KR102136695B1

KR102136695B1 - 현장 진단용 장치를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법

Info

Publication number: KR102136695B1
Application number: KR1020180098022A
Authority: KR
Inventors: 신용; 이은영; 조비
Original assignee: 주식회사 인퓨전텍
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2038-08-22
Also published as: CN112639095A; JP2021534751A; EP3842533A4; KR20200022188A; WO2020040577A1; EP3842533A1; US20210214718A1

Abstract

본 발명은 아민으로 기능화된 규조토 및 가교제로서 디메틸 수베르이미데이트를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법에 관한 것으로, 음전하를 띠는 병원체는 상기 가교제에 의해 양전하를 띠는 규조토 표면에 전기적으로 흡수되고, 세포 용해 후 방출된 핵산은 규조토의 아민기와 가역적 가교결합을 통해 규조토 상에 고정되어 분리될 수 있다. 상기 방법은 특별한 장비 및 전기(전력)의 사용 없이 일체형 장치로 동시에 병원체 농축 및 핵산 추출이 가능하여 현장 진단 방법으로 활용될 수 있으며, 종래 방법보다 시간 및 비용 절감이 우수하고, 추출된 핵산은 질병의 진단 및 치료에 유용하게 활용될 수 있는 이점이 있다.

Description

현장 진단용 장치를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법{Method for pathogen enrichment and nucleic acid extract using device for point of care testing}

본 발명은 현장 진단용 장치를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법에 관한 것이다.

병원체 진단은 전 세계적인 건강 문제, 특히 중앙 집중화 실험실 기술과 같이 자원 제한된 환경에서 매우 중요하다. 현재까지 세포 배양, 혈액 화학, 유세포분석, 면역측정법, 핵산 검사(nucleic acid testing; NAT)와 같은 다양한 방법들이 병원체 진단을 위해 개발되었으며, 이중 세포 배양은 임상 진단에 많이 사용되고 있으나 시간이 많이 소요되는 절차, 고비용, 종 특이 프로토콜, 실험실 환경 및 장비를 필요로 하는 단점이 있다. 반면, 핵산 검사는 잠복기(window period) 진단, 면역변이 바이러스 검출 및 면역침묵(immunosilent/occult) 감염 동정 등 진단 검사를 위한 응용뿐만 아니라 프로토콜이 상대적으로 빠르고 보편적인 장점을 가지고 있어 관심이 증대되고 있다. 그러나 기존의 핵산 검사 기반의 분석은 상업적으로 이용 가능한 제품 및 실험실에서 개발한 분석법 모두 일반적으로 복잡하다는 단점이 있다. 따라서 숙련된 기술자, 특정 장비 및 다중 단계와 같이, 실험실 기반 작업을 필요로 하는 복잡한 전처리가 요구된다. 이러한 요구 때문에 현장 진단 검사(point of care testing; POCT)에서 핵산 검사의 사용이 제한되고 있다.

핵산 검사를 기반으로 하는 현장 진단 분석법은 시료 준비, 주형 증폭(template amplification) 및 신호 검출의 3가지 주요 측면을 포함한다. 핵산 검사를 기반으로 하는 현장 진단 분석법을 개선하기 위한 방법으로 간단하고 효과적인 증폭 및 검출 부분에 중점을 둔 연구들이 수행되었으나, 초기 시료 준비 단계에 중점을 둔 연구들 또한 수행된 바 있다. 시료에서 직접적으로 증폭될 수 있으며, 많은 추출을 필요로 하지 않는 핵산 기반의 현장 진단 분석법이 개발되었으나 낮은 민감도 및 고비용으로 여전히 제한적이다. 고품질의 핵산은 모든 하위 분석의 기초이기 때문에 생물학적 기질로부터의 핵산 추출 및 화학적 억제제 제거를 포함하는 시료 준비가 매우 중요하다. 특히, 이 단계는 무균 실험실에서 자원 제한 환경으로의 경계를 제거하기 위해 실험실 조건보다 개방 환경에 맞게 조정되어야 한다.

선진국과 달리, 대량 중앙 집중화 실험실 기반 진단은 영구적인 통합 시설의 고비용 및 숙련된 기술자의 제한으로 인해 자원 제한 환경에 적합하지 않다. 따라서 일회용 현장 진단 분석법은 자원 제한 환경에 해결책이 될 수 있다. 지난 10년 동안 면역크로마토그래피 스트립(immune-chromatographic strip; ICS) 검사가 자원 제한 환경에서 성공적으로 사용된 진단 분석법 중 하나였으나, 심층 시료 분석에 제한되는 단점이 있었다.

현장 진단 사용을 위해, 분석은 단순화(즉, 제조 공정 및 응용 공정, 시설 또는 훈련 요구가 거의 없음) 되어야 하고, 신속하고 안정적(물류 및 저장 측면)이며 저비용으로 최적화되어야 한다. 특히, 소변, 혈액 및 객담과 같은 일반적인 임상 시료에 이 분석법을 적용하는 것이 필수적이다. 그러나 이는 시료로부터 병원체 추출뿐만 아니라 생체 시료에도 폭넓게 자극되는 PCR 억제제 때문에 어려움이 있다. 따라서 병원체 농축 및 핵산 시료 준비의 통합을 위한 적용가능한 해결책이 임상적 검출 및 현장 진단 분석에 모두 기여할 수 있다. 또한, 아프리카를 비롯한 저개발 국가에서는 전기 공급이 어려워 실험실 기반 장비들의 사용이 제한적인 바, 전기(전력) 사용 없이 병원체 농축 및 핵산 추출이 가능한 현장 진단 분석은 자원 제한 환경에서 폭넓게 활용될 수 있는 이점이 있다.

대한민국 등록특허 제10-1799153호 (2017.11.13 등록)

본 발명의 목적은 현장 진단용 병원체 농축 및 핵산 추출 장치를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 장치를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유입부; 상기 유입부와 연결되며, 상기 유입부를 통해 도입되는 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 혼합시키는 반응부; 상기 반응부와 연결되며, 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 차단하고 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 필터부; 및 상기 필터부와 연결되며, 핵산을 분리하는 유출부;를 포함하는 현장 진단용 병원체 농축 및 핵산 추출 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 현장 진단용 병원체 농축 및 핵산 추출 장치를 제공하는 제 1단계; 상기 장치의 유입부를 통해 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 도입하는 제 2단계; 상기 장치의 반응부에서 가교제에 의해 병원체를 실란 화합물로 개질된 규조토 표면에 고정시키는 제 3단계; 상기 장치의 유입부를 통해 용해 완충액을 도입하는 제 4단계; 상기 장치의 반응부에서 병원체로부터 추출된 핵산을 실란 화합물로 개질된 규조토 표면에 고정시키는 제 5단계; 상기 장치의 유입부를 통해 용리 완충액을 도입하는 제 6단계; 및 상기 장치의 필터부를 통해 핵산을 분리하고, 유출부를 통해 핵산을 획득하는 제 7단계;를 포함하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법을 제공한다.

도 1은 아민으로 기능화된 규조토(DA) 및 디메틸 수베르이미데이트(DMS)를 사용하여 휴대용 주사기 필터 장치에 의한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법을 도시하여 나타낸 것으로, (a) 주사기 내부에 DA, 병원체 및 DMS의 혼합, (b) 병원체가 DMS에 의해 DA 표면에 흡수되고 이후에 필터에 의해 차단되는 병원체 농축 과정, (c) DA의 아민기와 용해된 병원체로부터 방출된 핵산 사이의 가역적 가교 반응을 통한 핵산 분리를 나타낸 것이다.
도 2는 주사기 필터의 상단면 및 측면을 도시하여 나타낸 것이다.
도 3은 핵산 분리 공정의 최적화를 위한 실시간 정량 PCR 결과를 나타낸 것으로, (a) DA 제조를 위한 실란 화합물의 최적화, (b) 동형2기능성 이미도에스터의 최적화, (c) DA 농도의 최적화. (d) DMS 농도의 최적화. (e) RNA 분리를 위한 배양시간의 최적화, (f) 최적화된 조건으로 분리된 DNA 주형에 대한 평가를 C_T 값으로 나타낸 것이다.
도 4는 최적화된 핵산 분리 공정을 이용한 DNA 및 RNA의 포획 효율을 나타낸 것이다.
도 5는 DA-DMS 튜브 시스템 평가를 위한 실시간 정량 PCR 결과를 나타낸 것으로, (a) DA-DMS 튜브 시스템 및 상업용 키트 시스템을 이용하여 병원체 시료에서 분리된 RNA 주형에 대한 평가, (b) 다양한 시료 및 부피에서 분리된 RNA 주형에 대한 평가를 C_T 값으로 나타낸 것이다.
도 6은 DA-DMS 필터 시스템 평가를 위한 실시간 정량 PCR 결과를 나타낸 것으로, (a) 주사기 필터 유형에 대한 평가, (a) DA-DMS 필터 시스템 및 상업용 키트 시스템을 이용하여 병원체 시료에서 분리된 RNA 주형에 대한 평가를 C_T 값으로 나타낸 것이다.
도 7은 DA-DMS 필터 시스템의 대용량 시료 처리 능력 평가를 위한 실시간 정량 PCR 결과를 나타낸 것으로, (a) 다양한 부피의 시료에서 분리된 RNA 주형에 대한 평가, (b) 상이한 시료에서 분리된 RNA 주형에 대한 평가를 C_T 값으로 나타낸 것이다.

본 발명의 발명자들은 다른 분석법에 쉽게 통합될 수 있는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법을 제공하며, 상기 방법은 전체 공정이 단순화되도록 설계된 일체형장치로 현장 진단에 사용이 가능하다. 병원체는 아민으로 기능화된 규조토(amine-functionalized diatomaceous earth; DA) 및 디메틸 수베르이미데이트(dimethyl suberimidate; DMS)의 존재 하에 주사기 필터에 의해 농축되고, 별도의 장비 없이 핵산 추출이 가능하다.

양전하를 띠는 규조토는 수성 환경에서 음전하를 띠는 병원체와 전기적으로 결합될 수 있다. 그러나 규조토의 아민기와 결합될 수 있는 디메틸 수베르이미데이트가 존재하면 더 많은 양전하가 형성되어 병원체 농축 과정이 강화될 수 있다. 따라서, 음전하를 띠는 병원체는 1 mL 시료에서 규조토에 직접적으로 흡수되거나 대용량 시료(50 mL)에서는 짧은 인큐베이션을 통해 직접적으로 흡수될 수 있다. 한편, 디메틸 수베르이미데이트는 핵산 또는 단백질의 아민기의 가역적인 반응에 대한 가교 결합제로 알려져 있다. 반응은 조절된 pH로 역전될 수 있기 때문에, 진단에 사용되는 핵산 시료의 추출은 다른 완충액의 주입으로 쉽게 달성될 수 있으며, 특히, 본 발명의 진단 방법은 다양한 임상 시료에 적합한 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일체형 분석법의 개략도를 나타낸 것으로, 휴대용 주사기 필터 장치는 병원체를 효과적으로 농축하고 핵산을 분리할 수 있으며, 분석 제작 및 조작 절차가 간소하고, 비용이 저렴하며, 총 작업 시간을 최소 20분으로 감소시킬 수 있는 이점이 있다. 또한, 실험실 시설을 필요로 하지 않으며, 다양한 임상 시료에 대해 보편적인 프로토콜을 제공할 수 있다.

이에, 본 발명은 유입부; 상기 유입부와 연결되며, 상기 유입부를 통해 도입되는 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 혼합시키는 반응부; 상기 반응부와 연결되며, 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 차단하고 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 필터부; 및 상기 필터부와 연결되며, 핵산을 분리하는 유출부;를 포함하는 현장 진단용 병원체 농축 및 핵산 추출 장치를 제공한다.

상기 필터는 0.5 내지 1 μm의 평균 직경을 갖는 포어를 구비하며, 10 내지 30 mm 범위의 지름 및 1 내지 10 mm 범위의 두께일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 필터는 나노- 및 마이크로-여과막 필터, 역삼투압 필터, 중공사막 필터 및 한외여과막 필터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 제 2단계의 병원체가 함유된 시료는 병원체에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 제 2단계의 병원체는 미생물이며, 상기 미생물은 바이러스, 세균, 진균, 원충, 리케차 또는 스피로헤타일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 제 2단계의 가교제는 디메틸 수베르이미데이트(dimethyl suberimidate; DMS), 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP) 및 3,3’-디티오비스프로피온이미데이트(dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 제 2단계의 실란 화합물은 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 제 3단계는 음전하를 띠는 병원체가 가교제에 의해 양전하를 띠는 실란 화합물로 개질된 규조토 표면에 정전기적 결합으로 고정될 수 있다.

상기 제 5단계는 병원체로부터 추출된 핵산이 실란 화합물로 개질된 규조토의 아민기와 가역적 가교결합을 통해 규조토 표면에 고정될 수 있다.

상기 병원체 농축 및 핵산 추출은 15 내지 30분의 시간 안에 완료될 수 있다.

상기 핵산은 DNA, RNA, 순환종양 DNA(circulating tumor DNA; ctDNA) 및 세포유리 DNA(cell free DNA; cfDNA)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 cfDNA는 순환 유리 핵산으로 혈액에서 순환하며 존재하는 DNA를 의미한다. 상기 순환 유리 핵산은 구체적으로 순환 유리 DNA, 순환 유리 RNA 등을 포함하며, 바람직하게는 순환 유리 DNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 상기 순환 유리 핵산은 일반적으로 혈장 또는 혈청에 1000 bp 이하 (DNA), 100 nt 이하 (RNA)의 길이를 나타내나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 ctDNA는 암세포로부터 분리되어 혈액을 순환하며 존재하는 DNA를 의미한다. 종양 특이적 돌연변이 및 후성 유전학적 변이를 모두 가지고 있으며, 혈액 내 전체 순환 DNA의 매우 적은 양을 차지한다. 순환 종양 DNA의 크기는 50 bp에서 250 bp로 다양하나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 물질

규조토(diatomaceous earth; DE), (3-아미노프로필)트리에톡시실란[(3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES, 99%], 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란[3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS, 97%], [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS, 80%) 및 N1-(3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민[ N1-(3-trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine; TPDA]은 시그마 알드리치에서 구매하였다.

실시예 2: 아민으로 기능화된 규조토의 제조

규조토(DE)는 증류수(distilled water; DW)로 30분 동안 격렬하게 교반하여 세척한 다음 원심분리하여 불순물이 포함된 퇴적물을 제거하였다. 아민으로 기능화된 규조토(amine-functionalized DE; DA)는 농축 및 추출 매트릭스로서 이용하였고, 세척된 DE의 표면은 실란 화합물의 아민기와 반응시켜 합성하였다. DA의 제조 방법은 다음과 같다. 간략하게, 5 mL의 실란을 5%(v/v) 증류수 100 mL이 포함된 에탄올 혼합물에 적가하고 아세트산(pH 5)으로 산성화시켰다. 2 g의 세척된 DE를 강력한 교반 하에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. DA를 에탄올로 세척한 다음 밤새 진공 건조시키고, 추가 분석에 사용되기 전까지 보관하였다.

실시예 3: 세포 배양

브루셀라 오비스(Brucella ovis, ATCC 25840)는 병원성 진단을 평가하는 데 사용되었다. 브루셀라 오비스는 5% 탈섬유 양(defibrinated sheep) 혈액(MBcell, Korea)을 이용하여 브루셀라 한천(Sigma-Aldrich)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica, ATCC 14028)는 트립티케이스 소이 배지(trypticase soy broth, TSB, BD Difco)에 접종한 후, 호기성 대기 하에 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 한천 평판법으로 박테리아 현탁액을 정량한 다음 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 상이한 농도로 희석하였다.

실시예 4: 병원체 농축-튜브 기반

DA와 디메틸 수베르이미데이트(dimethyl suberimidate; DMS, Sigma-Aldrich)를 최적화된 공정에 따라 농축 및 추출 매트릭스로 선택하였다. 먼저, 120 μL의 APDMS-DE 현탁액(50 mg/mL in DW) 및 100 μL의 DMS 용액(200 mg/mL in DW)을 시료에 첨가하였다. 99 rpm 회전 혼합기(Topscien Instrument Co., Ltd., Ningbo, China)를 이용하여 상온에서 1 내지 30분 동안 반응시킴으로써 동형2기능성 이미도에스터(homobifunctional immidoester; HI) 그룹을 통한 가역적 교차 가교 반응에 기초하여 APDMS-DE 표면에 병원체를 부착시켰다. 병원체가 흡수된 APDMS-DE를 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 수집하고 상등액을 제거하였다. 이후 1 mL의 인산완충식염수로 세척하고 한 번 더 원심분리하여 상등액을 제거하고 병원체가 포함된 시료 100 μL를 획득하였다.

실시예 5: 핵산 추출-튜브 기반

농축된 시료로부터의 핵산을 분리하기 위해, 시료에 20 μL의 프로테이나아제 K, 150 μL의 자체 용해 완충액[100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM 에틸렌디아민테트라 아세트산, 1% 소듐 도데실 설페이트 및 10% 트리톤 X-100], 30 μL의 리소자임 용액(30 ㎎/mL in DW, Sigma-Aldrich) 및 10 μL의 RNase-Free DNase 용액(RNA용, Qiagen)을 첨가하였다. 이후 850 rpm의 교반기를 이용하여 56℃에서 30분(DNA의 경우) 또는 상온에서 10분(RNA의 경우) 동안 배양하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 핵산이 결합된 APDMS-DE를 200 μL의 인산완충식염수로 2회 세척하고 모든 용액을 부드럽게 피펫팅하여 혼합하였다. 이후 용액에 100 μL의 용리 완충액(elution buffer; EB)(10 mM 중탄산 나트륨, pH > 10, NaOH로 조절, Sigma-Aldrich)을 첨가하고 상온에서 1분 동안 배양한 다음 원심분리하여 핵산이 포함되어 있는 상등액을 1.5 mL 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다. 또한, 양성 대조군으로서 동일한 시료는 시판용 키트(QIAamp DNA Mini Kit 및 QNagen RNeasy Mini Kit)를 사용하여 권장 프로토콜에 따라 핵산 추출하였다.

실시예 6: 병원체 농축- 필터 기반

주사기 필터 및 DA-HI 시스템을 사용한 병원체 농축 절차의 개략도는 도 1b에 도시하였다. 120 μL의 APDMS-DE 현탁액(50 mg/mL in DW) 및 100 μL의 DMS 용액(200 mg/mL in DW)을 시료에 첨가하였다. 99 rpm 회전 혼합기(Topscien Instrument Co., Ltd., Ningbo, China)를 이용하여 상온에서 1 내지 30분 동안 반응시킴으로써 HI 그룹을 통한 가역적 교차 가교 반응에 기초하여 APDMS-DE 표면에 병원체를 부착시켰다. 병원체가 흡수된 APDMS-DE 혼합물을 1.0 μm의 공극을 가지는 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE) 주사기 필터(Whatman, USA)에 통과시켰다. 그 다음 1 mL 인산완충식염수를 통과시켜 병원체가 포획된 필터를 세척하였다. 마지막으로 공기가 주입된 주사기의 플런저를 강하게 눌러 필터에 용액을 제거하였다.

실시예 7: 핵산 추출-필터 기반

농축된 시료로부터의 핵산을 분리하기 위해, 주사기 필터에 20 μL의 프로테이나아제 K, 150 μL의 자체 용해 완충액, 30 μL의 리소자임 용액 및 10 μL의 RNase-Free DNase 용액을 주입하였다. 다음으로 시린지 필터를 가볍게 볼텍싱하고, 56℃(DNA의 경우) 또는 상온(RNA의 경우)에서 배양한 후, 1 mL의 인산완충식염수로 필터를 2회 통과시켜 핵산이 포획된 필터를 세척하였다. 공기가 주입된 주사기의 플런저를 강하게 눌러 필터의 용액을 제거하고, 100 μL의 용리 완충액을 필터에 주입한 다음 상온에서 1분간 반응시켰다. 마지막으로 공기가 주입된 주사기의 플런저를 강하게 눌러 핵산이 포함되어 있는 용액을 용리시키고, -20℃에서 보관하였다.

실시예 8: 실시간 PCR

분리된 DNA의 품질을 확인하기 위해, PCR 및 실시간 PCR을 수행하였으며, 추출된 RNA의 품질을 검증하기 위해 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 실험에 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

시료	타겟	서열(5' -> 3')
B. ovis	IS711	F: GCTTGAAGCTTGCGGACAGT
		R: GGCCTACCGCTGCGAAT
S.enterica	invA	F: TATCGCCACGTTCGGGCAA
		R: TCGCACCGTCAAAGGAACC

실험예 1: 일체형(all-in-one) 휴대용 분석 장치 제조

다양한 시료로부터 핵산 주형을 수집하는데 사용된 분석은 상업용 PTFE 주사기 필터를 기반으로 하였으며, 도 1a와 같이 주사기로 펌핑되었다. DA와 DMS의 사용은 병원체 농축을 향상시켰다. 이미도에스터인 DMS는 DA의 아민기와 연결되어 음전하를 띠는 병원체를 직접 끌어당길 수 있는 양전하를 띠는 이미딘 결합을 생성할 수 있다. 더욱이 나노 다공성 구조가 부여된 DA는 매우 강한 흡수 능력과 매우 높은 반응 영역을 나타내며, 이는 향상된 성능에 기여한다. 시린지 필터는 흡수된 병원체와 DA를 격리하는데 사용되었다. 따라서 도 1b와 같은 농축 과정은 DMS와 DA를 용액에 있는 병원체와 혼합한 다음 필터에 주입하여 쉽게 수행될 수 있다.

세척 후 필터의 병원체를 현장에서 용해시켰다. DNA와 RNA는 가역적 가교 반응으로 분리되는 것으로 알려져 있다. DMS는 핵산과 DA의 아민기 사이 가교제로서의 역할을 한다. 즉, 반응 완충액 pH 하에서 가교 반응을 통해 DA의 표면 상에 핵산이 고정되는 반면, 높은 pH의 용리 완충액은 반응을 역전시키고 이후 포획된 핵산을 방출시킨다. 따라서 도 1c와 같이 주입된 완충액의 pH만을 조절하여 쉽게 핵산 주형을 추출할 수 있다. 특히, 본 발명의 분석은 RNA 분리에서 탁월한 효능을 나타낸다. RNA와 DA 사이의 강력한 공유 결합으로 인해 포획된 RNA는 분해에 견딜 정도로 충분히 안정하다. 본 발명의 분석법은 현장 진단 시스템에 쉽게 적용될 수 있는 RNase를 제거하기 위한 추가 장비 또는 전처리를 필요로 하지 않는다.

실험예 2: 일체형 휴대용 분석법의 최적화

분석법을 통합하기 전에 모든 관련 요인들은 개별적으로 최적화되어야 한다. 이에, 도 3에서 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)의 사이클 임계값(cycle threshold; C_T)을 통해 튜브에서 배양 시간뿐만 아니라 DA 및 DMS 조건의 추출 효율을 평가하였다. 모든 최적화 공정에 1 mL의 브루셀라 오비스 시료(10⁴ CFU mL^-1 in PBS)를 사용하였다. 레퍼런스로서 상업용 키트(QIAamp DNA Mini Kit 및 QNagen RNeasy Mini Kit)를 이용하여 동일한 시료에서 핵산을 추출하였다. DA의 아민 기능화는 초기 단계이며 병원체 농축 및 RNA 추출 공정에 기여한다.

상이한 실란 화합물도 도 3a에서 분석되었다. C_T이 낮을수록 핵산 주형의 품질이 더 높은 바, APDMS가 최종적으로 선택되었다. 한편, 가교 결합제로서, 다양한 이미도에스터가 도 3b에서 분석되었으며, DMS가 다른 이미도에스터(DMA, DMP)보다 더 우수한 성능을 나타내었다. 특히 상온에서 안정한 DMS만이 분석의 저장과 수송에 도움이 될 수 있다. 이후 도 3c-d와 같이 DA와 DMS의 농도가 각각 최적화되었다. 이로써 병원체 농축의 최적화가 완료된다. 세포 용해 후, RNA가 방출되며 DMS의 DA에 동시에 결합된다. 또한, 배양시간에 따른 성능을 분석하였다. 도 3e와 같이 배양시간 5분에서 가장 높은 효율을 나타내었다. 또한, 최적화된 시스템은 도 3f와 같이 DNA 추출을 분석하는데 사용되었다. 포획 효율은 C_T 값을 비교하여 평가되었다. 동일한 농도의 병원체를 함유하는 100 μL의 시료(브루셀라 오비스 in PBS, 10⁵ CFU mL^-1)를 키트로 분리하고 레퍼런스로 사용하였다. RNA 및 DNA 분리에 대한 포획 효율은 각각 95% 및 81%였다(도 4). 이후 최적화된 시스템은 주사기 필터와 통합되었다. 포획 효율은 레퍼런스에 비해 85% 이상을 나타내었다. 즉, 병원체 농축 및 핵산 추출에 대한 일체형 휴대용 분석은 시약 종류(도 3a-b), 농도(도 3c-d) 및 배양시간 (도 3e)으로 최적화되었다.

실험예 3: 튜브를 이용한 일체형 접근법 평가

본 발명의 시스템을 사용하여 현장 시료 준비 능력을 확인하기 위해, 병원체인 브루셀라 오비스 시료 1 mL(10⁰ 내지 10⁴ CFU mL^-1)를 사용하였다. 본 발명의 시스템 및 상업용 키트를 이용하여 동시에 RNA 주형을 추출하였으며 병원체 검출을 위한 qPCR 분석을 수행하였다. 본 발명의 시스템의 검출 한계는 도 5a와 같이 10⁰ CFU mL^-1로 관찰되었으며, 키트 시스템(10² CFU mL^-1)보다 100배 민감하였다. 또한, 본 발명의 분석법은 도 5b와 같이 PBS, 소변 및 혈청과 같은 다양한 매트릭스로부터 시료를 50 mL까지 처리할 수 있다. 도 5b와 같이 10³ CFU 브루셀라 오비스가 서로 다른 부피의 매질에 첨가되었으며, 10 mL 희석액에서 본 발명의 분석법으로 추출한 RNA 주형이 매우 효과적인 증폭을 나타내었다. PBS 및 소변 시료로부터 주형은 각각 2.3 및 0.8 사이클이 지연되었다. 특히, 혈청 시료의 모든 주형이 초기 사이클에 관찰되었는데, 이는 혈청 시료에는 훨씬 많은 RNase가 포함되어 있기 때문에 방출된 RNA는 일반적인 방법으로 쉽게 분해되는 반면, 본 분석법에서 추출된 RNA는 견고한 공유 결합으로 인해 RNase 분해에 강한 저항성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 분석법은 대량의 저농도 시료뿐만 아니라 병원체 검출의 한계를 향상시킬 수 있다.

실험예 4: 일체형 휴대용 분석법의 성능 평가

실험실 의존성을 완전히 극복하기 위해 본 발명의 분석법을 주사기 필터와 통합하였다. 최적화된 조건으로 몇 가지 상용 필터를 분석하였으며, 다양한 필터 유형[셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate; CA), 폴리에테르술폰 (polyethersulfone; PES), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene Fluoride; PVDF) 및 폴리테트라 플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE)]에 따른 농축 결과를 도 6a에 나타내었다. 특히, 가장 높은 알칼리 포화도 및 낮은 단백질 결합률에 기여한 PTFE 필터에서 빠른 C_T 사이클이 관찰되었다. 다음으로 주사기 필터를 이용하여 다양한 농도의 병원체 시료에서 RNA 주형을 준비하고 이후 qPCR로 검출 분석을 수행하였다. 도 6b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 분석법은 튜브를 사용하는 프로토콜과 유사하게 키트 시스템(10² CFU mL^-1)보다 100배 높은 10⁰ CFU mL^-1로 매우 낮은 검출 한계를 나타냈다. 튜브 및 키트 시스템 모두 병원체 농축 및 현장 핵산 추출에서 높은 효율을 나타내었는데, 이는 본 발명의 프로토콜이 현장에서 고품질의 RNA 주형을 추출하기 위해 다른 분석법과 쉽게 통합될 수 있음을 의미한다.

또한, 본 발명의 분석법은 주사기를 이용한 간단한 로딩 단계로 대량의 시료를 쉽게 처리할 수 있다. 최대 50 mL의 시료를 테스트하였으며, 도 7a와 같이 다양한 부피의 시료로부터 농축 및 핵산 추출이 안정적으로 수행되는 것을 확인하였다. 또한, 도 7b와 같이 다른 생물학적 매트릭스에서 본 발명의 분석 성능을 검증하였으며, 소변 시료에서도 농축 및 핵산 추출이 우수한 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Method for pathogen enrichment and nucleic acid extract using device for point of care testing <130> ADP-2018-0260 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS711 forward <400> 1 gcttgaagct tgcggacagt 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS711 reverse <400> 2 ggcctaccgc tgcgaat 17 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> invA forward <400> 3 tatcgccacg ttcgggcaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> invA reverse <400> 4 tcgcaccgtc aaaggaacc 19

Claims

현장 진단용 병원체 농축 및 핵산 추출 장치를 제공하는 제 1단계;
상기 장치의 유입부를 통해 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 도입하는 제 2단계;
상기 장치의 반응부에서 가교제에 의해 병원체를 실란 화합물로 개질된 규조토 표면에 고정시키는 제 3단계;
상기 장치의 유입부를 통해 용해 완충액을 도입하는 제 4단계;
상기 장치의 반응부에서 병원체로부터 추출된 핵산을 실란 화합물로 개질된 규조토 표면에 고정시키는 제 5단계;
상기 장치의 유입부를 통해 용리 완충액을 도입하는 제 6단계; 및
상기 장치의 필터부를 통해 핵산을 분리하고, 유출부를 통해 핵산을 획득하는 제 7단계;를 포함하고,
상기 현장 진단용 병원체 농축 및 핵산 추출 장치는,
유입부;
상기 유입부와 연결되며, 상기 유입부를 통해 도입되는 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 혼합시키는 반응부;
상기 반응부와 연결되며, 병원체가 포함된 시료, 가교제 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 차단하고 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 필터부; 및
상기 필터부와 연결되며, 핵산을 분리하는 유출부;를 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 가교제는 디메틸 수베르이미데이트(dimethyl suberimidate; DMS), 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 및 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이고, 상기 실란 화합물은 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 필터는 0.5 내지 1 μm의 평균 직경을 갖는 포어를 구비하며, 10 내지 30 mm 범위의 지름 및 1 내지 10 mm 범위의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 필터는 나노-여과막 필터, 마이크로-여과막 필터, 역삼투압 필터, 중공사막 필터 및 한외여과막 필터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 병원체가 함유된 시료는 병원체에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 병원체는 미생물인 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 6항에 있어서, 상기 미생물은 바이러스, 세균, 진균, 원충, 리케차 또는 스피로헤타인 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 제 3단계는 음전하를 띠는 병원체가 가교제에 의해 양전하를 띠는 실란 화합물로 개질된 규조토 표면에 정전기적 결합으로 고정되는 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 5단계는 병원체로부터 추출된 핵산이 실란 화합물로 개질된 규조토의 아민기와 가역적 가교결합을 통해 규조토 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 병원체 농축 및 핵산 추출은 15 내지 30분의 시간 안에 완료되는 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 순환종양 DNA(circulating tumor DNA; ctDNA) 및 세포유리 DNA(cell free DNA; cfDNA)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 병원체 농축 및 핵산 추출 방법.