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KR102135044B1 - 히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법 - Google Patents

히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법 Download PDF

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KR102135044B1
KR102135044B1 KR1020190016266A KR20190016266A KR102135044B1 KR 102135044 B1 KR102135044 B1 KR 102135044B1 KR 1020190016266 A KR1020190016266 A KR 1020190016266A KR 20190016266 A KR20190016266 A KR 20190016266A KR 102135044 B1 KR102135044 B1 KR 102135044B1
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이한원
이한구
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대화제약 주식회사
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Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 속 균주의 히알루론산 합성효소(hasA)의 아미노산 치환으로 비병원성인 바실러스속 균주에서 높은 수율로 히알루론산을 생산하는 히알루론산 합성효소 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 히알루론산 생산용 균주를 제공하며, 또한 상기 히알루론산 합성효소 변이 단백질을 생산하는 바실러스속 균주를 이용하여 높은 수율과 안정성으로 히알루론산을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법{Mutant protein of hyaluronic acid synthase and method of producing hyaluronic acid using the system}
본 발명은 히알루론산 생산 활성이 향상된 히알루론산 합성효소의 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자, 및 이를 이용한 히알루론산의 생산 방법에 관한 것이다.
히알루론산은 D-글루쿠론산(D-gluconic acid)과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)의 이당체단위로 이루어진 생체 고분자로 분자량에 따라, 성형용 필러, 관절염 치료제 및 유착방지제 등 다양한 용도로 활용되고 있다.
이러한, 히알루론산은 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.) 균주의 발효를 통해 생산할 수 있는데, 스트렙토코커스 속 균주는 감염성 미생물로 발열성 물질 등이 정제과정에서 오염될 가능성이 있다. 이러한 점을 개선하고자, GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주를 재조합벡터로 형질전환시켜 히알루론산을 생산하는 방법이 개발되었다.
등록특허 10-0879908 과 등록특허 10-0885163 (US 2003/175902)에서는 항시발현용 프로모터 (바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자 (amyQ) 프로모터)에 의해 조절되는 오페론 (스트렙토코커스 에퀴시미리스(Streptococcus equisimilis) 유래의 히알루론산 합성효소 유전자 (hasA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제(UDP-glucose 6-dehydrogenase) 유전자 (tuaD) 및 UDP-글루코스 피로포스포리라아제 (UDP-glucose pyrophosphorylase, gtaB)로 구성)을 바실러스 서브틸리스 게놈에 삽입시켜 히알루론산 생산이 가능하게 하였다.
이후, US2016/0237465에서는 히알루론산 생산 수율과 히알루론산 분자량을 향상시키고자, IPTG 유도용이며 강력한 프로모터 (Pgrac)에 의해 조절되는 오페론 (스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 유래의 hasA 유전자와 바실러스 서브틸리스 유래의 tuaD 유전자로 구성)을 포함하는 플라스미드를 이용하여 바실러스 서브틸리스를 형질전환하였고, 향상된 수율과 분자량을 보인 바 있다.
이러한 방식에서 가장 핵심이 되는 유전자는 히알루론산 합성 유전자로 이는 바실러스 서브틸리스에 존재하지 않는 유전자이므로, 스트렙토코커스 속 균주의 유전자를 사용하여야 한다. 또한, 히알루론산을 안정적으로 높은 수율로 생산할 수 있는, 히알루론산 생산 활성이 향상된 히알루론산 합성효소의 변이 단백질에 대한 요구가 절실하다.
본 발명의 목적은 히알루론산 생산 수율이 향상된 히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 유전자를 포함하는 오페론, 상기 변이 유전자 또는 상기 오페론을 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은, 히알루론산 생산 수율이 향상된 히알루론산 합성효소 변이 단백질, 또는 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물을 포함하는 히알루론산 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은, 히알루론산 생산 수율이 향상된 히알루론산 합성효소 변이 단백질, 또는 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물을 이용하여 높은 수율로 히알루론산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 히알루론산 생산 활성이 향상된 히알루론산 합성효소의 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자, 및 이를 이용한 히알루론산의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 야생형에 비해 향상된 활성을 보이는 히알루론산 합성효소 유전자를 얻기 위해 돌연변이를 유도하고 활성이 높은 유전자를 포함하는 균주에 대한 선별과정을 진행하였고, 특정 아미노산 서열의 치환의 조합을 통해 히알루론산 합성효소의 기능이 향상됨을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 히알루론산 생산 활성이 향상된 히알루론산 합성효소의 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자, 및 이를 이용한 히알루론산의 생산 방법을 완성하였다.
본 발명의 일 예는 서열번호 74 의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 히알루론산 합성효소(hasA)의 66번째 리신이 아르기닌으로, 148번째 글루탐산이 글리신으로 및 280번째 리신이 아르기닌으로 치환된 변이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는, 히알루론산 합성효소 변이 단백질, 바람직하게는 상기 3종의 변이를 모두 포함하는 히알루론산 합성효소 변이 단백질에 관한 것이다.
상기 변이 단백질은, 서열번호 75 의 염기서열을 포함하는 야생형 히알루론산 합성효소(hasA)를 암호화하는 유전자에서 197번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이, 443번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이 및 839번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클레오티드 변이를 포함하는 염기서열에 의해 암호화되는 것인 히알루론산 합성효소 변이 단백질일 수 있다. 상기 변이 단백질을 암호화하는 염기서열은, 582번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이를 추가로 포함할 수 있다.
상기 변이 단백질은 서열번호 76 의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 필요에 따라 단백질의 특성 및 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 부가적인 아미노산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 변이 단백질은 서열번호 77 의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화되는 것일 수 있으며, 필요에 따라 단백질의 특성 및 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 염기서열의 치환을 추가로 더 포함하거나 염기서열의 양 말단에 추가적인 염기 서열이 더 부가되거나 일부 염기서열이 제거될 수 있다.
본 발명에서 "단백질의 특성 및 활성에 영향을 주지 않는 범위"란, 아미노산 또는 염기서열의 부가를 포함하는 단백질 또는 유전자의 편집 후 단백질의 구조 또는 활성이 편집 전 단백질의 구조 또는 활성에 비교할 때 현저한 구조 변화가 일어나 새로운 활성의 발현 또는 기존의 활성이 감소하지 않는 범위를 의미하며, 편집 전 단백질이 가지고 있던 본래 활성이 편집 후 증가하는 범위를 포함한다.
상기 변이 단백질은 야생형 단백질에 비해 1.3 내지 5배, 1.3 내지 4배, 1.3 내지 3배, 1.3 내지 2.5배, 1.3 내지 2.3배, 1.3 내지 2배, 1.5 내지 5배, 1.5 내지 4배 1.5 내지 3배 1.5 내지 2.5배, 1.5 내지 2.3배 또는 1.5 내지 2배의 히알루론산 수율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 수크로즈 배지에서 배양 후 상기 변이 단백질은 야생형 대비 1.8배의 히알루론산 수율을 보였다.
본 발명은 상기 히알루론산 합성효소 변이단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 76 의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 필요에 따라 단백질의 특성 및 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 부가적인 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 유전자는 서열번호 75 의 염기서열을 포함하는 야생형 히알루론산 합성효소 유전자의 197번째, 443번째 및 839번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것일 수 있으며, 582번째 아데닌이 구아닌으로 치환되는 변이를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 돌연변이는 당업계에 알려진 방법에 따라 통상의 기술자가 직접 점돌연변이를 도입 또는 합성하여 사용할 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 77 의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 포함하는 히알루론산 생산용 발현 시스템을 제공한다. 상기 발현 시스템은 작동 가능하도록 연결된, 전사 프로모터, 히알루론산 합성효소 변이 유전자, 리보솜 결합부위(RBS), tuaD 유전자를 포함하는 히알루론산 생산용 발현 시스템일 수 있다. 상기 tuaD 유전자 및 히알루론산 합성효소 변이 단백질을 암호화하는 유전자는 하나의 오페론을 구성하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5'에서 3'방향으로 순차적으로 히알루론산 합성효소 변이 유전자, RBS 및 tuaD 유전자가 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템은 바실러스속 균주에 적용되는 것일 수 있으며, 예를 들면 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 발현 시스템에 적용되는 프로모터는 필요에 따라 유도형 또는 항시 발현형 프로모터(constitutive expression promoter)를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터는 바실러스속 균주에서 사용되는 항시발현용 프로모터일 수 있으며, 예를 들어, P43, Pmsm, Ppbp, Pylb, Pyob, Pyqe 또는 Pyvl일 수 있으며, 바람직하게는 Psigx, Pyob, 또는 Pyqe일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 히알루론산 생산 목적 범위에서 필요에 따라 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터를 사용하는 경우, IPTG등 고가의 유도제 없이도 히알루론산을 생산할 수 있는 장점이 있다.
상기 각 프로모터는 표 2에 나타낸 프라이머 세트를 사용하여 바실러스 서브틸리스 168 균주의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 얻을 수 있다. 구체적으로, 구체적으로 P43 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 39 및 40), Pmsm 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 41 및 42), Ppbp 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 43 및 44), Pylb 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 45 및 46), pyob 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 47 및 48), Pyqe 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 49 및 50), Pyvl 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 51 및 52), Psigx 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 53 및 54) 를 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에서 서열번호 53 및 서열번호 54의 프라이머로 바실러스 서브틸리스 168 균주(Bacillus Genetic Stock Center)의 유전체로부터 PCR을 통해 얻은 Psigx 프로모터 (서열번호 62)의 히알루론산 수율이 P43 프로모터를 사용한 경우에 비해 약 5배 높게 나타나, 가장 좋은 활성을 나타내었다 (도 3).
상기 전사 프로모터는 P43 프로모터를 포함하는 발현 시스템을 갖는 형질전환 균주에 비해 히알루론산 생산량이 1.1 내지 10배, 1.15 내지 10배, 1.5 내지 10배, 2 내지 10배, 3 내지 10배, 4 내지 10배, 5 내지 10배, 1.1 내지 9배, 1.15 내지 9배, 1.5 내지 9배, 2 내지 9배, 3 내지 9배, 4 내지 9배, 5 내지 9배, 1.1 내지 8배, 1.15 내지 8배, 1.5 내지 8배, 2 내지 8배, 3 내지 8배, 4 내지 8배, 5 내지 8배, 1.1 내지 7배, 1.15 내지 7배, 1.5 내지 7배, 2 내지 7배, 3 내지 7배, 4 내지 7배, 5 내지 7배, 1.1 내지 6.5배, 1.15 내지 6.5배, 1.5 내지 6.5배, 2 내지 6.5배, 3 내지 6.5배, 4 내지 6.5배, 5 내지 6.5배, 1.1 내지 6배, 1.15 내지 6배, 1.5 내지 6배, 2 내지 6배, 3 내지 6배, 4 내지 6배, 5 내지 6배, 1.1 내지 5.5배, 1.15 내지 5.5배, 1.5 내지 5.5배, 2 내지 5.5배, 3 내지 5.5배, 4 내지 5.5배, 또는 5 내지 5.5배인 프로모터일 수 있다.
본 발명의 발현 시스템에 적용 가능한 리보솜결합부위(RBS)는 상기 tuaD 유전자를 hasA 유전자와 함께 발현시킴으로써 바실러스에서 히알루론산을 생산할 수 있게 된다. 상기 RBS는 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 암호화 유전자를 높은 수준으로 번역할 수 있는 것이면 제한 없이 선택될 수 있으며, 상기 리보솜결합부위는 tuaD RBS를 사용하였을 때보다 1.1 내지 3배, 1.15 내지 3배, 1.2 내지 3배, 1.1 내지 2.5배, 1.15 내지 2.5배, 1.2 내지 2.5배, 1.1 내지 2배, 1.15 내지 2배, 1.2 내지 2배, 1.1 내지 1.5배, 1.15 내지 1.5배, 1.15 내지 1.5배, 1.1 내지 1.3배, 1.15 내지 1.3배 또는 1.2 내지 1.3배의 히알루론산 수율을 갖는 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 RBS는, BBa_B0030(서열번호 65), BBa_B0031(서열번호 66), BBa_B0032(서열번호 67), BBa_B0033(서열번호 68), BBa_B0034(서열번호 69), BBa_B0035(서열번호 70), tuaD 유전자의 RBS(tuaD RBS, 서열번호 71), 또는 pET 플라스미드의 RBS(서열번호 72)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템은 tuaD 유전자와 히알루론산 합성효소 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하며, 상기 두 가지 유전자는 하나의 오페론을 구성하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 순차적으로 히알루론산 합성효소 변이 단백질을 암호화하는 유전자, tuaD 유전자의 RBS 및 tuaD 유전자가 연결된 오페론일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 tuaD 유전자는 바실러스속 균주, 예를 들어 바실러스 서브틸리스 균에서 유래한 tuaD 유전자일 수 있다. 상기 tuaD 유전자는 tuaD 유전자를 가지고 있는 것으로 알려져 있는 종으로부터 유래된 tuaD 유전자를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 바실러스속 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 균에서 유래한 tuaD 유전자일 수 있다. 상기 tuaD 유전자는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 2217 균주의 tuaD 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 적절한 돌연변이가 도입된 tuaD 유전자일 수 있고, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제의 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 자유롭게 변형되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 리보솜결합부위 및 tuaD는 바실러스 서브틸리스 2217 균주로부터 서열번호 37 및 38의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 수득되었다.
본 발명의 히알루론산 생산용 발현 시스템에서 상기 히알루론산 합성효소 변이 유전자는 서열번호 76의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 필요에 따라 단백질의 특성 및 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 부가적인 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 유전자는 서열번호 75 의 염기서열을 가지는 야생형 히알루론산 합성효소 유전자의 197번째, 443번째 및 839번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것일 수 있으며, 582번째 아데닌이 구아닌으로 치환되는 변이를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 당업계에 알려진 방법에 따라 통상의 기술자가 직접 점돌연변이를 도입 또는 합성하여 사용할 수 있다.
상기 유전자는 서열번호 77 의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 서열번호 77의 염기서열을 가지는 히알루론산 합성효소 변이 유전자가 도입된 균주는 야생형 히알루론산 합성효소가 도입된 균주에 비해 배양액 내 히알루론산 농도가 1.8배 높았다 (도 5).
상기 변이 유전자에 의해 발현된 변이 단백질은 야생형 단백질에 비해 1.3 내지 5배, 1.3 내지 4배, 1.3 내지 3배, 1.3 내지 2.5배, 1.3 내지 2.3배, 1.3 내지 2배, 1.5 내지 5배, 1.5 내지 4배 1.5 내지 3배 1.5 내지 2.5배, 1.5 내지 2.3배 또는 1.5 내지 2배의 히알루론산 수율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일예는 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주 또는 재조합 균주일 수 있다.
상기 균주는 GRAS 등급의 균주일 수 있으며, 그람 양성균, 예를 들어, 바실러스속 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis)일 수 있다. GRAS 등급의 균주를 사용함으로써 히알루론산 합성시의 안전성이 증가할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 2217 균주에 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 도입시켜 IPTG와 같은 유도체 없이도 히알루론산을 생산하는 균주를 획득하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 2217 균주에 상기 히알루론산 합성용 재조합 벡터를 형질전환시켜 IPTG와 같은 유도체 없이도 야생형 히알루론산 합성효소를 도입한 균주에 비해 1.8배 높은 히알루론산 수율, 및 비병원성 특성을 가지는 균주를 획득하였다.
본 발명은 상기 히알루론산 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주를 배양하여 배양물을 얻는 단계를 포함하는 비병원성 세균을 이용한 히알루론산 생산방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 히알루론산 생산방법은 히알루론산 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계에 더하여, 히알루론산을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 배양액에서 균주를 제거하는 단계 및 상기 균주가 제거된 배양액에서 히알루론산을 침전시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 생산용 형질전환 균주 및 히알루론산 생산방법에서, 전사 프로모터, 히알루론산 합성효소(hasA) 변이 유전자, tuaD 유전자 발현용 리보솜 결합부위 및 tuaD 유전자 등에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 균주를 배양하는 단계는 탄소원으로 수크로즈를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 균주의 배양, 균주 제거 및 히알루론산의 침전 단계는 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 필요에 따라 통상의 기술자가 적절히 변형하여 사용할 수 있다.
상기 균주를 배양하는 단계는 배양 시작 후 50 내지 80시간, 50 내지 75시간, 50 내지 72시간, 50 내지 70시간, 55 내지 80시간, 55 내지 75시간, 55 내지 70시간 또는 60 내지 65시간 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 탄소원, 배양 온도 등 배양 조건에 따라 배양 시간을 적절히 조절할 수 있다. 상기 배양 시간은, 바람직하게는 수크로즈 배지, 37℃, 180rpm 배양 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 배양 시작 후 65시간 경과 후와 72시간 경과 후의 상대적 히알루론산 농도에 유의미한 차이가 없었고, 48시간 경과시의 히알루론산 수율은 65시간 경과시의 히알루론산 수율에 비해 매우 낮았다 (도 4). 적절한 배양 시간을 선택함으로써 히알루론산 합성을 위한 배양 비용을 최소화하면서 히알루론산 수율을 극대화할 수 있다.
상기 히알루론산의 생산 방법은 히알루론산의 침전단계 이후 히알루론산의 농축, 정제 또는 농축 및 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조 방법을 사용하여 수득된 히알루론산은 분자량이 100 내지 10,000kDa, 500 내지 10,000kDa, 500 내지 8,000kDa, 3,000 내지 8,000kDa, 또는 5,000 내지 6,000kDa일 수 있다.
본 발명의 히알루론산 합성효소 변이 단백질은 야생형 히알루론산 합성효소 단백질에 비해 향상된 히알루론산 수율을 가지며, 상기 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 히알루론산 합성 시스템을 바실러스속 균주에서 발현함으로써 높은 안정성 및 수율로 히알루론산을 생산하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일예에 따라 제조된 pHCMC02-hasA 플라스미드의 벡터의 제조 과정 및 pHCMCO2-hasA 플라스미드의 벡터맵을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일예에 따라 제조된 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드의 제작 과정과 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD의 벡터맵을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일예에 따라 다양한 프로모터를 포함하는 발현 시스템을 바실러스속 균주에 도입한 후 생산된 히알루론산의 농도를 P43을 기준으로 상대적으로 표시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일예에 따라 pSigX-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드가 도입된 바실러스 균주를 수크로즈 배지에서 배양하였을 때, 배양 시간이 경과함에 따른 상대적 히알루론산의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일예에 따라 DHPHA2217-WT 균주의 히알루론산 생산 농도를 기준으로 DHPHA2217-MT 돌연변이 균주의 히알루론산의 상대적 농도를 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 하기 실시예의 기재에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 히알루론산 합성효소 유전자 (hasA)의 클로닝
스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 유래의 히알루론산 합성효소 유전자 (hasA, Genbank No. AY173078의 염기서열 1~1254) (서열번호 75) 는 하기 표 1에 나타낸 서열번호 1부터 36까지의 프라이머들을 이용하여, PCR 기반의 2단계 DNA 합성 방식(PCR-based two step DNA synthesis, PTDS; Xiong, 2004, Nucleic Acids Research 32:e98)으로 합성하였다. 구체적으로, 서열번호 1부터 12까지를 이용하여 DNA 단편 1을 만들고, 마찬가지로 서열번호 13부터 24까지, 25부터 36까지를 이용하여 각각 DNA 단편 2와 단편 3을 제조하였다. 전체 길이의 hasA 유전자를 얻기 위해, 상기 얻어진 DNA 단편 1, 단편 2 및 단편 3을 혼합하고 서열번호 1 및 서열번호 36로 구성된 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 진행하여, hasA 유전자를 획득하였다. PCR조건은 Veriti® Thermal Cycler (applied biosystem)을 이용하여 94℃에서 15초 변성, 55℃에서 15초 결합, 72℃에서 1분30초 신장하는 단계를 총 25회 실시하였다.
명명 서열
번호		 hasA CDS
증폭부위		 염기서열(5'-> 3')
hasA_frag1_forward1 1 (1~42) cgggatccatgagaacattaaaaaacctcataactgttgtggcctttagt
hasA_frag1_forward2 2 (28~77) gttgtggcctttagtattttttgggtactgttgatttacgtcaatgttta
hasA_frag1_forward3 3 (63~112) ttacgtcaatgtttatctctttggtgctaaaggaagcttgtcaatttatg
hasA_frag1_forward4 4 (98~147) gcttgtcaatttatggctttttgctgatagcttacctattagtcaaaatg
hasA_frag1_forward5 5 (133~182) ctattagtcaaaatgtccttatcctttttttacaagccatttaagggaag
hasA_frag1_forward6 6 (168~217) gccatttaagggaagggctgggcaatataaggttgcagccattattccct
hasA_frag1_reverse1 7 (203~252) ggtctctagcaatgactcagcatcttcgttataagagggaataatggctg
hasA_frag1_reverse2 8 (238~287) gctaggggataggtttgctgctgaacactttttaaggtctctagcaatga
hasA_frag1_reverse3 9 (273~322) catcagcacttccatcgtcaacaacataaatttctgctaggggataggtt
hasA_frag1_reverse4 10 (308~357) acgcacatagtcttcaatgcgcttaatacctgtctcatcagcacttccat
hasA_frag1_reverse5 11 (343~392) tgaacaatgacattgcttgataggtcaccagtgtcacgcacatagtcttc
hasA_frag1_reverse6 12 (378~427) gtgcatgacgctttccttgatttttctctgaccgatgaacaatgacattg
hasA_frag2_forward1 13 (413~462) gaaagcgtcatgcacaggcctgggcctttgaaagatcagacgctgatgtc
hasA_frag2_forward2 14 (448~497) tcagacgctgatgtctttttgaccgttgactcagatacttatatctaccc
hasA_frag2_forward3 15 (483~532) tacttatatctaccctgatgctttagaggagttgttaaaaacctttaatg
hasA_frag2_forward4 16 (518~567) taaaaacctttaatgacccaactgtttttgctgcgacgggtcaccttaat
hasA_frag2_forward5 17 (553~602) acgggtcaccttaatgtcagaaatagacaaaccaatctcttaacacgctt
hasA_frag2_forward6 18 (588~637) tctcttaacacgcttgacagatattcgctatgataatgcttttggcgttg
hasA_frag2_reverse1 19 (623~672) aaggatattacctgtaacggattgggcagctcgttcaacgccaaaagcat
hasA_frag2_reverse2 20 (658~707) tcgcgtctgtaaacgctaagcggacctgagcaaacaaggatattacctgt
hasA_frag2_reverse3 21 (693~742) ggttgatgtatctatctatgttaggaacaaccacctcgcgtctgtaaacg
hasA_frag2_reverse4 22 (728~777) atcaccaatacttacaggaatacccaggaaggtctggttgatgtatctat
hasA_frag2_reverse5 23 (763~812) cctaaatcagttgcatagttggtcaagcacctgtcatcaccaatacttac
hasA_frag2_reverse6 24 (798~847) taatacatttagcagtggattgataaacagtctttcctaaatcagttgca
hasA_frag3_forward1 25 (833~882) ctgctaaatgtattacagatgttcctgacaagatgtctacttacttgaag
hasA_frag3_forward2 26 (868~917) tctacttacttgaagcagcaaaaccgctggaacaagtccttctttagaga
hasA_frag3_forward3 27 (903~952) gtccttctttagagagtccattatttctgttaagaaaatcatgaacaatc
hasA_frag3_forward4 28 (938~987) aaatcatgaacaatccttttgtagccctatggaccatacttgaggtgtct
hasA_frag3_forward5 29 (973~1022) atacttgaggtgtctatgtttatgatgcttgtttattctgtggtggattt
hasA_frag3_forward6 30 (1008~1057) ttctgtggtggatttctttgtaggcaatgtcagagaatttgattggctca
hasA_frag3_reverse1 31 (1043~1092) aacaatgaagataatcaccagaaaggctaaaaccctgagccaatcaaatt
hasA_frag3_reverse2 32 (1078~1127) tgcttaagcatgtaatgaatgttccgacacagggcaacaatgaagataat
hasA_frag3_reverse3 33 (1113~1162) ccccataaaacggagataacaagaaggacagcgggtgcttaagcatgtaa
hasA_frag3_reverse4 34 (1148~1197) taatttcaagggctgtaggacaaacaaatgcagcaccccataaaacggag
hasA_frag3_reverse5 35 (1183~1232) ccccagtcagcatttctaatagtaaaaagagaatataatttcaagggctg
hasA_frag3_reverse6 36 (1218~1254) gctctagattataataattttttacgtgttccccagtcagcattt
획득한 전체 길이의 hasA 유전자를 제한효소 BamHI과 XbaI으로 절단하고, BamHI과 XbaI으로 절단된 pHCMC02 (Bacillus Genetic Stock Center) 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 상기 벡터를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pHCMC02-hasA를 단리하였다. 확보된 플라스미드 pHCMC02-hasA는 염기서열 분석을 통해 정상적인 hasA 유전자가 클로닝되었음을 확인하였다. 상기 pHCMC02-hasA의 플라스미드 제작 방법의 모식도 및 pHCMC02-hasA의 벡터맵을 도 1에 나타내었다.
실시예 2: UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자(tuaD)의 클로닝
바실러스속 균주에서 히알루론산을 생산하기 위해서는 히알루론산 합성효소만으로는 부족하고, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제(UDP-glucose 6-dehydrogenase)가 동시에 발현되어야 하며 (Winder, 2005, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71:3747-3752), 이를 위해서는 hasA와 tuaD로 이루어진 오페론을 완성하여야 한다.
오페론을 구성하기 위해서는 tuaD 유전자 앞에 RBS (ribosome binding site)가 존재해야 하므로, 바실러스 서브틸리스 2217 균주 (생물자원센터(KCTC))의 DNA를 주형으로 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머를 이용하여, tuaD 유전자 5말단에 RBS34 (BioBrick BBa_B0034)가 포함되도록 tuaD 유전자를 증폭하였다. PCR은 Veriti® Thermal Cycler (applied biosystem)를 이용하여 94℃에서 15초 변성, 55℃에서 15초 결합, 72℃에서 1분30초 신장하는 단계를 총 30회 실시하였다.
서열번호 37: 5'-aatctagaaaagaggagaaatactagatgaaaaaaatagctgtcattgg-3'
서열번호 38: 5'-gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt-3'
증폭된 RBS34-tuaD 유전자는 제한 효소 XbaI로 절단하였고, XbaI과 SmaI으로 절단된 pBluescriptII SK+ (Stratagene) 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pBSIISK-RBS34-tuaD를 단리하였다. 확보된 플라스미드 pBSIISK-RBS34-tuaD는 염기서열 분석을 통해 Genbank No. AF015609의 염기서열 3599~4984 (서열번호 73, tuaD 유전자의 단백질 코딩 부위)가 정상적으로 클로닝되었음을 확인하였다.
실시예 3: hasA 및 tuaD 오페론의 클로닝
hasA와 tuaD유전자로 구성된 오페론을 완성하기 위해서, pBSIISK-RBS34-tuaD를 제한효소 XbaI과 SmaI으로 절단하고, 절단된 RBS34-tuaD유전자를 동일한 제한효소로 처리된 pHCMC02-hasA 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드를 단리하였다.
상기 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드의 제작 방법과 상기 플라스미드의 벡터맵을 도 2에 나타내었다.
실시예 4: hasA-tuaD 오페론 발현용 프로모터 선별
실시예 1에서 제조된 플라스미드 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD에서 hasA-tuaD 오페론의 발현은 PlepA 프로모터에 의해 조절되는데, PlepA 프로모터는 활성이 약한 것으로 알려져 있다. 이에, PlepA 프로모터를 다양한 프로모터로 교체하여 hasA-tuaD 오페론 발현 활성이 높은 프로모터를 선별하였다. 상기 후보 프로모터들은 바실러스속 균주에서 사용되는 항시 발현용 프로모터(constitutive expression promoter)인 P43에 비해 발현 활성이 높은 것들로 선정하였다 (Yu, 2015, Scientific Reports, 5:18405; Song, 2016, PLoS One. 11:e0158447).
상기 시험된 각 프로모터에 의해 조절되는 플라스미드를 제작하기 위해서, 바실러스 서브틸리스 168 균주 DNA (Bacillus Genetic Stock Center)를 주형으로 표 2에 기재된 프라이머쌍을 이용하여 각각의 프로모터들을 PCR로 증폭하였다. 구체적으로 P43 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 39 및 40), Pmsm 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 41 및 42), Ppbp 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 43 및 44), Pylb 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 45 및 46), pyob 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 47 및 48), Pyqe 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 49 및 50), Pyvl 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 51 및 52), Psigx 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 53 및 54) 를 사용하였다.
프로모터 프라이머 방향 서열번호 염기서열(5'-> 3')
P43 forward 39 gatcgctagctgataggtggtatgttttcg
reverse 40 gatcggatccgtgtacattcctctcttacctataa
Pmsm forward 41 gatcgctagcagtgtctgcgaaaacattac
reverse 42 gatcggatccctaacatccccctttgttat
Ppbp forward 43 gatcgctagcagatggcaagttagttacgc
reverse 44 gatcggatcctcctccacctcccatatctc
Pylb forward 45 gatcgctagccatcgtcgaacgcgctccat
reverse 46 gatcggatccacgttctacctttgtcaaacaa
pyob forward 47 gatcgctagcattcggcgttttggttttaggc
reverse 48 gatcggatccttaagcttctccccttctct
Pyqe forward 49 gatcgctagccttcttgagcgtctcaacca
reverse 50 gatcggatcctcctttgatttgaagcaagg
Pyvl forward 51 gatcgctagcttcaaaacaaaaaaggcaagat
reverse 52 gatcggatccttcattccacactcctattg
Psigx forward 53 gatcgctagcaggttataaatttgaggtcggcg
reverse 54 gatcggatccttgaaacccctccgttcacttt
PCR을 통해 증폭된 각각의 프로모터를 제한효소 NheI과 BamHI으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 각각의 플라스미드를 단리하였다. 염기서열 분석을 통해 단리된 각각의 플라스미드들에 정상적으로 각 프로모터들이 클로닝되었음을 확인하였다.
서로 다른 프로모터를 가지고 있는 플라스미드들을 전기천공법(Sun, 2015, Applied Microbiology and Biotechnology, 99:5151-5162)에 의해 바실러스 2217 균주에 도입하여, 클로로암페니콜 내성을 가지는 형질전환 균주들을 제조하였다.
다음으로, 각각의 형질전환 균주들을 LB배지에 접종하고 밤샘 배양을 하였다. 밤샘 배양된 균주 0.2 mL을 250mL 삼각플라스크에 들어 있는 20 mL sucrose배지 (1L당 50g 의 수크로즈, 20g 의 효모추출물, 1.5g 의 황산마그네슘 (MgSO4)이 포함된 50mM 인산칼륨 (potassium phosphate (pH7.0))에 접종한 후, 37℃ 온도에서 180rpm으로 진탕 배양하였다. 배양시작 후 65시간에 각각의 배양액을 취하고, 10,000 rpm으로 1분간 원심분리 후 0.45 μm 필터를 통과시켜 균주를 제거하였다.
균주가 제거된 배양액에 3배 부피의 에탄올을 첨가하고 4℃ 온도에서 2 시간 동안 정치시키고, 4℃ 온도에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 히알루론산을 침전시켰다. 침전된 히알루론산을 건조시키고, 물에 녹인 후, HA quantitative Test Kit (Corgenix, Westminster, CO, USA)를 사용하여 히알루론산 함량을 측정하고, 항시 발현용 프로모터(constitutive expression promoter)인 P43을 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산의 함량(g/L)을 100% 로 설정하고, 시험 프로모터를 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산 함량을 상대적으로 표시하여 그 결과를 도 3에 나타냈다.
프로모터 상대적 히알루론산 생산량(%)
P43 100.0 ± 4.2
Pmsm 15.1 ± 1.9
Ppbp 3.9 ± 0.8
Pylb 38.1 ± 2.3
pyob 31.6 ± 7.1
Pyqe 134.3 ± 6.7
Pyvl 15.0 ± 11.1
Psigx 488.2 ± 13.4
도 3에 각 프로모터를 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 상대적 히알루론산의 함량을 그래프로 나타내었다. Psigx 프로모터(서열번호 62), Pyob 프로모터(서열번호 63), 및 Pyqe 프로모터(서열번호 64)가 P43 프로모터 보다 발현양이 높았으며, 특히 Psigx 프로모터가 다른 프로모터에 비해 히알루론산 생산에 효과적임을 확인하였다. 이후 Psigx 프로모터가 클로닝된 플라스미드를 pSigx-hasA-RBS34-tuaD로 명명하였으며, 이후 실험에는 상기 pSigx-hasA-RBS34-tuaD 재조합 플라스미드를 이용하였다.
실시예 5: tuaD 유전자의 과발현용 RBS 선별
D-글루쿠론산은 히알루론산의 구성요소로 본래 바실러스가 가지고 있는 tuaD 유전자에 의해 생성될 수 있지만, 효율적인 히알루론산 생산을 위해서는 tuaD 유전자의 과발현이 필요하다. 이를 위해 전술한 바와 같이 hasA 유전자와 tuaD 유전자를 오페론 형태로 제작하여 hasA 유전자와 함께 tuaD 유전자의 과발현을 유도한다. 오페론을 구성하기 위해서는 tuaD 유전자 5'말단에 활성이 높은 RBS서열이 존재하여 tuaD 유전자의 번역을 조절해야 한다. RBS의 활성도는 주변 서열에 상황 의존적(sequence context-dependent)이므로, 조절받는 유전자의 서열에 따라 다를 수 있다 (Mutalik, 2013, Nature Methods, 10:347-353). 이러한 이유로 실제 tuaD의 번역에 유리하며 결과적으로 히알루론산 생산에 적합한 RBS 선별과정을 진행하였다.
구체적으로, RBS 선별에는 BioBrick Registry of standard biological parts로부터 6개의 합성 RBS (BBa_B0030, BBa_B0031, BBa_B0032, BBa_B0033, BBa_B0034, BBa_B0035), tuaD 유전자 본래의 RBS (tuaD RBS), 그리고 pET 와 같이 일반적으로 사용되는 플라스미드의 RBS (RBS)를 비교하였다. 상기 시험한 8개 RBS 서열을 표 4에 나타냈다. 각각의 RBS서열이 5'말단에 포함된 tuaD 유전자를 확보하기 위해서 표 4에 나타낸 프라이머 및 서열번호 38을 사용하여 바실러스 서브틸리스 168 균주 (Bacillus Genetic Stock Center)의 DNA를 주형으로 PCR을 진행하였다.
증폭된 각각의 RBS를 포함한 tuaD유전자는 XbaI으로 절단하였고, XbaI과 SmaI으로 절단하여 RBS34-tuaD가 제거된 pSigx-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 각각의 플라스미드를 단리하였다. 염기서열 분석을 통해 단리된 각각의 플라스미드들에 정상적으로 해당하는 RBS를 포함한 tuaD유전자가 클로닝 되었음을 확인하였다.
명명 서열
번호		 염기서열 (5'->3')
BBa_B0030-RBS 65 attaaagaggagaaatactag
BBa_B0031-RBS 66 tcacacaggaaacctactag
BBa_B0032-RBS 67 tcacacaggaaagtactag
BBa_B0033-RBS 68 tcacacaggactactag
BBa_B0034-RBS 69 aaagaggagaaatactag
BBa_B0035-RBS 70 attaaagaggagaatactag
tuaD RBS 71 gacactgcgaccattataaattggaagatcattttacaggagagggttgagcgct
pET RBS 72 aataattttgtttaactttaagaaggagatatacat
BBa_B0030-PCR 55 aatctagaattaaagaggagaaatactagatgaaaaaaatagctgtc
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
BBa_B0031-PCR 56 aatctagatcacacaggaaacctactagatgaaaaaaatagctgtc
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
BBa_B0032-PCR 57 aatctagatcacacaggaaagtactagatgaaaaaaatagctgtc
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
BBa_B0033-PCR 58 aatctagatcacacaggactactagatgaaaaaaatagctgtc
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
BBa_B0034-PCR 37 aatctagaaaagaggagaaatactagatgaaaaaaatagctgtcattgg
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
BBa_B0035-PCR 59 aatctagaattaaagaggagaatactagatgaaaaaaatagctgtc
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
tuaD-RBS-PCR 60 aatctagagacactgcgaccattataaattgg
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
pET-RBS-PCR 61 aatctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaaaaaatagctgtc
38 gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt
상기에서 얻어진, 서로 다른 RBS를 가지고 있는 플라스미드들을 전기천공법으로 바실러스 서브틸리스 2217 균주에 도입하고, 클로로암페니콜 내성을 가지는 형질전환 균주들을 제조하였다.
다음으로, 실시예 4의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로, 각각의 형질전환 균주들을 배양하고 배양액을 취하여 히알루론산 함량을 측정하였으며, pET 플라스미드의 RBS를 사용한 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산의 함량(g/L)을 100으로 설정하고, 시험 RBS 서열을 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산 함량을 상대적으로 표시하여 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
RBS 종류 상대적 히알루론산의 생산량(%)
BBa_B0030-RBS 83.6 ± 8.9
BBa_B0031-RBS 4.2 ± 1.4
BBa_B0032-RBS 4.7 ± 0.5
BBa_B0033-RBS 5.7 ± 0.9
BBa_B0034-RBS 123.3 ± 1.8
BBa_B0035-RBS 80.5 ± 1.0
tuaD RBS 75.7 ± 9.5
pET RBS 100.0 ± 6.4
BioBrick Registry of standard biological parts (http://parts.igem.org/Ribosome_Binding_Sites/Prokaryotic/Constitutive/Community_Collection)의 비교 결과에 따르면 BBa_B0035가 BBa_B0034 (실시예 1-2의 RBS에 해당)에 비해 더욱 발현 효율이 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 실시예의 실험결과에 따르면 RBS 자체 특성과 달리, 본 발명에 따른 발현시스템의 경우 BBa_B0034 RBS서열을 사용할 때 가장 높은 히알루론산 생산 수율을 확인하였다.
실시예 6: 히알루론산 수율 확인
히알루론산을 생산하는 바실러스 균주를 만들기 위해, pSigX-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드를 전기천공법 (Sun, 2015, Applied Microbiology and Biotechnology, 99:5151-5162)으로 바실러스 2217 균주에 도입하고, 클로람페니콜 내성을 가지는 형질전환균주를 완성하여 DHPHA2217-WT로 명명하였다.
다음으로, DHPHA2217-WT을 LB배지에 접종하고 밤샘 배양을 하였다. 밤샘 배양된 균주 0.2 mL을 250mL 삼각플라스크에 들어 있는 20 mL 수크로즈(sucrose)배지 (1L당 50g 의 수크로즈, 20g 의 효모추출물(Yeast extract), 1.5g 의 황산마그네슘 (MgSO4)이 포함된 50mM 인산칼륨 (potassium phosphate (pH7.0))에 접종한 후, 37℃에서 180rpm으로 진탕 배양하였다.
시간별 히알루론산 수율을 측정하기 위해서, 배양시작 후 48시간, 65시간, 72시간 경과 후 각각 배양액을 취하고, 10,000 rpm으로 1분간 원심분리 후 0.45 μm 필터를 통과시켜 균주를 제거하였다. 균주가 제거된 배양액에 3배 부피의 에탄올을 첨가하고 4℃에서 2 시간 동안 정치시키고, 4℃에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 히알루론산을 침전시켰다. 침전된 히알루론산을 건조시키고, 물에 녹인 후, HA quantitative Test Kit (Corgenix, Westminster, CO, USA)을 사용하여 히알루론산 함량을 측정하였다.
시간의 경과에 따른 상대적 히알루론산 농도 그래프를 도 4에 나타내었다. 65시간 배양하였을 때의 히알루론산 농도를 100%로 두었을 때, 48시간 배양하였을 때에는 31 %, 72시간 경과 후에는 101% 의 히알루론산 농도를 보였다.
이를 통해 배양액 내에 히알루론산이 존재한다는 사실 및 상기 조건에서는 약 65시간 가량의 배양으로 충분한 수율을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 돌연변이 라이브러리 제작
다음으로, 히알루론산 합성효소에 변이를 유발하고 활성이 높아진 클론을 선별하기 위해 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. Wilson, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Unit8.3에 기술되어 있는 error prone PCR (EP-PCR)기법을 통해 hasA 유전자에 돌연변이를 유발하였다. 구체적인 방법으로, 하기 표 6의 반응액을 94℃에서 1분 변성, 60℃ 1분 결합, 72℃ 3분 신장하는 단계를 총 18회 진행하였다. 증폭된 hasA 돌연변이 유전자는 제한효소 BamHI과 XbaI으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단하여 야생형 hasA가 제거된 pSigX-hasA-RBS34-tuaD에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체들로부터 돌연변이 라이브러리 플라스미드를 단리하였다.
조성 함량 (μL)
물 51
100mM Tris pH8.3 10
2M KCl 2.5 2.5
200mM MgCl2 3.5
25mM dCTP 4
25mM dTTP 4
5mM dATP 4
5mM dGTP 4
100uM hasA-a1 2
100uM hasA-c12 2
0.2 ng/uL pHCMC02-hasA 10
25mM MnCl2 2
5 unit/uL Taq polymerase (solgent) 1
실시예 8: 돌연변이 라이브러리 선별
실시예 7에서 얻은 돌연변이 라이브러리 중 야생형에 비해 히알루론산 합성 수율이 높은 클론을 선별하기 위해 완성된 라이브러리 플라스미드를 바실러스 서브틸리스 2217 균주에 전기천공법을 사용하여 형질 전환하였다.
각각의 형질전환된 균주의 히알루론산 생산 수율을 확인하기 위해서, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 65시간 동안 균주를 배양하고 배양액 내 히알루론산의 농도를 측정하였다. 이 때 야생형과의 비교를 위해 DHPHA2217-WT균주도 DHPHA2217-MT와 동일한 방법으로 배양 및 시료를 취하여 배양액 내 히알루론산 농도를 측정하였다.
다수의 돌연변이 라이브러리에 의해 형질전환된 균주를 테스트해 본 결과, 야생형(DHPHA2217-WT)에 비해 약 1.8배 가량 높은 히알루론산 수율을 보이는 균주 선별에 성공하였으며, 상기 균주를 DHPHA2217-MT로 명명하였다. 야생형과 DHPHA2217-MT의 히알루론산 수율을 비교한 그래프를 도 5에 나타내었다.
실시예 9: 돌연변이 서열 분석
DHPHA2217-MT 균주의 hasA 유전자 서열을 확인하기 위해, 상기 균주로부터 플라스미드를 분리 한 후, 하기 서열번호 78 과 서열번호 79 의 프라이머 쌍을 이용하여 hasA유전자의 염기서열을 분석하였다.
- 서열번호 78 (hasA_Seq_forward): cttccaaattccagttactcgt
- 서열번호 79 (hasA_Seq_reverse): caaagcaagtgcctgatacg
분석 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 hasA 야생형 유전자 DNA서열 중 4개의 뉴클레오티드에 변이가 발생하였고, 이로 인해 3개의 아미노산 치환이 발생하였다. 구체적으로, hasA 유전자의 염기서열 중 197번, 443번, 582번, 839번 아데닌(A)이 구아닌(G)으로 치환되었고 (서열번호 77), 이에 따라 hasA 단백질의 아미노산 서열 중 66번 리신(Lys, K)이 아르기닌(Arginine, R)으로, 148번 글루탐산(Glutamic acid, E)이 글리신(Glycine, G)으로, 280번 리신이 아르기닌으로 치환되었다(서열번호 76).
DNA 염기서열 변이 아미노산 변이
197 A->G K66R
443 A->G E148G
582 A->G Silent mutation
839 A->G K280R
<110> Dae Hwa Pharma. Co., Ltd. RedoxBio <120> Mutant protein of hyaluronic acid synthase and method of producing hyaluronic acid using the system <130> DPP20190382KR <150> KR 10-2018-0158626 <151> 2018-12-10 <160> 79 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_frag1_forward1) <400> 1 cgggatccat gagaacatta aaaaacctca taactgttgt ggcctttagt 50 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_frag1_forward2) <400> 2 gttgtggcct ttagtatttt ttgggtactg ttgatttacg tcaatgttta 50 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_frag1_forward3) <400> 3 ttacgtcaat gtttatctct ttggtgctaa aggaagcttg tcaatttatg 50 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_frag1_forward4) <400> 4 gcttgtcaat ttatggcttt ttgctgatag cttacctatt agtcaaaatg 50 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_frag1_forward5) <400> 5 ctattagtca aaatgtcctt atcctttttt 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<400> 42 gatcggatcc ctaacatccc cctttgttat 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Ppbp_forward primer) <400> 43 gatcgctagc agatggcaag ttagttacgc 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Ppbp_reverse primer) <400> 44 gatcggatcc tcctccacct cccatatctc 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pylb_forward primer) <400> 45 gatcgctagc catcgtcgaa cgcgctccat 30 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pylb_reverse primer) <400> 46 gatcggatcc acgttctacc tttgtcaaac aa 32 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyob_forward primer) <400> 47 gatcgctagc attcggcgtt ttggttttag gc 32 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyob_reverse primer) <400> 48 gatcggatcc ttaagcttct ccccttctct 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyqe_forward primer) <400> 49 gatcgctagc cttcttgagc gtctcaacca 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyqe_reverse primer) <400> 50 gatcggatcc tcctttgatt tgaagcaagg 30 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyvl_forward primer) <400> 51 gatcgctagc ttcaaaacaa aaaaggcaag at 32 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyvl_reverse primer) <400> 52 gatcggatcc ttcattccac actcctattg 30 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Psigx_forward primer) <400> 53 gatcgctagc aggttataaa tttgaggtcg gcg 33 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Psigx_reverse primer) <400> 54 gatcggatcc ttgaaacccc tccgttcact tt 32 <210> 55 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0030-RBS-tuaD_forward primer) <400> 55 aatctagaat taaagaggag aaatactaga tgaaaaaaat agctgtc 47 <210> 56 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0031-RBS-tuaD_forward primer) <400> 56 aatctagatc acacaggaaa cctactagat gaaaaaaata gctgtc 46 <210> 57 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0032-RBS-tuaD_forward primer) <400> 57 aatctagatc acacaggaaa gtactagatg aaaaaaatag ctgtc 45 <210> 58 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0033-RBS-tuaD_forward primer) <400> 58 aatctagatc acacaggact actagatgaa aaaaatagct gtc 43 <210> 59 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0035-RBS-tuaD_forward primer) <400> 59 aatctagaat taaagaggag aatactagat gaaaaaaata gctgtc 46 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (tuaD-RBS-tuaD_forward primer) <400> 60 aatctagaga cactgcgacc attataaatt gg 32 <210> 61 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (pET-RBS-tuaD_forward primer) <400> 61 aatctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaaa aaaatagctg 60 tc 62 <210> 62 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Psigx_promoter ) <400> 62 aggttataaa tttgaggtcg gcgctgaatg aaattttgga aaagcgtagt aggcaagctg 60 tggtttacga tcctttcact cgtcttgatc gtattgttca ttttaacggt tcttttgctg 120 gagtttattg aaaactacca tgtggaagaa gctgagaatg atttaacaca gcttgcgaat 180 aaagttgctg tcatcctaga aaatcacgag gaccaggcac tggcaaggtc aatcacttgg 240 gaactcgctg ataacttaac aagcattgcc atcatccagg atgagaagaa ccactggtat 300 tctccgaatg ataaaaatcg cctgtcgtct attacggttg agcaaataca gcatgacaaa 360 gacttaaata aagctctcaa agaccataaa aaagtaagca aacggacggg actgagcgat 420 acagacacgg ataatgaacg cctgattgta ggtgtcccgt atgaaaaaga cggaaagaaa 480 ggcatggtct ttttatccca gtctttgctt gccgttaaag atacaacaaa acatacgacc 540 cgctatattt ttcttgccgc tggaattgcg attgtgctga ccacattttt cgcattcttt 600 ttatcaagca gggtcacgta ccctctccga aaaatgagag aaggcgcgca ggatttggcg 660 aagggcaagt tcgatacaaa aatcccgatt ttaactcagg atgaaatcgg tgaactggcg 720 accgctttta atcaaatggg ccggcagctt aactttcata tcaatgcgct caatcaagaa 780 aaagagcagc tttctaacat tttgagcagt atggctgacg gggttattac cattaatatt 840 gacggtacga ttcttgtgac caacccgccg gctgaacgtt ttcttcaggc ttggtattat 900 gaacagaaca tgaatatcaa agaaggcgac aatcttccgc ctgaagcaaa agagctgttt 960 caaaacgctg tcagcactga aaaagaacaa atgattgaga tgacgcttca aggcagatca 1020 tgggtgcttt tgatgtcgcc gctttatgcg gaatcgcacg tcagaggagc ggttgccgta 1080 ctgcgtgaca tgacagaaga acgccgcctt gataagctgc gggaggactt tatcgcaaat 1140 gtcagtcatg agctgagaac accgatctcc atgcttcagg gatacagtga agcaattgtc 1200 gatgacattg caagctctga agaagaccgg aaagaaattg cccaaatcat ttatgacgaa 1260 tcgctccgaa tgggccgttt agttaatgat ttgcttgatt tagcccgaat ggaatcaggc 1320 catacaggct tacattatga aaaaatcaat gtgaatgagt ttttagaaaa gatcattcgg 1380 aagttttccg gtgttgcgaa agaaaaaaat attgctttag atcatgacat ttctctcaca 1440 gaagaggaat ttatgtttga tgaagacaag atggagcagg tatttaccaa tttgattgat 1500 aacgcgctgc ggcatacttc agccggcggc agtgtctcca tttcagtcca ttctgtgaag 1560 gatggattga aaattgatat caaagactcc gggtctggca taccggaaga agatctgcca 1620 tttatctttg agcggtttta taaggcagat aaagcgcgga caaggggcag agcaggaacc 1680 gggttagggc tggctatcgt taaaaatatc gtggaagccc acaacggatc aattactgtg 1740 cacagccgaa tagataaagg aacaacattt tctttttata ttccgacaaa acggtaaaat 1800 cgagtctgaa tttgccgaag aatcttgttc cataagaaac acccgctgac tgagcgggtg 1860 tttttttaat agccaacatt aataaaattt aaggatatgt taatataaat tcccttccaa 1920 attccagtta ctcgtaatat agttgtaatg taacttttca agctattcat acgacaaaaa 1980 agtgaacgga ggggtttcaa 2000 <210> 63 <211> 494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyob_promoter ) <400> 63 attcggcgtt ttggttttag gctacaactt tgatcatgca tcagttgtaa atagaactaa 60 tgaatataaa gaacactatg gccttactga tggacttgtg gttattgaag atgttgatta 120 ctttgcttac tgtctagata caaataaaat gaaagacgga gaatgccctg tagttgaatg 180 ggatagggta attggttatc aagatactgt tgcagacagc tttattgaat ttttttataa 240 taagattcag gaagcgaaag atgactggga tgaggatgaa gactgggacg attaagcaaa 300 agtattgcta tagcgcaata gaaggcttga gttgcacatc ctcaatctaa ataaaataag 360 ctctcgcaat gagagcttat tttattggat taaataatta aagtgacaga agttttctag 420 tcccgtttta tatgaaacct tttttatttt agcccgtatt aaaagtaaat tcagagagaa 480 ggggagaagc ttaa 494 <210> 64 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Pyqe_promoter) <400> 64 cttcttgagc gtctcaacca ggatatgaag ctgtatatga aaaaccgtga gaaagacaaa 60 ctgactgtcg ttcgaatggt taaggcttca cttcaaaatg aagcaattaa gcttaagaaa 120 gacagtttga ccgaggatga ggaactcact gtcctttctc gtgaacttaa gcaacgtaaa 180 gactccctcc aggaattttc aaacgctaat cgtttagatt tagtagataa agttcaaaaa 240 gagctggaca ttttagaagt ttatttacct gagcagctgt cagaagaaga gctgcgtaca 300 atcgtaaatg aaaccatcgc ggaggtcggt gcgagctcaa aagcggacat gggcaaagtg 360 atgggggcaa ttatgcctaa agtaaaaggt aaagctgacg gaagtttaat taataagctt 420 gtgagcagtc aactgtctta aatggcaaag aaaaggacat ctttctaaga gagatgtctt 480 tttttataca taaaaaaatg aaacctttga tacatttgtt acgtatgaag agaaggcact 540 tattataaaa ggaaggaggg atacaccgcc cttgcttcaa atcaaagga 589 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0030-RBS) <400> 65 attaaagagg agaaatacta g 21 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0031-RBS) <400> 66 tcacacagga aacctactag 20 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0032-RBS) <400> 67 tcacacagga aagtactag 19 <210> 68 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0033-RBS) <400> 68 tcacacagga ctactag 17 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0034-RBS) <400> 69 aaagaggaga aatactag 18 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (BBa_B0035-RBS) <400> 70 attaaagagg agaatactag 20 <210> 71 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RBS_tuaD) <400> 71 gacactgcga ccattataaa ttggaagatc attttacagg agagggttga gcgct 55 <210> 72 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RBS_pET) <400> 72 aataattttg tttaacttta agaaggagat atacat 36 <210> 73 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (tuaD_gene) <400> 73 gtgaaaaaaa tagctgtcat tggaacaggt tatgtaggac tcgtatcagg cacttgcttt 60 gcggagatcg gcaataaagt tgtttgctgt gatatcgatg aatcaaaaat cagaagcctg 120 aaaaatgggg taatcccaat ctatgaacca gggcttgcag acttagttga aaaaaatgtg 180 ctggatcagc gcctgacctt tacgaacgat atcccgtctg ccattcgggc ctcagatatt 240 atttatattg cagtcggaac gcctatgtcc aaaacaggtg aagctgattt aacgtacgtc 300 aaagcggcgg cgaaaacaat cggtgagcat cttaacggct acaaagtgat cgtaaataaa 360 agcacagtcc cggttggaac agggaaactg gtgcaatcta tcgttcaaaa agcctcaaag 420 gggagatact catttgatgt tgtatctaac cctgaattcc ttcgggaagg gtcagcgatt 480 catgacacga tgaatatgga gcgtgccgtg attggttcaa caagtcataa agccgctgcc 540 atcattgagg aacttcatca gccattccat gctcctgtca ttaaaacaaa cctagaaagt 600 gcagaaatga ttaaatacgc cgcgaatgca tttctggcga caaagatttc ctttatcaac 660 gatatcgcaa acatttgtga gcgagtcggc gcagacgttt caaaagttgc tgatggtgtt 720 ggtcttgaca gccgtatcgg cagaaagttc cttaaagctg gtattggatt cggcggttca 780 tgttttccaa aggatacaac cgcgctgctt caaatcgcaa aatcggcagg ctatccattc 840 aagctcatcg aagctgtcat tgaaacgaac gaaaagcagc gtgttcatat tgtagataaa 900 cttttgactg ttatgggaag cgtcaaaggg agaaccattt cagtcctggg attagccttc 960 aaaccgaata cgaacgatgt gagatccgct ccagcgcttg atattatccc aatgctgcag 1020 cagctgggcg cccatgtaaa agcatacgat ccgattgcta ttcctgaagc ttcagcgatc 1080 cttggcgaac aggtcgagta ttacacagat gtgtatgctg cgatggaaga cactgatgca 1140 tgcctgattt taacggattg gccggaagtg aaagaaatgg agcttgtaaa agtgaaaacc 1200 ctcttaaaac agccagtcat cattgacggc agaaatttat tttcacttga agagatgcag 1260 gcagccggat acatttatca ctctatcggc cgtcccgctg ttcggggaac ggaaccctct 1320 gacaagtatt ttccgggctt gccgcttgaa gaattggcta aagacttggg aagcgtcaat 1380 ttataa 1386 <210> 74 <211> 417 <212> PRT <213> Streptococcus zooepidemicus <400> 74 Met Arg Thr Leu Lys Asn Leu Ile Thr Val Val Ala Phe Ser Ile Phe 1 5 10 15 Trp Val Leu Leu Ile Tyr Val Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Gly 20 25 30 Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Val Lys 35 40 45 Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lys Pro Phe Lys Gly Arg Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Lys Val Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Leu Ala 85 90 95 Glu Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asp Glu Thr Gly Ile Lys 100 105 110 Arg Ile Glu Asp Tyr Val Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn Val 115 120 125 Ile Val His Arg Ser Glu Lys Asn Gln Gly Lys Arg His Ala Gln Ala 130 135 140 Trp Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser 145 150 155 160 Asp Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe 165 170 175 Asn Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn 180 185 190 Arg Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn 195 200 205 Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu 210 215 220 Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val Pro 225 230 235 240 Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gln Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Ser 245 250 255 Ile Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys 260 265 270 Thr Val Tyr Gln Ser Thr Ala Lys Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys 275 280 285 Met Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe 290 295 300 Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val 305 310 315 320 Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr 325 330 335 Ser Val Val Asp Phe Phe Val Gly Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu 340 345 350 Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg 355 360 365 Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Leu Ser Phe Leu Leu Ser Pro 370 375 380 Phe Tyr Gly Val Leu His Leu Phe Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu 405 410 415 Leu <210> 75 <211> 1254 <212> DNA <213> Streptococcus zooepidemicus <400> 75 atgagaacat taaaaaacct cataactgtt gtggccttta gtattttttg ggtactgttg 60 atttacgtca atgtttatct ctttggtgct aaaggaagct tgtcaattta tggctttttg 120 ctgatagctt acctattagt caaaatgtcc ttatcctttt tttacaagcc atttaaggga 180 agggctgggc aatataaggt tgcagccatt attccctctt ataacgaaga tgctgagtca 240 ttgctagaga ccttaaaaag tgttcagcag caaacctatc ccctagcaga aatttatgtt 300 gttgacgatg gaagtgctga tgagacaggt attaagcgca ttgaagacta tgtgcgtgac 360 actggtgacc tatcaagcaa tgtcattgtt catcggtcag agaaaaatca aggaaagcgt 420 catgcacagg cctgggcctt tgaaagatca gacgctgatg tctttttgac cgttgactca 480 gatacttata tctaccctga tgctttagag gagttgttaa aaacctttaa tgacccaact 540 gtttttgctg cgacgggtca ccttaatgtc agaaatagac aaaccaatct cttaacacgc 600 ttgacagata ttcgctatga taatgctttt ggcgttgaac gagctgccca atccgttaca 660 ggtaatatcc ttgtttgctc aggtccgctt agcgtttaca gacgcgaggt ggttgttcct 720 aacatagata gatacatcaa ccagaccttc ctgggtattc ctgtaagtat tggtgatgac 780 aggtgcttga ccaactatgc aactgattta ggaaagactg tttatcaatc cactgctaaa 840 tgtattacag atgttcctga caagatgtct acttacttga agcagcaaaa ccgctggaac 900 aagtccttct ttagagagtc cattatttct gttaagaaaa tcatgaacaa tccttttgta 960 gccctatgga ccatacttga ggtgtctatg tttatgatgc ttgtttattc tgtggtggat 1020 ttctttgtag gcaatgtcag agaatttgat tggctcaggg ttttagcctt tctggtgatt 1080 atcttcattg ttgccctgtg tcggaacatt cattacatgc ttaagcaccc gctgtccttc 1140 ttgttatctc cgttttatgg ggtgctgcat ttgtttgtcc tacagccctt gaaattatat 1200 tctcttttta ctattagaaa tgctgactgg ggaacacgta aaaaattatt ataa 1254 <210> 76 <211> 417 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_MT_prt) <400> 76 Met Arg Thr Leu Lys Asn Leu Ile Thr Val Val Ala Phe Ser Ile Phe 1 5 10 15 Trp Val Leu Leu Ile Tyr Val Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Gly 20 25 30 Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Val Lys 35 40 45 Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lys Pro Phe Lys Gly Arg Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Leu Ala 85 90 95 Glu Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asp Glu Thr Gly Ile Lys 100 105 110 Arg Ile Glu Asp Tyr Val Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn Val 115 120 125 Ile Val His Arg Ser Glu Lys Asn Gln Gly Lys Arg His Ala Gln Ala 130 135 140 Trp Ala Phe Gly Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser 145 150 155 160 Asp Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe 165 170 175 Asn Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn 180 185 190 Arg Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn 195 200 205 Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu 210 215 220 Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val Pro 225 230 235 240 Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gln Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Ser 245 250 255 Ile Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys 260 265 270 Thr Val Tyr Gln Ser Thr Ala Arg Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys 275 280 285 Met Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe 290 295 300 Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val 305 310 315 320 Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr 325 330 335 Ser Val Val Asp Phe Phe Val Gly Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu 340 345 350 Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg 355 360 365 Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Leu Ser Phe Leu Leu Ser Pro 370 375 380 Phe Tyr Gly Val Leu His Leu Phe Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu 405 410 415 Leu <210> 77 <211> 1254 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_MT_dna) <400> 77 atgagaacat taaaaaacct cataactgtt gtggccttta gtattttttg ggtactgttg 60 atttacgtca atgtttatct ctttggtgct aaaggaagct tgtcaattta tggctttttg 120 ctgatagctt acctattagt caaaatgtcc ttatcctttt tttacaagcc atttaaggga 180 agggctgggc aatatagggt tgcagccatt attccctctt ataacgaaga tgctgagtca 240 ttgctagaga ccttaaaaag tgttcagcag caaacctatc ccctagcaga aatttatgtt 300 gttgacgatg gaagtgctga tgagacaggt attaagcgca ttgaagacta tgtgcgtgac 360 actggtgacc tatcaagcaa tgtcattgtt catcggtcag agaaaaatca aggaaagcgt 420 catgcacagg cctgggcctt tggaagatca gacgctgatg tctttttgac cgttgactca 480 gatacttata tctaccctga tgctttagag gagttgttaa aaacctttaa tgacccaact 540 gtttttgctg cgacgggtca ccttaatgtc agaaatagac agaccaatct cttaacacgc 600 ttgacagata ttcgctatga taatgctttt ggcgttgaac gagctgccca atccgttaca 660 ggtaatatcc ttgtttgctc aggtccgctt agcgtttaca gacgcgaggt ggttgttcct 720 aacatagata gatacatcaa ccagaccttc ctgggtattc ctgtaagtat tggtgatgac 780 aggtgcttga ccaactatgc aactgattta ggaaagactg tttatcaatc cactgctaga 840 tgtattacag atgttcctga caagatgtct acttacttga agcagcaaaa ccgctggaac 900 aagtccttct ttagagagtc cattatttct gttaagaaaa tcatgaacaa tccttttgta 960 gccctatgga ccatacttga ggtgtctatg tttatgatgc ttgtttattc tgtggtggat 1020 ttctttgtag gcaatgtcag agaatttgat tggctcaggg ttttagcctt tctggtgatt 1080 atcttcattg ttgccctgtg tcggaacatt cattacatgc ttaagcaccc gctgtccttc 1140 ttgttatctc cgttttatgg ggtgctgcat ttgtttgtcc tacagccctt gaaattatat 1200 tctcttttta ctattagaaa tgctgactgg ggaacacgta aaaaattatt ataa 1254 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_Seq_forward) <400> 78 cttccaaatt ccagttactc gt 22 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (hasA_Seq_reverse) <400> 79 caaagcaagt gcctgatacg 20

Claims (15)

  1. 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 히알루론산 합성효소(hasA)의 66번째 리신이 아르기닌으로 치환된 변이, 148번째 글루탐산이 글리신으로 치환된 변이 및 280번째 리신이 아르기닌으로 치환된 변이를 포함하는, 히알루론산 합성효소 변이 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이 단백질은, 서열번호 75의 염기서열로 이루어진 야생형 히알루론산 합성효소(hasA)를 암호화하는 유전자에서 197번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이, 443번째 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이, 및 839번 아데닌이 구아닌으로 치환된 변이를 포함하는 염기서열에 의해 암호화되는 것인 히알루론산 합성효소 변이 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이 단백질은 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어진, 히알루론산 합성효소 변이 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변이 단백질은 서열번호 77의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화되는 것인, 히알루론산 합성효소 변이 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 합성효소 변이 단백질을 암호화하는, 히알루론산 합성효소 변이 유전자.
  6. 작동 가능하도록 연결된, 전사 프로모터, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 합성효소 변이 단백질을 암호화하는 히알루론산 합성효소 변이 유전자, 리보솜 결합 부위 및 tuaD 유전자를 포함하는, 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 전사 프로모터는 항시 발현 프로모터인, 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항시 발현 프로모터는 P43, Pmsm, Ppbp, Pylb, Pyob, Pyqe, Pyvl 또는 Psigx인, 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항시 발현 프로모터는 서열번호 39 및 40, 서열번호 41 및 42, 서열번호 43 및 44, 서열번호 45 및 46, 서열번호 47 및 48, 서열번호 49 및 50, 서열번호 51 및 52, 또는 서열번호 53 및 54로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 것인 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항시 발현 프로모터는 서열번호 62 내지 64 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드인, 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  11. 제6항에 있어서, 상기 리보솜 결합부위는 BBa_B0030(서열번호 65), BBa_B0034(서열번호 69), 또는 BBa_B0035(서열번호 70)인 것인, 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  12. 제6항에 있어서, 상기 발현 시스템은 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스에서 히알루론산을 생산하는 것인, 히알루론산 생산용 발현 시스템.
  13. 제6항에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 재조합 균주.
  14. 제13항에 있어서, 상기 재조합 균주는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스인, 히알루론산 생산용 재조합 균주.
  15. 제6항에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 재조합 균주를 배양하여 배양물을 얻는 단계를 포함하는 재조합 균주를 이용한 히알루론산의 생산 방법.
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