KR102127911B1

KR102127911B1 - 면역 증진용 발효음료 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102127911B1
Application number: KR1020170162892A
Authority: KR
Inventors: 양승민; 오치두
Original assignee: 주식회사 건강을 지키는 사람들
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2020-06-29
Anticipated expiration: 2037-11-30
Also published as: KR20190063831A

Abstract

본 발명은 면역 증진용 발효음료 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배와 더덕을 유효성분으로 하여 면역 증진에 활성을 갖는 발효음료 및 이를 이용한 가공 식품의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 여러 구현예에 따르면, 배와 더덕을 유효성분으로 하여 면역 증진에 활성을 갖는 면역 증진용 발효음료를 제조할 수 있다.
또한, 상기 발효음료는 과립화된 제형으로 가공하여 다양한 가공 식품으로 응용이 가능하다.

Description

면역 증진용 발효음료 및 이의 제조방법{The composition of fermented beverage for immunity enhancement and method for production thereof}

본 발명은 면역 증진용 발효음료 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배와 더덕을 유효성분으로 하여 면역 증진에 활성을 갖는 발효음료 및 이를 이용한 가공 식품의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 요구르트라 부르는 유산균 음료는 기원전부터 인간이 이용하여온 식품의 일종으로서 영양적인 가치 뿐만 아니라 여러 가지 생리적인 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 생성된 유산이 제품의 보존 기간을 늘려주며, 특유의 상쾌한 신맛을 주고, 유해 미생물에 대한 생장 억제기능을 발휘하며, 유단백질의 소화율을 높이고, 칼슘, 철, 인의 흡수를 촉진시키는 등 생유에 비하여 다양한 장점을 지고 있다.

또한, 우리나라에서는 예로부터 유산균을 이용한 음료로서 상기와 같은 발효유 외에 동치미 및 나박김치 등 김치 유산균에 의해 발효된 김치의 국물을 떡 등의 음식을 먹을 때 음료로서 음용해 왔다.

배는 그 과육이 주로 수분으로 이루어져 있는데, 당도는 11 Brix 내외로, 의학문헌에 따르면 배는 위궤양, 변비, 이뇨작용 촉진에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 담, 해열, 기침 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 배에 많이 들어있는 섬유나 효소가 대도시에 많이 발생되고 있는 미세먼지와 튀김식품으로 인한 독성물질을 배설시킴으로써, 발암작용을 억제하는 효과를 나타내고 있으며, 배에 함유된 기능성물질인 플라보노이드류 중 퀘르세틴은 항암이나 항산화 작용에 탁월하고, 투테올린은 기관지염, 가래, 기침을 다스리는 효과가 있다고 알려져 있다.

그러나, 배는 과일의 특성상 그 보존기간이 짧고 보존조건이 까다로워서, 장시간 보관하면서 섭취하는데 어려움이 있으며, 수확기가 지나 늦게 수확된 배는 대부분 바람이 들어있어 그 당도는 높지만 과일로 섭취하기에는 어려운 상태가 되어 주로 폐기 처분되는 경우가 많다.

따라서, 본 발명에서는 배와 더덕을 유효성분으로 하는 발효음료를 제조하여, 면역 증진에 활성을 갖는 발효음료를 제공하고자 하는 것이다.

한국공개특허 제2017-0119008호

본 발명의 목적은 배와 더덕을 유효성분으로 하여 면역 증진에 활성을 갖는 면역 증진용 발효음료를 제공하고자 하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 배와 더덕을 유효성분으로 하는 발효액을 제조하고, 이를 과립화된 제형으로 가공하여 다양한 가공식품으로 응용하고자 하는 것이다.

본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 배, 더덕 및 유산균을 유효성분으로 하는 면역 증진용 발효음료에 관한 것이다.

상기 유산균은 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii)인 것이 바람직하다[기탁번호: KCCM11136P].

본 발명의 다른 대표적인 일 측면에 따르면, (a) 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계; 및

(b) 상기 혼합물을 발효시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 발효음료의 제조방법에 관한 것이다.

상기 유산균은 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii)이고,

상기 락토바실러스 호모히오키이 균주의 생균 수는 1.0 × 10¹⁰내지 1.0 × 10¹²cfu/g인 것이 바람직하다[기탁번호: KCCM11136P].

상기 (a) 단계는 배 고형분과 더덕 분말을 1 내지 5 : 5 내지 15의 중량 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 (b) 단계는 25 내지 40 ℃의 온도에서 1 내지 10일 동안 발효시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 대표적인 일 측면에 따르면, (a) 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 발효시키는 단계; 및

(c) 상기 발효된 발효액에 첨가제를 투입하고 반죽 및 성형하여 제형화하는단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 가공 식품의 제조방법에 관한 것이다.

상기 첨가제는 더덕, 도라지, 은행, 감초, 박하향, 생강, 비타민 C, 홍삼농축액, 유당, 결정셀룰로오스, 프락토올리고당, 정향, 콩, 미숫가루, 매실 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 배와 더덕을 유효성분으로 한여 면역 증진에 활성을 갖는 면역 증진용 발효음료를 제조할 수 있다.

또한, 상기 발효음료는 과립화된 제형으로 가공하여 다양한 가공 식품으로 응용이 가능하다.

도 1의 (a)는 실시예 2와 비교예 3의 효모 발효 여부를 확인한 결과를 나타낸 사진이고, (b)는 실제 배 + 더덕 발효액을 나타낸 사진이다.
도 2는 실시예 4의 과립화된 가공 식품을 스틱 포장하기 전의 모습을 나타낸 사진이다.
도 3은 동물 실험군을 미세먼지(연무)에 노출시키기 전(a)과 후(b)를 나타낸 사진이다.
도 4는 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 TNF-α에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다
도 5는 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 Interleukin-6(IL-6)에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 INF-γ에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 IL-10에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 IL-1β에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 동물의 비장무게에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 혈청 aminotransferase 함량 변화에 미치는 영향을 분석한 것으로, (a)는 AST, (b)는 ALT 결과를 나타낸다.
도 11은 실시예 2 시료의 용량별 투여에 따른 Leukocytes 함량 변화에 미치는 영향을 분석한 것으로, (a)는 WBC, (b)는 Neutrophils, (c)는 Lymphocytes, (d)는 Monocytes, (e)는 EO 결과를 나타낸다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 배, 더덕 및 유산균을 유효성분으로 하는 면역 증진용 발효음료를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, (a) 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계; 및

(b) 상기 혼합물을 발효시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 발효음료의 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계는 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계이다.

보다 상세하게는, 상기 (a) 단계는 배 고형분과 더덕 분말을 1 내지 5 : 5 내지 15의 중량 비율로 혼합하는 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 후공정인 발효가 잘 이루어지지 않을 우려가 있어 바람직하다. 더욱 바람직하게는 2 내지 3 : 8 내지 12인 것으로 상기 범위 내에서 발효 후 유기산 함량이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.

상기 배는 배즙 형태로 사용하는 것이 더욱 바람직한데, 이는 배의 불순물을 최소화하고 발효시키는데 더욱 효과적이다. 상기 배는 배즙 형태로 사용할 경우, 고형분이 2.5 내지 3.5 중량%(wt%)인 것이 바람직한데, 이는 상술한 배 고형분의 함량 범위를 충족시키기 위함이다.

상기 더덕은 분말 형태로 사용하는 것이 효과적이다.

상기 유산균은 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii)인 것으로, 상기 락토바실러스 호모히오키이 균주의 생균 수는 1.0 × 10¹⁰내지 1.0 × 10¹²cfu/g인 것이 바람직하다. 상기 생균 수를 갖는 락토바실러스 호모히오키이를 사용했을 때 발효 효율이 가장 뛰어난 것을 확인하였다[기탁번호: KCCM11136P].

상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계를 통해 혼합된 혼합물을 발효시키는 단계이다.

상기 발효는 25 내지 40 ℃의 온도에서 1 내지 10일 동안 수행되는 것이 바람직한데, 상기 온도 및 시간 범위를 벗어나는 경우에는 유기산 함량이 급격히 저하될 수 있어 바람직하지 않다. 더욱 바람직하게는 25 내지 35 ℃의 온도로 2 내지 5일 동안 수행되는 것이며, 상기 범위 내에서 유기산 함량 및 플라보노이드의 함량이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, (a) 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 발효시키는 단계; 및

(c) 상기 발효된 발효액에 첨가제를 투입하고 반죽 및 성형하여 제형화하는단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 가공 식품의 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계와 (b) 단계는 앞서 발효음료의 제조방법에서 설명한 내용과 동일하므로 생략하기로 한다.

상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계를 통해 발효된 발효액에 첨가제를 투입하고 반죽 및 성형하여 제형화하는 단계이다.

더욱 바람직하게는 상기 첨가제는 더덕, 도라지, 은행, 감초, 박하향, 생강, 비타민 C, 홍삼농축액, 유당 및 결정셀룰로오스가 혼합된 것으로, 상기 종류의 첨가제를 혼합하여 사용했을 때 액상의 발효액을 과립화할 수 있었으며, 이렇게 과립화된 가공 식품은 발효액의 맛과 향, 그리고 풍미를 유지할 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 가공 식품은 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류를 특별히 제한하지 않는다. 상기 건강기능식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예 1 내지 3: 배 + 더덕의 발효액 제조

배즙(고형분: 3%)에 더덕 분말 및 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii) 1.0×10¹¹cfu/g을 혼합하여 30 ℃의 온도에서 2일간 발효시켜 발효액을 제조하였으며, 각 원료의 배합비율은 하기 표 1과 같다[기탁번호: KCCM11136P].

구분(중량%)	배즙	더덕분말	미생물(Lactobacillus homohiochii)
실시예 1	94.9	5	0.1
실시예 2	89.9	10	0.1
실시예 3	84.9	15	0.1

실시예 4: 배 + 더덕 발효액을 포함하는 가공식품 제조

실시예 2의 발효액 28 중량%, 더덕 분말 10 중량%, 도라지 분말 10 중량%, 은행 분말 4 중량%, 감초 분말 4 중량%, 박하향 2 중량%, 생강 분말 2 중량%, 비타민 C 2 중량%, 홍삼농축액 1 중량%, 유당 29 중량% 및 결정셀룰로오스 8 중량%를 혼합하고 반죽한 후, 성형하여 과립화하였다. 그리고 50 ℃의 온도에서 4시간 동안 건조시켜 수분 함량이 5 중량% 이하가 되도록 한 후, 스틱 포장하여 가공식품으로 제조하였다.

비교예 1: 배의 발효액 제조

배즙(고형분: 3wt%) 100 중량%에 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii) 1.0×10¹¹cfu/g 0.1 중량%를 혼합하여 30 ℃의 온도에서 2일간 발효시켜 발효액을 제조하였다[기탁번호: KCCM11136P].

비교예 2: 배 + 도라지의 발효액 제조

실시예 2와 동일하게 실시하되, 더덕 분말 대신에 도라지 분말을 사용하여 발효액을 제조하였다.

비교예 3: 수세미도라지배 + 더덕의 발효액 제조

실시예 2와 동일하게 실시하되, 배즙 대신에 수세미도라지배즙(고형분: 3wt%)을 사용하여 발효액을 제조하였다.

실험예 1: 실시예 1 내지 3 발효액의 발효 시간 경과에 따른 성분 평가

당도계(MSTER-53T, ATAGO, Japen)를 사용하여 당도를 측정하였으며, pH는 검체 약간을 취하여 pH-meter기(Orion 420 A+, USA)를 사용하여 측정하였다. 또한, 유기산 산도는 2008년 건강기능식품공전을 참고하여 측정하였는데, 구체적으로, 각 시료액 약 10 g에 증류수 90 ml을 가해 균질화 시킨 다음 0.1N-NaOH용액으로 pH가 8.3이 될 때까지 적정하여 소비된 0.1N-NaOH의 양(ml)을 lactic acid 함량(%)으로 환산하여 유기산 산도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

구분	발효기간(일)	당도(brix)	pH	유기산 산도(%)
실시예 1	0	13.2	-	-
	1	13.0	4.23	0.72
	2	12.8	4.00	1.11
실시예 2	0	16.0	-	-
	1	15.7	4.30	0.97
	2	15.6	4.01	1.45
실시예 3	0	20.0	-	-
	1	18.5	4.23	1.12
	2	18.5	4.09	1.63

상기 표 2를 참조하면, 발효기간이 경과 함에 따라 당도, pH는 낮아지는 것을 알 수 있으며, 또한, 더덕분말 함량이 많을수록 유기산 산도가 높았으며, 더덕분말 15% 함유 발효액이 1.63%로 가장 높은 것을 확인할 수 있다.

실시예 1 내지 3의 발효물에 대한 관능검사를 실시하기 위하여, 5 명의 관능검사인원을 선별하여, 2일 발효 후에 검체 번호 임의 지정 후 질감, 맛, 향 등 러프하게 실시하였다.

그 결과, 더덕분말 10% 함유 발효액(실시예 2)에 대한 선호도 가장 좋았으며, 더덕분말 5% 함유 발효액(실시예 1)의 경우 전반적으로 무난하였으나 최종제품 첨가 시 고형분의 수율이 낮아 비효율적일 것으로 판단되었다. 또한, 더덕분말 15% 함유 발효액(실시예 3)은 고형분의 함량이 높아 최종제품 생산 시 효율적일 수 있으나, 발효 과정 중 내용물(더덕분말)이 표면에 노출되는 부분이 많아 변질의 위험성이 많으며 살균 공정의 어려움이 있었다.

결과적으로 발효액의 배합비율은 배즙 : 더덕분말 : 미생물 = 89.9 : 10 : 0.1인 것이 당도, pH, 유기산 산도 및 관능평가 결과 가장 좋은 것으로 나타났다.

또한, 실시예 2에 따른 배즙, 더덕분말 및 플란타김치유산균을 30 ℃의 온도에서 0, 1, 2, 3, 4일까지 발효 시킨 후에 발효 시간 별 당도, pH, 유기산 산도 및 유기산 함량 등을 분석하였다.

구분	발효기간(일)	당도(brix)	pH	유기산 산도(%)
실시예 2	0	17.5	5.38	0.31
	1	17.1	4.14	1.00
	2	16.9	4.05	1.43
	3	16.5	4.04	1.61
	4	16.5	4.04	1.72

발효기간(일)	유기산 함량(%)
발효기간(일)	Citric acid	Malic acid	Latic acid	Acetic acid	Pyroglutamic acid	Total
0	0.733	0.414	0.493	1.268	0.054	2.962
1	0.081	0.031	0.129	0.034	0.008	0.282
2	0.376	0.193	1.206	0.263	0.041	2.079
3	1.297	0.322	2.338	0.485	0.074	4.516
4	1.153	0.314	2.310	0.448	0.074	4.300

상기 표 3의 결과에 따르면, 발효기간이 경과 함에 따라 당도 및 pH는 낮아지며, 유기산 산도 및 함량이 높아지는 것을 알 수 있다. 특히, 유기산 산도의 경우 4일 발효액이 1.72%로 발효 전 대비 82%가까이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

유기산 함량 결과인 표 4에 따르면, 발효기간이 경과함에 따라 유기산 함량도 함께 증가하는 것을 알 수 있다. 특히, 발효 3일째 4.516%로 가장 높았으며, 발효 전 대비 34%이상 증가한 것을 확인할 수 있다.

총 폴리페놀을 측정하기 위해서는 Methanol로 용해하여 1 mg/mL 농도로 준비한 시료 100 μL에 Folin-Denis reagent(Fluka, Buchs, Switzerland)를 100 μL을 가하여 혼합한 후 3분간 실온에 반응시킨 후, 10% sodium carbonate solution 100 μL을 가하여 혼합하고 1시간 반응시킨 후 상층액을 취하여 Microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 폴리페놀 함량은 Methanol에 녹인 10 μg/mL, 20 μg/mL, 30 μg/mL, 40 μg/mL, 50 μg/mL 의 gallic acid의 표준곡선을 이용하여 구하였다.

총 플라보노이드는 methanol로 용해하여 1 mg/mL 농도로 준비한 시료 100 μL에 diethylene glycol을 1 mL씩 가하여 혼합한 후, 1 N NaOH를 100 μL 가하여 잘 혼합하고 37 ℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시키고, 반응이 완료되면 Microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

표준물질로는 naringin을 사용하였으며 10 μg/mL, 20 μg/mL, 30 μg/mL, 40 μg/mL, 50 μg/mL 농도의 표준검량곡선을 작성하여 총 플라보노이드 함량을 환산하였다.

또한, DPPH 라디칼 소거능을 측정하였으며, 실험방법은 먼저, 시료는 methanol을 이용하여 1 mg/mL 농도로 준비하였고, DPPH 시약은 빛을 차단한 상태에서 0.1 mM 농도가 되도록 methanol에 녹여 준비하였다. 상기 시료 100 μL과 DPPH 시약 0.5 mL을 넣고 20분 동안 빛을 차단한 조건에서 반응시킨 후 Microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

음성대조군으로 시료 대신 methanol을 사용하였고, 양성대조군으로는 시료 대신 ascorbic acid(1 mg/mL)를 가하여 동일한 조건으로 실험을 수행하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 다음과 같은 식을 이용하여 DPPH 억제율(Inhibitory activity, %)을 산출하였다.

DPPH inhibition (%) = [1-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도)]×100 …… 식)

구분	발효기간(일)	Polyphenol(mg/kg)	Flavonoid(mg/kg)	DPPD 소거능
실시예 2	0	0	101.43	21.04ㅁ0.34
	1	0	22.51	21.98ㅁ1.28
	2	8.99	22.51	23.11ㅁ0.88
	3	27.55	35.67	26.46ㅁ1.64
	4	33.74	22.51	22.02ㅁ0.95

상기 표 5에 따르면, 총 폴리페놀은 발효기간이 경과함에 따라 증가하였고, 총 플라보노이드는 발효 기간 중 발효 3일째의 발효액이 35.67mg/kg으로 가장 많은 함량 보이는 것을 알 수 있다.

DPPH 라디칼 소거능의 경우 발효 기간 중 발효 3일째의 발효액이 26.46ㅁ1.64로 소거능 가장 좋았으며, 결과적으로, 발효기간이 3, 4일인 경우에 데이터가 유의적으로 큰 차이를 보이지 않아 배즙, 더덕분말 유산균 발효기간은 3일이 가장 좋은 것으로 판단된다. 따라서, 상기 실시예의 발효액은 폴리페놀과 플라보노이드가 높은 함량으로 함유되어 있어 면역 증진 활성에 효과적임을 확인할 수 있다.

실험예 2: 당도, pH, 유기산 산도, 유기산 함량 변화 분석

실험예 1과 동일한 방법으로 실시하여 실시예 2 및 비교예 1 내지 3의 발효액에 대한 당도, pH, 유기산 산도 변화와 유기산함량을 분석하여 그 결과를 하기 표 6, 7에 나타내었다.

구분	발효기간(일)	당도(brix)	pH	유기산 산도(%)
실시예 2	1	15.9	4.32	1.07
실시예 2	2	15.9	4.06	1.35
비교예 1	1	11.9	4.17	0.48
비교예 1	2	11.9	3.92	0.66
비교예 2	1	17.1	4.22	1.08
비교예 2	2	17.1	4.14	1.32
비교예 3	1	17.1	4.41	0.80
비교예 3	2	16.9	4.13	1.36

구분	발효기간(일)	유기산 함량(%)
구분	발효기간(일)	Malic acid	Latic acid	Acetic acid	Pyroglutamic acid	Fumaric acid	Total
실시예 2	0	0.6897	0.8102	-	-	0.0034	1.5033
	1	0.3464	1.5752	0.1855	-	-	2.1071
	2	0.4117	1.6762	0.2370	-	-	2.3249
비교예 1	0	0.4635	-	-	-	0.0021	0.4656
	1	0.2529	0.6684	0.0318	-	-	0.9531
	2	0.3565	1.1316	0.1194	-	-	1.6075
비교예 2	0	0.6630	0.8679	-	0.0393	0.0030	1.5732
	1	0.2792	1.2624	0.0673	0.0274	-	1.6363
	2	0.2918	1.6046	0.1253	0.0337	-	2.0554
비교예 3	0	0.4257	0.9642	0.2434	0.0222	-	1.6555
	1	0.8097	1.0030	-	0.0242	0.0050	1.8419
	2	0.3831	1.5709	0.1405	0.0194	-	2.1139

상기 표 6을 참조하면, 당도는 발효기간이 경과 하여도 일정하게 유지되며, pH, 유기산 산도는 발효기간에 경과 함에 따라 pH는 낮아지면서 유기산 산도는 증가하는 것을 알 수 있다.

또한, 표 7을 참조하면, 모두 발효기간에 경과 함에 따라 유기산 함량이 높아졌으며, 비교예 1의 경우, 발효시킨 원료에 비해 분말 혼합 발효액의 유기산 함량이 휠씬 높은 것을 알 수 있다.

특히, 발효 전(0 일) 대비 발효 종료 후 증가율은 배즙+더덕분말 혼합 발효액인 실시예 2의 경우, 35.34%로 가장 높게 확인되었으며, 발효 종료 시 함량도 2.3249%로 가장 높은 것을 확인할 수 있다.

도 1은 실시예 2와 비교예 3의 효모 발효 여부를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 모두 배양 3일째 효모가 확인되었다.

실험예 3: 면역력 평가

실험 재료

1. 동물 준비: 체중이 약 170∼180 g의 Sprague Dawley계의 백서를 항온항습 환경의 사육장(실내온도 24∼26 ℃, 습도 40∼60%)내에서 고형사료(Pellet, GMO, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.

2. 시료 준비: 건강을 지키는 사람들에서 제조한 면역력 향상 약 2L(실시예 2)를 Rotary evaporator(Buchi, Netheland)로 수분을 증발시켜 400 ml로 감압 농축하여 3일간 열풍건조를 하여 355g 건조시료를 얻었다.

실험 방법

1. 군 분리: 실험군은 아무처치를 하지 않은 Intact군(n=6), 미세먼지 노출 및 면역저하 유발 후 시술을 하지 않은 control군(n=6), 미세먼지 노출 및 면역저하 유발 후 시료투여 50mg/㎏ 군(n=6), 미세먼지 노출 및 면역저하 유발 후 시료투여 100mg/㎏ 군(n=6), 미세먼지 노출 및 면역저하 유발 후 시료투여 200mg/㎏ 군(n=6)으로 분리하였다.

2. 미세먼지 노출: Urban Particular Matter(Standard Reperance Matter,1648a : NIST, USA)를 구입하여 연무기를 사용하여 1% Urban Particular Matter(Particle Diameter : 0.135㎛)를 PBS에 녹여 10분(1회) 간 4회 미세먼지를 노출시켰다. 시료투여 9일째, 10일째, 16일째, 17일째 되는 날 1회/1일 총 4회 연무기를 사용하여 미세먼지를 노출시키되, 오전에 실시하였다.

3. Immunodeficiency 유발: Methotrexate(Sigma, USA) 2mg/㎏을 구강투여하고, Methotrexate 시료투여 9일째 되는 날부터 연속 4일간 4회/1일 유발하였으며, 상기 유발은 오후에 실시하였다.

4. 시료투여: 건조시킨 면역력 향상 약은 50mg/㎏, 100mg/㎏, 200mg/㎏ 농도로 제조한 후 20일간 음용수에 섞어 투여하였다.

5. 체중 및 비장무게 측정: 체중은 전자 저울(Cass, China)을 이용하여 시료투여전 0일쩨, 시료투여 5일째, 시료투여 10일째, 시료투여 15일째, 시료투여 20일째 흰쥐의 무게를 총 5회 측정하였다. 비장무게는 실험 종료 후 비장을 분리해 전자 저울(OHAUS, USA)을 이용하여 측정하였다.

6. 혈액 및 혈청학적 검사: 채혈에 의하여 얻어진 혈액 중 약 100 μl를 EDTA-bottle에 넣은 후 곧바로 Multispecies Hematology Analyser(950, Hemavet, USA)에 주입하여 Leukocytes, Erythrocytes, Thrombocytes를 측정하였다. 나머지 혈액은 원심분리기 (VS 6000CFI, Vision, Korea)에서 3,000 rpm으로 20분간 시행하여 혈청을 분리하였으며, 혈청 분석으로는 AST, ALT, Albumin, Bun, Creatine을 Dri-chem 4000i(Fujifilm corp. Japan)으로 측정하였다.

7. ELISA에 의한 Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) 측정: TNF-α 측정은 Rat TNF-α(Invitrogen, USA)를 사용하여 측정하였다. Rat TNF-α 가 코팅된 microplate에 Rat TNF-α standard, serum, control 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개로 테이핑한 후에 1분간 교반하고 실온에 2시간 방치하였다. 세척수 400 ㎕로 4회 세척한 후 Rat TNF-α Biontin Conjugate 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개를 덮고 실온에 1시간 방치하였다. 세척수 400 ㎕로 4회 세척한 후 Streptavidin-HRP Working solution 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개를 덮고 실온에 30분간 방치하였다. 세척수 400 ㎕로 4회 세척한 후 Stabilized Chromogen 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개를 덮고 실온(dark상태)에 30분간 방치하였다. Stop solution 100 ㎕를 플레이트에 넣고 발색반응을 중지시킨 후 microplate reader(EZ Read 400, Biochrom, UK)로 450 ㎚에서 O.D.(Optical density)를 측정하였다. 기준 곡선을 만들어 샘플의 TNF-α 양을 분석하였다.

8. ELISA에 의한 Interleukin-6 (IL-6) 측정: IL-6 측정은 Rat IL-6(BIOMATIK, USA)를 사용하여 측정하였다. Rat IL-6 가 coating된 microplate에 Rat IL-6 standard 100 ㎕, serum, control 50 ㎕에 incubation Buffer 50 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개로 테이핑한 후에 1분간 교반하고 37 ℃에 2시간 방치하였다. 세척수 400 ㎕로 4회 세척한 후 Rt Biotinylated anti IL-6 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개를 덮고 실온에 1시간 방치하였다. 세척수 400 ㎕로 5회 세척한 후 Streptavidin-HRP Working solution 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개를 덮고 37 ℃에 1시간 방치하였다. 세척수 400 ㎕로 5회 세척한 후 TMB Substrate 90 ㎕를 첨가하고 플레이트 덮개를 덮고 실온(dark상태) 30분간 방치하였다. Stop solution 50 ㎕를 플레이트에 넣고 발색반응을 중지시킨 후 microplate reader(EZ Read 400, Biochrom, UK)로 450 ㎚서 OD(Optical density)를 측정하였다. 기준 곡선을 만들어 샘플의 IL-6 양을 분석하였다.

9. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)에 의한 Interferon-γ(IFN-γ), Interleukin-10(IL-10), Interleukin-1β(IL-1β) 측정

① Total RNA 분리

: 적출된 비장은 신속히 급속 냉동시키고 분석할 때까지 -70 ℃에서 보관하였다. Total RNA의 분리는 비장 조직(100mg)을 800 ul Tripure Isolation Reagent(Roche, Gernmany)를 넣고 precellys 24(Bertin technologies, France)에서 균질화하고, 균질액에 200 ㎕ 의 chloroform(Sigma, USA)을 가하여 15 초 동안 흔들어 잘 혼합한 후, 실온상태에서 5 분 방치하고 난 다음 세포 유잔물을 제거하기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상층액과 500 ㎕ 의 isopropanol(sigma, USA)을 첨가하여 실온상태에서 5 분 동안 방치한 후 RNA 펠렛을 얻기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 8 분간 원심분리하고, 원심분리로 생긴 펠렛에 냉장 보관된 70% ethanol과 함께 DEPC를 넣고 4 ℃, 7,500 rpm에서 5 분간 원심분리 후 펠렛만 남기고 모두 제거하고, 남은 에탄올은 실온에서 5 분간 방치시켜 건조시킨 다음 DEPC-treated water에 녹여 spectrophotometer(Eppendorf, Germany)에서 OD260 값을 읽어 RNA의 순도 및 농도를 정량하였다.

② Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

: 분리된 total RNA 5μg과 2.5 μl Oligo(dT), DEPC-treated water를 RT premix(Bioneer, Korea)에 넣어 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)를 이용하여 50 μl cDNA를 합성하여 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용하였다. 이때 하우스 키핑 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)(sense primer: 5'-ACTCCATCACCATCTTCCAG-3', antisense primer: 5'-CCTGCTTTCACCACCTCCTTG-3')를 내부 컨트롤로 사용하였다. Reverse transcription temperature cycle은 42 ℃에서 1 시간 동안 cDNA synthesis, 94 ℃에서 5 분 동안 denature 그리고 4 ℃에서 5 분 동안 냉각시키는 단계를 거쳤다. Polymerase chain reaction은 cDNA, 10pg sense primer , 10pg antisense primer, DEPC-treated water를 PCR premix(Bioneer, Korea)에 넣었다. PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95 ℃에서 300 초 동안 pre-denaturation, 94 ℃에서 40 초 동안 melting, 55 ℃에서 40 초 동안 어닐링하고, 72 ℃에서 90 초 동안 extension하는 과정을 34 회 반복 수행하고 마지막 사이클에서 72 ℃에서 600 초 동안 extension 단계를 거쳐 Interferon-γ(IFN-γ) 유전자증폭은 primer(senseprimer: 5'-AACGCTACACACTGCAATCTTGG-3', Interleukin-10(IL-10) 유전자증폭은 primer(senseprimer: 5'-TGCCTTCAGTCAAGTGAAGAC-3', antisense primer: 5'-AAACTCATTCATGGCCTTGTA-3'), Interleukin-1β(IL-1β) 유전자증폭은 primer(senseprimer: 5'-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3', antisense primer: 5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3')를 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 시행하였다. 이렇게 증폭된 Interferon-γ(IFN-γ), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-1β(IL-1β) DNA를 Greenview nucleic acid gel stain(IO Rodeo, 1:10,000)를 포함한 1.5% agarose gel상에서 0.5x TBE buffer (80 mM Tris-HCL, 80 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.3)로 100 V에서 전기 영동시켜 관찰한 후 Image Station(Samsung, Korea)을 이용하여 촬영하였으며, Alphaease FC StandAlone Software(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.

(단, 모든 측정값은 Excel statistic program(Microsoft, USA)을 이용하여 평균치와 표준오차(mean±standard error)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS(SPSS, USA)를 사용하여 비모수적 방법으로 Mann-Whitney U test를 시행하였다. 각 실험군은 대조군에 비하여 α=0.05 수준(P<0.05)과 α=0.01 수준(P<0.01)에서 유의성을 검정하였다.)

실험 결과

도 4는 TNF-α에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 8 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 TNF-α 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 15.2±1.49 pg/ml, 대조군은 25.1±1.66 pg/ml로 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, 50mg군은 22.9±1.91 pg/ml, 100mg군은 121.1±1.12 pg/ml, 200mg군은 19.4±1.62 pg/ml으로 대조군에 비하여 200mg군은 유의한 감소를 나타내었다.

구분	TNF-α(pg/ml)	Interleukin-6(pg/ml)
Normal	15.2±1.49	124.6±14.2
Control	25.1±1.66##	177.4±18.9
50mg	22.9±1.91	174.4±11.2
100mg	21.1±1.12	159.9±41.0
200mg	19.4±1.62*	151.4±29.3

도 5는 Interleukin-6(IL-6)에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 8 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 IL-6 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 124.6±14.2 pg/ml, 대조군은 177.4±18.9 pg/ml로 정상군에 비하여 대조군은 증가의 경향을 나타내었으며, 50mg군은 174.4±11.2 pg/ml, 100mg군은 159.9±41.0 pg/ml, 200mg군은 151.4±29.3 pg/ml로 대조군에 비하여 100mg군, 200mg군은 감소의 경향을 나타내었다.

도 6은 INF-γ에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 9 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 INF-γ 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 81.1±3.3 (*103 OD)인 것에 비하여 대조군은 119.7±4.9 (*103 OD)로 유의한 증가를 보였고, 대조군에 비하여 50mg군은 113.4±7.8 (*103 OD), 100mg군은 107.7±7.5 (*103 OD), 200mg군은 104.2±3.5 (*103 OD)로 대조군에 비하여 200mg군은 유의한 감소를 나타내었다.

구분	INF-γ(*103 OD)	Interleukin-10(*103 OD)
Normal	81.1±3.3	127.9±4.6
Control	119.7±4.9##	102.2±4.4#
50mg	113.4±7.8	112.7±9.7
100mg	107.7±7.5	114.0±6.8
200mg	104.2±3.5*	122.2±4.9*

도 7은 IL-10에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 9 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 IL-10 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 127.9±4.6 (*103 OD)인 것에 비하여 대조군은 102.2±4.4 (*103 OD)로 유의한 감소를 보였고, 대조군에 비하여 50mg군은 112.7±9.7 (*103 OD), 100mg군은 114.0±6.8 (*103 OD), 200mg군은 122.2±4.9 (*103 OD)로 대조군에 비하여 200mg군은 유의한 증가를 나타내었다.

도 8은 IL-1β에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 10 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 IL-1β 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 121.5±3.3(*103 OD)인 것에 비하여 대조군은 159.0±15.9 (*103 OD)로 증가의 경향을 보였고, 대조군에 비하여 50mg군은 141.6±14.7 (*103 OD), 100mg군은 133.5±12.6 (*103 OD), 200mg군은 128.4±9.8 (*103 OD)로 대조군에 비하여 100mg, 200mg군은 감소의 경향을 나타내었다.

구분	Interleukin-1β(*103 OD)	Weight of Spleen (g)
Normal	121.5±3.3	0.76±0.03
Control	159.0±15.9	0.86±0.04
50mg	141.6±14.7	0.84±0.02
100mg	133.5±12.6	0.83±0.03
200mg	128.4±9.8	0.78±0.06

도 9는 비장무게에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 10 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 비장무게에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 0.76±0.03 g, 대조군은 0.86±0.04 g로 정상군에 비하여 대조군은 증가의 경향을 나타내었으며, 50mg군은 0.84±0.02 g, 100mg군은 0.83±0.03 g, 200mg군은 0.78±0.06 g로 대조군에 비하여 실험군은 유의한 차이를 나타내지는 않았으나 200mg군에서 비장 무게가 감소되는 경향을 나타내었다.

도 10은 혈청 aminotransferase 함량 변화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 11 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 혈청 aminotransferase 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, aspartate aminotransferase(AST)의 경우, 정상군은 73.0±5.6 U/l, 대조군은 89.3±19.6 U/l, 50mg군은 86.5±3.5 U/l, 100mg군은 77.3±5.5 U/l, 200mg군은 85.0±4.0 U/l로 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 변화를 보이지 않았다. Alanine aminotransferase(ALT)의 경우, 정상군은 39.8±1.4 U/l, 대조군은 45.3±2.1 U/l, 50mg군은 41.8±2.6 U/l, 100mg군은 39.7±0.3 U/l, 200mg군은 39.3±1.8 U/l를 나타내어 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 변화를 보이지 않았다.

구분	AST(U/l)	ALT(U/l)
Normal	73.0±5.6	39.8±1.4
Control	89.3±19.6	45.3±2.1
50mg	86.5±3.5	41.8±2.6
100mg	77.3±5.5	39.7±0.3
200mg	85.0±4.0	39.3±1.8

도 11은 혈액 Leukocytes 함량 변화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다(표 12 참조). 실시예 2 시료의 용량별 투여가 혈액 leukocytes 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, Neutrophils의 경우 정상군에 비하여 대조군은 유의한 감소를 나타내었고, 대조군에 비하여 100mg군, 200mg군은 증가의 경향을 나타내었으며, WBC의 경우 정상군에 비하여 대조군은 감소의 경향을 보였고, 대조군에 비하여 실험군은 유의한 증가 경향을 나타내었다.

구분 (K/uL)	WBC	Neutrophils	Lymphocytes	Monocytes	EO
Normal	5.2±0.4	0.87±0.08	4.1±0.3	0.19±0.01	0.02±0.01
Control	4.4±0.6	0.52±0.12#	3.7±0.5	0.18±0.02	0.01±0.00
50mg	5.5±0.5	0.69±0.07	4.6±0.5	0.22±0.02	0.02±0.01
100mg	5.2±0.3	0.68±0.05	4.3±0.3	0.20±0.02	0.02±0.01
200mg	6.0±0.4	0.83±0.11	4.9±0.3	0.27±0.05	0.03±0.01

# P<0.05 compared with normal

따라서, 본 발명의 여러 구현예에 따르면, 배와 더덕을 유효성분으로 하여 면역 증진에 활성을 갖는 면역 증진용 발효음료를 제조할 수 있다.

Claims

배와 더덕을 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii, 기탁번호: KCCM11136P)로 발효시킨 발효액을 유효성분으로 하고,
상기 배와 더덕은 배 고형분과 더덕 분말을 1 내지 5 : 5 내지 15의 중량 비율로 혼합한 것이고,
상기 발효는 25 내지 35℃의 온도로 2 내지 5일 동안 수행된 것이고,
상기 발효액은 TNF-α 및 INF-γ를 감소시키고, 인터루킨-10(Interleukin-10)을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 면역 증진용 발효음료.
삭제
(a) 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물을 발효시키는 단계;를 포함하고,
상기 유산균은 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii, 기탁번호: KCCM11136P)이고,
상기 (a) 단계는 배 고형분과 더덕 분말을 1 내지 5 : 5 내지 15의 중량 비율로 혼합하고,
상기 (b) 단계는 25 내지 35 ℃의 온도에서 2 내지 5일 동안 발효시키고, 상기 발효에 따라 제조된 발효액은 TNF-α 및 INF-γ를 감소시키고, 인터루킨-10(Interleukin-10)을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 발효음료의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 락토바실러스 호모히오키이 균주의 생균 수는 1.0 × 10¹⁰내지 1.0 × 10¹²cfu/g인 것을 특징으로 하는 면역 증진용 발효음료의 제조방법.
삭제
삭제
(a) 배, 더덕 및 유산균을 혼합하는 단계;
(b) 상기 혼합물을 발효시키는 단계; 및
(c) 상기 발효된 발효액에 첨가제를 투입하고 반죽 및 성형하여 제형화하는 단계;를 포함하고,
상기 유산균은 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii, 기탁번호: KCCM11136P) 이고,
상기 (a) 단계는 배 고형분과 더덕 분말을 1 내지 5 : 5 내지 15의 중량 비율로 혼합하고,
상기 (b) 단계는 25 내지 35 ℃의 온도에서 2 내지 5일 동안 발효시키고, 상기 발효에 따라 제조된 발효액은 TNF-α 및 INF-γ를 감소시키고, 인터루킨-10(Interleukin-10)을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 가공 식품의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 첨가제는 더덕, 도라지, 은행, 감초, 박하향, 생강, 비타민 C, 홍삼농축액, 유당, 결정셀룰로오스, 프락토올리고당, 정향, 콩, 미숫가루, 매실 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 면역 증진용 가공 식품의 제조방법.