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KR102119714B1 - 실시간 글루타치온 측정을 통한 치료용 세포의 품질 향상 방법 - Google Patents

실시간 글루타치온 측정을 통한 치료용 세포의 품질 향상 방법 Download PDF

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KR102119714B1
KR102119714B1 KR1020180149697A KR20180149697A KR102119714B1 KR 102119714 B1 KR102119714 B1 KR 102119714B1 KR 1020180149697 A KR1020180149697 A KR 1020180149697A KR 20180149697 A KR20180149697 A KR 20180149697A KR 102119714 B1 KR102119714 B1 KR 102119714B1
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양광모
신지웅
강혜원
김용환
김명진
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Abstract

본 발명은 실시간 글루타치온 측정을 통하여 치료용 세포의 품질을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

실시간 글루타치온 측정을 통한 치료용 세포의 품질 향상 방법{Method of Therapeutic Cell Quality Improvement based on Real-time Glutathione Measurement}
본 발명은 실시간 글루타치온 측정을 통한 치료용 세포의 품질을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
인체는 항산화계의 작용을 통해 활성 산소종을 적절히 제거하여 항상성을 유지하나, ROS 생성과 항산화계 작용 사이의 균형이 깨지면 산화적 스트레스(oxidative stress)가 증가하고, 이는 노화를 비롯하여 퇴행성 관절염, 백내장, 알쯔하이머 등의 노화 관련 퇴행성 질환, 각종 암, 섬유화 질환을 비롯하여 최근에는 당뇨병, 비만, 심혈관 질환 등의 대사성 증후군의 발병에 중요한 공통 원인 인자로 주목받고 있다. 상기 ROS는 불안정하고 반응성이 높아 생체 분자를 산화시켜 생화학적, 생리적 손상을 유발시키고 이는 노화의 주요 기전 중 하나이다. 따라서 인체의 산화도 뿐 아니라 항산화도나 항산화 능력은 생체 나이 계측에 주요한 바이오 마커가 될 수 있다.
활성산소종(ROS)은 세포 대사, 증식 및 생존을 조절하는 중요한 신호 분자이다. ROS의 증가는 신호전달 단백질 상의 시스테인 잔기의 티올 산화를 유도하여, 세포 기능을 조절하기 위한 단백질 활성의 변화를 가져온다. 특히, ROS 매개 산화는 OCT4, NRF2, FoxOs, APE1/Ref-1, ATM, HIF-1, p38, 및 p53를 포함하여 자가 재생 능력, 다능성, 생존력 및 게놈 안정성에 영향을 미치는 줄기세포(SC)의 다양한 신호 단백질을 조절하는데 중요한 역할을 한다(Wang et al., 2013).
한편, 줄기세포 및 세포 배양물의 품질, 일관성 및 효능을 평가하는데 이용되는 다수의 방법이 있다. 줄기세포의 경우, 자가-재생능(self-renewal capacity) 및 특이적 마커의 발현에 의해 정의된다. 원하는 세포군의 동일성이 정의되어야 한다. 현 hESC 세포주는 일련의 표준화된 메트릭스(metrics), 즉 표면 항원, 특정 효소 활성(예컨대, 알칼리성 포스파타제)의 발현, 유전자 발현, 후생유전학적 마커(epigenetic markers), 게놈 안정성 평가, 세포학 및 형태뿐만 아니라 시험관내(배아체 형성) 및 생체내 분화 잠재성(테라토마계 이종이식류(teratoma-like xenografts) 형성)을 이용하여(일본 등록특허 제 5185443호), 측정가능한 미생물학적 감염의 부재에 의해 특성화된다. 그러나, 이들 줄기세포 특성을 평가하는데 이용되는 절차는 숙련된 인원을 필요로 하나 정보 내용이 상대적으로 적고 시간 소비적이며 비용이 많이 든다. 게다가, 안전성 프로파일 및/또는 이로부터 생성된 세포의 목적 적합성에 관한 결정적인 정보를 보여주지 못한다. 줄기세포의 경우, 미분화 세포의 증식을 지원하는 조건 하에 세포군의 확장을 포함하여, 배양에 있어서 계속적인 계대배양 하에 유도 단계의 줄기세포주의 품질 및 일관성에 관한 정보의 제공 및 세포 품질 향상이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 실시간 글루타치온 측정을 통하여 치료용 세포의 품질을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 세포를 특성화하고 및/또는 시험관내 세포 배양계의 품질 및 안전성 프로파일을 향상시키는데 그 목적이 있다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다. 명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서, 용어 "FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)" 또는 "FreSH"는 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 화합물을 의미하고, 세포 소기관에 제한없는 티올 검출용 형광물질로서 사용된다. 따라서, FreSH-트레이서는 세포 소기관에 특이적인 화합물 및 이에 한정하지 않는 화합물 모두를 포함한다.
[화학식 A]
Figure 112018118942817-pat00001
상기 화학식 A에서
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나, R1, R2 및 X가 함께 5각 또는 6각 고리를 이루는 헤테로 사이클로알킬 또는 헤테로 사이클로알케닐이고; R3은 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬, -(CH2)m-COO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나(상기 m는 1-5의 정수이다), R4, R5 및 Y는 함께 C3-7 헤테로 사이클로알킬을 이루고, 상기 헤테로 사이클로알킬은 비치환 또는 R6으로 치환된 헤테로 사이클로알킬이고; 상기 R6은 -COO(CH2)n-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 n은 1-5의 정수이다), -(CONH)-(CH2)o-PPh3 +Cl-(상기 o는 1-5의 정수이다) 또는 -(CONH)-CHR7-COO(CH2)p-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며(상기 p는 1-5의 정수이다); 상기 R7은 -(CH2)q-COO(CH2)r-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 q 및 r은 각각 1-5의 정수이다)이고; X 및 Y는 각각 독립적으로 N 또는 O이다.
본 발명의 일 구체예에서, 용어 "MitoFreSH-트레이서(Mitochondria Fluorescent Real-time SH group-Tracer)" 또는 "GolgiFreSH-트레이서(Golgi Fluorescent Real-time SH group-Tracer)"는 하기 화학식 B 로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 화합물을 의미하고, 이에 제한되지는 않지만, 미토콘드리아 또는 골지체 내의 티올의 양을 측정하는데 사용한다. 또한 이의 구체예에서, 특히 화학식 B-8로 표시되는 화합물은 GolgiFreSH-트레이서로 사용되고, 화학식 B-4로 표시되는 화합물은 MitoFreSH-트레이서로 사용된다. 상기 이러한 화합물을 통해서 미토콘드리아 또는 골지체 내의 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명할 수 있다.
[화학식 B]
Figure 112018118942817-pat00002
상기 화학식 B에서 R1은 하나 이상의 N을 포함하는 3-7원 고리인 헤테로사이클로알킬이다.
본 명세서에서, 용어 "비율계량적(ratiometric)"은 산출량이 투입량(input)에 직접적으로 비례하는 것을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서, "비율계량적"은 본 발명의 조성물이 티올 투입량에 따라 직접적으로 비례해서 형광세기 또는 형광세기의 비율이 증가 또는 감소하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "검출"은 시료 속에서 화학종이나 생물학적 물질의 존재 유무나 그 양을 측정하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가역적(reversible)"은 화학반응에서 반응물과 생성물의 혼합물이 평형상태의 혼합물을 생성하는 것이 가능한 상태를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "티올(thiol)"은 탄소와 결합된 설프히드릴기를 포함하는 유기 화합물을 의미하고, 설프히드릴기 또는 티올기는 혼용되어 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 미토콘드리아는 생세포(living cell) 내에 포함된 것이다. 본 발명의 조성물은 미토콘드리아 내 티올 수준을 측정하는데 있어서, 세포로부터 분리된 미토콘드리아에 국한되지 않고, 세포 내에 포함된 상태의 미토콘드리아 내 티올 수준을 측정할 수 있는 특징이 있다. 특히 살아있는 세포 내 미토콘드리아에서의 티올 수준을 특이적으로 검출할 수 있다.
본 명세서에서, GolgiFreSH-트레이서는 시아노아크릴아마이드 친전자체(cyanoacrylamide electrophile)를 갖는 쿠마린(coumarin) 유도체로서 본원의 화학식 B로 표시되는 화합물을 의미하고, 본 발명에서의 골지체 내 티올 검출용 형광물질로서 사용된다. 본 발명자들은 세포 내 골지체에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출 가능한 바이오 센서인 GolgiFreSH-트레이서를 개발하였다. 그 결과, 본원의 화학식 B-5로 표시되는 본 발명의 GolgiFreSH-트레이서(Golgi Fluorescent Real-time SH group-Tracer)가 세포 내 골지체에서의 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고, 세포 내 골지체에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 세포 또는 줄기세포의 "안전성" 및 "품질"과 관련해서, 안전하지 못한(예를 들어 종양형성) 세포 또는 세포들 및/또는 좋지 못한 품질(아마도 특이적 마커의 발현 부족)의 세포 간의 표현형 차이가 있다. 이는 표준 방법에 의해서 검출되지 않을 수 있다. 본 발명은 세포 또는 세포계(예를 들어 세포 배양물의 세포군)가 일련의 사전결정된 표준에 부합하는지 여부를 결정하고 부합하도록 세포의 특성을 향상시키는 고도로 민감하고 정교한 수단을 제공한다. 종래에 있어서는, 세포 품질 특성을 파악하기 위해, 숙련자가 일련의 사전결정된 안전성 및/또는 품질 표준에 부합하는 것으로 알려져 있는 세포의 마이크로RNA 프로파일을 확립하고, 동일 유형의 다른 세포에 대해 마이크로 RNA의 비교에 의해 사전결정된 품질 및/또는 특성에 부합하는지를 평가할 수 있었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, "부티오닌 설폭시민(Buthionine-sulfoximine, BSO)"은 글루타치온(GSH)의 합성을 위한 필수 효소인 γ-글루타밀 시스테인 합성효소를 비가역적으로 억제함으로써 세포에 산화 스트레스를 유도한다. GSH 결핍에 의해 유도된 산화 스트레스가 DNA 결실과 같은 게놈 재배열을 유도할 수 있다고 공지되어 있으며, 외인성 항산화제인 N-아세틸-L-시스테인(NAC)에 의한 산화촉진 조건을 막음으로써 DNA 결실을 억제할 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 상기 만능성 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 또한, 다능성 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 만능성 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있다. 다능성 줄기세포로서는, 간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있다. 또한, 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다. 특히, 본원 발명에서 중간엽 줄기세포(MSC)는 hES-MSC(Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stroma cells), BM-MSC(Bone marrow mesenchymal stem cell), UC-MSC(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 및 ADSC(Adipose Derived Stem Cell-Condtioned Medium)인 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)"는 수정란이 착상하기 직전인 배반포기(blastocyst)의 내부세포 덩어리(세포내괴, inner cell mass)를 분리하여 체외에서 배양한 세포로, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency)을 갖는다. 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체를 포함한다. 본 발명에서 용어, "배아체(embryonic body 또는 embryoid body, EB)"는 부유 배양 상태에서 생성된 구형의 줄기세포의 덩어리를 의미하며, 잠재적으로 내배엽, 중배엽, 외배엽으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있어 조직특이적 분화 세포를 확보하기 위한 대부분의 분화 유도 과정에서 전구체로 이용된다.
본 발명에서 용어, “추출물(extract)”은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 추출물은 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크르르메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
글루타치온 프로브를 통해 세포 전체 또는 세포 소기관에 따라 GSH의 양을 측정할 수 있다. 본 발명의 FreSHracer는 살아있는 세포 내 글루타치온(GSH)의 양을 빠르고 쉽게 측정할 수 있도록 새롭게 합성된 형광 염료이다. FreSHtracer는 세포와 세포 소기관 내에 쉽게 들어갈 수 있는 작은 분자 프로브로 GSH의 티올(-SH)기와 결합하여 작용한다(도 1 참고). FreSHtrace가 GSH에 결합하면 510nm (F510)의 파장대의 형광을 나타내며 GSH와 결합하지 않으면 580nm (F580)의 파장대의 형광을 나타낸다. 이렇게 측정된 F510/F580의 형광 값으로 세포 내 GSH 양을 측정할 수 있다. FreSHtracer와 GSH 사이의 반응은 가역적이며 측정하는데 세포 내 GSH를 소비하지 않는다.
본 발명에서 용어 “글루타치온 평균값 또는 중앙값(Glutathione Mean Level, GM)”은 상기 글루타치온의 측정방법을 이용하여, 배양된 세포에서의 GSH의 평균값 또는 중앙값을 측정하여 세포의 항산화능력을 측정할 수 있는 파라미터이다.
본 발명에서 용어 “글루타치온 산포도(Glutathione Heterogeneity, GH)”는 상기 글루타치온의 측정방법을 이용하여, 배양된 세포에서의 GSH의 분포양상을 측정하여 세포의 항산화능력을 측정할 수 있는 파라미터이다. 이 산포도는 변동계수(Coefficient of variation)이나 강건 변동계수(Robust coefficient of variation)"이고 변동계수 구하는 법은 도 8에 나타나 있는 것이다.
본 발명에서 용어 “글루타치온 재생산 능력(Glutathione Regeneration Capacity, GRC)”은 디아미드를 처리하여 GSH가 GSSG로 환원되는 조건을 유발하고 세포의 GSH 농도를 실시간으로 측정하여 다시 GSH로 회복시키는 능력을 측정하여 세포의 항산화능력을 객관적으로 분석할 수 있는 파라미터이다. 즉, 살아있는 세포에 산화제 처리 후 실시간으로 FR이나 F510을 모니터링하여 얻어지는 수치로 제1산화제 처리군의 제 1 곡선하면적(area under the curve, AUC)에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값을 무처리 대조군의 제 3 곡선하면적에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값으로 나눈 후 100을 곱한 값으로 산출한 값이다.
본 발명에서 “가역적 산화제” 또는 “제1산화제”는 H2O2, 및 tert-부틸 과산화물을 포함한 히드로과산화물 (hydroperoxide); 디아미드, GSSG (oxidized GSH), 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산), 말레이미드, N-에틸말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산 및 요오드아세트아미드을 포함한 티올 산화제; 비스-클로로에틸니트로조우레아를 포함한 글루타치온 환원효소 억제제; PX-12을 포함한 티오레독신 억제제; 안티마이신 A, 로테논, 올리고마이신 및 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존을 포함한 미토콘드라아 전달전달계 억제제; 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트을 포함한 NADPH 산화효소 활성화제; 1S,3R-RAS-셀렉티브 레탈 3(1S,3R-RAS- selective lethal 3; 1S,3R-RSL3), DPI19, DPI18, DPI17, DPI13, DPI12, DPI10 (ML210), DPI7 (ML162), 또는 알트레타민을 포함한 gpx4 억제제; 에라스틴(Erastin), 설파살라진, 소라페닙, 글루타메이트, 피페라진 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴, 및 에라스틴 유사체를 포함한 시스템 x- c 억제제; 페로토시스 유도체 56(FIN56)를 포함한 GPX4 단백질량 및 CoQ10 양 감소유도제; 카스파제-의존성 레탈 56 (CIL56) 및 페로토시스 유도체 엔도페록시드 (FINO2)를 포함한 지질 과산화유도제; 부티오닌-(S, R)-설폭시민을 포함한 글루탐산염 시스타인 연결효소 (GCL) 억제제; 디에틸말레산염을 포함한 GSH 감소 유도제; DPI2, 시스플라틴, 시스테네이즈(cysteinase), 스타틴, 구연산 철 암모늄, 트리고넬린, 사염화탄소, 실리카계 나노입자 및 비열플라즈마를 포함할 수 있다. 상기 산화스트레스의 농도는 0.05~20 μM일 수 있다.
본 발명에서 용어 ”비가역적 티올 산화제”, “비가역적 산화제” 또는 “제2산화제”는 세포독성제 내에 임의의 반응되지 않은 기(가령, 티올)가 진정되도록 담보하는데 이용될 수 있는 제제이다. 이는 세포독성제, 특히 반응되지 않은 티올 기를 갖는 세포독성제 (가령, DM1)의 이합체화를 예방하는데 도움을 줄 수 있다. 즉, 비가역적 티올 산화제는 GSH를 완전히 없애는 블랭크(blank)군을 만들기 위한 물질이다. 예를 들면, 말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산, 에틸말레이미드, N-에틸말레이미드, 요오드아세트아미드, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 또는 요오드아세트아미도프로피온산을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 에틸말레이미드가 바람직하다.
일 구체예에서, 줄기세포의 품질은 GM, GH 및 GRC 기준값 범위로 결정할 수 있는데, 대상 세포의 GM, GH 및 GRC의 값과 대상세포의 표준 줄기세포의 값을 비교하여 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어 “산화제”는 통상적으로 산화시키는 물질 외에 세포에 산화스트레스를 유발시키는 처리를 포함한다. 바람직하게는, 이는 제1산화제 또는 제2산화제를 포함한다.
본 발명에서 용어 “산화스트레스 저항 능력(Oxidative Stress Resistance Capacity, ORC)”은 살아있는 세포에 제1산화제 처리 후 GSH 수준을 정량하여 얻어지는 수치로 GSH 수준을 산화제 처리하지 않은 대조군 세포 또는 산화제 처리하기 전의 대조군 세포에서 정량된 GSH 수준을 비교하여, GSH 발현이 변동된 세포양으로 산출한 값이다. 예를 들어, 바람직하게는 세포에 산화스트레스를 가한 후, 미토콘드리아 글루타치온(mGSH) 발현 수준을 정상 레벨로 유지할 수 있는 지 측정할 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 줄기세포의 품질은 ORC 값이 10%에서 100%, 바람직하게는 30%에서 90%, 보다 바람직하게는 40%에서 90%으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 ORC에서의 용어 “산화스트레스”는 세포에 제1산화제를 가한 것을 의미한다.
본 발명은 목적하는 세포를 분리하는 단계; 분리한 세포에서 글루타치온의 수준을 측정하는 단계; 글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단하는 단계; 및 분리한 세포에서 글루타치온 평가파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 첨가하는 단계를 포함하는, 세포의 품질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단하는 것은 하기 평가파라미터 중 어느 하나 이상인 방법: i) 세포의 글루타치온 평균값 또는 중앙값(Glutathione Mean Level, GM); ii) 세포의 글루타치온 산포도(Glutathione Heterogeneity, GH); iii) 세포의 글루타치온 재생산 능력(Glutathione Regeneration Capacity, GRC); 및 iv) 산화스트레스 저항 능력(Oxidative Stress Resistance Capacity, ORC)을 들 수 있고, 여기서, GM은 세포 FR(FreSHtracer Ratio)이나 F510의 평균값이나 중앙값으로 산출하고, GH는 세포 FR이나 F510의 변동계수(Coefficient of variation)이나 강건 변동계수(Robust　coefficient of variation)로 산출하며, GRC는 세포에 산화제 처리 후 실시간으로 FR이나 F510을 모니터링하여 얻어지는 수치로 제1산화제 처리군의 제 1 곡선하면적(area under the curve, AUC)에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값을 무처리 대조군의 제 3 곡선하면적에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값으로 나눈 후 100을 곱한 값으로 산출하며, ORC는 살아있는 세포에 제1산화제 처리 후 GSH 수준을 정량하여 얻어지는 수치로 GSH 수준을 제1산화제 처리하지 않은 대조군 세포 또는 제1산화제 처리하기 전의 대조군 세포에서 정량된 GSH 수준을 비교하여, GSH 발현이 변동된 세포양으로 산출한 값이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 세포의 품질의 향상은 글루타치온 평가파라미터인 GM, GRC를 높이거나, GH를 낮추거나, 또는 ORC 측정 시 산화제를 처리하지 않은 세포와 비교하여, 산화제 처리에 의해 GSH가 감소된 세포의 비율을 적게 하는 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 글루타치온 평가 파라미터를 개선시킬 수 있는 물질은 글루타치온 에틸 에스터(Glutathione ethyl ester), 아스코르브산 2-글루코시드(Ascorbic Acid 2-Glucoside), 글루타치온(Glutathione), N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 디티오트레이톨(Dithiothreitol; DTT), 시스테인(Cysteine), 감마-글루타밀 시스테인(gamma-glutamyl cysteine; GGC), 감마-글루타밀 시스테인 에스터(GGC Esters), 옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid; OTC), L-2-옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(L-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid), 리포익산(Lipoic acid), 페로스타틴-1(Ferrostatin-1), 리프록스타틴-1(Liproxstatin-1), 비타민D3(Vitamin D3), 1-알파, 25-디하이드록스 비타민D3 (1alpha,25-Dihydroxy VitD3), 비타민E(Vitamin E), 코엔자임 Q10(Coenzyme q10), 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스를 포함한 철이나 구리 이온 킬레이터, 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 루테오린(Luteolin), 퀘르세틴(Quercetin), 부테인(Butein), 국화꽃 추출물(Flower extracts of Chrysanthemum morifolium Ramat), 가죽나무잎 추출물(Leaf extracts of Cedela sinensis A. Juss), 달맞이순 추출물(Extracts of Oenothera stricta Ledeb.), 쇠뜨기 추출물(Extracts of Equisetum arvense L.), 고구마잎 추출물(Leaf extracts of Ipomoea batatas), 토마토 추출물 및 호모 시스틴(Homocysteine)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 글루타치온 평가파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 첨가하는 단계 이전에 글루타치온의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 글루타치온 평가파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 첨가하는 단계 이후에 글루타치온의 수준을 측정하여 글루타치온의 수준이 향상되었는지를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 목적하는 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 줄기세포; 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 면역세포; 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 체세포(Somatic cell); CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 제재의 생산에 사용되는 세포주; 또는 인체나 동물의 구강, 비강, 폐, 피부, 위장관, 및 비뇨관 등에서 유래한 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 인체 마이크로바이옴 (Microbiome)을 들 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, T 세포는 조절 T 세포(Treg cell)를 제외한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제1산화제는 H2O2, 및 tert-부틸 과산화물을 포함한 히드로과산화물 (hydroperoxide); 디아미드, GSSG (oxidized GSH), 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산), 말레이미드, N-에틸말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산 및 요오드아세트아미드을 포함한 티올 산화제; 비스-클로로에틸니트로조우레아를 포함한 글루타치온 환원효소 억제제; PX-12을 포함한 티오레독신 억제제; 안티마이신 A, 로테논, 올리고마이신 및 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존을 포함한 미토콘드라아 전달전달계 억제제; 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트을 포함한 NADPH 산화효소 활성화제; 1S,3R-RAS-셀렉티브 레탈 3(1S,3R-RAS- selective lethal 3; 1S,3R-RSL3), DPI19, DPI18, DPI17, DPI13, DPI12, DPI10 (ML210), DPI7 (ML162), 또는 알트레타민을 포함한 gpx4 억제제; 에라스틴(Erastin), 설파살라진, 소라페닙, 글루타메이트, 피페라진 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴, 및 에라스틴 유사체를 포함한 시스템 x- c 억제제; 페로토시스 유도체 56(FIN56)를 포함한 GPX4 단백질량 및 CoQ10 양 감소유도제; 카스파제-의존성 레탈 56 (CIL56) 및 페로토시스 유도체 엔도페록시드 (FINO2)를 포함한 지질 과산화유도제; 부티오닌-(S, R)-설폭시민을 포함한 글루탐산염 시스타인 연결효소 (GCL) 억제제; 디에틸말레산염을 포함한 GSH 감소 유도제; DPI2, 시스플라틴, 시스테네이즈(cysteinase), 스타틴, 구연산 철 암모늄, 트리고넬린, 사염화탄소, 실리카계 나노입자 및 비열플라즈마를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제2산화제는 말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산, 에틸말레이미드, N-에틸말레이미드, 요오드아세트아미드, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 또는 요오드아세트아미도프로피온산을 포함한다.
본 발명은 목적하는 세포에서 글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단한 후, 추가된 세포 품질 향상용 조성물로서, 글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단하는 것은 하기 평가파라미터 중 어느 하나 이상인 조성물: i) 세포의 글루타치온 평균값 또는 중앙값(Glutathione Mean Level, GM); ii) 세포의 글루타치온 산포도(Glutathione Heterogeneity, GH); iii) 세포의 글루타치온 재생산 능력(Glutathione Regeneration Capacity, GRC); 및 iv) 산화스트레스 저항 능력(Oxidative Stress Resistance Capacity, ORC)이고, 여기서, GM은 세포 FR(FreSHtracer Ratio)이나 F510의 평균값이나 중앙값으로 산출하고, GH는 세포 FR이나 F510의 변동계수(Coefficient of variation)이나 강건 변동계수(Robust　coefficient of variation)로 산출하며, GRC는 살아있는 세포에 산화제 처리 후 실시간으로 FR이나 F510을 모니터링하여 얻어지는 수치로 제1산화제 처리군의 제 1 곡선하면적(area under the curve, AUC)에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값을 무처리 대조군의 제 3 곡선하면적에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값으로 나눈 후 100을 곱한 값으로 산출하며, ORC는 살아있는 세포에 제1산화제 처리 후 GSH 수준을 정량하여 얻어지는 수치로 GSH 수준을 제1산화제 처리하지 않은 대조군 세포 또는 제1산화제 처리하기 전의 대조군 세포에서 정량된 GSH 수준을 비교하여, GSH 발현이 변동된 세포양으로 산출한 값인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 세포의 품질의 향상은 글루타치온 평가파라미터인 GM, GRC를 높이거나, GH를 낮추거나, 또는 ORC 측정 시 산화제를 처리하지 않은 세포와 비교하여, 산화제 처리에 의해 GSH가 감소된 세포의 비율을 적게 하는 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 글루타치온 평가 파라미터를 개선시킬 수 있는 물질은 글루타치온 에틸 에스터(Glutathione ethyl ester), 아스코르브산 2-글루코시드(Ascorbic Acid 2-Glucoside), 글루타치온(Glutathione), N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 디티오트레이톨(Dithiothreitol; DTT), 시스테인(Cysteine), 감마-글루타밀 시스테인(gamma-glutamyl cysteine; GGC), 감마-글루타밀 시스테인 에스터(GGC Esters), 옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid; OTC), L-2-옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(L-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid), 리포익산(Lipoic acid), 페로스타틴-1(Ferrostatin-1), 리프록스타틴-1(Liproxstatin-1), 비타민D3(Vitamin D3), 1-알파, 25-디하이드록스 비타민D3 (1alpha,25-Dihydroxy VitD3), 비타민E(Vitamin E), 코엔자임 Q10(Coenzyme q10), 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스를 포함한 철이나 구리 이온 킬레이터, 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 루테오린(Luteolin), 퀘르세틴(Quercetin), 부테인(Butein), 국화꽃 추출물(Flower extracts of Chrysanthemum morifolium Ramat), 가죽나무잎 추출물(Leaf extracts of Cedela sinensis A. Juss), 달맞이순 추출물(Extracts of Oenothera stricta Ledeb.), 쇠뜨기 추출물(Extracts of Equisetum arvense L.), 고구마잎 추출물(Leaf extracts of Ipomoea batatas), 토마토 추출물 및 호모 시스틴(Homocysteine)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 목적하는 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 줄기세포; 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 면역세포; 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 체세포(Somatic cell); CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 제재의 생산에 사용되는 세포주; 또는 인체나 동물의 구강, 비강, 폐, 피부, 위장관, 및 비뇨관 등에서 유래한 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 인체 마이크로바이옴 (Microbiome)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제1산화제는 H2O2, 및 tert-부틸 과산화물을 포함한 히드로과산화물 (hydroperoxide); 디아미드, GSSG (oxidized GSH), 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산), 말레이미드, N-에틸말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산 및 요오드아세트아미드을 포함한 티올 산화제; 비스-클로로에틸니트로조우레아를 포함한 글루타치온 환원효소 억제제; PX-12을 포함한 티오레독신 억제제; 안티마이신 A, 로테논, 올리고마이신 및 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존을 포함한 미토콘드라아 전달전달계 억제제; 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트을 포함한 NADPH 산화효소 활성화제; 1S,3R-RAS-셀렉티브 레탈 3(1S,3R-RAS- selective lethal 3; 1S,3R-RSL3), DPI19, DPI18, DPI17, DPI13, DPI12, DPI10 (ML210), DPI7 (ML162), 또는 알트레타민을 포함한 gpx4 억제제; 에라스틴(Erastin), 설파살라진, 소라페닙, 글루타메이트, 피페라진 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴, 및 에라스틴 유사체를 포함한 시스템 x- c 억제제; 페로토시스 유도체 56(FIN56)를 포함한 GPX4 단백질량 및 CoQ10 양 감소유도제; 카스파제-의존성 레탈 56 (CIL56) 및 페로토시스 유도체 엔도페록시드 (FINO2)를 포함한 지질 과산화유도제; 부티오닌-(S, R)-설폭시민을 포함한 글루탐산염 시스타인 연결효소 (GCL) 억제제; 디에틸말레산염을 포함한 GSH 감소 유도제; DPI2, 시스플라틴, 시스테네이즈(cysteinase), 스타틴, 구연산 철 암모늄, 트리고넬린, 사염화탄소, 실리카계 나노입자 및 비열플라즈마를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제2산화제는 말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산, 에틸말레이미드, N-에틸말레이미드, 요오드아세트아미드, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 또는 요오드아세트아미도프로피온산을 포함한다.
FR은 430-550 nm에서 형광 세기 (F510) 및 550-680 nm에서 형광 세기 (F580)의 비율일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 FreSHtracer 및 평가파라미터는 살아있는 줄기세포의 세포 내 GSH 수준을 실시간으로 모니터링하고 GSH 수준에 따라 세포를 분화하는 데 사용되며, 세포 치료제 품질을 평가할 수 있고, 또한 그 품질을 향상시킬 수 있는 신규한 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 FreSH-트레이서가 글루타치온(GSH)과 가역적으로 반응하는 반응식(도 1a), FreSH-트레이서의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 1b), 430nm 및 520nm 각각에서 여기(excitation)에 의하여 발생된 FreSH-트레이서의 형광 방출 스펙트럼을 510nm(F510) 및 580nm(F580)에서 각각 모니터링한 결과(도 1c), 상기 도 1c의 결과를 그래프로 나타낸 결과(도 1d), F510/F580(FR)로 나누어서 계산하고 증가된 농도의 GSH에 맞춘 방출 비율(도 1e)를 나타낸다.
도 2는 hBM-MSC를 F510/F580(FR)로 FACS 선별(sorting)하는 단계를 나타내는 그래프이다.
도 3은 FreSH-트레이서가 세포에서 제거 가능한 것을 보여주는 그래프로 FreSH-트레이서로 염색된 세포를 세척후 새로운 배양액에서 배양한 후 시간에 따라 FACS 분석한 결과(도 3a), 이를 수치화한 그래프(도 3b)를 나타낸다.
도 4는 FreSH-트레이서 기반으로 FASC 분리한 hBM-MSC의 CFU-F(도 4a)와 SDF-1alpha와 PDGF-AA에 대한 이동능(도 4b)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5f는 FreSH-트레이서에 의하여 분리된 섬유아세포의 항노화 활성 나타낸 결과이다.
도 6는 FreSH-트레이서에 의하여 분리된 수지상 세포의 활성을 나타낸 결과이다.
도 7는 FreSH-트레이서에 의하여 분리된 T 세포에서 Treg 세포의 활성을 나타낸 결과이다.
도 8은 치료용 세포 품질 평가를 위한 네 가지 글루타치온 파라미터들, 도출식, 그 결과 예시들을 개략적으로 나타낸다.
도 9은 hBM-MSC의 계대배양에 따른 CFU-F 분석(도 9a) 및 SDF-1alpha와 PDGF-AA에 대한 이동능(도 9b)을 나타낸 결과이다.
도 10a 내지 10c는 hBM-MSC의 계대배양에 따른 FreSH-트레이서나 GolgiFreSH-트레이서, MitoFreSH-트레이서 기반의 GM과 GH를 분석한 결과이다.
도 11은 hBM-MSC의 계대배양에 따른 FreSH-트레이서나 GolgiFreSH-트레이서, MitoFreSH-트레이서 기반의 GRC를 분석한 결과이다.
도 12는 쥐 골수세포를 Lineage에 따라 분리한 후 MitoFreSH-트레이서 기반의 GM과 GH를 분석한 결과이다.
도 13은 FreSH-트레이서를 이용하여 FACS 분리된 hES-MSC(도 13a) 또는 분리없이 배양한 hES-MSC(도 13b)에 BSO나 GSH-EE를 처리한 후 CFU-F(도 13a) 또는 PDGF-AA에 대한 세포 이동능(도 13b)을 분석한 결과이다.
도 14a 내지 도 14c는 hUC-MSC를 AA2G가 포함된 배양액에 세 번 계대배양한 후 FreSH-트레이서 기반의 GRC를 분석한 결과이다.
도 15a 내지 도 15b는 hUC-MSC를 AA2G가 포함된 배양액에 세 번 계대배양한 후 FreSH-트레이서 기반의 ORC를 분석한 결과이다.
도 16a는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL(좌측 사진) 또는 250μg/mL(우측 사진)를 3일간 처리하여 CFU-F 어세이를 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 16b는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL 또는 250μg/mL을 3일간 처리하여 CFU-F 어세이(n = 3)를 실시한 결과의 그래프이다.
도 17a는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL 또는 250μg/mL을 3일간 처리하여 PDGF-AA에 의한 이동능을 나타내는 사진이다.
도 17b는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL 또는 250μg/mL을 3일간 처리하여 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석한 결과의 그래프이다.
도 18a는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL 또는 250μg/mL을 3일간 처리하여 T 세포의 증식능 저하 효과(n = 3)를 관찰한 그래프이다.
도 18b는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL 또는 250μg/mL을 3일간 처리하여 T 세포의 분화능 저하 효과(n = 3)를 관찰한 그래프이다.
도 18c는 hUC-MSC에 AA2G 125μg/mL 또는 250μg/mL을 3일간 처리하여 Treg 세포의 분화 촉진 효과(n = 3)를 관찰한 그래프이다.
도 19은 hUC-MSC에 감마-글루타밀 시스테인(GGC) 0.1, 0.25, 및 0.5mM을 2시간 처리하여 CFU-F 어세이(n = 3)를 실시한 결과의 그래프이다.
도 20a는 hUC-MSC에 GGC를 처리하지 않고 SDF1alpha와 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석한 결과의 그래프이다. STI571은 PDGFR 키나아제 억제제로 사용하였다.
도 20b는 hUC-MSC에 GGC 0.1mM을 처리하고 SDF1alpha와 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석한 결과의 그래프이다. STI571은 PDGFR 키나아제 억제제로 사용하였다.
도 20c는 hUC-MSC에 GGC 0.25mM을 처리하고 SDF1alpha와 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석한 결과의 그래프이다. STI571은 PDGFR 키나아제 억제제로 사용하였다.
도 21은 GM, GH, 및 ORC 분석을 통해 세포의 GSH를 조절하는 물질을 스크리닝하는 실험 단계를 도식화한 도면이다.
도 22a 내지 도 22b는 hUC-MSC에서 리프록스타틴-1의 ORC를 분석 결과이다.
도 23a 내지 도 23c는 hUC-MSC에서 비타민D3의 GM, GH, 및 ORC를 분석 결과이다.
도 24는 hUC-MSC에서 비타민E의 GM, GH, 및 ORC를 분석 결과이다.
도 25a 내지 도 25e는 hUC-MSC에서 플라보노이드의 GM, GH, 및 ORC를 분석한 결과이다.
도 25a는 hUC-MSC에서 바이칼린의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 25b는 hUC-MSC에서 바이칼레인의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 25c는 hUC-MSC에서 루테오린의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 25d는 hUC-MSC에서 퀘르세틴의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 25e는 hUC-MSC에서 부테인의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 26a 내지 도 26e는 hUC-MSC에서 식물추출물의 GM, GH, 및 ORC를 분석한 결과이다.
도 26a는 hUC-MSC에서 국화꽃 추출물의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 26b는 hUC-MSC에서 가죽나무잎 추출물의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 26c는 hUC-MSC에서 달맞이순 추출물의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 26d는 hUC-MSC에서 쇠뜨기 추출물의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 26e는 hUC-MSC에서 고구마잎 추출물의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 26f는 hUC-MSC에서 토마토 추출물(LYCOBEADS®)의 GM, GH, 및 ORC 분석 결과이다.
도 27은 hUC-MSC에 0.2, 1, 2, 및 4μM의 페로스타틴-1(Ferrostatin-1) 및 0.1, 0.5, 1, 및 2μM의 리프록스타틴-1(Liproxstatin-1)을 24시간 처리하여 CFU-F 어세이(n = 3)를 실시한 결과의 그래프이다.
도 28a는 hUC-MSC에 1μM 페로스타틴-1을 24시간 처리하거나 0.2mM GGC 또는 2mM GSH-EE를 2시간 처리한 후 T 세포 증식능 저하 효과(n = 3)를 관찰한 그래프이다.
도 28b는 hUC-MSC에 1μM 페로스타틴-1을 24시간 처리하거나 0.2mM GGC 또는 2mM GSH-EE를 2시간 처리한 후 T 세포 분화능 저하 효과(n = 3)를 관찰한 그래프이다.
도 28c는 hUC-MSC에 1μM 페로스타틴-1을 24시간 처리하거나 0.2mM GGC 또는 2mM GSH-EE를 2시간 처리한 후 Treg 세포 분화 촉진효과(n = 3)를 관찰한 그래프이다.
도 29a는 전방십자인대(anterior cruciate ligament, ACL)를 파열하여 골관절염을 유도한 랫(rat)의 관절에 AA2G(250μg/mL)를 넣은 배양액에서 3번 계대배양한 hES-MSC(2 x 105)를 주입한 후 관절조직의 사진이다.
도 29b는 ACL 파열 골관절염을 가진 랫의 관절에 AA2G(250μg/mL)를 넣은 배양액에서 3번 계대배양한 hES-MSC(2 x 105)를 주입한 후 관절조직을 H&E와 사프라닌-O로 염색한 사진이다.
도 29c는 ACL 파열 골관절염을 가진 랫의 관절에 AA2G(250μg/mL)를 넣은 배양액에서 3번 계대배양한 hES-MSC(2 x 105)를 주입한 후 관절조직의 2형 콜라겐에 면역염색한 사진이다.
도 30은 계대배양 4, 7, 15에 해당하는 세포에 대한, mGSH 발현 수준의 유세포분석 결과 히스트그램이다.
도 31은 계대배양 4, 7, 15에 해당하는 세포에 대한, mGSH 발현 수준의 Confocal imaging 히스토그램 결과이다.
도 32는 줄기세포의 계대배양 수와 RSL3의 농도에 따른 mGSH High cell 과 Low Cell의 분포양상 분석결과이다.
도 33은 Ferrostatin-1 처리를 통한 중간엽줄기세포에서의 RSL3 처리 효과의 지질산화물 의존성을 확인한 결과이다.
도 34는 RLS3 처리 후 mGSH High 세포와 Low 세포의 CD146 표면 발현을 비교한 결과이다.
도 35는 섬유아세포의 계대배양 정도에 따른 mGSH High cell 과 Low Cell의 분포양상를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<화합물 준비>
FreSH-트레이서에서 사용하기 위해 하기의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 준비하였다:
[화학식 A]
Figure 112018118942817-pat00003
상기 화학식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나, R1, R2 및 X가 함께 5각 또는 6각 고리를 이루는 헤테로 사이클로알킬 또는 헤테로 사이클로알케닐이고; R3은 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬, -(CH2)m-COO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나(상기 m는 1-5의 정수이다), R4, R5 및 Y는 함께 C3-7 헤테로 사이클로알킬을 이루고, 상기 헤테로 사이클로알킬은 비치환 또는 R6으로 치환된 헤테로 사이클로알킬이고; 상기 R6은 -COO(CH2)n-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 n은 1-5의 정수이다), -(CONH)-(CH2)o-PPh3 +Cl-(상기 o는 1-5의 정수이다) 또는 -(CONH)-CHR7-COO(CH2)p-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며(상기 p는 1-5의 정수이다); 상기 R7은 -(CH2)q-COO(CH2)r-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 q 및 r은 각각 1-5의 정수이다)이고; X 및 Y는 각각 독립적으로 N 또는 O이다.
보다 바람직하게는, FreSH-트레이서에서 사용하기 위해 상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 화학식 A-1 내지 화학식 A-6으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 사용하였다:
[화학식 A-1]
Figure 112018118942817-pat00004
[화학식 A-2]
Figure 112018118942817-pat00005
[화학식 A-3]
Figure 112018118942817-pat00006
[화학식 A-4]
Figure 112018118942817-pat00007
[화학식 A-5]
Figure 112018118942817-pat00008
[화학식 A-6]
Figure 112018118942817-pat00009
더욱 바람직하게는, FreSH-트레이서는 상기 화학식 A-1의 화합물을 사용하였다.
이어서, MitoFreSH-트레이서에서 사용하기 위해 하기의 화학식 B로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 준비하였다:
[화학식 B]
Figure 112018118942817-pat00010
상기 화학식 B에서 R1은 하나 이상의 N을 포함하는 3-7원 고리인 헤테로사이클로알킬이고, 상기 헤테로사이클로알킬은 R2 치환기가 결합되어 있으며; 상기 R2는 -(C(=O)NH)-(CH2)m-PPh3 +Cl-(상기 m은 1-4의 정수임), -(CH2)n-PPh3 +Cl-(상기 n은 1-6의 정수임), 또는 -(C(=O)-(CH2)p-R3(상기 p는 1-4의 정수임)이고; 상기 R3은 -C(NHC(=O)-R4)이며, 상기 R4는 다음 화학식 B-1로 표시되는 치환기이다.
[화학식 B-1]
Figure 112018118942817-pat00011
상기 화학식 B-1에서 상기 x는 1-4의 정수이다.
또한, 본 발명의 R1은 1 또는 2개의 N을 포함하는 6원고리 헤테로사이클로알킬이다. 본 발명에서 "6원고리 헤테로사이클로알킬"에 포함된 용어 "6원고리"는 바이사이클릭 화합물(bicyclic compound) 또는 스피로 화합물(Spiro compound)과 같이 복수개의 고리가 접합된 고리화합물 형태가 아닌 모노사이클릭 화합물로서의 하나의 6각고리 형태를 의미하고, "헤테로사이클로알킬"은 비-방향족성 고리형 알킬로서, 고리 내에 포함된 탄소 원자 중 적어도 하나가 헤테로원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황에 의해 치환되어 있는 것을 의미한다. 바람직하게는, R1은 6원고리 헤테로사이클로알킬로서 1개 또는 2개의 질소를 고리 내에 포함된 헤테로원자로서 포함한다.
보다 바람직하게는, MitoFreSH-트레이서에서 사용하기 위해 상기 화학식 B로 표시되는 화합물은 화학식 B-2 내지 B-4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 사용하였다:
[화학식 B-2]
Figure 112018118942817-pat00012
[화학식 B-3]
Figure 112018118942817-pat00013
[화학식 B-4]
Figure 112018118942817-pat00014
더욱 바람직하게는, MitoFreSH-트레이서는 상기 화학식 B-4의 화합물을 사용하였다.
이어서, GolgiFreSH-트레이서에서 사용하기 위해 하기의 화학식 B-5로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 준비하였다:
[화학식 B-5]
Figure 112018118942817-pat00015
상기 화학식 B-5에서 R4는 (CH2)p-(OCH2CH2O)q-(CH2)r, 또는-(CH2CH2)s-인 화합물(상기 p,q,r,s는 1-5의 정수임)이다. 보다 상세하게는, 상기 화학식 B-5에서 R4는 (OCH2CH2O)-, -(CH2CH2)-, 및 -(CH2(0CH2CH2)2OCH2)- 중의 어느 하나이다.
보다 바람직하게는, GolgiFreSH-트레이서에서 사용하기 위해 상기 화학식 B-5로 표시되는 화합물은 화학식 B-6 내지 B-8로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 사용하였다:
[화학식 B-6]
Figure 112018118942817-pat00016
[화학식 B-7]
Figure 112018118942817-pat00017
[화학식 B-8]
Figure 112018118942817-pat00018
더욱 바람직하게는, GolgiFreSH-트레이서는 상기 화학식 B-8의 화합물을 사용하였다.
본 발명에 따른 화합물A 또는 B 또는 이를 포함하는 조성물을 사용하여, 줄기세포를 포함하는 모든 세포의 세포 내 소기관인 미토콘드리아 또는 골지체의 항산화능을 측정하여 항산화능에 관련된 세포 활성을 정확하게 측정할 수 있고 고활성의 세포 분류가 가능하다. 본 발명의 조성물을 사용한 세포의 활성 측정은 항산화능 측정을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 화학식 A 또는 B로 표시되는 화합물; 이의 라세미체, 광학이성질체, 부분입체이성질체, 광학이성질체의 혼합물, 또는 부분입체이성질체의 혼합물; 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 내 소기관의 항산화능 측정용 조성물을 제공하였다.
실시예
실시예 1: FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 이용한 실험 조건 수립 및 세포 내 발현 양상 확인
FreSH-트레이서를 이용하여 생 세포의 세포 활성을 측정하고, 세포 활성이 높은 세포를 분리하기 위하여 하기와 같은 실험 조건을 수립하였다.
세포는 인간 골수 중간배엽줄기세포(hBM-MSC; human bone marrow mesenchymal stem cell, Lonza에서 구입)와 인간 탯줄 유래 중간배엽줄기세포(hUC-MSC; human bone marrow mesenchymal stem cell, 서울대병원 산부인과에서 탯줄 시료를 받아 제작), 인간 배아줄기세포 분화 중간배엽줄기세포(hES-MSC: human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cell, 건국대학교 정형민 교수 실험실에서 분양받음)를 이용하였다.
이때, FreSH-트레이서는 상기 화학식 A-1의 화합물을 사용하였고, MitoFreSH-트레이서는 하기 화학식 B-4의 화합물을 사용하였으며, GolgiFreSH-트레이서는 하기 화학식 B-8을 사용하였다.
GSH(0-200mM)와 FreSH-트레이서(10μM)가 혼합된 완충용액(인산염 10mM, NaCl 150mM, pH 7.4, H2O:DMSO=98:2)을 제조하고, 이 용액의 시간에 따른 UV 가시광선 흡수 스펙트럼과 형광 방출 스펙트럼 변화를 각각 신코 S-3100와 Hitachi F-7000 분광광도계로 측정하였다. 구체적으로 FreSH-트레이서에 GSH의 농도를 증가시키면서 첨가한 경우, 자외선 및 가시광선에 대한 흡광도가 λmax = 430nm에서 증가하고 λmax = 520nm에서는 감소하였고(도 1a), 형광 방출 세기는 약 510nm(F510, λex = 430nm; λem = 510nm)에서 증가하였고 약 580nm(F580, λex = 520nm; λem = 580nm)에서 감소하였다(도 1b 내지 도 1c). 또한, FreSH 트레이서의 F510과 F580의 형광방출세기 비(F510/F580, FR)가 넓은 GSH 농도 범위에서 비례적으로 변함을 확인하였다(도 1d). FR 형광비로부터 수득된 회귀 곡선은 세포내 존재하는 GSH 농도보다 넓은 범위(0-50mM)에서 선형성(R2 = 0.9938)을 나타내었다(도 1e).
더불어 FreSH-트레이서에 포함되는 다양한 유도체들(상기 화합물 A 또는 B) 또한 자외선 및 가시광선에 대한 흡광도가 λmax = 430nm에서 증가하고 λmax = 520nm에서는 감소하였고, 형광 방출 세기는 F510에서 증가하였으며 F580에서 감소함을 확인하였다. 마찬가지로, F510과 F580의 형광방출세기 비(F510/F580) 역시 화학식 B-1와 같이 넓은 GSH 농도 범위에서 비례적으로 변함을 확인하였다(데이터 미기재). 상세한 데이터는 대한민국 출원특허 제10-2015-0161745호와 제10-2017-0107429을 참고할 수 있다.
[화학식 A-1]
Figure 112018118942817-pat00019
[화학식 B-4]
Figure 112018118942817-pat00020
[화학식 B-8]
Figure 112018118942817-pat00021
따라서, 이러한 결과는 FreSHtracer가 세포 균질 액에서 ROS로 유도된 GSH 변화를 모니터링 할 수 있음을 보여준다.
실시예 2: FACS를 이용하여 FreSH-트레이서 기반 GSH 농도에 따른 생 세포의 분리
2-1. hBM-MSC 분리
1x103세포/cm2의 밀도로 hBM-MSC 줄기세포를 배양 배지(MSCGM Bullet Kit; Lonza #PT-3001)에 접종(seeding)하고, 3일 후 2μM FreSH를 포함하는 배양액으로 1.5시간 동안 세포를 표지하였다. DPBS(WELGENE #LB 001-02)로 두 번 세척한 후, TrypsinLE(gibco #12604-013) 용액을 처리하여 세포를 탈착시킨 후, 2μM FreSH를 포함하는 새로운 배지로 트립신을 불활성화시켰다. 이후, 4℃, 1800rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 세포를 2μM FreSH를 포함하는 새로운 배지로 현탁(resuspend)하였다. 이를 FACS에 로딩 직전, 2μM FreSH를 포함하는 PBS로 1/5 희석하였다(4℃ 유지를 위하여 한 번에 약 1ml 씩 희석).
이후, 다음과 같은 FACS Instruction 조건(BD ARIAIII, 파장 405(F510 측정을 위함) 및 488(F580 측정을 위함) 레이저, 노즐 크기 100μm, 2,000-3,000 events/sec)에서 F510/F580 비율이 전체 세포 수의 상위 3.9-35%와 하위 3.9-35%를 게이팅(gating)하여 FACS 분리를 실시하였다.
GSHHigh(상위 1.9-35% 세포군), GSHMiddle(GSHMid, 상위 30.2-62.5% 세포군), GSHLow(하위 1.9-35% 세포군)로 분리 후 새로운 배양액으로 배양 배지를 교체하여 FreSH-트레이서를 제거하였다(도 2). FreSH-트레이서는 GSH와 가역적으로 결합하기 때문에 배양액을 교체하면 FreSH-트레이서는 세포에서 제거된다(도 3).
2-2. 인간섬유아세포 세포 분리
사람 음경의 포피에서 분리하여 제조한 인간섬유아세포(HDF: Human diploid fibroblast)를 노화(Old) 세포(p32)로 만든 후[계대배양(passsage)에 따른 복제성 노화 모델] 150 pi 조직 배양 배지(tissue culture media)에 접종(seeding)하고 2μM FreSH를 포함하는 10% 우태혈청(Fetal bovine serum)과 1% penicillin-streptomycin를 포함하는 페놀 레드를 포함하지 않는(Phenol red free) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지로 2시간 동안 세포를 표지하였다. 2시간 후, PBS로 2번 세척하고, TrypsinLE(Invitrogen) 용액을 처리하여 세포를 탈착시킨 후, 새로운 배지로 트립신을 불활성화시킨 후, 얼음 위에서 5분간 방치하였다. 이후, 4℃, 1000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 세포를 2x107세포/ml 밀도가 되도록 2μM FreSH를 포함하는 새로운 배지로 현탁(resuspend)하였다.
이후, 다음과 같은 FACS Instruction 조건(BD ARIAIII, 파장 405(F510 측정을 위함) 및 488(F580 측정을 위함) 레이저, 노즐 크기 100μm)에서 F510/F580 비율이 전체 클 세포 수의 GSHHigh(상위 0.2-30.2% 세포군)와 GSHLow(하위 0.2-30.3% 세포군)를 게이팅(gating)하여 FACS 분리를 실시하였다. 이후, 새로운 배양액으로 배양 배지를 교체하여 FreSH를 제거하였다(도 4). FreSH는 GSH와 가역적으로 결합하기 때문에 배양액을 교체하면 FreSH는 세포에서 바로 제거된다(데이터 미기재).
2-3. 단핵구 유래 인간 수지상 세포 배양
인간 혈액을 채취한 후 DPBS(WELGENE #LB 001-02)로 3배 용량이 되도록 희석하고 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare, 17-1440-02) 용액을 이용하여 밀도차 분리 방식으로 유핵세포만 분리한다. 분리된 세포의 개수를 확인하고, 1x107 세포 당 90μL 의 2% FBS 가 함유된 DPBS와 10μL 의 CD14 MicroBead(Milteny biotech #130-050-201)를 넣어 주고, 15분 동안 4℃에서 반응시켜준 후 LS Column을 이용하여 CD14+ 단핵구를 분리하였다. 6웰플레이트에 웰당 1x106개 세포를 2mL의 수지상세포 분화배지(RPMI 1640, 2mM L-Glutamine, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 100μM ß-mercaptoethanol, 20ng/mL hGMCSF, 20ng/mL IL-4) 에서 6일간 분화시켰다. 6일 후 분화가 완료된 수지상세포는 미성숙 수지상세포로 간주하고 0.5μg/mL LPS 를 24시간 동안 처리하여 성숙 수지상세포를 배양하였다.
실시예 2-3과 같이 FreSH를 포함하는 배지로 상기 세포를 표지하였다.
2-5. 쥐의 T림프구 분리
5μg/mL의 CD3 항체(Biolegend #100340)를 37℃에서 4시간 동안 24웰플레이트에 코팅한 후 DPBS를 이용하여 세척하였다. 쥐의 비장과 림프절로부터 Mouse Pan T Cell Isolation Kit II(Milteny biotech #130-095-130)를 이용하여 분리한 T림프구를 웰당 2x106개 넣어주고 1μg/mL 농도의 CD28 항체(Biolegend #102112)와 함께 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 3일 동안 배양하였다. FreSH를 최종 2μM 농도가 되도록 배양 배지에 첨가하고 2시간 동안 세포를 표지 후, 4℃, 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 세포를 2x107세포/ml 밀도가 되도록 2μM FreSH를 포함하는 새로운 배지로 현탁(resuspend)하였다. 그 후, 다음과 같은 FACS Instruction 조건(BD ARIAIII, 파장 405(F510 측정을 위함) 및 488(F580 측정을 위함) 레이저, 노즐 크기 70μM)에서 F510/F580 비율에 따라 세 가지 세포군으로 분리하였다.
2-6. hES-MSC 줄기세포 분리
3x106세포/ml 밀도의 hES-MSC 줄기세포를 150 pi 조직 배양 배지(tissue culture media)에 접종(seeding)하고, 12시간 후, 30ml PBS로 두 번 세척한 후, 2μM FreSH를 포함하는 EGM-2 MV 배양액으로 2시간 동안 세포를 표지하였다. 2시간 후, 2μM FreSH를 포함하는 PBS로 2번 세척하고, TrypsinLE(Invitrogen) 용액을 처리하여 세포를 탈착시킨 후, 2μM FreSH를 포함하는 새로운 EGM-2 MV 배지로 트립신을 불활성화시켰다. 이후, 4℃, 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후 세포를 5x107세포/ml 밀도가 되도록 2μM FreSH를 포함하는 새로운 EGM-2 MV 배지로 현탁(resuspend)하였다. 이를 FACS에 로딩 직전, 2μM FreSH를 포함하는 PBS로 1/5 희석하였다(4℃ 유지를 위하여 한번에 약 1ml씩 희석).
이후, 다음과 같은 FACS Instruction 조건(BD ARIAIII, 파장 405(F510 측정을 위함) 및 488(F580 측정을 위함) 레이저, 노즐 크기 100μM, 2,000-3,000 events/sec)에서 F510/F580 비율이 전체 세포 수의 상위 3.9-35%와 하위 3.9-35%를 게이팅(gating)하여 FACS 분리를 실시하였다.
GSHHigh(상위 3.9-35% 세포군), GSHLow(하위 3.9-35% 세포군)로 분리 후 새로운 배양액(EGM-2-MV media, LONZA)으로 배양 배지를 교체하여 FreSH를 제거하였다(도 4). FreSH는 GSH와 가역적으로 결합하기 때문에 배양액을 교체하면 FreSH는 세포에서 바로 제거된다(데이터 미기재).
실시예 3: 분리한 세포의 특성 분석
3-1: FreSH-트레이서 기반 분리된 줄기세포의 세포학적 특성 분석
hBM-MSC 줄기세포의 치료 효능을 결정하는 주요 인자인 콜로니 형성 단위(CFU-F, colony forming unit-fibroblast)와 생착률을 세포 배양 모델에서 평가하였다. 200세포/100 pi dish로 접종후 14일간 배양한 후 크리스탈바이올렛 염색을 실시한 결과, GSHHigh 세포가 GSHMid나 GSHLow 세포에 비해 현저히 높은 CFU-F 수치를 나타냄을 확인하였다(도 4a). 또한, 트랜스웰 배양을 활용하여 SDF-1(150ng/ml)이나 PDGF-AA(10ng/mL) ± STI571(0.5μg/mL)에 관한 주화성을 측정한 결과, GSHHigh 세포가 GSHLow 세포에 비해 현저히 높은 세포 이동성을 나타냄을 확인하였다(도 4b).
3-2: FreSH-트레이서 기반 분리된 섬유아세포에서의 노화 특성 분석
사람 음경의 포피에서 분리하여 제조한 인간섬유아세포(HDF: Human diploid fibroblast)를 젊은(Young) 세포(p6)와 노화(Old) 세포(p32)[계대배양(passsage)에 따른 복제성 노화 모델]로 만든 후 Promega사의 GSH/GSSG-GloTM 분석 키트를 이용하여 GSH 수준을 측정하였을 경우, 노화 세포에 비해 젊은 세포의 GSH 수준이 약 44% 감소되어 있음을 확인하였다(도 5a).
상기 인간섬유아세포를 실시예 2-2의 방법에 의하여 GSHHigh 및 GSHLow 섬유아세포로 분리하였다. 세포 크기를 측정한 결과, GSHLow 세포가 GSHHigh 세포에 비해 1.5배 큰 결과를 확인하여 노화가 될수록 세포의 크기(FSC, Forward scattering)가 커진다는 기존의 발표(참고자료 1을 참고)에 부합함을 확인하였다(도 5b). 5μM DHR123(Dihydrorhodamine 123)을 세포에 처리 후 30분간 37℃에서 배양하여 세포내 ROS 양을 측정하였을 경우, GSHLow 세포가 GSHHigh 세포에 비해 염색의 정도가 양호함을 확인하였다(도 5c).
또한, 리포푸신(lipofuscin) 양을 Alexa488 형광필터를 사용하여 자가형광(autofluorescence)로 측정하여 정량하였을 때 GSHLow 세포가 GSHHigh 세포에 비해 강하게 측정되었고(도 5d), GSHLow 세포가 GSHHigh 세포에 비해 ki67 mRNA 발현양은 적은 반면 p21의 mRNA 발현양은 높았다(도 5e). 또한, SASP관련 유전자들의 발현양을 상술한 RQ-PCR로 분석하였을 때, GSHLow 세포가 GSHHigh 세포에 비해 IL-1A 유전자 및 IL-1B 유전자 발현이 증가되어 있음을 확인하였다(도 5f). 세포가 노화됨에 따라 리포푸신이 증가하고(참고자료 2를 참고), 노화가 될수록 ki67 발현양은 감소하고 p21 발현양은 증가하며(참고자료 3을 참고), SASP(senescence associated secretory phenotype)관련 유전자들의 발현양이 증가됨이 알려져 있는바(참고자료 4를 참고), GSHHigh 세포가 GSHLow 세포에 비해 항노화 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 본 실시예의 유전자 발현은 상술한 RQ-PCR 분석을 이용하여 측정하였고, 분석에 사용된 모든 프라이머는 QuantPrime(http://www.quantprime.de/)을 이용하여 디자인하였으며, 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 명칭 프라이머 서열(5‘ -> 3’)
IL1A_For TGTGACTGCCCAAGATGAAGACC
IL1A_Rev TTGGGTATCTCAGGCATCTCCTTC
IL1B_For GAACTGAAAGCTCTCCACCTCCAG
IL1B_Rev AAAGGACATGGAGAACACCACTTG
Ki67_For AGCACCTGCTTGTTTGGAAGGG
Ki67_Rev ACACAACAGGAAGCTGGATACGG
p21_For GGCAGACCAGCATGACAGATTTC
p21_Rev AGATGTAGAGCGGGCCTTTGAG
3-3: FreSH-트레이서 기반 분리된 수지상세포에서 면역 활성 분석
인간 단핵구 유래 수지상세포의 면역활성에 관련된 다양한 표면단백질에 대한 항체를 FreSH Tracer와 동시에 염색한 후 유세포 분석법을 이용하여 GSHHigh(상위 0.2-30.2% 세포군), GSHMid(상위 30.2-62.5% 세포군)와 GSHLow(하위 0.3-32.7% 세포군)를 게이팅(gating)하고 각각의 세포군에서의 표면단백질의 발현정도를 확인하였다. 그 결과, T림프구 활성에 중요한 역할을 한다고 알려진 CD80의 세포 표면의 발현 정도가 수지상세포의 성숙여부와 관계없이 GSHHigh, GSHMid, GSHLow 순서로 감소하는 것을 확인하였다(도 6). 이를 통해 GSH가 높은 수지상세포의 면역활성이 클 것으로 예상할 수 있다. 실험에 사용한 표면단백질 항체는 표 2와 같다.
표면단백질 형광 제조사 Cat. No.
CD40 AlexaFluor®700 Biolegend 334328
CD80 APC Biolegend 305220
HLA-DR BV650 BD 564231
CD86 PE/Cy7 Biolegend 305422
HLA-A,B,C APC/Cy7 Biolegend 311426
CD11c BrilliantViolet711™ Biolegend 301630
3-4: FreSH-트레이서 기반 분리된 T세포에서 Treg 세포 활성 분석
쥐의 T림프구를 CD3 및 CD28 항체를 이용하여 활성화시킨 후 FreSHtracer를 이용하여 GSH 농도에 따라 3가지 실험군으로 분리하였다. 분리된 T림프구를 Trizol(Invitrogen #15596026)을 이용하여 mRNA를 추출하고 Treg 세포특이적으로 발현하는 전사인자인 foxp3 mRNA 수준을 RQ-PCR을 통해 분석한 결과, GSHHigh, GSHMid에 비해 GSHLow에서 4배 가량 증가되어 있음을 확인하였다(도 7). 이를 통해 GSH가 높은 T세포군에서 Treg 세포의 존재비율이 낮을 것으로 예상할 수 있다.
실시예 4: FreSH-트레이서 기반 세포 치료제 품질 평가를 위한 평가파라미터 수립
치료용 세포의 품질을 평가하기 위하여 아래에 기술하는 것과 같이 FreSH-트레이서를 이용한 실시간 글루타치온 측정법을 기반으로 하는 네 가지의 평가 파라미터를 개발하여 분석하였다(도 8). 그 네 가지는 각각 세포의 글루타치온 평균값(또는 중앙값; Glutathione Mean Level, GM) 및 글루타치온 산포도(Glutathione Heterogeneity, GH), 글루타치온 재생산 능력(Glutathione RegenerationCapacity, GRC), 산화스트레스 저항 능력(Oxidative Stress Resistance Capacity, ORC)이다.
도 8에 나타내어진 바와 같이, GM은 세포 FR의 평균값이나 중앙값으로 산출한다. 또한, GH는 세포 FR의 변동계수(Coefficient of variation)이나 강건 변동계수(Robust coefficient of variation)로 산출한다. GRC는 살아있는 세포에 산화제 처리 후 실시간으로 FR을 모니터링하여 얻어지는 수치로 산화제(디아미드, H2O2 등) 처리군의 FR 곡선하면적(area under the curve, AUC)에서 0.1~100mM N-에틸말레이미드(NEM) 처리군의 AUC를 뺀 값을 아무것도 처리하지 않은 대조군의 AUC에서 NEM 처리군의 AUC를 뺀 값으로 나눈 후 100을 곱한 값을 의미한다. NEM 처리군의 FR은 해당 세포 FR의 블랭크 값으로 처리하여 GRC 수치의 민감성을 높이기 위한 수치이다. 또한, ORC는 살아있는 hUC-MSC에 산화제인 글루타치온 페록시다아제 4(glutathione peroxidase 4, GPX4) 억제제 RSL3를 0.5μM나 1μM 농도로 처리하여 37℃에서 2시간동안 배양하였다. RSL3가 포함된 배지를 제거한 후 15μM Mito-FreSHtracer를 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 10mM HEPES를 포함한 HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt Solution)가 사용되었다. 측정 전 배지 상의 Mito-FreSHtracer를 제거해 주기 위해 10mM HEPES를 포함한 HBSS로 배지를 교환해준 후 공초점 이미지 장비인 operetta를 이용해 형광이미지를 측정하였다. RSL3를 처리하지 않은 대조군 세포 또는 RSL3 처리하기 전의 대조군 세포에서 정량된 GSH 수준을 비교하여, GSH 발현이 변동된 세포분포로 산출하였다. 분포를 나타내는 히스토그램이 두 개의 peak 로 나뉘는 지점을 기준으로 GSH High cell (오른쪽 피크), GSH Low cell (왼쪽 피크) 을 나누어 해당하는 세포의 비율을 %로 나타내었다.
상기한 글루타치온 평가 파라미터들의 줄기세포 품질과의 관련성 여부를 확인하기 위해 hBM-MSC 계대배양 횟수(passage, P)에 따른 CFU-F(colony-forming unit-fibroblasts)와 이동능을 분석하였다. 그 결과, p4.5의 hBM-MSC가 p9.5의 hBM-MSC보다 CFU-F가 현저히 높고(도 9a), SDF-1a(혈관 신생인자) 또는 PDGF-AA(혈소판유래증식인자-AA) 의존적 이동능이 큰 것을 확인하였다(도 9b). 이 조건에서 세포 전반적 글루타치온 측정용 FreSH-트레이서와 각각 골지체, 및 미토콘드리아 특이적인 GolgiFreSH-트레이서, 및 MitoFreSH-트레이서를 이용하여 줄기세포의 글루타치온 평가 파라미터들을 비교 분석하였다(도 10a). GM은 계대배양이 높을수록 hBM-MSC에서 FR 평균값 및 Mito-FR 평균값은 유의적으로 낮아졌으나 Golgi-FR 평균값은 유의적인 변화가 나타나지 않았다(도 10b). GH는 계대배양이 높을수록 hBM-MSC에서 FR rCV값과 Mito-FR rCV값이 유의적으로 증가하였으나 Golgi-FR rCV값은 유의적으로 변하지 않았다(도 10c). GRC는 계대배양이 높을수록 hBM-MSC에서 디아미드 처리에 의한 FR기반 %GRC와 Mito-FR 기반 %GRC가 감소하였으나 Golgi-FR 기반 %GRC는 변화가 없었다(도 11). 이를 통해, 줄기세포의 품질과 FreSH-트레이서나 MitoFreSH-트레이서 기반의 GM과 GRC는 비례적 상관관계를 보이며, FreSH-트레이서나 MitoFreSH-트레이서 기반의 GH는 반비례적 상관관계를 보이는 것을 알 수 있었다. 특히 MitoFreSH-트레이서 기반의 글루타치온 평가 파라미터가 줄기세포 품질에 대한 민감성이 큰 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 골수세포의 분화 정도에 따른 MitoFreSH-트레이서 기반의 글루타치온 평가 파라미터의 변화를 관찰하였다. 쥐에서 분리한 Lineage+ 세포와 Lin- 세포를 각각 MitoFreSH-트레이서를 이용하여 염색을 실시한 후, Operetta 기기(PerkinElmer)를 이용하여 FR을 측정하고, 세포군 별 MitoFreSH-트레이서 기반의 글루타치온 평가 파라미터를 확인하였다. 그 결과, 분화가 진행된 Lineage+ 세포군에 비해 미분화된 Lin- 세포군에서 미토콘드리아 GM은 높고 GH는 낮아짐을 확인하였다(도 12). 이는 골수세포의 줄기성을 글루타치온 평가 파라미터로 구분할 수 있음을 의미한다.
실시예 5: FreSH-트레이서를 이용한 세포 치료제 품질 향상 물질 탐색
직접적으로 줄기세포내 GSH 양을 조절할 경우 세포기능 변화를 초래하는지를 테스트하기 위해 부티오닌 설폭시민(BSO, buthionine sulfoximine; 글루타치온 합성 억제제)와 글루타치온 에틸 에스터(GSH-EE, Glutathione ethyl ester)를 FreSH-트레이서에 의해 분리된 hES-MSC에 처리하였다. GSHHigh 세포에 BSO(80μM, 24h)를 처리하여 세포내 GSH를 낮출 경우 CFU-F가 증가함을 확인하였고, 역으로 GSHLow 세포에 GSH-EE(1mM, 2h)를 처리하여 GSH를 높혔을 경우 CFU-F가 감소함을 확인하였다(도 13a). 또한 FreSH-트레이서로 분리하지 않은 hES-MSC에 BSO를 처리하거나 GSH-EE를 처리하였을 경우, 각각 PDGF-AA에 대한 세포 이동능이 감소하거나 증가함을 확인하였다(도 13b).
한편, hUC-MSC를 항산화제 아스코르브산 2-글루코시드(AA2G, 250μg/mL)를 넣은 배지에서 세 번 계대배양하는 경우, 그렇지 않은 나이브 세포군에 비해 낮은 농도의 디아미드 처리에 의한 FreSH-트레이서 기반의 GRC가 높아지는 것을 확인하였다(도 14). 이로써 글루타치온 평가파라미터 개선 물질이 세포 기능을 향상시킴을 확인하였다.
또한, hUC-MSC를 항산화제 아스코르브산 2-글루코시드(AA2G, 250μg/mL)를 넣은 배지에서 세 번 계대배양하는 경우, 그렇지 않은 나이브 세포군(NC)에 비해 FreSH-트레이서 기반의 ORC가 GSHHigh 세포에서 더 높아지는 것을 확인하였다(도 15a 및 도 15b).
본원 발명자들은 글루타치온 평가 파라미터를 개선하는 물질을 각각의 줄기세포에 처리하여, 줄기세포에 대한 상기 물질의 영향을 관찰하였다. L-아스코르브산 2-글루코시드(L-Ascorbic Acid 2-Glucoside, AA2G)를 넣은 배지에서 hUC-MSC(human umbilical cord mesenchymal stem cells)를 계대배양한 경우, CFU-F, 이동능, 및 항염증효과를 관찰하였다. hUC-MSC에 AA2G를 125μg/mL 또는 250μg/mL로 3일간 처리하여 CFU-F 어세이(n = 3)를 실시하였다. 도 16a 및 도 16b에 나타나있는 바와 같이, AA2G를 처리한 경우에 CFU-F가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, hUC-MSC에 125μg/mL 또는 250μg/mL의 AA2G를 3일간 처리하여 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석하였다. 도 17a 및 도 17b에 나타나있는 바와 같이, AA2G를 처리한 경우에 이동능이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 추가로, hUC-MSC에 125μg/mL 또는 250μg/mL의 AA2G를 3일간 처리하여 T 세포의 증식능 저하 및 T 세포의 분화능 저하를 관찰하고, Treg 세포 분화의 촉진을 관찰하였다. 도 18a 내지 도 18c에 나타나있는 바와 같이, AA2G를 처리한 경우에 줄기세포의 항염증 효과를 확인할 수 있었다.
한편, hUC-MSC를 글루타치온 전구물질인 감마-글루타밀 시스테인(gamma-glutamyl cysteine; GGC, 0.1, 0.25, 및 0.5mM)으로 배양하였다. hUC-MSC에 각각 농도의 GGC를 2시간 처리하여 CFU-F 어세이(n = 3)를 실시하였다. 그 결과, 도 19에 나타나있는 바와 같이, CFU-F가 증가되어 있는 것을 확인하였다. 또한, hUC-MSC에 GGC를 처리하지 않고 SDF1alpha와 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석하고 나서, hUC-MSC에 GCC를 상기한 농도로 증가시켜 처리하고, SDF1alpha와 PDGF-AA에 의한 이동능(n = 3)을 분석하였다. STI571은 PDGFR 키나아제 억제제로 사용하였다. 도 20a 내지 20c에 나타나있는 바와 같이, GCC 처리 농도가 증가함에 따라 SDF1alpha와 PDGF-AA에 의해 이동능이 향상되는 것을 확인하였다.
또한, ORC 분석을 위해, 도 21에 나타낸 바와 같이, 살아있는 세포를 준비하여, 3×103의 세포를 웰에 각각 접종하였다. α-MEM 배지에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신을 처리하였다. 글루타치온 평가 파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 처리하였다. 그 다음, 글루타치온 페록시다아제 4(glutathione peroxidase 4, GPX4) 억제제인 RSL3를 처리하였다. 2시간 정도 배양한 후, RSL3가 포함된 배지를 제거한 후 15μM Mito-FreSHtracer를 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이 때 사용한 배지는 10mM HEPES를 포함한 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)를 사용하였다.
본 발명자들은 hUC-MSC에서 글루타치온 평가 파라미터를 개선시킬 수 있는 물질로서 리프록스타틴-1, 비타민D3, 비타민E, 플라보노이드 계열인 바이칼린, 바이칼레인, 루테오린, 퀘르세틴, 부테인, 식물 추출물인 국화꽃 추출물, 가죽나무잎 추출물, 달맞이순 추출물, 쇠뜨기 추출물, 고구마잎 추출물, 및 토마토 추출물(LYCOBEADS®)을 처리하여 ORC를 분석하였다(도 22a 내지 도 26f 참고). 예를 들어, 도 22a에 나타난 바와 같이, 리프록스타틴-1의 농도를 각각 0, 2.5, 5, 10μM으로 처리하고, RSL3도 각각 0, 0.5, 1μM 으로 처리하였다. RSL3에 의해 세포의 품질이 저하되어도 리프록스타틴-1의 농도가 높으면 세포의 품질이 증가한 것을 관찰하였다. 즉, GSHHigh 세포의 비율이 증가하는 것을 확인하였다.
hUC-MSC에 0.2, 1, 2, 및 4μM의 페로스타틴-1(Ferrostatin-1) 및 0.1, 0.5, 1, 및 2μM의 리프록스타틴-1(Liproxstatin-1)을 24시간 처리하여 CFU-F 어세이(n = 3)를 실시하였다. 도 28a 내지 27c에 나타내는 바와 같이, GGC 처리로 항염증 효과에 대한 변화는 보이지 않았다.
또한, 지질 산화를 억제하여 세포내 글루타치온 수준을 조절하는 페로스타틴-1(0.2, 1, 2, 4μM) 및 리프록스타틴-1(0.1, 0.5, 1, 2μM)으로 hUC-MSC를 배양하였다. 도 27에 나타나있는 바와 같이, CFU-F가 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, hUC-MSC에 각각 1μM의 페로스타틴-1을 24시간 처리하고, 0.2mM의 GGC를 2시간 처리하고, 2mM의 GSH-EE를 2시간 처리하였다. 이로부터, T 세포의 증식능 저하 및 T 세포의 분화능 저하를 관찰하고, Treg 세포 분화의 촉진을 관찰하였다. 페로스타틴-1 및 리프록스타틴-1과 같은 물질들은 도 28a 내지 27c에 나타나있는 바와 같이 hUC-MSC의 항염증 효과에 대한 변화는 보이지 않았다. 이로써 글루타치온 평가파라미터를 개선하는 물질이 치료용 줄기세포 기능을 향상시킴을 확인하였다.
또한, 본원 발명자들은 줄기세포 항산화능에 따른 연골 재생 효과를 골관절염 동물모델에서 확인하였다. 전방십자인대(anterior cruciate ligament, ACL)를 파열하여 골관절염을 유도한 랫(rat)의 관절을 준비하였다. AA2G(250μg/mL)를 포함하는 배양액에서 3번 계대배양한 hES-MSC(2 x 105)를 상기 관절에 주입하였다. 그 결과 도 29a에 나타내는 바와 같이, 일반적인 줄기세포와 비교하여 항산화능 증가 줄기세포 이식(high GSH MSC)시 연골 재생 효능이 현저하게 우수한 것을 확인하였다. 또한, 상기한 바와 같은 hES-MSC(2 x 105)를 주입한 관절조직을 준비하여, H&E 및 사프라닌-O(Safranin-O)으로 염색하였다(도 29b). 또한, 상기한 바와 같은 hES-MSC(2 x 105)를 주입한 관절조직을 준비하여, 2형 콜라겐(Type II collagen)을 면역 염색하였다(도 29c). GAG 및 2형 콜라겐(Type II collagen)의 발현이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이로써 글루타치온 파라미터 개선 물질이 줄기세포의 질환 치료 효능을 향상시킴을 확인하였다.
모든 데이터는 비모수검정의 사후검정(Bonferroni post-hoc tests)과 함께 일원 분산분석(one-way ANOVA) 또는 이원 분산분석(two-way ANOVA)을 이용하여 분석하였다. 모든 분석은 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, 캐나다)로 수행하였고, p<0.05 또는 p<0.01인 경우 통계학적으로 유의한 것으로 결정하였다.
실시예 6: 지질산화제를 이용한 GSH 발현 수준 측정
본연구실에서 배양된 hUC-MSC 계대배양 4, 7, 15 에 해당하는 세포에 RSL3를 다양한 농도로 처리한 후 Mito-FreSH를 사용하여 염색후 유세포분석과 컨포칼 이미징을 통해 세포의 미토콘드리아 GSH (mGSH) 의 분포양상을 히스토그램을 통해 확인해보았다.
1. RSL3 농도와 계대배양 수에 따른 mGSH 발현수준 변동
1)실험과정
<유세포분석법을 통한 MSC에서의 GSH 분포 측정>
탯줄 유래 중간엽 줄기세포 (human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, hUC-MSC)의 계대배양 4, 7, 15를 준비한 뒤 6-well 세포 배양 플레이트에 well당 70000 cells 를 넣어준 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. 배지를 제거한 후 글루타치온 페록시다아제 4(glutathione peroxidase 4, GPX4) 억제제인 RSL3를 0.1/0.5/1μM 농도로 넣고 37℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. RSL3가 포함된 배지를 제거한 후 5μM Mito-FreSHtracer를 넣고 37℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. Mito-FreSHtracer가 포함된 배지를 제거한 후, 2mL의 DPBS 로 세포를 2회 세척해주었다. 250μL 의 TrypLE Express를 넣고, 37℃에서 2분30초 동안 반응한 뒤, 2% FBS가 포함된 DPBS를 동량 넣어 세포를 플레이트에서 떼어주었다. 플레이트에서 떼어낸 세포를 FACS tube 로 옮겨 얼음에 보관한 뒤, Flow cytometry 장비를 이용해 형광 값을 측정하였다.
<형광 이미징을 이용한 GSH 분포 측정>
탯줄 유래 중간엽 줄기세포 (human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, hUC-MSC)의 계대배양 4, 7, 15를 준비한 뒤 96-well 세포 배양 플레이트에 well당 7000 cells/100㎕를 넣어준 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. 배지를 제거한 후 글루타치온 페록시다아제 4(glutathione peroxidase 4, GPX4) 억제제인 RSL3를 0.1/0.5/1μM 농도로 100㎕를 넣고 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. RSL3가 포함된 배지를 제거한 후 15μM Mito-FreSHtracer를 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 10mM HEPES를 포함한 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)가 사용되었다. 측정 전 배지 상의 Mito-FreSHtracer를 제거해 주기 위해 10mM HEPES를 포함한 HBSS로 배지를 교환해준 후 공초점 이미지 장비인 operetta를 이용해 형광이미지를 측정하였다.
<히스토그램 분석방법>
각 세포 내의 F510 (Mito-FreSHtracer가 SH기와 결합했을 때의 형광 값)과 F580 (Mito-FreSHtracer가 SH와 결합하지 않은 상태로 자체 형광 값)의 형광 값을 측정한 뒤 F510값을 F580값으로 나눈 값을 세포 내 GSH 평균 값을 의미하는 F510/F580 ratio 값으로 구하였다. prism 5 프로그램을 사용해 각 세포가 갖는 F510/ F580 ratio 값을 X축으로 F510/F580 ratio값에 해당되는 세포의 %양을 Y축으로 히스토그램으로 나타내었다. Flow cytometry를 분석하는 Flowjo 소프트웨어를 이용하여 모든 샘플에서 Alexa 430 / PE (F510/F580) 파라미터를 분석하였고, F510/F580 의 분포를 나타내는 히스토그램이 두 개의 peak 로 나뉘는 지점을 기준으로 GSH High (오른쪽 피크), Low cell (왼쪽 피크) 을 나누어 해당하는 세포의 비율을 %로 나타내었다
2)실험결과
본연구실에서 배양된 hUC-MSC 계대배양 4, 7, 15 에 해당하는 세포 모두 RSL3를 처리하지 않은 경우 거의 동인한 패턴의 mGSH의 분포를 보였으나 RSL3 농도와 계대배양 수에 의존적으로 mGSH양 이 감소된 집단이 관찰됨을 확인 할 수 있었다 (도 30, 도 31, 및 도 32).
계대배양을 거듭할수록 세포는 항산화 스트레스를 받는다고 알려져있고 이러한 세포는 세포노화를 겪은 세포이며 줄기세포의 기능이 저하되어있다는 것은 많은 연구를 통해 증명되었다. 이를 바탕으로 본 결과를 해석해본다면 RSL3에 의해 유발된 지질산화스트레스 조건에서 항산화능이 저하된 세포는 그렇지 않은 세포에 비해 mGSH 레벨을 정상적으로 유지하지 못한다고 할 수 있다.
도 33에서 세포형광 이미지 사진에서 보이는 바와 같이 녹색으로 보이는 세포는 mGSH를 유지하는 세포이며 노란색으로 보이는 세포는 mGSH가 감소된 세포이다. 계대배양 가 높은 세포일수록 노란색 세포의 비율이 많아짐을 관찰할 수 있으며 같은 세포 안에서 비교하더라도 노란색세포가 녹색세포에 비해 크기가 크고 넓게 퍼져있는 모양으로 관찰된다. 또한 Ferrostatin-1을 처리하게 되면 RSL3의 효과가 사라지는 것으로 보아, 이는 지질산화스트레스에 의존한 결과라고 볼 수 있다 (도 33).
2. Human dermal fibrolast 에서의 mGSH 발현수준 변동
MSC를 통한 실험과 마찬가지로, 다양한 횟수로 계대 배양된 Human dermal fibrolast 에 RSL3를 처리한 후 Mito-FreSHtracer로 세포를 염색하고 컨포칼 이미징을 통해 mGSH의 양을 유지하는 세포와 유지하지 못한 세포의 비율을 백분율로 나타냈다. 그 결과 중간엽줄기세포의 결과와 마찬가지로 계대 배양을 지속할수록 RSL3의 처리에 의해 mGSH이 감소하는 세포의 비율이 증가하는 것으로 나타났다(도 35 참조)
2. mGSH 발현수준과 CD146의 발현량과의 관계
1) 실험과정
실제 RSL3처리에 의한 지질산화스트레스 조건에서 mGSH 레벨이 떨어진 세포들이 줄기세포의 기능이 저하되어있는가를 확인하기 위해 기존 문헌을 통해 밝혀진 좋은 줄기세포가 높게 발현한다고 알려진 세포표면단백질인 CD146의 발현량을 유세포분석을 통해 확인하였다.
위에서 언급한 유세포분석을 이용한 미토콘드리아 GSH 레벨을 측정하는 방식과 동일한 방법으로 세포를 염색하고 트립신을 이용해 세포를 플레이트에서 떼어낸다. 떼어낸 세포를 형광 물질인 BUV395가 결합된 CD146에 대한 유세포분석용 항체를 4℃ 에서 30분간 처리한 후, PBS로 씻어준다. Flow cytometry 장비를 이용해 GSH 레벨 측정을 위한 F510, F580 형광값과, CD146 발현 측정을 위한 BUV395 형광값을 측정하였다. 그 후, FlowJo 소프트웨어를 이용하여 F510/F580 의 분포를 나타내는 히스토그램이 두 개의 peak 로 나뉘는 지점을 기준으로 GSH High (오른쪽 피크), Low cell (왼쪽 피크) 을 나누고, 해당하는 세포의 CD146 양성 비율을 %로 정량하였다.
2) 실험결과
RSL3 처리 후 Mito-FreSH와 CD146 항체를 동시에 염색하여 mGSH High 세포와 Low 세포에서 CD146의 표면발현량을 비교해보면, P4 hUC-MSC에서 RSL3에 의해 mGSH 레벨이 낮아진 집단은 CD146 mGSH 레벨을 유지한 집단에 비해 CD146 양성 비율이 25% 정도 낮아진 것을 확인하였다 (도 34). 이는 P15 줄기세포의 CD146 양성비율과 비슷한 수치였다. P7은 P4와 비교하여 CD146의 양성 비율이 차이가 없기 때문에 이러한 표면단백질 발현 비율을 이용한 세포의 품질 평가방법으로는 두 세포의 품질을 구분을 할 수 없었지만, 도 32에서와 같이 현 기술을 이용하면 이들의 품질도 구분하여 평가할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고자료
1. E. ROBBINS et al., J Exp Med. 1970 Jun 1;131(6):1211-22.
2. Georgakopoulou EA et al., Aging(Albany NY), 2013 Jan;5(1):37-50.
3. Thomas Kuilman et al.. Genes Dev. 2010 Nov 15;24(22):2463-79.
4. Jean-Philippe Copp´ et al., Annu Rev Pathol. 2010;5:99-118.

Claims (17)

  1. 목적하는 세포를 분리하는 단계;
    분리한 세포에서 글루타치온의 수준을 측정하는 단계;
    글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단하는 단계; 및
    분리한 세포에서 글루타치온 평가파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 첨가하는 단계를 포함하는, 세포의 품질을 향상시키는 방법에서,
    글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단하는 것은 하기 평가파라미터 중 어느 하나 이상인 방법:
    i) 세포의 글루타치온 평균값 또는 중앙값(Glutathione Mean Level, GM);
    ii) 세포의 글루타치온 산포도(Glutathione Heterogeneity, GH);
    iii) 세포의 글루타치온 재생산 능력(Glutathione Regeneration Capacity, GRC); 및
    iv) 산화스트레스 저항 능력(Oxidative Stress Resistance Capacity, ORC)
    여기서,
    GM은 세포 FR(FreSHtracer Ratio)이나 F510의 평균값이나 중앙값으로 산출하고,
    GH는 세포 FR이나 F510의 변동계수(Coefficient of variation)이나 강건 변동계수(Robust　coefficient of variation)로 산출하며,
    GRC는 세포에 산화제 처리 후 실시간으로 FR이나 F510을 모니터링하여 얻어지는 수치로 제1산화제 처리군의 제 1 곡선하면적(area under the curve, AUC)에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값을 무처리 대조군의 제 3 곡선하면적에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값으로 나눈 후 100을 곱한 값으로 산출하며,
    ORC는 살아있는 세포에 제1산화제 처리 후 GSH 수준을 정량하여 얻어지는 수치로 GSH 수준을 제1산화제 처리하지 않은 대조군 세포 또는 제1산화제 처리하기 전의 대조군 세포에서 정량된 GSH 수준을 비교하여, GSH 발현이 변동된 세포양으로 산출한 값인, 방법에서,
    글루타치온 평가 파라미터를 개선시킬 수 있는 물질은 글루타치온 에틸 에스터(Glutathione ethyl ester), 아스코르브산 2-글루코시드(Ascorbic Acid 2-Glucoside), 글루타치온(Glutathione), N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 디티오트레이톨(Dithiothreitol; DTT), 시스테인(Cysteine), 감마-글루타밀 시스테인(gamma-glutamyl cysteine; GGC), 감마-글루타밀 시스테인 에스터(GGC Esters), 옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid; OTC), L-2-옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(L-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid), 리포익산(Lipoic acid), 페로스타틴-1(Ferrostatin-1), 리프록스타틴-1(Liproxstatin-1), 비타민D3(Vitamin D3), 1-알파, 25-디하이드록스 비타민D3 (1alpha,25-Dihydroxy VitD3), 비타민E(Vitamin E), 코엔자임 Q10(Coenzyme q10), 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스를 포함한 철이나 구리 이온 킬레이터, 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 루테오린(Luteolin), 퀘르세틴(Quercetin), 부테인(Butein), 국화꽃 추출물(Flower extracts of Chrysanthemum morifolium Ramat), 가죽나무잎 추출물(Leaf extracts of Cedela sinensis A. Juss), 달맞이순 추출물(Extracts of Oenothera stricta Ledeb.), 쇠뜨기 추출물(Extracts of Equisetum arvense L.), 고구마잎 추출물(Leaf extracts of Ipomoea batatas), 토마토 추출물 및 호모 시스틴(Homocysteine)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    세포의 품질의 향상은 글루타치온 평가파라미터인 GM, GRC를 높이거나, GH를 낮추거나, 또는 ORC 측정 시 산화제를 처리하지 않은 세포와 비교하여, 산화제 처리에 의해 GSH가 감소된 세포의 비율을 적게 하는, 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    글루타치온 평가파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 첨가하는 단계 이전에 글루타치온의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    글루타치온 평가파라미터를 개선시킬 수 있는 물질을 첨가하는 단계 이후에 글루타치온의 수준을 측정하여 글루타치온의 수준이 향상되었는지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    목적하는 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 줄기세포;
    수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 면역세포;
    섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 체세포(Somatic cell);
    CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 제재의 생산에 사용되는 세포주; 또는
    인체나 동물의 구강, 비강, 폐, 피부, 위장관, 및 비뇨관에서 유래한 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 인체 마이크로바이옴 (Microbiome)인, 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    T 세포는 조절 T 세포(Treg cell)를 제외한 것인, 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    제1산화제는 H2O2, 및 tert-부틸 과산화물을 포함한 히드로과산화물 (hydroperoxide); 디아미드, GSSG (oxidized GSH), 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산), 말레이미드, N-에틸말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산 및 요오드아세트아미드을 포함한 티올 산화제; 비스-클로로에틸니트로조우레아를 포함한 글루타치온 환원효소 억제제; PX-12을 포함한 티오레독신 억제제; 안티마이신 A, 로테논, 올리고마이신 및 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존을 포함한 미토콘드라아 전달전달계 억제제; 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트을 포함한 NADPH 산화효소 활성화제; 1S,3R-RAS-셀렉티브 레탈 3(1S,3R-RAS- selective lethal 3; 1S,3R-RSL3), DPI19, DPI18, DPI17, DPI13, DPI12, DPI10 (ML210), DPI7 (ML162), 또는 알트레타민을 포함한 gpx4 억제제; 에라스틴(Erastin), 설파살라진, 소라페닙, 글루타메이트, 피페라진 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴, 및 에라스틴 유사체를 포함한 시스템 x- c 억제제; 페로토시스 유도체 56(FIN56)를 포함한 GPX4 단백질량 및 CoQ10 양 감소유도제; 카스파제-의존성 레탈 56 (CIL56) 및 페로토시스 유도체 엔도페록시드 (FINO2)를 포함한 지질 과산화유도제; 부티오닌-(S, R)-설폭시민을 포함한 글루탐산염 시스타인 연결효소 (GCL) 억제제; 디에틸말레산염을 포함한 GSH 감소 유도제; DPI2, 시스플라틴, 시스테네이즈(cysteinase), 스타틴, 구연산 철 암모늄, 트리고넬린, 사염화탄소, 실리카계 나노입자 및 비열플라즈마를 포함하는, 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    제2산화제는 말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산, 에틸말레이미드, N-에틸말레이미드, 요오드아세트아미드, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 또는 요오드아세트아미도프로피온산을 포함하는, 방법.
  11. 목적하는 세포에서 글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단한 후, 추가된 세포 품질 향상용 조성물로서,
    글루타치온의 수준에 따른 세포 품질을 판단하는 것은 하기 평가파라미터 중 어느 하나 이상인 조성물:
    i) 세포의 글루타치온 평균값 또는 중앙값(Glutathione Mean Level, GM);
    ii) 세포의 글루타치온 산포도(Glutathione Heterogeneity, GH);
    iii) 세포의 글루타치온 재생산 능력(Glutathione Regeneration Capacity, GRC); 및
    iv) 산화스트레스 저항 능력(Oxidative Stress Resistance Capacity, ORC)
    여기서,
    GM은 세포 FR(FreSHtracer Ratio)이나 F510의 평균값이나 중앙값으로 산출하고,
    GH는 세포 FR이나 F510의 변동계수(Coefficient of variation)이나 강건 변동계수(Robust　coefficient of variation)로 산출하며,
    GRC는 살아있는 세포에 산화제 처리 후 실시간으로 FR이나 F510을 모니터링하여 얻어지는 수치로 제1산화제 처리군의 제 1 곡선하면적(area under the curve, AUC)에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값을 무처리 대조군의 제 3 곡선하면적에서 제2산화제 처리군의 제 2 곡선하면적을 뺀 값으로 나눈 후 100을 곱한 값으로 산출하며,
    ORC는 살아있는 세포에 제1산화제 처리 후 GSH 수준을 정량하여 얻어지는 수치로 GSH 수준을 제1산화제 처리하지 않은 대조군 세포 또는 제1산화제 처리하기 전의 대조군 세포에서 정량된 GSH 수준을 비교하여, GSH 발현이 변동된 세포양으로 산출한 값인, 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    세포의 품질의 향상은 글루타치온 평가파라미터인 GM, GRC를 높이거나, GH를 낮추거나, 또는 ORC 측정 시 산화제를 처리하지 않은 세포와 비교하여, 산화제 처리에 의해 GSH가 감소된 세포의 비율을 적게 하는, 조성물.
  13. 제 11항에 있어서,
    글루타치온 평가 파라미터를 개선시킬 수 있는 물질은 글루타치온 에틸 에스터(Glutathione ethyl ester), 아스코르브산 2-글루코시드(Ascorbic Acid 2-Glucoside), 글루타치온(Glutathione), N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 디티오트레이톨(Dithiothreitol; DTT), 시스테인(Cysteine), 감마-글루타밀 시스테인(gamma-glutamyl cysteine; GGC), 감마-글루타밀 시스테인 에스터(GGC Esters), 옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid; OTC), L-2-옥소-4-티아졸리딘 카르복실산(L-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid), 리포익산(Lipoic acid), 페로스타틴-1(Ferrostatin-1), 리프록스타틴-1(Liproxstatin-1), 비타민D3(Vitamin D3), 1-알파, 25-디하이드록스 비타민D3 (1alpha,25-Dihydroxy VitD3), 비타민E(Vitamin E), 코엔자임 Q10(Coenzyme q10), 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스를 포함한 철이나 구리 이온 킬레이터, 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 루테오린(Luteolin), 퀘르세틴(Quercetin), 부테인(Butein), 국화꽃 추출물(Flower extracts of Chrysanthemum morifolium Ramat), 가죽나무잎 추출물(Leaf extracts of Cedela sinensis A. Juss), 달맞이순 추출물(Extracts of Oenothera stricta Ledeb.), 쇠뜨기 추출물(Extracts of Equisetum arvense L.), 고구마잎 추출물(Leaf extracts of Ipomoea batatas), 토마토 추출물 및 호모 시스틴(Homocysteine)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 조성물.
  14. 제 11항에 있어서,
    목적하는 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 줄기세포;
    수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 면역세포;
    섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 체세포(Somatic cell);
    CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 제재의 생산에 사용되는 세포주; 또는
    인체나 동물의 구강, 비강, 폐, 피부, 위장관, 및 비뇨관에서 유래한 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 인체 마이크로바이옴 (Microbiome)인, 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    T 세포는 조절 T 세포(Treg cell)를 제외한 것인, 조성물.
  16. 제 11항에 있어서,
    제1산화제는 H2O2, 및 tert-부틸 과산화물을 포함한 히드로과산화물 (hydroperoxide); 디아미드, GSSG (oxidized GSH), 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산), 말레이미드, N-에틸말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산 및 요오드아세트아미드을 포함한 티올 산화제; 비스-클로로에틸니트로조우레아를 포함한 글루타치온 환원효소 억제제; PX-12을 포함한 티오레독신 억제제; 안티마이신 A, 로테논, 올리고마이신 및 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존을 포함한 미토콘드라아 전달전달계 억제제; 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트을 포함한 NADPH 산화효소 활성화제; 1S,3R-RAS-셀렉티브 레탈 3(1S,3R-RAS- selective lethal 3; 1S,3R-RSL3), DPI19, DPI18, DPI17, DPI13, DPI12, DPI10 (ML210), DPI7 (ML162), 또는 알트레타민을 포함한 gpx4 억제제; 에라스틴(Erastin), 설파살라진, 소라페닙, 글루타메이트, 피페라진 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴, 및 에라스틴 유사체를 포함한 시스템 x- c 억제제; 페로토시스 유도체 56(FIN56)를 포함한 GPX4 단백질량 및 CoQ10 양 감소유도제; 카스파제-의존성 레탈 56 (CIL56) 및 페로토시스 유도체 엔도페록시드 (FINO2)를 포함한 지질 과산화유도제; 부티오닌-(S, R)-설폭시민을 포함한 글루탐산염 시스타인 연결효소 (GCL) 억제제; 디에틸말레산염을 포함한 GSH 감소 유도제; DPI2, 시스플라틴, 시스테네이즈(cysteinase), 스타틴, 구연산 철 암모늄, 트리고넬린, 사염화탄소, 실리카계 나노입자 및 비열플라즈마를 포함하는, 조성물.
  17. 제 11항에 있어서,
    제2산화제는 말레이미드, 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산, 에틸말레이미드, N-에틸말레이미드, 요오드아세트아미드, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 또는 요오드아세트아미도프로피온산을 포함하는, 조성물.
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