 상승 작용에 의해 각각의 성분을 동량으로 사용한 경우에 비해 현저하게 향상된 항산화능을 구현할 수 있다.

본 명세서에서 각 성분의 "추출물"은 원료로부터 일반적인 추출 방식에 의해 얻어지는 것으로 물질의 상태(pahse)에 따라 제한되지 않으며, 예를 들면 액상, 고상, 혼합상 등일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 복합 조성물의 발효물을 포함하는 건강보조식품으로, 상기 복합 조성물에는 서목태 발효물, 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수가 포함된다.

상기 전체 복합 조성물 중 서목태 발효물은 서목태를 불림, 가열 또는 익힘 처리한 서목태를 전체 복합 조성물의 발효에 앞서 1차 발효시킨 것으로부터 수득하여 이용한다.

상기 서목태(鼠目太)는 학명으로 여우콩속 쥐눈이콩과(Rhynchosia Nulubilis)에 속하는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 같은 검은콩에 속하는 흑태, 서리태 등과는 식물학적으로 명백하게 구분되며, 주요한 영양 성분에 차이가 있다. 상기 서목태는 아글리콘(aglycone), 제니스테인(genistein), 다이진(daidzin) 등의 성분과 이외의 이소플라본(isoflavone) 성분을 고함량으로 포함하여, 항암, 항염증 및 면역력 증진 효능을 구현한다.

또한, 서목태는 해독작용, 당뇨치료, 중풍치료에 효능이 뛰어나고(본초강목), 신장병에 좋고 기를 내려서 모든 풍열을 억제하며(동의보감), 독성을 해소하고 혈액순환을 활발하게 하며(한방집성방), 중풍과 풍비 산후의 냉혈을 저감시키고, 속을 다스리고 관맥을 통하여 모든 약독을 제거하며(명의별), 대변을 본 후 항문에 피가 나는 증상을 저감하고(보제방), 속을 편하게 하고 기를 내리며(임화본초), 중풍으로 인해 약해진 다리와 산후의 모든 병을 다스리는 효과(식물본초)를 구현할 수 있다.

상기 서목태 발효물은 서목태를 중량 2 배수 내지 6 배수의 물을 첨가하여 불림하거나, 상기 불림 처리된 서목태를 2 배수 내지 6 배수의 물이 포함된 상태로 80℃ 내지 100℃에서 1 시간 내지 3 시간 동안 익힘 처리한 후, 실온 또는 상온에서 황국균(Aspergillus oryzae)에 의해 1차 발효한 후 이용될 수 있다. 이러한 경우, 발효에 의해 서목태가 포함하는 유효 성분의 흡수량이 증대되며, 황국균 이외의 다른 미생물에 의해 발효되는 경우에 비해 항암, 항염증 및 면역력이 더욱 향상되어, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현할 수 있다.

상기 1차 발효 조건은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 불림처리한 서목태에 황국균(aspergillus oryzae)에 속하는 균주를 접종한 후, 20 시간 내지 30 시간 동안, 20℃ 내지 45℃의 상온에서 자연 발효시키는 것일 수 있다.

상기 서목태 발효물은 전체 복합 조성물 중 10 중량% 내지 40 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 암 세포 증식 억제능, 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 전체 복합 조성물 중 유황 오리 추출물은 천연 유황을 5g/day 내지 7g/day의 양으로 3개월 내지 12개월 섭취시켜 생육한 오리의 깃털 등을 제거한 후 세척한 전체 부위를 이용한 추출물을 의미한다. 상기 유황 오리 추출물은 각종 니아신 및 시스테인과 같은 필수아미노산, 식이유황, 칼슘, 오메가 3와 같은 다중 불포화지방산 등의 성분을 고함량으로 포함하여, 항암, 항염증 및 면역력 증진 효능을 구현하며, 인체에 자양 강장 효과를 부여할 수 있어, 건강보조적 효능이 더욱 우수하다.

상기 유황 오리 추출물은 특별히 제한되지 않으나, 4 배수 내지 10 배수의 물 또는 10 v/v% 내지 60 v/v% 함수 에탄올을 첨가한 후 80℃ 내지 100℃에서 가열 추출한 추출물일 수 있다. 유황 오리 추출물의 고형분 함량은 5 중량% 내지 15 중량%일 수 있다. 이러한 경우, 필수아미노산, 식이유황 및 다중 불포화지방산과 같은 유효 성분의 함량이 고농도로 추출되면서도, 건강보조식품으로 사용하기에 우수한 효능을 가지며, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 유황 오리 추출물은 전체 복합 조성물 중 4 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 전체 복합 조성물 중 마늘 추출물은 마늘 열매의 껍질을 제거한 생육을 추출한 것을 의미한다. 상기 마늘 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 C, 글루탐산(glutamic acid), 칼슘, 철, 인, 아연, 셀레늄, 알리신 등의 성분을 고함량으로 포함하여, 항암, 항염증 및 면역력 증진 효능을 구현하며, 강력한 항산화 효과를 부여할 수 있어, 건강보조적 효능이 더욱 우수하다.

또한, 상기 마늘 추출물은 살균, 살충, 거악생신하는 작용이 뛰어나고, 여러 질환에 효능이 있(본초강목), 장기 복용해도 인체에 해가 없으며(산농본초), 살균, 정장(整腸), 각기 개선, 백일해 개선, 폐결핵 개선, 강장 등의 효과를 발휘할 수 있다.

상기 마늘 추출물은 특별히 제한되지 않으나, 2 배수 내지 6 배수의 물 또는 10 v/v% 내지 60 v/v% 함수 에탄올을 첨가한 후 80℃ 내지 100℃에서 가열 추출한 추출물일 수 있다. 상기 마늘 추출물의 고형분 함량은 2 중량% 내지 15 중량%일 수 있다. 이러한 경우, 유효 성분의 함량이 고농도로 추출되면서도, 건강보조식품으로 사용하기에 우수한 효능을 가지며, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 마늘 추출물은 전체 복합 조성물 중 2 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 전체 복합 조성물 중 유근피 추출물은 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica) 뿌리의 껍질을 말린 건조물의 추출물을 의미한다. 상기 유근피 추출물은 루테올, 피토스테롤 성분을 고함량으로 포함하여, 세포보호, 항염, 천식 및 면역력 증진에 효과를 구현할 수 있어 건강보조적 효능이 더욱 우수하다.

상기 유근피 추출물은 특별히 제한되지 않으나, 4 배수 내지 10 배수의 물 또는 10 v/v% 내지 60 v/v% 함수 에탄올을 첨가한 후 80℃ 내지 100℃에서 가열 추출한 추출물일 수 있다. 상기 유근피 추출물의 고형분 함량은 2 중량% 내지 10 중량%일 수 있다. 이러한 경우, 유효 성분의 함량이 고농도로 추출되면서도, 건강보조식품으로 사용하기에 우수한 효능을 가지며, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 유근피 추출물은 전체 복합 조성물 중 2 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 전체 복합 조성물 중 금은화 추출물은 인동덩굴(Lonicerae Japonica Thunberg)의 꽃 건조물의 추출물을 의미한다. 상기 금은화 추출물은 루테올린(luteolin), 아피제닌(apigenin), 퀘르세틴(quercetin) 등의 플라보노이드 성분을 고함량으로 포함하여, 항암, 항염증 및 면역력 증진 효능을 구현하며, 식중독 예방, 치은염 예방 등의 효과를 부여할 수 있어, 건강보조적 효능이 더욱 우수하다.

상기 전체 복합 조성물 중 금은화 추출물은 특별히 제한되지 않으나, 2 배수 내지 6 배수의 물 또는 10 v/v% 내지 60 v/v% 함수 에탄올을 첨가한 후 80℃ 내지 100℃에서 가열 추출한 추출물일 수 있다. 상기 금은화 추출물의 고형분 함량은 1 중량% 내지 8 중량%일 수 있다. 이러한 경우, 유효 성분의 함량이 고농도로 추출되면서도, 건강보조식품으로 사용하기에 우수한 효능을 가지며, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 금은화 추출물은 전체 복합 조성물 중 0.5 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 포공영 추출물은 민들레(Taraxacum platycarpum H. Dahlstedt), 털민들레 (Taraxacum mongolicum Handel-Mazzetti), 흰민들레(Taraxacum coreanum Nakai) 및 서양민들레(Taraxacum officinale Weber) 등의 동속 근연식물의 전초 건조물의 추출물을 의미한다. 상기 포공영 추출물은 타라크사신(taraxacin), 타락사롤(taraxarol), 아스파라긴(asparagin) 등의 성분을 고함량으로 포함하여, 항암, 항염증 및 면역력 증진 효능을 구현하며, 해열, 소염, 이뇨, 건위, 해열해독, 항균 효과를 부여할 수 있어, 건강보조적 효능이 더욱 우수하다.

상기 포공영 추출물은 특별히 제한되지 않으나, 2 배수 내지 6 배수의 물 또는 10 v/v% 내지 60 v/v% 함수 에탄올을 첨가한 후 80℃ 내지 100℃에서 가열 추출한 추출물일 수 있다. 상기 포공영 추출물의 고형분 함량은 1 중량% 내지 8 중량%일 수 있다. 이러한 경우, 유효 성분의 함량이 고농도로 추출되면서도, 건강보조식품으로 사용하기에 우수한 효능을 가지며, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 포공영 추출물은 전체 복합 조성물 중 4 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 죽염수는 죽염을 4 w/v% 내지 30 w/v%의 농도로 함유하는 수용액을 400mesh로 여과한 것을 의미한다. 상기 죽염(bamboo salt)은 죽염은 대나무 통 속에 천일염을 투입하여, 아홉번 고온처리를 반복하여 제조되는 것으로, 위장을 튼튼히 하고, 해독작용이 우수할 뿐 아니라 백혈구를 증가시켜 살균력을 강화시키고, 정혈, 소염, 해열에 탁월하며, 공기를 정화하고 악취를 제거하고 식욕을 촉진시키는 등의 효능이 있다. 또한, 죽염은 천일염과 달리 중금속이 완전히 제거되며, 각종 미네랄이 더욱 풍부하고, 알칼리성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 상기 죽염은 우리나라 천일염을 지리산 왕대나무에 다져 넣고, 소나무 장작으로 태우는 공정을 8번 반복하고 9번째는 송진으로 1,400℃ 이상의 고열로 녹여 내린 9회 자죽염일 수 있다. 이러한 9회 자죽염은 위염, 위궤양 등 위장병 계통환자에게 총 91.95%의 유효 개선율을 구현하며, 위나 장의 점막에 독성 또는 인체손상작용이 없다. 또한, 산성인 종래의 소금, 천일염과 달리 pH 8~13의 알칼리성으로, 산성화된 식단을 중화시키는 효과가 있으며, 염증을 일으키는 물질의 생성을 억제시키는 효과를 구현할 수 있다.

상기 죽염수는 전체 복합 조성물 중 10 중량% 내지 80 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서, 보다 우수한 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 구현하면서도, 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 건강보조식품은 상기 유황 오리 추출물 2 중량%, 마늘 추출물 6 중량%, 유근피 추출물 2 중량%, 금은화 추출물 1 중량%, 포공영 추출물 1 중량%, 25 w/v% 농도의 죽염수 62 중량% 및 1차 발효된 발효 서목태 발효물 26 중량%를 함유하는 복합 조성물을 2차 발효한 발효물을 포함한다. 이러한 경우, 본 발명은 더욱 향상된 암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 가지며, 간독성을 유발하지 않고, 면역능을 증진시킬 수 있는 건강보조식품을 제공하는 효과를 구현한다.

본 발명의 다른 구현예는 서목태에 황국균(Aspergillus oryzae)을 접종하여 서목태 발효물을 제조하는 1차 발효 단계; 상기 서목태 발효물에 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수를 첨가하여 복합 조성물을 제조하고, 상기 복합 조성물을 발효시키는 2차 발효 단계; 및 상기 2차 발효 단계 이후, 발효물을 3 내지 180일간 숙성한 후, 여과 및 가열 살균하는 단계; 를 포함하는 대장암 세포 증식 억제능 및 항산화능을 갖는 건강보조식품의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 건강보조식품 제조 방법에서 사용되는 서목태 발효물, 유황 오리 추출물, 마늘 추출물, 유근피 추출물, 금은화 추출물, 포공영 추출물 및 죽염수에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

상기 2차 발효 단계에서, 상기 복합 조성물을 발효하는 조건은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 상기 복합 조성물을 20 시간 내지 30 시간 동안 25℃ 내지 45℃의 상온에서 자연 발효 시키는 것일 수 있다. 이때, 2차 발효는 추가 균주가 접종되거나 또는 1차 발효에서 서목태 발효물에 포함된 황국균(aspergillus oryzae)에 의해 추가 발효되는 것일 수 있다. 이러한 경우, 복합 조성물에 포함된 각각의 추출물로부터 유래된 성분의 체내 흡수율을 증진시키면서도, 보다 다양한 영양 성분을 공급하여 건강보조식품으로 사용하기에 우수한 효능을 가지며, 장기간 섭취 시에도 간독성의 발생을 방지할 수 있다.

상기 2차 발효 단계 이후, 발효물은 3일 내지 180일간 숙성된 후, 여과 및 가열 살균하여 건강보조식품으로 이용된다. 상기 숙성 방법은 구체적으로 발효물을 5℃ 내지 30℃의 조건에서 빛을 차단한 후 보관하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 고분자의 분해에 의한 저분자 유효성분이 더욱 증가될 수 있다.

상기 여과 및 가열 살균 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 식품용 여과포를 이용하여 숙성이 완료된 발효물로부터 불용물을 제거한 후, 이를 80℃내지 100℃에서 1시간 내지 6시간 동안 가열살균처리하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 건강보조식품 내의 유효 성분의 함량 변화를 방지하면서도, 부패 및 산패를 방지한 상태로 장기간 보관할 수 있다.

본 발명의 건강보조식품은 다양한 형태로 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 건강보조식품은 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 유가공품, 식육제품, 어육제품, 두부류 또는 묵류, 식용유지류, 면류, 다류, 음료류, 특수영양식품, 조미식품, 얼음, 인삼제품류, 김치절임식품, 건포류 외 기타 식품류에 적용된 식품으로 이용될 수 있으며, 상기 식품류의 구체적인 종류는 제한되지 않는다.

실시예

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다. 본 명세서에서 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

제조예 1

중량 3배수의 물을 첨가하여 불림처리한 서목태를 4 배수의 물로 100℃에서 3 시간 동안 익힘 처리한 후, 실온에서 냉각하고, 황국균(Aspergillus oryzae)을 10g/kg로 접종하고, 35℃의 온도에서 24 시간 동안 1차 발효하여 수득하였다.

제조예 2

깃텃을 제거하는 가공 후 세척한 유황 오리 전부위에 4 배수의 식용수를 가하여 100℃에서 2 시간 동안 열수 추출하여 유황 오리 추출물을 수득하였다. 고형분 함량은 8.4 중량%이다.

제조예 3

마늘 생육에 4 배수의 식용수를 가하여 100℃에서 2시간 동안 열수 추출하여 마늘 추출물을 수득하였다. 고형분 함량은 7.8 중량%이다.

제조예 4

유근피 건조물에 10 배수의 식용수를 가하여 100℃에서 4 시간 동안 열수 추출하여 유근피 추출물을 수득하였다. 고형분 함량은 6.7중량%이다.

제조예 5

금은화 건조물에 4 배수의 식용수를 가하여 100℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 금은화 추추물을 수득하였다. 고형분 함량은 4.5 중량%이다.

제조예 6

포공영 건조물에 4 배수의 식용수를 가하여 100℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 포공영 추출물을 수득하였다. 고형분 함량은 3.2중량%이다.

제조예 7

천일염을 9회 구워 제조한 9회 자죽염에 4배수의 식용수를 가하여, 25 w/v%의 죽염수를 준비하였다.

실시예 1

상기 제조예 1 내지 7에서 준비된 서목태 발효물 26 중량%, 유황 오리 추출물 2 중량%, 마늘 추출물 6 중량%, 유근피 추출물 2 중량%, 금은화추출물 1 중량%, 포공영추출물 1 중량%, 25 w/v%의 죽염수 62 중량%를 혼합하여, 20℃에서 180일간 2차 발효 및 숙성을 진행하였다. 상기 2차 발효 및 숙성이 완료된 후 결과물을 여과 및 100℃에서 4 시간 동안 가열 살균하여 실시예 1의 건강보조식품을 제조하였다.

비교예 1

상기 제조예 1에서 준비된 서목태 발효물을 20℃ 에서 180일간 2차 발효 및 숙성을 진행하였다. 상기 2차 발효 및 숙성이 완료된 후 결과물을 여과 및 100℃ 에서 4시간 가열 살균하여 비교예 1의 건강보조식품을 제조하였다.

비교예 2 내지 7

상기 제조예 1에서 준비된 서목태 발효물 대신 제조예 2 내지 7에서 준비된 동량의 유황 오리 추출물(비교예 2), 마늘 추출물(비교예 3), 유근피 추출물(비교예 4), 금은화 추출물(비교예 5), 포공영 추출물(비교예 6), 죽염수(비교예 7)를 각각 사용한 것을 제외하고, 비교예 1과 동일한 방법으로 비교예 2 내지 7의 건강보조식품을 제조하였다.

<실험예>

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 7에서 제조된 건강보조식품 시료에 대하여 하기와 같이 실험예 1 내지 5의 실험을 통해 효능을 평가하였다.

실험예 1. 항산화능 평가 실험

암의 예방과 치료에 영향을 미치는 항산화능을 분석하기 위해 매우 안정한 프리 라디칼(free radical)인 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)가 수소 양성자 라디칼 스캐빈저(hydrogen proton-radical scavenger)에 의해 보라색에서 노란색의 1,1-다이페닐-2-파이크릴하이드라진 (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazine)으로 변색되는 현상을 이용하여 각 샘플의 전자 공여능을 측정하였다.

실험방법 : 실시예 1 및 비교예 2 내지 7의 시료를 농도별 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 %)로 정제수에 용해 후 각각 75μl를 DPPH(0.2mM in ethanol)용액 750μl와 3차 정제수 675μl으로 혼합하였다. 상온에서 30분간 반응시킨 후, 96well plate에 반응액 200μl를 옮긴 후 ELISA reader 기기(Molecular Devices, CA, USA)로 520nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

각 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성(%)은 하기 식 1의 계산식으로 산출하였다.

[식 1]

DPPH 라디칼 소거활성(%) = {1 - (시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가군의 흡광도}} X 100

상기 식 1에서 산출된 DPPH 라디칼 소거 활성(%)에 대하여, 양성대조물질로 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG, 갈산염-3-에피갈로카테킨)를 사용하여 SC₅₀값(발생한 라디칼 50%를 소거하는데 필요한 최소농도)을 μg/ml 단위로 표시하였다.

실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타냈으며, Student’s t-test로 통계처리하여 비교하였다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결과는 하기 도 1 및 표 1에 나타내었다.

구분	원료	SC50값 (μg/ml)
실시예 1	서목태 발효조성물	78.21 ± 5.17
비교예 1	발효서목태 여과물	419.33 ± 63.98
비교예 2	유황 오리 추출물	492.97 ± 32.49
비교예 3	마늘추추물	295.36 ± 38.61
비교예 4	유근피추출물	151.28 ± 15.29
비교예 5	금은화추출물	126.87 ± 5.69
비교예 6	포공영추출물	132.51 ± 9.66
비교예 7	죽염수	814.26 ± 66.92

도 1 및 표 1을 통해 알 수 있는 바와 같이 실시예 1의 시료가 비교예 1 내지 7의 시료 대비 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 최소값인 SC₅₀ 값이 78.21 ± 5.17 μg/ml로 항산화능이 가장 우수하였다.

또한, 상기 결과를 통해 본 발명의 실시예 1은 비교예 1 내지 7의 시료의 혼합을 통해 달성할 수 있는 정도에 비해 현저하게 향상된 항산화능을 구현하는 것으로, 전체 조성에 의해 복합 상승적인 항산화능 향상 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 2. in vitro 유전독성시험

실시예 1에 대해 유전자돌연변이 유발성을 히스티딘 요구성인 살모넬라균 (Salmonella typhimurium)의 한 종류인 TA1535를 이용하여 비임상시험관리기준 (식품의약품안전처 고시 제2014-67호, 2014년 02월 12일) 및 의약품등의 독성시험기준 (식품의약품안전처 고시 제2015-82호, 2015년 11월 11일)를 준수하여 박테리아를 이용한 복귀돌연변이 시험을 수행하였다.

실험방법 : 대사활성화 비존재하에서는 각 용량의 시험물질, 음성 및 양성대조물질을 각각 100 μL씩 건열멸균한 유리시험관에 넣고, phosphate buffered saline(pH 7.4) 500 μL 및 균주 100 μL를 첨가한 후, 각 균주에 맞는 top agar를 2 mL씩 첨가하여 vortexing한다. 그 후, 현탁액을 최소 glucose 한천평판배지에 중층하여 실온에 방치하였다. 대사활성화 존재하에서는 phosphate buffered saline (pH 7.4) 500 μL 대신에 S9 mix 500 μL 를 첨가한다. 그 외의 처리는 동일하게 실시하였다.

잡균에 의한 오염유무를 확인하기 위해, 최고용량의 시험물질액, phosphate buffered saline (pH 7.4) 및 S9 mix를 건열멸균한 유리시험관에 각각 넣고 2 mL top agar에 혼합하여 nutrient agar plate평판에 부어 물질의 오염여부를 확인하였다. Top agar가 굳은 후, 플레이트를 뒤짚어서 37℃ 배양기에서 약 48시간 배양하였다. 복귀돌연변이 콜로니의 계측은 배양종료 후, 육안계수로 복귀돌연변이 콜로니수를 계측하였다. 3개의 플레이트로부터 얻어진 복귀돌연변이 콜로니수의 평균 및 표준편차를 표시하였다. Background lawn 및 microcolony의 확인은 생육저해를 확인하기 위해, 복귀돌연변이 콜로니수 계측시, background lawn의 형성유무를 확인하였다. 생육저해의 판정기준은 음성대조군과 비교해 엷어지거나 없어져 현저히 감소하는 것으로 하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	실시예 1 (2500μg/plate)	실시예 1 (5000μg/plate)	음성대조군 (정제수)	양성대조군 (2-Aminoanthracene)
대사활성화 여부	유	유	유	유
복귀돌연변이 콜로니수	8±2.1	7±1.0	10±1.0	95±4.6
background lawn의 형성유무	무	무	무	무
대사활성화 여부	무	무	무	무
복귀돌연변이 콜로니수	8±1.0	7±1.5	7±2.1	312±10.8
background lawn의 형성유무	무	무	무	무

상기 표 2를 통해 알 수 있는 바와 같이 각 균주별 대사활성화 비존재하 및 존재하의 모든 용량에서 복귀돌연변이 콜로니의 변화가 관찰되지 않았고, 복귀돌연변이 콜로니는 자연복귀돌연변이 콜로니수의 background data 범위 이내이었다. 양성대조군에서는 각 균주의 복귀돌연변이 콜로니수가 음성대조군과 비교하여 2배 이상 확실하게 증가하였다. 시험물질에 의한 생육저해 및 석출은 각 균주별 대사활성화 비존재하 및 존재하의 모든 용량에서 관찰되지 않았다.

이를 통해, 본 발명 실시예 1의 시료는 유전 독성을 발생시키지 않고, 안정성이 우수함을 알 수 있다.

실험예 3. 세포주 이식모델(Tumor xenograft model)을 이용한 in vivo 안전성 확인시험

실험방법 : 본 실험에 사용된 BALB/c-nu mouse는 ㈜두열바이오텍 에서 구입하여 사용하였으며 14~18g의 수컷을 사용하였다. 동물은 2~3마리씩 마우스 사육용 상자에서 사육하였으며 동물실은 온도 20~24℃, 습도 40~70%, 명암주기 12시간으로 조절되었으며 음수와 사료는 자유롭게 섭취토록 하였다. 동물실험의 모든 절차는 호서대학교 안전성평가센터 윤리위원회의 승인을 얻어 수행되었다.

Tumor xenograft model의 제조는 사람 유래 암 세포(HCT116)를 trypsin-EDTA 용액을 이용하여 flask 바닥에서 떼어낸 다음, 20% FBS가 포함되어 있는 DMEM에 1×107 cells/150 μl가 되도록 희석한다. Balb/c nu/nu mice의 좌측 허리에 세포를 150 μl씩 피하주사한다. Caliper를 이용하여 주 2회 암의 크기를 측정한 다음, 크기가 100~200 mm³ 정도 되었을 때 군마다 암의 크기가 일정하도록 하여 6마리씩 나누고 4주 동안 시료를 경구 투여하고, 주 2회 암의 크기와 동물의 몸무게를 측정하였다.

혈액학적 검사는 4주간의 투여 종료 후 실험동물을 CO₂를 흡입시켜 마취시킨 후 복대동맥에서 혈액을 채취하여 채취된 혈액을 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었으며 이 혈청을 사용하여 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), blood urea nitrogen (BUN), creatinine (CRE)을 측정하였다. 조직학적 검사는 간, 신장, 종양조직을 파라핀 절편을 제작하여 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 체중변화 결과를 비교하여 도 2에, 사료 섭취량 변화를 도 3에 나타내었다. 또한, 장기 무게 변화를 표 3 및 도 4에, 혈액학적 변화를 표 4에 나타내었다.

(NC : Normal control, PC : Positive control cisplatin 5mg/kg bw, Low : 실시예 1을 공비 4로 설정, Middle : 실시예 1을 공비 2로 설정, High : 실시예 1 원액)

상대장기무게	간 (단위: g)	신장 (단위: g)
NC	4.46±0.36	0.73±0.04
PC	5.17±0.54	0.78±0.04
Low	4.46±0.51	0.75±0.04
Middle	4.61±0.32	0.75±0.08
High	4.74±0.32	0.76±0.08

Test group	AST	ALT	BUN	CRE
	IU/L	IU/L	mg/dL	mg/dL
NC	144.7 ± 47.4	104.3 ± 46.7	21.2 ± 1.4	0.4 ± 0.0
PC	174.3 ± 23.4	260.7 ± 118.8	23.1 ± 1.5	0.6 ± 0.2
Low	198.4 ± 65.5	197.0 ± 58.4	22.4 ± 0.9	0.4 ± 0.1
Middle	142.3 ± 19.4	204.9 ± 17.3	22.0 ± 0.9	0.4 ± 0.1
High	150.8 ± 74.4	127.8 ± 55.6	21.1 ± 1.2	0.4 ± 0.1

도 2에 나타낸 바와 같이 시험물질에 의한 체중 변화를 확인하기 위하여 시험물질을 4주간 투여 하면서 체중을 측정한 결과 모든 군에서 1~3day에 종양의 이종이식과 실시예 1의 투여로 인한 미약한 체중의 변동과 PC군에서 Cisplatin의 투여로 인하여 3~15day에 체중의 감소가 확인되었으며 15day부터는 체중이 유지되었다. NC와 비교하여 다른 시험물질 투여군 (Low, Middle, High)에서 통계적으로 유의성 있는 체중의 변화는 관찰되지 않았다.

도 3에 나타낸 바와 같이 사료섭취량의 측정결과는 NC에 비해 모든 군에서 약간의 감소하였다가 다시 증가하는 성향을 보였으며 군간의 유의적 변화는 없었다.

표 3과 도 4에 나타낸 바와 같이 장기무게 측정결과 군간의 유의적 차이는 관찰되지 않았다.

표 4에 나타낸 바와 같이 시험물질에 의한 간독성(AST, ALT)과 신장독성(BUN, CRE)을 확인하기 위하여 시험물질을 4주간 투여한 후 생화학적 검사를 실시한 결과 AST는 Low군에서 약 1.3배, Middle 군에서는 약 1.2배정도가 대조군에 비해 높게 확인되었고 ALT는 PC 군에서 약 2.5배, Low군에서 약 1.89배, Middle군에서 1.96배 증가하였다. 통계적 유의성은 없었으며 BUN과 CRE의 수치는 대조군에 비해 큰 변화가 없었다.

이를 통해, 본 발명 실시예 1의 시료는 간 독성을 발생시키지 않고, 안정성이 우수함을 알 수 있다.

실험예 4. 세포주 이식모델(Tumor xenograft model)을 이용한 in vivo 항암효과 확인시험(이식된 종양의 무게 및 부피 변화)

실험방법 : 실험예 3의 동물모델에서 3가지 농도의 실시예 1의 투여에 따른 이식된 종양의 무게 및 부피의 변화를 측정하였다. 무게 변화 결과를 표 5 및 도 5에, 부피 변화 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

(NC : Normal control, PC : Positive control cisplatin 5mg/kg bw, Low : 실시예 1을 공비 4로 설정, Middle : 실시예 1을 공비 2로 설정, High : 실시예 1 원액, 비교예 1 내지 7 : 원액)

상대장기무게	종양 (단위: g)
NC	17.80±10.23
PC	12.72±3.78
Low	16.80±6.85
Middle	15.92±4.95
High	14.71±2.56
비교예 1	17.21±6.12
비교예 2	16.58±7.25
비교예 3	17.95±8.39
비교예 4	16.66±10.62
비교예 5	16.52±5.59
비교예 6	15.87±6.51
비교예 7	16.82±8.25

상기 표 5와 도 5에 나타낸 바와 같이 종양의 무게는 대조군인 PC군에서 가장 낮은 수치를 보였고 통계학적 유의성은 확인되지 않았으나 대조군에 비해 실시예 1의 투여군이 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 도 6에 나타낸 바와 같이 종양의 부피 측정결과 14일부터 종양의 부피가 모든 군에서 급격하게 성장하는 것을 확인 할 수 있고 18일부터는 High와 PC군에서 종양의 성장이 다른 군에 비해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다. 종양의 최종부피측정결과는 PC군이 1479.07mm3 가장 부피가 작게 측정되었으며 시험물질 투여군은 용량 의존적으로 부피가 감소하는 것을 관찰하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이 투여 4주째 NC군은 육안사진에서 다른 군에 비해 가장 종양이 큰 것을 확인 할 수 있으며 육안상으로는 PC군의 종양이 가장 크기가 작았고 실시예 1의 투여군이 대조군에 비해 작아진 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5 세포주 이식모델(Tumor xenograft model)을 이용한 in vivo 항암효과 확인시험(세포주기 촉진인자 억제 검증)

실험방법 : 실험예 3의 동물모델에서 실시예 1의 종양에서의 세포주기 조절 효과를 확인하기 위하여 세포주기 촉진인자로 p-ERK1/2를, 억제인자로 p16에 대한 면역염색을 실시하였다. 결과를 하기 도 8에 나타내었다.

(Control: vehicle만 처리, Cisplatin; cisplatin 2 mg/kg/b.w. 처리, SRJ-L; 실시예 1 250 mg/kg/b.w. 처리, SRJ-M: 실시예 1 500 mg/kg/b.w. 처리, SRJ-H: 실시예 1 1,000 mg/kg/b.w. 처리)

상기 도 8에 나타낸 바와 같이 종양이 이식된 마우스에 실시예 1 을 4주간 투여한 후 p-ERK1/2 염색을 실시한 결과 cisplatin 투여군은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의성있게 발현량 감소가 확인되었으며 실시예 1 투여군 중에서는 500 과 1,000 mg/kg/b.w. 투여군에서 통계적으로 유의성있게 발현량 감소가 확인되었다 ([도 8] A-E, K). p16에 대한 면역염색 결과에서는 cisplatin 투여군은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의성있게 발현량 증가가 확인되었으며 실시예 1 투여군 중에서는 500 과 1,000 mg/kg/b.w. 투여군에서 통계적으로 유의성있게 발현량 증가가 확인되었다 ([도 8] F-J, L).

Claims (5)

1. 서목태 발효물 26 중량%, 유황 오리 추출물 2 중량%, 마늘 추출물 6 중량%, 유근피 추출물 2 중량%, 금은화 추출물 1 중량%, 포공영 추출물 1 중량% 및 25 w/v% 죽염수 62 중량%를 함유하는 복합 조성물의 발효물을 포함하는 항산화능을 갖는 건강보조식품으로서,
   상기 서목태 발효물은 서목태에 4배수의 물을 첨가하여 익힌 뒤 황국균(Aspergillus oryzae)에 의해 1차 발효된 것이고, 상기 유황 오리 추출물은 유황 오리에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 마늘 추출물은 마늘에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 유근피 추출물은 유근피에 10배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 금은화 추출물은 금은화에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 포공영 추출물은 포공영에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이고,
   상기 서목태 발효물 및 복합 조성물의 발효물은 20 내지 30시간 동안 20 내지 45℃에서 발효되어 제조되는 것인, 항산화능을 갖는 건강보조식품.
2. 삭제
3. 서목태에 4배수의 물을 첨가하여 익힌 뒤 황국균을 접종하여 서목태 발효물을 제조하는 1차 발효 단계;
   상기 1차 발효 단계를 거친 서목태 발효물 26 중량%에 유황 오리 추출물 2 중량%,　 마늘 추출물 6 중량%, 유근피 추출물 2 중량%, 금은화 추출물 1 중량%, 포공영 추출물 1 중량% 및 25 w/v% 죽염수 62 중량%를 첨가하여 복합 조성물을 제조하고, 상기 복합 조성물을 발효시키는 2차 발효 단계; 및
   상기 2차 발효를 거친 발효물을 3일 내지 180일간 숙성한 후 여과 및 가열 살균하는 단계;를 포함하는 항산화능을 갖는 건강보조식품의 제조 방법으로서,
   상기 유황 오리 추출물은 유황 오리에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 마늘 추출물은 마늘에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 유근피 추출물은 유근피에 10배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 금은화 추출물은 금은화에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 포공영 추출물은 포공영에 4배수의 물을 첨가하여 열수 추출한 것이며, 상기 1차 및 2차 발효는 20 내지 30시간 동안 20 내지 45 ℃에서 수행되는, 방법.
4. 삭제
5. 삭제

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