KR102142791B1 - miR-204 억제제의 골관절염 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 miR-204를 표적으로 하는 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시한다. 본원은 또한 관절염 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있는 마커 및 그 용도를 개시한다. 본원의 조성물은 프로테오글리칸의 합성을 조절하여, 연골기질의 합성과 분해의 불균형을 감소시켜 골관절염을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

miR-204 억제제의 골관절염 치료 용도 {Use of miR-204 inhibitors for treating osteoarthritis}

본원은 골관절염 치료 및 검출과 관련된 기술분야이다.

골관절염은 관절염의 가장 흔한 형태로 연골 조직 또는 연골 기질이 노화나 상해에 의해 점진적으로 퇴행하면서 진행되는 질환이다. 이러한 퇴행성관절염 또는 골관절염 (OA, osteoarthritis)은 2014년 기준 441 만 명이 겪고 있는 질환으로 치료에 대한 수요가 급증하고 있다.

골관절염은 노화로 인한 전신적 인자 또는 과도한 체중과 관절 불안정으로 인한 기계적/물리적 스트레스와 같은 국소적인 인자를 포함하는 다양한 원인에 의해 발병한다. 이러한 노화와 비정상적인 기계적 스트레스는 연골 세포(chondrocyte)의 산화 스트레스의 축적을 촉진하여, 이는 이어 세포노화, 탈분화 및 세포사멸과 같은 하위단계 기전을 촉발시킨다. 결국 이러한 골관절염 위험 요소는 연골세포의 세포 노화를 촉진하는데, 골관절염의 발생으로 이어질 수 있으나, 연골 세포의 노화를 규율하는 분자경로는 알려진 바가 없다.

퇴행성관절염의 치료제는 히아루론산 치료제나 소염제와 같은 통증완화 수준으로, 분자 기전을 표적으로 하는 효과적인 치료제의 개발이 필요하다.

한국 공개특허 2014-0144508호는 연골손상 재생 치료용 조성물에 관한 것으로, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF)를 유효성분으로 포함하는 연골손상 재생 치료용 약학 조성물을 개시한다.

미국 공개특허 2015-0119449 (2015.04.30 공개)는 miR-204 길항제를 사용하여 miR-204의 발현 및 활성을 조절할 수 있는 조성물 및 방법을 개시하나 인슐린 생산을 조절하기 위한 것으로 본원과 용도가 상이하다.

상기 어떤 문헌도 본원에서 표적으로 하는 관절염 치료와 관련되서는 개시하고 있지 않다. 연골 기질의 대사를 조절하는 분자적 기전규명이 필요하고, 해당 인자의 조절을 통한 치료전략의 개발이 요구된다.

본원은 연골 기질의 대사를 조절하는 miR-204을 표적으로 하는 골관절염 치료제를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 miR-204 활성을 억제하는 물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 관절염 치료용 약학 조성물을 제공한다.

일 구현예에서 상기 miR-204는 miR-204-5p 또는 mir-204-3p 일 수 있다.

일 구현예에서 상기 miR-204 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-204의 표적 유전자로서 SLC35D1(Solute carrier family 35 (UDP-glucuronic acid/UDP-N-acetylgalactosamine dual transporter), member D1), CHSY1(Chondroitin sulfate synthase 1), CSGALNACT2 (Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2), CHST11 (Carbohydrate sulfotransferase 11), CHST15 (Carbohydrate sulfotransferase 15); HAS2 (Hyaluronan synthase 2) 또는 HAPLN1 (Hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 유전자의 3'-UTR 과 miR-204의 상호작용을 억제할 수 있는 물질이다.

일 구현예에서 상기 miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질은 이의 발현을 억제할 수 있는 물질이다.

일 구현예에서 상기 miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-204의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자이다.

일 구현예에서 핵산분자는 앤타고미어, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

일 구현예에서 사기 핵산분자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 1 번또는 8번까지의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부, 예를 들면 2 내지 7번까지의 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하는 6 내지 100mer의 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.

일 구현예에서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.

일 구현예에서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-AAGGGA-3'(서열번호 4), 5’-AAAGGGAA-3'(서열번호 5), 또는 5′-AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA-3′(서열번호 6) 이다.

다른 양태에서 본원은 miR-204 RNA를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 miR-204 RNA의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 miR-204의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-204 RNA의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 miR-204는 miR-204-5p,또는 miR-204-3p 일 수 있다.

일 구현예에서 상기 miR-204 RNA는 이를 발현하는 세포는 마우스 일차 배양 연골세포; 퇴행성관절염 환자 유래 일차 배양 연골세포; SW1353 세포주; C20A4, TC28A2, 또는 C28I2을 포함하는 인간 연골 세포주: 또는 H4 마우스 콘드로사이트 (RRID: CVCL_W634), ATDC5, 또는 MC615를 포함하는 마우스 연골세포주를 포함하는 세포에서 발현되는 형태로 제공되며, 그리고 상기 활성은 상기 miR-204 RNA의 발현 분석으로 결정되며, 상기 세포는 miR-204 발현의 상위 조절자로 GATA4 및 NF-kB (Nuclear Factor kappa B)을 추가로 발현한다.

일 구현예에서 상기 miR-204 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-204 RNA와 이의 표적인 SLC35D1, CHSY1, CSGALNACT2, CHST11, CHST15, HAS2 또는 HAPLN1 의 3'-UTR 과 miR-204 RNA와의 상호작용 분석으로 결정된다.

다른 양태에서 miR-204 검출용 물질을 포함하는 관절염 진단용 키트를 제공한다.

다른 양태에서 관절염의 진행정도 또는 진단 또는 예후가 필요한 대상자 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 miR-204의 발현을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 발현량을 검사 대상자의 관절염 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 상기 연관시키는 단계에서 상기 검사 대상자의 miR-204의 발현량은 대조군 시료와 비교하여 그 양의 증가한 경우, 상기 대상자를 관절염으로 진단하는 것인, 관절염의 진행정도 또는 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 마커를 인비트로에서 검출하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 시료는 연골조직, 활액, 혈액 또는 소변이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 상기 키트 및 방법에서 상기 miR-204는 miR-204-5p, 또는 miR-204-3p 일 수 있다.

본원은 miR-204를 표적으로 하는 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 관절염 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있는 마커 및 그 용도를 개시한다. 본원의 조성물은 프로테오글리칸의 합성을 조절하여, 연골기질의 합성과 분해의 불균형을 감소시켜 골관절염을 효과적으로 치료할 수 있다.

또한 본 발명은 miR-204의 상위 조절자로서 GATA4/NF-kB 및 miR-204의 표적 유전자를 새롭게 규명하였으며 이는 관절염 치료제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1에서 (A) 마우스 연골세포는 고산소 (20% 산소) 조건에서 P0 또는 P2로 배양하였음. 마우스 P0 및 P2 연골세포에서 SA-β-Gal 염색과 SA-β-Gal 양성 세포 정량 (n = 5). Scale bar, 100 μm. (B) 저산소 (3% 산소), 20% 산소 조건에서 배양하거나 과산화수소 (200 μM)를 처리한 연골세포 내 4-HNE에 대한 면역형광법. Scale bar, 25 μm. (C and D) 고산소 (P0 및 P2) 또는 저산소 (P2)에서 배양한 연골세포 내 (C) γ-H2AX와 (D) p16^INK4a에 대한 면역형광법. (E) P0 및 P2 연골세포 내 CDK 저해인자 및 Lmnb1의 상대적 mRNA 발현량 측정. (F) 마우스 P0 및 P2 연골세포에서 Alcian blue 염색과 흡광도 정량 (n = 4). (G) Volcano plot log2(fold change) 대비 log10(FDR)에 대한 볼케이노 플롯. 플롯은 P0와 P2 연골세포 사이의 miRNA 발현량의 차이를 나타냄. (H) 통계적으로 유의미하게 증가한 41개 miRNA들의 예상 표적 전사체와 퇴행성관절염 및 노화 연골에서 감소한 유전자 세트들 사이의 집중 분포 정도. miRNA들의 표적유전자에 대한 예측은 TargetScan 알고리즘으로 수행하였음. (I) sGAG assay를 통한 명시된 miRNA들이 전달된 연골세포의 sGAG 방출량 (n = 5). (J) 퇴행성관절염 연골의 손상부위와 비손상부위의 조직 절편 염색. Alcian blue 염색, p16^INK4a의 면역조직화학법, miR-204의 제자리혼성화기법 (in situ hybridization). 또한, 연골의 손상정도에 대한 등급 (n = 10). Scale bar, 25 μm. (K and L) (K) 2개월, 24개월 마우스 (n ≥ 4) 및 (L) 대조군과 퇴행성관절염 유도 마우스(DMM 후 8주, n ≥ 6)의 연골조직 절편 염색. safranin O 염색, p16^INK4a의 면역조직화학법 및 miR-204의 제자리혼성화기법. Scale bar, 200 μm. (M) 퇴행성관절염 환자(위), 노화 환자(중간) 및 퇴행성관절염 마우스(아래) 연골조직에서 miR-204의 표적유전자에 대한 GSEA 분석. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, not significant. Student's t test in (A), (E), and (F). ANOVA in (E). Mann-Whitney U test in (J) to (L).
도 2에서 (A) 연골세포에 menadione (25 μM; n = 3) 또는 과산화수소 (500 μM; n = 4)를 명시된 시간 동안 처리한 뒤 miR-204의 상대적 발현량. (B) 연골세포에 명시된 농도의 과산화수소를 7일간 처리한 뒤 miR-204의 상대적 발현량 (n = 6). (C) Vehicle 또는 과산화수소(200 μM)를 처리한 뒤 γ-H2AX (흰색 화살표로 표시)와 p16^INK4a에 대한 면역형광법. Scale bar, 100 μm. (D) 연골세포에 vehicle 또는 과산화수소(200 μM)를 처리한 뒤 SA-β-Gal 염색과 SA-β-Gal 양성 세포 정량 (n = 3). Scale bar, 100 μm. (E) Vehicle 또는 과산화수소를 처리한 연골세포 내 CDK 저해인자 및 Lmnb1의 상대적 mRNA 발현량 측정. (n = 4). (F) 연골세포에 명시된 정도의 감마선 조사 후 5일 뒤 SA-β-Gal 염색과 SA-β-Gal 양성 세포 정량 (n = 3). Scale bar, 100 μm. (G) 감마선을 조사한 연골세포 내 CDK 저해인자 및 Lmnb1의 상대적 mRNA 발현량 측정 (n = 6). (H) 연골세포에 감마선 조사 후 5일뒤 miR-204의 상대적 발현량 (n = 6). (I) 연골세포에 명시된 농도의 bleomycin (n = 4)과 doxorubicin (n = 6) 처리 후 SA-β-Gal 양성세포 정량 (J and K) (J) Bleomycin 또는 (K) doxorubicin을 처리한 연골세포 내 CDK 저해인자 및 Lmnb1의 상대적 mRNA 발현량 측정 (n = 6). (L) Bleomycin 또는 (K) doxorubicin을 처리한 연골세포 내 miR-204의 상대적 발현량 (n = 4). (M) 연골세포에 감마선 조사 후 명시된 시간에 따른 miR-204, Il6, and Mmp3 의 상대적 발현량 (5 Gy; n = 6). (N and O) Gata4 or Rela를 표적으로 하는 siRNA 전달과 (N) 감마선 조사 (n ≥ 3) 및 (O) doxorubicin (n = 3) 처리 후 miR-204의 상대적 발현량. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, not significant. ANOVA in (A), (B), (F), (H), (I), and (L) to (O). Student's t test in (D), (E), (G), (J), and (K).
도 3에서 (A) miR-Ctrl 또는 miR-204로 전달되고 14일 동안 3차원 매트릭스에서 성장한 연골세포 (n = 68)에서 Alcian blue 염색(왼쪽)과 pericellular matrix (오른쪽)의 두께 정량. Scale bar, 100 μm. (B) miR-Ctrl 또는 miR-204로 형질 감염된 연골세포의 sGAG 방출량 (n = 8). (C) 자발적인 퇴행성관절염 모델 마우스 (위) 또는 퇴행성관절염 유도 수술 마우스 (아래)에서 miRNA 전달 실험의 도식적 그림. (D) miR-Ctrl 또는 miR-204가 전달된 활액막 (위) 또는 연골 (아래)의 절편에서 miR-204 (검은색 화살표로 표시)의 제자리혼성화기법. Scale bar, 25 μm. (E) In vivo-jetPEI (0.4 mg/kg miRNA, 10주 동안 2주에 1회)를 통한 마우스 무릎 관절 내 miR-Ctrl 또는 miR-204의 전달. 관절 조직 절편은 safranin O, fast green, hematoxylin으로 염색됨. Scale bar, 200 μm. (F) 연골 손상, 연골하골 경화, 골극 형성, 활액막염 등이 safranin O/hematoxylin 염색을 통해 분석됨 (n = 4). (G) 대조군 및 퇴행성관절염 유도 수술 마우스의 관절강 내 miR-Ctrl 또는 miR-204를 전달 (0.4 mg/kg; 6주 동안 2주에 1회). 관절 조직 절편은 safranin O, fast green, hematoxylin으로 염색됨. Scale bar, 200 μm. (H) 연골 손상, 연골하골 경화, 골극 형성, 활액막염 등이 safranin O/hematoxylin 염색을 통해 분석됨 (n = 4). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, ***P < 0.001. NS, not significant. ANOVA와 post hoc test in (B). Mann-Whitney U test in (F). Kruskal-Wallis test와 Mann-Whitney U test in (H).
도 4에서 (A) miR-Ctrl 또는 miR-204을 전달한 연골 세포 또는 bleomycin 또는 doxorubicin이 처리 된 연골 세포의 SA-β-Gal 염색. miR-Ctrl 또는 miR-204을 전달한 연골 세포에서의 SA-β-Gal의 대표적인 이미지 (n = 3). Scale bar, 100 μm. (B) miR-Ctrl 또는 miR-204 (n = 6)을 전달한 연골 세포 성장 분석. (C or D) miR-Ctrl 또는 miR-204 (n ≥ 4)을 전달한 연골 세포에서 (C) CDK 저해인자 또는 (D) SASP 인자의 상대적 mRNA 발현량. (E) PG 생합성 경로는 IPA로부터 얻음. miR-204 전달에 따른 유전자 발현의 변화는 RNA seq. 데이터에서 녹색 (낮은 발현량)에서 적색 (높은 발현량)까지의 색으로 표시하였음. (F) qRT-PCR을 이용하여 (E)에서 발현량이 감소한 유전자의 상대적 mRNA 발현량 측정 (n = 8). (G) 예측된 miR-204 표적 유전자에 대한 3'UTR 리포터 벡터의 설계도. miR-204의 6-mer seed binding site 인 AAGGGA는 돌연변이 3'UTR 리포터에서 CGTACC로 돌연변이됨. (H or I) miR-Ctrl 또는 miR-204 (n ≥ 3)을 전달한 연골 세포에서 (H) Slc35d1, Chsy1, Chst11, Chst15 및 (I) Csgalnact2의 WT 또는 돌연변이 3'UTR 리포터의 상대적인 luciferase 활성. (J) miR-Ctrl 또는 miR-204 (n = 3)을 전달한 연골 세포에서 Hapln1 및 Has2의 3'UTR 리포터의 상대적인 luciferase 활성. (K) miR-Ctrl 또는 miR-204의 관절강 내 주사를 통해 전달 후 생쥐의 연골 절편에서 SLC35D1, CHSY1, CHST11, HAPLN1 및 CS의 면역 염색. 스케일 바, 25 μm. (L) Slc35d1, Chsy1, Chst11, 또는 Hapln1을 표적으로 하는 25 nM siRNA 또는 이들의 siRNA 혼합 물을 전달한 연골 세포의 sGAG 방출량. 전달한 siRNA의 총량 (100 nM)을 음성 대조군 siRNA (n = 6)으로 설정. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, not significant. Student's t test in (A) to (D), (F), (H) to (J), and (L).
도 5에서 (A) antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204을 전달한 P2 연골세포에서 PG와 관련된 miR-204 표적 유전자의 상대적인 mRNA 발현량 (n = 6). (B) antimiR-Ctrl 또는 antimi-204을 전달한 연골 세포의 sGAG 방출 (n = 5). (C) antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204을 전달 한 뒤, IR 노출 후 연골 세포에서의 SA-β-Gal 정량 (n = 3). (D) antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204 (n = 4)을 전달한 뒤, 감마선 조사 후 연골 세포에서 SASP 인자의 상대적 mRNA 발현량. (E) 외상 후 퇴행성관절염 모델 마우스에서 antimiR 치료의 개략도. (F) 생체 내 transfection 시약인 in vivo-jetPEI (0.4 mg/kg, 10주 동안 12일에 1회)를 사용하여 대조군 또는 DMM으로 수술한 마우스에게 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 전달하였음. 관절 조직 절편은 safranin O, fast green, hematoxylin 및 miR-204에 대한 제자리혼성화기법으로 염색됨. Scale bar, 200 μm. (G) 연골 손상, 연골하골 경화, 골극 형성, 활액막염 등이 safranin O/hematoxylin 염색을 통해 분석됨 (n = 3 for sham, n = 8 for DMM). (H) Sham 또는 DMM을 수행한 뒤 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 관절 내 주입한 마우스의 수술을 시행한 다리에 걸리는 체중과 반대쪽 다리에 걸리는 체중의 비율을 통한 퇴행성관절염 통증 분석. (I) CS, SASP 인자 (MMP3 및 MMP13) 및 노화표지자 p16^INK4a에 대한 면역조직화학법. Scale bar, 25 μm. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, not significant. Student's t test in (A), (B), and (H). ANOVA와 post hoc test in (C) and (D). Kruskal-Wallis test와 Mann-Whitney U test in (G).
도 6에서 (A) 14일간 doxorubicin (1 μM)이 처리된 인간유래 연골세포의 SA-β-Gal 염색의 대표적인 이미지 및 정량 (n = 3). Scale bar, 100 μm. (B) Vehicle 또는 doxorubicin을 처리한 인간유래 연골세포 내 p16^INK4a에 대한 면역형광법. Scale bar, 25 μm. (C) Vehicle 또는 doxorubicin을 처리한 인간유래 연골세포 내 CDK 저해인자 및 LMNB1의 상대적 mRNA 발현량 측정 (n = 5). (D) Vehicle 또는 doxorubicin을 처리한 인간유래 연골세포 내 miR-204의 상대적 발현량 (n = 4). (E) miR-Ctrl 또는 miR-204를 과발현한 인간유래 연골세포 내 PG 생합성 경로를 구성하는 유전자들의 상대적 mRNA 발현량 (n = 3). (F) 퇴행성관절염 환자의 연골을 조직 배양한 뒤 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 과발현하였음. 연골 조직 절편은 miR-204의 제자리혼성화기법 및 CS, MMP3, MMP13에 대한 면역 염색으로 염색됨. miR-204, CS, MMP3, MMP13에 대한 연골세포 내 양성도를 정량함 (n ≥ 3). Scale bar, 100 μm. (G) miR-204의 매개에 의한 노화 유도에 따른 OA 발생의 신호 경로 모식도. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Student's t test in (A), (C), (D), (E), and (F).
도 7에서 (A) 퇴행성관절염의 진행과 연관된 miRNA 선별을 위한 스크리닝 방법의 모식도. (B) P0 연골세포에 대비한 P2 연골세포에서 유의하게 발현이 증가한 41개의 miRNA 발현의 fold change. (C) P0 연골세포에 대비한 P2 연골세포에서 miR-204의 상대적 발현량. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05. Student's t test in (C).
도 8에서 (A) HA tag과 결합된 공벡터, mouse p16^INK4a, mouse p19^Arf 단백질을 과발현한 HEK293T 세포주에서의 HA, p16^INK4a, Vinculin, Actin에 대한 웨스턴 블롯팅. (B) 대조군 sham과 퇴행성관절염 유도 마우스의 연골 조직에서의 p16^INK4a에 대한 면역조직화학법. (C) 2개월 또는 24개월령 마우스의 연골 조직에서의 p16^INK4a에 대한 면역조직화학법.
도 9에서 (A) 연골세포에 명시된 정도의 감마선 조사 후 5일 뒤 SA-β-Gal 염색의 대표 이미지. Scale bar, 100 μm. (B) 대조군 또는 5 Gy의 감마선을 조사한 마우스 연골세포에서 γ-H2AX (백색 화살표로 표시)에 대한 면역형광법. DAPI로 염색된 핵이 푸른색으로 염색됨. Scale bar, 25 μm.
도 10에서 (A and B) 마우스 연골세포에 명시된 농도의 (A) bleomycin 또는 (B) doxorubicin 처리 후 SA-β-Gal 염색의 대표 이미지. Scale bar, 100 μm. (C) bleomycin (200 μg/ml) 또는 doxorubicin (100 nM)을 처리한 연골세포에서의 p16^INK4a에 대한 면역형광법. Scale bar, 25 μm.
도 11에서 (A) 마우스 연골세포에 감마선 조사 (5 Gy; n = 4), bleomycin (200 μg/ml; n = 6), 또는 doxorubicin (100 nM; n = 3)를 처리한 뒤 Cdkn1a의 상대적 발현량. (B) Nutlin-3a를 명시된 농도로 처리한 연골세포에서 Cdkn1a (n = 4)와 miR-204 (n = 3)의 발현량. (C and E) (C) Trp53과 (E) Cdkn2a에 대한 siRNA의 연골세포 내 knockdown 효율성을 RT-PCR (위)과 qRT-PCR (아래)를 통해 확인하였음. (D and F) 감마선을 조사한 뒤 control siRNA, (D) Trp53 또는 (F) Cdkn2a에 대한 siRNA를 형질주입한 연골세포 내 miR-204의 상대적 발현량. (n ≥ 3). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, not significant. Student's t test in (A), (C), and (E). ANOVA와 post hoc test in (B), (D), and (F).
도 12에서 (A) 마우스 연골세포에 명시된 농도의 감마선 조사 후 5일 뒤 Trpm3의 상대적 발현량 (n = 6). (B) 마우스 연골세포에 감마선 조사 (5 Gy; n = 6) 후 명시된 시간 뒤 Trpm3의 상대적 발현량. (C) miR-204 유전자의 유전체 상 위치를 표시한 모식도 (위). 두 개의 전사개시점(TSS)이 인간과 마우스 사이에 보존됨. 수직선이 miR-204의 host 유전자인 Trpm3의 엑손 부위를 나타냄. 6번 인트론 내에 위치하는 miR-204를 coding하는 서열은 초록색 화살표로 표시됨. Trpm3-miR-204 TSS1과 TSS2 프로모터에 대한 reporter construct는 진화적으로 보존된 영역 (ECR)에 기반해 설계되었음. (D) 감마선을 명시된 농도로 처리한 연골세포 내 Trpm3-miR-204 TSS1과 TSS2 프로모터의 상대적 luciferase 활성도 (n = 4). (E) Trpm3-miR-204 TSS1 프로모터 상의 GATA와 NF-κB 전사인자에 대한 결합부위의 모식도. (F and G) Gata4 또는 Rela에 대한 siRNA의 knockdown efficiency를 일차 배양한 연골세포에서 RT-PCR (위)과 qRT-PCR (아래; n = 3)을 통해 검증하였음. (H) 40 nM 또는 100 nM의 miR-Ctrl 또는 miR-204를 형질주입한 연골세포 내 miR-204의 상대적 발현량 (n = 4). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS, not significant. ANOVA와 post hoc test in (A), (B), and (D). Student's t test in (F) to (H).
도 13에서 (A) miR-Ctrl에 FITC를 결합한 뒤 마우스 관절강 내 주입함 (0.4 mg/kg). FITC (검은색 화살표)가 마우스 무릎관절의 활액막과 연골 조직에서 면역조직화학법으로 염색됨. AC, 관절 연골; Sy, 활액막. Scale bars, 25 μm. (B and C) miR-Ctrl 또는 miR-204를 관절강 내 주입한 마우스의 활액막 절편에서의 (B) IL-1β, TNF-α과 (C) MMP13에 대한 면역조직화학법. (D) miR-Ctrl 또는 miR-204를 관절강 내 주입한 마우스의 연골조직에서 MMP13에 대한 면역조직화학법. Scale bar, 100 μm.
도 14에서 (A) 연골세포에서 miR-204 과발현에 의해 발현이 감소한 유전자들의 co-expression 양상을 대표하는 heatmap. Gene profile 간의 강한 양성의 correlation은 빨간 색으로, 강한 음성의 correlation은 파란 색으로 표현하였음. Hierarchical clustering을 통해 네 개의 잠재적인 gene cluster가 선별됨. (B) 잠재적 miR-204의 표적 유전자와 각 gene cluster 간의 hypergeometric P value. (C) Cluster 2를 KEGG, Reactome, HumanCyc pathway 데이터베이스를 이용해 Enrichr pathway 분석한 결과 combined score가 가장 높은 네 개의 annotation과 그에 해당하는 combined score를 그래프로 표현하였음. (D) Cluster 1, 3, 4의 Enrichr pathway 분석 결과 combined score가 가장 높은 annotation을 표현하였음.
도 15에서 (A and B) (A) 마우스 연골세포 또는 (B) SW1353 연골암 세포주에서 miR-Ctrl 또는 miR-204 형질주입에 의한 유전자들의 mRNA 발현을 RT-PCR을 통해 분석하였음. (C) miR-Ctrl 또는 miR-204를 형질주입한 마우스 연골세포에서의 Slc35b4, Xylt1, Chsy3, Hs2st1 유전자의 mRNA 상대적 발현량. 네 개의 유전자는 3 ′UTR에 miR-204에 대한 seed 서열을 포함하지만 miR-204 mimic 형질주입에 의해 마우스 일차배양 연골세포에서 발현이 감소하지 않음 (n ≥ 8). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. NS, not significant. Student's t test in (C).
도 16에서 (A) miR-Ctrl 또는 miR-204를 형질주입한 마우스 연골세포에서의 Sox9 또는 Acan mRNA 상대적 발현량 (n = 3). (B) miR-Ctrl 또는 miR-204를 형질주입한 마우스 연골세포에서 SOX9과 ACAN 3 ′UTR reporter의 상대적 luciferase 활성도 (n = 5). (C) miR-Ctrl 또는 miR-204를 과발현한 마우스 연골세포에서의 SOX9, ACAN, Actin에 대한 웨스턴 블롯팅. (D) miR-Ctrl 또는 miR-204를 관절강 내 전달한 마우스의 연골 조직에서 SOX9과 ACAN을 면역조직화학법으로 염색하였음. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. Scale bar, 25 μm. NS, not significant. Student's t test in (A) and (B).
도 17에서 (Slc35d1, Chsy1, Chst11, Hapln1에 대한 siRNA의 knockdown 효율성 RT-PCR (위)과 qRT-PCR (아래; n = 3). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. Student's t test.
도 18에서 (A) 감마선 조사 후 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 형질주입한 마우스 연골세포에서 SA-β-Gal 염색의 대표 이미지. (B and C) (B) IL-1β (1 ng/ml) 또는 감마선 (5 Gy)을 조사한 연골세포와 (C) 감마선을 조사한 후 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 형질주입한 연골세포에서의 Timp2와 Igfbp7 SASP factor의 상대적 mRNA 발현량. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냄. *P < 0.05, ***P < 0.001. NS, not significant. ANOVA와 post hoc test in (B) and (C).
도 19에서 (A) 생체 내 transfection 시약인 in vivo-jetPEI (0.4 mg/kg, 10주 동안 12일에 1회)를 사용하여 sham 대조군 마우스에게 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 전달하였음. 연골 조직은 safranin O 염색과 miR-204에 대한 제자리혼성화기법을 이용해 염색됨. Scale bar, 25 μm. (B) Sham 또는 DMM을 수행한 마우스에 antimiR-Ctrl 또는 antimiR-204를 주입하였음. 연골조직에서 p16^INK4a에 대한 항체 (Abcam #54210)을 이용한 p16^INK4a에 대한 면역조직화학법. Scale bar, 25 μm.

본원은 miR-204가 연골 세포에서 프로테오글리칸의 합성을 조절하는 중요한 조절자인자로서 골관절염의 발생에 중요한 역할을 하며, miR-204 활성의 억제는 연골기질의 합성과 분해의 불균형을 감소시켜 골관절염을 치료할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

이에 한 양태에서 본원은 miR-204 억제제를 포함하는 골관절염 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 조성물은 골관절염 (Osteoarthritis, OA)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 흔히 퇴행성 관절염이라고도 불리는 골관절염은 관절 질환 중에서 가장 많이 발생하는 관절염으로 연골 기질이 점진적으로 파괴되며, 또한 관절을 구성하는 다른 부분에도 병적인 상태, 예를 들면 연골한 골경화증, 골증식 형성, 및 활막염증과 같은 병태를 포함한다. OA의 병인은 나이와 같은 전신적 원인 및 체중증가 및 관절 불안정성으로 인한 기계적 스트레스로 인한 국소적 원인을 포함하는 다수의 원인을 포함한다. 이러한 병인은 연골세포에 산화성 스트레스 축적을 촉진하고, 이는 이어 세포노화, 탈분화 및 세포사멸과 같은 다수의 하위 신호전달 경로를 활성화시킨다. 산화 스트레스는 세포의 항산화능을 초과하는 활성 산소종 (ROS)의 생산으로 이어진다. ROS가 관절 연골에서 증가된 농도의 ROS는 OA의 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. OA 연골에서는 연골세포(chondrocytes)에 의한 증가된 이화(catabolic) 매개자 분비 및 연골 특이적 기질 생산의 감소로 인해 기실 항상성이 깨진다. 연골세포의 노화는 이러한 OA 발생의 기질 대사 불균형을 초래하는 중요한 세포성 이벤트이다.

관절 연골은 코어단백질에 결합된 글리코사미노글리칸 (GAG) 사슬로 구성된, 풍부한 황산화 PG(프로테오글리칸)를 함유하고 있다. 연골에서 가장 풍부한 GAG 사슬은 GalNAc (2)의 4- 또는 6- 위치에서 황산화 된 N- 아세틸갈락토사민 (GalNAc) 및 글루쿠론산 (GlcA)의 반복 이당 구조로 이루어진 콘드로이틴 설페이트 (CS)이다. 황산화 PG는 히알루론산 (HA)과 상호 작용하여 고도로 하전된 PG 응집체를 형성한다. PG의 음이온적 특성은 삼투압 활성 양이온을 강하게 끌어 당기고 연골 기질에 물 분자를 보유하여 관절에 특유한 내 하중능을 부여한다. 연골 기질 항상성은 연골의 주된 세포 유형인 연골 세포(chondrocytes)에 의해 조절된다.

본원에서는 miR-204가 OA 연골에서 현저하게 증가되어 있으며, 전사인자인 GATA4 및 NF-kB를 통한 노화 신호에 위해 유도된다는 것을 밝혔다. 이렇게 상향 조절된 miR-204는 다수의 황산화 프로테오글리칸 (PG) 생합성 경로에 관여하는 다수의 인자에 동시에 영향을 미쳐, PG 합성을 차단하는 것을 발견하였다. 외인성 miR-204의 발현은 자동적 연골 손실 및 OA 발생을 초래하였으며, 반면 miR-204의 억제는, 연골세포에서 PG 합성 회복 및 염증성 SASP (senescence-associated secretory phenotype) 인자의 억제와 OA를 완화하는 것은 발견하였다.

따라서 본원에 따른 조성물은 관절염의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA"는 표적 RNA의 3’UTR(비번역부위)에 결합하여 이의 분해(degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2012년 8월 현재 miRNA 데이터베이스 (19판, miRBase)에 의하면 193개 종에서 유래한 25,141 개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.

본원에서 miR-204은 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, OA가 발생한 연골세포에 상향 발현되며 PG 생합성에 관여하는 유전자의 3’UTR에 결합하여 결국 PG 생합성을 억제한다. 이러한 유전자는 CS 이탄당 반복체 빌딩블록인 UDP-GlcA 및 UDP-GalNAc의 전달체로 작용하는 SLC35D1(52); CS 사슬의 신장에 관여하는 CHSY1 및 CSGALNACT2 (53, 54); 사슬의 GalNAc 황산화에 필요한 효소인 CHST11 및 CHST15 (55, 56); 그리고 HA 및 코어 단백질 PG 백본의 어셈블리에 필요한 HAS2 and HAPLN1 (57, 58)이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 유전자는 miR-204의 도입에 의해 그 발현이 감소하는 것으로 나타났다 (도 4F 등 참조).

따라서 본원에 따른 miR-204 활성 억제제는 miR-204의 표적 유전자로 SLC35D1, CHSY1, CSGALNACT2, CHST11, CHST15, HAS2 및 HAPLN1의 3’UTR에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 상기 유전자의 서열은 다음과 같이 NCBI DB에 공지되어 있다: 인간 SLC35D1: NM015139.2, 인간 CHSY1: NM014918.4, 인간 CSGALNACT2: NM018590.4, NM001319654.1, NM001319656.1, 인간 CHST11: NM01888413.5, NM001173982.1, 인간 CHST15: NM015892.4, NM014863.3, NM001270764.1, 인간 HAS2: NM005328.2, 인간 HAPLN1: NM001884.3

본원의 miR-204의 서열은 인간 유래이며, 성숙된 서열은 miR-204-5p [5′- UUCCCUUU GUCAUCCUAUGCCU-3’(서열번호 1)], miR-204-3p [5′- GCUGGGAA GGCAAAGGGACGU-3′(서열번호 2)], 전구 서열 [(5’ggcuacagucuuucuucaugugacucguggacuucccuuugucauccuaugccugagaauauaugaaggaggcugggaaggcaaagggacguucaauugucaucacuggc 3′(서열번호 3))를 포함하는 것이다. 밑줄친 부분은 씨드서열을 나타낸다. 씨드 서열이란 miRNA가 표적 유전자의 3’UTR 부분에 결합하여 표적 유전자의 발현을 저해하는 특이적 서열이다.

본원에서는 특히 miR-204-5p가 연골세포 노화에 따라 발현되는 것을 확인하고 miR-204-5p 발현 억제제를 사용하였다.

본원에 따른 miR-204 억제제는 특히 miR-204-5p의 발현을 억제하거나, 또는 이를 분해하거나, 또는 이의 활성을 억제할 수 있는 것을 포함한다.

본원에서 miR-204의 활성 억제는 miR-204의 세포내 작용 또는 기능을 억제 또는 방해하는 것을 의미하는 것으로 전형적으로 miR-204가 이의 표적 분자와의 결합을 직접적으로 억제하거나, 또는 저분자 억제제, 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 miR-204의 기능을 직접적으로 억제하거나, 또는 small interfereing RNA분자를 이용하여 간접적으로 조절되는 것을 포함한다. 나아가 miR-204의 활성의 방해 또는 억제는 직접 또는 간접적으로 전구서열(서열번호 1) 및 성숙서열 (서열번호 1 또는 2)의 활성을 억제하는 것을 포함한다. 또한 miR-204의 활성 억제는 miR-204의 전사 자체를 억제하여 이의 세포내 농도를 낮추는 것을 포함한다.

본원에서 용어 “miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질”은 이의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 물질은 예를 들면 앤타고미어, 안티센스 분자, 소헤어핀 RNA 분자 (shRNA), 소방해 RNA 분자 (siRNA), 시드 표적 LNA (Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드, 데코이올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임, 또는 DNA:RNA 하이브리드를 인지하는 항체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열의 전부 또는 일부, 또는 miRNA의 씨드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 miRNA 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 가지고 있어, miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄하는 것이다. 일 구현예에서는 RNA-RNA 이합체이다. 따라서 본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 나타낼 수 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에는 다양한 분자가 포함되며, 예를 들면 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 앤타고미어, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드이다. 바람직하게는 리보핵산이다.

LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 내지 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다.

PNA(peptide nucleic acids)는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2'-O-C_1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 하기 설명하는 앤타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "앤타고미어"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 microRNA의 차단 (silence)에 사용된다. 앤타고미어는 Arganoute 2 (Ago 2) 절단 부위에서 상보적이지 않는 서열을 포함하거나, 또는 Ago2 절단이 억제되도록 염기가 예를 들면 2' 메톡시기, 3‘ 콜레스테롤기, 포스포로씨오에이트로 변형되어 있으며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본원에 따른 앤타고미어는 miR-204, 특히 miR-204의 씨드 서열, 특히 miR-204-5p, 특히 miR-204-5p 씨드서열의 전부 또는 일부에 적어도 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 일 구현예에서 앤타고미어는 하나 이상의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸-당 변형, 또는 3‘ 콜레스테롤 변형)을 포함한다. 다른 구현예에서 앤타고미어는 하나이상의 포스포로씨오에이트 결합을 포함하며, 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다.

본원에 따른 miR-204을 억제하기 위하여 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앤타고미어의 길이는 6-50 뉴클레오타이드, 특히 10-40 뉴클레오타이드, 더욱 특히 15-30 뉴클레오타이드, 더더욱 특히 15-25 뉴클레오타이드 이나 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 효과를 달성하는 한 다양한 길이를 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-204 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과 즉, miR-204의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본원에서 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질은 miR-204의 전구 및/또는 성숙 서열의 전부 또는 일부, 특히 씨드 서열에 상보적으로 결합하여, 이의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 활성의 억제는 miR-204의 전사 및/또는 miR-204의 표적 mRNA와의 결합을 억제하는 것이다. 본원에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드를 연결하는 백본(골격)이 하기 하나 이상의 변형을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 즉 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트를 포함할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산분자는 miR-204, 특히 miR-204-5p의 씨드서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 씨드 서열은 miRNA의 표적분자의 인지에 매우 중요한 다양한 종에서 보존된 서열이다(Krenz, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu. Rev. Physiol.62:321(2000)). miRNA는 씨드서열을 통해 표적과 결합하기 때문에, 씨드서열의 표적과의 상호작용을 억제하는 경우, 표적 mRNA의 번역 등을 효과적으로 억제할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 싸드서열 (1 내지 8번째)의 전부 또는 일부 예를 들면 씨드서열 중 중 2번째부터 7번째까지의 뉴클레오타이드 서열에 전부 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하며, 예를 들면 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-204-5p 의 씨드서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 5’-AAGGGA-3'(서열번호 4) 또는 5’-AAAGGGAA-3' (서열번호 5); 또는 5′-AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA-3′(서열번호 6)일 수 있으며 또는 상기 AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA이 10-nucleotide 내외의 링커영역을 사이에 두고 세 차례 이상 반복되는 miR-204-5p sponge 서열 일 수 있다. 상기 스폰지 서열은 항상성 프로모터 및 단백질에 작동가능하게 연결되어 플라스미드로 도입되어 발현될 수 있다. 상기와 같은 서열은 miR-204-5p의 씨드 서열에 결합하여, miR-204-5p가 표적에 결합하는 것을 방지하여 이의 활성을 저해한다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 하나 이상의 각 뉴클레오타이드는 2‘-O- 메틸화되거나, 또는 상기 각 하나 이상의 뉴클레오타이드는 LNA이거나, 또는 상기 백본을 구성하는 화학결합 중 하나 이상은 포스포티오에이트일 수 있으나, 상기 변형을 포함하지 않을 수도 있다.

앞서 언급한 바와 같이 본원에 따른 조성물은 연골세포에서 PG의 합성을 조절하여, 연골 기질 대사의 불균형을 되돌림으로써 골관점염을 치료할 수 있다,

본원에서 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 관절염 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본원에 사용된 용어 "예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 본원의 miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질 이외에 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.

본원 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 아주번트를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다. 예를 들면 용액, 에멀젼 및 리포좀 제형 등과 같은 다양한 제형 및 투약형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 활성성분을 약학적으로 허용가능한 액체 및/또는 미세분말의 고형 담체 또는 부형제와 혼합하여, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제로 제조될 수 있다. 또한 본원에 따른 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질을 이용한 현탁액으로 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 높이는 물질을 추가로 포함할 수 있다.

필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 특히 관절 강 내 국소 투여)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형을 통해 투여할 수 있다.

본원에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC₅₀을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.

안테센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본원에 따른 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그 자체로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염이란, 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성은 유지하면서, 바람직하지 않는 독성은 최소화된 것이다. 이러한 염은 예를 들면 아연, 칼슘, 비스부스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 코퍼, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소디움, 포타슘 등과 같은 금속 양이온과 형성된 염기 부가염 및 유기 아미노산과 형성된 염, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민 (dibenzylethylene-diamine), D-클루코사민 (glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine) 유래의 양이온과 형성된 염을 포함 할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 이루는 뉴클레오타이드의 특성상 음으로 하전되어 있다. 세포막은 친지질성 성질로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포막으로의 흡수가 감소될 수 있다. 이러한 극성으로 인한 흡수 방해는 하기에 기재된 전구약물 접근방식을 통해 해결될 수 있다 (Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).

본원에 따른 miR-204 분자는 본원에 개시된 바와 같이 노화 또는 기타 스트레스로 인한 관절염에서 상향 발현되어, 관절염의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

이에 다른 양태에서 본원은 miR-204 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 관절염 진단용 마커로서의 용도를 개시하며, 이러한 관점에서 상기를 포함하는 관절염 진단용 키트 또는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 본원에 따른 miR-204를 특이적으로 인식하는 것으로 상기 서열에 상보적인 서열을 가진다. 본원에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 상기에서 정의된 바와 같이, 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 완전 상보적인 것 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다. 프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명의 miRNA의 뉴클레오타이드 서열은 본원에 개시된 서열 또는 miRBase에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 검체로부터 miR-204의 발현을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 발현량을 검사 대상자의 관절염 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 관절염 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 miR-204 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법에서 상기 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 발현량을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 검출결과와 비교하는 것으로, 정상 대조군과 비교하여 그 발현량이 증가한 것이다.

나아가 본원에 따른 방법은 마커의 발현량을 검사 대상자의 관절염 진단 또는 예후 판별시에 발작 질환 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 및 초음파 등의 검사를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현 정도, 예컨대, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rded. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현 정도가 정상 대조군과 비교하여 예를 들면 약 1.5배 이상, 바람직하게는 2배이상의 발현도를 나타내는 경우에는 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 관절염을 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정한다.

본원은 또한 연골 세포의 PG 합성에 중요한 조절자인 miR-204의 상위 조절자 및 miR-204의 표적 유전자를 규명한 것으로, 이를 이용하여 miR-204의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하여 관절염 치료제를 개발할 수 있다.

이러한 관점에서 본원은 다음의 단계를 포함하는 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

miR-204 RNA를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 miR-204 RNA의 활성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 접촉된 miR-204의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-204 RNA의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 일 구현에서, 상기 miR-204 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-204 RNA의 발현으로 분석되는 것이다. 예를 들어 본원에 따른 miR-204을 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, miR-204의 ?현량의 변화를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 발현량에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 miR-204의 발현량은 노던블랏, RT-PCR, 마이크로어레이를 이용한 혼성화 방법 등과 같은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

또다른 구현예에서 상기 miR-204 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-204 RNA의 표적인 CS 이탄당 반복체 빌딩블록인 UDP-GlcA 및 UDP-GalNAc의 전달체로 작용하는 SLC35D1(52); CS 사슬의 신장에 관여하는 CHSY1 및 CSGALNACT2 (53, 54); 사슬의 GalNA 황산화에 필요한 효소인 CHST11 및 CHST15 (55, 56); 그리고 HA 및 코어 단백질 PG 백본의 어셈블리에 필요한 HAS2 and HAPLN1 (57, 58)의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정된다. 예를 들어 본원에 따른 miR-204을 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, 상기 유전자 적어도 하나 바람직하게는 전부의 3'-UTR과 miR-204의 상호작용 정도를 접촉 전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 상호작용에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 RNA-RNA 상호작용을 검출하는 방법은 당업계의 공지된 것으로 예를 들면 RNA Walk (Lusting et al., Nucleic Acids Res. 2010; 38(1):e5 에 기재된 것 참조) 또는 Yeast two hybrid system (Piganeau et al., RNA 2006; 12: 177-184) 등을 이용하여 검출할 수 있으며, RNA: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 2011)를 참조할 수 있다.

다른 구현예에서 본원의 방법에 사용될 수 있는 miRNA 및 또는 표적 유전자는 또한 분리된 형태 예를 들면 플라스미드 또는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 세포의 경우 본원의 방법에 채용되는 물질을 내인적으로 발현하거나, 또는 이를 발현하는 플라스미드의 도입(transient 또는 stable 전달이입)에 의해 이를 발현 또는 과발현하는 세포주일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포주는 일차 배양 연골세포, 퇴행성관절염 환자 유래 일차 배양 연골세포, SW1353 세포주를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 구현예에서 상기 세포주는 C20A4, TC28A2, 또는 C28I2을 포함하는 인간 연골 세포주: 또는 H4 마우스 콘드로사이트 (RRID: CVCL_W634), ATDC5, 또는 MC615를 포함하는 마우스 연골세포주를 포함하는 세포를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서, 상기 세포주에서 상기 활성은 상기 miR-204 RNA의 발현 분석으로 결정되며, 상기 세포는 miR-204 발현의 상위 조절자로 GATA 모티브에 결합하는 전사인자인 GATA4 (인간 GATA4 단백질 서열 NCBI 데이터베이스: NP001295022.1, NP002043.2, NP001295023.1, 핵산: NM001308093.1, NM002052.4, NM001308094.1) 및 NF-kB (인간 NF-KB 단백질: NP068810.3, NP001138610.1, NP001230913.1, NP001230914.1, 핵산: NM021975.3, NM001145138.1, NM001243984.1, NM001243985.1) 또는 NF-kB (Nuclear Factor kappa B) (단백질 서열 NCBI 데이터베이스 : NP_001158884.1 NP_001306155.1 등)을 추가로 발현한다. 후보물질은 상기 상위 조절자의 조절을 통해 miR-204의 발현(전사)을 조절할 수 있다. 예를 들면 본원 도 12의 c 및 e에 기재된 시스템을 통해 miR-204의 전사를 억제하는 물질을 선별할 수 있을 것이며, 상기 시스템에 사용될 수 있는 프로모터는 서열번호 7로 개시된다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 세포의 종류, 양 및/또는 조건을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 miR-204 RNA의 활성의 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

일 구현예에서는 miR-204의 발현 또는 활성을 억제할 가능성이 있는 물질이 시험물질로서 사용된다. 앞서 언급한 바와 miR-204 활성은 이의 표적 유전자와의 결합을 억제할 수 잇는 것이다. 다른 구현예에서는 miR-204를 코딩하는 유전자의 전사를 억제할 가능성이 있는 물질이 시험물질로서 사용된다.

본원의 "시험물질"은 상술한 바와 같은 miR-204 RNA의 활성 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

실시예

실험 방법

실험의 설계

본 연구의 목적은 퇴행성관절염의 진행과 연관된 miRNA를 발굴하고 miRNA 저해제를 통한 치료 전략 확보에 있음. 퇴행성관절염의 진행에 있어 세포 노화의 중요성이 증가함에 따라 본 연구진은 그 miRNA의 기능 저해를 통해 연골세포 내 노화 표현형을 효과적으로 완화하고 퇴행성관절염을 치료하는 miRNA를 선별하고자 하였음. 이를 위해 퇴행성관절염 환자로부터 무릎 관절 연골 조직을 수집한 paired analysis를 수행하였음. 노화성 및 외상후 퇴행성관절염 마우스 모델을 이용해 miRNA와 antimiR 저해제의 기능을 분석하였음. 실험에 사용된 마우스는 각 그룹으로 무작위적으로 배치되었으며 모든 샘플은 암맹평가를 통해 분석되었음. 실험군 별 숫자는 선행연구를 통해 결정되었으며, 특정 샘플을 분석에 배제한 경우는 없음. 각 실험에 대해 실험군 별 숫자는 독립적인 반복 실험군 숫자이며, 각 도면의 설명에 기재되어 있음. 인체유래물의 분석과 동물실험을 동반하는 실험들은 해당되는 윤리적 검토기관을 통해 승인되었음.

통계적 분석

세포실험에 대해서는 각 실험이 독립적으로 최소한 세 차례 진행되었음. 실험군의 비교는 모수적 검정에 대해 two-tailed Student's t test 또는 ANOVA with post hoc test (LSD)를 통해 진행하였음. 개체 수준의 동물실험에서 한 마리의 마우스가 각각의 독립된 trail로 사용됨. 동물 실험의 비모수적 검정은 Mann-Whitney U test 또는 다중 실험군의 비교에 대해서는 Kruskal-Wallis test with Mann-Whitney U test를 통해 진행되었음. P-value < 0.05인 경우에 대해 통계적으로 유의미하다고 분석하였음. 모든 통계적 분석은 IBM SPSS Statistics 23 프로그램을 이용해 진행되었음.

마우스 퇴행성관절염 실험모델

모든 동물실험은 서울대학교동물실험윤리위원회를 통해 승인되었음. 동물실험의 설계, 분석, 보고는 ARRIVE 강령을 따라 진행되었음. 동물은 서울대학교 무균동물시설(SPF)에서 사육되었음. 야생형 수컷 C57BL/6N 마우스가 실험에 사용되었음. FITC-miRNA의 무릎 내 전달 실험은 5 μg의 FITC-labeled miR-Ctrl을 10 μl의 transfection(형질주입) mixture (1.2μl의 in vivo-jetPEI® (Polyplus), 5% glucose, 0.2 mg of miRNA/kg)를 무릎 관절강내 주사를 통해 진행되었음. FITC의 전달은 관절강 내 주사 후 이틀 뒤에 분석됨. MiRNA의 무릎 내 전달 실험은 10μg의 miR-Ctrl 또는 miR-204를 10μl의 transfection mixture (1.2μl의 in vivo-jetPEI® (Polyplus), 5% glucose, 0.4mg of miRNA/kg)를 무릎 관절강내 주사를 통해 진행되었음. 자발적 퇴행성관절염 유도 실험의 경우 miR-Ctrl 또는 miR-204를 생후 12주 마우스에 10주간 5차례 주입한 뒤 마우스의 조직 분석을 통해 진행되었음. DMM 수술을 통한 외상후 퇴행성관절염 모델은 생후 12주 마우스에서 유도되었으며, sham 수술을 진행한 마우스가 대조군으로 사용되었음. DMM 수술 후 6, 8, 또는 10주 후 마우스를 희생하였음. miR-204에 의한 퇴행성관절염 심화를 관찰하기 위해 DMM을 수행한 마우스에 6주간 네 차례의 무릎 관절강 내 주사를 통한 miR-204 전달이 이루어짐. antimiR-204에 의한 퇴행성관절염 억제를 관찰하기 위해 DMM을 수행한 마우스에 10주간 다섯 차례의 무릎 관절강 내 주사를 통한 antimiR-204 전달이 이루어짐. 생후 24개월 마우스가 노화 마우스 모델로 사용되었음. Safranin O 염색과 OARSI grading system을 이용한 퇴행성관절염 심화도 분석을 통해 연골의 퇴행 정도가 분석되었음.

인체로부터 분리된 인체 유래 시료 수집

서울대학교 보라매병원에서 인공관절치환술을 수행한 10인의 퇴행성관절염 환자로부터 퇴행성관절염이 심하게 발생한 무릎 관절 연골과 상대적으로 덜 영향 받은 부위를 수집하였음. 서울대학교 보라매병원과 서울대학교의 생명윤리위원회에서 인체유래물 연구를 승인하였음. 인공관절치환술을 진행하기 전에 10인의 환자로부터 IRB 연구에 동의하는 동의서에 서명을 받음.

세포 배양

마우스 무릎 관절 연골세포의 1차배양을 위해 생후 5일 ICR 마우스로부터 femoral condyle과 tibial plateau를 분리하여 collagenase 처리를 통해 연골세포를 분리하였음. 마우스 연골세포는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에 배양되었음. 37도씨, 5% 이산화탄소, 3% 산소 조건에서 세포가 배양되었음. 마우스 연골세포의 1차배양 3일 이후 세포를 이용한 실험을 수행하였음. 연골세포 계대배양 실험의 경우 37도씨, 5% 이산화탄소, 20% 산소 조건에서 배양된 세포가 트립신 처리를 통해 계대배양되었음. 2차례의 계대배양 후 P2 세포는 전사체 분석, Alcian blue 염색 등에 사용되었음. SW1353 세포주는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에 배양되었음. 인체유래물 관절 연골세포의 1차배양을 위해 인간 연골 검체로부터 femoral condyle과 tibial plateau를 분리하여 선행연구와 같이 collagenase 처리를 통해 연골세포를 분리하였음. 인간유래 연골세포는 10% FBS와 1% antimycotics, 1% antibiotics가 첨가된 DMEM/F-12에 배양되었음. 형질주입 전 4시간동안 FBS가 없는 DMEM에 hyaluronidase type I-S (4 units/ml)을 첨가한 배지에 연골세포를 두었음. siRNA, miRNA, antimiR 형질주입은 METAFECTENE® PRO (Biontex)를 이용하여 진행되었음. p53의 세포 내 안정화 실험을 위해 연골세포에 nutlin-3a를 처리하였음.

인체로부터 분리된 인체유래 연골 조직 배양

퇴행성관절염 환자의 연골 tibial plateau의 내측 퇴행성관절염의 정도가 심한 부위를 8 mm³ 크기로 절편한 뒤 3% 산소 조건에서 10% FBS와 1% antimycotics, 1% antibiotics가 첨가된 DMEM/F-12에 배양하였음. AntimiR 형질주입은 METAFECTENE® PRO를 통해 이루어졌으며, 24시간 형질주입 후 7일 뒤 조직을 염색하였음.

조직학과 면역조직화학 염색법

퇴행성관절염 인체유래물은 OCT compound에 넣고 굳혀 5 μm 두께로 동결절편화하였음. 동결절편의 조직학적 분석을 위해 20분간 air dry를 한 후 차갑게 해둔 아세톤을 이용해 10분간 고정하였음. Alcian blue 염색과 OARSI grading을 통해 인체유래물의 조직학적 분석을 진행하였음. 마우스 모델에서 수집한 무릎 관절 연골 조직은 4% paraformaldehyde로 고정하고 0.5M EDTA로 탈석회화하고 processing을 통해 paraffin block을 제작하였음. 5 μm 두께로 절편화한 마우스 관절은 Safranin O 염색과 OARSI grading을 통해 조직학적 분석을 수행하였음. 연골의 손상은 safranin O 염색과 OARSI grading을 통해 분석됨. 경골 내측 경화는 연골하골 겉질뼈와 골수 간의 비율로 측정됨. 골극 형성은 전내측 경골의 분석을 통해 이루어짐. 활액막염은 활액막 내 염증 세포의 침투 정도를 기준으로 측정되었음.

면역형광법

인체유래 또는 마우스 연골세포는 50% 메탄올 및 10% 아세트산 고정액에 고정되었고, PBS 세척 3회 후 blocking solution (0.1% BSA, 10% FBS in PBS)에 처리되었음. 그 후 1차항체 및 2차항체와 DAPI를 이용해 형광을 표지하였음.

체중 부하 측정

체중부하를 위해 마우스는 측정기구 (Incapacitance meter)에서 안정을 취하도록 3회 이상 훈련되었으며, 마우스가 한쪽 다리를 벽에 짚지 않을 때까지 적응 기간을 두었음. 마우스의 양쪽 다리가 양 측정 패드에 위치하는 것을 확인한 뒤 양 다리에 1초간 걸리는 체중 부하를 측정하였음. 3회 이상 측정 후 Sham을 수행한 다리 대비 DMM을 수행한 다리에 걸리는 체중을 퍼센트 단위로 변환하였음.

리포터 유전자 분석

miR-204 프로모터 reporter gene assay 는 다음과 같이 수행됨. 0.9μg의 Trpm3-miR-204 TSS1 또는 TSS2 프로모터 벡터와 0.1μg의 constitutive Renilla luciferase 벡터를 6시간 형질주입한 연골세포의 배지를 시약과 FBS가 들어있는 배지로 교환한 뒤 5일간 배양하였음. 3′UTR reporter gene assay는 다음과 같이 수행됨. 0.225μg의 3′UTR vector, 0.1μg의 constitutive Renilla luciferase 벡터, 50nM의 miR-Ctrl 또는 miR-204를 24시간 연골세포에 형질주입한 뒤, 배지를 교환하여 하루 더 배양하였음. 세포 lysate의 reporter gene 활성도는 Dual Luciferaee Assay Kit를 이용하여 분석됨.

sGAG assay

P0 연골세포에 miR-204이나 각종 siRNA들을 24시간 형질주입한 뒤 FBS가 없는 배지로 교환하여 3일간 배양하였음. 형질주입 이후 매일 세포 배양액을 수집하여 배지 내 sGAG 양을 분석하였음. 배지 내 sGAG 양은 DMMB assay의 525 nM 흡광도 측정을 통해 진행됨. sGAG 양은 MTT assay를 통해 보정됨.

MTT assay

33μg/ml의 PBS-based MTT solution를 30분간 세포에 처리한 뒤 PBS로 2회 washing하였음. DMSO를 15분간 처리해 침전물을 용해한 뒤 570nM의 흡광도를 측정하였음.

RT-PCR과 정량적 RT-PCR

세포 내 전체 RNA는 TRI reagent를 통해 추출되었고, EasyScript Reverse Transcriptase (Transgen Biotech)를 통해 역전사되었음. cDNA는 amplified by RT-PCR이나 qRT-PCR를 통해 증폭되었음. SYBR TOPreal PCR 2× premix (Enzynomics)와 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied iosystems)을 이용해 정량적 RT-PCR이 수행됨. miRNA의 정량적 분석은 miRCURY LNA microRNA PCR kit (Exiqon)를 통해 진행되었으며, U6 snRNA control을 이용해 결과를 보정하였음.

플라스미드

miR-204 promoter의 reporter gene assay를 위해 진화적으로 보존된 Trpm3-miR-204의 두 개의 전사시작점의 프로모터 부분을 genomic DNA로부터 증폭하여 pGL3-basic 벡터로 삽입하였음. miR-204의 표적 유전자 내 예상 결합부위는 TargetScanHuman 7.0를 통해 예측하였음. miR-204 결합부위를 포함하는 3′UTR는 pGL3-UC 벡터의 luciferase 유전자의 3′(downstream)에 삽입되었음. 한 개의 miR-204 결합부위를 가진 유전자에 대해서는 결합부위를 중심으로 한 300bp를 삽입하였음. 다수의 miR-204 결합부위를 가진 유전자에 대해서는 모든 결합부위와 300bp의 주변 서열을 포함하는 부위를 삽입하였음. miR-204 결합부위를 가지지 않는 유전자에 대해서는 전체 3′UTR 부위를 삽입하였음. Mutant 3′UTR 벡터는 전체 miR-204 결합 부위 (5′-AAGGGA-3′)를 임의 서열(5′-CGTACC-3′)로 치환하여 제작하였음. p16^INK4a의 면역형광법을 위해 p16Ink4a 및 p19Arf 유전자의 번역 부위를 마우스 연골세포의 역전사 DNA로부터 추출하여 pcNA3-HA 벡터 내 삽입하였음.

SA-β-Gal 염색

연골세포를 두 차례 PBS로 washing하고, 2% PFA와 0.2% glutaraldehyde를 이용해 5분간 고정하였음. 37도씨에서 12~16시간 SA-β-Gal 염색액에 두었음. 염색 이후 PBS로 두 차례, methanol로 washing한 뒤 air drying하였음, Eclipse Ni-U microscope (Nikon)를 이용해 이미징하였으며, 전체 세포 개수와 SA-β-Gal이 나타난 세포의 개수는 각 dish 별 세 개의 임의의 영역을 정량화한 결과로 하였음.

면역 블롯

HEK293T 세포주는 pcDNA3-HA, pcDNA3-HA-p16^Ink4a, 또는 pcDNA3-HA-p19^Arf 플라스미드와 PEI 복합체로 형질주입되었음. 마우스 연골세포는 miR-Ctrl 또는 miR-204로 형질주입됨. 세포는 두 차례의 PBS washing 후 protease inhibitor가 들어있는 RIPA buffer에 용해됨. 50 μg의 lysate를 12.5% SDS-PAGE gel을 이용해 분리된 후 NC membrane 위에 transfer됨. Membrane은 3% 탈지분유가 들어있는 TBS-T를 이용해 blocking된 후 1차항체 (4도씨, 12시간) 및 2차항체 (실온, 1시간) 처리 후 ECL 기질과 LuminoGraph II System을 이용해 관찰됨.

연골세포에서의 DNA damage 유도

마우스 연골세포에서의 doxorubicin에 의한 DNA damage 유도는 5일간 처리를 통해 이루어졌으며, bleomycin에 의한 DNA damage 유도는 1일간 처리를 통해 일시적으로 유도한 후 3일간 신선한 배지에서 추가 배양하여 진행되었음. Ionizing radiation (IR)을 통한 DNA damage 유도는 GC 3000 Elan irradiator (MDS Nordion)를 이용하여 4 Gy/min의 감마선을 조사하여 진행되었음. IR을 조사한 뒤 5일 이후 세포가 분석됨. 마우스 연골세포에 산화 스트레스를 생성하기 위해 sodium pyruvate을 포함하지 않는 배지에서 명시된 농도 및 시간 동안 과산화수소 또는 menadione을 처리하였음. siRNA 또는 antimiR 형질주입은 IR 조사 후 2일 뒤 24시간 동안 진행되었으며, 신선한 배지에서 2일간 추가 배양한 뒤 세포를 분석하였음. 인간유래 연골세포에서의 세포노화 유도를 위해 doxorubicin을 14일간 처리하였음.

연골세포의 아가로스 배양

연골세포의 3차원 배양은 agarose gel 내 배양을 통해 진행되었음 100nM의 miR-Ctrl 또는 miR-204를 24시간 형질주입한 연골세포를 2일간 배양한 뒤 액화된 2% low melting agarose, 2% FBS, 1% HEPES, 1% 페니실린/스트렙토마이신, DMEM이 들어있는 agarose gel medium에서 배양하였음. 24-well plate에서 14일간 배양한 뒤 4% PFA로 3일간 고정한 뒤 processing하여 7μm 두께로 절편화하였음. Alcian blue 염색을 통해 세포 ECM을 염색한뒤 Image Pro Premier software (Media Cybernetics)를 이용하여 ECM의 두께를 측정하였음.

miRNA 제자리 혼성화기법

miR-204-5p and U6 snRNA에 대한 miRCURY LNA detection probe (5′ and 3′ DIG-labeled, Exiqon)를 이용하여 제자리 혼성화기법을 수행하였음. 연골 절편에 5μg/ml proteinase K를 37도씨에서 30분간 처리하였고, 4% PFA 용액에 20분간 처리하여 post-fixation을 수행하였음. Probe를 overnight으로 처리한 뒤 anti-DIG-AP 항체 (Roche) and NBT/BCIP (Sigma Aldrich)에 처리하여 염색을 진행하였음.

miR-204 프로모터 영역의 in silico 분석

Trpm3-miR-204 TSS1과 TSS2의 프로모터 영역은 참고 문헌(22)에 따라 ECR 브라우저 (https://ecrbrowser.dcode.org)에 의해 분석되어 진화 보존 지역 (ECR)을 선택하였음. 각 TSS로부터 약 1.3 (TSS1) 및 1.0 (TSS2) kb 상류 영역을 프로모터 영역으로 선택하였음. 추정 전사 인자에 대한 결합 부위의 분석은 TRANSFAC 7.0 (Biobase)에 의해 minSUM cutoff로 수행하였음.

Small RNA 시퀀싱

총 RNA는 TRI 시약을 사용하여 P0 또는 P2 마우스 연골 세포로부터 추출 하였음.small RNA 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq small RNA library preparation kit (Illumina)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 Macrogen 사에서 생성하였음. 요약하자면, small RNA 조각 (17-25nt)을 겔 정제 한 다음 3 '및 5'어댑터에 순서대로 연결함. 연결된 RNA를 역전사하여 PCR로 증폭시키고, PCR 산물을 HiSeq 2500 System (Illumina)에 의해 서열 분석하였음.

Small RNA 염기서열 분석

데이터 처리 과정으로 Truseq 3 '어댑터 시퀀스는 FASTQ 파일에서 제거되었으며 18nt보다 짧은 읽기는 cutadapt (45)를 사용하여 필터링 하였음. 다음으로, FASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)을 사용하여 low-quality 리드(phred quality <20 또는 <30 in> 95 % 또는> 50 % of nucleotide) 또는 인위적인 리드는 삭제하였음. 처리된 리드는 BWA의 -n 3 (46) 옵션으로 Mus musculus reference genome (mm10)에 정렬하였음. 매핑 된 리드를 증폭시키기 위해 정렬 결과를 최상의 정렬 스코어로 선택하였음. 최상의 정렬 스코어는 사용자 정의 스크립트를 사용하여 3' 끝의 리드의 불일치만 허용하였음. miRBase V21의 miRNA (miRBase V21)의 지놈 좌표와 중복 된 리드 값은 BEDTools의 intersectBed에 의해 확인되었으며 추가 분석에 사용됨. 우리는 edgeR 라이브러리에 내재 된 일반 선형 모델 (GLM)을 사용하여 대조군과 일치하는 노화 연골 세포 (49) 사이에 차별적으로 발현 된 miRNA를 발견하였음. 우도 비율 테스트로 P 값을 계산하고 Benjamini-Hochberg 절차로 조정하였음. 차별적인 miRNA 발현에 대한 cutoff는 FDR <0.0001로 설정하였음.

RNA 시퀀싱

마우스 연골세포에 50 nM miR-Ctrl 또는 miR-204 mimic을 24 시간 동안 전달하고 48 시간 동안 새로운 배지에서 배양 하였음. 4개의 생물학적 반복을 각각의 실험군에 사용하였음. 총 RNA는 TRI 시약을 사용하여 분리 하였음. 1 마이크로 그램의 전체 RNA(RIN> 9.5)를 사용하여 TruSeq Stranded mRNA LT 샘플 준비 키트 (Illumina)로 cDNA 라이브러리를 획득하였음. 최종 cDNA 라이브러리는 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 qRT-PCR (Kapa Library Quant KIT, Kapa Biosystems)으로 정량화하고, 시퀀싱을 위해 2 nmol / L로 정규화하여 크기 분포를 분석하였음. RNA 시퀀싱은 HiSeq 2500 System을 사용하여 수행하였고 전 RNA 시퀀싱 절차는 마크로젠에 의뢰하여 수행하였음. TopHat 프로그램을 사용하여 리드가 처리되었고 기준 지놈 (mm10)에 정렬하였음. TopHat는 정렬을 위해 Bowtie v2.2.3 (2) 알고리즘을 통합하였고, 기준 게놈 서열 및 애노테이션 데이터는 UCSC 지놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu)로부터 다운로드되었음. 유전자 주석 정보는 다른 매개 변수를 기본값으로 설정하는 동안 "-G"옵션을 사용하여 TopHat를 실행하는 데 사용됨. 지놈으로 리드를 정렬 한 후, Cufflinks v2.2.1을 사용하여 정렬 된 리드를 사본으로 집계하고 그 양을 추정하였음. mRNA 전사체는 Cufflinks 사용하여 FPKM (fragments per kilobase per million mapped read) 당 프래그먼트를 계산하여 정량화하였음. 유전자 발현의 통계적 분석을 위해 하나 이상의 표본에서 FPKM이 제로 값을 갖는 유전자는 제외하였음. 샘플의 Quantile 표준화는 log2 (FPKM + 1) 값을 사용하여 수행하였음. miR-Ctrl 및 miR-204가 전달된 연골 세포 사이의 통계적으로 유의미한 유전자 발현은 검출 P 값이 0.05 미만으로 설정하였음.

RNA 시퀀싱 데이터 및 공개 데이터의 생물 정보학 분석

검출 P 값 <0.05을 기준으로 구성된 차별적으로 발현 된 유전자 differentially expressed gene)들 중에서 Pearson correlation, Euclidean distance, Ward criterion에 기초한 계층 적 클러스터링 알고리즘을 사용하여 co-expression 패턴에 따라 4 개의 유전자 세트를 분류하였음. 분석은 R 버전 3.3.2을 이용하였음. TargetScan에 기초하여 예측된 miR-204-5p의 표적 유전자들의 추정 P 값을 계산하여 각 군에서 표적 유전자의 enrichment socre을 측정하였음. 4개의 클러스터의 유전자 온톨로지 분석은 Enrichr (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)을 사용하였음. 클러스터 2의 경우, KEGG, Reactome 및 HumanCyc의 상위 4 개 용어가 Enrichr combined score로 선정됨. 클러스터 1, 3 및 4의 경우 KEGG, Reactome 및 HumanCyc의 최상위 용어가 Enrichr 합산점수에 의해 선택되고 결합 점수가 표시하였음. PG 생합성 경로는 Ingenuity Pathway Analysis (https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathwayanalysis/) 에서 얻음. 경로의 구성 요소의 변화차이는 색의 차이로 표시됨. OA 연골에서 miR-204 표적 유전자 enrichment의 정도를 분석하기 위해, 통계적으로 유의미하게 증가한 41개 miRNA들의 예상 표적 전사체와 퇴행성관절염 및 노화 연골에서 감소한 유전자 세트들 사이의 중복된 유전자 수가 결정됨. GSEA의 경우 GSE57218 또는 GSE41342의 유전자 목록은 fold change에 따라 정렬하였음. GSEA 소프트웨어는 OA 또는 노인 연골에서 감소한 유전자의 목록의 GSEA 분석을 위해 모두 기본 기준의 re-ranked mode로 사용하였음.

[표 1] siRNA, miRNA 및 antimiR의 서열

[표 2-1] 본원에 사용된 PCR 프라이머 서열

[표 2-2] 본원에 사용된 PCR 프라이머 서열

표 3 본원에 사용된 클로닝용 PCR 프라이머 리스트

실시예 1: 인간 및 마우스 OA(골관절염) 연골(cartilage)에서 miR-204의 상향 발현

본 실시예 에서는 PG 손실과 연골 퇴행과 같은 주요 OA 연골 징후와 관련이 있는 연골세포에서 이전에 알려지지 않은 노화 관련 신호 전달 경로를 규명하고자 하였다. 일차 배양 세포에 대한 장기간의 정상산소농도 (normoxia) 영향은 알려져 있다(25-27). 연골 세포가 분리되는 생리학적 니치(Niches)는 낮은 산소 장력 (0.5 ~ 5 %)에 있다 (28). 본원에서는 생리학적 산소농도보다 높은 농도에서 배양 된 일차 마우스 연골 세포는, 지질 과산화 생성물인 4-hydroxynonenal (4-HNE)의 증가에 의해 입증 된 바와 같이 광범위한 산화 스트레스를 보였다 (도 1B). 정상 산소 농도에 노출된 연골 세포 (즉, 2번 계대)는 강력한 감마-H2AX 핵 포사이로부터 알수 있듯이 DNA 손상 반응을 나타냈을 뿐만 아니라 p16^INK4a의 유도, Cdkn1a 및 Cdkn2a의 상향 조절, Lmnb1의 하향 조절과 같은 다양한 노화 표현형을 나타냈고, SA-베타-Gal 양성을 증가시켰다 (도 1A 및 도 1C 내지 도 1E, 도 8의 A). 이 상태의 연골 세포는 또한 황산화 된 PGs의 활성 합성을 중단시켰다 (도 1F).

본원에서는 정상 산소 농도하에서 연속적으로 계대배양되는 연골 세포에서 small RNA 염기 서열 분석을 수행했다 (도 7의 A). 그 결과 총 41 개의 miRNA가 노화의 개시와 함께 차별적으로 상향조절 된 miRNA로 확인되었다 (도 7의 B). 특히, miR-204는 양의 증가 (18.1 배 증가) FDR (False discovery rate, FDR, 1.66 × 10-60) (도 1G 및 도 1C)의 측면에서 현저한 차별성이 있었다. targetScan 알고리즘 (30)을 사용하여 41 개의 차별적으로 상향 조절 된 miRNA의 표적 전 사체를 예측하고 OA 및 노화 연골의 전사체와 비교하였다. 특히 miR-204-5p와 miR-24-3p, miR-27b-3p 및 miR-30a-3p의 3 가지 다른 miRNA의 예상되는 표적은 OA 및 노화 연골의 하양 조절 유전자 세트에 집중되어 있었다 (도 1H). 나아가 miR-24, miR-27b 또는 miR-30a가 아니라, miR-204가, 노화된 연골세포에서 관찰되는 OA 관련 표현형인, 연골 세포에서 황산화 GAG (sGAG)의 신생 합성의 억제를 일으킨다는 것을 실험적으로 규명하였다 (도 1I). 따라서, 상기 결과를 근거로 miR-204와 OA 발병, 병인의 관련성을 조사하였다.

본원에서는 인간과 마우스의 OA 연골에서 miR-204의 발현 특징을 규명 하였다. miR-204 농도는 OA에 걸린 인간 연골에서 증가되었지만 손상되지 않은 관절 연골부위에서는 거의 검출되지 않았다. 이 발현 패턴은 세포 노화의 바이오 마커인 p16INK4a (도 1J)의 발현 양상과 관련성이 있는 것으로 나타났다. OA 표현형이 무릎 관절의 관절 연골에서 나타난 노화 마우스 모델에서, miR-204 발현은 p16INK4a의 발현과 함께 현저하게 상승 하였다 (도 1K 및 도 2B). 본원에서는 또한 외상후 골관절염의 마우스 모델로서 DMM (Destabilization of Medial Meniscus) 수술 의 불안정성을 사용했다 (33, 34). 관절의 기계적 불안정성이 연골 세포의 노화를 유발한다는 이전의 연구와 일치하게도, 본원에서는 OA의 수술 유도 후 p16INK4a 및 miR-204 수준의 현저한 증가를 발견했다 (도 1L 및 도 8의 C). GSEA (Gene set enrichment analysis) 분석을 통해 miR-204의 표적 유전자가 또한 OA 연골의 전체 전사체에서 농도가 감소되어 있음(negatively enriched)을 발견하였다. 이는 miR-204의 상향 조절이 OA 조건에서 표적 유전자를 억제하는 역할을 한다는 것을 나타낸다 (도 1M).

실시예 2. 노화 - 유발 스트레스에 의한 miR-204의 발현 유도

본 실시예에서는 miR-204가 OA 연골에서 상향 조절되는 분자 기전을 연구하기 위해 miR-204 전사 유도를 담당하는 상위 신호를 조사하였다. OA에서 산화 스트레스의 결정적인 중요성과 miR-204 발현 패턴이 산화 스트레스와 상관 관계가 있다는 사실에 주목하여 miR-204 발현 조절에서 ROS의 역할을 분석했다 (도 1B, 도 1G 및 도 7의 C). 연골세포에서 miR-204 발현을 조절에 있어 ROS의 역할을 분석하였다. 일차 배양 마우스 연골세포에서는 자유 라디칼 발생제인 메나디온 또는 과산화수소(H2O2)로의 급성 처리가 miR-204 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 단기의 산화 환원 신호는 상위 조절자가 아님을 나타내는 것이다 (도 2A).

흥미롭게도 H2O2 에 장기간 노출(7 일)되면 DNA 손상의 축적과 노화 마커의 유도와 함께 miR-204 발현을 현저하게 유도했다 (도 2B 내지 2E). 또한 다른 노화 유발 자극이 또한 miR-204 발현에 영향을 주는지를 조사하였다. 연골 세포의 DNA 손상과 세포 노화를 유발하는 이온화 방사선 (IR)은 miR-204의 발현을 강력하게 유도했다 (도 2H, 도 2F 및 도 2G, 및 도 3). 블레오마이신 또는 독소루비신과 같은 같은 DNA를 손상시키는 화학제제는 유사하게 노화 표현형과 miR-204 발현을 촉진하는 것으로 나타났다(도 2I 내지 도 2L, 도 4).

p53은 DNA 손상에 반응하여 활성화되고 노화 유도된 세포주기 정지를 일으킨다 (37). 기계적 스트레스와 같은 OA 유도 조건은 DNA 손상을 유발하고 p53을 활성화시킨다 (38). 따라서 본원에서는 p53이 miR-204의 상위 조절자로서 작용하는지 여부를 조사하였다. 연골 세포에서 DNA 손상 인자는 현저하게 Cdkn1a의 발현을 촉진하여 p53 활성화하는 것으로 나타났다 (도 11의 A). 그러나, nutlin-3a에 의해 유도 된 p53 활성화는 miR-204 발현을 증가시키지 않았다 (도 5b). 일관되게 p53의 small interfering RNA (siRNA) 매개 낙다운은 IR-유도 miR-204 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 11의 C 및 D). 유사하게 또 다른 주요 노화 관련 세포주기 정지 조절자인 p16INK4a (32)는 miR-204의 발현을 조절하지 못했다 (도 11의 E 및 F).

세포주기 정지와 더불어 세포 노화는 SASP라고 불리는 향-염증 반응을 일으킨다 (39). 이전에 보고 된 바와 같이 (40, 41), SASP는 비교적 천천히 발생하여 노화를 매개로 하는 세포주기 정지가 시작되고 며칠 후에 나타났다. 특히, miR-204 발현은 Il6 및 Mmp3과 같은 SASP 인자의 발현과 일치하며 (도 2M), 이는 miR-204 및 SASP가 공통적인 상위 조절자에 의해 조절 될 수 있음을 시사한다. 이 가설을 탐구하기 위해, 본원에서는 먼저 miR-204의 전사를 조절하는 것으로 추정되는 프로모터를 규명하였다. miR-204는 Trpm3 호스트 유전자의 인트론 부위에 위치하고 있으며 miR-204와 Trpm3의 발현은 공통적으로 나타난다 (42). Trpm3 mRNA는 miR-204 발현 패턴 (도 2H 및 도 12의 A 및 B)과 일치하여 용량 및 시간 의존적으로 IR에 의해 유도되었다. 게놈 분석에 따르면 Trpm3에는 진화적으로 보존된 2 개의 전사 시작 사이트 (TSS), TSS1과 TSS2 (도 12의 C)가 있다. 본원에서는 TSS1과 TSS2에서 전사를 반영하는 두 가지 리포터 구축물을 생성했다. TSS2 리포터가 아닌 TSS1 리포터 는 IR 노출에 반응했다 (도 12의 D). TRANSFAC 분석 (43)을 통해 SASP 조절에 관여하는 전사 인자인 GATA4 (40)와 NF-κB (44)가 TSS1 프로모터의 상류에 결합 할 것으로 예측되었다 (도 12의 E). 실제로, IR 노출 또는 DNA 손상 인자에 의해 유도 된 miR-204 발현은 Gata4 또는 Rela를 표적으로 하는 siRNA에 의해 효과적으로 제거되었다 (도 2N 및 도 2O, 및 도 12의 F 및 G).

실시예 3. miR-204에 의한 연골 세포에서 황화 PG 합성 저해 및 OA 발병

본 실시예에서는 연골 세포에서 상향 조절된 miR-204의 병태생리학적 역할을 탐구했다. 연골 세포에 miR-Ctrl 또는 miR-204를 직접 전달하여 3 차원 (3D) 매트릭스(45)로 배양했다. 매트릭스-임베디드 miR-Ctrl-전달이입된 연골 세포는 PG에 풍부한 세포주변 기질 (pericellular matrix)를 축적하였다. 대조적으로, miR-204로 전달이입된 연골 세포는 세포외기질 (ECM)의 침착히 현저히 감소되었다(도 3A). 일관되게 miR-204 전달은 연골 세포에서 sGAG의 세포외 방출을 감소시켰다 (도 3B 및 도 12의 H).

연골기질 합성능의 감소는 OA 연골 세포의 주요한 징후이기 때문에 본원에서는 miR-204의 관절 내 (IA) 전달이 마우스에서 생체 내에서 OA 관련 phenotypes을 유도 하는지를 시험 하였다 (도 3C). 마우스 무릎 연골에 small RNA를 효과적으로 전달하는 전달이입 시약인 양이온성 중합체를 사용하였다. 연골 ECM 내의 연골 세포가 jetPEI 및 FITC 표지 miRNA (FITC-miRNA) 복합체의 IA 주사에 의한 전딜이입의 표적임을 실험적으로 확인했다. FITC-miRNA는 관절 연골의 표면과 중간 영역에 위치한 연골 세포에서 주로 발견되었다 (도 13의 A). 또한 주입된 miRNA는 관절의 활막 세포에서 발견되었다.

마우스 무릎 관절 조직으로의 miR-204 전달은 섬유성연축 또는 균열 (fibrillation 또는 fissure)로부터 명백하듯이, 현저한 PG의 손실과 자연적 연골의 파괴를 유발했고, 반면 miR-Ctrl의 전달은 연골에 영향을 미치지 않았다 (도 3D 내지 도 3F). miR-204를 투여 한 마우스는 또한 중등도의 연골하 골 경화증 (subchondral bone sclerosis) 을 나타냈다. 골증식증 발생과 활막염은 관찰되지 않았다. 면역조직화학염색 분석으로 miR-204를 주사 한 마우스의 관절 연골 세포에서 MMP13 수치의 증가를 발견하였고, 이는 연골에서 퇴행성이 진행되고 있음을 나타낸다 (도 13의 D). 대조적으로, 활막 세포에 miR-204를 효율적으로 전달 함에도 불구하고, IL-1β, TNF-α 또는 MMP13의 발현은 활막에서 발견되지 않았으며, 활막염의 징후와 일치하지 않았다. 종합하면 이러한 결과는 활막라이닝 염증 반응이 관절 연골의 기질 이화 작용에 이차적으로 기여할 가능성을 배제하는 것이다 (도 13의 B 및 C). 이어 miR-204 발현이 마우스에서 외상 후 OA 진행에 어떻게 영향을 미치는지를 조사했다. miR-Ctrl 전달과는 대조적으로, miR-204 전달은 DMM 유도된 OA에서 OA의 진행을 현저하게 가속화하였으며, 이는 연골파괴, 연골하골경화증, 골증식성숙 (osteophyte maturation) 및 활액막염 (synovitis)을 포함하여 조사된 모든 OA 관련 증상을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 3G 및 도 3H).

실시예 4. miR-204에 의한 연골 세포에서 PG 생합성 경로 조절

miR-204가 연골 항상성을 방해하는 근본적인 기전을 명료하게 설명하기 위해 miR-Ctrl 및 miR-204로 전달이입된 연골 세포에서 RNA 시퀀싱을 수행했다. 본원에서는 생물학적 과정에 관여하고 miR-204에 의해 통제되는 일련의 유전자 세트인 기능적 모듈을 결정하고자 했다. 본원에서는 계층적 클러스터링을 수행하여 공-발현 패턴에 따라 차별적으로 하향 조절된 유전자를 배열하였다. 이 클러스터링으로 서열 기반 miR-204 표적 (도 14의 A 및 B)이 풍부한 네 가지 유전자 집합을 밝혀 냈다. 본원에서는 이 유전자 세트가 miR-204의 상향 조절에 의해 불활성화 된 기능적 모듈을 반영한다고 가정했다. 경로 분석을 통해 확인된 유전자 세트가 '프로테오글리칸 합성', '세포주기'또는 '프로그램된 세포 사멸'과 관련된 주석이 관련이 있음을 나타냈다 (도 14의 C 및 D). 이러한 주석은 세포 노화 (49, 50)와 밀접한 관련이 있으므로, 본원에서는 miR-204가 연골 세포의 세포 노화의 원동력이라는 가능성을 분석하였다. 그러나 miR-204의 전달은 연골 세포에서 노화 관련 표현형을 직접적으로 유도하지는 않았다 (도 4, A 내지 D). 이는 골관절염 표현형으로 나타나는 PG 감소와 세포 노화, SASP 등 가운데, miR-204는 PG 감소를 직접적으로 저해하는 기능을 가지고, SASP 발현에 간접적으로 필요한 것으로 생각된다. (도 5D) 그러나 도 4, A 내지 D와 도 5C를 보게 되면 miR-204 과발현이 세포 노화를 촉진하지는 않고, miR-204 저해제가 세포 노화를 저해하지는 않음을 나타낸다.

본원에서는 4 개의 기능적인 유전자 모듈 중 클러스터 2가 예측된 miR-204 표적으로 가장 풍부하게 존재하고 PG 생합성 경로와 관련된 용어와 강한 연관성을 보였다 (도 14의 C). 따라서, 본원에서는 주요 miR-204 표적이 연골 세포 PG 합성 경로에 연루된 유전자라고 가정했다. 연골에서 황산화 PG가 가장 풍부한 GAG 사슬은 CS (4)로 구성되어있다. 따라서 본원에서는 miR-204가 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 데이터베이스 (51)에서 유래된 PG 백본 어셈블리, CS 사슬 연장 및 CS 사슬에 대한 황산염 접합에 관여하는 유전자를 포함하여 PG 생합성 경로의 유전자에 어떻게 영향을 미치는지 조사했다 (도 4E). 연골 세포에서의 miR-204 전달이입시, PG 생합성 경로를 포함하는 유전자의 전반적인 하향 조절이 있었다. 특히, 경로에 관련된 11 개의 유전자는 3'UTR에 추정 miR-204 결합 사이트를 포함하고, 그 중 7 개가 실제로 연골 세포에서 miR-204 전달이입에 의해 하향 조절되었다.

miR-204가 조절하는 7 개의 유전자는 PG 생합성과 조립에 결정적인 기능을 한다. SLC35D1은 CS disaccharide repeats (52)의 구성 요소 인 UDP-GlcA와 UDP-GalNAc를 운반하는 운반체이다. CHSY1과 CSGALNACT2는 CS 사슬 (53, 54)의 신장에 관여하고, CHST11과 CHST15는 사슬에서 GalNAc의 황화에 필요한 효소이다 (55,56). HA와 핵심 단백질 PG 백본의 조립에는 HAS2와 HAPLN1이 필요하다 (57, 58). 또한, 본원에서는 실시간 PCR 분석을 사용하여 이들 유전자의 mRNA 농도가 일차 배양된 마우스 연골 세포 및 인간 연골 육종 세포주 SW1353 (도 4F 및 도 15) 모두에서 miR-204에 의해 억제되는지를 확인 하였다.

PG 합성에 대한 miR-204의 네트 효과를 감안할 때, 본원에서는 miR-204가 이들 유전자의 3'UTR에 miR-204 표준 결합 시드 서열이 없더라도 SOX9와 aggrecan의 발현을 조절할 가능성을 조사했다. 그러나, Sox9와 Acan의 mRNA 농도 또는 3'UTR 리포터 활성은 연골 세포에서 miR-204의 영향을 받지 않았다 (도 16의 A 및 B). 마찬가지로 전체 세포 융해물에서 SOX9와 aggrecan의 단백질 농도는 영향을 받지 않았으며, 이는 miR-204에 의한 번역 수준에서의 조절 가능성을 배제하는 것이다 (도 16의 C). 또한 miR-Ctrl 또는 miR-204가 주입된 마우스에서 얻어진 연골 절편에서 SOX9와 aggrecan의 농도를 조사했다. SOX9의 단백질 수준은 영향을 받지 않았지만, aggrecan의 단백질 수준은 miR-204 전달 연골에서 중간정도로 감소했다 (도 16의 D). 이에 본원에서는 Aggrecan의 단백질 농도 감소가 OA 진행 동안 연골에서 황산화 PG의 전반적인 손실과 관련이 있을 것으로 추측하였다 (도 3E). 유사하게, miR-204 주사 시 관절 연골에서의 MMP13의 농도 증가 (도 13의 D)는 MMP13 발현에 대한 miR-204의 조절 역할 때문이 아닌 것으로 나타났다 (도 4D). 이는 miR-204에 의한 PG 합성 감소는 연골 기질의 탑재기능을 손상시키고 관절 연골에 가해지는 기계적 스트레스를 증가시켜, 이에 의해 MMP13 발현과 같은 이화작용 인자 발현을 유도하는 것으로 판단된다.

다음으로 본원에서 규명된 miR-204 표적 중 어느 것이 PG 합성을 통한 플럭스 조절에 대한 제한 요인으로 작용하는지 조사했다. 그러나, Slc35d1, Chsy1, Chst11 또는 Hapln1의 개별적인 낙다운 결과 이는 연골 세포의 PG 합성 속도에 영향을 미치지 않았다 (도 4L 및 도 11S). 이에 본원에서는 miR-204가 PG 합성과 관련된 여러 유전자를 동시에 표적으로하는 능력에 주목했다. 흥미롭게도, Slc35d1, Chsy1, Chst11 및 Hapln1을 표적으로 하는 siRNA의 동시 도입은 연골 세포에서 PG 합성을 현저하게 감소시켰다 (도 4l). 따라서 본원의 결과는 집합적으로 조절될 때, 이들 miR-204 표적이 PG 합성에 이르는 플럭스를 미세 조정하는 네트 효과를 가지는 것을 나타내며, 다중 유전자를 동시에 억제하는 miRNA의 내제적 능력의 중요성을 강조하는 것이다.

실시예 5. miR-204 길항 작용에 의한 OA 치료 효과

다음으로 황산화 PG 합성, 연골 세포 노화 및 OA 병인에 대한 miR-204 길항 작용의 영향을 조사했다. antimiR-204에 의한 miR-204 활성 억제는 miR-204 표적 (도 5A) 유전자 발현을 증가시키고 연골 세포에서 PG 신생 생합성을 촉진했다 (도 5B). 이러한 결과는 miR-204가 황산화 된 PG 생합성 경로를 조절한다는 사실을 뒷받침한다. miR-204 전달 자체만으로 연골 세포의 노화 (도 4A)가 일어나지 않는 것을 보여주는 본원의 결과와 일치하게, antimiR-204 처리에 의해 DNA 손상에 의한 노화가 연골 세포에서 완화되지는 않았다 (도 5C 및 도 18의 A). 이는 연골 세포 수준에서 도 4A에서 관찰한 것과 같이 miR-204 전달 자체는 세포 노화를 유발하지 않고, miR-204 억제제 전달 자체는 세포 노화를 억제하지 않았음을 나타낸다. 하지만 도 5D와 같이 세포 노화의 하위 표현형 중 하나인 SASP가 특이적으로 miR-204 억제제 전달에 의해 발현이 감소했다는 것을 나타낸다. 그러나 연골 세포의 DNA 손상에 대한 지연 반응으로 나타나는 SASP 인자의 상향 조절은 miR-204 활성의 저해에 의해 효과적으로 폐지되었으며 (도 5D 및 도 18의 B 및 C), 노화 과정에서 유도된 miR-204 발현은 SASP의 발현에 필요한 것을 나타낸다.

이어 마우스에서 외과적으로 유도된 OA 모델에서 miR-204 저해의 치료 효과를 조사 하였다 (도 5E). antimiR-204의 IA 전달은 샘(sham) 수술 마우스의 무릎 관절의 관절 연골의 정상적인 모양에 영향을 미치지 않았다 (도 19의 A). antimiR-Ctrl 가 전달된 DMM-수술된 마우스는 상당한 연골 파괴, 연골하 골 경화증, 골증식달 및 중등도의 활막염증을 나타냈다. antimiR-204의 IA 주사는 DMM에 의한 연골 파괴와 연골하 골경화를 상당하게 개선시켰으며, 골증식 성숙 (Osteophyte maturation) 및 활막염증에도 영향을 미쳤다 (도 5, F와 G). 분자 수준에서, DMM-수술 마우스의 무릎 관절에서의 miR-204 억제는 황산화 PG 합성의 동시 회복 및 염증성 SASP 인자 억제 및 연골에서의 세포 노화의 비-세포성 자율 전파 억제 모두를 유발 하였다 (도 5I 및 도 19의 B). 또한, 수술적 (DMM 또는 sham) 처리 된 다리와 치료받지 않은 다리 사이의 체중 분포를 OA-유도 통증의 행동 평가로 측정 하였다. antimiR-Ctrl의 IA 주사를 맞은 DMM 수술은 부상당한 다리의 체중 부하를 감소시켰다. DMM 수술로 인한 체중 불균형은 antimiR-204 (도 5H) 치료로 완화되었다. 이를 종합하면, 이는 miR-204 길항 작용이 마우스에서의 OA 발현을 효과적으로 치료할 수 있음을 나타낸다.

실시예 6. 골관절염 치료 표적으로서의 스트레스 - 활성화된 miR-204

최종적으로, 인공슬관절 전 치환술을 받은 환자 유래의 일차 배양 된 인간 관절 연골 세포와 체외이식편 (explants)을 사용하여, 본원의 결과를 인간에의 적용 가능성을 시험하였다. 일차 배양된 인간 관절 연골 세포에서 DNA 손상 화학 물질 인 doxorubicin은 SA-β-Gal 활성 및 p16INK4a 발현 유도로 입증된 바와 같이, 세포성 노화를 유발했다 (도 6, A 및 B). CDKN1A 및 CDKN2A의 상향 조절 및 LMNB1의 하향 조절과 같은 노화 표지자의 발현 프로파일을 조사함으로써 노화를 추가로 확인 하였다 (도 6C). 이러한 노화-유도된 인간 관절 연골 세포에서 miR-204의 발현은 현저히 증가하였으며 (도 6D), 이는 인간과 마우스 사이의 miR-204 발현의 보존된 조절 기전임을 나타내는 것이다. 유사하게, PG 생합성 경로를 포함하는 단백질을 코딩하는 확인된 miR-204 표적 유전자의 mRNA 농도는 miR-204로 전달이입 된 인간 관절 연골 세포에서 억제되었으며 (도 6E), 이는 일차 배양된 마우스 연골 세포 및 인간 연골 육종 세포주 SW1353 (도 4F 및 도 15의 B)의 결과와 일치하는 것이다. 마지막으로, 임상 OA에서 miR-204 표적 치료의 가능성을 시험하기 위해, 본원에서는 슬관절 전 치환술을 시행한 환자 유래의 OA 연골의 체외이식편에서 miR-204 길항 작용의 효과를 평가했다. OA가 걸린 체외이식편에서의 miR-204 억제는 황산화된 PG의 합성을 명확하게 회복시키고 MMP3 및 MMP13과 같은 이화 작용 매개체의 발현을 억제 하였다 (도 6F). 이러한 결과는 miR-204가 인간에서 관절염 치료의 표적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Use of miR-204 inhibitors for treating osteoarthritis <130> DP201808001P <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uucccuuugu cauccuaugc cu 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcugggaagg caaagggacg u 21 <210> 3 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcuacaguc uuucuucaug ugacucgugg acuucccuuu gucauccuau gccugagaau 60 auaugaagga ggcugggaag gcaaagggac guucaauugu caucacuggc 110 <210> 4 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 4 aaggga 6 <210> 5 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 aaagggaa 8 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 6 aggcauagga ugacaaaggg aa 22

Claims (14)

1. miR-204 활성을 억제하는 물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 관절염 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 miR-204 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-204의 표적 유전자로서 SLC35D1(Solute carrier family 35 (UDP-glucuronic acid/UDP-N-acetylgalactosamine dual transporter), member D1), CHSY1(Chondroitin sulfate synthase 1), CSGALNACT2 (Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2), CHST11 (Carbohydrate sulfotransferase 11), CHST15 (Carbohydrate sulfotransferase 15); HAS2 (Hyaluronan synthase 2) 및 HAPLN1 (Hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 유전자의 3'-UTR 과 miR-204의 상호작용을 억제할 수 있는 물질인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질은 이의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 miR-204의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR-204의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 핵산분자는 RNA, DNA, 앤타고미어, 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 핵산분자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 1번 또는 8번까지의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 6 내지 100mer의 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5’-AAGGGA-3'(서열번호 4), 5’-AAAGGGAA-3'(서열번호 5), 또는 5′-AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA-3′(서열번호 6) 인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
9. miR-204 RNA를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및
   상기 시험물질과 접촉된 miR-204 RNA의 활성을 결정하는 단계를 포함하며,
   상기 접촉된 miR-204의 활성이, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군의 miR-204 RNA의 활성과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 것인, 관절염 치료제 스크리닝 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 miR-204 RNA는 이를 발현하는 세포는 마우스 일차 배양 연골세포; 퇴행성관절염 환자 유래 일차 배양 연골세포; SW1353 세포주; C20A4, TC28A2, 또는 C28I2을 포함하는 인간 연골 세포주: 또는 H4 마우스 콘드로사이트 (RRID: CVCL_W634), ATDC5, 또는 MC615를 포함하는 마우스 연골세포주를 포함하는 세포에서 발현되는 형태로 제공되며,
    상기 활성은 상기 miR-204 RNA의 발현 분석으로 결정되며, 상기 세포는 miR-204 발현의 상위 조절자로 GATA4 및 NF-kB을 추가로 발현하는 것인, 관절염 치료제 스크리닝 방법.
    
11. 제 9 항에 있어서,
    상기 miR-204 RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며,
    상기 활성은 상기 miR-204 RNA와 이의 표적인 SLC35D1, CHSY1, CSGALNACT2, CHST11, CHST15, HAS2 또는 HAPLN1 의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정되는 것인, 관절염 치료제 스크리닝 방법.
    
12. 삭제
13. 관절염의 진행정도 또는 진단 또는 예후가 필요한 대상자 유래의 시료를 제공하는 단계;
    상기 시료에서 miR-204의 발현을 검출하는 단계; 및
    상기 검출된 마커의 발현량을 검사 대상자의 관절염 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 상기 연관시키는 단계에서 상기 검사 대상자의 miR-204의 발현량은 대조군 시료와 비교하여 그 양의 증가한 경우, 상기 대상자를 관절염으로 진단하는 것인, 관절염의 진행정도 또는 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 마커를 인비트로에서 검출하는 방법.
    
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 시료는 연골조직, 활액, 혈액 또는 소변인, 방법.
    
    

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