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KR102141446B1 - Ｉｇｆｂｐ3 및 이의 용도 - Google Patents

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KR102141446B1
KR102141446B1 KR1020187000310A KR20187000310A KR102141446B1 KR 102141446 B1 KR102141446 B1 KR 102141446B1 KR 1020187000310 A KR1020187000310 A KR 1020187000310A KR 20187000310 A KR20187000310 A KR 20187000310A KR 102141446 B1 KR102141446 B1 KR 102141446B1
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KR
South Korea
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igfbp3
tmem219
inhibitor
bowel disease
igf
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프란체스카 다디오
파올로 피오리나
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오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘.
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Abstract

본 발명은 장 질병, 특히 당뇨병성 장질환(diabetic enteropathy) 또는 염증성 장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IGFBP3의 저해제 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 장 질병, 특히 당뇨병성 장질환 또는 염증성 장 질환의 진단, 예후를 위한 IGFGP3 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

ＩＧＦＢＰ3 및 이의 용도
본 발명은 장 질병, 특히 당뇨병성 장질환(diabetic enteropathy) 또는 염증성 장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IGFBP3의 저해제 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 장 질병, 특히 당뇨병성 장질환 또는 염증성 장 질환의 진단, 예후를 위한 IGFGP3 및 이의 용도에 관한 것이다.
위마비, 복부 팽만, 과민성 대장 증후군 및 변실금으로 이루어진 위장 장애는 1형 당뇨병(T1D)을 앓고 있는 개체에서 보편적이다(1993). 사실상 장기 지속형 T1D를 앓고 있는 개체의 80%까지는 일반적으로 말기 신장 질환(ESRD; end stage renal disease)을 포함한 몇몇 당뇨 합병증을 갖고 있으며(1993; Atkinson et al, 2013; Fiorina et al., 2001), 장 증상을 보여준다. 당뇨병성 장질환(DE)으로 알려진 이들 위장 증상의 존재는 삶의 질을 상당히 떨어뜨리고(1993; Atkinson et al., 2013; CamiUeri, 2007; Talley et al., 2001), 대체로 알려지지 않은 발병 원인을 갖고 있다(Feldman and Schiller, 1983). 예비임상 연구는 당뇨병 설치류에서 장점막 형태의 상당한 교란을 보여주었으며(Domenech et al., 2011; Zhao et al, 2003), 이는 T1D에서, 장 항상성(intestinal homeostasis)이 변경될 수 있음을 제시하나; 인간에서는 데이터를 거의 이용할 수 없다. 장 상피는 장 줄기세포들 및 이들의 적소(niche)에 의해 유지되며, 이들은 생리학적 스트레스 및 환경적 손상에 반응한다(Barker, 2014; Medema and Vermeulen, 2011). 대장의 크립트 기부(crypt base)에 위치하고 다른 마커들 중에서도 에프린 B 수용체 2(EphB2), 루신-풍부 반복부-함유 G 단백질-커플드 수용체 5(LGR5), h-TERT 및 알데하이드 데하이드로게나제(Aldh)를 발현하는 결장 줄기세포(CoSC)(Carlone and Breault, 2012; Carpentino et al., 2009; Jung et al., 2011; Sato and Clevers, 2013)는 국소 미세환경과 함께 CoSC 적소를 구성한다(van der Flier and Clevers, 2009; Zeki et al., 2011). 최근의 연구는, 시험관내에서 장 항상성의 많은 특징들을 반복하고 정상적인 자가-재생 라지(large) 크립트 오르가노이드(organoid)를 생성하는 조건, 또는 소위 "미니-소화관("mini-gut)"을 규명하였다(Sato and Clevers, 2013). 순환하는 호르몬과 같은 전신 인자들이 CoSC를 조절하는 역할을 하는지는 아직 규명되지 않았다(Stange and Clevers, 2013).
위장 장애, 특히 당뇨병성 장질환의 치료는 설사, 복통, 변비 및 소화 불량에 대한 대증 약물(symptomatic drug) 및 완화 약제(reliever medication)를 포함한다. 지금까지는 당뇨병성 장질환에 이용 가능한 특이적 치료법이 존재하지 않는다.
위장 장애, 특히 당뇨병성 장질환의 진단은 결장 내시경, 위 내시경, 항문직장 내압검사, 식도 내압검사 및 배설물 시료 분석, 말초 암(peripheral cancer) 마커(즉, CEA, Ca 19.9, 알파-페토단백질, Cal25) 및 복강 마커(celiac marker)의 평가를 포함한다. 상기 방법들 중 어느 것도 당뇨병성 장질환의 소정의 진단을 제공하지 못한다.
WO 2011133886 및 WO2007024715는 IGFBP3 결합 항체 형태의 치료 복합체를 개시하고 있다.
WO O187238은, 특히 결장암 치료를 위한, 치료학적으로 유효한 TMEM219를 포함하는 항암 약제학적 조성물에 관한 것이다.
WO 2014089262는 만성 염증(비만) 장애(특히, UC 및 크론병과 같은 염증성 장 질환 및 결장암)의 진단 마커로서의 IGFBP3의 용도를 개시하고 있다.
US 6066464는 종이인 고형 지지체 상에서 IGFBP3의 검출을 위한 면역검정법에 관한 것이다.
WO 2013152989는 결장직장암의 바이오마커로서의 IGFBP3의 용도에 관한 것이다.
WO O153837은 종양 마커와 IGF 축의 적어도 하나의 구성성분의 조합을 측정하는 단계를 수반하는, 질병 상태의 모니터링 또는 진단 방법을 개시하고 있다. IGFBP3은 결장 종양의 마커로서 제안되어 있다.
따라서, 위장 장애, 특히 당뇨병성 장질환의 대안적인 치료 및 진단 방법이 요망되고 있다.
전신 인자들이 결장 상피 및 결장 줄기세포(CoSC)의 항상성을 조절하는 역할을 하는지는 명확하지 않다. 본 발명자들은, 순환하는 "호르몬" 다이아드(dyad)가 CoSC를 조절하고, 당뇨병성 장질환(DE)을 초래하는 장기 지속형 1형 당뇨병(T1D)에서 교란된다고 가정하고 있다. 장기 지속형 T1D를 앓고 있는 개체는 장점막 및 CoSC의 비정상, 및 시험관내 미니-소화관의 생성 실패를 나타내었다. 혈청 프로테옴 프로파일링(proteomic profiling)은 장기 지속형 T1D 개체에서 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-I) 및 이의 결합 단백질-3(IGFBP3)의 변경된 순환 수준을 보여주었으며, 고혈당-매개 IGFBP3 간 방출의 증가를 증명하고 있다. IGFBP3은 시험관내에서 TMEM219-의존적/카스파제-매개 IGF-I-독립적 효과를 통한 미니-소화관 성장을 방지하였으며, 생체내 예비임상 모델에서 CoSC를 교란시켰다. 장기 지속형 T1D에서 신장-이자 이식을 이용한 정상혈당의 복구, 및 당뇨병 마우스에서 엑토-TMEM219 재조합 단백질을 이용한 치료는 적절한 IGF-I/IGFBP3 순환 수준을 복구함으로써 CoSC를 재구축하였다. 말초 IGF-I/IGFBP3 다이아드는 CoSC를 조절하고, DE에서 기능 장애이다.
본 명세서에서, 발명자들은, 장기 지속형 T1D 및 DE를 앓고 있는 개체가 변경된 CoSC를 갖고 있으며, 증가된 수준의 IGFBP3를 보여줌을 입증한다. IGFBP3의 투여는 DE의 예비임상 모델에서 순환하는 IGF-I을 제지하고 CoSC에 미치는 TMEM219-의존적/카스파제-매개 독성 효과를 발휘함으로써, 시험관내 및 생체내에서 CoSC 재생 특성 및 점막 형태를 변경시킨다. 나아가, 변경된 IGFBP3/IGF1 비율이 염증성 장 질환 환자에서 발견되었다. IGFBP3 수용체(TMEM219)의 세포외 도메인을 기반으로 하는 새로운 엑토-TMEM219 재조합 단백질이 생성되었다. 엑토-TMEM219는 말초 IGFBP3를 제지하고(quench), 말초 IGFBP3가 이의 IGFBP3 수용체인 TMEM219에 결합하는 것을 방지한다. 그런 다음, CoSC 상에서 발현되는 이러한 엑토-TMEM219 재조합 단백질을 이용하여 IGFBP3을 표적화하는 것은 시험관내 및 생체내에서 IGFBP3 유해 효과를 없앤다.
장 장애로는, 당뇨병성 장질환, 염증성 장 질환, 과민성 장 질환 및 소아 지방변증이 있다.
당뇨병성 장질환을 앓고 있는 개체에서 보고된 증상들은 다른 장 장애들에서 보고된 것들과 유사하며, 따라서, 다양한 결장직장 질병들에서 장 줄기세포(ISC; intestinal stem cell)의 역할은 수많은 연구들에서 조사되어 왔다(하기 표 I-A 참조).
Figure 112018001241113-pct00001
ISC 제어 및 크립트 및 상피 자가-재생 특성의 변경은 IBD10, 결장 전암성 상태11 및 결장직장암4에서 언급되어 왔다. 최근, ISC가 활성 소아 지방변증(CD)에서 감소될 수 있으며, 따라서 장 상피 구획의 재생 손상을 초래할 수 있고, 이는 융모의 소멸5을 설명할 수 있다고 제안되기도 하였다. IGFBP3가, IGFBP3 수용체인 TMEM219에 결합하여, 결장 크립트에 위치한 ISC의 특정 하위세트인 결장 줄기세포(CoSC)를 표적화하고, 당뇨병성 장질환의 발병을 매개하는 것이 입증된 점을 고려하면, 이러한 유해 효과가 상기 언급된 바와 같은 다른 장 장애들에서의 CoSC에 대해서도 발휘될 수 있다고 주장된 바 있다. 따라서, TMEM219/IGFBP3 축의 저해는, ISC 또는 CoSC의 조절장애로부터 기원할 수 있는 모든 장 장애들에서의 IGFBP3-매개 유해 효과로부터 CoSC 및 ISC를 보존하는 전략을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 장 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, IGFBP3의 저해제를 제공한다.
바람직하게는, 저해제는 IGFBP3/TMEM219 축의 저해제이다.
바람직하게는, 상기 저해제는 IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219(IGFBP3-수용체라고도 함)의 상호작용을 저해 또는 차단하거나, 또는 상기 저해제는 IGFBP3과 IGF-1의 상호작용을 저해 또는 차단하거나, 또는 상기 저해제는 IGFBP3 기능을 저해하거나 차단한다.
바람직하게는, 상기 저해제는
a) 폴리펩타이드;
b) 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해 또는 차단할 수 있거나, 또는 IGFBP3과 GF1의 상호작용을 저해 또는 차단할 수 있거나, 또는 IGFBP3 발현 및/또는 기능을 저해하거나 차단할 수 있는 폴리뉴클레오타이드;
c) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 발현하는 벡터;
d) 상기 폴리펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포;
e) 저분자(small molecule);
f) IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해 또는 차단할 수 있거나, 또는 IGFBP3과 GF1의 상호작용을 저해 또는 차단할 수 있거나, 또는 IGFBP3 발현 및/또는 기능을 저해 또는 차단할 수 있는 펩타이드, 단백질, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 안티센스 발현 벡터 또는 재조합 바이러스 또는 임의의 다른 제제
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 저해제는 수용체 TMEM219 또는 이의 단편이다. 바람직하게는, TMEM219의 단편은 TMEM219의 세포외 도메인의 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 저해제는 엑토-TMEM219이다.
저해제는 IGFBP3을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 저해제는 항체, 바람직하게는 IGFBP3-차단 항체, 바람직하게는 TMEN219-차단 항체, 바람직하게는 IGF-1-차단 항체이다.
바람직한 실시형태에서, 장 장애는 흡수불량 증후군, 소아 지방변증, 과민성 장 증후군, 염증성 장 질환, 악액질, 당뇨병성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 장 장애는 당뇨병성 장질환 또는 염증성 장 질환(궤양성 대장염 및 크론병)이다. 바람직하게는, 장 장애는 소아 지방변증이다.
염증성 장 질환(IBD)은 소화관의 전부 또는 일부의 만성 염증을 수반한다. IBD는 주로, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함한다. 둘 다 통상적으로, 중증 설사, 통증, 피로 및 체중 감량을 수반한다. IBD는 쇠약하게 만들 수 있고, 이따금 생명을 위협하는 합병증을 초래한다. 궤양성 대장염은 대장(결장) 및 직장의 가장 안쪽의 라이닝(innermost lining)에서 장기 지속형 염증 및 발진(궤양)을 유발하는 염증성 장 질환이다. 크론병은 소화관의 라이닝의 염증을 유발하는 IBD이다. 크론병에서, 염증은 종종 영향을 받는 조직 내로 깊숙이 확산된다. 염증은 소화관 - 대장, 소장 또는 둘 다의 상이한 영역들을 수반할 수 있다.
글루텐-민감성 장질환으로도 공지되어 있는 소아 지방변증은 섭취된 글리아딘에 대한 면역학적으로 매개된 염증 반응에 의해 유발된 상부 소화관의 만성 질병이다. 글리아딘은 밀, 호밀 및 보리와 같은 곡물에서 발견되는 단백질인 글루텐의 구성성분이다. 이러한 염증 반응은 장 점막에 손상을 주어, 소화불량 및 흡수불량을 초래한다. 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 저해제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 장 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 피험자에서의 장 장애의 진단 방법을 제공하며, 본 방법은:
a) 피험자로부터 수득된 생물학적 시료에서 단백질 IGFBP3의 양 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하는 단계;
b) 단백질 IGFBP3의 측정된 양 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 측정된 양을 대조군 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서, 측정된 양이 대조군 양보다 더 높으면, 피험자는 장 장애가 있다고 진단된다.
바람직하게는, IGFBP3의 양은 항체에 의해 측정된다.
바람직하게는, 생물학적 시료는 혈청, 소변, 세포 배양 상층액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 장 장애는 흡수불량 증후군, 과민성 장 질환, 염증성 장 질환, 악액질, 당뇨병성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 장 장애는 당뇨병성 장질환이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 단백질 IGFBP3의 양을 측정하기 위한 수단 및/또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하기 위한 수단, 및 선택적으로 조절 수단을 포함하는, 장 장애 진단용 키트를 제공한다. 상기 진단 방법은 또한, 피험자의 치료 단계를 포함할 수 있고, 특히 치료는 본 발명에서 정의된 바와 같은 IGFBP3의 저해제 또는 기존의 장 장애용 치료제, 예컨대 항염증제(예를 들어 아미노아실-유도체, 예컨대 메살라진, 설파살라진), 코티코스테로이드, 면역억제 치료제(아조티오프린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 나탈리주맙, 베돌리주맙), TNF-알파 차단제(인플릭시맙, 아달리무맙, 세트롤리주맙, 골리무맙), 항생제(예를 들어 메트로니다졸 및 시프로플록사신), 프로바이오틱스, 인테그린 알파 저해제일 수 있다.
본 발명에서, 장 장애는 위장 장애, 흡수불량 증후군, 당뇨병성 장질환, 악액질, 소아 지방변증, 과민성 장 증후군 및 염증성 장 질환을 포함한다. 본 발명에서, 장 장애는 결장직장암을 포함하지 않는다.
본 발명에서, "IGFBP3 기능을 저해 또는 차단한다"는 것은, CoSC 및 결장 크립트 상에서 IGFBP3 프로아폽토틱(pro-apoptotic) 효과를 중단시키기 위해, 순환하는 IGFBP3을 제지하고, 이 IGFBP3이 IGFBP3 수용체인 TMEM219에 결합하는 것을 방지하는 것을 의미한다. 이러한 저해 또는 차단은 IGFBP3을 포함하는 융합 단백질에 의해 달성될 수 있다. IGFBP3의 발현은 조직 및 세포 상에서의 RT-PCR, 조직 및 세포 상에서의 웨스턴 블롯, 조직 상에서의 면역조직화학에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 유체 내 IGFBP3의 수준은 면역-표적화된 검정법 및 프로테옴 분석에 의해 측정될 수 있다.
IGFBP3의 기능은 RT-PCR, 마이크로어레이를 사용하여 표적 세포 상에서 카스파제 8 및 카스파제 9 발현을 검출하는 수단에 의해 측정될 수 있으며, 표적 세포/구조물을 Pan 카스파제 저해제, 카스파제 8 저해제 및 카스파제 9 저해제와 공동-배양하고 살아 있는 세포/구조물을 측정함으로써 측정될 수 있다.
본 발명에서, "IGFBP3과 IGF-1의 상호작용을 저해하거나 차단한다"는 것은, IGFBP3이 유리(free) IGF-1에 결합하는 것을 방지하기 위해, 순환으로부터 유리 IGFBP3을 제거하는 것을 의미한다.
IGFBP3과 IGF-1의 상호작용은 순환에서 IGF-I 유리 수준 및/또는 순환에서 IGFBP3 수준을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본 발명에서, "IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해하거나 차단한다"는 것은, 순환하는 IGFBP3을 제지하고, 이러한 IGFBP3이 CoSC 상에 발현된 TMEM219 수용체에 결합하는 것을 방지함을 의미한다. IGFBP3-TMEM219 결합은 또한, IGFBP3-차단 항체의 사용에 의해 방지될 수 있다. 또한, TMEM219 차단 항체는 TMEM219 수용체에 결합하여, IGFBP3이 순환으로부터 올 때 수용체를 이용할 수 없도록 할 수 있다.
본 발명에서, IGFBP3/TMEM219 축의 저해는 예를 들어 순환에서 IGFBP3을 제지함으로써 IGFBP3가 TMEM219에 결합하는 것의 차단을 의미하고, 이는 또한, TMEM219의 IGFBP3-결합 부위의 차단, TMEM219 상의 IGFBP3 결합 부위의 차단을 의미한다. 이는 나아가, TMEM219 기능 및/또는 발현 및/또는 신호전달의 저해를 의미하고, 이는 예를 들어, 특히 SiRNA 또는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 TMEM219 발현을 침묵화시킴으로써 달성될 수 있다. 이는 또한, IGFBP3의 기능 및/또는 발현의 저해를 의미한다.
본 발명에 따르면, TMEM219에의 IGFBP3 결합의 저해제는 하기 분자들 중 하나일 수 있다:
· 순환하는 IGFBP3를 중화하는 가용성 엑토-TMEM219(TMEM219의 세포외 부분);
· 융합 단백질 TMEM219-Ig으로서, TMEM219 펩타이드 또는 이의 세포외 부분에 직접 연결되는 면역글로불린 Fc 도메인으로 구성되며, 순환하는 IGFBP3을 제지하고, 베타 세포 상에 발현된 TMEM219에 IGFBP3이 결합되는 것을 방지하는 Fc-기반 융합 단백질;
· TMEM219-결합 부위를 선택적으로 차단하는 항-IGFBP3 항체;
· TMEM219 수용체의 IGFBP3 결합 부위를 차지하여 IGFBP3 결합을 방지하는(IGFBP3에 대해 길항 활성을 가진) 항-TMEM219 항체;
· IGFBP3 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드.
본 발명의 저해제는 수용체 TMEM219
Figure 112018001241113-pct00002
또는 이의 단편일 수 있다.
특히 TMEM219의 단편은 IGFBP3이 TMEM219에 접근 및/또는 결합하는 것을 차단/방지하도록 디자인되며, 이는 더 작은 분자량을 가지고, 이는 이황화 가교 및 구형 구조를 형성하는 5개의 시스테인을 함유한다. 바람직하게는, 단편은 적어도 50개 아미노산 길이, 바람직하게는 100개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 120개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 150개 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 160개 아미노산 길이이다.
바람직한 실시형태에서, 단편은 적어도 162, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235개 아미노산 길이이다. 바람직하게는, 단편은 TMEM219의 서열과 적어도 65% 동일성, 바람직하게는 TMEM219의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진다.
바람직하게는, TMEM219의 단편은 TMEM219의 세포외 도메인의 단편이며, 특히 이러한 단편은 서열:
Figure 112018001241113-pct00003
를 포함한다.
바람직하게는, TMEM219의 단편은 TMEM219의 세포외 도메인이며, 특히 이러한 단편은 서열:
Figure 112018001241113-pct00004
을 포함한다.
바람직하게는, TMEM219의 단편은
Figure 112018001241113-pct00005
로 구성된다.
바람직하게는 TMEM219의 단편은
Figure 112018001241113-pct00006
으로 구성된다.
본 발명에서, TMEM219는 바람직하게는 진핵생물 TMEM219, 바람직하게는 포유류 TMEM219, 보다 바람직하게는 인간 TMEM219이다.
IGFBP3과 TMEM219의 상호작용은 표적 세포 상에서 IGFBP3의 효과의 간접적인 평가(RT-PCR을 이용한 카스파제 8 및 카스파제 9 발현의 증가), 액체 또는 고체 상 리간드 결합 검정법(즉, 면역침전, RT-PCR, 면역검정법) 및 비방사성 리간드 결합 검정법을 이용한 IGFBP3-IGFBP3-수용체(TMEM219) 결합의 직접적인 평가에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에서, "장기 지속형 T1D"는 당뇨 합병증의 발병과 연관이 있는 15년이 넘는 1형 당뇨병의 이력을 의미한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 저해제는 항체, 또는 이의 합성 또는 재조합 유도체이다. 상기 항체는 바람직하게는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 이의 합성 또는 재조합 유도체이며, 보다 바람직하게는, 상기 항체는 인간화된 모노클로날 항체이다.
바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA, 바람직하게는 siRNA, shRNA, microRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자 및 파지로 이루어진 군으로부터 선택되는 발현 벡터이다.
바람직하게는, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균류 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포이다.
바람직한 실시형태에서, 상기에서 (a)로서 정의된 저해제는 적어도 하나의 치료제 (b)와 조합되어, 조합 또는 조합된 제제를 규정한다. 치료제는 항당뇨병제, 통증 완화제, 설사용 약제, 또는 장 장애, 특히 당뇨병성 장질환에 대한 임의의 다른 치료제일 수 있다.
치료제의 예로는, 임의의 형태의 인슐린 요법, 프람린타이드; 안지오텐신-전환 효소 저해제 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제(ARB); 아스피린, 항응고제 및 혈소판 항응집제; 콜레스테롤-저하 약물; 다른 혈압 강하제; 경구 항당뇨병제, 예컨대 메트포르민, 설포닐우레아(글리부라이드, 글리피자이드 및 글리메피라이드, 메글리티나이드(라파글리나이드 및 나테글리나이드), 티아졸리딘디온(로시글리타존 및 피오글리타존), DPP-4 저해제(시타글립틴, 삭사글립틴 및 리나글립틴), GLP-1 수용체 작용제(엑세나타이드 및 리라글루타이드), SGLT2 저해제(예를 들어 카나글리플로진 및 다파글리플로진); 항염증제(예를 들어 아미노살리실-유도체, 예컨대 메살라진, 설파살라진); 코티코스테로이드; 면역억제 치료제(아조티오프린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸) 인테그린 저해제(나탈리주맙, 베돌리주맙); TNF-알파 차단제(인플릭시맙, 아달리무맙, 세트롤리주맙, 골리무맙), 항생제(예를 들어 메트로니다졸 및 시프로플록사신); 프로바이오틱스가 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "조합" 및 "조합된 제제"는 독립적으로, 또는 구별된 양의 조합 파트너 (a) 및 (b)와의 상이한 고정된 조합들의 사용에 의해, 즉 동시에 또는 상이한 시점에서 투약될 수 있다는 점에서, "파트(part)의 키트"를 규정한다. 이에, 파트의 키트의 파트들은 예를 들어, 동시에 또는 시간적으로 간격을 두고, 즉 파트의 키트의 임의의 파트에 대해 상이한 시점에서, 동일하거나 상이한 시간 간격을 두고 투여될 수 있다. 조합된 제제로 투여되는 조합 파트너 (b)에 대한 조합 파트너 (a)의 총 양의 비율은 예를 들어, 치료를 받는 환자 소집단의 요구 또는 단일 환자의 요구에 부합하기 위해 다양할 수 있다.
조합 요법은 장 질병 치료에서 예상치 못한 개선을 가져올 수 있다. 저해제 및 다른 치료제는 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여되는 경우, 상승작용 방식으로 상호작용하여, 장 질병을 저감시킬 수 있다. 이러한 예상치 못한 상승작용은 각각의 화합물의 필요 용량을 감소시킬 수 있어서, 화합물 및 치료의 부작용 감소 및 임상적 효능의 증강을 가져온다. 하나 이상의 구성성분들 사이의 상승작용적 상호작용을 확인하면, 효과를 위한 최적 범위 및 효과를 위한 각각의 구성성분의 절대 용량 범위가, 치료가 필요한 환자에게 상이한 w/w 비율 범위 및 용량에 걸쳐서 구성성분을 투여함으로써 명확하게 측정될 수 있다. 인간의 경우, 환자에서 임상 연구를 수행할 때의 복잡성 및 비용은 이러한 형태의 시험을 상승작용에 대한 1차 모델로서 사용하는 것을 비현실적으로 만든다. 그러나, 하나의 종에서의 상승작용의 관찰은 다른 종에서 그 효과를 예측할 수 있게 하며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 상승작용 효과를 측정하기 위해 동물 모델이 존재하고, 이러한 연구의 결과는 또한, 다른 종에서 필요한 유효량 및 혈장 농도비 범위 및 절대 용량 및 혈장 농도를 약동학/약력학 방법의 적용에 의해 예측하는 데 사용될 수 있다. 장 질병 모델과 인간에서 관찰된 효과 사이의 규명된 상관관계는, 동물에서의 상승작용이 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같은 모델에서 입증될 수 있음을 제시한다.
상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 전신 투여, 경구 투여, 지역적 투여, 바람직하게는 직장내 투여 또는 국소 투여용이다.
대조 수단은 상기 정의된 바와 같은 화합물의 양 또는 양의 증가를 적절한 대조군과 비교하기 위해 사용될 수 있다. 적절한 대조군은 예를 들어, 공지된 표준을 참조로 하여 정상 피험자 또는 정상 집단(population)으로부터 수득될 수 있다.
상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화합물의 양을 측정하기 위한 수단은 바람직하게는 적어도 하나의 항체, 이의 기능성 유사체 또는 유도체이다. 상기 항체, 이의 기능성 유사체 또는 유도체는 상기 화합물에 특이적이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키트는
- 상기 화합물에 특이적인 고상 부착 항체;
- 리간드 특이적-바이오마커 복합체의 검출 수단.
을 포함한다.
본 발명에 따른 키트는 통상적인 보조제, 예컨대 완충제, 담체, 마커 등 및/또는 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
적절한 대조군은 건강한 환자, 또는 장 질병이 아닌 장애를 앓고 있는 환자로부터 취한 시료일 수 있다.
장 질병의 진행을 모니터링하기 위한 방법 또는 키트의 경우, 질병의 진행이 모니터링되고, 적절한 대조군은 다양한 시점에서 동일한 피험자로부터 취한 시료 또는 또 다른 환자로부터 취한 시료일 수 있고, 적절한 대조군 양은 다양한 시점에서 동일한 피험자로부터 취한 시료 또는 또 다른 환자로부터 취한 시료에서 측정된 동일한 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 양일 수 있다.
치유적 치료의 효능을 모니터링하기 위한 방법 또는 키트의 경우, 적절한 대조군은 요법의 개시 전 동일한 피험자로부터 취한 시료 또는 치료 요법 과정 동안 다양한 시점에서 취한 시료일 수 있고, 적절한 대조군 양은 요법의 개시 전 동일한 피험자로부터 취한 시료 또는 치료 요법 과정 동안 다양한 시점에서 취한 시료에서 측정된 동일한 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 양일 수 있다.
본 발명에서, "양을 측정한다"는 표현은, 각각의 단백질 및/또는 이의 mRNA 및/또는 이의 DNA의 양, 농도 또는 수준을 바람직하게는 반정량적(semi-quantitative) 또는 정량적으로 측정하는 것으로 의도될 수 있다. 단백질의 측정은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 직접적인 측정은 단백질로부터 직접 수득된 신호를 기반으로 하는 바이오마커의 양 또는 농도 측정을 지칭하며, 시료에 존재하는 단백질 분자의 수와 직접적으로 상관관계가 있다. 이러한 신호 - 세기(intensity) 신호로 지칭될 수도 있음 - 는 예를 들어, 바이오마커의 화학적 또는 물리적 특성의 세기 값을 측정함으로써 수득될 수 있다. 간접적인 측정은 2차 구성성분(예를 들어 유전자 발현 생성물과 상이한 구성성분) 및 생물학적 측정 시스템(예를 들어 세포 반응, 리간드, "태그" 또는 효소적 반응 생성물의 측정)으로부터 수득된 측정을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "양"은 단백질 및/또는 이의 mRNA 및/또는 이의 DNA의 절대량 또는 상대량, 및 이들과 연관되거나 이들로부터 유래될 수 있는 임의의 다른 값 또는 파라미터를 지칭하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 값 또는 파라미터는 단백질의 물리적 또는 화학적 특성으로부터 수득되며, 직접적인 측정에 의해 수득되는 신호의 세기 값, 예를 들어 면역검정법, 질량 분광법 또는 핵 자기 공명에서의 세기 값을 포함한다. 부가적으로, 이들 값 또는 파라미터는 간접적인 측정, 예를 들어 본 명세서에 기재된 임의의 측정 시스템에 의해 수득된 것들을 포함한다. 시료 내 mRNA 및 DNA의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 핵산 수준을 측정하기 위해, 시험 시료 내 세포는 용해될 수 있고, 용해물 내 mRNA, 또는 용해물로부터 정제되거나 반정제된 RNA 내 mRNA의 수준이 당업자에게 친숙한 임의의 여러 가지 방법들에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 검출 가능하게 표지된 DNA 또는 RNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정법(즉, 노던 블로팅) 또는 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 정량적 또는 반정량적 RT-PCR 방법을 포함한다. 대안적으로, 정량적 또는 반정량적 인 시추(in situ) 혼성화 검정법은 예를 들어, 조직 절편 또는 비용해된 세포 현탁액, 및 검출 가능하게 표지된(예를 들어 형광 또는 효소-표지된) DNA 또는 RNA 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. mRNA를 정량화하기 위한 부가적인 방법은 RNA 보호 검정법(RPA), cDNA 및 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 등차적 표현행동(differential display), EST 서열 분석 및 유전자 발현의 순차적 분석(SAGE)을 포함한다.
단백질 IGFBP3 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 측정된 양을 대조군 시료로부터 수득된 양과 비교함으로써, 피험자로부터 단리된 시료 내 상기 화합물의 양이 더 높은 값에 상응한다면, 이 피험자는 질병이 존재하거나 상기 질병의 악화로 진행될 수 있다.
단백질 IGFBP3 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 측정된 양을 대조군 시료로부터 수득된 양과 비교함으로써, 피험자로부터 단리된 시료 내 상기 화합물의 양이 유사하거나 더 낮은 값에 상응한다면, 이 피험자는 각각 질병을 앓고 있지 않거나 상기 질병의 경감으로 진행될 수 있다.
대안적으로, 표현 "검출" 또는 "양의 측정"은 분자의 변경의 측정으로서 의도된다. 상기 변경은 상기 정의된 바와 같은 화합물의 양의 증가 또는 감소를 반영할 수 있다. 단백질 IGFBP3 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 증가는 질병의 악화와 상관될 수 있다. 단백질 IGFBP3 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 감소는 질병의 경감 또는 피험자의 회복과 상관될 수 있다.
표현 "단백질 IGFBP3", "IGFBP3" 또는 "TMEM219"는 또한, IGFBP3 또는 TMEM 이종상동성 또는 상동성 유전자로부터 인코딩된 상응하는 단백질, 이의 기능성 돌연변이체, 기능성 유도체, 기능성 단편 또는 유사체, 아이소폼을 포함하는 것으로 의도된다.
표현 "유전자 IGFBP3", "IGFBP3", "유전자 TMEM21" 또는 "TMEM219"는 또한, 상응하는 이종상동성 또는 상동성 유전자, 이의 기능성 돌연변이체, 기능성 유도체, 기능성 단편 또는 유사체, 아이소폼을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에서, 단백질의 "기능성 돌연변이체"는, 단백질 서열에서 하나 이상의 아미노산을 돌연변이화시킴으로써 생성될 수 있고 장 질병 치료에 대한 이의 활성을 유지하는 돌연변이체이다. 사실상, 본 발명의 단백질은 필요하다면, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들어 글리코실화, 미리스토일화, 아미드화, 카르복실화 또는 인산화에 의해 변형될 수 있고, 예를 들어 당업계에 공지된 합성 또는 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 단백질 "IGFBP3" 또는 "TMEM219"는 당업계에 공지된 방법에 의해 이의 생체이용률 또는 반감기를 증가시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 중합체에 컨쥬게이션될 수 있으며, 페길화(pegylated) 등이 될 수 있다.
본 발명에서, 활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 각각 콜로이드성 약물 운반 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지효성 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 형태가 있는 물품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 지효성 매트릭스의 예는, 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 [감마] 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산이 100일에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있는 한편, 소정의 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출시킨다. 캡슐화된 항체들이 장기간 동안 체내에 잔류하는 경우, 이들 항체는 37℃에서 수분에 노출된 결과 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화를 초래할 수 있다. 합리적인 전략은 관련된 메커니즘에 따라 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-다이설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견된 경우, 안정화는 설피드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결, 수분 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에서, "기능성"은 예를 들어 "이들의 활성의 유지", 예를 들어 장 질병의 치유적 치료로서 의도된다.
단백질을 지칭할 때 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "유사체"는 변형된 펩타이드를 의미하며, 여기서, 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있으며, 그리고/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 펩타이드로부터 결실되어 있으며, 그리고/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 펩타이드로부터 결실되어 있으며, 그리고/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 펩타이드에 부가되어 있다. 아미노산 잔기의 이러한 부가 또는 결실은 펩타이드의 N-말단 및/또는 펩타이드의 C-말단에서 일어날 수 있다.
단백질과 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "유도체"는 화학적으로 변형된 펩타이드 또는 이의 유사체를 의미하며, 여기서, 적어도 하나의 치환체는 비변형된 펩타이드 또는 이의 유사체에 존재하지 않고, 즉, 펩타이드는 공유결합으로(covalently) 변형되어 있다. 전형적인 변형은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르 등이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 또한, IGFBP3, 또는 IGFBP3 이종상동성 또는 상동성 유전자로부터 인코딩된 상응하는 영역의 아미노산 서열과 예를 들어 적어도 41%, 바람직하게는 적어도 41.5%, 50%, 54.9%, 60%, 61.2%, 64.1%, 65%, 70% 또는 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 퍼센트를 갖는 더 길거나 더 짧은 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "단편"은 바람직하게는 적어도 10개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 15개, 적어도 17개 아미노산 또는 적어도 20개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 25개 아미노산, 적어도 37개 또는 40개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개 또는 500개 아미노산 길이를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 조성물의 "유효량"은 요망되는 생물학적 효과, 이 경우 장 장애 또는 질병의 경감 또는 치료를 달성하기에 충분한 양이다.
유효 투약량은 수여자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 있다면 수반하는 치료의 종류, 치료의 빈도 및 요망되는 효과의 성질에 따라 다를 것으로 이해된다. 본 발명의 저해제 또는 분자의 제공된 유효 용량 범위(예를 들어 1 mg/kg 내지 1000 mg/kg, 특히 전신 투여 시)는 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 바람직한 용량 범위를 나타낸다. 그러나, 바람직한 투약량은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이 개별 피험자에게 맞춰질 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 투여는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 여기서, 핵산은 시험관내에서 또는 생체내에서, 요망되는 표적 세포 내로 도입된다.
본 발명의 일 양태는 운반 비히클 내에 포함된 핵산 구축물을 포함한다. 운반 비히클은, 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 배지로부터 또 다른 배지로 수송될 수 있게 하는 개체(entity)이다. 운반 비히클은 일반적으로, 핵산 구축물 내에서 인코딩된 서열의 발현 및/또는 구축물의 세포내 전달에 사용될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 운반 비히클은 RNA-기반 비히클, DNA-기반 비히클/벡터, 지질-기반 비히클, 바이러스-기반 비히클 및 세포-기반 비히클로 이루어진 군으로부터 선택되는 비히클일 수 있다. 이러한 운반 비히클의 예는, 생분해성 중합체 마이크로스피어, 리포좀 담체와 같은 지질-기반 제형, 구축물을 콜로이드성 골드 입자 상으로 코팅, 리포다당류, 폴리펩타이드, 다당류, 바이러스 비히클의 페길화 등이 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 운반 비히클로서 바이러스를 포함할 수 있으며, 여기서, 바이러스 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 거품형성 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 폭스바이러스, RNA 바이러스 벡터 및 DNA 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있다.
보편적으로 사용되는 유전자 전달 기술은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 형질감염, 전기천공, 현미주사 및 바이러스 방법을 포함한다. DNA를 세포 내로 도입하기 위한 또 다른 기술은 양이온성 리포좀의 사용이다. 상업적으로 입수 가능한 양이온성 지질 제형은 예를 들어 Tfx 50(Promega) 또는 Lipofectamin 2000(Life Technologies)이다.
본 발명의 조성물은 용액, 예를 들어 주사 가능한 용액, 크림, 연고, 정제, 현탁액 등의 형태일 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 방식, 예를 들어 주사, 특히 안내(intraocular) 주사, 경구 적용, 국소 적용, 비내 적용, 직장 적용 등에 의해 투여될 수 있다. 담체는 임의의 적합한 약제학적 담체일 수 있다. 바람직하게는, 표적-세포로 들어가기 위한 RNA 분자의 효능을 증가시킬 수 있는 담체가 사용된다. 이러한 담체의 적합한 예는, 리포좀, 특히 양이온성 리포좀이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질변환시키거나 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터로는, 전파 및 증식, 또는 발현 또는 둘 다를 위해 디자인된 것들, 예컨대 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 구축물은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 복제 시스템 기능을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은 예를 들어, CoIEl, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 조절 서열, 에컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함하며, 이들은, 적절하고 벡터가 DNA-기반 또는 RNA-기반인지를 고려하여, 이러한 벡터가 도입되는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물)에 특이적이다. 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 마커는 형질변환된 숙주 또는 형질감염된 숙주를 선별할 수 있게 한다. 마커 유전자는 항생제 내성, 중금속 등과 같은 살생물제 내성, 자가 영양 생물 조건(prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는 예를 들어, 네오마이신/G418 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 히스티디놀 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 PCYOX1 저해제(이의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적이거나 이와 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 천연 또는 비천연 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들어 강한, 약한, 유도성, 조직-특이적 및 발달-특이적 프로모터의 선택은 당업자의 통상의 기술 범위 내이다. 유사하게는, 뉴클레오타이드 서열과 프로모터의 조합 또한 당업자의 통상의 기술 범위 내이다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴-말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적인 발현, 안정한 발현 또는 둘 다를 위해 디자인될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적(constitutive) 발현 또는 유도성 발현을 위해 제작될 수 있다. 상기 IGFBP3 조성물에서, 추가의 물질뿐만 아니라 가공 기술 등은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, Marck Publishing Company, Easton, Pennsylvania]의 파트 5에서 제시될 수 있으며, 이 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한, 지효성 형태로 투여되거나 지효성 약물 운반 시스템으로부터 투여될 수 있다. 대표적인 지효성 물질에 대한 설명 또한, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences] 내에 포함된 물질에서 찾을 수 있다. 더욱이, 약제학적 제형은 약제학적 분야에 일반적으로 공지된 공정을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 분자가 또 다른 치료제와 함께 투여되는 경우, 이는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
서열
IGFBP3의 아미노산 서열:
Figure 112018001241113-pct00007
IGFBP3의 뉴클레오타이드 서열: 호모 사피엔스 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3(IGFBP3), 염색체 7 상의 RefSeqGene, NCBI 참조 서열: NG_011508.1
IGFBP3의 mRNA 서열: 호모 사피엔스 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3(IGFBP3), 전사 변이체 1, mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001013398.1
TMEM219의 아미노산 서열:
Figure 112018001241113-pct00008
TMEM219의 뉴클레오타이드 서열: TMEM219 막관통 단백질 219[호모 사피엔스 (인간)], 유전자 ID: 124446.
TMEM219의 mRNA 서열: 호모 사피엔스 막관통 단백질 219(TMEM219), 전사 변이체 1, mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001083613.1
본 발명은 하기 도면을 참조로 하여 비제한적인 실시예에 의해 예시될 것이다.
도 1. 장기 지속형 T1D에서 당뇨병성 장질환은 장점막의 비정상 및 결장 줄기세포에서의 손상을 특징으로 한다. A, B, C. 막대 그래프는 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서 GSRS 질문표(questionnaire)의 투여에 따른 설사, 복통 및 변비의 점수를 도시한 것이다. 회색 영역은 파라미터에 대한 정상 범위를 가리킨다. D, E, F. 막대 그래프는 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서 항문직장 내압검사에 의한 항문직장 괄약근 수축 톤(mmHg), 반사 반응(ml) 및 응급 용적(ml)의 측정을 보고하고 있다. 회색 영역은 파라미터에 대한 정상 범위를 가리킨다. N=20 CTRL 및 n=60 T1D+ESRD 개체가 평가에 포함되었다. G1-G2, I1-I2, K1-K2, M1-M2, O1-O2, Q1-Q2. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 조직학 염색, 면역염색된 MIB1+ 세포, 신경 구조의 초미세구조 분석의 대표적인 이미지이며, 적색 화살표는 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)로부터 수득된 생검 시료 상에서의 신경내분비 소낭의 국지화 및 존재, 면역염색된 5HT+, 알데하이드 데하이드로게나제(Aldh)+ 세포 및 EphB2+ 발현을 가리킨다. 초미세구조 분석 척도 막대: 2000 nm. 본래의 배율: G1-G2에서 100X; I1-I2, K1-K2에서 400X; O1-O2에서 40X; Q1-Q2에서 200X. 척도 막대 80 미크론. H, J, L, N, P, R. 막대 그래프는 CTRL 및 장기 지속형 T1D 피험자(T1D+ESRD)에서 크립트, MIB1+ 세포, 신경 말단의 신경내분비 소낭(신경 말단 당 검출된 NE 소낭이 3개 초과인 경우의 수), 5HT+, Aldh+ 세포 및 EphB2+ 발현(세기 점수 0 내지 5)의 측정을 보고하고 있다. N=20 CTRL 및 n=60 T1D+ESRD 개체가 평가에 포함되었다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: GSRS, 위장 증상 등급 척도; CoSC, 장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; MIB1, Ki67에 대한 항체; EphB2, 에프린 B 수용체 2; Aldh, 알데하이드 데하이드로게나제; 5HT, 세로토닌; NE, 신경내분비 소낭.
도 2. 장기 지속형 T1D에서 당뇨병성 장질환은 CoSC에서의 결함과 연관되어 있다. A, B. 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서 EphB2low, EphB2medium 및 EphB2hi 세포의 대표적인 흐름 점도표(dot plot)이다. C, D, E. 막대 그래프는 신선하게 단리된 크립트(n=10 CTRL 및 n=10 T1D+ESRD)에서 EphB2hi +, EphB2hi+LGR5+ 및 EphB2+h-TERT+ 세포의 유세포 분석(flow cytometric analysis)의 결과를 도시하고 있다. F, G, H. 막대 그래프는 단리된 장 크립트 상에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 정상화된 mRNA 발현으로서 CoSC 마커 EphB2, LGR5, h-TERT의 발현 데이터를 도시하고 있다. 모든 시료는 3회 중복으로 진행되었으며, 하우스키핑 유전자 ACTB(△△Ct)의 발현에 대해 정상화되었다. I. 산점도(scatter plot)는 n=10 건강한 피험자(CTRL) 및 n=10 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)의 신선하게 단리된 장 크립트에서 검사된 CoSC 시그너처 마커 및 줄기세포 전사체 프로파일링을 나타낸다. J1-J2. 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD) 및 건강한 피험자(CTRL)의 이전에 단리된 크립트로부터 수득된 시험관내에서 8일 동안 배양된 미니-소화관의 대표적인 이미지이다. 10X 배율. 척도 막대 50 미크론. K. 막대 그래프는 n=10 CTRL 및 n=10 T1D+ESRD 개체로부터 신선하게 단리된 장 크립트 배양 8일째에 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 도시하고 있다. L1-L4. 건강한 피험자(CTRL)의 이전에 단리된 크립트로부터 수득되고 하기 조건에서 8일 동안 배양된 미니-소화관의 대표적인 이미지이다: L1=정상(FBS) 혈청+정상 글루코스(5 mM); L2=T1D+ESRD 혈청+정상 글루코스; L3=정상 혈청+고농도 글루코스(35 mM); L4=T1D+ESRD 혈청+고농도 글루코스. 10X 배율. 척도 막대 50 미크론. M. 신선하게 단리된 장 크립트로부터 유래되고 하기 조건으로 배양된 배양물의 8일째에 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다: 정상(FBS) 혈청+정상 글루코스(5 mM); T1D+ESRD 혈청+정상 글루코스; 정상 혈청+고농도 글루코스(35 mM); T1D+ESRD 혈청+고농도 글루코스. 통계학적 유의성은 상이한 배양 조건들을 비교함으로써 각각의 그룹 내에서 계산되었다(정상 글루코스+정상 혈청, 배지+고농도 글루코스, 배지+장기 지속형 T1D 혈청, 고농도 글루코스+장기 지속형 T1D 혈청). 막대 그래프에서의 비교는 모든 조건들 대 정상 혈청+정상 글루코스를 지칭한다. N. 전사체 프로파일링은 건강한 피험자로부터 수득되고 고농도 글루코스 및/또는 장기 지속형 T1D 혈청과 함께/없이 배양된 단리된 크립트에서의 CoSC 시그너처 마커 발현을 나타내고 있다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **P<0.001; ***p<0.0001. 약어: CoSC, 결장 줄기세포;; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; EphB2, 에프린 B 수용체 2; LGR5, 루신-풍부 반복부-함유 G 단백질-커플드 수용체 5; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; FBS, 태아 소 혈청.
도 3. 순환하는 IGF -I 및 IGFBP3은 장기 지속형 T1D에서 변경되고, 시험관내 에서의 이의 조작은 CoSC 성장 및 자가-재생에 대해 뚜렷한 효과를 유도한다. A. 열 지도는 건강한 피험자(CTRL)와 비교하여 장기 지속형 T1D(T1D+ESRD)에서 프로테옴 프로파일을 나타낸다. 확인되고 정량화된 단백질의 완전한 데이터세트는 통계학적 분석 처리되었다(p<0.01). 유의하게 차별적으로 발현된 단백질은 계층적 군집분석(hierarchical clustering)을 통해 더 분석되었다. n=10 CTRL 및 n=10 T1D+ESRD 개체의 혈청이 분석되었다. B. 막대 그래프는 비표적화된 프로테옴 분석으로부터 외삽된 단일 단백질인 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3(IGFBP3)에 대한 LFQ 세기를 도시하고 있다. C1-C2. 간에서 IGFBP3 발현의 대표적인 이미지(40X 배율)이다. IGFBP3은 건강한 피험자 유래의 간 실질조직(parenchyma)에서는 약하고 확산되어 발현되어 있는 한편(C1), IGFBP3은 장기 지속형 당뇨병 개체에서는 보다 구역적으로 양성이다(C2). D. 막대 그래프는 상이한 글루코스 농도(35 mM: 고농도 글루코스; 20 mM: 중간 농도 글루코스; 5 mM: 정상 글루코스)에서 5일 동안 배양된 불멸화된 인간 간종양 세포주(HuH-7)의 상층액에서 ELISA에 의해 측정된 IGFBP3 수준을 나타낸다. 실험은 3회 중복으로 진행되었다. E. 막대 그래프는 건강한 피험자 및 장기 지속형 T1D(T1D+ESRD)의 혈청에서 ELISA에 의해 측정된 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-I) 수준을 나타낸다. F. 웨스턴 블롯 분석(크랍트 블롯(cropped blot))은 장 크립트 표면 상에서의 IGF-IR 및 TMEM219 발현을 확인하여 주었다. WB에 의한 총 IGF-IR 발현의 평가는 IGF-IR 전체 단백질의 하위단위인 IGF-IRα의 검출을 포함한다. TMEM219 인 시추 혼성화의 대표적인 사진(G1 음성 대조군, G2 TMEM219 염색)은 CTRL로부터 수득된 직장 점막 생검 시료 상에서 수행되었다. 20X 배율. G1-G2. TMEM219 인 시추 혼성화의 대표적인 사진(G1 음성 대조군, G2 TMEM219 염색)은 CTRL로부터 수득된 직장 점막 생검 시료 상에서 수행되었다. 배율 400X. H. 막대 그래프는 △△Ct 방법을 사용하여 TMEM219(IGFBP3 수용체)의 정상화된 mRNA 발현을 도시하고 있다. 그룹당 N=5명의 피험자가 평가되었다. I. 상이한 조건들에서 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득된 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이고, IGF-1, IGFBP3 및 항-IGF-IR의 효과를 보여준다. p 값은 기준선 조건 및 배양물에의 IGF-1의 첨가에 상대적이다. J. 막대 그래프는 3회 중복 수행된, 건강한 피험자로부터 단리되고 IGFBP3 및 IGF-I+IGFBP3의 존재하에 배양된 크립트에서 카스파제 8 및 카스파제 9의 정상화된 mRNA 발현을 나타낸다. K. 건강한 피험자로부터 수득되고 Pan-카스파제 저해제, 카스파제 8, 9 및 3의 선택적 저해제, 및 IGFBP3의 존재하에 배양된, 8일째 배양물 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. L. 건강한 피험자로부터 수득되고 상이한 조건들(정상 글루코스+정상 혈청, 고농도 글루코스+정상 혈청, T1D+ESRD 혈청+정상 글루코스, T1D+ESRD 혈청+고농도 글루코스)에서 배양된 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하고, IGF-1, IGFBP3 및 항-IGF-IR의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. p 값은 기준선 조건(배지 단독, 배지+고농도 글루코스, 배지+장기 지속형 T1D 혈청, 고농도 글루코스+장기 지속형 T1D 혈청)에 상대적이다. 부가적인 p 값은 하기 조건들 중에서 미니-소화관 성장의 차이를 비교하기 위해 계산되었다: 배지 단독 대 배지+고농도 글루코스, 대 배지+고농도 글루코스+장기 지속형 T1D 혈청). 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. M. 건강한 피험자로부터 수득되고, 8일 동안 배양되며, siRNA를 이용한 TMEM219 표적화에 노출된 다음, 마지막으로 배지 단독 및 배지+고농도 글루코스+장기 지속형 T1D 혈청에서 TMEM219-발현 크립트와 비교된, 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합단백질 3; IGF-IR, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체; CoSC, 결장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; LFQ, 표지-프리 정량화; SEM, 평균의 표준 오차; siRNA, 작은 RNA 간섭; inhib, 저해제.
도 4. 시험관내에서 단일-세포로부터 유래된 미니-소화관 및 카스파제 캐스케이드에 미치는 말초 IGF -I/ IGFBP3 다이아드의 효과이다. 말초 IGF -I/ IGFBP3 다이 아드의 조작이 당뇨병성 장질환의 예비임상 모델에서 당뇨병성 장질환의 진행을 변경하는 한편, 동시적인 췌장-신장 이식(SPK)에 의한 장기 지속형 T1D의 치료는 장 증상, 운동성 및 형태를 개선한다. A. 막대 그래프는 건강한 피험자의 크립트로부터 수득된 EphB2+ 소팅된 단일 세포에서 TMEM219, LRP1, TGF-β 유형 I 및 유형 II의 정상화된 mRNA 발현을 나타낸다. 실험은 3회 중복으로 수행되었다. B. 막대 그래프는 건강한 피험자의 신선하게 단리된 크립트로부터 소팅된 EphB2+ 세포로부터 수득되고 상이한 조건들(정상 글루코스+정상 혈청, 고농도 글루코스+정상 혈청, T1D+ESRD 혈청+정상 글루코스, T1D+ESRD 혈청+고농도 글루코스)에서 배양된 (전체 중에서) 발달된 단일 세포-유래 미니-소화관의 %를 보여주고, IGF-I 및 IGFBP3의 효과를 보여준다. p 값은 기준선 조건에 상대적이다. C, D. 산점도는 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)로부터 신선하게 단리되고 IGFBP3 및 IGF-I과 함께/없이 배양된 장 크립트에서 검사된 세포자멸사 전사체 프로파일링을 나타낸다. 실험은 3회 중복으로 진행되었다. E. CoSC에 미치는 순환하는 IGF-I 및 IGFBP3의 효과를 나타내기 위한 도식도이다. F, G, I. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ), 나이브 B6(WT) 및 IGFBP3로 처리된 나이브 B6(WT+IGFBP3)로부터 기준선 및 8주 후에 수합된 장 하부관의 절편 상에서 평가된 크립트의 수(B), 크립트의 깊이(C) 및 크립트의 폭(E)을 보고하는 선 그래프이다. WT: 야생형, STZ: 스트렙토조티신(streptozoticin)-처리. 그룹당 N=3마리의 마우스가 평가되었다. H1-H3. WT, 당뇨병성 장질환이 발병한 B6+STZ 마우스 및 IGFBP3로 처리된 나이브 B6(WT+IGFBP3)의 H&E 절편 상에서 장 크립트의 대표적인 이미지이다. 조직학 배율, 400X. J. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스, WT, 및 IGFBP3로 처리된 나이브 B6(WT+IGFBP3)의 면역염색된 절편에서 Aldh+ 세포/mm2의 수를 나타내는 막대 그래프이다. K1-K3. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스, WT, 및 IGFBP3로 처리된 나이브 B6(WT+IGFBP3)으로부터 수합된 장 하부관의 면역염색된 절편 상에서 Aldh+ 세포의 대표적인 이미지이다. 조직학 배율, 400X. L, N, P. 막대 그래프는 4개 그룹의 피험자들(n=20 CTRL, n=30 SPK, n=K+T1D 및 n=60 T1D+ESRD)에서 MIB1+ 및 Aldh+ 세포, 및 EphB2+ 발현의 측정(세기 점수 0-5)을 보고한다. M1-M2, O1-O2, Q1-Q2. 8년간의 추적 조사에서, 신장 단독(K+T1D) 또는 동시적인 췌장-신장(SPK) 이식을 받은 T1D+ESRD의 면역염색된 직장 점막 생검 시료에서 MIB1+ 및 Aldh+ 세포, 및 EphB2+ 발현의 대표적인 이미지이다. 조직학 M1-M2 및 O1-O2에서 400X, Q1-Q2에서 20X. 척도 막대 80 미크론. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: WT, 야생형; STZ, 스트렙토조티신-처리; B6, C57BL/6J 마우스; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; IGF-IR, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체; CoSC, 결장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; SPK, 동시적인 신장-췌장 이식; K+T1D, 1형 당뇨병에서 신장 이식 단독; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; MIB1, Ki67에 대한 항체; EphB2, 에프린 B 수용체 2; Aldh, 알데하이드 데하이드로게나제; SEM, 평균의 표준 오차.
도 5. SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 순환하는 IGF -I 및 IGFBP3의 복구를 통해 CoSC를 보충하고, CoSC 시그너처 프로파일 및 미니-소화관 발달을 복구한다. A, B, C. 막대 그래프는 8년간의 추적 조사에서 장기 지속형 T1D(기준선), 신장 췌장(SPK) 또는 신장 단독(K+T1D) 이식을 받은 T1D+ESRD에서 단리된 크립트로부터 수득된 EphB2hi +, EphB2hi +LGR5+, EphB2+h-TERT+세포의 유세포 분석 결과를 도시한 것이다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. D, E, F. 막대 그래프는 8년간의 추적 조사에서 장기 지속형 T1D(기준선), 신장 췌장(SPK) 또는 신장 단독(K+T1D) 이식을 받은 T1D+ESRD로부터 수득된 단리된 장 크립트 상에서의 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 장 줄기세포 마커 EphB2, LGR5, h-TERT의 정상화된 mRNA 발현을 도시한 것이다. 모든 시료들은 3회 중복으로 진행되었고, △△Ct 방법을 사용하여 하우스키핑 유전자 ACTB의 발현에 대해 정상화되었다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. G. 웨스턴 블롯 분석은 8년간의 추적 조사에서 4개 그룹의 단리된 장 크립트에서 EphB2, LGR5, h-TERT의 발현을 도시하고 있다. 그룹당 N=5명의 피험자가 평가되었다. H. 막대 그래프는 8년간의 추적 조사에서 장기 지속형 T1D 개체(기준선), SPK 및 K+T1D 피험자로부터 수득된 신선하게 단리된 장 크립트 배양 8일째에 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 도시한 것이다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. I. 열 지도는 8년간의 추적 조사에서 CTRL, 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD), SPK 및 K+T1D 피험자의 신선하게 단리된 장 크립트에서 검사된 CoSC 시그너처 마커 전사체 프로파일링을 나타낸다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. J. 막대 그래프는 8년간의 추적 조사에서 4개 그룹의 피험자의 혈청에서 ELISA에 의해 측정된 IGF-I 수준을 나타낸다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. K. 막대 그래프는 4개 그룹의 피험자의 혈청에서 ELISA에 의해 측정된 IGFBP3 수준을 나타낸다. 그룹당 N=20명의 피험자가 평가되었다. L, M. K+T1D(L) 및 SPK(M) 그룹의 n=20명의 피험자에서 IGFBP3 혈청 수준과 GSRS 질문표(0-7)를 사용하여 평가된 장 증상 사이의 상관관계이다. 분석은 모든 그룹들을 비교하는 데 있어서 ANOVA(p<0.05)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: CoSC, 결장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; SPK, 동시적인 신장-췌장 이식; EphB2, 에프린 B 수용체 2; LGR5, 루신-풍부 반복부-함유 G 단백질-커플드 수용체 5; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; K+T1D, 1형 당뇨병에서 신장 이식 단독; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; SEM, 평균의 표준 오차.
도 6. 새로 생성된 재조합 단백질 엑토 - TMEM219 ( 엑토 - TMEM219 )를 이용한 치료는 예비임상 모델에서 IGFBP3 -매개 미니-소화관 파괴를 없애고, CoSC를 보존한다. A. 상이한 조건에서 건강한 피험자로부터 수득된 전체 중 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하고, IGFBP3-처리 미니-소화관 및 고농도 글루코스에 노출된 미니-소화관에서 다양한 농도(IGFBP3와 비교하여 1:2, 1:1 및 2:1 몰비)의 엑토-TMEM219의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. p 값은 기준선 조건에 상대적이다. B. 3회 중복으로 수행된, 건강한 피험자로부터 단리되고 IGFBP3 및 엑토-TMEM219+IGFBP3의 존재 하에 배양된 크립트에서 EphB2의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. C, D. 3중 중복으로 수행된, 건강한 피험자로부터 단리되고 IGFBP3 및 엑토-TMEM219+IGFBP3의 존재 하에 배양된 크립트에서 카스파제 8 및 카스파제 9의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. E, F, G. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ), 나이브 B6(WT), 및 엑토-TMEM219로 처리된 STZ-B6 마우스로부터 기준선 및 8주 후에 수합된 장 하부관 절편 상에서 평가된 크립트의 수(E), 크립트의 깊이(F) 및 크립트의 폭(G)을 보고하는 선 그래프이다. WT: 야생형, STZ: 스트렙토조티신-처리. 그룹당 N=3마리의 마우스가 평가되었다. H. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ), 나이브 B6(WT), 및 엑토-TMEM219로 처리된 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스의 기준선 및 8주 후의 체중을 보고하는 선 그래프이다. WT: 야생형, STZ: 스트렙토조티신-처리. 그룹당 N=3마리의 마우스가 평가되었다. I. 8주째에 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 엑토-TMEM219로 처리된 STZ-B6 마우스로부터 수집된 장 시료로부터 단리된 EphB2+ 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 막대 그래프이다. J. 8주째에 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 엑토-TMEM219로 처리된 STZ-B6 마우스로부터 단리된 크립트로부터 단리된 EphB2+ 세포의 대표적인 유동 히스토그램이다. 그룹당 N=3에서 5마리의 마우스가 평가되었다. K. 8주째에 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 엑토-TMEM219로 처리된 STZ-B6 마우스로부터 수합된 장 시료에서 EphB2의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. L, M. 8주째에 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 엑토-TMEM219로 처리된 STZ-B6 마우스로부터 수집된 장 시료에서 카스파제 8(K) 및 카스파제 9(L)의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. N. 8주째에 나이브 B6 마우스(WT), STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ) 및 엑토-TMEM219로 처리된 B6+STZ 마우스에서 측정된 IGFBP3 순환 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: WT, 야생형; STZ, 스트렙토조티신-처리; B6, C57BL/6J 마우스; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; CoSC, 결장 줄기세포; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; EphB2, 에프린 B 수용체 2; SEM, 평균의 표준 오차, T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴.
도 7. CTRL , T1D 및 T1D + ESRD 개체의 혈청(A) 및 소변(B)에서 IGFBP3 수준의 평가이다. (C) 본 연구를 위해 평가된 코호트의 모든 피험자들에서 혈청 IGFBP3과 소변 IGFBP3 수준 사이의 상관관계이다. (D-E) 투석 시 T1D+ESRD 피험자(D) 및 eGFR > 15 ml/min/m2인 T1D 피험자(E)에서 IGFBP3 혈청 수준과 MDRD 식으로 계산된 eGFR 사이의 상관관계이다. (F) 본 연구를 위해 평가된 코호트의 모든 피험자들에서 혈청 IGFBP3과 소변 IGFBP3 수준 사이의 상관관계이다. 회색 영역은 IGFBP3의 소변 및 혈청 수준 내에 존재하는 정상 범위를 가리킨다.
도 8. 장기 지속형 T1D 및 건강한 피험자에서 CoSC 프로파일, 미니-소화관의 시험관내 생성, 간에서의 IGFBP3의 발현 및 CoSC 상에서의 IGF -IR의 발현이다. A-B. 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서 PI- 세포 게이팅 전략(gating strategy)의 대표적인 흐름 점도표이다. C. 막대 그래프는 신선하게 단리된 크립트(n=10 CTRL 및 n=10 T1D+ESRD) 내 PI- 세포의 유세포 분석의 결과를 도시한 것이다. D-E. 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서 EphB2hiLGR5+(D) 및 EphB2+h-TERT+ 세포의 대표적인 흐름 점도표이다. F. 웨스턴 블롯 분석(크랍트 블롯)은 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)의 시험관내에서 단리된 장 크립트에서 EphB2, LGR5, h-TERT의 낮은 발현을 확인시켜 준다. 전장 블롯은 도 5에 제시되어 있다. 그룹당 N=5명의 피험자가 평가되었다. G. 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)의 신선하게 단리된 장 크립트에서 검사된 줄기세포 전사체 프로파일링을 나타내는 산점도이다. 표는 분석된 유전자 및 경로를 요약한 것이다(표 S1). 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. H-I. DAPI로 염색된, 건강한 피험자 및 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득된 신선하게 단리된 크립트의 대표적인 이미지이다. 20X 배율. J. 12시간째에 건강한 피험자 및 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득된 평판배양된 크립트의 미니-소화관 형성 효율의 %를 나타내는 막대 그래프이다. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. K. 건강한 피험자 및 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득된 간 시료에서 면역조직화학 평가 시, IGFBP3 세기/확산의 계산된 조합 점수(0-6)를 나타내는 막대 그래프이다. 그룹당 N=3명의 피험자가 평가되었다. L1-L6. 간에서 IGFBP3 발현의 대표적인 이미지(63X 배율)이다. 면역형광이 Hep Par-1+ 세포 및 IGFBP3 발현의 공동국지화를 확인시켜 준 한편(L1-L3), IGFBP3과 CD163+ 세포 사이에서는 공동국지화가 관찰되지 않았다(L4-L6). M. 막대 그래프는 단리된 장 크립트 상에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 IGF-I 수용체(IGF-IR)의 정상화된 mRNA 발현을 도시한 것이다. 모든 시료들은 3회 중복으로 진행되었으며, △△Ct 방법을 사용하여 하우스키핑 유전자 ACTB에 대해 정상화되었다. N1-N2. CTRL 및 T1D+ESRD 개체로부터 수득된 직장 점막 시료 상에서의 IGF-IR+ 세포의 대표적인 사진이다. 검은색 화살표는 크립트 기부에 존재하는 양성 세포를 가리킨다. 배율 200X. O1-O2. CTRL 및 T1D+ESRD 개체로부터 수득된 직장 점막 생검 시료 상에서 수행된 TMEM219 인 시추 혼성화의 대표적인 사진이다. 배율 400X. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01. 약어: PI, 프로피디움 요오다이드; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; IGF-IR, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체; CoSC, 결장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; EphB2, 에프린 B 수용체 2; LGR5, 루신-풍부 반복부-함유 G 단백질-커플드 수용체 5; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; SEM, 평균의 표준 오차.
도 9. IGF -I/ IGFBP3 배양된 미니-소화관에서의 카스파제 발현, 및 다른 순환 인자의 효과의 결여는 미니-소화관 발달에 미치는 IGFBP3 주요 프로아폽토틱 효과를 확인시켜 주었다. A. 3회 중복으로 수행된, T1D+ESRD 개체로부터 단리되고 IGFBP3, IGF-I+IGFBP3 및 IGF-I의 존재 하에 배양된 크립트에서 카스파제 8의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. B. 3회 중복으로 수행된, T1D+ESRD 개체로부터 단리되고 IGFBP3, IGF-I+IGFBP3 및 IGF-I의 존재 하에 배양된 크립트에서 카스파제 9의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. C, D. FBS가 포함된 배지, 및 건강한 피험자로부터 수득된 혈청인 "CTRL 혈청"이 포함된 배지의 존재 하에 배양된, 건강한 피험자(C) 및 장기 지속형 T1D 개체(D)로부터 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. E. 건강한 피험자로부터 수득된 다음, 8일 동안 배양되고, siRNA 및 항-IGF-IR을 이용한 TMEM219 표적화에 노출되고, 마지막으로 배지 단독 및 배지+고농도 글루코스+장기 지속형 T1D 혈청에서 TMEM219-발현 크립트와 비교된 전체 중, 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. F, G. 건강한 피험자(F) 및 장기 지속형 T1D 개체(G)로부터 수득된 다음, 배지 단독 및 프로테옴 분석에 의해 확인된 다양한 분자들(표 S7)의 존재하에 배양된 배양물의 8일째에, 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. H. 건강한 피험자로부터 수득되고, 인슐린과 함께/없이 배지 단독, 배지+고농도 글루코스, 배지+고농도 글루코스 및 장기 지속형 T1D 혈청, IGF-I, IGFBP3의 존재 하에 배양된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001. 약어: IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; IGF-IR, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체; CoSC, 결장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; SEM, 평균의 표준 오차; siRNA, 작은 RNA 간섭; ALDOA, 프룩토스-비포스페이트 알돌라제 A; RNASE, 췌장 리보뉴클레아제; MASP, 만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1.
도 10. 단일 세포 유래 미니-소화관, 줄기세포 전사체 프로파일 및 세포자멸사 경로에 미치는 IGF -I/ IGFBP3 다이아드의 효과이다. A1-A3. 건강한 피험자의 이전에 단리된 EphB2+ 소팅된 세포로부터 수득되고 배지 단독, 배지 + IGFBP3, 배지 + 글루코스 35 mM + 장기 지속형 T1D 혈청과 함께 배양된, 시험관내에서 8일 동안 배양된 단일 세포-유래 미니-소화관의 대표적인 이미지이다. 이미지는 10X 배율로 나타나 있다. 척도 막대 50 미크론. B, C, D. 건강한 피험자로부터 단리되고 상이한 조건들에서 배양된 유세포소팅된 EphB2+ 세포로부터 성장된 단일 세포-유래 미니-소화관에서 카스파제 8, 카스파제 9 및 Ki67의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. E, F. IGFBP3 및 IGF-I과 함께/없이 배양된 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)의 신선하게 단리된 장 크립트에서 검사된 줄기세포 전사체 프로파일링을 나타내는 산점도이다. 검정법은 3회 중복으로 진행되었다. G, H. IGF-I과 함께/없이 배양된 건강한 피험자(CTRL) 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)로부터 신선하게 단리된 장 크립트에서 검사된 세포자멸사 전사체 프로파일링을 나타내는 산점도이다. 표는 분석된 유전자 및 경로를 요약한 것이다(표 S3). 검정법은 3회 중복으로 진행되었다. I, J. 건강한 피험자(I) 및 장기 지속형 T1D(J)로부터 수득된 다음, 배지 단독, Fas 리간드(FasL), 과산화수소(H2O2) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 존재 하에 배양된 크립트로부터 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다. 검정법은 3회 중복으로 수행되었다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; CoSC, 결장 줄기세포; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; SEM, 평균의 표준 오차; FasL, Fas 리간드; H2O2, 과산화수소; TNF-α, 종양 괴사 인자 알파.
도 11. 당뇨병성 장질환의 예비임상 모델에서 IGF -I/ IGFBP3 다이아드의 조작이다. A. 나이브 B6 마우스(WT) 및 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ)에서 측정된 IGFPB3 순환 수준을 나타내는 막대 그래프이다. B. 나이브 B6 마우스(WT) 및 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ)에서 측정된 IGF-I 순환 수준을 나타내는 막대 그래프이다. C. 나이브 B6 마우스(WT) 및 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ)에서 측정된 인슐린 혈청 수준을 나타내는 막대 그래프이다. D, E, F: 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ), 나이브 B6(WT) 및 IGFBP3로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3) 또는 IGF-I(B6+STZ+IGF-I)로 처리된 STZ-B6 마우스로부터 기준선 및 8주 후에 수합된 장 하부관 절편 상에서 평가된 크립트의 수(D), 크립트의 깊이(E) 및 크립트의 폭(F)을 보고하는 선 그래프이다. WT: 야생형, STZ: 스트렙토조티신-처리. 그룹당 N=3마리의 마우스가 평가되었다. G. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스, WT 및 IGFBP3로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3) 또는 IGF-I (B6+STZ+IGF-I)로 처리된 STZ-B6 마우스의 면역염색된 절편에서 Aldh+ 세포의 수/mm2를 나타내는 막대 그래프이다. H1-H2: IGFBP3로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3)(H1) 또는 IGF-I로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGF-I)(H2)의 H&E 절편 상에서의 장 크립트의 대표적인 이미지이다. 조직학 배율, 400X. I. 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ), 나이브 B6(WT), IGFBP3로 처리된 당뇨병성 장질환이 발병한 STZ-처리 B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3)의 체중을 보고하는 선 그래프이다. WT: 야생형, STZ: 스트렙토조티신-처리. 그룹당 N=3마리의 마우스가 평가되었다. J. 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 IGFBP3로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3)로부터 수합된 장 시료에서 EphB2+ 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 막대 그래프이다. K, L. 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 IGFBP3로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3)로부터 수합된 장 시료에서 EphB2(K) 및 LGR5(L)의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. M, N. 나이브 B6 마우스, STZ-처리 B6 마우스 및 IGFBP3로 처리된 STZ-B6 마우스(B6+STZ+IGFBP3)로부터 수합된 장 시료에서 카스파제 8(M) 및 카스파제 9(N)의 정상화된 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 다르게 보고되지 않는 한 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 약어: WT, 야생형; STZ, 스트렙토조티신-처리; B6, C57BL/6J 마우스; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; CoSC, 결장 줄기세포; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; EphB2, 에프린 B 수용체 2; Aldh, 알데하이드 데하이드로게나제; SEM, 평균의 표준 오차.
도 12. SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 당뇨병성 장질환을 개선한다. A, B, C. 막대 그래프는 건강한 피험자(CTRL), 장기 지속형 T1D 개체(기준선), 신장 췌장(SPK) 또는 신장 단독(K+T1D) 이식을 받은 T1D+ESRD에서 GSRS 질문표에 따른 복통, 설사 및 변비의 점수를 도시한 것이다. 회색 영역은 모든 파라미터들에 대한 정상 범위를 가리킨다. 통계는 평균±SEM으로서 표현된다. D1-D2, E1-E2, G1-G2, J1-J2. 8년간의 추적 조사에서 신장 췌장(SPK) 또는 신장 단독(K+T1D) 이식을 받은 T1D+ESRD로부터 수득된 직장 점막 생검 시료에서 수행된 신경 구조(적색 화살표는 신경내분비 소낭의 국지화 및 존재를 가리킴), 슈반 세포(적색 화살표는 세포질 교란을 가리킴) 및 5HT+ 세포의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 초미세구조 분석의 대표적인 사진이다. 배율 400X. F, H, I, K. 막대 그래프는 8년간의 추적 조사에 걸쳐 CTRL, 장기 지속형 T1D 개체(기준선), 신장 췌장(SPK) 또는 신장 단독(K+T1D) 이식을 받은 T1D+ESRD의 직장 점막으로부터 수득된 생검 시료에서 수행된, 신경내분비 소낭(신경 말단 당 검출된 NE 소낭이 3개 초과인 경우의 %), 전자 현미경을 사용한 농축 핵 및 세포질 교란이 있는 슈반 세포의 %(양성인 경우의 %), 5HT+ 세포의 측정을 보고하고 있다. 통계는 평균±SEM으로서 표현된다. N=20 CTRL, n=30 SPK, n=30 K+T1D 및 n=60 T1D+ESRD 피험자가 평가되었다. 통계는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 하기와 같이 상이한 그룹들을 비교할 때, 검사된 모든 파라미터들은 통계학적으로 유의하게 상이하였다: *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 그룹당 N=10명의 피험자가 평가되었다. 약어: GSRS, 위장 증상 등급 척도; SPK, 동시적인 신장-췌장 이식; K+T1D, 1형 당뇨병에서 신장 이식 단독; CTRL, 건강한 피험자; T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; 5HT, 세로토닌; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; NGF, 신경 성장 인자; SEM, 평균의 표준 오차; NE, 신경내분비 소낭.
도 13. SPK 및 K+ T1D 그룹에서 당뇨병성 장질환에서 결장 줄기세포, IGF-IR, 및 순환 인자의 프로테옴 프로파일의 분석이다. A1-A6. 8년간의 추적 조사에서 장기 지속형 T1D 개체, 신장 췌장(SPK) 또는 신장 단독(K+T1D) 이식을 받은 T1D+ESRD의 이전에 단리된 크립트로부터 수득된 다음 시험관내에서 8일 동안 배양된 미니-소화관의 대표적인 이미지이다. 이미지는 5X 및 10X 배율로 나타나 있다. 척도 막대 10 미크론. B. SPK 개체에서 신선하게 단리된 장 크립트에서 검사된 줄기세포 전사체 프로파일링을 나타내는 산점도이다. N=3 피험자가 평가되었다. C. 막대 그래프는 정량적 RT-PCR에 의해 측정된, 건강한 피험자(CTRL), 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD), SPK 및 K+T1D의 단리된 크립트 상에서의 IGF-I 수용체(IGF-IR)의 상대적인 발현 수준을 도시한 것이다. 모든 시료들은 3회 중복으로 진행되었으며, △△Ct 방법을 사용하여 ACTB 상대 발현 수준에 대하여 정상화되었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. D. 열 지도는 8년간의 추적 조사에서 CTRL 및 SPK 피험자와 비교하여 장기 지속형 T1D의 프로테옴 프로파일을 나타낸 것이다. 확인되고 정량화된 단백질의 완전한 데이터세트는 통계학적 분석 처리되었다(p<0.05). 유의하게 차별적으로 발현된 단백질은 계층적 군집분석을 통해 더 분석되었다. 통계는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 그룹당 N=10명의 피험자의 혈청이 평가되었다. 하기와 같이 상이한 그룹들을 비교할 때, 검사된 모든 파라미터들은 통계학적으로 유의하게 상이하였다: *p<0.01. 약어: T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; SPK, 동시적인 신장-췌장 이식; K+T1D, 1형 당뇨병에서 신장 이식 단독; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; IGF-IR, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체; SEM, 평균의 표준 오차.
도 14. SPK 및 K+ T1D 그룹에서 장 증상과 인슐린, HbA1C 및 혈당 수준과의 상관관계이다. A, B. K+T1D(A) 및 SPK(B) 그룹의 n=20명의 피험자에서 GSRS 질문표를 사용하고 최고 점수(0-7)를 가진 항목을 고려하여 평가된 인슐린 혈청 수준과 장 증상 사이의 상관관계이다. 분석은 모든 그룹들을 비교하는 데 있어서 ANOVA(p<0.05)를 사용하여 수행되었다. C. K+T1D(A) 및 SPK(B) 그룹의 n=20명의 피험자에서 인슐린-프리 방법을 사용하여 측정된 인슐린 혈청 수준이다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. D, E. K+T1D(A) 및 SPK(B) 그룹의 n=20명의 피험자에서 GSRS 질문표(0-7)를 사용하여 평가된, 글리케이트화된 헤모글로빈(glycated hemoglobin)(HbA1C) 혈청 수준과 장 증상 사이의 상관관계이다. 분석은 모든 그룹들을 비교하는 데 있어서 ANOVA(p<0.05)를 사용하여 수행되었다. F, G. K+T1D(A) 및 SPK(B) 그룹의 n=20명의 피험자에서 GSRS 질문표(0-7)를 사용하여 평가된, 혈당 수준(혈당증)과 장 증상 사이의 상관관계이다. 분석은 모든 그룹들을 비교하는 데 있어서 ANOVA(p<0.05)를 사용하여 수행되었다. 약어: T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; SPK, 동시적인 신장-췌장 이식; K+T1D, 1형 당뇨병에서 신장 이식 단독; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3.
도 15. 상이한 배양 조건들에 노출된 미니-소화관에서의 세포 계통 마커의 발현이다. A1-A4, B1-B4, C1-C4, D1-D4, E1-E4. 건강한 피험자, CTRL(A1-A4) 및 T1D+ESRD 개체(B1-B4)로부터 단리된 크립트로부터 수득되고, IGFBP3(C1-C4), 글루코스 35 mM(D1-D4) 및 글루코스 35 mM) + 장기 지속형 T1D 혈청(T1D+ESRD 혈청) + IGF-I(E1-E4)과 함께 배양된 미니-소화관에서의 사이토케라틴 20(KRT20), 비멘틴, 시냅토피신 및 알데하이드 데하이드로게나제(ALDH) 발현의 대표적인 이미지(10X 배율)이다. 면역형광은, 모든 계통 마커들의 발현이 CTRL과 비교하여 T1D+ESRD 개체로부터 수득된 미니-소화관에서 감소되고(A1-A4, B1-B4), ALDH는 최소 발현된 마커임(B4)을 확인시켜 주었다. 감소된 ALDH 발현은 IGFBP3-처리 미니-소화관(C4)에서도 검출된 한편, 고농도 글루코스 및 장기 지속형 T1D 혈청에 노출되고 IGF-I로 처리된 미니-소화관은 명백한 ALDH 발현 회복을 보여주었다. F. 정량적 RT-PCR에 의해 측정된, 비-줄기세포 (EphB2- 세포) 상에서의 TMEM219, KRT20, 상피-세포 부착 분자(EpCam) 및 크로모그라닌 A(CHGA)의 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 모든 시료들은 3회 중복으로 진행되었으며, △△Ct 방법을 사용하여 ACTB 상대 발현 수준에 대하여 정상화되었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. 약어: T1D, 1형 당뇨병; ESRD, 말기 신장 질환; CTRL, 건강한 피험자; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자 1; IGFBP3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; IF, 면역형광; KRT20, 사이토케라틴 20, ALDH, 알데하이드 데하이드로게나제, EpCam, 상피 세포 부착 분자; CHGA, 크로모그라닌 A; RT-PCR, 실시간 중합 연쇄 반응; ACTB, 베타 액틴.
도 16. 시험관내에서 미니-소화관 검정법에서 단백질 후보물질을 시험하기 위한 선별 전략이다. 순서도는 시험관내 미니-소화관 검정법에서 시험되어야 하는 프로테옴 프로파일을 기반으로 단백질 후보물질을 선별하는 데 사용된 전략을 도시하고 있다.
도 17. 크립트 도메인 정량적 기준을 사용한 발달된 미니-소화관의 분석이 다. A-P. 논문 전체를 통해 이미 보고된 상이한 조건들에서 검출 가능한 적어도 1개의 크립트 도메인을 가진 발달된 미니-소화관의 %를 그룹핑하는 막대 그래프이다.
도 18. 말초 IGFBP3 수준은 건강한 피험자와 비교하여 염증성 장 질환을 앓고 있는 개체에서 증가된다.
실시예 1
재료 및 방법
동시적인 췌장-신장 이식(SPK)을 위한 대기 명단에 등록된 60명의 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)를 연구에 등록시키고, 연령 및 성별이 일치하는 20명의 건강한 피험자(CTRL)와 비교하였다. 위장 증상, 장 운동성 및 장점막 병리학의 평가에 의해 DE를 정의하였다. CoSC를, CoSC 특이적 마커의 발현(유세포 분석, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 전사체 프로파일링)을 기반으로, 정제된 결장 크립트 상에서 확인하였다. CoSC 자가-재생 특성을 시험관내에서 발달된 미니-소화관의 %를 평가하고, 상이한 조건들에서 세포 계통 마커의 발현을 특징화함으로써 평가하였다(도 15). 광범위한 혈청 프로테옴을 사용하여, CoSC를 조절할 수 있는 순환 인자를 검출하였으며, 그런 다음, 후보 인자를 시험관내 미니-소화관 검정법에서 시험하였다(도 16). 상세한 방법 및 통계학적 분석은 하기에 기재되어 있다. 연구는 이탈리아 밀라노 소재의 Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico Ospedale San Raffaele의 의학연구윤리심의위원회에 의해 승인을 받았다(Enteropathy-Pancreas KidneyTransplantation/01 Secchi/Fiorina).
환자 및 연구 설계
(연령 41세 내지 43세), 성별 및 T1D 기간(29.4±1.8년)에 일치하는, 동시적인 췌장-신장 이식(SPK)을 위한 대기 명단에 등록된 60명의 T1D+ESRD 개체를 연구에 등록하였다. 정상 신기능 및 정상 당대사 파라미터를 가지며 연령 및 성별에 일치하는 20명의 건강한 피험자(CTRL) 또한 연구하였다. T1D+ESRD 피험자들은 모두 연구에 등록 시 집중적인 인슐린 치료를 받은 한편, CTRL 그룹은 임의의 약제를 투여받지 않았다. 모든 T1D+ESRD 피험자들은 항혈소판 요법(ASA) 및 항고혈압제(안지오텐신-전환-효소 저해제)과 동일한 치료를 받은 한편, 60명 중 40명은 연구에 등록되었을 때 스타틴을 수여받았다. 염증성 장 질환뿐만 아니라 소아 지방변증의 명확한 징후가 있는 피험자는 등록하지 않았다.
이식 시 거시적인 외과적 평가에 따라 SPK(n=30) 또는 K+T1D(n=30) 이식한 후, T1D+ESRD 개체를 8년 동안 추적조사하였다(평균 추적 조사: 8.6±1.1년). 경구 항응고제를 복용한 개체는 포함시키지 않았다. SPK 개체들은 모두 전체 추적조사 기간 동안 인슐린-독립적인 반면, K+T1D 개체는 집중적인 피하 인슐린 요법을 받았다. 모든 피험자들은 연구 등록 전에 정보에 근거한 동의를 제공하였다. 일상적인 임상적 추적조사에 포함되지 않은 연구는 적절한 의학연구윤리심의위원회 승인에 의해 커버되었다(Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina).
이식 및 면역억제
이식용 장기는 "노스 이탈리아 이식" 장기 조달 협력단(NITp, Milan)을 통해 사망한 공여자로부터 입수하였다. ATG(티모글로불린, IMTIX, SANGSTAT)를 이용한 유도 후, 사이클로스포린(100 ng/ml 내지 250 ng/ml 사이의 수준을 통해) 또는 FK506(10 ng/ml 내지 15 ng/ml 사이의 수준을 통해), 미코페놀레이트 모페틸(500 mg/일 내지 2000 mg/일) 및 메틸프레드니솔론(10 mg/일)을 사용하여 면역억제를 유지시켰다. 이식 후 3 내지 6개월 이내에 스테로이드를 중단시켰다. T1D+ESRD 및 SPK 그룹에 포함된 모든 환자들에게 항-혈소판 요법(80% ASA 및 20% 티클로피딘)을 수행하여, 그래프트(graft) 또는 누공 혈전증(fistula thrombosis)을 예방하였다. 대사 상태, 신기능 및 혈압을 등록 동안 및 이후 이식 후 2년마다 검사하였다. 추정된 사구체 여과율(eGFR)을, 신장 질병에서 식이요법의 변형(MDRD; Modification of Diet in Renal Disease) 식에 따라 계산하였다(Levey et al, 1999).
위장 증상 등급 척도(GSRS)
위장 증상을 이식 후 2년, 4년 및 8년째에 건강한 피험자, 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD), 및 SPK 및 K+T1D 그룹에서 GSRS 질문표에 의해 평가하였다. 위장 증상 등급 척도(GSRS)는, 기술적 앵커(descriptive anchor)에 의해 정의된 7-등급 라이커트 척도와 함께 15개의 항목으로 구성된 질문표이다(Svedlund et al., 1988). 질문표는 본래, 광범위한 위장 증상을 평가하도록 설계된 인터뷰-기반 등급 척도로서 구축되었으며, 이후 자가-투여된 질문표가 되도록 변형되었다. 점수가 높을수록, 증상은 더 중증이다: 척도는 최소값 1 내지 최대값 7의 범위이다. 연구에서 개체의 참여가 중단되는 경우, 마지막의 이용 가능한 관찰 시의 값이 분석에서 앞으로 이용될 것이다. 항목은 인자 분석을 기반으로 이전에 확인된 5개의 범주로 분류될 수 있다: 복통 증상(3개 항목), 역류 증상(2개 항목), 소화불량 증상(4개 항목), 설사 증상(3개 항목) 및 변비 증상(3개 항목).
항문직장 내압검사
항문직장 내압검사에 대한 데이터는 건강한 피험자에서는 이미 이용 가능하였으며, 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서, 맞춤-설계된, 오픈-팁, 14-Fr 직경, 프로브의 말단에 4-cm 라텍스 벌룬이 묶여 있고 7개의 루멘을 가진 PVC 프로브(Bioengineering Laboratories Pic, Milan, Italy)를 사용하여 항문직장 내압검사를 수행함으로써 수득된 데이터와 비교하였다(Carrington et al, 2014; Remes-Troche et al, 2010). 10분간의 진행 기간 후 괄약근 길이를 측정하였으며, 휴식 조건에서 압력을 15분 동안 기록하였다. 그런 다음, 피험자에게 항문을 가능한 한 단단하게 가능한 한 오랫동안 - 적어도 20초 동안 - 조이도록 지시하였다. 발명자들의 연구는 하기 항목들을 평가하였다: 휴지기 톤, 수축 톤, 반사 반응 및 응급 반응.
병리학, 면역조직화학 및 전자 현미경
결장직장 내시경 시술을, 기준선에서 건강한 피험자, 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD) 및 이식 후 2년, 4년 및 8년째에 SPK 및 K+T1D 그룹에서 Welch Allyn 광학 S자형 스코프를 사용하여 수행하였다. 장점막 시료를 완충된 포르말린(포름알데하이드 4% w/v 및 아세테이트 완충제 0.05 M)에서 고정하고, 파라핀 왁스에서 통상적으로 가공하였다. 각각의 등록된 케이스의 3 ㎛-두께의 절편을 형태학적 평가를 위해 헤마톡실린 & 에오신(H&E)으로 염색하였다. 면역조직화학을 위해, 3 ㎛-두께의 절편을 폴리-L-리신 코팅된 슬라이드 상에 마운팅하고, 탈파라핀처리한 다음, 등급별 알코올 및 물을 통해 수화시켰다. 절편을 전자레인지에서 650 W에서 0.01 M 시트레이트 완충제, pH 6에 10분 동안 침지시킴으로써 수행된 항원 복구(retrieval), 뿐만 아니라 절편을 3% 과산화수소에 10분 동안 침지시킴으로써 수행된 내인성 퍼옥시다제 활성 저해 후, 1차 항체와의 인큐베이션을 4℃에서 18시간 내지 20시간 동안 수행한 다음, 후속해서 아비딘-비오틴 복합체 절차를 수행하였다(Hsu et al, 1981). 0.03% 3,3'다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드를 사용하여 면역반응을 발색시킨 다음, 절편을 해리스 헤마톡실린을 이용하여 대조염색하였다. 하기 항체들을 사용하였다: Ki67(모노클로날, 클론 MIB1, 1:100 희석, Dako, Carpinteria, CA, USA), 알데하이드 데하이드로게나제(모노클로날, 클론 44/ALDH, 1:1000 희석, Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), EphB2(모노클로날, 클론 48CT12.6.4, 1:200 희석, Lifespan Biosciences, Seattle, WA, USA), LGR5(모노클로날, 클론 2A2, 1:100 희석, Origene Technologies, Rockville, MD, USA), hTERT(모노클로날, 클론 Y182, 1:500 희석, Millipore, Billerica, MA, USA), 글리센틴(폴리클로날, 1:1250 희석, Milab, Malmo, Sweden), 췌장 폴리펩타이드(폴리클로날, 1:500 희석, Peninsula, Belmont, CA, USA), PYY(폴리클로날, 1:1000 희석, Biogenesis, Bournemouth, UK), 세로토닌(모노클로날, 클론 YC5, 1:50 희석, Biogenesis), 소마토스타틴(폴리클로날, 1:550 희석, Dako), IGF-I(폴리클로날, 1:500, Abeam) 및 IGF-IR(폴리클로날, 1:100, Cell Signaling Technologies)(Fiorina et al, 2003). 초미세구조 연구를 위해, 시료들을 4℃에서 0.05 M 카코딜레이트 완충제, pH 7.3 중 2% 파라포름알데하이드와 2% 글루타르알데하이드의 혼합물에서 2시간 동안 고정하였다. 이들 시료를 실온에서 1% 오스뮴 테트록사이드에서 1시간 동안 후고정한 다음, 탈수하고, 에폰-아랄다이트(Epon-Araldite)에서 포매시켰다. 초박절편을 다이아몬드 나이프를 이용하여 절단하고, 이전에 Formvar 필름으로 코팅된 200-메쉬 니켈 그리드 상에 마운팅하였다. 초박절편을 수성 우라닐 아세테이트 및 레이놀즈 납 시트레이트 용액을 이용하여 염색하고, 후속해서 Philips Morgagni 268D 전자 현미경을 이용하여 검사하였다. 통계학적 분석을 위해 케이스를 신경내분비 소낭의 수(n > 3 및 n < 3)에 따라 그룹핑하였다. 크립트 단리를 위해, 항생제 혼합물을 함유하는 시료에서 조직을 수합하고, 다음 단락에 기재된 바와 같이 가공하였다. EphB2에 대한 면역염색 세기를 1(필드 당 크립트 당 소수의 양성 세포에 대한 네가티브 EphB2 구배) 내지 5(모든 세로방향 크립트들에서 강한 EphB2 구배)로서 등급화하였다. 항-IGFBP3 1차 항체(폴리클로날, 1:50 희석, Sigma Aldrich)를 1형 당뇨병 환자의 간 생검에서 면역조직화학적으로 시험하였다. 병리학적 발견점이 없는 간 생검을 대조군으로서 사용하였다. 이들 조직 시료들은 모두 이탈리아 파마 소재의 Department of Biomedical, Biotechnological, and Translational Sciences, University of Parma의 병리학 유닛에 보관된 파일로부터 가져왔다. 면역염색 세기를 1(약함), 2(중간) 및 3(강함)으로서 등급화한 한편, 이의 확산을 1(중심적), 2(구역적) 및 3(확산적)으로서 등급화하였다.
면역형광
간 생검에서 수득된 면역형광 시료를 63x 오일 대물 렌즈를 가진 공초점 시스템(Axiovert 200 M 도립 현미경과 통합된 LSM 510 Meta 스캔 헤드; Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 이미지를, 연속적 및 독립적 광학 경로를 사용하여 멀티트랙 모드에서 획득하였다. 하기 1차 항체들을 사용하였다: 토끼 IGFBP3(1:10, Sigma), 마우스 Hep Par-1(1:20, 모노클로날, Dako), 마우스 CD 163(1:10, 클론MRQ26, CellMarque).
IGFBP3과 함께/없이, 장기 지속형 T1D 혈청 + 고농도 글루코스(35 mM 글루코스)와 함께/없이 공동배양된 미니-소화관 및 T1D+ESRD 개체의 크립트로부터 수득된 미니-소화관을 면역형광 분석을 위해 비멘틴, 시토케라틴 20, 알데하이드 데하이드로게나제 및 시냅토피신으로 염색하여, 세포 계통 마커의 발현을 평가하였다(도 15: A1-A4, B1-B4, C1-C4, D1-D4, E1-E4). 하기 1차 항체들을 사용하였다: 마우스 비멘틴(1:80, 모노클로날, 클론: V9 Dako), 마우스 알데하이드(1:1000, 모노클로날, 클론: 44, BD), 마우스 시토케라틴 20(1:100, 모노클로날, 클론: Ks20.8, Dako) 및 시냅토피신(1:100, 모노클로날, 클론: syn88, BioGenex).
인 시추 혼성화
인간 결장 점막의 파라핀 절편을 표준 절차에 따라 탈파라핀화하고, 재수화시켰다. 실온에서 0.2 M HC1을 사용하여 절편을 15분 동안 처리한 후, 절편을 PBS에서 3회 세척하고, 37℃에서 15분 동안 프로테이나제 K(PBS 중 30 ㎍/ml)에서 인큐베이션하였다. PBS 중 0.2% 글리신을 1분 동안 첨가하여, 프로테이나제 K 활성을 중화시키고, 시료를 PBS에서 2회 세척하였다. 실온에서 4% PFA에서 10분 동안 후고정하고 PBS에서 3회 세척한 후, 시료를 1.5% 트리에탄올아민, 0.15% HC1 및 0.6% 아세트산 무수물을 함유하는 수용액에서 5분 동안 2회 인큐베이션함으로써 히스톤 아세틸화를 달성하였다. 그런 다음, 시료를 세척하고, 68℃에서 혼성화 용액(50% 포름아미드, 5X SSC, pH4.5, 2% 블라킹 시약(Roche), 0.05% CHAPS(Sigma), 5 mM EDTA, 50 ㎍/ml 헤파린(Sigma) 및 50 ㎍/ml 효모 RNA)에서 1시간 동안 예비-혼성화시켰다. TMEM219의 경우, 디곡시게닌-표지 프로브를 혼성화 용액에서 750 ng/ml으로 희석시키고, 65℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 혼성화-후 세척을 65℃에서 50% 포름아미드/2XSSC에서 3X 20 min 수행하였다. 절편을 TBS-T 완충제(0.1 M TrisHCl pH7.5, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20)에서 헹구고, 실온에서 블라킹 용액(TBS-T 중 0.5% 블라킹 시약, 10% 양 혈청)에서 30분 동안 블라킹하였다. 양 항-DIG 항체(Fab 단편, Roche)를 블라킹 용액에서 1/2000 희석시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 시료를 TBS-T에서 세척한 다음, NTM 완충제(0.1 M Tris pH9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl2)에서 세척하고, NBT/BCIP 용액(Roche)에서 24시간 동안 발색시켰다.
CoSC 특징화
크립트 정제
근육층 및 점막하층을 인간의 신선한 직장 생검 검체로부터 조심스럽게 제거하고, 점막을 항생제 혼합물(노르모신[Invivogen, San Diego, California 92121, USA], 겐타마이신[Invitrogen, Carlsbad, CA,USA] 및 푼기존[Invitrogen])과 함께 실온(RT)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 조직을 작은 조각으로 절단하고, PBS 중 10 mM 디티오트레이톨(DTT)(Sigma, St. Louis, MO 63103, USA)과 함께 RT에서 5분 동안 2회 내지 3회 인큐베이션하였다. 그런 다음, 시료를 PBS 중 8 mM EDTA로 옮기고, 4℃에서 60분 내지 75분 동안 서서히 회전시켰다. 상층액을 신선한 PBS에 의해 대체하고, 시료를 격렬히 흔들어서 결장 크립트가 풍부한 상층액을 수득하였다. 태아 소 혈청(FBS, Sigma)을 5%의 최종 농도로 첨가하고, 분획을 40xg에서 2분 동안 원심분리하여, 단일 세포를 제거하였다. 이 세척 절차를, 2 mM 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen), 10 mM HEPES(Sigma) 및 5% FBS(Sigma)가 보충된 Advanced DMEM/F12(ADF, Gibco) 배지를 이용하여 3회 반복하였다.
200개 내지 300개의 단리된 인간 결장 크립트 단위를 50 ㎕ 마트리겔과 함께 혼합하고, 이미 보고된 바와 같이 예열된 24-웰 배양 접시 상에 평판배양하였다. 고형화(37℃에서 15분 내지 20분) 후, 크립트를 600 ㎕ 완전 크립트 배양 배지[글루타맥스, 10 mM HEPES, N-2[1x], 레티노산이 없는 B-27[1x], 10 mM 니코틴아미드, 1 mM N-아세틸-L-시스테인, 50 ng/ml 인간 EGF(Life Technologies, Grand Island, NY), 1 ㎍/ml RSPO1(Sino Biological, Beijing, China), 100 ng/ml 인간 노긴(Noggin)(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 1 ㎍/ml 가스트린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 500 nM LY2157299(Axon MedChem, Groningen, The Netherlands), 10 μΜ SB202190(Sigma) 및 0.01 μΜ PGE2(Sigma)가 보충된, Wnt3a-조건화된 배지 및 Advanced DMEM/F12(Life Technologies, Grand Island, NY) 50:50]로 덮어씌웠다. 배지를 격일로 교체하였다. 락(rock) 저해제 Y-27632(10 μΜ, Sigma)를 처음 2일 내지 3일 동안 배양물에 첨가하였다. 정제된 크립트를 8일 동안 직접 배양하였다. 장세포 및 장내분비 세포에 대한 세포 계통 마커를 미니-소화관 및 EphB2+ 및 EphB2- 소팅된 단일 세포에서 RT-PCR로 시험: CHGA, KRT20 및 EPCAM(Life Technologies, Grand Island, NY)에 의해 평가하였다. 생검 절차 및 단리 가공이 시험관내 배양에서 미니-소화관을 형성하는 데 있어서의 이들의 효율을 절충할 수 있었을 것임을 배제하기 위해, 결장 형성 효율(%)을 신선하게 단리된 크립트 상에서 평가하였다. DAPI 염색을 수행하여, CTRL 및 T1D+ESRD 피험자 유래의 신선하게 단리된 크립트에서 핵의 수를 확인하였다. 적어도 1개의 크립트 도메인을 가진 발달된 미니-소화관을 또한 계수하였으며, 보다 정량적인 기준을 부가하여, 발달된 미니-소화관을 측정하기 위해 퍼센트를 계산하였다(도 17: A-P). 장기 지속형 T1D(T1D+ESRD) 및 CTRL 혈청에서 측정된 인슐린 및 글루코스 수준은 하기와 같이 보고되어 있다:
글루코스 수준(T1D+ESRD vs. CTRL, 178±47.5 vs 90±5.5 mg/dl, p=O.0001);
인슐린 수준(T1D+ESRD vs. CTRL, 12.9±4.6 vs 5.8±1.6 μIU/ml, p=0.009).
유세포 분석
CD45- 및 CD11b-양성 세포(V450 항-인간 CD45 및 CD11b, BD Biosciences, San Jose, CA)를 배제함으로써 CoSC 마커 EphB2(APC 항-인간 EphB2 항체, R&D, Minneapolis, MN) 및 LGR5(PE 항-인간 LGR5, Origene, Rockville, MD)의 발현을 유세포 분석에 의해 확인하였다. 프로피디움 요오다이드(PI)(10 ㎍/ml)를 첨가하여, 사멸한 세포를 배제하였다. EphB2+ 세포 또한, 유세포 분석에 의해 소팅하여, 배양용 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 투과성으로 만들고, 1차 항-인간 hTERT 항체(GeneTex, Irvine, CA)를 이용하여 염색하고, 후속해서 DAPI 항-염소 2차 항체(Life Technologies)를 이용하여 염색함으로써, 인간-tert(hTERT)의 세포내 검출을 수행하였다. 분석에 관하여, 처음에 세포를 모두 PI-로서 게이팅(gating)한 다음, 다른 표면 또는 세포내 마커를 평가하였다. 시료를 BD LSR-Fortessa 상에서 진행시키고, FSC Express 3.0(DeNovo 소프트웨어, Los Angeles, CA, USA)에 의해 분석하였다.
시험관내 미니-소화관 생성 연구
크립트를 건강한 피험자 직장 생검 시료로부터 단리하고, 이전에 기재된 바와 같이 배양하여, 미니-소화관을 생성시켰다. 고혈당 조건을 만들기 위해, 글루코스를 상이한 농도(35 mM: 고농도 글루코스; 5 mM: 정상 글루코스)에서 첨가함으로써 배양 배지를 변형시켰다. 요독증 환경을 모방하기 위해, ESRD가 있는 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득한 인간 요독증 혈청을 크립트에 첨가하였으며, 이 크립트를 크립트 배양 방법 섹션에서 보고된 바와 같이 배양하였다. 8일 후, 크립트를 수합하고, 형태, 미니-소화관 성장, 장 시그너처 마커(EphB2, LGR5, h-TERT), IGF-IR 및 TMEM219(Life Technologies) 및 카스파제 9(Life Technologies)의 발현을 RT-PCR을 이용하여 검사하였다. pan-카스파제 저해제(카스파제 저해제 Z-VAD-FMK, 20 mM, Promega, Madison, WI), 카스파제 8 선택적 저해제(Z-IETD-FM, BD Pharmingen), 카스파제 9 선택적 저해제(Z-LEHD-FMK, BD Pharmingen), 카스파제 3 저해제 Z-DEVD-FMK(BD Pharmingen)를 시험관내에서 미니-소화관에 사용하여, IGFBP3의 항세포자멸사 효과를 확인하였다.
단리된 크립트를 통상의 PBS 대신 건강한 피험자 인간 혈청, 즉 CTRL 혈청을 함유하는 크립트 배양 배지와 함께 배양하기 위해, L-Wnt3 세포를 10% CTRL 혈청에서 성장시켜, 조건화된 배지를 생성시키고, 나아가 이를 Advanced DMEM/F12 배지에 50:50으로 첨가하여, 이전에 기재된 바와 같은 크립트 배양 배지를 수득하였다(크립트 정제 참조).
미니-소화관을 생성시키는 데 있어서 소팅된 EphB2+ 세포의 특성을 평가하기 위해, 2000개의 소팅된 세포를 50 ㎕ 마트리겔과 함께 혼합하고, 예열된 24-웰 배양 접시에 평판배양하였다. 마트리겔의 고형화(37℃에서 10분 내지 15분) 후, 세포를 "단일 세포 성장 배지"(= 완전 크립트 배양 배지 + 10 M 락 저해제 Y-27623)로 덮어씌웠다. 배지를 격일로 신선한 단일 세포 배양 배지로 교체하였다. 락 저해제를 배양 배지에 7일 내지 9일 동안 포함시켰다.
면역블로팅
장 생검 시료의 총 단백질을 Laemmli 완충제(Tris-HCl 62.5 mmol/l, pH 6.8, 20% 글리세롤, 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올)에서 추출하고, 이들의 농도를 측정하였다(Lowry et al, 1951). 총 단백질 35 ㎍을 7% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하고, 니트로셀룰로스(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) 상으로 블로팅하였다. 그런 다음, 블로트를 Ponceau S를 이용하여 염색하였다. 막을 25℃에서 TBS(Tris[10 mmol/l], NaCl[150 mmol/l]), 0.1% Tween-20, 5% 무지 분유, pH 7.4에서 1시간 동안 블라킹하고, 4℃, TBS-5% 밀크에서 1:200으로 희석된 200 mg/ml의 폴리클로날 항-염소 EphB2 항체 또는 폴리클로날 항-염소 LGR5 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 또는 모노클로날 IGF-IR(Santa Cruz Biotechnology) 및 폴리클로날 TMEM219(R&D, Minneapolis, MN) 또는 1:1000으로 희석된 모노클로날 마우스 항-β-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 12시간 동안 인큐베이션하고, TBS-0.1% Tween-20으로 4회 세척한 다음, TBS-5% 밀크에서 1:1000으로 희석된 퍼옥시다제-표지된 토끼 항-염소 IgG 2차 항체(또는 β-액틴에 대한 토끼 항-마우스)(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 인큐베이션하고, 마지막으로 TBS-0.1% Tween-20을 이용하여 세척하였다. 결과적인 밴드를 증강된 화학발광제(SuperSignal; Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 시각화하였다.
장 크립트 성장의 라이브 이미지화(Live imaging)
CTRL, T1D+ESRD 및 SPK 개체의 장 크립트의 정제 및 배양에 의해 수득된 미니-소화관의 라이브 이미지화를, 챔버와 함께 환경적 컨트롤이 장착된 Zeiss Axiovert S100(Oko-Lab, Italy) 상에서 수행하였으며, 상기 챔버 내에 5% C02 및 95% 공기로 구성된 습윤화되고 예비혼합된 기체가 주입되었으며, 전체 셋업을 37℃에서 설정하였다. 이미지를 72시간 동안 20분 간격으로 획득하였다. 이미지를 획득하고, Time Lapse(Oko-Lab, Italy)를 사용하여 가공한 다음, 필요하다면 Adobe Photoshop Elements 7.0을 사용하여 이미지 편집을 수행하였다.
형태학적 이미지 분석
미니-소화관의 이미지를 도립 현미경 Leica DH/RB에 의해 0일, 5일 및 8일째에 촬영하고, Axio Vision AC Release 4.3을 이용하여 획득하였다. 도면에 보고된 사진은 5일째의 미니-소화관을 나타낸다. 10X 배율.
전사체 프로파일링
총 RNA를, 온-컬럼 DNase I 분해와 함께 RNeasy Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제된 장 크립트 현탁액으로부터 단리하였다. 다음, 각각의 시료 유래의 3 ㎍ 총 RNA를, RT2 First Strand 키트(C-03; SABiosciences, Frederick, MD)를 사용하여 역전사하였다. 본 발명자들은 하기 유전자들과 함께 인간 줄기세포 RT2 프로파일러 PCR 어레이(PAHS-405Z), 인간 줄기세포 신호전달 PCR 어레이(PAHS-047Z) 및 커스텀 어레이를 사용하였다: AXIN2, OLFM4, BMI1, RNF43, CDCA7, SLC12A2, CDK6, SOX9, DKC1, ZNRF3, ETS2, EPHB2, FAM84A, LGR5, GPX2, ACTB(SABiosciences). 프로파일러 PCR 어레이는 SYBR 그린-기반 실시간 PCR을 사용하여 유전자 패널의 발현을 정량적으로 측정한다(Kosinski et al, 2007). 세포자멸사 마커 및 산화 스트레스 마커의 전사체 프로파일링을 평가하기 위해, 인간 세포자멸사 PCR 어레이(PAHS-012Z, SABiosciences) 및 인간 산화 스트레스 PCR 어레이(PAHS-065Z, SABiosciences)를 사용하였다.
qRT - PCR 분석
정제된 장 크립트 유래의 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출하고, qRT-PCR 분석을 TaqMan 검정법(Life Technologies, Grand Island, NY)을 제조업체의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 정상화된 발현 값을 △△Ct 방법을 사용하여 확인하였다. 정량적 역전사효소 중합 연쇄 반응(qRT-PCR) 데이터를 ACTB의 발현에 대해 정상화하고, △△Ct 값을 계산하였다. 통계학적 분석은 원-웨이 ANOVA를 통해 각각의 환자에 대한 모든 세포 집단들에 걸쳐 유전자 발현을 비교하였으며, 관심 집단과 모든 다른 집단들 사이에서의 다중 비교를 위한 Bonferroni 포스트-테스트를 수행하였다. 통계학적 분석을 또한, 소프트웨어 이용 가능한 RT2 프로파일러 PCR 어레이 데이터 분석(Qiagen)을 사용함으로써 수행하였다. 2개 그룹의 비교를 위해, 스튜던트 t 테스트를 이용하였다. 신선한 크립트의 단리 후 및/또는 8일간의 미니-소화관의 배양 후 분석을 3회 중복 수행하였다. 표 I-B는 사용된 프라이머의 주요 특징을 보고하고 있다.
Figure 112018001241113-pct00009
ELISA 검정법
모든 그룹의 피험자들의 풀링된(pooled) 혈청/혈장 및 모든 그룹의 처리된 마우스 및 비처리된 마우스들에서의 IGF-I 및 IGFBP3 수준을 상업적으로 입수 가능한 ELISA 키트를 제조업체(R&D and Sigma)의 지시에 따라 평가하였다.
인간 불멸화된 간종양 세포주 HuH-7을 DMEM 10% FBS에서 상이한 글루코스 농도: 5.5 mM, 20 mM 및 35.5 mM에서 5일 동안 배양하였다. 배양 상층액을 수합하고, IGFBP3을 IGFBP3 ELISA 키트(Sigma)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 평가하였다. 수합된 세포를 트립신에 의해 분리하고, 혈구계산기를 이용하여 계수하였다.
인슐린 수준을, 3.0% 및 5.0%의 검정법내 및 검정법간 변동 계수(CV)와 함께 마이크로입자 효소 면역검정법(Mercodia Iso-Insulin ELISA)을 이용하여 검정하였다.
재조합 단백질 및 개입 연구
재조합 인간 IGF-I(Sigma, 13769), (IGF-I), 재조합 인간 IGFBP3(Life Technologies, 10430H07H5), (IGFBP3) 및 항-IGF-IR(Selleckchem, Boston, OSI-906)을 단리 후 +2일째에 크립트 배양물에 첨가하였다. IGFBP3(Reprokine, Valley Cottage, NY)을 나이브 마우스 및 STZ-처리 B6 마우스에게 0.3 mg/마우스/일로 15일 동안 투여하였으며; IGF-I(Reprokine) 및 엑토 TMEM219를, 생체내에서 당뇨병 2주 후 STZ-처리 B6 마우스에게 각각 5 ㎍/마우스/일의 용량으로 20일 동안 및 100 ㎍/마우스/일의 용량으로 15일 동안 투여하였다.
다른 분자들을 시험관내에서 미니-소화관 검정법에서 시험하였으며, 단리 후 +2일째에 크립트 배양물에 첨가하였다: 아디포넥틴(R&D), 티모신 β4(Abeam), C-반응성 단백질(Merck Millipore), 시스타틴 C(Cell Signaling Technologies), 크로모그라닌 A(Life Technologies), 프룩토스-비포스페이트 알돌라제(Novoprotein), 오스테오폰틴(R&D), 췌장 리보뉴클레아제(RNASE, Novoprotein), 혈청 아밀로이드 A 단백질(Abeam), 만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1(MASP1, Novoprotein), 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파, R&D), FaS 리간드(FasL, R&D). 과산화수소(H202, 50 μΜ)를 또한 미니-소화관 검정법에서 시험하였다.
재조합 인간 엑토 TMEM219의 생성
재조합 인간 엑토-TMEM219를, E. Coli를 합성용 발현 숙주로서 사용하여 생성시켰다. 간략하게는, 세포외 TMEM219의 유전자 서열을 수득하였다.
Figure 112018001241113-pct00010
세포외 TMEM219의 DNA 서열을, lac 프로모터를 함유하는 고 복사-수 플라스미드 내로 클로닝하였으며, 그런 다음, 이를 박테리아 E. coli로 형질변환시킨다. IPTG(락토스 유사체)의 첨가는 lac 프로모터를 활성화시켰으며, 박테리아가 세포외 TMEM219(엑토 TMEM219)를 발현하도록 유발하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 사용하여, 순도가 90% 초과임을 확인하였다. 새로 생성된 단백질 재조합 인간 엑토 TMEM219의 분자량은 80 kda이었다.
건강한 피험자 유래의 크립트를 단리하고, 이전에 기재된 바와 같이 배양하였으며, 사용된 IGFBP3 농도(2:1, 1:1 및 1:2)와 비교하여 엑토-TMEM219를 3개의 농도(260 ng/ml, 130 ng/ml 및 75 ng/ml)로 하여 배양물에 첨가하였으며, 적절한 대조군을 각각의 농도에 대하여 설정하였다. 8일간의 배양 후, 카스파제 8 및 카스파제 9 발현, CoSCSC 시그너처 마커(EphB2 및 LGR5) 발현, 발달된 미니-소화관의 수를 추가로 평가하였다.
작은 RNA 간섭
건강한 피험자로부터 수득된 단리된 크립트를 성장시켜, 이전에 기재된 바와 같이 시험관내에서 완전 배지, 및 고농도 글루코스 및 장기 지속형 T1D 혈청을 첨가함으로써 변형된 배양 배지에서 미니-소화관을 생성시켰다(온라인 방법에서 시험관내에서의 미니-소화관 생성 연구 참조). 크립트가 회복될 수 있게 한 72시간의 배양 후, 혈청을 함유하지 않고 6 ㎕ HiPerFect 형질감염 시약(Qiagen)을 함유하는 100 ㎕ 배양 배지 중 작은 간섭 RNA(siRNA; Flexitube siRNA SI04381013, Qiagen, Valencia, CA) 750 ng을 실온에서 인큐베이션하여, 형질감염 복합체가 형성되게 하였다. 크립트들을 이들의 정상 성장 조건 하에 이들 형질감염 복합체와 함께 6시간 동안 인큐베이션하였다. 유전자 침묵의 분석을 24시간, 48시간 및 72시간째에, 정상 미니-소화관 발달의 퍼센트를 평가함으로써 수행하였다. 대조군 siRNA를 음성 대조군으로서 사용하여, 유전자 침묵의 효과를 확인하였다.
프로테옴 분석
그룹당 10명의 환자 유래의 풀링된 혈청 8 ㎕를 ProteoPrep 20 spin column(Sigma)을 사용하여 고갈시켜, 20개의 고도로 풍부한 단백질이 제거될 수 있게 하였다. 제조업체의 지시에 따라 이러한 절차를 2회 반복하여, 약 99%의 고갈을 수득하였다. 회수된 상층액을 분석하여, 다이렉트 디텍트 IR 분광 광도계 및 표준으로서 BSA를 사용하여 총 단백질 농도를 확인하였다. 프로테옴 분석용 단백질을 충분히 수득하기 위해, 각각의 풀로부터 32 ㎕를 상기 기재된 바와 같이 가공하였다. 각각의 시료 유래의 총 단백질 40 ㎍을, 문헌에 보고된 바와 같이 필터 보조 시료 제조(FASP) 프로토콜을 사용하여 용액-내(in-solution) 분해시켰다(Wisniewski et al, 2009). 시료를, C18 홈메이드 팁 컬럼(C18 Empore membrane, 3M)을 사용하여 탈염시킨 후, 모세관 크로마토그래픽 시스템(EasyLC, Proxeon Biosystem, Thermo Scientific) 내로 주사하였다. 펩타이드 분리를, 3 ㎛ ReproSil Pur 120 C18-AQ로 채워진, 홈메이드 25 cm 역상 분무 융합된 실리카 모세관 컬럼 상에서 수행하였다. 용리제 A(2% v/v ACN, 0.5% v/v 아세트산이 포함된 순수한 물) 및 B(0.5% v/v 아세트산이 포함된 20% v/v 순수한 물이 포함된 ACN)의 구배를 사용하여, 분리(0.15 ㎕/분 유속)(230분 이내에 10%로부터 35% B, 5분 이내에 35%로부터 50% B 및 30분 이내에 50%로부터 70% B)를 달성하였다. 질량 분광학적 분석을, 나노전기분무 이온 소스(Proxeon Biosystem)가 장착된 LTQ-Orbitrap 질량 분광계(Thermo Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 수행하였다. 풀 스캔 질량 스펙트럼을, 락-매스(lock-mass) 옵션 및 60,000으로 설정된 해상도를 이용하여 획득하였다. 각각의 시료에 대한 획득 질량 범위는 m/z 300 내지 1750 Da이었다. 이온 트랩에서 정상화된 충돌 에너지 37%를 사용하여 10개의 가장 강렬한 이중 및 삼중으로 하전된 이온을 선별하고 단편화하였다. MS/MS에 대해 이미 선별된 표적 이온을 120초 동안 동적으로 배제하였다. 모든 MS/MS 시료들을 Mascot(v.2.2.07, Matrix Science, London, UK) 검색 엔진을 사용하여 분석하여, UniProt_인간 완전 프로테옴_cp_hum_2013_12를 검색하였다. 검색은 트립신 특이성, 허용된 2개의 누락(missed) 절단, 고정된 변형으로서 시스테인 카르바미도메틸화, 단백질 N-말단에서의 아세틸화 및 가변 변형으로서 메티오닌의 산화를 이용하여 수행하였다. 질량 관용성(mass tolerance)은 전구체 및 단편 이온 각각에 대해 5 ppm 및 0.6 Da으로 설정하였다. 단백질을 정량화하기 위해, 원(raw) 데이터를 MaxQuant 소프트웨어 버전 1.3.0.5(Cox et al, 2011) 내로 로딩하였다. 표지-프리 단백질 정량화는 전구체의 세기를 기반으로 하였다. 펩타이드 및 단백질은 1개 단백질 당 최소 2개의 펩타이드인 1% 미만의 FDR인 것으로 허용되었다. 실험을 기술적으로 3회 중복하여 수행하였다. 프로테옴 분석(표 I-C)에 의해 수득된 단백질의 완전한 데이터세트를, MeV 소프트웨어 v. 4_8_1을 사용하는 스튜던츠 t-테스트에 의해 분석하였다. 대조군 풀 대 T1D-ESDR 풀에서 유의하게 상이한(p-값 < 0.01) 47개의 단백질을 추가로 계층적 군집분석 처리하였다.
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후보 단백질을 선별하기 위한 전략
장기 지속형 T1D 피험자 및 건강한 대조군에서 개별적으로 분리된 46개의 인자들 중에서, 본 발명자들은 우선, 2개의 그룹을 비교하는 데 있어서 LFQ 세기에서 보다 유의한 차이(p>0.005)를 가진 것들을 선별하여, 12개의 인자를 배제하였다(도 16). 다음, 본 발명자들은 당업계에 이미 보고된 연구 및 공개문헌을 검색함으로써, 변경된 인자가 장 장애 및/또는 당뇨병 발병과 연관이 있을 수 있는지의 여부를 평가하였다. 이로써 본 발명자들은 다른 12개의 인자를 배제할 수 있었다. 본 발명자들은 또한, 주로 림프성 구획(lymphoid compartment)과 관련이 있는 인자들을 배제하였다(n=5). 이로써, 본 발명자들은 17개의 인자를 선별하였다. 본 발명자들은 세포막 단백질을 배제하였고(n=4), 나머지(n=13)를 미니-소화관 검정법에서 시험하는 것을 진행하였다. 2개의 인자들은 시험관내에서 시험되기에 이용 가능하지 않았다. 본 발명자들은 총 n=11개의 단백질을 시험하였다.
동물 연구
C57BL/6(B6) 마우스를 미국 메인주 바 하버 소재의 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. 모든 마우스들을 하바드 의과 대학 동물 케어 및 사용 위원회에 의해 승인된 기관 가이드라인에 따라 잘 돌보고 사용하였다. 스트렙토조토신 주사(225 mg/kg, 복강내 투여됨; Sigma)에 의해 마우스에서 당뇨병을 유발하였다. 당뇨병은 3번의 연속적인 측정에서 250 mg/dL 초과의 혈당 수준으로서 정의되었다. 당뇨병성 장질환을 하기와 같이 평가하였다: 간략하게는, 안락사된 마우스로부터 전체 장을 적출하고, PBS로 씻어 내었다. 그런 다음, 결장의 극단부(extreme part)를 절단하고, 2개의 조각으로 나누었다. 1개의 결장 조직을 포르말린에 직접 담근 한편, 나머지 1개의 결장 조직을 세로방향으로 절단하여, 루멘 및 장 점막을 노출시킨 다음, 포르말린에 담갔다. 그런 다음, 조직을 파라핀 포매하고, H&E 및 면역염색을 위해 가공하였다. 또한, 결장 조직을 마찬가지로 절단하고, 결장 줄기세포의 단리를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Merlos-Suarez et al, 2011). 간략하게는, 결장을 2 mm ~ 4 mm 조각으로 절단하고, 단편을 30 mL 빙냉 PBS에서 세척하였다. 단편을, 예열된 20 mM EDTA-PBS를 함유하는 50 ml 튜브로 옮기고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 현탁된 조직을, 30 ml 냉각 PBS를 함유하는 튜브로 옮기고, 원심분리하였다. 크립트를 13 ml 냉각 DMEMF12에 재현탁하고, PBS로 세척한 다음, 37℃에서 트립신/DNAse 용액 5 ml 내지 10 ml에서 30분 동안 분해시켰다. 그런 다음, 크립트를 DMEMF12/EDTA에서 재현탁하고, 40 미크론 여과기에서 2회 여과한 다음, 세척하였다. 그런 다음 마지막으로, 크립트를 유동 배지(DMEM+FBS+EDTA)에 재현탁하고, 항-EphB2-APC (R&D), 마우스 항-CD45-PeRCP 및 마우스 항-CD11b-PE(BD Pharmigen)에 대해 염색하였다. 시료를 FACSCalibur Analyzer를 사용하여 진행시키고, FlowJo를 이용하여 데이터를 분석하였다. 조직의 일부를 또한, 스냅 동결(snap frozen)시키고, 트리졸에 보관하여, 하기 마커들에 대한 RT-PCR 연구를 수행하였다:
Figure 112018001241113-pct00016
마지막으로, 혈장 및 혈청을 수합하여, IGF-I(IGF-I ELISA 키트, R&D), IGFBP3(IGFBP3 ELISA 키트, R&D) 및 인슐린 수준(Mercodia 마우스 인슐린 ELISA 키트)의 분석을 수행하였다. 혈당을 8주 동안 1주에 2회 모니터링하여, 당뇨병 발병 및 영속성을 확인하였다.
통계학적 분석
데이터를 평균 및 평균의 표준 오차(SEM)로서 제시하고, 콜모고로우-스머노프(Kolmogorov-Smirnov) 테스트를 이용하여 정상 분포, 및 레벤(Levene) 테스트를 이용하여 변량의 균질성에 대해 시험하였다. 차이의 통계학적 유의성을 2-테일드 t-테스트 및 카이-제곱(χ2) 테스트를 이용하여 시험하였다. 2개의 그룹들 사이에서의 유의성을 2-테일드 언페어드 스튜던츠 t 테스트에 의해 확인하였다. 다중 비교를 위해, 본페로니(Bonferroni) 교정과 함께 ANOVA 테스트를 이용하였다. 모든 데이터들을 사회과학용 통계학적 패키지(SPSS®IBM®SPSS Inc., Chicago, IL)에 넣어, 분석하였다. GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 그래프를 만들었다. 모든 통계학적 테스트들을 5% 유의성 수준에서 수행하였다.
결과
장 기능 장애 및 임상적 징후는 장기 지속형 T1D에서 제시된다
본 발명자들은 우선, 장기 지속형 T1D 및 말기 신장 질환(T1D+ESRD)을 가진 개체 및 건강한 피험자(CTRL)의 집단에서 장 형태 및 기능을 특징화하였다. 중증 장 증상, 예컨대 설사, 복통 및 변비는 위장 증상 등급 척도(GSRS) 질문표를 사용하여 평가된 바와 같이 T1D+ESRD 개체에서 뚜렷하였다(도 1 : A-C). 증상들은 항문직장 괄약근 기능의 비정상과 연관이 있었다(도 1 : D-F). 장점막은 건강한 피험자와 비교하여 T1D+ESRD 개체에서 변경되었으며, 더 낮은 크립트의 수, 뒤틀림 및 점막 고유층의 구역적 경화증이 동반되었다(도 1 : G1-G2, H). Ki67(MIB1 항체) 염색에 의해 평가된 바와 같이 상피 세포 증식의 유의한 감소(도 1 : I1-I2, J), 신경 변성 징후(도 1 : K1-K2, L) 및 장 신경내분비 세포에서의 세로토닌 발현의 감소(도 1 : M1-M2, N)가 관찰되었으며, 이는 이들 개체에서 DE의 존재를 확인시켜 주었다.
CoSC는 장기 지속형 T1D에서 변경된다
결장 크립트의 특징화는, 건강한 피험자와 비교하여 T1D+ESRD 개체에서, 둘 다 국소 줄기세포의 마커인 EphB2+ 발현 및 알데하이드 데하이드로게나제(Aldh)+ 면역반응성 세포의 수의 유의함 감소를 보여주었다(Carpentino et al., 2009; Jung etal., 2011)(도 1: O1-O2, P, Q1-Q2, R). FACS 분석(도 8: A-C)에서 PI- 세포에 게이팅을 하였을 때, 건강한 피험자와 비교하여 T1D+ESRD 개체로부터 수득된 장 크립트로부터 단리된 EphB2hi, EphB2hi +LGR5+ 및 EphB2+h-TERT+세포의 퍼센트에서 엄청난 감소가 뚜렷하였고(도 2: A-B, C-E, 도 8: D-E), RT-PCR(도 2: F-H) 및 웨스턴 블롯(WB) 분석(도 8F)에 의해 확인되었다. T1D+ESRD로부터 수득된 크립트의 전사체 프로파일링은, 건강한 피험자에서, 이전에 CoSC를 조절하는 경로인 것으로 공지된 Notch 경로(Notch1 및 Notch2, JAG1, DIl1, Sox1 및 Sox2), Wnt 경로(APC, FZD1, DKC1, ETS2, FAM84A, GPX2, RNF43) 및 BMP 경로(BMP1, BMP2, BMP3) 유전자의 발현과 비교하여, 이들 유전자의 감소된 발현을 확인시켜 주었다(도 8G 및 표 II).
Figure 112018001241113-pct00017
- CoSC 시그너처 유전자의 분석은, LGR5, EphB2(Gracz et al., 2013; Merlos-Suarez et al., 2011), h-TERT(Breault et al., 2008) 및 다른 장 줄기세포 마커 유전자(Hughes et al., 2011; Munoz et al., 2012; Ziskin et al., 2013)가 건강한 피험자와 비교하여 T1D+ESRD에서 상당히 저발현되었음을 보여주었으며(도 21), 이는 CoSC가 DE 개체에서 변경됨을 확인시켜 준다.
시험관내에서의 미니-소화관의 생성은 장기 지속형 T1D에서 변경된다
CoSC 자가-재생 특성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 시험관내 미니-소화관 검정법을 사용하였다. 사실상, T1D+ESRD 개체로부터 단리되고 시험관내에서 8일 동안 배양된 크립트는 작은 구상형 미니-소화관을 형성하였으며, 이 소화관은 건강한 피험자와 비교하여, 2개 그룹 모두에서 유사한 생존 능력(도 8: H-I) 및 미니-소화관 형성 효율(도 8J)에도 불구하고, 성장에 실패하였다(도 2: Jl, J2, K). CoSC에 미치는 순환 인자 및 고농도 글루코스의 효과의 구현을 시작하기 위해, 본 발명자들은 건강한 피험자로부터 수득된 단리된 장 크립트를 시험관내 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득된 혈청과 함께/없이 고농도 글루코오스에서 8일 동안 배양하였다(도 2: L1-L4, M). 고농도 글루코스는 완전히 성숙한 미니-소화관의 생성을 부분적으로 방지하였으며, CoSC 자가-재생 특성을 변경시키는 데 있어서 장기 지속형 T1D 개체의 혈청과 상승작용을 하여, 미니-소화관은 붕괴되어 나타났다(도 2: L2-L4). 유전자 발현의 분석은 또한, CoSC 시그너처의 변화를 보여주었으며(도 2N), 따라서, 고혈당 및 순환 인자가 함께 장기 지속형 T1D에서 CoSC 재생 특성을 변경하는 작용을 함을 제시한다.
혈청 비편성 (unbiased) 프로테옴 프로파일링은 장기 지속형 T1D에서 IGFBP3 의 증가된 수준을 보여주었다
장친화성 호르몬으로서 역할을 할 수 있고 CoSC를 조절하는 데 있어서 역할을 가질 수 있는 잠재적인 순환 인자를 확인하기 위해, 본 발명자들은 비편성 프로테옴 어레이를 사용하여 건강한 피험자의 혈청 프로테옴을 T1D+ESRD 개체와 비교하였다. 건강한 피험자와 비교하여 T1D+ESRD 개체에서 명확한 프로테옴 프로파일이 분명하였으며, 검출된 단백질 중 50% 초과가 한 그룹 또는 다른 그룹에서 분리되었다(도 3A). 일부 단백질들은 당뇨병과 연관이 있었으며, 일부는 성장 인자 또는 줄기세포-관련 단백질이었거나 또는 잠재적으로는 장 기능에 관여하였다(도 3A). 특히, IGF-I 결합 단백질(IGFBP2 및 3)의 수준은 건강한 피험자와 비교하여 장기 지속형 T1D 개체에서 검출 가능하였으며, IGFBP3가 대략 5배 증가한 한편(도 3B), IGFBP1, 4, 5 및 6은 거의 검출 불가능한 채로 남아 있었다. 흥미롭게는, 장기 지속형 T1D 개체의 간에서, 쿠퍼 세포가 아닌 간세포는 건강한 피험자와 비교하여 더 높은 IGFBP3 면역조직화학 발현을 보여주었으며(도 3: C1-C2, 도 8: K, Ll-L6), 이는, 간세포의 IGFBP3 합성 및 방출 증가를 제시한다. 간에서의 IGFBP3 방출에 미치는 고농도 글루코스의 효과를, 고농도 글루코스에 노출된 인간 불멸화된 간세포의 상층액 내 증가된 IGFBP3 수준의 검출에 의해 확인하였다(도 3D). 마지막으로, 유리 IGF-I의 혈청 수준은 건강한 피험자와 비교하여 장기 지속형 T1D에서 상당히 감소된 것으로 나타났으며(도 3E), 이는, 순환하는 IGF-I 및 IGFBP3 수준이 장기 지속형 T1D에서 변경됨을 가리킨다.
말초 IGFBP3 및 IGF -I는 CoSC를 조절한다
CoSC 및 장 상피 증식의 조절에 있어서 순환하는 IGF-I 및 IGFBP3의 역할을 더 구현하기 위해, 본 발명자들은 RT-PCR 및 WB(도 3: F, H, 도 8M)를 사용하여 단리된 크립트(도 3: F, H, 도 8: M, N1-N2) 상에서의 IGF-IR 및 IGFBP3 수용체(TMEM219)의 발현을 입증하였으며, CoSC 상에서의 IGF-IR의 발현을 면역염색(도 8: N1-N2)을 이용하여 확인하였고, TMEM219의 발현을 인 시추 혼성화(도 3: G1-G2)를 이용하여 확인하였다. CoSC에 미치는 IGF-I 및 IGFBP3의 역할을 기계론적으로 확인하기 위해, 본 발명자들은 프로테옴 프로파일링에 의해 확인된 몇몇 분자들의 효과를 이들의 시험관내 미니-소화관 검정법에서 시험하였다. 잠재적인 표적을 선별하기 위한 발명자들의 전략은 보충 정보에 보고되어 있다. T1D+ESRD 개체로부터 수득된 장 시료로부터 생성된 심각하게 변경된 미니-소화관은 재조합 인간 IGF-I(IGF-I)를 배양 배지에 첨가함으로써 구제된 한편(도 3I), 재조합 인간 IGFBP3(IGFBP3)의 첨가는 IGF-I를 이용하여 관찰된 양성 효과를 없앴으며, 미니-소화관의 발달을 감소시키고, 붕괴되고 뒤틀린 오르가노이드의 형성을 증가시켰다(도 3I). 최근에 IGFBP3이 IGFBP3 수용체(TMEM219)(Baxter, 2013)를 통해 IGF-I과 독립적으로 작용하는 것으로 나타났기 때문에(Williams et al., 2007), IGFBP3이 IGF-I에 결합함으로써 또는 CoSC 상의 TMEM219를 직접 표적화함으로써 CoSC 상에서 이러한 IGFBP3의 효과를 발휘하는지의 여부를 명확하게 하는 것이 필수적이었다. 본 발명자들은 우선, 건강한 피험자 및 장기 지속형 T1D 개체로부터 수득되고 IGFBP3와 함께 배양된 미니-소화관에서 증가된 카스파제 8 및 카스파제 9 발현(도 3J, 도 9: A-B), 및 한편으로는 Pan-카스파제 저해제(Z-VAD-FMK)의 첨가, 또는 다른 카스파제 캐스케이드 저해제(카스파제 3 저해제)가 아닌 카스파제 8 및 카스파제 9 둘 다의 선택적 저해제의 첨가는 IGFBP3 효과를 없앴음(도 3K)을 입증함으로써 IGFBP3이 CoSC 상에서 직접적인 프로아폽토틱 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 그런 다음, 본 발명자들은, IGF-I의 첨가가 건강한 피험자로부터 수득되고 IGFBP3에 노출된 미니-소화관의 발달을 구제하지 못하였음을 언급하였으며(도 3L), 이는, IGFBP3이 직접적인 및 간접적인 IGF-I 메커니즘 둘 다를 통해 작용할 수 있음을 확인시켜 준다. 흥미롭게는, 고농도 글루코스 단독으로는 미니-소화관 성장을 완전히 붕괴할 수는 없었으며, 항-IGF-IR은 건강한 피험자로부터 형성된 미니-소화관의 성장 및 형태를 악화시키지 않았다(도 3L). 건강한 피험자로부터 생성되었으나 고농도 글루코스 및 장기 지속형 T1D 개체 유래의 혈청과 함께 배양된 미니-소화관에 IGF-I을 첨가하는 것은 미니-소화관 형태를 구제한 한편, IGFBP3은 미니-소화관 배양물에 첨가되었을 때 IGF-I의 양성 효과를 없앴다(도 3L). 흥미롭게는, 장기 지속형 T1D로부터 수득된 크립트를 배양하는 데에 건강한 피험자 "CTRL" 혈청을 사용하는 것은 미니-소화관 발달/형태를 거의 복구하였으며, 이는 순환 인자, 특히 IGF-I/IGFBP3 다이아드가 CoSC를 조절함을 가리킨다(도 9: C-D). 그런 다음, 본 발명자들은 시험관내에서 건강한 피험자로부터 수득된 미니-소화관에 siRNA를 사용함으로써 TMEM219 발현을 유전적으로 조정하였다. 미니-소화관에서 TMEM219들의 넉다운은, 장기 지속형 T1D 혈청과 함께 IGFBP3 및 고농도 글루코스의 첨가에도 불구하고 이들 TMEM219의 성장 및 자가-재생 능력을 보존하였다(도 3M). SiRNA에 의한 TMEM219의 수반되는 차단 및 블라킹 항체에 의한 IGF-IR의 수반되는 차단은 건강한 피험자 또는 장기 지속형 T1D 유래의 혈청의 사용에도 불구하고 미니-소화관 발달에 임의의 부가적인 유익 효과를 가져오지 않았다(도 9E).
장기 지속형 T1D 개체의 혈청 프로테옴에서 변경된 것으로 나타난 다른 순환하는 단백질들을 시험관내 미니-소화관검정법에서 시험하였으며, 이들 단백질은 미니-소화관 성장에 임의의 유의한 효과를 보여주지 않았다(도 9: F-G). C-펩타이드 및 인슐린은, 이들의 수준이 T1D에서 보편적으로 변경되며, IGF-IR에 결합함으로써 IGF-I/IGFBP3 다이아드를 방해할 수 있어서(도 9h), 마찬가지로 이들을 시험하였으나, 임의의 효과를 보여주지 않았다.
IGF-I/IGFBP3 다이아드가 크립트만이 아닌 CoSC를 효과적으로 표적화하는지 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 단일 세포-유래 미니-소화관 상에서 이의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 단리된 크립트로부터 EphB2+ 세포를 유세포 소팅하였으며, TMEM219가 이러한 세포의 표면 상에서 고도로 발현되었음을 규명하였다(도 4A). 그런 다음, 본 발명자들은 시험관내 단일 세포-유래 미니-소화관 검정법에서 EphB2+ 세포를 배양하였으며, 고농도 글루코스 및 장기 지속형 T1D 혈청 노출뿐만 아니라 IGFBP3의 첨가가 단일 세포-유래 미니-소화관 성장을 상당히 없애고, 따라서 크립트-유래 미니-소화관에서의 이들의 이전의 관찰에서 보고된 주요 특징들을 반복함을 확인하였다(도 4B, 도 10: A1-A3). 더욱이, 카스파제 8 및 카스파제 9의 발현이 IGFBP3-처리 미니-소화관, 및 고농도 글루코스 및 장기 지속형 T1D 혈청에 노출된 미니-소화관에서 상향조절된 한편, 증식 마커인 Ki67은 상당히 저발현되었다(도 10: B-D).
CoSC를 조절하는 이전에 공지된 경로에 미치는 IGF-I/IGFBP3 다이아드의 효과
이전에 CoSC 적소 기능에 관여하는 것으로 이전에 공지된 경로(즉, Wnt/Notch/BMP)에 미치는 IGF-I/IGFBP3 다이아드의 효과를 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 이들의 줄기세포 전사체 프로파일로부터 적소 특이적 유전자 전사체의 발현을 수득하였다. IGF-I은 T1D+ESRD의 크립트로부터 수득된 미니-소화관 상에서 Wnt/Notch 신호전달 경로와 연관된 일부 인자들의 발현을 상당히 복구한 한편(도 10E, 표 III), IGFBP3은 건강한 피험자 또는 T1D+ESRD 개체의 크립트로부터 수득된 미니-소화관에서 Wnt/Notch/BMP 유전자 발현에 불량한 영향을 미친다(도 10F, 표 III).
Figure 112018001241113-pct00018
이는, IGF-I이 Wnt/Notch/BMP 신호전달에 관여하는 일부 유전자의 발현을 보존할 뿐만 아니라, IGFBP3이 이전에 공지된 다른 경로의 주요-표적 유전자의 발현에서의 주요한 변경 없이 CoSC에 대해 독립적으로 작용함을 확인시켜 준다.
CoSC에서 세포자멸사 경로에 미치는 IGF/IGFBP3 다이아드의 효과
미니-소화관에 미치는 IGFBP3 카스파제-매개 효과(도 4: C-D, 도 10: G-H, 표 IV)를 명확하게 하기 위해 수행된 광범위한 전사체 분석은, 건강한 피험자 크립트로부터 성장된 미니-소화관에의 IGFBP3의 첨가가 카스파제-캐스케이드 활성화제(카스파제 8 및 카스파제 9) 및 프로아폽토틱 유전자의 상당한 상향조절과 연관이 있었으며, 한편 항-세포자멸사 유전자 Bcl2는 하향조절되었음을 보여주었다(도 4C).
Figure 112018001241113-pct00019
흥미롭게는, 항-세포자멸사 유전자(Bcl2, Fas, Nol3)는 건강한 피험자와 비교하여 T1D+ESRD 크립트로부터 성장된 미니-소화관에서도 상당히 저발현되었으며, 한편 대부분의 카스파제 관련 유전자들(카스파제 1, 5, 7, 8, 9, 14)은 과발현되었다(도 10G). 더욱이, 다른 프로아폽토틱 경로에 관여하는 유전자의 발현은 T1D+ESRD 미니-소화관에서 변경되지 않거나(즉, Fas 리간드, FADD, TNF), 또는 저해되지 않았다(TRADD). IGF-I을 첨가함으로써 반대 효과가 관찰되었다(도 4D, 도 10H). 산화 스트레스 표적 유전자의 발현에서의 변경의 부재(표 V) 및 산화 스트레스 인자의 임의의 효과의 부재(도 10: I-J)는, 순환하는 IGFBP3이 CoSC를 직접적으로 조절하는 주요 세포자멸사-관련 카스파제-매개 IGFBP3 메커니즘을 확인시켜 주었다(도 4E).
Figure 112018001241113-pct00020
순환하는 IGF -I/ IGFBP3 다이아드의 조작은 예비임상 모델에서 당뇨병성 장질환의 경로를 변경시킨다
생체내에서 IGF-I/IGFBP3 순환 인자의 관련성을 더 알아보기 위해, 본 발명자들은 DE의 예비임상 모델에서 IGF-I 및 IGFBP3 투여의 효과를 시험하였다. (스트렙토조토신 [STZ]을 사용하여) 화학적으로-유도된 당뇨병의 8주 후, C57BL/6(B6) 마우스는 결장직장 조직에서 감소된 크립트 수를 보여주었으며(도 4F), 이는 경우의 70% 초과에서 증가된 깊이 및 폭(도 4: G, H-H2, I) 및 감소된 Aldh+ 세포 수(도 4: J, K1-K2)를 보여주었다. 흥미롭게는, 이들 마우스는 IGFBP3의 나이브 B6와 비교하여 더 낮은 뮤린 인슐린 수준과 함께, 증가된 혈청 수준 및 IGF-I의 낮은 수준을 보여주었다(도 11: A-C). 나이브 B6 마우스에서 IGFBP3의 복강내(i.p.) 투여는 국소 크립트 수의 감소를 초래하였으며(도 4: F, H3), 대부분의 크립트는 비처리된 마우스와 비교하여 증가된 깊이 및 폭(도 4: G, G3, I), 및 Aldh+ 세포의 상당한 감소(도 4: J, K3)를 보여주었다. 이들 특징은, 체중 감소(도 11J), CoSC 손실(도 11: J-l) 및 카스파제 8 및 카스파제 9의 상향조절된 발현(도 11: M-N)의 증거와 함께, STZ-처리 B6 마우스에게의 IGFBP3 투여에 의해 악화되었다(도 11: D-G, H1-H2). STZ-처리 B6 마우스에게 IGF-I를 복강내 투여하는 것은 점막 형태를 단지 부분적으로 개선하였으며, 정상 크립트의 수를 증가시켰으며 이는 비정상으로 남아 있으며(도 11D), Aldh+ 세포의 수를 단지 부분적으로 복구하였다(도 11: G, H1-H2).
동시적인 췌장-신장 이식(SPK)을 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 DE의 임상적 특징 및 형태학적 특징을 되돌린다
장기 지속형 T1D에 대한 최적 표준 치료는 SPK이며, 이러한 치료는 안정한 당대사 조절을 제공하며, 위험 인자를 거의 정상화시키고, 생존율을 연장시킨다(표 VI)(Fiorina et al., 2004; Fiorina et al, 2005; Folli et al, 2010; Secchi et al, 1998; Smets et al., 1999).
Figure 112018001241113-pct00021
그러나, T1D+ESRD 개체는 또한 신장 이식 단독으로도 치료되나, 당뇨병(K+T1D)은 여전하다(Fiorina et al., 2001). 이식된 개체의 본 발명자들의 코호트에서 SPK 후 시간 경과에 따른 위장 증상의 상당한 개선이 명백한 한편, K+T1D 그룹에서는 임의의 이득이 보고되지 않았으며(도 12: A-C), 이는 DE가 원상회복이 가능함을 제시한다.
SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 장점막 형태 및 국소 자가-재생 특성을 재구축한다
장점막 시료의 분석은, SPK 그룹에서 보상적인 상피 과형성과 함께 상피 구획의 구조의 상당한 회복을 보여주었다(도 12: D1-D2). 정상 크립트 조직 및 수의 회복은, 장기 지속형 T1D가 성공적으로 치료되었을 때 SPK 그룹에서 명백하였으며, 한편 이들 특징 중 어느 것도 신장 이식만을 받은 개체에서는 명백하지 않았고 당뇨병은 여전하였다(도 12: D1-D2). 상피 세포 증식(MIB1+세포)은 SPK 후 각각의 시점에서, 기준선 및 K+T1D과 비교하여 시간 경과에 따라 증가하였으며(도 4: L, M1-M2), 장 형태, 상피 재생 및 신경 특징은 거의 정상화되었다(도 12: E1-E2, F, G1-G2, H-I, J1-J2, K). 이는, SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료가 장 상피 복구 및 자가-재생 특성의 회복을 촉진하였음을 나타낸다.
장기 지속형 T1D의 치료는 CoSC의 복구를 촉진한다
SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 장 크립트에서 Aldh+ 세포(도 4: N, O1-O2) 및 EphB2+ 발현(도 4: P, Q1-Q2)의 증가와 연관이 있고, 단리된 장 크립트에서 기준선과 비교하여 EphB2hi +, EphB2+hTERT+ 및 EphB2hi +LGR5+ 세포의 퍼센트를 거의 정상화시킨다(도 5: A-C). SPK 개체로부터 수득된 미니-소화관의 CoSC 마커 발현(도 5: D-G) 및 성장/형태 또한 거의 정상화되었다(도 5H, 도 13: A1-A6). 전사체 분석은, SPK가 줄기세포 및 CoSC 마커, 및 CoSC의 보존에 관여하는 경로의 발현이 거의 복구되었음을 보여주었다(도 5I, 도 13B, 표 VII).
Figure 112018001241113-pct00022
SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 CoSC의 복구를 촉진하는 것으로 결론내려진다.
SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 순환하는 IGF -I 및 IGFBP3을 복구한다
광범위한 프로테옴 분석 및 표적화된 면역검정법은, SPK 후 IGFBP3 및 IGF-I 혈청 수준의 거의 정상화(도 5: J-K)와 함께 IGF-IR의 거의 재구축된 발현(도 13C)을 보여주었다. 이들 결과는, 낮은 수준의 IGF-I(도 5j) 및 IGF-IR 발현(도 13c) 및 이들의 IGFBP 프로파일에서 단지 부분적인 회복(도 13C)을 보여준 K+T1D 그룹에서는 분명하지 않았다. SPK 그룹 및 K+T1D 그룹 둘 다에서 IGFBP3 혈청 수준과 장 증상 사이의 유의한 상관관계는, K+T1D 그룹에서 더 명확하긴 하지만, IGFBP3 수준의 회복이 당뇨병성 장질환의 개선과 연관이 있음을 확인시켜 주었다(도 5: L-M, 도 14: A-G). SPK를 이용한 장기 지속형 T1D의 치료는 순환하는 IGF-I/IGFBP3 다이아드의 글루코스-연관 복구를 통해 당뇨병성 장질환을 개선한다.
엑토 - TMEM219 재조합 단백질은 DE의 뮤린 모델에서 시험관내 IGFB P3-매개 미니-소화관 파괴를 없애고, 생체내에서 CoSC를 보존한다.
CoSC에 미치는 IGFBP3-매개 유해 효과를 더 입증하기 위해, 본 발명자들은 TMEM219 세포외 도메인(엑토-TMEM21)을 기반으로 하는 재조합 단백질을 생성하였다. CTRL로부터 수득되고 IGFBP3와 함께 배양된 크립트에 엑토-TMEM219(IGFBP3과 2:1의 몰비를 가짐)를 첨가하면, 미니-소화관에 미치는 IGFBP3의 프로아폽토틱 효과가 없어졌으며, 미니-소화관을 생성하는 크립트의 재생 특성이 보존되었다(도 6A). CoSC 시그너처 마커, EphB2 및 LGR5의 발현은 IGFBP3 및 엑토-TMEM219와 함께 배양된 미니-소화관에서 상당히 회복되었으며, 이는 CoSC를 보존하는 데 있어서의 선호할 만한 효과를 강조하며(도 6B), 이는 또한, 고농도 글루코스-배양된 미니-소화관에서도 확인되었다(도 6A). 더욱이, RT-PCR에 의한 카스파제 8 및 카스파제 9의 분석은, 엑토-TMEM219가 IGFBP3-배양된 미니-소화관에 첨가되었을 때 IGFBP3 단독과 비교하여 이들의 발현의 순 감소(net decrease)를 나타내었다(도 6: C-D). 그런 다음, 본 발명자들은 STZ-B6 마우스를 엑토-TMEM219로 처리하였으며, 크립트의 수, 깊이 및 폭의 회복과 함께 개선된 점막 형태를 관찰하였다(도 6: E, F, G). 엑토-TMEM219의 투여는 STZ-처리 B6과 비교하여 마우스 체중의 증가(도 6H), CoSC의 상당한 재획득(도 6: I-K), 카스파제 8 및 카스파제 9의 감소된 발현(도 6: L-M) 및 순환하는 IGFBP3 수준의 재구축(도 6N)과 연관이 있었다.
고찰
당뇨병성 장질환은 삶의 질 저하, 영양실조 및 흡수불량과 연관이 있기 때문에 T1D 개체에서 임상적으로 관련된 합병증을 나타낸다(Bytzer et al., 2002; Faraj et al, 2007; Talley et al., 2001). 특히, 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)에서, 장 장애는 고 빈도 및 중증도로 발생하여(Cano et al., 2007; Wu et al, 2004), 체질량 손실 및 악액질을 초래하고(Pupim et al., 2005), 이는, 장질환이 장기 지속형 T1D의 중요한 합병증임을 가리킨다(Atkinson et al., 2013; Pambianco et al., 2006). 본 발명자들의 결과는, 장기 지속형 T1D 개체가 중증 장 장애를 경험하였으며(표 VIII), 이들 임상적 상태가 장점막의 변경, 장 상피 세포의 증식의 감소 및 신경 퇴행 징후와 연관이 있음을 나타낸다.
Figure 112018001241113-pct00023
유사한 특징들은 T1D 및 DE의 설치류 모델에서도 보고된 바 있다(Domenech et al, 2011). 처음으로 본 발명자들의 데이터는 DE를 CoSC의 결함과 연결짓고, IGFBP3가 장 상피 항상성의 유지에 있어서 중요한 역할을 가진 것을 시사한다. 고혈당이 T1D의 우세한 특징이긴 하지만, 본 발명자들의 시험관내 연구는, 이러한 특징이 DE를 완전히 설명할 수 없으며 순환 인자가 중요한 역할을 할 수 있음을 제시한다. 프로테옴 분석은 CoSC의 항상성에 관여하는 장친화성 인자로서 IGF-I를 확인하게 하였다. 그런 다음, 본 발명자들은, IGF-I 및 IGFBP3이 CoSC를 조절하고, 이러한 축이 장기 지속형 T1D에서 기능 장애임을 확인하였다. 본 발명자들의 데이터는, IGF-I이, 크립트 성장을 촉진하고 IGF-IR을 통해 CoSC를 조절하는 순환하는 장친화성 인자로서 역할을 하는 한편, IGFBP3이 순환하는 IGF-I에 결합하고 이의 생체이용률을 감소시킴으로써 IGF-I 신호전달을 차단할 수 있음을 가리킨다. 또한 가장 중요하게는, 본 발명자들은, IGFBP3이, 본 발명자들이 TMEM219(IGFBP3 수용체)를 발현한다고 입증한 CoSC 상에서 프로아폽토틱 IGF-I-독립적 메커니즘을 통해 작용하여, 미니-소화관 성장의 실패를 유도함을 보여주었다. 이러한 미니-소화관 성장 실패의 유도 효과는 카스파제 8 및 카스파제 9-매개 및 TMEM219-의존적이고; 사실상, CoSC 상에서의 IGFBP3 수용체(TMEM219)의 부재는 고농도 글루코스-연관 CoSC 손상을 크게 저하시켰다. 기아 및 악액질과 함께 T1D는, 간의 IGF-I 방출의 감소로 인해, 순환하는 IGF-I의 낮은 수준을 특징으로 하며(Bondy et al., 1994; Giustina et al., 2014), 이는 내인성 인슐린에 의해 조절되고 자극된다(Le Roith, 1997; Sridhar and Goodwin, 2009). 보다 중요하게는, 고혈당은 간의 IGFBP3 합성 및 방출에 직접적인 효과를 가지는 것으로 나타났다. 따라서, IGFBP3은 고혈당 동안 장 흡수 능력을 감소시키는 간 호르몬으로서 작용할 수 있다. 흥미롭게는, SPK는, CoSC를 조절하는 순환 인자의 존재와 관련하여 본 발명자들의 가설에 대한 개념의 증거를 제공하였으며, 그들의 발견을 지지하였다. 본 발명자들이 이들의 연구에서 관찰한 DE의 임상적 특징 및 기능적 특징의 놀라운 개선은 CoSC의 보충 및 순환하는 IGF-I 및 IGFBP3의 복구와 연관이 있었으며, 본 발명자들의 가설을 보강한다. 마지막으로, 새로 생성된 엑토-TMEM219 재조합 단백질은 생체내에서 당뇨병 마우스에서 DE를 개선하였고, 시험관내에서 미니-소화관의 정상 성장 능력을 복구하였으며, 따라서 CoSC를 조절하고 신규 잠재적인 치료 전략 방식을 다듬는 데 있어서 IGFBP3의 역할을 확인시켜 주었다. 요약하자면, 본 발명자들의 연구는, 고혈당과 연관된 CoSC의 IGFBP3-매개 교란이 DE에서 분명함을 보여준다. 본 발명자들은, 순환하는 IGF-I/IGFBP3이, CoSC를 조절하는 호르몬 다이아드, 및 장 장애, 특히 장기간의 당뇨병에 의해 유발된 장 장애를 앓고 있는 개체에 대한 신규 치료 표적을 나타냄을 제시한다(Bondy et al., 1994; Bortvedt and Lund, 2012; Boucher et al., 2010).
실시예 2
재료 및 방법
환자 및 연구 설계
(연령 41세 내지 43세), 성별 및 T1D 기간(29.4±1.8년)에 일치하는, 동시적인 췌장-신장 이식(SPK)을 위한 대기 명단에 등록된 60명의 T1D+ESRD 개체를 연구에 등록하였다. 10년 내지 20년 동안 1형 당뇨병(T1D)을 앓고 있는 20명의 피험자를 또한 등록하였다. 정상 신기능 및 정상 당대사 파라미터를 가지며 연령 및 성별이 일치하는 20명의 건강한 피험자(CTRL) 또한 연구하였다. T1D+ESRD 피험자들은 모두 연구에 등록 시 집중적인 인슐린 치료를 받은 한편, CTRL 그룹은 임의의 약제를 투여받지 않았다. 모든 T1D+ESRD 피험자들은 항혈소판 요법(ASA) 및 항고혈압제(안지오텐신-전환-효소 저해제)와 동일한 치료를 받은 한편, 60명 중 40명은 연구에 등록되었을 때 스타틴을 수여받았다. 염증성 장 질환뿐만 아니라 소아 지방변증의 명확한 징후가 있는 피험자는 등록하지 않았다.
이식 시 거시적인 외과적 평가에 따라 SPK(n=30) 또는 K+T1D(n=30) 이식한 후, T1D+ESRD 개체를 8년 동안 추적조사하였다(평균 추적 조사: 8.6±1.1년). 경구 항응고제를 복용한 개체는 포함시키지 않았다. SPK 개체들은 모두 전체 추적조사 기간 동안 인슐린-독립적인 반면, K+T1D 개체는 집중적인 피하 인슐린 요법을 받았다. 모든 피험자들은 연구 등록 전에 정보에 근거한 동의를 제공하였다. 일상적인 임상적 추적조사에 포함되지 않은 연구는 적절한 의학연구윤리심의위원회 승인에 의해 커버되었다(Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina).
소변 및 혈청에서의 IGFBP3 평가
혈청을, 신선한 혈액 3 ml로부터 원심분리 후 수합하였다. 소변 시료를 신선하게 수집하고, 원심분리하고, -80℃에 보관하였다. 모든 그룹의 피험자들의 IGFBP3 수준을 혈청 및 소변의 동결된 시료에서, 상업적으로 입수 가능한 ELISA 키트를 제조업체(R&D)의 지시에 따라 사용하여 평가하였다.
통계학적 분석
상관관계 분석 및 그래프를 Prism Graphpad 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 상관관계 분석은 평가된 개체의 혈청 대(vs) 소변에서 IGFBP3 수준, IGFBP3 혈청 수준 대 추정된 사구체 여과율(eGFR)의 평가를 포함하였다. p 값이 0.05 미만일 때, 통계학적 유의성이 고려되었다.
신기능 및 당대사 파라미터의 측정
MDRD 식을 사용하여, 추정된 사구체 여과율(eGFR)을 ml/min/m2로서 평가하였다. 혈액 시험은, CTRL을 T1D 개체 및 장기 지속형 T1D 개체(T1D+ESRD)와 비교하는 데 초점을 둔 연구에 등록된 모든 피험자들에서 크레아틴, 혈당, 글리케이트화된 헤모글로빈의 평가를 포함하였다.
결과
혈청 IGFBP3 수준은 소변 IGFBP3 수준과 상관관계가 있다
연구에 등록된 모든 피험자들에서 IGFBP3의 혈청 및 소변 수준의 분석은 CTRL와 비교하여 T1D+ESRD 피험자에서 IGFBP3의 혈청(도 7A) 및 소변(도 7B) 수준 둘 다 상당한 증가를 보여주었으며 T1D 개체와 비교할 때 더 적은 정도로 증가하였다. IGFBP3의 소변 수준과 혈청 수준 사이의 유의한 상관관계를 평가된 모든 피험자들에서 관찰하였다(도 7C). 더 높은 수준의 혈청 IGFBP3은 더 높은 수준의 소변 IGFBP3과 상관관계가 있다. 이것이 신기능과 관련이 있을 것임을 배제하기 위해, IGFBP3 혈청 수준과 신기능(eGFR) 사이의 상관관계를 수행하였다. IGFBP3 혈청 수준은 ESRD 피험자에서 상당히 더 높았다(eGFR < 15 ml/min/m2)(도 7D). 그러나, T1D의 존재 및 병력과는 상관없이, eGFR이 15 ml/min/m2 초과이어서 ESRD에 의해 영향을 받지 않는 피험자는 eGFR과 IGFBP3 혈청 수준 사이에서 임의의 통계학적으로 유의한 상관관계를 보여주지 않았다(도 7E). CTRL에서의 소변 IGFBP3 대 혈청 IGFBP3 수준 사이의 상관관계를 고려하고 이들의 평균 및 중앙값을 25° 및 75° 백분위 내에서 비교하여, 본 발명자들은 소변 IGFBP3에 대한 범위를 하기와 같이 설정할 수 있다:
350 pg/ml 미만: 정상 수준(건강한 피험자에서 관찰되는 수준)
350 pg/ml ~ 500 pg/ml: 변경된 수준(5년 미만의 질병 이력을 가진 T1D에서 관찰되는 수준)
500 pg/ml 초과: 장질환을 가리킴(T1D 병력이 5년 초과인 장기 지속형 T1D, 다른 T1D 합병증을 가진 T1D 피험자에서 관찰되는 수준).
본 발명자들은 또한, 도 7F에서 회색 영역으로 표시된 바와 같이, 소변 IGFBP3 수준과 혈청 IGFBP3 수준의 상관관계를 고려함으로써 소변 IGFBP3 수준의 정상 범위(350 pg/ml 미만)를 확인할 수 있다.
실시예 3
장기간(5년 초과)의 염증성 장 질환(IBD)을 앓고 있는 5명의 개체를 등록하였으며, 당뇨병 시료의 분석에 대해 상기 기재된 바와 동일한 방법에 따라 IGFBP3 및 IGF-1의 말초 수준 및 IGFBP-3/IGF-1의 비율을 스크리닝하였다.
IGFBP3이 약간 증가된 한편, IGFI의 수준은 IGFBP3/IGF1 비율의 전반적인 변경과 함께 심각하게 감소되었음을 확인하였다(도 18). 따라서, 염증성 장 질환에서, 다량의 IGFBP3가 유리되어 장 줄기세포에 IGFBP3의 독성 효과를 발휘할 수 있다.
결과적으로, IGFBP3의 저해제는 또한, 염증성 장 질환의 치료 및/또는 예방에 유익하다.
참조문헌
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Figure 112018001241113-pct00025
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Claims (18)

  1. 저해제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 흡수불량 증후군, 과민성 장 질환, 염증성 장 질환, 악액질, 당뇨병성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 저해제가 IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해 또는 차단하거나, 또는 상기 저해제가 IGFBP3 기능을 저해 또는 차단하는 저해제로서, 상기 저해제가 수용체 TMEM219의 단편이고, 상기 단편은 하기 서열번호 2의 서열로 이루어지는, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
    Figure 112019052599420-pct00044
  2. 제1항에 있어서,
    상기 저해제가 하기 서열번호 2로 이루어진 엑토-TMEM219인, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
    Figure 112019052599420-pct00045
  3. 제2항에 있어서,
    상기 저해제가 페길화된, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 저해제가 Fc-기반 융합 단백질인, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  5. 저해제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 흡수불량 증후군, 과민성 장 질환, 염증성 장 질환, 악액질, 당뇨병성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 저해제가 IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해 또는 차단하거나, 또는 상기 저해제가 IGFBP3 기능을 저해 또는 차단하는 차단하는 저해제로서, 상기 저해제가 수용체 TMEM219의 단편 또는 엑토-TMEM219를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 단편 또는 엑토-TMEM219는 하기 서열번호 2의 서열로 이루어지는, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
    Figure 112019052599420-pct00046
  6. 저해제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 흡수불량 증후군, 과민성 장 질환, 염증성 장 질환, 악액질, 당뇨병성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 저해제가 IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해 또는 차단하거나, 또는 상기 저해제가 IGFBP3 기능을 저해 또는 차단하는 차단하는 저해제로서, 상기 저해제가 수용체 TMEM219의 단편 또는 엑토-TMEM219를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 발현하는 벡터이고, 상기 단편 또는 엑토-TMEM219는 하기 서열번호 2의 서열로 이루어지는, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
    Figure 112019052599420-pct00047
  7. 저해제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 흡수불량 증후군, 과민성 장 질환, 염증성 장 질환, 악액질, 당뇨병성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 저해제가 IGFBP3과 이의 수용체 TMEM219의 상호작용을 저해 또는 차단하거나, 또는 상기 저해제가 IGFBP3 기능을 저해 또는 차단하는 차단하는 저해제로서, 상기 저해제가 수용체 TMEM219의 단편, 또는 엑토(ecto)-TMEM219, 또는 수용체 TMEM219의 단편 또는 엑토-TMEM219를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포이고, 상기 단편 또는 엑토-TMEM219는 하기 서열번호 2의 서열로 이루어지는, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
    Figure 112019052599420-pct00048
  8. 제1항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 장 장애가 당뇨병성 장질환 또는 염증성 장 질환인, 장 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  9. 제1항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 치료제를 더 포함하며,
    상기 치료제가 항당뇨병제, 통증 완화제, 항염증제, 코티코스테로이드, 면역억제 치료제, TNF-알파 차단제, 항생제, 프로바이오틱스, 인테그린 알파 저해제, 설사용 약제, 인슐린 요법, 안지오텐신-전환 효소 저해제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 항응고제 및 혈소판 항응집제, 콜레스테롤-저하 약물, 혈압 강하제, 항당뇨병제, DPP-4 저해제, GLP-1 수용체 작용제, SGLT2 저해제 또는 인테그린 저해제인, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 치료제가 아미노살리실-유도체, 아조티오프린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 나탈리주맙, 베돌리주맙, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세트롤리주맙, 골리무맙, 메트로니다졸, 시프로플록사신, 인슐린 요법, 프람린타이드, 아스피린, 메트포르민, 설포닐우레아, 메글리티나이드, 라파글리나이드, 나테글리나이드, 티아졸리딘디온, 시타글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 엑세나타이드, 리라글루타이드, 카나글리플로진 및 다파글리플로진으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
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